アルブミン融合繊毛様神経栄養因子
【課題】哺乳類において肥満症を治療する方法、また、適度に高い濃度のＣＮＴＦを用いる哺乳類の治療に関連する副作用(例えば悪心、頭痛)を潜在的に最小化する方法を提供する。
【解決手段】アルブミン、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも一個の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる融合タンパク質。
【解決手段】アルブミン、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも一個の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アルブミン、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも一個の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる融合タンパク質に関する。
【発明の背景】
【０００２】
一日のエネルギー恒常性の調節は、主に基底視床下部（腹内側核、背内側核、室傍核、および視床下部外側野）における少数の個々の核［１］の中枢制御下にあるが、その他の中枢神経構造（大脳皮質、辺縁域、脳幹、脳下垂体、自律神経節前細胞、迷走神経背側複合体）ならびに関連する末梢神経構造（交感神経節前細胞）もある［２］。
【０００３】
中枢および末梢神経の調節の他に、エネルギー恒常性のバランスに関与する末梢器官は、消化管 (胃、腸）、膵臓、脂肪組織、筋組織、副腎および甲状腺である。
【０００４】
調節のプロセスは複雑で、消化管などの末梢器官が食物摂取後に視床下部で食欲増進ホルモンを減少させるホルモン（例えばＣＣＫ（コレシストキニン))を放出する。さらに、食物摂取後に脂肪組織によって放出されるレプチンには、例えば中枢に作用する主な食欲増進ホルモンの一つであるＮＰＹ（ニューロペプチドＹ）にマイナスの調節効果がある。他方、中枢に放出されるホルモンは、同様に熱産生を増加させる末梢効果を有する可能性がある（例えばβ３アドレナリン作動性アゴニスト、脱共役タンパク質（ＵＣＰ））。興味のある方は全範囲を網羅する実際の総説［１−６］を参照のこと。
【０００５】
アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））(REGENERON, Terrytown, NY, USA)は、ＣＮＴＦの変異型である。アクソカイン（商標）は 、Ｃ末端の最後の１５のアミノ酸が取り去られたＣＮＴＦの末端切断型である。分子の安定性を向上させるため、６３番のグルタミンがアルギニンに置換され、１７番の遊離システインがアラニンに置換されている［７］。
【０００６】
運動ニューロン疾患に苦しむ患者における臨床試験中、偶然にＣＮＴＦの体重減少作用が発見された［８］。さらなる研究によって、ＣＮＴＦによってもたらされる体重減少誘発作用のメカニズムがレプチンに類似し、ＣＮＴＦが食餌誘発性の肥満症にも有効である点が違うことが明らかとなった［７］。アクソカイン（商標）を用いる動物実験で、このＣＮＴＦ変異体による体重減少誘発能力がＣＮＴＦのメカニズムに類似することが確認された。
【０００７】
ＣＮＴＦは、いずれも摂食を刺激することで知られる、ＮＰＹ、アグーチ関連ペプチド（ＡＧＲＰ）およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成にマイナスの調節効果を有する。
【０００８】
ＣＮＴＦはそのままの形で血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが示された［１０］。最近になって、ＣＮＴＦは、Ｋｉの流入率が４．６０（±０．７８）×１０−４ｍＬ／ｇ分の、飽和可能な輸送系を経由して輸送されることが示された［１１］。
【０００９】
ＢＢＢは、血液から脳組織への分子の進入を防ぐ、高度に調節された関門（バリア）である［１３］。それは脳の毛細血管内皮細胞で形成されている。
【００１０】
Lambert et al.［７］から、アクソカイン（商標）がレプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ）マウスおよび野生型（食餌誘発性肥満症、ＤＩＯ）マウスに働くことが分かっている。最も有効な用量はアクソカイン（商標）が３００μｇ／体重ｋｇであったが、効果は１００μｇ／体重ｋｇでも見出された。達成した体重の減少は主に脂肪組織の減少によるものであり、除脂肪体重による減少は避けられている。
【００１１】
さらに、アクソカイン（商標）で処置したマウスにはリバウンド効果がなかったが、アクソカイン（商標）で処置せずにアクソカイン（商標）で処置した動物の摂取したものと同じ食餌を与えたマウスは（食餌を与えた群）、直ちに元の体重を取り戻した。
【００１２】
フェーズＩのデータは、GulerらによりInternational Journal of Obesityに公表されている［１４］。アクソカイン（商標）は十分に耐性を示し、脱落した被験体はなく、全ての有害事象（ＡＥ）の過半数が「軽度」とされた。用量を制限する毒性はパートＡにおいて１６μｇ／体重ｋｇでの嘔吐および悪心であった。注射部位の反応は、薬剤で治療した被験体でＡＥが最も頻繁に報告され、続いて食欲低下、悪心、頭痛、および下痢であった。口にヘルペス状の病変が見られる被験体もあった。
【００１３】
ある被験体は、アクソカイン（商標）を１μｇ／体重ｋｇ／日での処置の終了後１０日に一過性のＢｅｌｌ麻痺（顔の表情筋が麻痺する、第ＶＩＩ脳神経である顔面神経の麻痺）を被った。高用量では、Ｃ反応性タンパク質および赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の増加、および血清Ｆｅ＋の減少が見られた。用量依存型では、心拍数が増加し、体温が高くなる傾向があった。
【００１４】
１７０名の重症または病的肥満患者に関する多施設無作為化二重盲検プラシーボ対照用量比較フェーズII試験［１５］を評価すると、１２週間の治療期間に最適な量のアクソカイン（商標）（１．０μｇ／ｋｇ）を受けた患者は、プラシーボレシピエントよりも、平均して１０ポンド多く［１６］体重が減少した（ｐ＜０．００１）。
【００１５】
体重の減少は、８週間の治療群の患者へのアクソカイン（商標）の最後の投与から４ヶ月間維持された［１７、１８］。重大な有害事象は報告されなかった。最も頻繁に報告された有害事象は用量依存性、プラシーボ群を含む全ての患者に起こった軽い注射部位反応（部位の赤み）であった。アクソカイン（商標）の投与は咳および悪心と付随し、２．０μｇ／体重ｋｇ量の薬剤投与後に最も頻繁に起こった。プラシーボと比較してアクソカイン（商標）レシピエントに単純ヘルペスウイルス感染の増加は見出されなかった。比較できる比率のアクソカイン（商標）、および（５８〜７４％）、およびプラシーボ（６１％）、レシピエントは全１２週間の試験を完了した。
【００１６】
フェーズIIIプラシーボ対照試験において１４６７名のアクソカイン（商標）治療患者および５０１名のプラシーボ治療患者により以下のことが実証された。
【００１７】
アクソカイン（商標）治療は、プラシーボと比較すると、試験の双方の終末点に関して統計的優位性を達成した。
【００１８】
プラシーボ治療患者と比較して初期体重の少なくとも５％減少した割合はアクソカイン（商標）治療患者のほうが多かった（２５．１％対１７．６％、ｐ＜０．００１）。
【００１９】
アクソカイン（商標）を受けた参加者はプラシーボを受けた参加者よりも平均の体重減少が大きかった（６．２ポンド対２．６ポンド、ｐ＜０．００１）。
【００２０】
アクソカイン（商標）治療は、初期体重の少なくとも１０％減少した患者の割合（１１．３％対４．２％、ｐ＜０．００１）など、３つの二次終末点のうち２つに統計上有意な結果を達成した。
【００２１】
アクソカイン（商標）治療は一般に十分な耐性を示した。有害事象は一般に軽度から中程度として特徴づけられ、重篤または重症な有害事象の傾向は現れなかった。プラシーボと比較して最も注目すべき有害作用は、注射部位反応、悪心および咳であったが、これらは主に軽度として特徴付けられた。
【００２２】
アクソカイン（商標）に関連する体重の減少は、アクソカイン（商標）治療の約３ヶ月後に始まる抗体の産生によって制限された。しかし、アクソカイン（商標）で治療した全１４６７名のうち３０%を超える患者が一年終了までに抗体を産生しなかった。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の一つの態様では、本発明は、アルブミン、特にヒト血清アルブミン、またはアルブミン活性を有するその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化させる少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。
【００２４】
異なる態様では、ＣＮＴＦまたはアルブミンは、断片または誘導体、あるいはアクソカイン（商標）の場合はその双方、または変異体であってよい。アルブミン融合タンパク質は治療剤であってよい。
【００２５】
もう一つの態様では、本発明は、哺乳類においてＣＮＴＦの半減期を延長させる方法である。この方法は、ＣＮＴＦをアルブミンと連結させてアルブミン融合ＣＮＴＦを形成させ、かつ、アルブミン融合ＣＮＴＦを哺乳類へ投与することを伴う。一般に、アルブミン融合ＣＮＴＦの半減期は、連結型アルブミンを欠くＣＮＴＦの半減期の少なくとも２倍から少なくとも５０倍延長される。
【００２６】
ＣＮＴＦの輸送系かまたは例えば経細胞輸送などの血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する非特異的輸送系を用いることによって、脳内のアルブミン融合アクソカイン（商標）の濃度は増加すると期待される。やがてＢＢＢで、非融合アクソカイン（商標）と比較してアルブミン融合アクソカイン（商標）の血漿濃度が上昇することによって、より多くの経細胞輸送によるアルブミン融合アクソカイン（商標）の流入が起こる。
【００２７】
さらに、本発明は、哺乳類において肥満症を治療する方法を伴う。この方法は、ＣＮＴＦをアルブミンと連結させてアルブミン融合ＣＮＴＦを形成させ、かつ、アルブミン融合ＣＮＴＦを哺乳類へ投与することを含んでなる。本発明はまた、適度に高い濃度のＣＮＴＦを用いる哺乳類の治療に関連する副作用(例えば悪心、頭痛)を潜在的に最小化する方法を包含する。この方法は、前記ＣＮＴＦをアルブミンと連結させてアルブミン融合ＣＮＴＦを形成すること、および前記アルブミン融合ＣＮＴＦを前記哺乳類へ投与することを含む。
【発明の具体的説明】
【００２８】
定義
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）とは、天然に存在するＣＮＴＦの単一の生物活性を有する、天然に存在するＣＮＴＦの類似体、同族体、断片、または誘導体であるいずれの分子も意味する。好ましいＣＮＴＦはアクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））である。もう一つのＣＮＴＦ変異体（Ｓｅｒ１６６Ａｓｐ／Ｇｌｎ１６７Ｈｉｓ）が欧州特許ＷＯ９８／２２１２８号に記載されており、それは１５９番から１７８番に以下のアミノ酸配列を有する： Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe（１５９〜１７８；配列番号４）
【００２９】
アクソカイン（商標）は、ＣＮＴＦの変異型である。アクソカイン（商標）は、Ｃ末端の最後の１５のアミノ酸が取り去られたＣＮＴＦの末端切断型である。分子の安定性を高めるため、６３番のグルタミンがアルギニンに置換され、１７番の位置で遊離システインがアラニンに置換されている［７］。
【００３０】
Ｎ末端−アクソカイン（商標）は、実施例１に記載のように、アクソカイン（商標）のＣ末端とヒト血清アルブミンのＮ末端との融合体である。
【００３１】
Ｃ末端−アクソカイン（商標）は、実施例１に記載のように、アクソカイン（商標）のＮ末端とヒト血清アルブミンのＣ末端との融合体である。
【００３２】
実施例１に記載の切断可能なアクソカイン（商標）とは、ＣＮＴＦ部分とアルブミンとの間に、切断可能なまたは、Ｎ−およびＣ末端融合体の対照として用いられた非融合アクソカイン（商標）を生成するために用いられたエンテロキナーゼ切断部位を有するヒト血清アルブミンとのアクソカイン（商標）のＣ末端融合体である。
【００３３】
アルブミン
ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)およびヒトアルブミン(ＨＡ)という語は、本明細書中では同義的に用いられる。「アルブミン」および「血清アルブミン」という語はさらに広義であって、ヒト血清アルブミン(ならびにその断片および変異体)ならびにその他の種由来のアルブミン(ならびにその断片および変異体)を包含する。
【００３４】
本明細書において「アルブミン」とは、集合的に、アルブミンタンパク質またはアミノ酸配列、またはアルブミンの１以上の機能活性(例えば、生物学的に活性な) を有するアルブミン断片または変異体をさす。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンまたはその断片（ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７参照）をさし、特に、引用することによりそのまま本明細書の一部とされるＷＯ０１／７９４８０の図１５（配列番号１８）に示されるようにヒトアルブミンの成熟型、またはその他の植物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子の類似体もしくは変異体もしくはその断片をさす。
【００３５】
本願中ではＷＯ０１／７９４８０の図１５のこの配列を「ＷＯ’４８０配列」と呼ぶ。
【００３６】
本発明のアルブミン融合タンパク質に用いられるヒト血清アルブミンタンパク質は、ＷＯ‘４８０配列に関して以下の一連の点突然変異：４０７番のＬｅｕがＡｌａへ、４０８番のＬｅｕがＶａｌへ、４０９番のＶａｌがＡｌａへ、および４１０番のＡｒｇがＡｌａへ；または４１０番のＡｒｇがＡｌａへ、４１３番のＬｙｓがＧｌｎへ、および４１４番のＬｙｓがＧｌｎへ（例えば、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる国際公開Ｗ０９５／２３８５７号参照）の一方または両方を含む。別の態様では、上記の一連の点突然変異の一方または両方を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質分解切断への安定性／抵抗性を改善したもので、酵母宿主細胞で発現する組み換えアルブミン融合タンパク質の産生を増加させるものである。
【００３７】
本明細書で用いられるように、ＣＮＴＦのin vivo半減期、治療活性、または保存寿命（shelf-life）を延ばす、または拡大するのに十分なアルブミンの部分とは、非融合状態のＣＮＴＦのin vivo半減期、治療活性、または保存寿命と比較して、アルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分のin vivo半減期、治療活性、または保存寿命を安定化する、延ばす、または拡大するのに十分な長さまたは構造のアルブミンの部分をさす。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記のように全長ＨＡ配列を含み得るか、または治療活性を安定化する、または引き延ばすことのできるその１以上の断片を含み得る。このような断片は、１０以上のアミノ酸長であるか、またはＨＡ配列由来の約１５、２０、２５、３０、５０、またはそれ以上の隣接するアミノ酸を含むか、またはＨＡの特異的ドメインの一部または全部を含んでよい。
【００３８】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常なＨＡの変異体であってよい。本発明のアルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分もまた、本明細書に記載のように治療用タンパク質の変異体であってよい。「変異体」には、挿入、欠失および保存的または非保存的置換のいずれをも含み、その場合そのような変化は、治療用タンパク質の治療活性を与えるアルブミン、または活性部位または活性ドメインの１以上の腫脹の、有用なリガンド結合および非免疫原性を実質的に変更しない。
【００３９】
特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、天然に存在するヒトアルブミンの多型変異体およびヒトアルブミンの断片、例えばＥＰ３２２０９４に開示の断片など（つまり、ｎが３６９〜４１９であるＨＡ（Ｐｎ））を含んでよい。アルブミンは、どのような脊椎動物、特に哺乳類、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来するものであってよい。非哺乳類由来のアルブミンとしては、限定されるものではないが、雌鳥および鮭が挙げられる。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分はＣＮＴＦ部分とは異なる動物由来であってよい。
【００４０】
一般的に言えば、ＨＡ断片または変異体は少なくとも１００アミノ酸長となり、所望により少なくとも１５０アミノ酸長となる。ＨＡ変異体は、少なくともＨＡの一つのドメイン全体から構成されるかまたはそれを含んでよい。例えばドメイン１（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸１〜１９４）、２（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸１９５〜３８７）、３（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（ＷＯ‘４８０配列の１〜３８７）、２＋３（ＷＯ‘４８０配列の１９５〜５８５）または１＋３（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸１〜１９４＋ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸３８８〜５８５）である。各ドメインはそれ自体２つの相同なサブドメイン、つまり１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１および５１２〜５８５からなり、Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａ１３１５およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１残基を含んでなる柔軟なサブドメイン相互のリンカー領域を含む。
【００４１】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインまたはドメインまたはその保存的変更形態を含んでよい。融合体がサブドメインに基づくならば、隣接するリンカーのいくつかまたは全てを所望によりＣＮＴＦ部分との連結に用いてよい。
【００４２】
アルブミン融合タンパク質
本発明は、一般的に、アルブミン融合タンパク質、ならびに疾病および疾患を治療、予防または改善する方法に関する。本明細書で用いられるように、「アルブミン融合タンパク質」とは、アルブミン(またはその断片または変異体)の少なくとも一つの分子とＣＮＴＦ(またはその断片または変異体)の少なくとも一つの分子との融合によって形成されるタンパク質をさす。本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＣＮＴＦの少なくとも一つの断片または変異体およびヒト血清アルブミンの少なくとも一つの断片または変異体を含んでなり、それは互いの遺伝子の融合などによって互いに結合している(すなわち、アルブミン融合タンパク質は、ＣＮＴＦの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドがアルブミンの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドとフレーム内に連結される核酸の翻訳によって生成される)。ＣＮＴＦおよびアルブミンタンパク質は、いったんアルブミン融合タンパク質の部分となると、アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「一部」と呼ばれ得る。
【００４３】
一つの態様では、本発明はＣＮＴＦおよび血清アルブミンタンパク質を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン 融合タンパク質を提供する。もう一つの態様では、本発明はＣＮＴＦおよび血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。もう一つの態様では、本発明はＣＮＴＦおよび血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる態様では、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は血清アルブミンの成熟部分である。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、ＣＮＴＦならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる態様では、本発明はＣＮＴＦならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、アルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分は治療用タンパク質の成熟部分である。
