アレルギー予防・治療剤および食品
【課題】ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）を利用して、安全で、長期間投与・摂取可能な、アレルギー予防・治療（アレルギー反応により誘発され得る疾患の発症予防止効果も含む）剤および食品を提供する。
【解決手段】ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）、特にはホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の、菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）のいずれかをそのまま、あるいはその乾燥物、あるいはそれらの抽出物（例えば熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、有機溶媒抽出液）を含有する、アレルギー予防・治療剤および食品。
【解決手段】ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）、特にはホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の、菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）のいずれかをそのまま、あるいはその乾燥物、あるいはそれらの抽出物（例えば熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、有機溶媒抽出液）を含有する、アレルギー予防・治療剤および食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物やヒトにおけるアレルギーの予防・治療のための薬剤および食品に関する。本発明の薬剤および食品は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本を初めとする先進国において、生活環境等の変化により、アレルギー疾患の罹患率は急増している（厚生省統計情報部保健福祉動向調査、１９９１年）。日本人の場合、３人に１人は何らかのアレルギー症状をもっているといわれており、いわゆる「国民病」として、社会的問題になっている。
【０００３】
アレルギーは、外部から生体内に自己以外の物質などが異物として侵入することによって発症する免疫疾患であり、発症機序に基づき、Ｉ〜Ｖ型の５種類にタイプ分類される。すなわち、Ｉ型アレルギー反応は即時型、II型アレルギー反応は細胞傷害型、III型アレルギー反応は免疫複合体型、IＶ型アレルギー反応は遅延型、Ｖ型アレルギー反応は細胞刺激型といわれる。Ｉ型では気管支喘息やアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アナフィラキシー、食物アレルギー、蕁麻疹などが、II型では溶血性貧血やグッドパスチャー症候群、肺出血、腎炎などが、III型では血清病や膠原病（全身性エリテマトーデスや関節リウマチなど）、糸球体腎炎、過敏性肺炎などが、IＶ型では接触性皮膚炎や移植片拒絶反応などが、Ｖ型ではバセドウ病や重症筋無力症、Ｉ型糖尿病などが関与疾患とされている。いずれの疾患も発症に至るまでの過程は複雑・多様であり、アレルギーのトリガーが引かれてから、症状を呈するまでには、体内で様々な反応が起きる。本疾患の原因物質は主としてタンパク質であり、修飾因子は遺伝的背景や成育環境などであるが、反応の強さはアレルギー応答を調節する物質の摂取または暴露によっても影響される。
【０００４】
これらアレルギー反応に由来する症状や愁訴は、患者のＱＯＬ（quality of life；生活の質）に重大な影響を及ぼすだけではなく、場合によっては致死的な転帰をたどることもある。アレルギーを予防するためには、抗原物質との接触を避けることが基本であり、低アレルゲン加工食品摂取や抗原物質注射による減感作療法も行われる。さらに、アレルゲンの速やかな同定も治療方針をたてる上で重要である。発症した場合の治療薬として、症状が軽症の時は抗ヒスタミン剤や抗アレルギー薬、重症の時はステロイド剤の使用が一般的である。また、ビタミン類や脂肪酸、抗酸化物質、細菌製剤の投与も試みられている。しかし、薬の効き目が個々人により異なること、製剤等の服用を中断することによる疾患の再燃、治療中に発生する副作用などが問題視されており、有効な治療若しくは予防法の開発が求められている。
【０００５】
本発明者は、これらアレルギー反応を調節する方法を鋭意検討する過程で、Ｉ〜Ｖ型アレルギーの実験モデルを作成し、食用キノコ由来物質等の活性を評価したところ、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）、特にはホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株が、優れたアレルギー反応抑制活性を有することを見出し、本発明に至った。
【０００６】
ホンシメジは、担子菌キシメジ科シメジ属に属するキノコであり、「香りマツタケ、味シメジ」と古くからいわれるように、古来より食され、副作用の心配は少ない。本キノコは稀少な菌根菌であり、菌糸体の形での増殖は可能であるが、人工栽培はできないとされていた。しかし、最近の研究で、ある条件を選べば、栽培できるような技術が報告されている。すなわち、栄養菌糸体だけでなく、子実体でも利用可能であり、産業応用上必須な量的供給には問題ない。
【０００７】
なお従来、シメジ属に属するキノコを利用した技術として制癌剤を製造する方法が知られている（例えば、特許文献１〜２参照）が、Ｉ〜Ｖ型アレルギーのどのタイプにも有効なキノコまたは成分は、本発明者が知る限りにおいて、これまで報告がされていない。
【０００８】
【特許文献１】特公昭５１−１６７号公報
【特許文献２】特公昭５２−４４６３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、ホンシメジ、特にはＮＩＴＥ Ｐ−２６０株が、アレルギーに対し優れた予防・治療効果を有することを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明の課題は、ホンシメジ、特にはＮＩＴＥ Ｐ−２６０株、を利用したアレルギー予防・治療剤および食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために本発明は、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を提供する。
【００１２】
また本発明は、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む、アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１３】
また本発明は、ホンシメジ（L. shimeji）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１４】
また本発明は、ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１５】
また本発明は、ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、乾燥粉末である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１６】
また本発明は、ホンシメジ抽出物が、ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、または有機溶媒抽出液である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、安全で、安定的に大量供給が可能な、アレルギー予防・治療のための薬剤および食品が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに平成１８年９月１日付で寄託したものである。このホンシメジ（L. shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は、福島県南会津郡にて採取したホンシメジＣＭ５０２−２株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養し、生育した菌糸を継代することにより得たものである。
【００１９】
本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の子実体の形態は、今関六也・本郷次雄編の「原色日本新菌類図鑑（１）」、保育社（大阪）、昭和６２年発行、プレート（Plate）９および５８頁記載のホンシメジ子実体に合致するものであった。
【００２０】
本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の継代は、ペプトン・デキストロース・イースト（以下、ＰＤＹ）寒天斜面培地で実施することができ、現在、株式会社クレハ・生物医学研究所にて維持されている。前記菌株の菌糸体を大量培養する場合には、液体培地に本菌を接種し、例えば、静置培養、振盪培養、またはタンク培養により実施することができる。また、固形培地に接種し、静置培養により子実体を形成させることもできる。
【００２１】
本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体をＰＤＹ寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、比較的大きなコロニーを形成する。また、走査型電子顕微鏡観察では、後述のように、太さ２〜３μｍの枝状の菌糸が無数に存在し、担子菌類特有のループ状のクランプ構造の存在を認める。
【００２２】
以下、本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の分類学的性質について記載する。
【００２３】
〔本発明菌株の培養的・形態的性質〕
（１）麦芽エキス寒天培地での生育状態
麦芽エキス寒天（Malt Extract Agar）（OXOID Ltd.、英国）５０ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注して麦芽エキス寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目のコロニーの肉眼観察では、白色の菌糸がマット状に密に伸長し、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は５６±３ｍｍ、７７±２ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００２４】
（２）ポテト・グルコース寒天培地での生育状態
ポテト・デキストロース寒天培地「ダイゴ」（日水製薬（株））３９ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してポテト・グルコース寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目の観察では、白色菌糸が放射状に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかったが、コロニーの厚さは上記（１）におけるコロニーに比べると薄かった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は４０±５ｍｍ、６９±１ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００２５】
（３）ツァペック寒天培地での生育状態
ディフコ・ツァペック溶液寒天（DifcoTM Czapek Solution Agar）（Becton Dickinson and Company，米国）４９ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してツァぺック寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目の観察では、気菌糸は極めて少なく、白色菌糸がかろうじて判別できる程度に樹状に希薄に伸長、コロニー裏面の中心部はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は３８±３ｍｍおよび６３±３ｍｍであり、培養開始２０日目にはコロニーは約８３ｍｍのシャーレ先端部に達していた。
【００２６】
（４）サブロー寒天培地での生育状態
サブロー寒天培地「ニッスイ」顆粒（日水製薬（株））６５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してサブロー寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色菌糸が放射状で比較的密に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目、１５日目および２０日目のコロニー径は、それぞれ、３０±５ｍｍ、５８±３ｍｍおよび６６±４ｍｍであった。
【００２７】
（５）オートミール寒天培地での生育状態
ディフコ・オートミール寒天（DifcoTM Oat Meal Agar）（Becton Dickinson and Company，米国）７２．５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してオートミール寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目の観察では、白色菌糸がマット状に密に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は５３±６ｍｍおよび８３±１ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００２８】
（６）合成ムコール寒天培地での生育状態
グルコース４０ｇ、アスパラギン２．０ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．０２５ｇ、チアミン塩酸塩０．５ｍｇおよび寒天１５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注して合成ムコール寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色菌糸が放射状、やや希薄に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は１８±３ｍｍおよび３３±６ｍｍであり、培養開始２０日目には４７±１２ｍｍに達した。
【００２９】
（７）ＹｐＳｓ寒天培地での生育状態
可溶性デンプン１５ｇ、酵母エキス４ｇ、リン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇおよび寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解、ｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してＹｐＳｓ寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色の菌糸が放射状に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。コロニーの厚さは上記（１）や（２）でのコロニーに比べると明らかに薄かった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は１５±５ｍｍおよび５８±６ｍｍであり、培養開始２０日目には８０±２ｍｍに達した。
【００３０】
（８）グルコース・ドライイースト寒天培地での生育状態
グルコース１０ｇ、乾燥酵母（エビオス錠、アサヒフードアンドヘルスケア（株））５ｇ、リン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇおよび寒天１５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してグルコース・ドライイースト寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色の菌糸が放射状にやや希薄に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は４０±４ｍｍおよび６５±５ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００３１】
（９）コーンミール寒天培地での生育状態
コーンミール寒天（Corn Meal Agar）（シグマアルドリッチ社）１７ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してコーンミール寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色の菌糸が放射状、やや希薄に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は３２±４ｍｍおよび５７±２ｍｍであり、培養２０日目には８１±１ｍｍに達した。
【００３２】
（１０）ＰＤＹ寒天平板で生育した菌糸の形態
グルコース２０ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇおよび寒天２０ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してＰＤＹ寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中央部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で１４日間培養した。培養終了後、ニードルを用いて、寒天平板上に生育したコロニーの一部をサンプリングした。このサンプリングしたものを試料とし、これをＯＣＴコンパウンド（凍結用包埋剤）を塗布した試料台に載せ、フィールドエミッションＳＥＭ専用装置ＡＬＴＯＡ２５００（オックスフォード・インストゥルメンツ（株））を用い、添付マニュアルに準じてサンプル調製した。すなわち、スラッシュ・チャンバー内に液体窒素を入れて減圧状態にすることにより、スラッシュ窒素を作製した。次に、交換棒に上記試料を取り付け、チャンバー内のスラッシュ窒素に入れて凍結させた後、プレパレーション・チャンバーに取り付けた。−９５℃にて付着水分を昇華させた後、金属蒸着を行った。そして、走査型電子顕微鏡ＪＳＭ−７４０１（日本電子（株））を用いて、処理試料の表面状態を観察した。
【００３３】
上記顕微鏡写真を図１〜２に示す。図１は撮影倍率１，０００倍、図２は撮影倍率５，０００倍で図１の部分拡大写真である。いずれも加速電圧２．０ｋＶで撮影した。図１〜２に示す顕微鏡写真から明らかなように、本発明菌株のコロニー表面には、太さ２〜３μｍの菌糸およびループ状のクランプが観察された。この構造は菌糸の隔壁部にある突起であり、担子菌に特有のものである。なお、表面に付着している球形物質は、菌糸付着の水分が凍結したものである。
【００３４】
〔本発明菌株の生理学的性質〕
（１）最適生育条件および生育の範囲（温度、ｐＨ）
グルコース２０ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇおよび寒天２０ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してペプトン・デキストロース・イースト寒天平板（以下、ＰＧＹ寒天平板）を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃および３５℃の恒温器中で培養し、経時的にコロニー径を測定した（各培養温度：ｎ＝３）。結果を表１に示す。
【００３５】
表１の結果から明らかなように、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は１０〜３０℃の範囲で増殖し、最適生育温度は２０〜２５℃であった。
【００３６】
【表１】
【００３７】
次に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇおよびリン酸一カリウム０．５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整した。１００ｍＬ容フラスコに上記液（培地）を２０ｍＬずつ分注後、１２１℃、２０分間の滅菌処置を行った。ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株をフラスコ内の上記培地に接種し、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃および３５℃の恒温器中で培養、２１日目に内容物を取り出し、濾過により菌体を分離、蒸留水にて洗浄した後、凍結乾燥して乾燥質量を測定した（各培養温度：ｎ＝３）。結果を表２に示す。
【００３８】
表２の結果から明らかなように、菌体質量を指標とした場合でも、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の生育温度は５〜３０℃であり、最適生育温度は２０〜２５℃であることが確認できた。
【００３９】
【表２】
【００４０】
次に、蒸留水１００ｍＬに、グルコース２．０ｇ、ポリペプトン０．２ｇ、酵母エキス０．２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｇおよびリン酸一カリウム０．０５ｇを加えて溶解させた後、１Ｎ塩酸または１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて培地のｐＨを下記表３に示す値にそれぞれ調整した。１００ｍＬ容フラスコにｐＨ調整済み培地を２０ｍＬずつ分注後、１２１℃、２０分間の滅菌処置を行った。ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株をフラスコに接種し、２５℃の恒温器中で培養、２０日目に内容物を取り出し、濾過により菌体を分離、蒸留水にてよく洗浄した後、凍結乾燥して乾燥質量を測定した（各培地ｐＨ：ｎ＝３）。結果を表３に示す。
【００４１】
表３の結果から明らかなように、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の生育限界はｐＨ４．０〜１０．０の範囲にあり、最適生育ｐＨは６．５付近であった。
【００４２】
【表３】
【００４３】
（２）フェノールオキシダーゼ反応検定用培地での生育
麦芽エキス寒天（Malt Extract Agar）５．０ｇ、タンニンン酸０．５ｇおよび没食子酸０．５ｇに蒸留水１００ｍＬを加え、液のｐＨを６．１に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してフェノールオキシダーゼ反応検定用寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近の培地にホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。
【００４４】
培養開始５日目および１０日目の観察では、気菌糸の生育はほとんどみられず、シャーレ裏面の褐変域は径１８±３ｍｍおよび２０±３ｍｍであった。培養開始２０日目、褐変域の径は４３±７ｍｍに達したが、菌糸の生育は極めて遅かった。
【００４５】
次に、ポテト・デキストロース寒天培地「ダイゴ」３．９ｇ、タンニン酸０．５ｇおよび没食子酸０．５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してフェノールオキシダーゼ反応検定用寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近の培地にホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。
【００４６】
培養開始１０日目および１５日目の観察では、気菌糸の生育は不良で、シャーレ裏面の褐変域は径８±３ｍｍおよび１０±１ｍｍであった。
【００４７】
（３）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（Ohta，”Trans. Mycol. Soc. Jpn.”，31，323，1990）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、４０日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定したところ、菌体６７２±１３ｍｇが得られた。
【００４８】
前記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、６種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。糖質関連物質の添加量はグルコースの炭素相当量になるように設定した。
【００４９】
その結果、菌体質量が多かった糖質関連物質から菌体質量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下の通りである。
【００５０】
デンプン＞グルコース＞フラクトース＞トレハロース＞スクロース＞マルトース＞マンニトール。
【００５１】
すなわち、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株はデンプン、グルコース、フラクトース、トレハロースを添加した培地で良好な生育を示したが、糖アルコールの資化能力は低かった。
【００５２】
次に、前記培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、９種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。なお、窒素関連物質の添加量は酒石酸アンモニウムの窒素相当量になるように設定した。
【００５３】
その結果、菌体質量が多かった窒素関連物質から菌体質量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下の通りである。
【００５４】
コーンスティープリカー＞ポリペプトン＞酵母エキス＞カザミノ酸＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞硝酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸カリウム。
【００５５】
すなわち、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は有機態窒素を添加した培地で良好な生育を示したが、無機態窒素の資化能力は劣っていた。
【００５６】
さらに、前記合成培地に、特定のミネラル１〜１０ｍｇ／Ｌをさらに追加した培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。
【００５７】
その結果、供試ミネラル５種類のうち、硫酸コバルト・７水塩、硫酸ニッケル・６水塩および硫酸銅・７水塩を追加した実験群で、菌体質量は対照群に比べて明らかに増加した。
【００５８】
一方、前記合成培地に、特定のビタミンをさらに追加した培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定したところ、供試ビタミン８種類のうち、培地に葉酸を追加した実験群で、菌体質量は明らかに増加した。
【００５９】
すなわち、コバルト、ニッケル、銅および葉酸はホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の増殖を促進する成分と考えられる。
【００６０】
〔対峙培養による帯線生成の有無観察〕
ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株と、財団法人発酵研究所から分譲を受けたホンシメジの標準菌株（ＩＦＯ８３３５、ＩＦＯ３２１８７、ＩＦＯ３２１８８、ＩＦＯ３２１８９）との異同について、寒天培地上で対峙培養を行うことにより調べた。
【００６１】
すなわち、ＰＧＹ寒天平板の中央部付近に、径約６ｍｍのホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌ブロックと供試菌株の菌ブロックを２ｃｍ間隔で対峙して接種し、２５℃の恒温器中で培養した。培養開始１３日後、両コロニーの境界部に帯線が生じるか否かを判定した。併せて供試菌株どうしでの対峙培養も行った。結果を表４に示す。
【００６２】
表４に示す結果から明らかなように、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株はすべての供試菌株と拮抗し、寒天平板上に帯線が生じたことから、新規菌株であることは明らかである。
【００６３】
【表４】
【００６４】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、有効成分として、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む。
【００６５】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）は、菌糸体、培養物（Broth）、子実体のいずれの形態のものも用いることができ、生でも乾燥したものでもよい。本発明では子実体は胞子も含むものとする。これら菌糸体、培養物（Broth）、子実体の抽出物も用いることができる。
【００６６】
本発明では特に上記したホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株が好ましく用いられる。具体的には、（i）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体〕、（ii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒可溶性画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のクロロホルム・メタノール混合液抽出画分〕、（iii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体の熱水抽出画分〕、および（iv）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ溶液抽出画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のアルカリ溶液抽出画分〕等の態様が好ましく例示される。ただしこれら例示に限定されるものでない。
【００６７】
（i）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物から適当な除去手段（例えば、濾過）により培地を除去しただけの状態で使用することもできるし、あるいは、培地を除去した後の菌糸体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
【００６８】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の培養物（Broth）としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）または子実体（すなわち培養子実体）と培地との混合物の状態で使用することもできるし、あるいは、前記混合物から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥や熱風乾燥）により水分を除去した培養物（Broth）乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記培養物（Broth）乾燥物を粉砕した培養物（Broth）乾燥物粉末の状態で使用することもできる。なお培養工程は、特に限定されるものでなく、一般にホンシメジ菌を培養する方法を任意に用いることができる。
【００６９】
培養工程は公知の方法で行うことができる。例えば静置培養では、ホンシメジ菌を固形培地または液体培地で培養または保存したもの（ホンシメジ菌含有培養液）を、液体培地に接種する。該静置液体培養での培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５度である。培養期間は１０〜６０日間程度が好ましく、より好ましくは２０〜４０日間程度である。静置液体培養では通常１００ｍL〜２Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。
【００７０】
また、振盪培養では通常３００ｍL〜５Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。振盪培養では、培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃である。培養期間は７〜２８日間程度が好ましく、より好ましくは１０〜１４日間程度である。振盪培養ではフラスコを３５〜２００ｒｐｍの回転数で振盪させるのが好ましい。
【００７１】
菌床栽培では、例えば、広葉樹おがこと、精麦済み粒状の大麦に、カリウムや鉄などを主成分とする無機栄養成分を添加した培地を用い、２０〜２５℃で菌糸培養を行い、菌糸が培地全体に蔓延した頃（接種してから約４０〜５０日後）、ピートや鹿沼土を用いて、培地上に厚さ１ｃｍ位の覆土を施し、さらに７〜１０日間培養した後、室温を１５℃近辺にすると、約１ヶ月位で子実体を収穫することができる。また、培養期間中、適宜の湿度調整や光照射により、子実体形成を促進させることができる。
【００７２】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の子実体としては、例えば、子実体をそのままで、または子実体を破砕した状態で使用することもできるし、あるいは、子実体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには、前記子実体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
【００７３】
（ii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒可溶性画分（＝有機溶媒抽出液）
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒抽出液は、例えば、培養により得られるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体を、有機溶媒で抽出することにより得ることができる。
【００７４】
抽出に用いる有機溶媒は、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株に含有される抗アレルギー作用を示す成分を抽出できる溶媒である限り、特に限定されるものではなく、例えば、脂溶性有機溶媒（例えば、クロロホルム、メタノール、エーテル、エタノール、酢酸エチルまたはヘキサン）またはそれらの混合物（例えば、クロロホルムとメタノールとの混合液）を用いることができる。なかでもクロロホルムとメタノールとの混合液が好ましい。
【００７５】
有機溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合液を使用する場合には、その混合比〔クロロホル：メタノール（ｖ／ｖ）〕は、例えば、１０：１〜１：１０であることができる。
【００７６】
有機溶媒抽出は、１５〜３０℃の温度で実施することが好ましい。また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、攪拌または振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は特に限定されるものでなく、ホンシメジの状態（子実体、菌糸体または培養物のいずれかの状態であるか、あるいは、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態、など）、有機溶媒の種類・温度、攪拌・振盪の有無等、実施条件に応じて適宜決定することができるが、通常０．２５〜３時間程度であり、０．５〜１．５時間程度が好ましい。
【００７７】
得られた有機溶媒抽出画分は、例えば、不溶物が混在する状態でそのまま、あるいは、不溶物を除去した抽出液の状態で、さらには、適当な処理（例えば、濃縮若しくは希釈、乾燥または再溶解）を施した状態で、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることができる。
【００７８】
なお、有機溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合液を使用する場合には、有機溶媒抽出を実施することにより、水層、中間層およびクロロホルム／メタノール混合層とが形成される。この場合、クロロホルム／メタノール混合層単独、あるいは、中間層とクロロホルム／メタノール混合層との混合物（すなわち、非水層）を、ホンシメジの有機溶媒抽出画分として使用することができる。
【００７９】
（iii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出画分（＝熱水抽出液）