【００４５】
さらなる態様では、本発明はＣＮＴＦの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片または変異体、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片または変異体を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、本発明はＣＮＴＦの成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。
【００４６】
一つの態様では、アルブミン融合タンパク質はＮ末端部分としてＨＡ、およびＣ末端部分としてＣＮＴＦを含んでなる。あるいは、Ｃ末端部分としてＨＡ、およびＮ末端部分としてＣＮＴＦを含んでなるアルブミン融合タンパク質も用いてよい。
【００４７】
その他の態様では、アルブミン融合タンパク質はアルブミンのＮ末端およびＣ末端の双方と融合したＣＮＴＦを有する。一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は同じＣＮＴＦタンパク質である。もう一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は異なるＣＮＴＦタンパク質である。もう一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は、同じ疾病、疾患または症状の治療または予防に用いてよい異なるＣＮＴＦタンパク質である。もう一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は、当技術分野で一般に複数の患者に同時に発生することが知られている疾病または疾患の治療または予防に用いてよい、異なるＣＮＴＦタンパク質である。
【００４８】
アルブミン部分がＣＮＴＦ部分のＮ末端および／またはＣ末端と融合したアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は目的のＣＮＴＦまたはペプチドをＨＡの内部領域へ挿入することによって製造してもよい。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列の中には、その末端からαへリックスの開始点の間に多数のループまたはターンが存在し、ジスルフィド結合によって安定化されている。これらのループは、ＨＡの結晶構造（ＰＤＢ識別番号１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７ｌおよび１ＵＯＲ）から決定されるように、大半は分子の本体から外へ伸び出している。このようなループは、本質的に特定の生物活性を有するアルブミン分子を生成するため、治療上有効なペプチド、特に機能的であるべき二次構造を必要とするものまたは治療用タンパク質の挿入または内部融合に有用である。
【００４９】
本発明のアルブミン融合タンパク質を生成するためにペプチドまたはポリペプチドを挿入し得るヒトアルブミン構造中のループとしては、Ｖａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６−Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２−Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７−Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６−Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０−Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２−Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９−Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２−Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８−Ｐｒｏ４８６、およびＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６が挙げられる。その他の態様では、ペプチドまたはポリペプチドは成熟ヒトアルブミン（ＷＯ’４８０配列）のＶａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、および／またはＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６ループに挿入される。
【００５０】
挿入されるペプチドは、ファージディスプレイまたは特定の生物学的な活性についてスクリーニングされた合成ペプチドライブラリーから導かれたものであってもよく、また所望の機能を含む分子の活性部分から導かれたものであってもよい。さらに、ランダムペプチドライブラリーを、特定のループ内に作成してもよく、無作為化されたペプチドを全ての可能なアミノ酸の組み合わせが表されるようにＨＡ分子の特定のループへ挿入して作成してもよい。
【００５１】
このようなライブラリーは、以下の方法のうちの一つによってＨＡまたはＨＡのドメイン断片上に生成され得る。
（ａ）ＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のペプチドループ内の無作為化されたアミノ酸突然変異。どちらも、ループ内のより多くまたは全ての残基をこの方法で突然変異することもあり得る；
（ｂ）長さＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基数である）の無作為化されたペプチドのＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のループの置換、またはその１以上のループへの挿入（すなわち、内部融合）；
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ−、Ｃ−またはＮ−およびＣ末端ペプチド／タンパク質融合体。
【００５２】
ＨＡまたはＨＡドメイン断片は、同一のＨＡまたはＨＡドメイン断片への異なる標的に対する異なるループの異なるスクリーニングからのペプチドを移植することによって、多機能にしてもよい。
【００５３】
ヒト血清アルブミンのループに挿入されるペプチドはＣＮＴＦペプチドまたはそのペプチド断片またはペプチド変異体である。より具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループに挿入された少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０アミノ酸長のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＮ末端と融合した少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０アミノ酸のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＣ末端と融合した少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０アミノ酸のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。
【００５４】
一般に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのＨＡ由来領域および１つのＣＮＴＦタンパク質由来領域を有してよい。しかし、各タンパク質の複数の領域を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作成してもよい。同様に、１以上のＣＮＴＦを用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作成してもよい。例えば、ＣＮＴＦをＨＡのＮおよびＣ末端双方と融合させてもよい。そのような配置では、ＣＮＴＦ部分は同じまたは異なるＣＮＴＦ分子であってよい。二機能性のアルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＹ−ＨＡ−ＸまたはＸ−Ｙ−ＨＡまたはＨＡ−Ｘ−ＹまたはＨＡ−Ｙ−Ｘ−ＨＡまたはＨＡ−Ｘ−Ｘ−ＨＡまたはＨＡ−Ｙ−Ｙ−ＨＡまたはＨＡ−Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＸ−ＨＡ−Ｙ−ＨＡまたは複数の組み合わせおよび／またはＨＡ配列内のどの位置へのＸおよび／またはＹの挿入として表され得る。
【００５５】
二機能性または多機能性アルブミン融合タンパク質は、機能、半減期などに応じて種々の割合で製造してよい。
【００５６】
二機能性または多機能性アルブミン融合タンパク質はまた、融合体のＣＮＴＦ部分をＨＡの反対の末端でタンパク質またはペプチドを介して標的器官または細胞種へ標的化するよう製造してよい。
【００５７】
公知の治療用分子の融合体の代わりとして、ＨＡのＮ−、Ｃ−またはＮ−およびＣ末端、または一般的に６、８、１２、２０または２５またはＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸（ａａ）であり、ｎは残基数に等しい）無作為化アミノ酸のＨＡのドメイン断片との融合体として構築されたライブラリーのスクリーニングによって、全ての可能なアミノ酸の組み合わせが表されるようにペプチドを得ることもあり得る。このアプローチの特に有利な点は、ペプチドがＨＡ分子上でin situ選択され得ること、従って、ペプチドの特性が、その後にＨＡと結合する、他のいずれかの方法によって誘導されたペプチドの場合など、むしろ可能性として修飾されるものに関して選択され得ることである。
【００５８】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、部分間の物理的分離をより大きくするために融合部分間にリンカーペプチドを含んでよく、従って例えば、その同族受容体との結合のため、ＣＮＴＦ部分の接近能を最大化することもあり得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかより強固であるようにアミノ酸で構成してもよい。
【００５９】
従って、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、次式Ｒ２−Ｒ１；Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１［式中Ｒ１は少なくとも１種類の治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列（その断片または変異体を含む）であり、必ずしも同一の治療用タンパク質である必要はなく、Ｌはリンカーであり、Ｒ２は血清アルブミン配列（その断片または変異体を含む）である］を有し得る。リンカーの例としては、（ＧＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号８）または（ＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号９）または（ＧＧＳ）Ｎ、式中、Ｎは１以上の整数であり、式中Ｇはグリシンを表し、Ｓはセリンを表す。Ｒ１が２以上の治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列である場合、これらの配列は所望によりリンカーによって接続してよい。
【００６０】
さらなる態様では、ＣＮＴＦタンパク質を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンと融合していない同じＣＮＴＦの保存寿命またはin vivo半減期または治療活性と比較して、保存寿命またはin vivo半減期または治療活性が延長されている。保存寿命とは、一般的に、ＣＮＴＦタンパク質の治療活性が溶液またはその他の保存用の処方形態で治療活性を過度に失うことなく安定している期間をさす。多くのＣＮＴＦタンパク質はその非融合状態で極めて不安定である。下記のように、これらのＣＮＴＦタンパク質の一般的な保存寿命は、本発明のアルブミン融合タンパク質へ組み込むことによって著しく延長された。
【００６１】
保存寿命の「延長された」（prolonged）または「拡大された」（extended）本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ保存および取り扱い条件に付された標準物質と比較して大きな治療活性を示す。標準物質は、非融合全長ＣＮＴＦタンパク質であってよい。アルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分が類似体、変異体、そうでなければ変更形態であるか、またはそのタンパク質の完全な配列を含まない場合、治療活性の延長は、またはその類似体、変異体、変更されたペプチド、または不完全配列の非融合同等物に匹敵する。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準物質と同じ保存および取り扱い条件に付された場合に、所定の時点で比較すると、治療活性の約１００％以上、または標準物質の治療活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％または２００％以上を保持する可能性がある。しかし、治療活性はＣＮＴＦタンパク質の安定性に依存し、１００％以下である可能性もある。
【００６２】
保存寿命はまた、保存開始時点の治療活性をノーマライズして保存後に残存する治療活性に関して評価してもよい。延長されたまたは拡大された治療活性によって示される保存寿命の延長されたまたは拡大された本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療活性の約５０％以上を保持する可能性があり、同じ条件に付された場合の同等な非融合ＣＮＴＦの治療活性の約６０％、７０％、８０％、または９０％またはそれ以上を保持する可能性がある。
【実施例】
【００６３】
実施例１
アルブミン融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の製造
ＣＮＴＦを、プライマー：
【化１】
をエクソン１に、そしてプライマー：
【化２】
をエクソン２に用い、それぞれ標準条件を用いて２つのエクソンを増幅してヒトゲノムＤＮＡからクローン化した。両断片を標準条件下で連結した後、プライマー：
【化３】
を用いてＰＣＲによって再増幅し、ベクターｐＣＲ４(Invitrogen)へクローニングした。Lambertら(PNAS 98: 4652-4657; 2001)に開示の通りアクソカイン（商標）を生成するため、位置指定突然変異誘発を用いてＣ１７Ａ（ＴＧＴ->ＧＣＴ）およびＱ６３Ｒ（ＣＡＧ->ＡＧＡ）突然変異を導入した。ＤＮＡシーケンシングも、サイレントＴ->Ｃ置換Ｖ８５Ｖ（ＧＴＴ->ＧＴＣ）の存在を明らかにした。
【００６４】
Ｃ末端ｒＨＡ−ＧＳ−アクソカイン（商標）融合体を作成するため、アクソカイン（商標）ｃＤＮＡを、単一の標準オリゴヌクレオチドプライマーＭＨ３２:
【化４】
およびＭＨ３５：
【化５】
を用いる突然変異誘発ＰＣＲによってヒトアルブミンをコードするｃＤＮＡと連結させ、１４アミノ酸ＧＳ−（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）ペプチドスペーサーを導入した。成熟ｒＨＡ−ＧＳ−アクソカイン（商標）融合体のアミノ酸配列を図８に示す。
【００６５】
Ｃ末端ｒＨＡ−３×ＦＬＡＧ−アクソカイン（商標）（切断可能なアクソカイン（商標））融合体を作成するため、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーＭＨ３２：
【化６】
およびＣＦ８３：
【化７】
を用いる突然変異誘発ＰＣＲによって、アクソカイン（商標）ｃＤＮＡを、ヒトアルブミンをコードするｃＤＮＡと連結させ、２２アミノ酸３×ＦＬＡＧ（−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−）ペプチドスペーサー(Sigma-Aldrich Company Ltd.)をアルブミンとアクソカイン（商標）との配列間へ導入した。成熟Ｃ末端ｒＨＡ３×ＦＬＡＧ−アクソカイン（商標）融合体のアミノ酸配列を図９に示す。ＷＯ９０／０１０６３に開示のＨＳＡ／ＭＦ□−１融合体分泌リーダー配列を準備して確実に融合タンパク質を分泌するようにする。
【００６６】
Ｎ末端アクソカイン（商標）−ＧＳ−ｒＨＡ融合体を作成するため、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーＭＨ３３：
【化８】
およびＭＨ３６：
【化９】
を用いる突然変異誘発ＰＣＲによってアクソカイン（商標）ｃＤＮＡを、ヒトアルブミンをコードするｃＤＮＡと連結させ、各１４のアミノ酸ＧＳ（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）ペプチドスペーサーをアクソカイン（商標）とアルブミンとの配列間に導入した。成熟アクソカイン−ＧＳ−ｒＨＡ融合体のアミノ酸配列を図１０に示す。
【００６７】
ｒＨＡ−ＧＳ−アクソカイン（商標）配列、ｒＨＡ−３×ＦＬＡＧ−アクソカイン（商標）配列およびアクソカイン（商標）−ＧＳ−ｒＨＡ配列のマップを、それぞれ図１１、１２および１３に示す。
【００６８】
酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターから、それぞれ既にＷＯ００／４４７７２に開示され、Sleep, D., et al. (1991)Bio/Technology 9,183-187に記載されている適当な転写プロモーターおよび転写ターミネーター配列がもたらされた。適当なベクター配列は、一般にＥＰ−Ａ−２８６４２４に開示され、Sleep, D., et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187に記載されている「分解」プラスミドｐＳＡＣ３５によりもたらされた。
ｒＨＡ融合体が発現し、振盪フラスコ培養発現レベルが決定された。
【００６９】
実施例２
精製
Ｃ末端アクソカイン（商標）は、高いレベルで切断された材料を含んでいた。それは標準のｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件（米国特許第６，０３４，２２１号参照）を用いて精製されたが、ネガティブモードであり、これにより融合体は透過物中にあった。透過物をｐＨ８および２．５ｍＳ・ｃｍ−１に調節し、１５ｍＭ四ホウ酸カリウム中で平衡化した標準のｒＨＡ ＤＥ−ＦＦにロードした。ＳＰ−ＦＦについては、ＤＥＦＦをネガティブモードで操作した。ＤＥ−ＦＦ透過物の伝導率は１５ｍＳ・ｃｍ−１に増加し、次に、この材料を、過剰量の５０ｍＭオクタノエートでの溶出による標準的なｒＨＡ ＤＢＡクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、溶出液を濃縮し、５ｍＭリン酸ｐＨ８．３でダイアフィルトレーションした。
【００７０】
Ｎ末端アクソカイン（商標）は、切断された材料をいくらか含んでいた。それは標準のｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件を用いて精製されたが、ネガティブモードであり、それにより、融合体が透過物中にあった。この透過物をｐＨ８および２．５ｍＳ・ｃｍ−１に調節し、１５ｍＭ四ホウ酸カリウム中で平衡化した標準のｒＨＡ ＤＥ−ＦＦに装填した。この場合は、融合体の比率を固定し、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む標準の溶出液で溶出した。溶出液の伝導率は１５ｍＳ・ｃｍ−１まで減少し、次に、この材料を、過剰量の５０ｍＭオクタノエートでの溶出による標準的なｒＨＡ ＤＢＡクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、溶出液を濃縮し、５ｍＭリン酸ｐＨ８．３でダイアフィルトレーションした。
【００７１】
切断可能なアクソカイン（商標）は、高いレベルで切断された材料を含んでいた。それは標準のｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件を用いて精製されたが、ネガティブモードであり、それにより融合体が透過物中にあった。透過物をｐＨ８および２．５ｍＳ・ｃｍ−１に調節し、１５ｍＭ四ホウ酸カリウム中で平衡化した標準のｒＨＡ ＤＥ−ＦＦにロードした。ＳＰ−ＦＦについては、これをネガティブモードで操作した。透過物の伝導率は１５ｍＳ・ｃｍ−１に増加し、この材料を、過剰量の５０ｍＭオクタノエートでの溶出による標準的なｒＨＡ ＤＢＡクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、この材料を濃縮し、切断バッファー中へダイアフィルトレーションした。室温で一晩切断を行い、Ｅｋａｐｔｕｒｅゲルを用いてエンテロキナーゼを除去した。次に、この材料を濃縮し、５ｍＭリン酸ｐＨ８．３でダイアフィルトレーションした。Wurde hier nicht erneut gereinigt?