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液は、例えば、培養により得られるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体を、熱水で抽出することにより得ることができる。
【００８０】
抽出に用いる熱水の温度は、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株に含有される抗アレルギー作用を示す成分が、活性を失わない状態で、熱水抽出液中に充分抽出されることのできる温度である限り、特に限定されるものではないが、６０〜１００℃程度が好ましく、８０〜９８℃程度がより好ましい。
【００８１】
菌糸体または子実体を熱水抽出に用いる場合には、抽出効率が向上するように、粉砕物または粉末の状態に加工することが好ましい。
【００８２】
また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌または振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、ホンシメジの状態（子実体、菌糸体または培養物のいずれかの状態であるか、あるいは、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態、など）、熱水の温度、攪拌若しくは振盪の有無等、実施の条件に応じて適宜決定することができるが、通常１〜６時間程度であり、２〜３時間程度が好ましい。
【００８３】
得られた熱水抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることもできるし、あるいは、不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、さらに、抽出液中の低分子画分を除去してから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることもできる。例えば、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることができる。あるいは、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることができる。
【００８４】
（iv）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ液抽出画分（＝アルカリ液抽出液）
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分であるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ溶液抽出液の製法は、例えば、上述したホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液の製造方法に準じた方法により実施することができる。すなわち、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液の前記製造方法と同様の方法により調製することができる。例えば、培養により得られるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体（すなわち、培養菌糸体）、培養物（Broth）、または子実体を、アルカリ溶液で抽出することにより得ることができる。
【００８５】
アルカリ溶液抽出に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは８〜１３が好ましく、９〜１２がより好ましい。アルカリ溶液抽出は、０〜３０℃程度で実施するのが好ましく、０〜２５℃程度がより好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体残渣の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、アルカリ溶液のｐＨ若しくは温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常３０分間〜５時間程度であり、１〜３時間程度が好ましい。得られたアルカリ溶液抽出液は、そのまま、あるいは所望により中和処理を実施してから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いる。
【００８６】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、有効成分であるホンシメジ、特にはホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体〕、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒可溶性画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のクロロホルム・メタノール混合液抽出画分〕、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体の熱水抽出液〕、あるいは、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ溶液抽出液〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のアルカリ溶液抽出液〕を、単独で、あるいは所望により薬学的に許容し得る担体とともに、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。上記有効成分はいずれもアレルギー症状に対する予防若しくは治療活性を有する。
【００８７】
本発明において「アレルギー予防・治療」とは、動物やヒトなどにおいて、アレルギー反応により生じる疾患の発症の予防、アレルギー反応により生じる疾患の発症後（病的状態）の治療を意味するが、アレルギー反応により生じる疾患の発症を遅延・抑制せしめる効果も含む。またアレルギー反応により生じる疾患により誘発され得る疾患の発症防止効果（アレルギー反応により生じる疾患に付随して発生する各種症状の防止）も含む。したがって、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の投与・摂取時期は、特に限定されるものではないが、日常的に継続投与・摂取するのが好ましい。
【００８８】
アレルギー反応により生じる疾患の種類や症状は多種多様であるが、後述の実施例に示すように、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品はアレルギー反応のタイプＩ〜Ｖ型のいずれにも有効なことから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、単に特定症状・疾患に対してだけでなく、アレルギー誘発症状全般に対して有効性が見込まれる。
【００８９】
本発明の対象となる具体的疾患として、アナフィラキシーショック、気管支喘息、花粉症、蕁麻疹、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸症、アレルギー性口内炎、アレルギー性紫斑病、アレルギー性肉芽腫、自己免疫性溶血性貧血、胎児赤芽球症、薬物による溶血性貧血、橋本甲状腺炎、血小板減少性紫斑病、顆粒細胞減少症、血清病、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺好酸球増多症、アレルギー性肺胞炎、肺結核、接触皮膚炎、全身性エリテマトーデス、ＰＮ型血管炎などが挙げられる。
【００９０】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の投与時期は、その投与によりアレルギー反応が抑制可能である限り、特に限定されるものではなく、例えば、予防的投与、治療的投与、治療後の再発予防的投与が可能である。
【００９１】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の投与・摂取剤型としては特に限定されるものでなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、座剤、局所投与のクリーム、点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００９２】
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、デンプンコーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法により製造することができる。
【００９３】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内など）等が例示される。なかでも注射剤が最も好適に用いられる。
【００９４】
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。
【００９５】
また、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００９６】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、これに限定されるものではないが、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株あるいはその抽出物（例えば、当該株の、有機溶媒抽出液、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液）等の有効成分を０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の量で含有することができる。
【００９７】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品を用いる場合の投与・摂取量は、被投与者の年齢、性別、体重、または投与・摂取方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまた非経口的に投与・摂取することが可能である。
【００９８】
また、投与・摂取形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株あるいはその抽出物（例えば、当該株の、有機溶媒抽出液、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液）等の有効成分を、添加剤（食品添加剤など）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、またはうがい剤等に添加することができる。
【００９９】
なお、上記において、特定保健用食品は、その食品が持つ健康機能の表示が認められる食品（食品ごとに厚生労働省の許可を必要とする）をいい、栄養機能食品は栄養成分の機能を明記できる食品（厚生労働省が作成した規格基準を満たす必要あり）をいい、いわゆる健康食品とは上記保健機能食品以外の食品一般を広く意味するもので、健康補助食品等を含むものである。
【実施例】
【０１００】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によってなんら限定されるものでない。
【０１０１】
（実施例１）
［天然由来ホンシメジ子実体の粉末、および該子実体抽出画分の調製］
福島県南会津郡で採取したホンシメジＣＭ５０２−２株〔＝ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株〕の子実体１，０５０ｇを軽く水洗した後、凍結乾燥し、得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末９２ｇを得た（なお、本子実体組織の一部は無菌状態で切り出し、試験管内で培養して菌糸継代株樹立に用いた）。
【０１０２】
上記子実体粉末１．０ｇを、３００ｍＬ容のビーカーに入れ、次いでクロロホルムとメタノールとの混合液（２：１、ｖ／ｖ。以下、「ＣｈＭｅ液」と記す）５０ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出した。この操作を３回繰り返した後、水層部、中間層、およびＣｈＭｅ液層をそれぞれ回収した。ＣｈＭｅ液層と中間層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．５５ｇ（以下、「天然子実体抽出画分」と記す）を得た。
【０１０３】
（実施例２）
［菌床栽培由来ホンシメジ子実体の培養物、および該子実体抽出画分の調製］
ホンシメジＣＭ５０２−２株の菌床栽培は、吉田らの方法に準じた（吉田ら、日菌報、日本菌学会、１９９４年、第３５巻、１９２頁）。すなわち、可溶性デンプン１００ｇ、グルコース２５ｇ、ペクチン１ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ、チアミン塩酸塩１．０ｍｇおよび炭酸カルシウム５ｇに蒸留水１０００ｍＬを加えた後、活性炭粉末５ｇを加え、均一に分散するようによく攪拌した。
【０１０４】
ピートモスを充填した市販のフィルター付菌床栽培袋に、ピートモス０．１６ｇ／培地ｍＬになるように上記培地を加え、中央部に径１．５ｃｍの穴をあけた後、１２１℃、７５分間の滅菌処理を施した。滅菌済み培養基の水分含量は８４〜６５％、ｐＨは５．５であった。
【０１０５】
この培養基に、株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を接種し、２３℃、湿度７５％に調整した恒温器内で、遮光下、３ヶ月間培養して菌糸を生育・熟成させた。次に、温度１７℃、湿度９０％に調整した培養器に上記培養基を移し、約５０ルクスの白色蛍光灯を照射したところ、２０日目頃から子実体原基が生じ、３０日頃から子実体が発生した。培養開始３５日目の成熟子実体収量は４１．１ｇ湿質量／培地ｍＬであった。
【０１０６】
培養終了後、子実体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末３．２９ｇを得た。さらに、実施例１と同様にして有機溶媒抽出（ＣｈＭｅ液抽出）を行い、回収した中間層とＣｈＭｅ液層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．１９ｇ（以下、「菌床栽培子実体由来抽出画分」と記す）を得た。
【０１０７】
（実施例３）
［静置培養菌糸体の培養物、および該菌糸体抽出画分の調製］
株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース、０．２％麦芽エキス、０．７５％酵母エキス、ｐＨ６．５）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２５℃の恒温器中で２１日間静置培養を行った。培養終了後、濾紙濾過により菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末６．５０ｇを得た。
【０１０８】
実施例１と同様の方法で、上記菌糸体粉末１．０ｇを、３００ｍＬ容のビーカーに入れ、次いでＣｈＭｅ液５０ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出した。この操作を３回繰り返した後、水層部、中間層、およびＣｈＭｅ液層をそれぞれ回収した。ＣｈＭｅ液層と中間層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．３２ｇ（以下、「静置菌糸体抽出画分」と記す）を得た。
【０１０９】
（実施例４）
［振盪培養由来ホンシメジ菌糸体の培養物、および該菌糸体抽出画分の調製］
株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース、０．２％麦芽エキス、０．７５％酵母エキス、ｐＨ６．５）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で３週間培養を行った。培養終了後、培養物（Broth）を濾紙濾過により、菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末８．５０ｇを得た。
【０１１０】
実施例１と同様の方法で、上記菌糸体粉末１．０ｇを、３００ｍＬ容のビーカーに入れ、次いでＣｈＭｅ液５０ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出した。この操作を３回繰り返した後、水層部、中間層、およびＣｈＭｅ液層をそれぞれ回収した。ＣｈＭｅ液層と中間層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．４１ｇ（以下、「菌糸体抽出画分」と記す）を得た。
【０１１１】
（実施例５）
［ジャーファメンター培養由来ホンシメジ菌糸体の培養物、および該菌糸体抽出画分の調製］
株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース、０．２％麦芽エキス、０．７５％酵母エキス、ｐＨ６．５）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で２週間培養を行った。得られた培養物（Broth）から菌糸体ペレットを回収し、滅菌蒸留水で洗浄後、ホモゲナイザー処理によりペレットを軽く解砕したものを種菌懸濁液とした。また、グルコース３０ｇおよび酵母エキス３ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解し、塩酸にて液のｐＨを５．５に調整後、当該液を１２１℃、２０分間の滅菌処理したものを培地とした。
【０１１２】
培養装置として「サクラ・バイオリアクターＴＢＲ−１」（サクラ精機（株））を用い、２Ｌ容培養用ポットおよび付属部品を１２１℃、２０分間の滅菌処理した後、培養システムを組み立てた。培養用ポットに培地１Ｌを入れた後、エタノール火炎下、導入口の部分から種菌懸濁液をポット容器に入れた。空気導入用滅菌フィルター口に空気導入管を接続し、容器内に滅菌空気を導入、空気排出口のシリコン栓を抜き取った。培地温度を２４℃、攪拌速度を２００ｒｐｍ、通気量を０．６〜０．９Ｌ／ｍｉｎとし、１４日間培養した。
【０１１３】
培養終了後、濾紙濾過により菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末５．１６ｇを得た。この粉末５．０ｇに蒸留水５００ｍＬを加え、９８℃の湯浴下、２時間の攪拌抽出を行い、室温まで冷却した後に８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清１を得た。残渣に蒸留水５００ｍＬを加え同様の操作を行い、上清２を得た。次に、残渣に０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５００ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出を行った後、遠心分離して上清３を得た。
【０１１４】
塩酸にて、上清３のｐＨを７．０に調整した後、上清１および上清２と混合し、透析膜チューブ（分画分子量：約８，０００）に入れて流水中で４８時間透析した。透析終了後、透析内液を回収、ロータリーエバポレーターを用いて約２００ｍＬまでに濃縮し、凍結乾燥したところ、粉末８５３ｍｇを得た。
【０１１５】
（実施例６）
［Ｉ型アレルギーに対する作用の検討−１］
Ｉ型アレルギーは抗原刺激後数秒から数分で起こる免疫反応である。抗原感作によりＩｇＥ抗体が産生されると、ＩｇＥはマスト細胞や好塩基性白血球膜上のＦｃεＲＩ（高親和性ＩｇＥ受容体）に結合する。曝露抗原が細胞膜に結合しているＩｇＥに結合すると、それらの細胞からヒスタミンやセロトニン、ロイコトリエンなどの化学伝達物質が放出され、血管の透過性が亢進し、平滑筋の強い収縮が起こり、発疹、嘔吐、くしゃみ、ふるえ、腹痛、下痢、呼吸困難などの症状を呈し、場合によっては死に至る。そこで、能動的全身アナフィラキシーを指標として、ラットのＩ型アレルギーモデルに対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１１６】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雄性Wistarラットを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１１７】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１１８】
（iii）実験群構成および処置
能動的全身性アナフィラキシー反応は、S. Nakamuraらの方法に準じて実施した（S. Nakamura他、Effects of N-556 on experimental allergy models in rats、"Jpn J Allergol"、39：1621−1628、1990）。すなわち、ジニトロフェニル結合アスカリス（以下、「ＤＮＰ−Ａｓ」と記す。コスモバイオ（株））のＰＢＳ（＝リン酸緩衝化生理食塩水）溶液 ２．５ｍｇ／０．１ｍＬと百日咳死菌（コスモバイオ（株））のＰＢＳ懸濁液１×１０10細胞／０．１ｍＬを混合し、その０．２ｍＬをラット四肢足蹠部に注射した。５日後、ＤＮＰ−ＡｓのＰＢＳ溶液 ０．５ｍｇ／０．１ｍＬをラット背部筋肉内に注射することにより、追加免疫を行った。
【０１１９】
最終注射９日後、ジニトロフェニル結合卵白アルブミン（以下「ＤＮＰ−ＯＶＡ」と記す。コスモバイオ（株））のＰＢＳ溶液 ０．５ｍｇ／０．１ｍＬまたは０．１ｍｇ／０．１ｍＬをラット静脈内に注射することにより、アナフィラキシーを誘導した。注射後２時間目までは、２０分ごとに症状および生死を観察した。最終観察は、注射後２４時間目に行った。
【０１２０】
実験群は以下の１２群からなる。
【０１２１】
実験群６−Ｉ： ＤＮＰ−Ａｓで免疫したWistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する感作・対照群−１（ｎ＝６）、
実験群６−II： ＤＮＰ−Ａｓで免疫したWistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する感作・対照群−２（ｎ＝６）、
実験群６−III： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する感作・子実体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−IＶ： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する感作・子実体群−２（ｎ＝６）、
実験群６−Ｖ： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する感作・菌糸体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−ＶI： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する感作・菌糸体群−２（ｎ＝６）、
実験群６−ＶII： 健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する非感作・対照群−１（ｎ＝６）、
実験群６−ＶIII： 健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する非感作・対照群−２（ｎ＝６）、
実験群６−IＸ： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する非感作・子実体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−Ｘ： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する非感作・子実体群−２（ｎ＝６）、
実験群６−ＸI： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する非感作・菌糸体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−ＸII： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する非感作・菌糸体群−２（ｎ＝６）。
【０１２２】
（iv）成績
下記表５に示すように、ＤＮＰ−Ａｓ感作ラットに０．５ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射して能動的アナフィラキシーを誘導した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈して２０分以内に死亡した（実験群６−Ｉ；死亡率１００％）。一方、ＤＮＰ−Ａｓ感作ラットに０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈したものの、実験群６−Ｉに比して比較的軽度であり、静脈内注射２４時間後の観察では、６匹中４匹が死亡し、２匹がショック死を免れた（実験群６−II；死亡率６７％）。
【０１２３】
初回感作から１４日間、天然子実体抽出画分（実施例１で調製）３００ｍｇ／ｋｇ／日を投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、０．５ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射して能動的アナフィラキシーを誘導した実験群では、６匹中５匹がアナフィラキシー症状を呈して２４時間以内に死亡した（実験群６−III；死亡率８３％）。一方、同ラットに０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈したが、その程度は実験群６−IIIに比して軽度であり、静脈内注射２４時間後の観察では、６匹中２匹が死亡したものの、４匹がショック死を免れた（実験群６−IＶ；死亡率３３％）。
【０１２４】
初回感作から１４日間、静置菌糸体抽出画分（実施例３で調製）３００ｍｇ／ｋｇ／日を投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、０．５ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射して能動的アナフィラキシーを誘導した実験群では、６匹中４匹がアナフィラキシー症状を呈して２４時間以内に死亡した（実験群６−Ｖ；死亡率６７％）。一方、同ラットに０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈したが、その程度は実験群６−Ｖに比して軽度であり、静脈内注射２４時間後の観察では、６匹中２匹が死亡したものの、４匹がショック死を免れた（実験群６−ＶI；死亡率３３％）。
【０１２５】
なお、ＤＮＰ−Ａｓ非感作ラットに、０．５ｍｇまたは０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡ抗原を静脈内注射しても、アナフィラキシー症状は全くみられなかった（実験群６−ＶIIおよび６−ＶIII；死亡率０％）。また、初回感作から１４日間、天然子実体抽出画分または静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ非感作ラットに、０．５ｍｇまたは０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡ抗原を静脈内注射しても、アナフィラキシー症状は全くみられなかった（実験群６−IＸ、６−Ｘ、６−ＸIおよび６−ＸII；死亡率０％）。
【０１２６】
これらの成績は、低用量の抗原（１ｍｇ／匹）を用いて能動的アナフィラキシー反応を誘導する系において、ホンシメジ子実体抽出画分および菌糸体抽出画分が、上記反応を抑制することを示している。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】
（実施例７）
［Ｉ型アレルギーに対する作用検討−２］
１９５０年代に米国のZ. Ovaryにより確立された受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ；passive cutaneous anaphylaxis）反応は、細胞親和性をもつＩｇＧ抗体やＩｇＥ抗体を高感度に検出するために開発されたものである。その原理は、動物の皮膚をあらかじめ抗体で受動感作した後、抗原と色素の混液を注射し、Ｉ型免疫反応により誘導される皮膚小血管の透過性亢進状態を、漏出色素量を指標として判定する。本反応は、抗体検出やＩ型アレルギー反応の発生・抑制メカニズム解析だけでなく、抗アレルギー活性をもつ薬剤や天然由来物質のスクリーニングに広く用いられる。
【０１２９】
そこで、ＰＣＡ反応を指標として、ラットのＩ型アレルギーモデルに対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１３０】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雄性Wistarラットを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１３１】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分、実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１３２】
（iii）実験群構成および処置
ＰＣＡ反応は、塩崎らの方法に準じて実施した（塩崎哲也ら、「緑茶抽出成分（茶ポリフェノール、カフェイン）のＩ型アレルギーに対する効果」、薬学雑誌、社団法人日本薬学会、１９９７年、第１１７巻、４４８−４５４頁）。すなわち、上記ラット背部の背中線に沿って、縦横：約４ｃｍ×約５ｃｍを剃毛し、剃毛部の右背側部２箇所に抗ジニトロフェニル（以下、ＤＮＰ）ＩｇＥ抗体（Sera-Labo）溶液２５ｎｇ／ｍＬを０．０５ｍＬ皮内注射し、左背側部２箇所にリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）を同量注射した。
【０１３３】
注射２４時間後、ＤＮＰ−ＯＶＡ（＝ジニトロフェニル結合卵白アルブミン）溶液２０μｇ／ｍＬとエバンスブルー（ＥＢ：Evans blue。シグマアルドリッチジャパン（株））溶液５ｍｇ／ｍＬの等量混合溶液１．０ｍＬを、上記ラット尾静脈内に注射し、３０分後にラットを放血致死させて、皮内注射部位の青染部を切り取り、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液１．０ｍＬ中に２５℃で２４時間漬け込むことにより色素を可溶化させた。次いで、濾紙濾過により固形物を除去し、色素溶解液を５Ｍリン酸溶液で中和し、アセトン３．０ｍＬを加えて青色色素を抽出した。分光光度計を用いて、抽出液の６２０ｎｍ吸収を測定し、次式：〔ＤＮＰ皮内注射部位（２箇所）の平均吸光度−ＰＢＳ注射部位（２箇所）の平均吸光度〕から、各被検個体の色素漏出度を算出した。
【０１３４】
実験群は、
（１）Wistarラットに溶媒を投与し、３０分、６０分または１８０分後にＰＣＡを実施する対照群（ｎ＝６×３）、
（２）Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与し、３０分、６０分または１８０分後にＰＣＡを実施する子実体群（ｎ＝６×３）、
（３）Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与し、３０分、６０分または１８０分後にＰＣＡを実施する菌糸体群（ｎ＝６×３）、
からなる。
【０１３５】
（iv）成績
抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体感作ラットにＤＮＰ−ＯＶＡ抗原を静脈内投与する前、時間を変えてＣＭ５０２−２株を経口投与した際の、ＰＣＡ反応抑制率を下記表６に示す。ＰＣＡ反応による局部皮膚での色素漏出状況を検討したところ、抗原静注６０分前に、子実体抽出画分または菌糸体抽出画分を経口投与した区の漏出量が最も少なく、その前後では色素漏出量は大きくなる傾向がみられた。
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
上記表６の結果をもとに、ＣＭ５０２−２株投与６０分後にＰＣＡ反応を実施するスケジュールで、ＣＭ５０２−２株の用量依存性を検討した結果を下記表７に示す。
【０１３８】
なおＣＭ５０２−２株として、実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分、実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１３９】
実験群は以下のとおりである。
【０１４０】
実験群７−Ｉ： 健常Wistarラットを用いる対照群（ｎ＝６）、
実験群７−II： Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇを投与する子実体１群（ｎ＝６）、
実験群７−III： Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分１５０ｍｇ／ｋｇを投与する子実体２群（ｎ＝６）、
実験群７−IＶ： Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与する子実体３群（ｎ＝６）、
実験群７−Ｖ： Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇを投与する菌糸体１群（ｎ＝６）、
実験群７−ＶI： Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分１５０ｍｇ／ｋｇを投与する菌糸体２群（ｎ＝６）、および
実験群７−ＶII： Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与する菌糸体３群（ｎ＝６）。
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
表７に示すように、子実体および菌糸体由来のいずれのＣＭ５０２−２株でも、投与量に依存して、色素漏出量はほぼ同程度抑制された。これらの成績は、ＣＭ５０２−２株が、アナフィラキシー反応の諸過程うち、皮膚小血管の透過性亢進抑制を介して、抗アレルギー作用を発現していることを示している。
【０１４３】
（実施例８）
［II型アレルギーに対する作用検討−１］
１９７３年にJH.PlayfairとS.Marshall-Clarkeにより、異種赤血球の頻回注射が、マウスにヒト自己免疫疾患類似の貧血症状を誘導することが報告された（JH. Playfair & S.Marshall-Clarke："Induction of red cell autoantibodies in normal mice"、Nature New Biology、243：213-214、1973）。本症状は、自己抗体と補体による赤血球障害により誘導されるものであり、典型的なII型アレルギーモデルとされている。そこで、本モデルを用いて、II型アレルギーに対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１４４】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ（以下、Ｃ５７ＢＬ／６）マウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１４５】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１４６】
（iii）実験群構成および処置
自己免疫溶血症状の誘導は、A. Mqadmiらの方法に準じた（A.Mqadmiら：CD4+CD25+ regulatory T cells control induction of autoimmune hemolytic anemia．"Blood"、105、3746−3748、2005）。すなわち、エーテル麻酔下、雌性Ｆ３４４ラット（８週齢、日本チャールス・リバー（株）から購入）の腹部大静脈から採血し、凝固防止のためにへパリンを加えた後、histopaqueTM−1077（シグマアルドリッチ社）を用いて、試薬添付マニュアルの方法に準じて赤血球を分離・回収した。ＲＰＭＩ培地で上記赤血球を１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整し、その０．２ｍＬ（２×１０8ｃｅｌｌｓ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス尾静脈に注射した。本処置は週１回、１０週間継続した。最終処置１週間後に、エーテル麻酔下、マウス腹部大静脈から採血し、凝固防止のためにへパリンを加えた後、末梢血液中の赤血球数を計数した。さらに、histopaqueTM−1077を用いて赤血球と血漿を分離・回収した。次に、所定量の赤血球と蛍光色素標識抗マウスＩｇＧ（Fluorescence-labeled anti-mouse IgG、Vector Lab.社、米国）の１０００倍希釈液とを２５℃で１時間反応後、フローサイトメトリー（Flow Cytometry）を用いて蛍光色素標識赤血球数を測定し、陽性率（全赤血球に対するマウスＩｇＧ結合赤血球数％）を算出した。さらに、標識赤血球懸濁液（５×１０7ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ）を健常Ｃ５７ＢＬ／６マウス尾静脈に注射し、毛細管を用いて経時的に眼窩静脈叢から採血し、フローサイトメトリーにより蛍光色素標識赤血球数を測定して、次式：〔注入１０分後の赤血球中の標識赤血球数×１００／注入直後の赤血球中の標識赤血球数〕からクリアランス率（％）を算出した。結果を表８に示す。