【００７２】
実施例３
薬物動態
非融合アクソカイン（商標）に対するＮ末端およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の半減期およびバイオアベイラビリティの評価、ならびに非融合アクソカイン（商標）に対するＮ末端およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の更なる薬物動態学的なパラメータの評価。
【００７３】
投与プロトコール：
試験品１： 非融合アクソカイン（商標）
適用量： ０．３３ｍＬ／ｋｇ
単回用量／経路： １０μｇ／ｋｇ 静脈内または皮下
回数： １回（ｔ＝０）
試験品２： Ｎ末端アルブミン−融合アクソカイン（商標）
適用量： ０．３３ｍＬ／ｋｇ
単回用量／経路： ４０μｇ／ｋｇ 静脈内または皮下
回数： １回（ｔ＝０）
試験品３： Ｃ末端 アルブミン-融合アクソカイン（商標）
適用量： ０．３３ｍＬ／ｋｇ
単回用量／経路： ４０μｇ／ｋｇ 静脈内または皮下
回数： １回（ｔ＝０）
【００７４】
試験計画
【表１】
試験動物
種／系統： ウサギ
性別／齢： 雄１２匹、雌１２匹；３〜４ヶ月
総数： ２４
供給者： Fa. Bauer (Neuenstein-Lohe, Germany)
【００７５】
動物モデル
０日に、グループあたり２匹の雄および２匹の雌のウサギに、切断可能なアクソカイン（商標）（１μｇ／ｋｇ）、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）（４０μｇ／ｋｇ）、またはＮ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）（４０μｇ／ｋｇ）を一回の静脈内または皮下注射によって投与した。それぞれの被験物質の静脈内投与後、ベースライン、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間（１日）、４８時間（２日）、７２時間（３日）、７日、９日、１１日、および１４日に、ならびに皮下注射後、ベースライン、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間（１日）、４８時間（２日）、７２時間（３日）、５日、７日、９日、１１日および１４日に、それぞれの抗原レベルを測定するために血液サンプルを採取した。アクソカイン（商標）およびアルブミン融合アクソカイン（商標）の血漿レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７６】
薬物動態学的（ＰＫ）変数：
消失半減期、１４日までの血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−１４）、最大濃度（Ｃｍａｘ）。無限大までの推定濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）、最大濃度時間（ｔｍａｘ）、平均滞留時間、吸収および分布の半減期（該当する場合）、分布のクリアランス量。
【００７７】
分析方法
非融合アクソカイン（商標）血漿濃度のＥＬＩＳＡ測定を、モノクローナルマウス抗ｈｕ ＣＮＴＦ抗体(R & D Systems, クローン番号２１８０９．１１１）とビオチニル化したポリクローナルヤギ抗ｈｕ ＣＮＴＦ抗体(R & D Systems, カタログ番号ＢＡＦ２５７）とを組み合わせて用いて行った。ＥＬＩＳＡキットの説明書に従ってヒトＣＮＴＦを標準物質として用いた。
【００７８】
アルブミン融合アクソカイン（商標）血漿濃度のＥＬＩＳＡ測定を、モノクローナル抗ｈｕアルブミン抗体(Aventis Behring GmbH, Laboratory) とビオチニル化したポリクローナルヤギ抗ｈｕ ＣＮＴＦ抗体(R & D Systems, カタログ番号ＢＡＦ２５７）と組み合わせて用いて行った。それぞれのアルブミン融合アクソカイン（商標）は標準曲線の生成に役立った。
【００７９】
市販のヒトＣＮＴＦ ＥＬＩＳＡ(R & D Systems)を用いると、アルブミン融合アクソカイン（商標）を検出するのは不可能であった。おそらく、アルブミンが抗ＣＮＴＦ抗体の結合に立体的に干渉するためであろう。
【００８０】
解決法として、抗アルブミンモノクローナル抗体を捕獲用抗体として用い、内部抗アルブミンアッセイを確立し、この抗体はプレートに結合した。次の工程として、R & D Systemsより得た市販のＣＮＴＦ抗体をアルブミン融合アクソカイン（商標）の検出用抗体として用いた。
【００８１】
個々の血漿レベル分析
Ｃ末端およびＮ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）および非融合アクソカイン（商標）の血漿濃度−時間プロフィールを、非線形回帰を用いて動物ごとに分析した。このデータを最小２乗法により指数関数モデルに当てはめた。静脈内投与の後のプロフィールには、オープン２コンパートメントモデルを用いた。皮下投与の後のプロフィールには、一次インプットとラグタイムを持つオープン１コンパートメントモデルを用いた。静脈内投与モデルには、１／（推定濃度）２のウエイト係数を適用した。
【００８２】
ＡＵＣはａ）最後の測定値（ＡＵＣ０−１４）まで線形台形公式を用いること、およびｂ）１４日と無限大までの間の期間を推定することによって（ＡＵＣ０−１４）を満たすことで算出した。
【００８３】
概要および比較分析
個々のＰＫ結果を処置および適用経路ごとに記述的に要約した（最小値、中央値、最大値、平均値、標準偏差）。
【００８４】
二元配置分散分析を、消失半減期、ＡＵＣおよびＣｍａｘ（全て対数変換した）について行った。固定因子は性別および処置群であった。処置群間の適当な対比を評価した。不均等分散も考慮に含めた。
【００８５】
この分析の上で、Ｉｎ（半減期）、Ｉｎ（ＡＵＣ）およびＩｎ（Ｃｍａｘ）は各々正規分布に従うことを前提とした。
【００８６】
消失半減期を物質間で比較し、ＡＵＣおよびＣｍａｘの点からバイオアベイラビリティを、両側９０％信頼区間を用い、αレベル０．１でアルブミン融合アクソカイン（商標）の投与経路群間で比較した。
【００８７】
結果
各時点でのアクソカイン（商標）濃度の平均値および標準偏差を、静脈内処置非融合アクソカイン（商標）群について図１に、静脈内処置アルブミン融合アクソカイン（商標）群について図２に、皮下処置アルブミン融合アクソカイン（商標）群について図３に示す。皮下処置非融合アクソカイン（商標）群に関しては、濃度測定はできなかった。
【００８８】
静脈内から非融合アクソカイン（商標）で処置された動物では、注射後４時間にレベルは１ｐｇ／ｍＬを下回った。アルブミン融合アクソカイン（商標）群では、このレベルは７日間１ｎｇ／ｍＬを上回った。アルブミン融合アクソカイン（商標）産物で皮下処置した動物では、このレベルは約１日後にピークに達し、７日間１ｎｇ／ｍＬを上回った。表２に静脈内処置群、表３に皮下処置群についての薬物動態学的な結果を示す。非融合アクソカイン（商標）の結果はアルブミン融合アクソカイン（商標）群の同じ単位へ変換されているが、半減期および平均滞留時間を除いては、検定法の違いからこれらとは比較できない。
【００８９】
【表２】
【００９０】
【表３】
【００９１】
表４は、消失半減期に関する分散分析の結果を示す。静脈内注射後の非融合およびアルブミン融合アクソカイン（商標）間の差は非常に有意であった。動物の性別は半減期に有意な影響を与えなかった。
【００９２】
【表４】
【００９３】
表５は、絶対的バイオアベイラビリティに関する分散分析の結果を示す。双方のアルブミン融合産物に対して、２つの投与経路間の差は、消失半減期に関して統計上有意ではなかった。ＡＵＣおよびＣｍａｘに関する差は非常に有意であった。
【００９４】
【表５】
【００９５】
非融合アクソカイン（商標）の濃度曲線下面積および最大血漿レベルの値は、直接ＮおよびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の値と比較はできない。これに対して、半減期の比較は妥当である。
【００９６】
双方のアルブミン融合アクソカイン（商標）製剤は、非融合アクソカイン（商標）と比較して、静脈内投与後の血漿からの排出の延長を顕著に示した。Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）は、非融合アクソカイン（商標）よりも７２倍長い平均消失半減期を示した。Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）は、非融合アクソカイン（商標）よりも４８倍長い平均消失半減期を示した。
【００９７】
ＡＵＣに関して、皮下注射後の絶対的バイオアベイラビリティは、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）に対して７６％、Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）に対して２３％であった。非融合アクソカイン（商標）の血漿レベルは皮下適用後に検出限界以下であったので、静脈内適用との比較はできなかった。
【００９８】
実施例４
薬力学
この実験の目的は、プラシーボまたは非融合アクソカイン（商標）と比較した、ＮおよびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）のレプチン欠損症または食餌誘発性肥満マウスでの体重の減少への有効性を評価することであった。
【００９９】
薬力学動物試験の研究デザイン、パートＩ
この試験は、合計７０匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）、および４１匹の雄および４１匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを含む、無作為化一部盲検平行１３アーム試験（２つの実験設定での試験（レプチン欠損症誘発性肥満症対食餌誘発性肥満症）としてデザインされた。
【０１００】
試験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）マウスに約３ヶ月間標準餌を与えた。この間、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）マウスはレプチン欠損症に関連して食餌摂取が制御されないため体重が強く増加した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、脂肪分４５％の高カロリー食を摂食することによって肥満症が誘発された。治療的処置に先行するこの肥満症誘発相の間、体重を週１回記録した。平均体重がベースラインの少なくとも１３０％まで増加したら、試験物質を用いる処置を開始した。試験物質（非融合アクソカイン（商標）、アルブミン融合アクソカイン（商標）、プラシーボ）を毎日皮下注射によって７日間にわたり投与した。治療相の間、体重を毎日測定した。ベースラインおよびプラシーボと比較した体重減少の平均を計算して試験物質の相対的効果を評価した。
【０１０１】
試験薬剤および用量
試験品１： プラシーボ（ｐＨ８．３の５ｍＭリン酸緩衝液）
エンドトキシン含量： ０．００７ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 適合せず
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 適合せず／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１０２】
試験品２： 非融合アクソカイン（商標）
エンドトキシン含量： １４．９ＥＵ／ｍ２Ｌ
保存濃度： ０．１ｍｇ／ｍＬ
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 表１および２に従う／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１０３】
被験品３： Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）
エンドトキシン含量： １．８ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： ５ｍｇ／ｍＬ
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 表１および２に従う／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１０４】
被験品４： Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）
エンドトキシン含量： ６４ＥＵ／ｍＬおよび３２ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： ０．２ｍｇ／ｍＬ
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 表１および２に従う／皮下
回数： ７日間連日注射
ａ処置日１日（８３日）に全てのマウスに試験物質２５０μｌを投与し、次に投与量を調節することによって投薬を体重の変化に適応させた。１３群（１２００μｇ／ｋｇ Ｃ末端アクソカイン（商標））のマウスには８３日に約３９０μｇを投与した。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
ｏｂ／ｏｂならびに野生型マウスの双方に対し、以下の用量減少が必要となった。
Delta製非融合アクソカイン（商標）：１〜２日に３００μｇ／ｋｇから３〜７日に２００μｇ／ｋｇ
Ｎ、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）：１〜２日に２８０μｇ／ｋｇから３〜７日に２００μｇ／ｋｇ
Ｎ、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）：１〜２日に１２００μｇ／ｋｇから３〜７日に８００μｇ／ｋｇ
無作為化は、無作為化リストに従い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して個別に行った。マウスを無作為化してケージに入れた後、ケージを無作為化して処置した。
有効性変数：体重(０日から７日まで毎日測定）
【０１０８】
分析方法
覚醒動物の体重を測定して体重を記録した。
【０１０９】
統計手法
一次有効性変数：７日と０日、および１０２日までの体重差。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）とＣ５７ＢＬ／６Ｊとに分類したマウスの非融合アクソカイン（商標）、Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）、およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）への用量−反応関係を、分散モデルの一分析法の範囲内で分析した。
【０１１０】
最小有効量を確認するための、対比（例えば、ヘルマート対比または逆のヘルマート対比）を用いる、プラシーボを含む種々の用量の逐次比較。差異に対する両側ｔ検定および両側９５％信頼区間を用いる等モル用量ペアの比較。
【０１１１】
Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の非融合アクソカイン（商標）に関する全体的な評価を、対数変換した用量での平行線検定によって行った。導かれた有効性を９５％信頼区間で補った。
【０１１２】
結果
一次エンドポイントの統計的分析
エンドポイント：８２日から９１、９２、９３、９４、９５、９６、１０２日までの体重変化（ｇ）
統計：順序仮説群(oederd hypotheses families)のＡＮＯＶＡ内のＦ検定。９２日に開始し、もし対応するＦ検定が有意であるとすれば、ある仮定は拒絶され、その前の仮定も拒絶される。
参照文献: Bauer P: Multiple tests in clinical trials. Statistics in Medicine, 10:871 890, 1991
【０１１３】
ｏｂ／ｏｂマウスの体重減少
図４、５、６および７は、レプチン欠損マウスでの等モル用量の非融合アクソカイン（商標）とアルブミン融合アクソカイン（商標）を比較している。
【０１１４】
要約すれば、薬力学的データは、レプチン欠損マウスにおいてアルブミン融合アクソカイン（商標）が、投与量群１１、１２、および１３に対して非融合アクソカイン（商標）よりも一層統計上有意であることを示している。野生型マウスにおいては、アルブミン融合アクソカイン（商標）は、１２群で非融合アクソカイン（商標）よりも一層統計上有意である。
【０１１５】
薬力学的動物試験の研究デザイン、パートII
本研究は本来、合計８２匹の雌Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）マウス、および４１匹の雄および４１匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを含む、２つの実験設定（レプチン欠損症誘発性肥満症対食餌誘発性肥満症）での無作為化一部盲検平行１１アーム試験としてデザインされた。非融合アクソカイン（商標）のアベイラビリティの制限のため、選択されたレプチン欠損マウスの処置群のみが本研究の処置相に含められた（表８）。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
スケジュール
Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂマウスに８０日まで標準餌を与え、体重は増加した。非融合アクソカイン（商標）またはＣ−アルブミン融合アクソカイン（商標）のいずれかでの連続７日間（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７日）かまたは１、４、７日（８１、８４、８７日）のみのいずれかでの処置は、８１日に開始した。
【０１１８】
処置停止後２１日（１０８日）まで体重を評価した。体重変化およびそれに関する分析は８１日の体重に関連づけた。
対応する時点を次の表にまとめる。
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
試験品の投与
試験品１： プラシーボ（ｐＨ８．３の５ｍＭリン酸緩衝液）
製造者： Aventis Behring (Laboratory Dr. H. Metzner)