【０１４７】
実験群は下記構成とした。
【０１４８】
実験群８−Ｉ： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラット赤血球を週１回、１０週間処置する感作・対照群（ｎ＝８）、
実験群８−II： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラット赤血球を週１回、１０週間処置する期間中、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・子実体群（ｎ＝８）、
実験群８−III： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラット赤血球を週１回、１０週間処置する期間中、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・菌糸体群（ｎ＝８）、
実験群８−IＶ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いる非感作・対照群（ｎ＝８）、
実験群８−Ｖ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、経口投与する非感作・子実体群（ｎ＝８）、
実験群８−ＶI： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、経口投与する非感作・菌糸体群（ｎ＝８）。
【０１４９】
（iv）成績
下記表８に示すように、実験群８−Ｉ（感作・対照群）では、実験群８−IＶ（非感作・対照群）に比べ、末梢赤血球数は有意に少なく、マウスＩｇＧ結合赤血球の陽性率は８１％、クリアランス率は２３％で、自己免疫性溶血疾患の症状を明らかに呈していた。一方、実験群８−II（感作・子実体群）および実験群８−III（感作・菌糸体群）では、実験群８−Ｉに比し、感作による末梢赤血球数の減少は防止され、マウスＩｇＧ結合赤血球の陽性率は低値傾向にあり、標識赤血球の残存率も高値であった。すなわち、ＣＭ５０２−２株の投与により、自己免疫性溶血疾患の症状は軽減された。
【０１５０】
なお、実験群８−Ｖ（非感作・子実体群）および実験群８−ＶI（非感作・菌糸体群）では、末梢赤血球数は実験群８−IＶとほぼ同レベルであり、マウスＩｇＧ結合赤血球は検出限界以下で、クリアランス％も実験群８−IＶとほとんど変わりなかった。
【０１５１】
【表８】
【０１５２】
（実施例９）
［II型アレルギーに対する作用検討−２］
実施例８においてＣＭ５０２−２株のII型アレルギー改善作用が示されたので、そのメカニズムを解析するため、ＣＭ５０２−２株の補体に対する作用を調べた。
【０１５３】
（i）試験材料と方法
免疫溶血試験は森らの方法に準じた（森陸司ら、「アミノ安息香酸誘導体のin vitroにおける溶血反応阻害作用」、薬学雑誌、社団法人日本薬学学会、１９７５年、第９５巻、１４７７−１４８２頁）。すなわち、アルセバー氏液に保存された緬羊血液（（株）日本バイオテスト研究所から購入）を２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、生理食塩水で３回洗浄後、得られたパック細胞（packed cells）（赤血球）にｐＨ７．５のゼラチン・ベロナール緩衝液を加えて１０％懸濁液（ｖ／ｖ）とした。次に、この懸濁液０．２５ｍＬに３．０５ｍＬの０．１％炭酸ナトリウム溶液を加えて完全溶血させたとき、５４１ｎｍにおける吸光度が０．４５５になるように、同緩衝液を適量加えて調整したものを、羊赤血球懸濁液として実験に用いた。試験管に上記緩衝液５ｍＬ、被検液１ｍＬ、羊赤血球懸濁液０．５ｍＬ、２，５００倍希釈の抗羊赤血球家兎血清０．５ｍＬ、補体溶液（モルモットの新鮮血清を緩衝液で１００倍希釈したもの）１ｍＬを順次加えて静かに攪拌し、３７℃で９０分間反応させた。氷冷により反応を停止させ、５℃、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離の後、分光光度計を用いて５４０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。なお、ゼラチン・ベロナール緩衝液のみを添加したものを対照とし、補体の代わりにゼラチン・ベロナール緩衝液を加えたものを検体ごとにとり、それぞれの盲検値として補正した。被検物質による溶血阻害率は次式：［｛１−（被検物質添加群の吸光度−対応する盲検値）／（対照群の吸光度−対照群の盲検値）｝×１００％］に従って算出した。
【０１５４】
（ii）被検液（ＣＭ５０２−２株抽出物）の調製
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例５で調製した菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。
【０１５５】
（iii）成績
免疫溶血反応に及ぼすＣＭ５０２−２株のインビトロ（in vitro）添加の影響を下記表９に示す。ＣＭ５０２−２株添加により、反応は用量依存的に阻害された。特に、２００μｇ／ｍＬ添加時の溶血阻害率は、実施例１で調製した子実体由来画分で３５％、実施例５で調製した菌糸体抽出画分で２７％に達した。
【０１５６】
免疫溶血反応においてはＣａ2+およびＭｇ2+が重要な役割を演じており、これらの陽イオンを捕捉若しくは不活性化する物質は阻害活性を有することが知られている。また、アミノ安息香酸誘導体など、ある種の化合物は赤血球に作用し、膜の安定化を介して抗補体作用を示す。現在のところＣＭ５０２−２株の作用メカニズムは不明であるが、特定金属イオンとのキレート形成の可能性は低く、細胞膜を安定化させ、補体の作用を阻害しているものと推測される。
【０１５７】
【表９】
【０１５８】
（実施例１０）
［III型アレルギーに対する作用検討］
III型アレルギーは、抗原と抗体の凝集体である免疫複合体が組織に沈着することにより生じる。免疫複合体が補体を活性化しＣ５ａなどのアナフィラトキシンが放出され、血管透過性を亢進させることにより、好中球、単球、リンパ球、肥満細胞（マスト細胞）の遊走および活性化が起こり、組織傷害が惹起される。局所に免疫複合体が沈着することにより生じるアルサス反応（Arthus reaction）は、典型的なIII型アレルギーとされている。そこで、マウスを用いて、本反応に対するＣＭ５０２−２株の作用を検討した。
【０１５９】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１６０】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例４で調製した菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１６１】
（iii）実験群構成および処置
能動的アルサス反応の誘導は小谷らの方法に準じた（小谷敬子ら、「サラゾスルファピリジンおよびブシラミンのIII型およびIＶ型アレルギー反応に対する抑制効果」、炎症、日本炎症・再生医学会、１９９７年、第１７巻、８７〜８９頁）。すなわち、緬羊血液（（株）日本バイオテスト研究所）を２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、生理食塩水で３回洗浄後、得られたパック細胞（packed cells）（羊赤血球）にＰＢＳを加えて、２．５×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整し、その０．２ｍＬ（５×１０8ｃｅｌｌｓ）を、マウス尾静脈に２週間隔で２回注射した。２回目処置の５日後、ノギスを用いてマウス右足蹠部の厚さを測定した後、同部位皮下に０．０５ｍＬの赤血球（２×１０8ｃｅｌｌｓ）を注射し、３時間後、再び同部位の足蹠厚を測定した。反応の強さは、注射前後の足蹠厚さの差により算出した。
【０１６２】
実験群は以下のとおりである。
【０１６３】
実験群１０−Ｉ： ＢＡＬＢ／ｃマウスを羊赤血球で感作する感作・対照群（ｎ＝６）、
実験群１０−II： ＢＡＬＢ／ｃマウスを羊赤血球で感作する期間中、実施例１で調製した子実体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・子実体群（ｎ＝６）、
実験群１０−III： ＢＡＬＢ／ｃマウスを羊赤血球で感作する期間中、実施例４で調製した菌糸体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・菌糸体群（ｎ＝６）、
実験群１０−IＶ： 健常ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いる非感作・対照群（ｎ＝６）、
実験群１０−Ｖ： 健常ＢＡＬＢ／ｃマウスに、実施例１で調製した子実体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する非感作・子実体群（ｎ＝６）、
実験群１０−ＶI： 健常ＢＡＬＢ／ｃマウスに、実施例４で調製した菌糸体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する非感作・菌糸体群（ｎ＝６）。
【０１６４】
（iv）成績
下記表１０に示すように、羊赤血球感作マウス足蹠部に抗原を注射して能動アルサス反応を誘導した時、対照群の足蹠厚の増加は０．５８±０．１９ｍｍであった（実験群１０−Ｉ）。一方、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の抽出画分を経口投与した群の足蹠厚の増加は、それぞれ、０．２７±０．１１ｍｍおよび０．２２±０．１０ｍｍであり（実験群１０−IIおよび１０−III）、ＣＭ５０２−２株により反応は明らかに抑制された。なお、非感作マウス足蹠部に抗原を注射しても、足蹠部はほとんど腫脹せず、ＣＭ５０２−２株を投与しても影響を認めなかった（実験群１０−IＶ、１０−Ｖ、および１０−ＶI）。すなわち、ＣＭ５０２−２株によるIII型アレルギー反応の抑制が示された。
【０１６５】
【表１０】
【０１６６】
（実施例１１）
［IＶ型アレルギーに対する作用検討−１］
化学物質や薬品、植物成分などのハプテンの皮膚接触により、自己免疫性の皮膚炎を発生することが知られている。実験的には、塩化ピクリルやジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ：dinitrochlorbenzene）のような化学物質をマウスやモルモットの皮膚に塗布後、しばらくしてから、同物質を再接触させると、軽度の紅斑や腫脹、硬結を伴う遅延型反応が再現性よく出現する。そこで、IＶ型アレルギーモデルとして汎用されている塩化ピクリル接触性皮膚炎に対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１６７】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１６８】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例３で調製した菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１６９】
（iii）実験群構成および処置
接触性皮膚炎の誘発は、G.L. Asherson & W. Ptakの方法に準じて実施した（”Contact and delayed hypersensitivity in the mouse I. Active sensitization and passive transfer”、Immunology、15：405−416、1968）。すなわち、前日に腹部を剃毛したマウスの腹部に、木綿棒を用いて、７％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．１ｍＬを塗布することにより、マウスを抗原感作した。７日後、マウスの両耳朶に、それぞれ、１％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．０２ｍＬを塗布して接触性皮膚炎を誘発させた。さらに、その３日後に再び、腹部に７％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．１ｍＬを塗布して再感作した。その後、７日目に再びマウスの両耳朶に１％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．０２ｍＬを塗布し、２４時間後の耳朶の厚さを、ダイアルシックネスゲージ（Dial Thickness Gauge）を用いて測定し、誘発前の耳朶の厚さを差し引き、接触性皮膚炎による腫脹度とした。
【０１７０】
実験群は以下の構成とした。
【０１７１】
実験群１１−Ｉ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに塩化ピクリルを感作する対照群（ｎ＝８）、
実験群１１−II： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する子実体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−III： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する子実体群−２（ｎ＝８）、
実験群１１−IＶ： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する菌糸体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−Ｖ： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する菌糸体群−２（ｎ＝８）、
実験群１１−ＶI： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両耳朶に塩化ピクリルを塗布する非感作・対照群（ｎ＝８）、
実験群１１−ＶII： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−IIと同期間経口投与する非感作・子実体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−ＶIII： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−IIIと同期間経口投与する非感作・子実体群−２（ｎ＝８）、
実験群１１−IＸ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−IＶと同期間経口投与する非感作・菌糸体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−Ｘ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−Ｖと同期間経口投与する非感作・菌糸体群−２（ｎ＝８）。
【０１７２】
（iv）成績
下記表１１に示すように、塩化ピクリル感作マウス耳朶に抗原液を塗布してIＶ型アレルギー反応を誘導した時、対照群の耳朶厚の増加は０．５８±０．０９ｍｍであった（実験群１１−Ｉ）。一方、子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇおよび菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを経口投与した群の耳朶厚の増加は、それぞれ、０．３４±０．０９ｍｍおよび０．２９±０．０７ｍｍであり（実験群１１−IIIおよび１１−Ｖ）、ＣＭ５０２−２株により反応は明らかに抑制された。なお、非感作マウス足蹠部に抗原を注射しても、足蹠部はほとんど腫脹せず、ＣＭ５０２−２株を投与しても影響を認めなかった（実験群１１−ＶI、１１−ＶII、１１−ＶIII、１１−IＸおよび１１−Ｘ）。すなわち、ＣＭ５０２−２株によるIＶ型アレルギー反応の抑制が示された。
【０１７３】
【表１１】
【０１７４】
（実施例１２）
［IＶ型アレルギーに対する作用検討−２］
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１７５】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例３で得た静置培養菌糸体の培養物（粉末）、実施例４で得た振盪培養由来菌糸体の培養物（粉末）の所定量をＰＢＳに均一分散させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１７６】
（iii）実験群構成および処置
実験群１２−Ｉ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに塩化ピクリルを感作する対照群（ｎ＝８）、
実験群１２−II： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で得た静置培養菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する子実体粉末群（ｎ＝８）、
実験群１２−III： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例４で得た振盪培養由来菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する菌糸体粉末群（ｎ＝８）、
実験群１２−IＶ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で得た静置培養菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を実験群１２−IIと同期間経口投与する非感作・子実体粉末群（ｎ＝８）、
実験群１２−Ｖ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例４で得た振盪培養由来菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する非感作・菌糸体粉末群（ｎ＝８）。
【０１７７】
上記各群に、実施例１１と同様のプロトコールを用いて接触性皮膚炎に及ぼす作用を評価した。
【０１７８】
（iv）成績
下記表１２に示すように、感作・対照群（実験群１２−Ｉ）の耳朶厚の増加に比し、感作・子実体粉末群（実験群１２−II）および感作・菌糸体粉末群（実験群１２−III）において、耳朶厚の増加は抑制された。なお、非感作マウス足蹠部に抗原を注射しても、足蹠部はほとんど腫脹せず、ＣＭ５０２−２株を投与してもほとんど影響なかった。
【０１７９】
【表１２】
【０１８０】
（実施例１３）
［Ｖ型アレルギーに対する作用検討］
バセドウ病（若しくはグレイブス病）は、甲状腺自己抗体によって甲状腺が微慢性に腫大する自己免疫疾患である。本疾患はＶ型アレルギーに分類され、甲状腺肥大に加え、眼球突出、頻脈、甲状腺機能亢進症などをきたす。抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体（ＴＳＲＡｂ）による甲状腺の過剰刺激が、病態発現に密接に関与していると考えられている。
【０１８１】
バセドウ病の病態を反映する動物モデルは少ないが、１９９６年、下条らは、ヒト甲状腺ホルモン（ＴＳＨ）遺伝子とＭＨＣクラスＩＩ抗原遺伝子導入線維芽細胞を用いたモデルを開発し、病態誘導におけるＴｈ２関連の免疫応答の重要性を報告した（Shimojo N., et al., "Induction of Graves-like disease in mice by immunization with fibroblasts transfected with the thyrotropin receptor and a class II molecule", Proc. Acad. Sci., U.S.A., 93, 11074-79, 1996）。以降、類似のモデル系を用い、病態解析や新規治療方法が検討されている。最近では、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）や、インターロイキン−４、インターロイキン−１０などを用いた免疫調節療法による症状制御の可能性が注目されている。
【０１８２】
そこで、本発明では、抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体によるマウス甲状腺細胞のインビトロ（in vitro）3Ｈチミジン取り込み反応に及ぼすＣＭ５０２−２株の影響を検討した。
【０１８３】
（i）マウス甲状腺細胞懸濁液の調製
日本チャールス・リバー（株）から７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを購入した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。マウスが８週齢になった時点で、エーテル麻酔によりマウスを屠殺し、ピンセットとハサミを用いて、甲状腺を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地入りのシャーレ中にて組織を軽く解してピペッティングした後、２００メッシュのステンレス製フィルターを通して単細胞懸濁液を得た。ＲＰＭＩ１６４０培地にて、本細胞を３回洗浄後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ培地に調整した。
【０１８４】
（ii）ＣＭ５０２−２株由来成分の調製
実施例３で調製したホンシメジ静置培養菌糸体抽出画分の所定量をＤＭＳＯに溶解させ、サンプルとした。
【０１８５】
（iii）抗体溶液の調製
マウス由来受容体と反応することが知られている抗ヒト甲状腺刺激ホルモン受容体抗体〔ＴＳＨＲ（Ｈ−１５５）：ｓｃ−１３９３６、Santa Cruz Biotechnology Inc.、米国〕をＲＰＭＩ１６４０培地に溶解し、２ｍｇ／ｍＬ濃度に調整した。
【０１８６】
（iv）補体溶液の調製
モルモットをエーテル麻酔により屠殺し、注射針を装着した１０ｍＬ容注射筒を用いて、腹部大静脈から血清を採取し、室温にて１時間放置後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（血清）を回収して補体とした。本補体は、使用時に、ＲＰＭＩ１６４０培地で１００倍希釈した。
【０１８７】
（v）甲状腺細胞培養反応
９６ウエルの培養用平底プレートの各ウエルに、上記（i）で調製した細胞懸濁液１５０μＬに上記（ii）で調製した溶液（ＣＭ５０２−２株菌糸体抽出画分）を加え、３７℃の炭酸ガス培養器中で３時間反応させた後、上記（iii）で調製した抗体溶液５０μＬおよび上記（iv）で調製した補体溶液２５μＬを加え、さらに４８時間培養した。培養終了４時間前に、各ウエルに、3Ｈチミジン（アマーシャム社）１．０μＣｉ加えた。培養終了後、セルハーベスターを用いて、細胞をフィルター上に回収し、室温乾燥させた。フィルターをバイアルに入れ、シンチレーターを加えた後、シンチレーションカウンターを用いて、放射能を測定した。なお、甲状腺細胞の3Ｈチミジン取り込み阻害率は次式：［｛１−（実験群１３−II〜実験群１３−ＶIIの放射能）／（実験群１３−Ｉの放射能）｝×１００％］に従って算出した。
【０１８８】
なお上記実験手続において、菌糸体抽出画分、抗体溶液、補体溶液については、下記のとおり実験群に応じて無添加とした。実験群は以下の構成とした（各群：ｎ＝３）。
【０１８９】
実験群１３−Ｉ： 細胞懸濁液のみの対照群（菌糸体抽出画分、抗体溶液、補体溶液のいずれも添加せず）、
実験群１３−II： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を１００μｇ／ｍＬ添加した菌糸体抽出画分添加群（抗体溶液、補体溶液の添加なし）、
実験群１３−III： 細胞懸濁液に抗体溶液（５０μＬ）を添加した抗体溶液添加群（菌糸体抽出画分、補体溶液の添加なし）、
実験群１３−IＶ： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を１００μｇ／ｍＬ、および補体溶液（２５μＬ）を添加した補体溶液・菌糸体画分添加群（抗体溶液の添加なし）、
実験群１３−Ｖ： 細胞懸濁液に抗体溶液（５０μＬ）、および補体溶液（２５μＬ）を添加した抗体溶液・補体溶液添加群（菌糸体抽出画分の添加なし）
実験群１３−ＶI： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を５０μｇ／ｍＬ、抗体溶液（５０μＬ）、および補体溶液（２５μＬ）を添加した抗体溶液・補体溶液・菌糸体抽出画分添加群、
実験群１３−ＶII： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を１００μｇ／ｍＬ、抗体溶液（５０μＬ）、および補体溶液（２５μＬ）を添加した抗体溶液・補体溶液・菌糸体抽出画分添加群。
【０１９０】
（vi）成績
細胞の放射能取り込みに及ぼすＣＭ５０２−２株静置培養菌糸体由来物のインビトロ（in vitro）添加の影響を下記表１３に示す。ＣＭ５０２−２株由来物の添加により、3Ｈチミジン取り込み反応は用量依存的に阻害された。特に、実験群１３−ＶのＣＭ５０２−２株非添加・コントロールの阻害率５８．０％に比し、実験群１３−ＶIIのＣＭ５０２−２株１００μｇ／ｍＬ添加時の阻害率は３５．８％であり、抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体による甲状腺機能変化は明らかに軽減されていた。
【０１９１】
現在のところ、作用メカニズムは不明であるが、ＣＭ５０２−２株が甲状腺細胞の抗体感受性に影響を及ぼしているのか、またはＣＭ５０２−２株が補体の作用を阻害しているものと推測される。
【０１９２】
【表１３】
【０１９３】
（まとめ）
Ｉ〜Ｖ型アレルギーのモデル動物を作成し、ホンシメジＣＭ５０２−２株の活性を評価した。
（１）ＤＮＰ結合卵白アルブミン（ＤＮＰ−ＯＶＡ）に対するラットの能動的全身アナフィラキシー反応は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。受身アナフィラキシー反応を用いたメカニズム解析により、これら画分は皮膚小血管の透過性亢進抑制を介して作用を発現していると考えられた。
（２）異種細胞（ラット赤血球）の頻回注射により誘導される自己免疫溶血反応は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。抗体と補体を用いたインビトロ（in vitro）メカニズム解析により、これら画分は補体を介して作用を発現していると考えられた。
（３）羊赤血球に対するマウスの能動的アルサス反応は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。
（４）マウスの塩化ピクリル接触性皮膚炎は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。
（５）抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体によるマウス甲状腺細胞の3Ｈチミジン取り込み反応低下は、ＣＭ５０２−２株の子実体抽出画分の共存により軽減された。
【０１９４】
以上により、ホンシメジＣＭ５０２−２株（＝ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株）は、Ｉ型、II、III、IＶおよびＶ型アレルギーを抑制することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】ＰＤＹ寒天平板で生育したホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸の顕微鏡写真（図面代用写真）である。
【図２】図１に示す顕微鏡写真の部分拡大写真（図面代用写真）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物やヒトにおけるアレルギーの予防・治療のための薬剤および食品に関する。本発明の薬剤および食品は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本を初めとする先進国において、生活環境等の変化により、アレルギー疾患の罹患率は急増している（厚生省統計情報部保健福祉動向調査、１９９１年）。日本人の場合、３人に１人は何らかのアレルギー症状をもっているといわれており、いわゆる「国民病」として、社会的問題になっている。
【０００３】
アレルギーは、外部から生体内に自己以外の物質などが異物として侵入することによって発症する免疫疾患であり、発症機序に基づき、Ｉ〜Ｖ型の５種類にタイプ分類される。すなわち、Ｉ型アレルギー反応は即時型、II型アレルギー反応は細胞傷害型、III型アレルギー反応は免疫複合体型、IＶ型アレルギー反応は遅延型、Ｖ型アレルギー反応は細胞刺激型といわれる。Ｉ型では気管支喘息やアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アナフィラキシー、食物アレルギー、蕁麻疹などが、II型では溶血性貧血やグッドパスチャー症候群、肺出血、腎炎などが、III型では血清病や膠原病（全身性エリテマトーデスや関節リウマチなど）、糸球体腎炎、過敏性肺炎などが、IＶ型では接触性皮膚炎や移植片拒絶反応などが、Ｖ型ではバセドウ病や重症筋無力症、Ｉ型糖尿病などが関与疾患とされている。いずれの疾患も発症に至るまでの過程は複雑・多様であり、アレルギーのトリガーが引かれてから、症状を呈するまでには、体内で様々な反応が起きる。本疾患の原因物質は主としてタンパク質であり、修飾因子は遺伝的背景や成育環境などであるが、反応の強さはアレルギー応答を調節する物質の摂取または暴露によっても影響される。
【０００４】
これらアレルギー反応に由来する症状や愁訴は、患者のＱＯＬ（quality of life；生活の質）に重大な影響を及ぼすだけではなく、場合によっては致死的な転帰をたどることもある。アレルギーを予防するためには、抗原物質との接触を避けることが基本であり、低アレルゲン加工食品摂取や抗原物質注射による減感作療法も行われる。さらに、アレルゲンの速やかな同定も治療方針をたてる上で重要である。発症した場合の治療薬として、症状が軽症の時は抗ヒスタミン剤や抗アレルギー薬、重症の時はステロイド剤の使用が一般的である。また、ビタミン類や脂肪酸、抗酸化物質、細菌製剤の投与も試みられている。しかし、薬の効き目が個々人により異なること、製剤等の服用を中断することによる疾患の再燃、治療中に発生する副作用などが問題視されており、有効な治療若しくは予防法の開発が求められている。
【０００５】
本発明者は、これらアレルギー反応を調節する方法を鋭意検討する過程で、Ｉ〜Ｖ型アレルギーの実験モデルを作成し、食用キノコ由来物質等の活性を評価したところ、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）、特にはホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株が、優れたアレルギー反応抑制活性を有することを見出し、本発明に至った。
【０００６】
ホンシメジは、担子菌キシメジ科シメジ属に属するキノコであり、「香りマツタケ、味シメジ」と古くからいわれるように、古来より食され、副作用の心配は少ない。本キノコは稀少な菌根菌であり、菌糸体の形での増殖は可能であるが、人工栽培はできないとされていた。しかし、最近の研究で、ある条件を選べば、栽培できるような技術が報告されている。すなわち、栄養菌糸体だけでなく、子実体でも利用可能であり、産業応用上必須な量的供給には問題ない。
【０００７】
なお従来、シメジ属に属するキノコを利用した技術として制癌剤を製造する方法が知られている（例えば、特許文献１〜２参照）が、Ｉ〜Ｖ型アレルギーのどのタイプにも有効なキノコまたは成分は、本発明者が知る限りにおいて、これまで報告がされていない。
【０００８】
【特許文献１】特公昭５１−１６７号公報
【特許文献２】特公昭５２−４４６３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、ホンシメジ、特にはＮＩＴＥ Ｐ−２６０株が、アレルギーに対し優れた予防・治療効果を有することを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明の課題は、ホンシメジ、特にはＮＩＴＥ Ｐ−２６０株、を利用したアレルギー予防・治療剤および食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために本発明は、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を提供する。
【００１２】
また本発明は、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む、アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１３】
また本発明は、ホンシメジ（L. shimeji）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１４】
また本発明は、ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１５】
また本発明は、ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、乾燥粉末である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【００１６】
また本発明は、ホンシメジ抽出物が、ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、または有機溶媒抽出液である、上記アレルギー予防・治療剤および食品を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、安全で、安定的に大量供給が可能な、アレルギー予防・治療のための薬剤および食品が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに平成１８年９月１日付で寄託したものである。このホンシメジ（L. shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は、福島県南会津郡にて採取したホンシメジＣＭ５０２−２株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養し、生育した菌糸を継代することにより得たものである。
【００１９】
本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の子実体の形態は、今関六也・本郷次雄編の「原色日本新菌類図鑑（１）」、保育社（大阪）、昭和６２年発行、プレート（Plate）９および５８頁記載のホンシメジ子実体に合致するものであった。
【００２０】
本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の継代は、ペプトン・デキストロース・イースト（以下、ＰＤＹ）寒天斜面培地で実施することができ、現在、株式会社クレハ・生物医学研究所にて維持されている。前記菌株の菌糸体を大量培養する場合には、液体培地に本菌を接種し、例えば、静置培養、振盪培養、またはタンク培養により実施することができる。また、固形培地に接種し、静置培養により子実体を形成させることもできる。
【００２１】
本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体をＰＤＹ寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、比較的大きなコロニーを形成する。また、走査型電子顕微鏡観察では、後述のように、太さ２〜３μｍの枝状の菌糸が無数に存在し、担子菌類特有のループ状のクランプ構造の存在を認める。
【００２２】
以下、本発明のホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の分類学的性質について記載する。
【００２３】
〔本発明菌株の培養的・形態的性質〕
（１）麦芽エキス寒天培地での生育状態
麦芽エキス寒天（Malt Extract Agar）（OXOID Ltd.、英国）５０ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注して麦芽エキス寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目のコロニーの肉眼観察では、白色の菌糸がマット状に密に伸長し、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は５６±３ｍｍ、７７±２ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００２４】
（２）ポテト・グルコース寒天培地での生育状態