バッチ番号： −
エンドトキシン含量： 実施せず
保存濃度： 適合せず
適用量： ５μｌ／ｇ
一用量／経路： 適合せず／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１２１】
試験品２： 非融合アクソカイン（商標）(エンテロキナーゼ切断型
Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（登録商標）)
製造者： Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D. Sleep
バッチ番号： １６７５＃４０
エンドトキシン含量： １８ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 約０．１ｍｇ／ｍＬ (標準物質としてＣＮＴＦと比較した、
クーマシー染色でのＳＤＳ ＰＡＧＥに基づく仮定、別表Ｂ）
適用量： ５μｌ／ｇ
一用量／経路： 表１に従う／皮下
回数： １、４、７日に単回注射または７日間連日注射
【０１２２】
試験品３： Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）
製造者： Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D. Sleep/
Aventis Behring GmbH, Laboratory Dr. H. Metzner
バッチ番号： ０９１００２
エンドトキシン含量： １６ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 約０．１ｍｇ／ｍＬ (標準物質としてＨＳＡと比較した、
クーマシー染色でのＳＤＳ ＰＡＧＥに基づく仮定、別表Ｂ）
適用量： ５μｌ／ｇａ
一用量／経路： 表１に従う／皮下
回数： １、４、７日に単回注射または７日間連日注射
【０１２３】
試験品４： 室温で１４日保存したＣ末端アルブミン融合アクソカイン
（商標）
製造者： Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D. Sleep/
Aventis Behring GmbH, Laboratory Dr. H. Metzner
バッチ番号： ０９１００２
エンドトキシン含量： １６ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 約０．４ｍｇ／ｍＬ (標準物質としてＨＳＡと比較した、
クーマシー染色でのＳＤＳ ＰＡＧＥに基づく仮定、別表Ｂ)
適用量： ５μｌ／ｇａ
一用量／経路： 表１に従う／皮下
回数： １、４、７日に単回注射または７日間連日注射
ａ全てのマウスに試験物質５μｌを投与した。但し、Ｃ末端アクソカイン（商標）３６００μｇ／ｋｇで処置したマウスには１０μｌ／ｇを投与した。
【０１２４】
動物モデル
Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂマウスに１２週間標準餌を与えた。この間、マウスはレプチン欠損症に関連して食餌摂取が制御されないため体重が強く増加した。治療的処置に先行するこの肥満症誘発相の間、動物の体重を測定しなかった４９〜６６日を除いて体重を週１回記録した。試験物質(アクソカイン（商標）、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）、プラシーボ)を、毎日皮下注射によって７日間にわたり投与するか、または１、４、７日の処置日に一回ずつ３回注射した。処置相の間、体重を毎日測定した。その後、１４日間体重を一日おきに記録し(すなわち、１週間につき３回)、処置後２１日(処置開始後２８日=調査日１０８日)にもう一回記録した。ベースラインおよびプラシーボと比較した体重減少の平均を計算して試験物質の相対的効果を評価した。
【０１２５】
無作為化
無作為化リストに従って無作為化を行った。マウスを無作為化してケージに入れた後、ケージを無作為化して処置した。
【０１２６】
有効性変数
主変数：処置１日（調査日８１日）から治療７日（調査日８８、８７、８６、８５、８４、８３、および８２日）の体重変化（ｇ）。
副変数：処置開始後２８日の体重（調査日１０８日）。調査日８１日から８９、９１、９４、９６、９８、１０１、１０８までの体重変化（ｇ）。
【０１２７】
分析方法
覚醒動物の体重を測定して体重を記録した。
【０１２８】
統計方法
順序仮説群のＡＮＯＶＡ内のＦ検定。８８日に開始し、その後下向きに進み、もし対応するＦ検定が有意（ｐ≦０．０５）であるとすれば、ある仮説は棄却され、その前の仮説も棄却される（ｐ≦０．０５）。同じ手順を８９日から１０８日まで上向きに用いた。この手順は、日に関係する７つの仮説からなる一連の比較の中で複数のレベル０．０５を制御した。
【０１２９】
４ブロックからなる分析を行った。表１０および１１にプラシーボと対照した試験の試験判定を集計した、すなわち、モデルの妥当性をチェックするため、有効な処置群（２〜１１群）をプラシーボ（１群）と比較した。等モル用量の分析を表１２および１３に示す一方、処置スケジュールを表１４および１５で比較している。最終的に、反応基準の代わりとなる８８日の体重変化での対数用量についての平行線検定を用いる効力評価を表１６に要約している。検定アプローチの適合性に関する試験（すなわち、直線性、平行度）はなされていない。
【０１３０】
結果
体重への影響
研究処置は８１日から８７日まで投与された。
プラシーボとの比較
試験物質を投与した全ての群が８２日〜１０１日の間にプラシーボに対して有意な差を示した(表１０および１１）。
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】
【表１１】
【０１３３】
等モル用量の比較
【表１２】
【０１３４】
【表１３】
【０１３５】
処置スケジュールの比較
【表１４】
【０１３６】
【表１５】
【０１３７】
効力評価
【表１６】
【０１３８】
融合タンパク質を皮下投与している間、ウサギで調査されたようにアルブミン融合アクソカインの血漿半減期の延長(非融合アクソカインよりも７２倍長い)が見出されたことは極めて驚くべきことである。第一に、皮下投与は吸収を減じることが知られているがここでは事実と異なっている。第二に、ヒト血漿タンパク質の血漿半減期は動物では劇的に減少することがあるということも一般に知られているので、この延長はヒトにおいてはより一層明白となることを示している。これは、非融合アクソカインを毎日適用することに比べてほぼそれに見合う効果のある融合タンパク質の３日おきの投与が可能であるという、マウスにおける発明者らの薬力学的知見によって確認された。結果として、発明者らは融合タンパク質をおそらくヒトに週１回またはさらに長い間隔で投与することが可能ではないかと推測する。ＣＮＴＦに対する抗体の産生率が減少することもあり得るため、さらなる効果および安全性は増加する可能性がある。
【０１３９】
臨床所見
動物の６匹が時期尚早に研究から離脱し、下記治療完了後全てが離脱した：
【０１４０】
８４日に開始した８群、１０群および１１群全ての動物（毎日１２００μｇ／ｋｇ Ｃ−ＡＦＰまたは３６００μｇ／ｋｇ Ｃ−ＡＦＰ ３回投与）は、動作が鈍く、毛並みが乱れ、皮膚が全身にわたり発赤し、全身症状が低下した。１２匹の動物のうち１０匹までが１２００μｇを投与され、３６００μｇで処置された全ての動物がその後２日にわたり出血性の下痢に罹り、水分摂取の減少も伴って、重い脱水症状となった。
【０１４１】
従って、８９日に１０群、１１群から各一匹の動物、９１日に８群の３匹の動物を死の直前に安楽死させた。さらに１０群の動物１匹が９６日に死亡した。
剖検で、重い肥満症、脱水症状、ならびに肝臓および腎臓の脂肪変性が、拡大した腸とともに試験した動物全てに見出された。
【０１４２】
結論
治療開始（８１日）に先立って、合計７０匹の動物が利用可能であり、プラシーボ群に１０匹（１群）、そして１０の有効な治療群の各々に６匹であった。合計６匹の動物が安楽死するか、研究途中に死亡し、全ては処置完了後に死亡した。つまり、８９日に１０、１１群から各一匹の動物が、９１日に８群の３匹の動物が、そして最後に１０群でさらにもう一匹の動物が９６日に死亡した。これらの事例ならびに見出された臨床症状は、最も用量の多い群に限定され、従って処置に関係があると考えられる。
【０１４３】
プラシーボで処置した動物の体重は、８１日から８８日の間ほぼ一定（８８日の平均体重変化：−０．４％）であったが、さらなる試験の過程で１０８日までに体重の増加（１０８日の平均変化：７．２％）が認められた。
【０１４４】
有効な物質での処置（２〜１１群）はプラシーボと比較して有意な用量依存性の体重減少をもたらした（表１０）。処置完了後２１日以内にも、有効成分で処置した動物はプラシーボ動物よりも有意に体重減少が高いことを示した（表１１）。
【０１４５】
等モル用量で比較した場合、アルブミン融合アクソカイン（商標）は、たとえどちらの処置スケジュールを適用したとしても、体重減少に関して非融合アクソカイン（商標）よりも相当に優れていた（表１２、図１４）。治療終了後この効果は用量依存的に続き（表１３）、７、１１群はさらに１０８日まで続いた。
【０１４６】
７日にわたる毎日注射の結果、治療を受けている期間と２１日の追跡調査期間の双方で１、４、７日の注射よりもより明白な効果が生じた（表７、８）。これは非融合アクソカイン（商標）内の比較およびＣ−アルブミン融合アクソカイン（商標）内の比較でも同じであった。
【０１４７】
効力評価は、８８日の体重変化に限定された。アルブミン融合アクソカイン（商標）は、非融合アクソカイン（商標）よりも７日間の処置スケジュールおよび１、４、７日の処置スケジュールのそれぞれ１．９および２．３倍効力が高かった（表１６）。１〜７日処置のほうが１、４、７日処置よりも効力が高かった。非融合アクソカイン（商標）に関して１．８５倍の効力、およびアルブミン融合アクソカイン（商標）に関して９．１３倍の効力が算出された。
【０１４８】
１、４、７日のアルブミン融合アクソカイン（商標）の注射は、非融合アクソカイン（商標）での７日間連続毎日注射とほぼ同じくらい効力があった。
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】ウサギ（静脈内注射）における非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の薬物動態。
【図２】ウサギ(静脈内注射）におけるＣ末端およびＮ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の薬物動態。
【図３】ウサギ(皮下注射）におけるＣ末端およびＮ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の薬物動態。
【図４】非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【図５】Ｃ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【図６】非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置した野生型マウスの体重減少曲線。
【図７】Ｃ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置した野生型マウスの体重減少曲線。
【図８】成熟Ｃ末端アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））（配列番号１）のアミノ酸配列。
【図９】成熟Ｃ末端ｒＨＡ−３ｘＦＬＡＧ−（切断可能な）アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））（配列番号２）のアミノ酸配列。
【図１０】成熟Ｎ末端アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））（配列番号３）のアミノ酸配列。
【図１１】Ｃ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））のマップ。
【図１２】Ｃ末端ｒＨＡ−３ｘＦＬＡＧ−（切断可能な）アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））のマップ。
【図１３】Ｎ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））のマップ。
【図１４】３日毎に非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））およびＣ末端融合アクソカイン（商標）で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【図１５】毎日非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））およびＣ末端融合アクソカイン（商標）で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アルブミン、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも一個の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる融合タンパク質に関する。
【発明の背景】
【０００２】
一日のエネルギー恒常性の調節は、主に基底視床下部（腹内側核、背内側核、室傍核、および視床下部外側野）における少数の個々の核［１］の中枢制御下にあるが、その他の中枢神経構造（大脳皮質、辺縁域、脳幹、脳下垂体、自律神経節前細胞、迷走神経背側複合体）ならびに関連する末梢神経構造（交感神経節前細胞）もある［２］。
【０００３】
中枢および末梢神経の調節の他に、エネルギー恒常性のバランスに関与する末梢器官は、消化管 (胃、腸）、膵臓、脂肪組織、筋組織、副腎および甲状腺である。
【０００４】
調節のプロセスは複雑で、消化管などの末梢器官が食物摂取後に視床下部で食欲増進ホルモンを減少させるホルモン（例えばＣＣＫ（コレシストキニン))を放出する。さらに、食物摂取後に脂肪組織によって放出されるレプチンには、例えば中枢に作用する主な食欲増進ホルモンの一つであるＮＰＹ（ニューロペプチドＹ）にマイナスの調節効果がある。他方、中枢に放出されるホルモンは、同様に熱産生を増加させる末梢効果を有する可能性がある（例えばβ３アドレナリン作動性アゴニスト、脱共役タンパク質（ＵＣＰ））。興味のある方は全範囲を網羅する実際の総説［１−６］を参照のこと。
【０００５】
アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））(REGENERON, Terrytown, NY, USA)は、ＣＮＴＦの変異型である。アクソカイン（商標）は 、Ｃ末端の最後の１５のアミノ酸が取り去られたＣＮＴＦの末端切断型である。分子の安定性を向上させるため、６３番のグルタミンがアルギニンに置換され、１７番の遊離システインがアラニンに置換されている［７］。
【０００６】
運動ニューロン疾患に苦しむ患者における臨床試験中、偶然にＣＮＴＦの体重減少作用が発見された［８］。さらなる研究によって、ＣＮＴＦによってもたらされる体重減少誘発作用のメカニズムがレプチンに類似し、ＣＮＴＦが食餌誘発性の肥満症にも有効である点が違うことが明らかとなった［７］。アクソカイン（商標）を用いる動物実験で、このＣＮＴＦ変異体による体重減少誘発能力がＣＮＴＦのメカニズムに類似することが確認された。
【０００７】
ＣＮＴＦは、いずれも摂食を刺激することで知られる、ＮＰＹ、アグーチ関連ペプチド（ＡＧＲＰ）およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成にマイナスの調節効果を有する。
【０００８】
ＣＮＴＦはそのままの形で血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが示された［１０］。最近になって、ＣＮＴＦは、Ｋｉの流入率が４．６０（±０．７８）×１０−４ｍＬ／ｇ分の、飽和可能な輸送系を経由して輸送されることが示された［１１］。
【０００９】
ＢＢＢは、血液から脳組織への分子の進入を防ぐ、高度に調節された関門（バリア）である［１３］。それは脳の毛細血管内皮細胞で形成されている。
【００１０】
Lambert et al.［７］から、アクソカイン（商標）がレプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ）マウスおよび野生型（食餌誘発性肥満症、ＤＩＯ）マウスに働くことが分かっている。最も有効な用量はアクソカイン（商標）が３００μｇ／体重ｋｇであったが、効果は１００μｇ／体重ｋｇでも見出された。達成した体重の減少は主に脂肪組織の減少によるものであり、除脂肪体重による減少は避けられている。
【００１１】
さらに、アクソカイン（商標）で処置したマウスにはリバウンド効果がなかったが、アクソカイン（商標）で処置せずにアクソカイン（商標）で処置した動物の摂取したものと同じ食餌を与えたマウスは（食餌を与えた群）、直ちに元の体重を取り戻した。
【００１２】
フェーズＩのデータは、GulerらによりInternational Journal of Obesityに公表されている［１４］。アクソカイン（商標）は十分に耐性を示し、脱落した被験体はなく、全ての有害事象（ＡＥ）の過半数が「軽度」とされた。用量を制限する毒性はパートＡにおいて１６μｇ／体重ｋｇでの嘔吐および悪心であった。注射部位の反応は、薬剤で治療した被験体でＡＥが最も頻繁に報告され、続いて食欲低下、悪心、頭痛、および下痢であった。口にヘルペス状の病変が見られる被験体もあった。
【００１３】
ある被験体は、アクソカイン（商標）を１μｇ／体重ｋｇ／日での処置の終了後１０日に一過性のＢｅｌｌ麻痺（顔の表情筋が麻痺する、第ＶＩＩ脳神経である顔面神経の麻痺）を被った。高用量では、Ｃ反応性タンパク質および赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の増加、および血清Ｆｅ＋の減少が見られた。用量依存型では、心拍数が増加し、体温が高くなる傾向があった。
【００１４】
１７０名の重症または病的肥満患者に関する多施設無作為化二重盲検プラシーボ対照用量比較フェーズII試験［１５］を評価すると、１２週間の治療期間に最適な量のアクソカイン（商標）（１．０μｇ／ｋｇ）を受けた患者は、プラシーボレシピエントよりも、平均して１０ポンド多く［１６］体重が減少した（ｐ＜０．００１）。