ポテト・デキストロース寒天培地「ダイゴ」（日水製薬（株））３９ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してポテト・グルコース寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目の観察では、白色菌糸が放射状に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかったが、コロニーの厚さは上記（１）におけるコロニーに比べると薄かった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は４０±５ｍｍ、６９±１ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００２５】
（３）ツァペック寒天培地での生育状態
ディフコ・ツァペック溶液寒天（DifcoTM Czapek Solution Agar）（Becton Dickinson and Company，米国）４９ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してツァぺック寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目の観察では、気菌糸は極めて少なく、白色菌糸がかろうじて判別できる程度に樹状に希薄に伸長、コロニー裏面の中心部はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は３８±３ｍｍおよび６３±３ｍｍであり、培養開始２０日目にはコロニーは約８３ｍｍのシャーレ先端部に達していた。
【００２６】
（４）サブロー寒天培地での生育状態
サブロー寒天培地「ニッスイ」顆粒（日水製薬（株））６５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してサブロー寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色菌糸が放射状で比較的密に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目、１５日目および２０日目のコロニー径は、それぞれ、３０±５ｍｍ、５８±３ｍｍおよび６６±４ｍｍであった。
【００２７】
（５）オートミール寒天培地での生育状態
ディフコ・オートミール寒天（DifcoTM Oat Meal Agar）（Becton Dickinson and Company，米国）７２．５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してオートミール寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始１５日目の観察では、白色菌糸がマット状に密に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は５３±６ｍｍおよび８３±１ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００２８】
（６）合成ムコール寒天培地での生育状態
グルコース４０ｇ、アスパラギン２．０ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．０２５ｇ、チアミン塩酸塩０．５ｍｇおよび寒天１５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注して合成ムコール寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色菌糸が放射状、やや希薄に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は１８±３ｍｍおよび３３±６ｍｍであり、培養開始２０日目には４７±１２ｍｍに達した。
【００２９】
（７）ＹｐＳｓ寒天培地での生育状態
可溶性デンプン１５ｇ、酵母エキス４ｇ、リン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇおよび寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解、ｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してＹｐＳｓ寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色の菌糸が放射状に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。コロニーの厚さは上記（１）や（２）でのコロニーに比べると明らかに薄かった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は１５±５ｍｍおよび５８±６ｍｍであり、培養開始２０日目には８０±２ｍｍに達した。
【００３０】
（８）グルコース・ドライイースト寒天培地での生育状態
グルコース１０ｇ、乾燥酵母（エビオス錠、アサヒフードアンドヘルスケア（株））５ｇ、リン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇおよび寒天１５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してグルコース・ドライイースト寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色の菌糸が放射状にやや希薄に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養１０日目および１５日目のコロニー径は４０±４ｍｍおよび６５±５ｍｍに達し、培養開始２０日目にはコロニーは内径約８３ｍｍのシャーレ全体を覆っていた。
【００３１】
（９）コーンミール寒天培地での生育状態
コーンミール寒天（Corn Meal Agar）（シグマアルドリッチ社）１７ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してコーンミール寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。培養開始２０日目の観察では、白色の菌糸が放射状、やや希薄に伸長、コロニー裏面はほとんど着色しなかった。培養開始１０日目および１５日目のコロニー径は３２±４ｍｍおよび５７±２ｍｍであり、培養２０日目には８１±１ｍｍに達した。
【００３２】
（１０）ＰＤＹ寒天平板で生育した菌糸の形態
グルコース２０ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇおよび寒天２０ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してＰＤＹ寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中央部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で１４日間培養した。培養終了後、ニードルを用いて、寒天平板上に生育したコロニーの一部をサンプリングした。このサンプリングしたものを試料とし、これをＯＣＴコンパウンド（凍結用包埋剤）を塗布した試料台に載せ、フィールドエミッションＳＥＭ専用装置ＡＬＴＯＡ２５００（オックスフォード・インストゥルメンツ（株））を用い、添付マニュアルに準じてサンプル調製した。すなわち、スラッシュ・チャンバー内に液体窒素を入れて減圧状態にすることにより、スラッシュ窒素を作製した。次に、交換棒に上記試料を取り付け、チャンバー内のスラッシュ窒素に入れて凍結させた後、プレパレーション・チャンバーに取り付けた。−９５℃にて付着水分を昇華させた後、金属蒸着を行った。そして、走査型電子顕微鏡ＪＳＭ−７４０１（日本電子（株））を用いて、処理試料の表面状態を観察した。
【００３３】
上記顕微鏡写真を図１〜２に示す。図１は撮影倍率１，０００倍、図２は撮影倍率５，０００倍で図１の部分拡大写真である。いずれも加速電圧２．０ｋＶで撮影した。図１〜２に示す顕微鏡写真から明らかなように、本発明菌株のコロニー表面には、太さ２〜３μｍの菌糸およびループ状のクランプが観察された。この構造は菌糸の隔壁部にある突起であり、担子菌に特有のものである。なお、表面に付着している球形物質は、菌糸付着の水分が凍結したものである。
【００３４】
〔本発明菌株の生理学的性質〕
（１）最適生育条件および生育の範囲（温度、ｐＨ）
グルコース２０ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇおよび寒天２０ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してペプトン・デキストロース・イースト寒天平板（以下、ＰＧＹ寒天平板）を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃および３５℃の恒温器中で培養し、経時的にコロニー径を測定した（各培養温度：ｎ＝３）。結果を表１に示す。
【００３５】
表１の結果から明らかなように、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は１０〜３０℃の範囲で増殖し、最適生育温度は２０〜２５℃であった。
【００３６】
【表１】
【００３７】
次に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン２ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇおよびリン酸一カリウム０．５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整した。１００ｍＬ容フラスコに上記液（培地）を２０ｍＬずつ分注後、１２１℃、２０分間の滅菌処置を行った。ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株をフラスコ内の上記培地に接種し、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃および３５℃の恒温器中で培養、２１日目に内容物を取り出し、濾過により菌体を分離、蒸留水にて洗浄した後、凍結乾燥して乾燥質量を測定した（各培養温度：ｎ＝３）。結果を表２に示す。
【００３８】
表２の結果から明らかなように、菌体質量を指標とした場合でも、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の生育温度は５〜３０℃であり、最適生育温度は２０〜２５℃であることが確認できた。
【００３９】
【表２】
【００４０】
次に、蒸留水１００ｍＬに、グルコース２．０ｇ、ポリペプトン０．２ｇ、酵母エキス０．２ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｇおよびリン酸一カリウム０．０５ｇを加えて溶解させた後、１Ｎ塩酸または１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて培地のｐＨを下記表３に示す値にそれぞれ調整した。１００ｍＬ容フラスコにｐＨ調整済み培地を２０ｍＬずつ分注後、１２１℃、２０分間の滅菌処置を行った。ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株をフラスコに接種し、２５℃の恒温器中で培養、２０日目に内容物を取り出し、濾過により菌体を分離、蒸留水にてよく洗浄した後、凍結乾燥して乾燥質量を測定した（各培地ｐＨ：ｎ＝３）。結果を表３に示す。
【００４１】
表３の結果から明らかなように、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の生育限界はｐＨ４．０〜１０．０の範囲にあり、最適生育ｐＨは６．５付近であった。
【００４２】
【表３】
【００４３】
（２）フェノールオキシダーゼ反応検定用培地での生育
麦芽エキス寒天（Malt Extract Agar）５．０ｇ、タンニンン酸０．５ｇおよび没食子酸０．５ｇに蒸留水１００ｍＬを加え、液のｐＨを６．１に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してフェノールオキシダーゼ反応検定用寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近の培地にホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。
【００４４】
培養開始５日目および１０日目の観察では、気菌糸の生育はほとんどみられず、シャーレ裏面の褐変域は径１８±３ｍｍおよび２０±３ｍｍであった。培養開始２０日目、褐変域の径は４３±７ｍｍに達したが、菌糸の生育は極めて遅かった。
【００４５】
次に、ポテト・デキストロース寒天培地「ダイゴ」３．９ｇ、タンニン酸０．５ｇおよび没食子酸０．５ｇに蒸留水１Ｌを加え、液のｐＨを５．５に調整して１２１℃、２０分間の滅菌後、当該液を無菌シャーレに約１５ｍＬずつ分注してフェノールオキシダーゼ反応検定用寒天平板を作成した。本シャーレを室温に放置して寒天を固化させた後、シャーレ中心部付近の培地にホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器で培養した。
【００４６】
培養開始１０日目および１５日目の観察では、気菌糸の生育は不良で、シャーレ裏面の褐変域は径８±３ｍｍおよび１０±１ｍｍであった。
【００４７】
（３）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（Ohta，”Trans. Mycol. Soc. Jpn.”，31，323，1990）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、４０日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定したところ、菌体６７２±１３ｍｇが得られた。
【００４８】
前記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、６種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。糖質関連物質の添加量はグルコースの炭素相当量になるように設定した。
【００４９】
その結果、菌体質量が多かった糖質関連物質から菌体質量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下の通りである。
【００５０】
デンプン＞グルコース＞フラクトース＞トレハロース＞スクロース＞マルトース＞マンニトール。
【００５１】
すなわち、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株はデンプン、グルコース、フラクトース、トレハロースを添加した培地で良好な生育を示したが、糖アルコールの資化能力は低かった。
【００５２】
次に、前記培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、９種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。なお、窒素関連物質の添加量は酒石酸アンモニウムの窒素相当量になるように設定した。
【００５３】
その結果、菌体質量が多かった窒素関連物質から菌体質量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下の通りである。
【００５４】
コーンスティープリカー＞ポリペプトン＞酵母エキス＞カザミノ酸＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞硝酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸カリウム。
【００５５】
すなわち、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株は有機態窒素を添加した培地で良好な生育を示したが、無機態窒素の資化能力は劣っていた。
【００５６】
さらに、前記合成培地に、特定のミネラル１〜１０ｍｇ／Ｌをさらに追加した培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。
【００５７】
その結果、供試ミネラル５種類のうち、硫酸コバルト・７水塩、硫酸ニッケル・６水塩および硫酸銅・７水塩を追加した実験群で、菌体質量は対照群に比べて明らかに増加した。
【００５８】
一方、前記合成培地に、特定のビタミンをさらに追加した培地に、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株を接種し、２５℃の恒温器中で培養し、培養終了後、菌体質量を測定したところ、供試ビタミン８種類のうち、培地に葉酸を追加した実験群で、菌体質量は明らかに増加した。
【００５９】
すなわち、コバルト、ニッケル、銅および葉酸はホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の増殖を促進する成分と考えられる。
【００６０】
〔対峙培養による帯線生成の有無観察〕
ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株と、財団法人発酵研究所から分譲を受けたホンシメジの標準菌株（ＩＦＯ８３３５、ＩＦＯ３２１８７、ＩＦＯ３２１８８、ＩＦＯ３２１８９）との異同について、寒天培地上で対峙培養を行うことにより調べた。
【００６１】
すなわち、ＰＧＹ寒天平板の中央部付近に、径約６ｍｍのホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌ブロックと供試菌株の菌ブロックを２ｃｍ間隔で対峙して接種し、２５℃の恒温器中で培養した。培養開始１３日後、両コロニーの境界部に帯線が生じるか否かを判定した。併せて供試菌株どうしでの対峙培養も行った。結果を表４に示す。
【００６２】
表４に示す結果から明らかなように、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株はすべての供試菌株と拮抗し、寒天平板上に帯線が生じたことから、新規菌株であることは明らかである。
【００６３】
【表４】
【００６４】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、有効成分として、ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む。