【００１５】
体重の減少は、８週間の治療群の患者へのアクソカイン（商標）の最後の投与から４ヶ月間維持された［１７、１８］。重大な有害事象は報告されなかった。最も頻繁に報告された有害事象は用量依存性、プラシーボ群を含む全ての患者に起こった軽い注射部位反応（部位の赤み）であった。アクソカイン（商標）の投与は咳および悪心と付随し、２．０μｇ／体重ｋｇ量の薬剤投与後に最も頻繁に起こった。プラシーボと比較してアクソカイン（商標）レシピエントに単純ヘルペスウイルス感染の増加は見出されなかった。比較できる比率のアクソカイン（商標）、および（５８〜７４％）、およびプラシーボ（６１％）、レシピエントは全１２週間の試験を完了した。
【００１６】
フェーズIIIプラシーボ対照試験において１４６７名のアクソカイン（商標）治療患者および５０１名のプラシーボ治療患者により以下のことが実証された。
【００１７】
アクソカイン（商標）治療は、プラシーボと比較すると、試験の双方の終末点に関して統計的優位性を達成した。
【００１８】
プラシーボ治療患者と比較して初期体重の少なくとも５％減少した割合はアクソカイン（商標）治療患者のほうが多かった（２５．１％対１７．６％、ｐ＜０．００１）。
【００１９】
アクソカイン（商標）を受けた参加者はプラシーボを受けた参加者よりも平均の体重減少が大きかった（６．２ポンド対２．６ポンド、ｐ＜０．００１）。
【００２０】
アクソカイン（商標）治療は、初期体重の少なくとも１０％減少した患者の割合（１１．３％対４．２％、ｐ＜０．００１）など、３つの二次終末点のうち２つに統計上有意な結果を達成した。
【００２１】
アクソカイン（商標）治療は一般に十分な耐性を示した。有害事象は一般に軽度から中程度として特徴づけられ、重篤または重症な有害事象の傾向は現れなかった。プラシーボと比較して最も注目すべき有害作用は、注射部位反応、悪心および咳であったが、これらは主に軽度として特徴付けられた。
【００２２】
アクソカイン（商標）に関連する体重の減少は、アクソカイン（商標）治療の約３ヶ月後に始まる抗体の産生によって制限された。しかし、アクソカイン（商標）で治療した全１４６７名のうち３０%を超える患者が一年終了までに抗体を産生しなかった。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の一つの態様では、本発明は、アルブミン、特にヒト血清アルブミン、またはアルブミン活性を有するその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化させる少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。
【００２４】
異なる態様では、ＣＮＴＦまたはアルブミンは、断片または誘導体、あるいはアクソカイン（商標）の場合はその双方、または変異体であってよい。アルブミン融合タンパク質は治療剤であってよい。
【００２５】
もう一つの態様では、本発明は、哺乳類においてＣＮＴＦの半減期を延長させる方法である。この方法は、ＣＮＴＦをアルブミンと連結させてアルブミン融合ＣＮＴＦを形成させ、かつ、アルブミン融合ＣＮＴＦを哺乳類へ投与することを伴う。一般に、アルブミン融合ＣＮＴＦの半減期は、連結型アルブミンを欠くＣＮＴＦの半減期の少なくとも２倍から少なくとも５０倍延長される。
【００２６】
ＣＮＴＦの輸送系かまたは例えば経細胞輸送などの血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する非特異的輸送系を用いることによって、脳内のアルブミン融合アクソカイン（商標）の濃度は増加すると期待される。やがてＢＢＢで、非融合アクソカイン（商標）と比較してアルブミン融合アクソカイン（商標）の血漿濃度が上昇することによって、より多くの経細胞輸送によるアルブミン融合アクソカイン（商標）の流入が起こる。
【００２７】
さらに、本発明は、哺乳類において肥満症を治療する方法を伴う。この方法は、ＣＮＴＦをアルブミンと連結させてアルブミン融合ＣＮＴＦを形成させ、かつ、アルブミン融合ＣＮＴＦを哺乳類へ投与することを含んでなる。本発明はまた、適度に高い濃度のＣＮＴＦを用いる哺乳類の治療に関連する副作用(例えば悪心、頭痛)を潜在的に最小化する方法を包含する。この方法は、前記ＣＮＴＦをアルブミンと連結させてアルブミン融合ＣＮＴＦを形成すること、および前記アルブミン融合ＣＮＴＦを前記哺乳類へ投与することを含む。
【発明の具体的説明】
【００２８】
定義
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）とは、天然に存在するＣＮＴＦの単一の生物活性を有する、天然に存在するＣＮＴＦの類似体、同族体、断片、または誘導体であるいずれの分子も意味する。好ましいＣＮＴＦはアクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））である。もう一つのＣＮＴＦ変異体（Ｓｅｒ１６６Ａｓｐ／Ｇｌｎ１６７Ｈｉｓ）が欧州特許ＷＯ９８／２２１２８号に記載されており、それは１５９番から１７８番に以下のアミノ酸配列を有する： Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe（１５９〜１７８；配列番号４）
【００２９】
アクソカイン（商標）は、ＣＮＴＦの変異型である。アクソカイン（商標）は、Ｃ末端の最後の１５のアミノ酸が取り去られたＣＮＴＦの末端切断型である。分子の安定性を高めるため、６３番のグルタミンがアルギニンに置換され、１７番の位置で遊離システインがアラニンに置換されている［７］。
【００３０】
Ｎ末端−アクソカイン（商標）は、実施例１に記載のように、アクソカイン（商標）のＣ末端とヒト血清アルブミンのＮ末端との融合体である。
【００３１】
Ｃ末端−アクソカイン（商標）は、実施例１に記載のように、アクソカイン（商標）のＮ末端とヒト血清アルブミンのＣ末端との融合体である。
【００３２】
実施例１に記載の切断可能なアクソカイン（商標）とは、ＣＮＴＦ部分とアルブミンとの間に、切断可能なまたは、Ｎ−およびＣ末端融合体の対照として用いられた非融合アクソカイン（商標）を生成するために用いられたエンテロキナーゼ切断部位を有するヒト血清アルブミンとのアクソカイン（商標）のＣ末端融合体である。
【００３３】
アルブミン
ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)およびヒトアルブミン(ＨＡ)という語は、本明細書中では同義的に用いられる。「アルブミン」および「血清アルブミン」という語はさらに広義であって、ヒト血清アルブミン(ならびにその断片および変異体)ならびにその他の種由来のアルブミン(ならびにその断片および変異体)を包含する。
【００３４】
本明細書において「アルブミン」とは、集合的に、アルブミンタンパク質またはアミノ酸配列、またはアルブミンの１以上の機能活性(例えば、生物学的に活性な) を有するアルブミン断片または変異体をさす。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンまたはその断片（ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７参照）をさし、特に、引用することによりそのまま本明細書の一部とされるＷＯ０１／７９４８０の図１５（配列番号１８）に示されるようにヒトアルブミンの成熟型、またはその他の植物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子の類似体もしくは変異体もしくはその断片をさす。
【００３５】
本願中ではＷＯ０１／７９４８０の図１５のこの配列を「ＷＯ’４８０配列」と呼ぶ。
【００３６】
本発明のアルブミン融合タンパク質に用いられるヒト血清アルブミンタンパク質は、ＷＯ‘４８０配列に関して以下の一連の点突然変異：４０７番のＬｅｕがＡｌａへ、４０８番のＬｅｕがＶａｌへ、４０９番のＶａｌがＡｌａへ、および４１０番のＡｒｇがＡｌａへ；または４１０番のＡｒｇがＡｌａへ、４１３番のＬｙｓがＧｌｎへ、および４１４番のＬｙｓがＧｌｎへ（例えば、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる国際公開Ｗ０９５／２３８５７号参照）の一方または両方を含む。別の態様では、上記の一連の点突然変異の一方または両方を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質分解切断への安定性／抵抗性を改善したもので、酵母宿主細胞で発現する組み換えアルブミン融合タンパク質の産生を増加させるものである。
【００３７】
本明細書で用いられるように、ＣＮＴＦのin vivo半減期、治療活性、または保存寿命（shelf-life）を延ばす、または拡大するのに十分なアルブミンの部分とは、非融合状態のＣＮＴＦのin vivo半減期、治療活性、または保存寿命と比較して、アルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分のin vivo半減期、治療活性、または保存寿命を安定化する、延ばす、または拡大するのに十分な長さまたは構造のアルブミンの部分をさす。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記のように全長ＨＡ配列を含み得るか、または治療活性を安定化する、または引き延ばすことのできるその１以上の断片を含み得る。このような断片は、１０以上のアミノ酸長であるか、またはＨＡ配列由来の約１５、２０、２５、３０、５０、またはそれ以上の隣接するアミノ酸を含むか、またはＨＡの特異的ドメインの一部または全部を含んでよい。
【００３８】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常なＨＡの変異体であってよい。本発明のアルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分もまた、本明細書に記載のように治療用タンパク質の変異体であってよい。「変異体」には、挿入、欠失および保存的または非保存的置換のいずれをも含み、その場合そのような変化は、治療用タンパク質の治療活性を与えるアルブミン、または活性部位または活性ドメインの１以上の腫脹の、有用なリガンド結合および非免疫原性を実質的に変更しない。
【００３９】
特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、天然に存在するヒトアルブミンの多型変異体およびヒトアルブミンの断片、例えばＥＰ３２２０９４に開示の断片など（つまり、ｎが３６９〜４１９であるＨＡ（Ｐｎ））を含んでよい。アルブミンは、どのような脊椎動物、特に哺乳類、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来するものであってよい。非哺乳類由来のアルブミンとしては、限定されるものではないが、雌鳥および鮭が挙げられる。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分はＣＮＴＦ部分とは異なる動物由来であってよい。
【００４０】
一般的に言えば、ＨＡ断片または変異体は少なくとも１００アミノ酸長となり、所望により少なくとも１５０アミノ酸長となる。ＨＡ変異体は、少なくともＨＡの一つのドメイン全体から構成されるかまたはそれを含んでよい。例えばドメイン１（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸１〜１９４）、２（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸１９５〜３８７）、３（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（ＷＯ‘４８０配列の１〜３８７）、２＋３（ＷＯ‘４８０配列の１９５〜５８５）または１＋３（ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸１〜１９４＋ＷＯ‘４８０配列のアミノ酸３８８〜５８５）である。各ドメインはそれ自体２つの相同なサブドメイン、つまり１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１および５１２〜５８５からなり、Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａ１３１５およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１残基を含んでなる柔軟なサブドメイン相互のリンカー領域を含む。
【００４１】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインまたはドメインまたはその保存的変更形態を含んでよい。融合体がサブドメインに基づくならば、隣接するリンカーのいくつかまたは全てを所望によりＣＮＴＦ部分との連結に用いてよい。
【００４２】
アルブミン融合タンパク質
本発明は、一般的に、アルブミン融合タンパク質、ならびに疾病および疾患を治療、予防または改善する方法に関する。本明細書で用いられるように、「アルブミン融合タンパク質」とは、アルブミン(またはその断片または変異体)の少なくとも一つの分子とＣＮＴＦ(またはその断片または変異体)の少なくとも一つの分子との融合によって形成されるタンパク質をさす。本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＣＮＴＦの少なくとも一つの断片または変異体およびヒト血清アルブミンの少なくとも一つの断片または変異体を含んでなり、それは互いの遺伝子の融合などによって互いに結合している(すなわち、アルブミン融合タンパク質は、ＣＮＴＦの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドがアルブミンの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドとフレーム内に連結される核酸の翻訳によって生成される)。ＣＮＴＦおよびアルブミンタンパク質は、いったんアルブミン融合タンパク質の部分となると、アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「一部」と呼ばれ得る。
【００４３】
一つの態様では、本発明はＣＮＴＦおよび血清アルブミンタンパク質を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン 融合タンパク質を提供する。もう一つの態様では、本発明はＣＮＴＦおよび血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。もう一つの態様では、本発明はＣＮＴＦおよび血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる態様では、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は血清アルブミンの成熟部分である。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、ＣＮＴＦならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる態様では、本発明はＣＮＴＦならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、アルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分は治療用タンパク質の成熟部分である。
【００４５】
さらなる態様では、本発明はＣＮＴＦの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片または変異体、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な断片または変異体を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。いくつかの態様では、本発明はＣＮＴＦの成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含んでなる、またはそれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。
【００４６】
一つの態様では、アルブミン融合タンパク質はＮ末端部分としてＨＡ、およびＣ末端部分としてＣＮＴＦを含んでなる。あるいは、Ｃ末端部分としてＨＡ、およびＮ末端部分としてＣＮＴＦを含んでなるアルブミン融合タンパク質も用いてよい。
【００４７】
その他の態様では、アルブミン融合タンパク質はアルブミンのＮ末端およびＣ末端の双方と融合したＣＮＴＦを有する。一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は同じＣＮＴＦタンパク質である。もう一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は異なるＣＮＴＦタンパク質である。もう一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は、同じ疾病、疾患または症状の治療または予防に用いてよい異なるＣＮＴＦタンパク質である。もう一つの態様では、ＮおよびＣ末端で融合した複数のＣＮＴＦタンパク質は、当技術分野で一般に複数の患者に同時に発生することが知られている疾病または疾患の治療または予防に用いてよい、異なるＣＮＴＦタンパク質である。
【００４８】
アルブミン部分がＣＮＴＦ部分のＮ末端および／またはＣ末端と融合したアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は目的のＣＮＴＦまたはペプチドをＨＡの内部領域へ挿入することによって製造してもよい。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列の中には、その末端からαへリックスの開始点の間に多数のループまたはターンが存在し、ジスルフィド結合によって安定化されている。これらのループは、ＨＡの結晶構造（ＰＤＢ識別番号１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７ｌおよび１ＵＯＲ）から決定されるように、大半は分子の本体から外へ伸び出している。このようなループは、本質的に特定の生物活性を有するアルブミン分子を生成するため、治療上有効なペプチド、特に機能的であるべき二次構造を必要とするものまたは治療用タンパク質の挿入または内部融合に有用である。
【００４９】
本発明のアルブミン融合タンパク質を生成するためにペプチドまたはポリペプチドを挿入し得るヒトアルブミン構造中のループとしては、Ｖａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６−Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２−Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７−Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６−Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０−Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２−Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９−Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２−Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８−Ｐｒｏ４８６、およびＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６が挙げられる。その他の態様では、ペプチドまたはポリペプチドは成熟ヒトアルブミン（ＷＯ’４８０配列）のＶａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、および／またはＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６ループに挿入される。
【００５０】
挿入されるペプチドは、ファージディスプレイまたは特定の生物学的な活性についてスクリーニングされた合成ペプチドライブラリーから導かれたものであってもよく、また所望の機能を含む分子の活性部分から導かれたものであってもよい。さらに、ランダムペプチドライブラリーを、特定のループ内に作成してもよく、無作為化されたペプチドを全ての可能なアミノ酸の組み合わせが表されるようにＨＡ分子の特定のループへ挿入して作成してもよい。
【００５１】
このようなライブラリーは、以下の方法のうちの一つによってＨＡまたはＨＡのドメイン断片上に生成され得る。
（ａ）ＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のペプチドループ内の無作為化されたアミノ酸突然変異。どちらも、ループ内のより多くまたは全ての残基をこの方法で突然変異することもあり得る；
（ｂ）長さＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基数である）の無作為化されたペプチドのＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のループの置換、またはその１以上のループへの挿入（すなわち、内部融合）；
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ−、Ｃ−またはＮ−およびＣ末端ペプチド／タンパク質融合体。
【００５２】
ＨＡまたはＨＡドメイン断片は、同一のＨＡまたはＨＡドメイン断片への異なる標的に対する異なるループの異なるスクリーニングからのペプチドを移植することによって、多機能にしてもよい。
【００５３】
ヒト血清アルブミンのループに挿入されるペプチドはＣＮＴＦペプチドまたはそのペプチド断片またはペプチド変異体である。より具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループに挿入された少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０アミノ酸長のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＮ末端と融合した少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０アミノ酸のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＣ末端と融合した少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０アミノ酸のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。
【００５４】
一般に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのＨＡ由来領域および１つのＣＮＴＦタンパク質由来領域を有してよい。しかし、各タンパク質の複数の領域を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作成してもよい。同様に、１以上のＣＮＴＦを用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作成してもよい。例えば、ＣＮＴＦをＨＡのＮおよびＣ末端双方と融合させてもよい。そのような配置では、ＣＮＴＦ部分は同じまたは異なるＣＮＴＦ分子であってよい。二機能性のアルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＹ−ＨＡ−ＸまたはＸ−Ｙ−ＨＡまたはＨＡ−Ｘ−ＹまたはＨＡ−Ｙ−Ｘ−ＨＡまたはＨＡ−Ｘ−Ｘ−ＨＡまたはＨＡ−Ｙ−Ｙ−ＨＡまたはＨＡ−Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＸ−ＨＡ−Ｙ−ＨＡまたは複数の組み合わせおよび／またはＨＡ配列内のどの位置へのＸおよび／またはＹの挿入として表され得る。
【００５５】
二機能性または多機能性アルブミン融合タンパク質は、機能、半減期などに応じて種々の割合で製造してよい。
【００５６】
二機能性または多機能性アルブミン融合タンパク質はまた、融合体のＣＮＴＦ部分をＨＡの反対の末端でタンパク質またはペプチドを介して標的器官または細胞種へ標的化するよう製造してよい。
【００５７】
公知の治療用分子の融合体の代わりとして、ＨＡのＮ−、Ｃ−またはＮ−およびＣ末端、または一般的に６、８、１２、２０または２５またはＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸（ａａ）であり、ｎは残基数に等しい）無作為化アミノ酸のＨＡのドメイン断片との融合体として構築されたライブラリーのスクリーニングによって、全ての可能なアミノ酸の組み合わせが表されるようにペプチドを得ることもあり得る。このアプローチの特に有利な点は、ペプチドがＨＡ分子上でin situ選択され得ること、従って、ペプチドの特性が、その後にＨＡと結合する、他のいずれかの方法によって誘導されたペプチドの場合など、むしろ可能性として修飾されるものに関して選択され得ることである。
【００５８】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、部分間の物理的分離をより大きくするために融合部分間にリンカーペプチドを含んでよく、従って例えば、その同族受容体との結合のため、ＣＮＴＦ部分の接近能を最大化することもあり得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかより強固であるようにアミノ酸で構成してもよい。
【００５９】
従って、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、次式Ｒ２−Ｒ１；Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１［式中Ｒ１は少なくとも１種類の治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列（その断片または変異体を含む）であり、必ずしも同一の治療用タンパク質である必要はなく、Ｌはリンカーであり、Ｒ２は血清アルブミン配列（その断片または変異体を含む）である］を有し得る。リンカーの例としては、（ＧＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号８）または（ＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号９）または（ＧＧＳ）Ｎ、式中、Ｎは１以上の整数であり、式中Ｇはグリシンを表し、Ｓはセリンを表す。Ｒ１が２以上の治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列である場合、これらの配列は所望によりリンカーによって接続してよい。
【００６０】
さらなる態様では、ＣＮＴＦタンパク質を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンと融合していない同じＣＮＴＦの保存寿命またはin vivo半減期または治療活性と比較して、保存寿命またはin vivo半減期または治療活性が延長されている。保存寿命とは、一般的に、ＣＮＴＦタンパク質の治療活性が溶液またはその他の保存用の処方形態で治療活性を過度に失うことなく安定している期間をさす。多くのＣＮＴＦタンパク質はその非融合状態で極めて不安定である。下記のように、これらのＣＮＴＦタンパク質の一般的な保存寿命は、本発明のアルブミン融合タンパク質へ組み込むことによって著しく延長された。
【００６１】
保存寿命の「延長された」（prolonged）または「拡大された」（extended）本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ保存および取り扱い条件に付された標準物質と比較して大きな治療活性を示す。標準物質は、非融合全長ＣＮＴＦタンパク質であってよい。アルブミン融合タンパク質のＣＮＴＦ部分が類似体、変異体、そうでなければ変更形態であるか、またはそのタンパク質の完全な配列を含まない場合、治療活性の延長は、またはその類似体、変異体、変更されたペプチド、または不完全配列の非融合同等物に匹敵する。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準物質と同じ保存および取り扱い条件に付された場合に、所定の時点で比較すると、治療活性の約１００％以上、または標準物質の治療活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％または２００％以上を保持する可能性がある。しかし、治療活性はＣＮＴＦタンパク質の安定性に依存し、１００％以下である可能性もある。
【００６２】
保存寿命はまた、保存開始時点の治療活性をノーマライズして保存後に残存する治療活性に関して評価してもよい。延長されたまたは拡大された治療活性によって示される保存寿命の延長されたまたは拡大された本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療活性の約５０％以上を保持する可能性があり、同じ条件に付された場合の同等な非融合ＣＮＴＦの治療活性の約６０％、７０％、８０％、または９０％またはそれ以上を保持する可能性がある。
【実施例】
【００６３】
実施例１
アルブミン融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の製造
ＣＮＴＦを、プライマー：
【化１】
をエクソン１に、そしてプライマー：
【化２】
をエクソン２に用い、それぞれ標準条件を用いて２つのエクソンを増幅してヒトゲノムＤＮＡからクローン化した。両断片を標準条件下で連結した後、プライマー：
【化３】
を用いてＰＣＲによって再増幅し、ベクターｐＣＲ４(Invitrogen)へクローニングした。Lambertら(PNAS 98: 4652-4657; 2001)に開示の通りアクソカイン（商標）を生成するため、位置指定突然変異誘発を用いてＣ１７Ａ（ＴＧＴ->ＧＣＴ）およびＱ６３Ｒ（ＣＡＧ->ＡＧＡ）突然変異を導入した。ＤＮＡシーケンシングも、サイレントＴ->Ｃ置換Ｖ８５Ｖ（ＧＴＴ->ＧＴＣ）の存在を明らかにした。
【００６４】
Ｃ末端ｒＨＡ−ＧＳ−アクソカイン（商標）融合体を作成するため、アクソカイン（商標）ｃＤＮＡを、単一の標準オリゴヌクレオチドプライマーＭＨ３２:
【化４】
およびＭＨ３５：
【化５】
を用いる突然変異誘発ＰＣＲによってヒトアルブミンをコードするｃＤＮＡと連結させ、１４アミノ酸ＧＳ−（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）ペプチドスペーサーを導入した。成熟ｒＨＡ−ＧＳ−アクソカイン（商標）融合体のアミノ酸配列を図８に示す。
【００６５】
Ｃ末端ｒＨＡ−３×ＦＬＡＧ−アクソカイン（商標）（切断可能なアクソカイン（商標））融合体を作成するため、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーＭＨ３２：
【化６】
およびＣＦ８３：
【化７】
を用いる突然変異誘発ＰＣＲによって、アクソカイン（商標）ｃＤＮＡを、ヒトアルブミンをコードするｃＤＮＡと連結させ、２２アミノ酸３×ＦＬＡＧ（−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−）ペプチドスペーサー(Sigma-Aldrich Company Ltd.)をアルブミンとアクソカイン（商標）との配列間へ導入した。成熟Ｃ末端ｒＨＡ３×ＦＬＡＧ−アクソカイン（商標）融合体のアミノ酸配列を図９に示す。ＷＯ９０／０１０６３に開示のＨＳＡ／ＭＦ□−１融合体分泌リーダー配列を準備して確実に融合タンパク質を分泌するようにする。
【００６６】
Ｎ末端アクソカイン（商標）−ＧＳ−ｒＨＡ融合体を作成するため、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーＭＨ３３：
【化８】
およびＭＨ３６：
【化９】
を用いる突然変異誘発ＰＣＲによってアクソカイン（商標）ｃＤＮＡを、ヒトアルブミンをコードするｃＤＮＡと連結させ、各１４のアミノ酸ＧＳ（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）ペプチドスペーサーをアクソカイン（商標）とアルブミンとの配列間に導入した。成熟アクソカイン−ＧＳ−ｒＨＡ融合体のアミノ酸配列を図１０に示す。
【００６７】
ｒＨＡ−ＧＳ−アクソカイン（商標）配列、ｒＨＡ−３×ＦＬＡＧ−アクソカイン（商標）配列およびアクソカイン（商標）−ＧＳ−ｒＨＡ配列のマップを、それぞれ図１１、１２および１３に示す。
【００６８】
酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターから、それぞれ既にＷＯ００／４４７７２に開示され、Sleep, D., et al. (1991)Bio/Technology 9,183-187に記載されている適当な転写プロモーターおよび転写ターミネーター配列がもたらされた。適当なベクター配列は、一般にＥＰ−Ａ−２８６４２４に開示され、Sleep, D., et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187に記載されている「分解」プラスミドｐＳＡＣ３５によりもたらされた。
ｒＨＡ融合体が発現し、振盪フラスコ培養発現レベルが決定された。
【００６９】
実施例２
精製
Ｃ末端アクソカイン（商標）は、高いレベルで切断された材料を含んでいた。それは標準のｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件（米国特許第６，０３４，２２１号参照）を用いて精製されたが、ネガティブモードであり、これにより融合体は透過物中にあった。透過物をｐＨ８および２．５ｍＳ・ｃｍ−１に調節し、１５ｍＭ四ホウ酸カリウム中で平衡化した標準のｒＨＡ ＤＥ−ＦＦにロードした。ＳＰ−ＦＦについては、ＤＥＦＦをネガティブモードで操作した。ＤＥ−ＦＦ透過物の伝導率は１５ｍＳ・ｃｍ−１に増加し、次に、この材料を、過剰量の５０ｍＭオクタノエートでの溶出による標準的なｒＨＡ ＤＢＡクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、溶出液を濃縮し、５ｍＭリン酸ｐＨ８．３でダイアフィルトレーションした。
【００７０】
Ｎ末端アクソカイン（商標）は、切断された材料をいくらか含んでいた。それは標準のｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件を用いて精製されたが、ネガティブモードであり、それにより、融合体が透過物中にあった。この透過物をｐＨ８および２．５ｍＳ・ｃｍ−１に調節し、１５ｍＭ四ホウ酸カリウム中で平衡化した標準のｒＨＡ ＤＥ−ＦＦに装填した。この場合は、融合体の比率を固定し、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む標準の溶出液で溶出した。溶出液の伝導率は１５ｍＳ・ｃｍ−１まで減少し、次に、この材料を、過剰量の５０ｍＭオクタノエートでの溶出による標準的なｒＨＡ ＤＢＡクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、溶出液を濃縮し、５ｍＭリン酸ｐＨ８．３でダイアフィルトレーションした。
【００７１】
切断可能なアクソカイン（商標）は、高いレベルで切断された材料を含んでいた。それは標準のｒＨＡ ＳＰ−ＦＦ条件を用いて精製されたが、ネガティブモードであり、それにより融合体が透過物中にあった。透過物をｐＨ８および２．５ｍＳ・ｃｍ−１に調節し、１５ｍＭ四ホウ酸カリウム中で平衡化した標準のｒＨＡ ＤＥ−ＦＦにロードした。ＳＰ−ＦＦについては、これをネガティブモードで操作した。透過物の伝導率は１５ｍＳ・ｃｍ−１に増加し、この材料を、過剰量の５０ｍＭオクタノエートでの溶出による標準的なｒＨＡ ＤＢＡクロマトグラフィーを用いて精製した。次に、この材料を濃縮し、切断バッファー中へダイアフィルトレーションした。室温で一晩切断を行い、Ｅｋａｐｔｕｒｅゲルを用いてエンテロキナーゼを除去した。次に、この材料を濃縮し、５ｍＭリン酸ｐＨ８．３でダイアフィルトレーションした。Wurde hier nicht erneut gereinigt?
【００７２】
実施例３
薬物動態
非融合アクソカイン（商標）に対するＮ末端およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の半減期およびバイオアベイラビリティの評価、ならびに非融合アクソカイン（商標）に対するＮ末端およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の更なる薬物動態学的なパラメータの評価。
【００７３】
投与プロトコール：
試験品１： 非融合アクソカイン（商標）
適用量： ０．３３ｍＬ／ｋｇ
単回用量／経路： １０μｇ／ｋｇ 静脈内または皮下
回数： １回（ｔ＝０）
試験品２： Ｎ末端アルブミン−融合アクソカイン（商標）
適用量： ０．３３ｍＬ／ｋｇ
単回用量／経路： ４０μｇ／ｋｇ 静脈内または皮下
回数： １回（ｔ＝０）
試験品３： Ｃ末端 アルブミン-融合アクソカイン（商標）
適用量： ０．３３ｍＬ／ｋｇ
単回用量／経路： ４０μｇ／ｋｇ 静脈内または皮下
回数： １回（ｔ＝０）
【００７４】
試験計画
【表１】
試験動物
種／系統： ウサギ
性別／齢： 雄１２匹、雌１２匹；３〜４ヶ月
総数： ２４
供給者： Fa. Bauer (Neuenstein-Lohe, Germany)
【００７５】
動物モデル
０日に、グループあたり２匹の雄および２匹の雌のウサギに、切断可能なアクソカイン（商標）（１μｇ／ｋｇ）、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）（４０μｇ／ｋｇ）、またはＮ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）（４０μｇ／ｋｇ）を一回の静脈内または皮下注射によって投与した。それぞれの被験物質の静脈内投与後、ベースライン、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間（１日）、４８時間（２日）、７２時間（３日）、７日、９日、１１日、および１４日に、ならびに皮下注射後、ベースライン、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間（１日）、４８時間（２日）、７２時間（３日）、５日、７日、９日、１１日および１４日に、それぞれの抗原レベルを測定するために血液サンプルを採取した。アクソカイン（商標）およびアルブミン融合アクソカイン（商標）の血漿レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７６】
薬物動態学的（ＰＫ）変数：
消失半減期、１４日までの血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−１４）、最大濃度（Ｃｍａｘ）。無限大までの推定濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）、最大濃度時間（ｔｍａｘ）、平均滞留時間、吸収および分布の半減期（該当する場合）、分布のクリアランス量。
【００７７】
分析方法
非融合アクソカイン（商標）血漿濃度のＥＬＩＳＡ測定を、モノクローナルマウス抗ｈｕ ＣＮＴＦ抗体(R & D Systems, クローン番号２１８０９．１１１）とビオチニル化したポリクローナルヤギ抗ｈｕ ＣＮＴＦ抗体(R & D Systems, カタログ番号ＢＡＦ２５７）とを組み合わせて用いて行った。ＥＬＩＳＡキットの説明書に従ってヒトＣＮＴＦを標準物質として用いた。
【００７８】
アルブミン融合アクソカイン（商標）血漿濃度のＥＬＩＳＡ測定を、モノクローナル抗ｈｕアルブミン抗体(Aventis Behring GmbH, Laboratory) とビオチニル化したポリクローナルヤギ抗ｈｕ ＣＮＴＦ抗体(R & D Systems, カタログ番号ＢＡＦ２５７）と組み合わせて用いて行った。それぞれのアルブミン融合アクソカイン（商標）は標準曲線の生成に役立った。
【００７９】
市販のヒトＣＮＴＦ ＥＬＩＳＡ(R & D Systems)を用いると、アルブミン融合アクソカイン（商標）を検出するのは不可能であった。おそらく、アルブミンが抗ＣＮＴＦ抗体の結合に立体的に干渉するためであろう。
【００８０】
解決法として、抗アルブミンモノクローナル抗体を捕獲用抗体として用い、内部抗アルブミンアッセイを確立し、この抗体はプレートに結合した。次の工程として、R & D Systemsより得た市販のＣＮＴＦ抗体をアルブミン融合アクソカイン（商標）の検出用抗体として用いた。
【００８１】
個々の血漿レベル分析
Ｃ末端およびＮ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）および非融合アクソカイン（商標）の血漿濃度−時間プロフィールを、非線形回帰を用いて動物ごとに分析した。このデータを最小２乗法により指数関数モデルに当てはめた。静脈内投与の後のプロフィールには、オープン２コンパートメントモデルを用いた。皮下投与の後のプロフィールには、一次インプットとラグタイムを持つオープン１コンパートメントモデルを用いた。静脈内投与モデルには、１／（推定濃度）２のウエイト係数を適用した。
【００８２】
ＡＵＣはａ）最後の測定値（ＡＵＣ０−１４）まで線形台形公式を用いること、およびｂ）１４日と無限大までの間の期間を推定することによって（ＡＵＣ０−１４）を満たすことで算出した。
【００８３】
概要および比較分析
個々のＰＫ結果を処置および適用経路ごとに記述的に要約した（最小値、中央値、最大値、平均値、標準偏差）。
【００８４】
二元配置分散分析を、消失半減期、ＡＵＣおよびＣｍａｘ（全て対数変換した）について行った。固定因子は性別および処置群であった。処置群間の適当な対比を評価した。不均等分散も考慮に含めた。
【００８５】
この分析の上で、Ｉｎ（半減期）、Ｉｎ（ＡＵＣ）およびＩｎ（Ｃｍａｘ）は各々正規分布に従うことを前提とした。
【００８６】
消失半減期を物質間で比較し、ＡＵＣおよびＣｍａｘの点からバイオアベイラビリティを、両側９０％信頼区間を用い、αレベル０．１でアルブミン融合アクソカイン（商標）の投与経路群間で比較した。
【００８７】
結果
各時点でのアクソカイン（商標）濃度の平均値および標準偏差を、静脈内処置非融合アクソカイン（商標）群について図１に、静脈内処置アルブミン融合アクソカイン（商標）群について図２に、皮下処置アルブミン融合アクソカイン（商標）群について図３に示す。皮下処置非融合アクソカイン（商標）群に関しては、濃度測定はできなかった。
【００８８】
静脈内から非融合アクソカイン（商標）で処置された動物では、注射後４時間にレベルは１ｐｇ／ｍＬを下回った。アルブミン融合アクソカイン（商標）群では、このレベルは７日間１ｎｇ／ｍＬを上回った。アルブミン融合アクソカイン（商標）産物で皮下処置した動物では、このレベルは約１日後にピークに達し、７日間１ｎｇ／ｍＬを上回った。表２に静脈内処置群、表３に皮下処置群についての薬物動態学的な結果を示す。非融合アクソカイン（商標）の結果はアルブミン融合アクソカイン（商標）群の同じ単位へ変換されているが、半減期および平均滞留時間を除いては、検定法の違いからこれらとは比較できない。
【００８９】
【表２】
【００９０】
【表３】
【００９１】
表４は、消失半減期に関する分散分析の結果を示す。静脈内注射後の非融合およびアルブミン融合アクソカイン（商標）間の差は非常に有意であった。動物の性別は半減期に有意な影響を与えなかった。
【００９２】
【表４】
【００９３】
表５は、絶対的バイオアベイラビリティに関する分散分析の結果を示す。双方のアルブミン融合産物に対して、２つの投与経路間の差は、消失半減期に関して統計上有意ではなかった。ＡＵＣおよびＣｍａｘに関する差は非常に有意であった。
【００９４】
【表５】
【００９５】
非融合アクソカイン（商標）の濃度曲線下面積および最大血漿レベルの値は、直接ＮおよびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の値と比較はできない。これに対して、半減期の比較は妥当である。
【００９６】
双方のアルブミン融合アクソカイン（商標）製剤は、非融合アクソカイン（商標）と比較して、静脈内投与後の血漿からの排出の延長を顕著に示した。Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）は、非融合アクソカイン（商標）よりも７２倍長い平均消失半減期を示した。Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）は、非融合アクソカイン（商標）よりも４８倍長い平均消失半減期を示した。
【００９７】
ＡＵＣに関して、皮下注射後の絶対的バイオアベイラビリティは、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）に対して７６％、Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）に対して２３％であった。非融合アクソカイン（商標）の血漿レベルは皮下適用後に検出限界以下であったので、静脈内適用との比較はできなかった。
【００９８】
実施例４
薬力学
この実験の目的は、プラシーボまたは非融合アクソカイン（商標）と比較した、ＮおよびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）のレプチン欠損症または食餌誘発性肥満マウスでの体重の減少への有効性を評価することであった。
【００９９】
薬力学動物試験の研究デザイン、パートＩ
この試験は、合計７０匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）、および４１匹の雄および４１匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを含む、無作為化一部盲検平行１３アーム試験（２つの実験設定での試験（レプチン欠損症誘発性肥満症対食餌誘発性肥満症）としてデザインされた。
【０１００】
試験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）マウスに約３ヶ月間標準餌を与えた。この間、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）マウスはレプチン欠損症に関連して食餌摂取が制御されないため体重が強く増加した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、脂肪分４５％の高カロリー食を摂食することによって肥満症が誘発された。治療的処置に先行するこの肥満症誘発相の間、体重を週１回記録した。平均体重がベースラインの少なくとも１３０％まで増加したら、試験物質を用いる処置を開始した。試験物質（非融合アクソカイン（商標）、アルブミン融合アクソカイン（商標）、プラシーボ）を毎日皮下注射によって７日間にわたり投与した。治療相の間、体重を毎日測定した。ベースラインおよびプラシーボと比較した体重減少の平均を計算して試験物質の相対的効果を評価した。
【０１０１】
試験薬剤および用量
試験品１： プラシーボ（ｐＨ８．３の５ｍＭリン酸緩衝液）
エンドトキシン含量： ０．００７ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 適合せず
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 適合せず／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１０２】
試験品２： 非融合アクソカイン（商標）
エンドトキシン含量： １４．９ＥＵ／ｍ２Ｌ
保存濃度： ０．１ｍｇ／ｍＬ
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 表１および２に従う／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１０３】
被験品３： Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）
エンドトキシン含量： １．８ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： ５ｍｇ／ｍＬ
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 表１および２に従う／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１０４】
被験品４： Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）
エンドトキシン含量： ６４ＥＵ／ｍＬおよび３２ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： ０．２ｍｇ／ｍＬ
適用量： ２５０μｌａ
一用量／経路： 表１および２に従う／皮下
回数： ７日間連日注射
ａ処置日１日（８３日）に全てのマウスに試験物質２５０μｌを投与し、次に投与量を調節することによって投薬を体重の変化に適応させた。１３群（１２００μｇ／ｋｇ Ｃ末端アクソカイン（商標））のマウスには８３日に約３９０μｇを投与した。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
ｏｂ／ｏｂならびに野生型マウスの双方に対し、以下の用量減少が必要となった。
Delta製非融合アクソカイン（商標）：１〜２日に３００μｇ／ｋｇから３〜７日に２００μｇ／ｋｇ
Ｎ、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）：１〜２日に２８０μｇ／ｋｇから３〜７日に２００μｇ／ｋｇ
Ｎ、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）：１〜２日に１２００μｇ／ｋｇから３〜７日に８００μｇ／ｋｇ
無作為化は、無作為化リストに従い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して個別に行った。マウスを無作為化してケージに入れた後、ケージを無作為化して処置した。
有効性変数：体重(０日から７日まで毎日測定）
【０１０８】
分析方法
覚醒動物の体重を測定して体重を記録した。
【０１０９】
統計手法
一次有効性変数：７日と０日、および１０２日までの体重差。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）とＣ５７ＢＬ／６Ｊとに分類したマウスの非融合アクソカイン（商標）、Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）、およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）への用量−反応関係を、分散モデルの一分析法の範囲内で分析した。
【０１１０】
最小有効量を確認するための、対比（例えば、ヘルマート対比または逆のヘルマート対比）を用いる、プラシーボを含む種々の用量の逐次比較。差異に対する両側ｔ検定および両側９５％信頼区間を用いる等モル用量ペアの比較。
【０１１１】
Ｎ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）およびＣ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）の非融合アクソカイン（商標）に関する全体的な評価を、対数変換した用量での平行線検定によって行った。導かれた有効性を９５％信頼区間で補った。
【０１１２】
結果
一次エンドポイントの統計的分析
エンドポイント：８２日から９１、９２、９３、９４、９５、９６、１０２日までの体重変化（ｇ）
統計：順序仮説群(oederd hypotheses families)のＡＮＯＶＡ内のＦ検定。９２日に開始し、もし対応するＦ検定が有意であるとすれば、ある仮定は拒絶され、その前の仮定も拒絶される。
参照文献: Bauer P: Multiple tests in clinical trials. Statistics in Medicine, 10:871 890, 1991
【０１１３】
ｏｂ／ｏｂマウスの体重減少
図４、５、６および７は、レプチン欠損マウスでの等モル用量の非融合アクソカイン（商標）とアルブミン融合アクソカイン（商標）を比較している。
【０１１４】
要約すれば、薬力学的データは、レプチン欠損マウスにおいてアルブミン融合アクソカイン（商標）が、投与量群１１、１２、および１３に対して非融合アクソカイン（商標）よりも一層統計上有意であることを示している。野生型マウスにおいては、アルブミン融合アクソカイン（商標）は、１２群で非融合アクソカイン（商標）よりも一層統計上有意である。
【０１１５】
薬力学的動物試験の研究デザイン、パートII
本研究は本来、合計８２匹の雌Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）マウス、および４１匹の雄および４１匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを含む、２つの実験設定（レプチン欠損症誘発性肥満症対食餌誘発性肥満症）での無作為化一部盲検平行１１アーム試験としてデザインされた。非融合アクソカイン（商標）のアベイラビリティの制限のため、選択されたレプチン欠損マウスの処置群のみが本研究の処置相に含められた（表８）。
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
スケジュール
Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂマウスに８０日まで標準餌を与え、体重は増加した。非融合アクソカイン（商標）またはＣ−アルブミン融合アクソカイン（商標）のいずれかでの連続７日間（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７日）かまたは１、４、７日（８１、８４、８７日）のみのいずれかでの処置は、８１日に開始した。
【０１１８】
処置停止後２１日（１０８日）まで体重を評価した。体重変化およびそれに関する分析は８１日の体重に関連づけた。
対応する時点を次の表にまとめる。
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
試験品の投与
試験品１： プラシーボ（ｐＨ８．３の５ｍＭリン酸緩衝液）
製造者： Aventis Behring (Laboratory Dr. H. Metzner)
バッチ番号： −
エンドトキシン含量： 実施せず
保存濃度： 適合せず
適用量： ５μｌ／ｇ
一用量／経路： 適合せず／皮下
回数： ７日間連日注射
【０１２１】
試験品２： 非融合アクソカイン（商標）(エンテロキナーゼ切断型
Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（登録商標）)
製造者： Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D. Sleep
バッチ番号： １６７５＃４０
エンドトキシン含量： １８ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 約０．１ｍｇ／ｍＬ (標準物質としてＣＮＴＦと比較した、
クーマシー染色でのＳＤＳ ＰＡＧＥに基づく仮定、別表Ｂ）
適用量： ５μｌ／ｇ
一用量／経路： 表１に従う／皮下
回数： １、４、７日に単回注射または７日間連日注射
【０１２２】
試験品３： Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）
製造者： Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D. Sleep/
Aventis Behring GmbH, Laboratory Dr. H. Metzner
バッチ番号： ０９１００２
エンドトキシン含量： １６ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 約０．１ｍｇ／ｍＬ (標準物質としてＨＳＡと比較した、
クーマシー染色でのＳＤＳ ＰＡＧＥに基づく仮定、別表Ｂ）
適用量： ５μｌ／ｇａ
一用量／経路： 表１に従う／皮下
回数： １、４、７日に単回注射または７日間連日注射
【０１２３】
試験品４： 室温で１４日保存したＣ末端アルブミン融合アクソカイン
（商標）
製造者： Delta Biotechnology Ltd., Laboratory Dr. D. Sleep/
Aventis Behring GmbH, Laboratory Dr. H. Metzner
バッチ番号： ０９１００２
エンドトキシン含量： １６ＥＵ／ｍＬ
保存濃度： 約０．４ｍｇ／ｍＬ (標準物質としてＨＳＡと比較した、
クーマシー染色でのＳＤＳ ＰＡＧＥに基づく仮定、別表Ｂ)
適用量： ５μｌ／ｇａ
一用量／経路： 表１に従う／皮下
回数： １、４、７日に単回注射または７日間連日注射
ａ全てのマウスに試験物質５μｌを投与した。但し、Ｃ末端アクソカイン（商標）３６００μｇ／ｋｇで処置したマウスには１０μｌ／ｇを投与した。
【０１２４】
動物モデル
Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂマウスに１２週間標準餌を与えた。この間、マウスはレプチン欠損症に関連して食餌摂取が制御されないため体重が強く増加した。治療的処置に先行するこの肥満症誘発相の間、動物の体重を測定しなかった４９〜６６日を除いて体重を週１回記録した。試験物質(アクソカイン（商標）、Ｃ末端アルブミン融合アクソカイン（商標）、プラシーボ)を、毎日皮下注射によって７日間にわたり投与するか、または１、４、７日の処置日に一回ずつ３回注射した。処置相の間、体重を毎日測定した。その後、１４日間体重を一日おきに記録し(すなわち、１週間につき３回)、処置後２１日(処置開始後２８日=調査日１０８日)にもう一回記録した。ベースラインおよびプラシーボと比較した体重減少の平均を計算して試験物質の相対的効果を評価した。
【０１２５】
無作為化
無作為化リストに従って無作為化を行った。マウスを無作為化してケージに入れた後、ケージを無作為化して処置した。
【０１２６】
有効性変数
主変数：処置１日（調査日８１日）から治療７日（調査日８８、８７、８６、８５、８４、８３、および８２日）の体重変化（ｇ）。
副変数：処置開始後２８日の体重（調査日１０８日）。調査日８１日から８９、９１、９４、９６、９８、１０１、１０８までの体重変化（ｇ）。
【０１２７】
分析方法
覚醒動物の体重を測定して体重を記録した。
【０１２８】
統計方法
順序仮説群のＡＮＯＶＡ内のＦ検定。８８日に開始し、その後下向きに進み、もし対応するＦ検定が有意（ｐ≦０．０５）であるとすれば、ある仮説は棄却され、その前の仮説も棄却される（ｐ≦０．０５）。同じ手順を８９日から１０８日まで上向きに用いた。この手順は、日に関係する７つの仮説からなる一連の比較の中で複数のレベル０．０５を制御した。
【０１２９】
４ブロックからなる分析を行った。表１０および１１にプラシーボと対照した試験の試験判定を集計した、すなわち、モデルの妥当性をチェックするため、有効な処置群（２〜１１群）をプラシーボ（１群）と比較した。等モル用量の分析を表１２および１３に示す一方、処置スケジュールを表１４および１５で比較している。最終的に、反応基準の代わりとなる８８日の体重変化での対数用量についての平行線検定を用いる効力評価を表１６に要約している。検定アプローチの適合性に関する試験（すなわち、直線性、平行度）はなされていない。
【０１３０】
結果
体重への影響
研究処置は８１日から８７日まで投与された。
プラシーボとの比較
試験物質を投与した全ての群が８２日〜１０１日の間にプラシーボに対して有意な差を示した(表１０および１１）。
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】
【表１１】
【０１３３】
等モル用量の比較
【表１２】
【０１３４】
【表１３】
【０１３５】
処置スケジュールの比較
【表１４】
【０１３６】
【表１５】
【０１３７】
効力評価
【表１６】
【０１３８】
融合タンパク質を皮下投与している間、ウサギで調査されたようにアルブミン融合アクソカインの血漿半減期の延長(非融合アクソカインよりも７２倍長い)が見出されたことは極めて驚くべきことである。第一に、皮下投与は吸収を減じることが知られているがここでは事実と異なっている。第二に、ヒト血漿タンパク質の血漿半減期は動物では劇的に減少することがあるということも一般に知られているので、この延長はヒトにおいてはより一層明白となることを示している。これは、非融合アクソカインを毎日適用することに比べてほぼそれに見合う効果のある融合タンパク質の３日おきの投与が可能であるという、マウスにおける発明者らの薬力学的知見によって確認された。結果として、発明者らは融合タンパク質をおそらくヒトに週１回またはさらに長い間隔で投与することが可能ではないかと推測する。ＣＮＴＦに対する抗体の産生率が減少することもあり得るため、さらなる効果および安全性は増加する可能性がある。
【０１３９】
臨床所見
動物の６匹が時期尚早に研究から離脱し、下記治療完了後全てが離脱した：
【０１４０】
８４日に開始した８群、１０群および１１群全ての動物（毎日１２００μｇ／ｋｇ Ｃ−ＡＦＰまたは３６００μｇ／ｋｇ Ｃ−ＡＦＰ ３回投与）は、動作が鈍く、毛並みが乱れ、皮膚が全身にわたり発赤し、全身症状が低下した。１２匹の動物のうち１０匹までが１２００μｇを投与され、３６００μｇで処置された全ての動物がその後２日にわたり出血性の下痢に罹り、水分摂取の減少も伴って、重い脱水症状となった。
【０１４１】
従って、８９日に１０群、１１群から各一匹の動物、９１日に８群の３匹の動物を死の直前に安楽死させた。さらに１０群の動物１匹が９６日に死亡した。
剖検で、重い肥満症、脱水症状、ならびに肝臓および腎臓の脂肪変性が、拡大した腸とともに試験した動物全てに見出された。
【０１４２】
結論
治療開始（８１日）に先立って、合計７０匹の動物が利用可能であり、プラシーボ群に１０匹（１群）、そして１０の有効な治療群の各々に６匹であった。合計６匹の動物が安楽死するか、研究途中に死亡し、全ては処置完了後に死亡した。つまり、８９日に１０、１１群から各一匹の動物が、９１日に８群の３匹の動物が、そして最後に１０群でさらにもう一匹の動物が９６日に死亡した。これらの事例ならびに見出された臨床症状は、最も用量の多い群に限定され、従って処置に関係があると考えられる。
【０１４３】
プラシーボで処置した動物の体重は、８１日から８８日の間ほぼ一定（８８日の平均体重変化：−０．４％）であったが、さらなる試験の過程で１０８日までに体重の増加（１０８日の平均変化：７．２％）が認められた。
【０１４４】
有効な物質での処置（２〜１１群）はプラシーボと比較して有意な用量依存性の体重減少をもたらした（表１０）。処置完了後２１日以内にも、有効成分で処置した動物はプラシーボ動物よりも有意に体重減少が高いことを示した（表１１）。
【０１４５】
等モル用量で比較した場合、アルブミン融合アクソカイン（商標）は、たとえどちらの処置スケジュールを適用したとしても、体重減少に関して非融合アクソカイン（商標）よりも相当に優れていた（表１２、図１４）。治療終了後この効果は用量依存的に続き（表１３）、７、１１群はさらに１０８日まで続いた。
【０１４６】
７日にわたる毎日注射の結果、治療を受けている期間と２１日の追跡調査期間の双方で１、４、７日の注射よりもより明白な効果が生じた（表７、８）。これは非融合アクソカイン（商標）内の比較およびＣ−アルブミン融合アクソカイン（商標）内の比較でも同じであった。
【０１４７】
効力評価は、８８日の体重変化に限定された。アルブミン融合アクソカイン（商標）は、非融合アクソカイン（商標）よりも７日間の処置スケジュールおよび１、４、７日の処置スケジュールのそれぞれ１．９および２．３倍効力が高かった（表１６）。１〜７日処置のほうが１、４、７日処置よりも効力が高かった。非融合アクソカイン（商標）に関して１．８５倍の効力、およびアルブミン融合アクソカイン（商標）に関して９．１３倍の効力が算出された。
【０１４８】
１、４、７日のアルブミン融合アクソカイン（商標）の注射は、非融合アクソカイン（商標）での７日間連続毎日注射とほぼ同じくらい効力があった。
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】ウサギ（静脈内注射）における非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の薬物動態。
【図２】ウサギ(静脈内注射）におけるＣ末端およびＮ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の薬物動態。
【図３】ウサギ(皮下注射）におけるＣ末端およびＮ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））の薬物動態。
【図４】非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【図５】Ｃ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【図６】非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置した野生型マウスの体重減少曲線。
【図７】Ｃ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））で処置した野生型マウスの体重減少曲線。
【図８】成熟Ｃ末端アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））（配列番号１）のアミノ酸配列。
【図９】成熟Ｃ末端ｒＨＡ−３ｘＦＬＡＧ−（切断可能な）アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））（配列番号２）のアミノ酸配列。
【図１０】成熟Ｎ末端アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））（配列番号３）のアミノ酸配列。
【図１１】Ｃ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））のマップ。
【図１２】Ｃ末端ｒＨＡ−３ｘＦＬＡＧ−（切断可能な）アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））のマップ。
【図１３】Ｎ末端融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））のマップ。
【図１４】３日毎に非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））およびＣ末端融合アクソカイン（商標）で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【図１５】毎日非融合アクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ（商標））およびＣ末端融合アクソカイン（商標）で処置したレプチン欠損マウスの体重減少曲線。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項２】
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＣＮＴＦがアクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ）である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
融合タンパク質のin-vivo半減期が、非融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質のin-vivo半減期よりも長い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
融合タンパク質の保存寿命が、非融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の保存寿命よりも長い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
酵母で発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
哺乳類細胞で発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の有効量と、医薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１０】
肥満症およびそれに関連する疾患を治療するための薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１１】
肥満症に関連する疾患が、糖尿病、高血糖または高インスリン血症である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
哺乳類において、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体の半減期を長くする方法であって、
前記生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質とアルブミンとを連結させてアルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質を形成させ、かつ、前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質を前記哺乳類へ投与して、それによって前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質の半減期の少なくとも２倍延長することを含んでなる、方法。
【請求項１３】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期の少なくとも５倍延長する、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期の少なくとも１０倍延長する、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期の少なくとも５０倍延長する、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
血液脳関門を通過する生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の濃度を上昇させる方法であって、
前記生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質とアルブミンとを連結させてアルブミン融合生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を形成させ、かつ、前記アルブミン融合生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を前記哺乳類へ投与して、それによって血液脳関門を通過する前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の濃度を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の濃度よりも上昇させることを含んでなる、方法。
【請求項１８】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、またははその断片もしくは変異体もしくは誘導体を活性化させる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化させる生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体による哺乳類の治療に関連する副作用を最小化する方法であって、
前記生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質とアルブミンとを連結させてアルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を形成させ、かつ、前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を前記哺乳類へ投与することを含んでなる、方法。
【請求項２１】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、またははその断片もしくは変異体もしくは誘導体を活性化させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
副作用が、悪心および／または頭痛である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の核酸分子を含んでなる、宿主細胞。
【請求項２７】
細胞中でＣＮＴＦ受容体を活性化させる方法であって、細胞を請求項１〜８のいずれか一項に記載の有効濃度の融合タンパク質と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項２８】
細胞が哺乳類細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞がヒト細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞中でＣＮＴＦ受容体を活性化させる方法であって、請求項２４に記載の核酸分子を細胞内へ導入して、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の治療上有効な量を、細胞が産生可能とすることにより、細胞に請求項１〜８のいずれか一項に記載の有効濃度の融合タンパク質を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項３１】
細胞が哺乳類細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞がヒト細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項１】
アルブミン、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体と、
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体とを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項２】
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＣＮＴＦがアクソカイン（ＡＸＯＫＩＮＥ）である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
融合タンパク質のin-vivo半減期が、非融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質のin-vivo半減期よりも長い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
融合タンパク質の保存寿命が、非融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の保存寿命よりも長い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
酵母で発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
哺乳類細胞で発現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の有効量と、医薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１０】
肥満症およびそれに関連する疾患を治療するための薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１１】
肥満症に関連する疾患が、糖尿病、高血糖または高インスリン血症である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
哺乳類において、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化する生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体の半減期を長くする方法であって、
前記生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質とアルブミンとを連結させてアルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質を形成させ、かつ、前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質を前記哺乳類へ投与して、それによって前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質の半減期の少なくとも２倍延長することを含んでなる、方法。
【請求項１３】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期の少なくとも５倍延長する、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期の少なくとも１０倍延長する、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の半減期の少なくとも５０倍延長する、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
血液脳関門を通過する生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の濃度を上昇させる方法であって、
前記生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質とアルブミンとを連結させてアルブミン融合生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を形成させ、かつ、前記アルブミン融合生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を前記哺乳類へ投与して、それによって血液脳関門を通過する前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の濃度を、連結したアルブミンを欠く生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質の濃度よりも上昇させることを含んでなる、方法。
【請求項１８】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、またははその断片もしくは変異体もしくは誘導体を活性化させる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体を活性化させる生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくは変異体もしくは誘導体による哺乳類の治療に関連する副作用を最小化する方法であって、
前記生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質とアルブミンとを連結させてアルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を形成させ、かつ、前記アルブミン融合型の生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を前記哺乳類へ投与することを含んでなる、方法。
【請求項２１】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、またははその断片もしくは変異体もしくは誘導体を活性化させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質が、ＣＮＴＦまたはその断片もしくは変異体もしくは誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
副作用が、悪心および／または頭痛である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の核酸分子を含んでなる、宿主細胞。
【請求項２７】
細胞中でＣＮＴＦ受容体を活性化させる方法であって、細胞を請求項１〜８のいずれか一項に記載の有効濃度の融合タンパク質と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項２８】
細胞が哺乳類細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞がヒト細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞中でＣＮＴＦ受容体を活性化させる方法であって、請求項２４に記載の核酸分子を細胞内へ導入して、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の治療上有効な量を、細胞が産生可能とすることにより、細胞に請求項１〜８のいずれか一項に記載の有効濃度の融合タンパク質を与える工程を含んでなる、方法。
【請求項３１】
細胞が哺乳類細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞がヒト細胞である、請求項３１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−２１３７０７（Ｐ２０１０−２１３７０７Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８９５６０（Ｐ２０１０−８９５６０）
【出願日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【分割の表示】特願２００４−５２６８９６（Ｐ２００４−５２６８９６）の分割
【原出願日】平成１５年８月６日（２００３．８．６）
【出願人】（５９１１３１５２３）ノボザイムス バイオファーマ ユーケー リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【分割の表示】特願２００４−５２６８９６（Ｐ２００４−５２６８９６）の分割
【原出願日】平成１５年８月６日（２００３．８．６）
【出願人】（５９１１３１５２３）ノボザイムス バイオファーマ ユーケー リミテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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