【００６５】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）は、菌糸体、培養物（Broth）、子実体のいずれの形態のものも用いることができ、生でも乾燥したものでもよい。本発明では子実体は胞子も含むものとする。これら菌糸体、培養物（Broth）、子実体の抽出物も用いることができる。
【００６６】
本発明では特に上記したホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株が好ましく用いられる。具体的には、（i）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体〕、（ii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒可溶性画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のクロロホルム・メタノール混合液抽出画分〕、（iii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体の熱水抽出画分〕、および（iv）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ溶液抽出画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のアルカリ溶液抽出画分〕等の態様が好ましく例示される。ただしこれら例示に限定されるものでない。
【００６７】
（i）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物から適当な除去手段（例えば、濾過）により培地を除去しただけの状態で使用することもできるし、あるいは、培地を除去した後の菌糸体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
【００６８】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の培養物（Broth）としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）または子実体（すなわち培養子実体）と培地との混合物の状態で使用することもできるし、あるいは、前記混合物から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥や熱風乾燥）により水分を除去した培養物（Broth）乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記培養物（Broth）乾燥物を粉砕した培養物（Broth）乾燥物粉末の状態で使用することもできる。なお培養工程は、特に限定されるものでなく、一般にホンシメジ菌を培養する方法を任意に用いることができる。
【００６９】
培養工程は公知の方法で行うことができる。例えば静置培養では、ホンシメジ菌を固形培地または液体培地で培養または保存したもの（ホンシメジ菌含有培養液）を、液体培地に接種する。該静置液体培養での培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５度である。培養期間は１０〜６０日間程度が好ましく、より好ましくは２０〜４０日間程度である。静置液体培養では通常１００ｍL〜２Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。
【００７０】
また、振盪培養では通常３００ｍL〜５Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。振盪培養では、培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃である。培養期間は７〜２８日間程度が好ましく、より好ましくは１０〜１４日間程度である。振盪培養ではフラスコを３５〜２００ｒｐｍの回転数で振盪させるのが好ましい。
【００７１】
菌床栽培では、例えば、広葉樹おがこと、精麦済み粒状の大麦に、カリウムや鉄などを主成分とする無機栄養成分を添加した培地を用い、２０〜２５℃で菌糸培養を行い、菌糸が培地全体に蔓延した頃（接種してから約４０〜５０日後）、ピートや鹿沼土を用いて、培地上に厚さ１ｃｍ位の覆土を施し、さらに７〜１０日間培養した後、室温を１５℃近辺にすると、約１ヶ月位で子実体を収穫することができる。また、培養期間中、適宜の湿度調整や光照射により、子実体形成を促進させることができる。
【００７２】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の子実体としては、例えば、子実体をそのままで、または子実体を破砕した状態で使用することもできるし、あるいは、子実体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには、前記子実体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
【００７３】
（ii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒可溶性画分（＝有機溶媒抽出液）
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒抽出液は、例えば、培養により得られるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体を、有機溶媒で抽出することにより得ることができる。
【００７４】
抽出に用いる有機溶媒は、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株に含有される抗アレルギー作用を示す成分を抽出できる溶媒である限り、特に限定されるものではなく、例えば、脂溶性有機溶媒（例えば、クロロホルム、メタノール、エーテル、エタノール、酢酸エチルまたはヘキサン）またはそれらの混合物（例えば、クロロホルムとメタノールとの混合液）を用いることができる。なかでもクロロホルムとメタノールとの混合液が好ましい。
【００７５】
有機溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合液を使用する場合には、その混合比〔クロロホル：メタノール（ｖ／ｖ）〕は、例えば、１０：１〜１：１０であることができる。
【００７６】
有機溶媒抽出は、１５〜３０℃の温度で実施することが好ましい。また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、攪拌または振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は特に限定されるものでなく、ホンシメジの状態（子実体、菌糸体または培養物のいずれかの状態であるか、あるいは、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態、など）、有機溶媒の種類・温度、攪拌・振盪の有無等、実施条件に応じて適宜決定することができるが、通常０．２５〜３時間程度であり、０．５〜１．５時間程度が好ましい。
【００７７】
得られた有機溶媒抽出画分は、例えば、不溶物が混在する状態でそのまま、あるいは、不溶物を除去した抽出液の状態で、さらには、適当な処理（例えば、濃縮若しくは希釈、乾燥または再溶解）を施した状態で、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることができる。
【００７８】
なお、有機溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合液を使用する場合には、有機溶媒抽出を実施することにより、水層、中間層およびクロロホルム／メタノール混合層とが形成される。この場合、クロロホルム／メタノール混合層単独、あるいは、中間層とクロロホルム／メタノール混合層との混合物（すなわち、非水層）を、ホンシメジの有機溶媒抽出画分として使用することができる。
【００７９】
（iii）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出画分（＝熱水抽出液）
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分として好適に用いられるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液は、例えば、培養により得られるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体を、熱水で抽出することにより得ることができる。
【００８０】
抽出に用いる熱水の温度は、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株に含有される抗アレルギー作用を示す成分が、活性を失わない状態で、熱水抽出液中に充分抽出されることのできる温度である限り、特に限定されるものではないが、６０〜１００℃程度が好ましく、８０〜９８℃程度がより好ましい。
【００８１】
菌糸体または子実体を熱水抽出に用いる場合には、抽出効率が向上するように、粉砕物または粉末の状態に加工することが好ましい。
【００８２】
また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌または振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、ホンシメジの状態（子実体、菌糸体または培養物のいずれかの状態であるか、あるいは、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態、など）、熱水の温度、攪拌若しくは振盪の有無等、実施の条件に応じて適宜決定することができるが、通常１〜６時間程度であり、２〜３時間程度が好ましい。
【００８３】
得られた熱水抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることもできるし、あるいは、不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、さらに、抽出液中の低分子画分を除去してから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることもできる。例えば、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることができる。あるいは、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いることができる。
【００８４】
（iv）ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ液抽出画分（＝アルカリ液抽出液）
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品における有効成分であるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ溶液抽出液の製法は、例えば、上述したホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液の製造方法に準じた方法により実施することができる。すなわち、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液の前記製造方法と同様の方法により調製することができる。例えば、培養により得られるホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体（すなわち、培養菌糸体）、培養物（Broth）、または子実体を、アルカリ溶液で抽出することにより得ることができる。
【００８５】
アルカリ溶液抽出に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは８〜１３が好ましく、９〜１２がより好ましい。アルカリ溶液抽出は、０〜３０℃程度で実施するのが好ましく、０〜２５℃程度がより好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体残渣の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、アルカリ溶液のｐＨ若しくは温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常３０分間〜５時間程度であり、１〜３時間程度が好ましい。得られたアルカリ溶液抽出液は、そのまま、あるいは所望により中和処理を実施してから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の有効成分として用いる。
【００８６】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、有効成分であるホンシメジ、特にはホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体〕、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の有機溶媒可溶性画分〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のクロロホルム・メタノール混合液抽出画分〕、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の熱水抽出液〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体の熱水抽出液〕、あるいは、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株のアルカリ溶液抽出液〔例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）、または子実体のアルカリ溶液抽出液〕を、単独で、あるいは所望により薬学的に許容し得る担体とともに、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。上記有効成分はいずれもアレルギー症状に対する予防若しくは治療活性を有する。
【００８７】
本発明において「アレルギー予防・治療」とは、動物やヒトなどにおいて、アレルギー反応により生じる疾患の発症の予防、アレルギー反応により生じる疾患の発症後（病的状態）の治療を意味するが、アレルギー反応により生じる疾患の発症を遅延・抑制せしめる効果も含む。またアレルギー反応により生じる疾患により誘発され得る疾患の発症防止効果（アレルギー反応により生じる疾患に付随して発生する各種症状の防止）も含む。したがって、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の投与・摂取時期は、特に限定されるものではないが、日常的に継続投与・摂取するのが好ましい。
【００８８】
アレルギー反応により生じる疾患の種類や症状は多種多様であるが、後述の実施例に示すように、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品はアレルギー反応のタイプＩ〜Ｖ型のいずれにも有効なことから、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、単に特定症状・疾患に対してだけでなく、アレルギー誘発症状全般に対して有効性が見込まれる。
【００８９】
本発明の対象となる具体的疾患として、アナフィラキシーショック、気管支喘息、花粉症、蕁麻疹、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸症、アレルギー性口内炎、アレルギー性紫斑病、アレルギー性肉芽腫、自己免疫性溶血性貧血、胎児赤芽球症、薬物による溶血性貧血、橋本甲状腺炎、血小板減少性紫斑病、顆粒細胞減少症、血清病、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺好酸球増多症、アレルギー性肺胞炎、肺結核、接触皮膚炎、全身性エリテマトーデス、ＰＮ型血管炎などが挙げられる。
【００９０】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の投与時期は、その投与によりアレルギー反応が抑制可能である限り、特に限定されるものではなく、例えば、予防的投与、治療的投与、治療後の再発予防的投与が可能である。
【００９１】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品の投与・摂取剤型としては特に限定されるものでなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、座剤、局所投与のクリーム、点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００９２】
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、デンプンコーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法により製造することができる。
【００９３】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内など）等が例示される。なかでも注射剤が最も好適に用いられる。
【００９４】
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。
【００９５】
また、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明のアレルギー予防・治療剤および食品をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００９６】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品は、これに限定されるものではないが、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株あるいはその抽出物（例えば、当該株の、有機溶媒抽出液、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液）等の有効成分を０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の量で含有することができる。
【００９７】
本発明のアレルギー予防・治療剤および食品を用いる場合の投与・摂取量は、被投与者の年齢、性別、体重、または投与・摂取方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまた非経口的に投与・摂取することが可能である。
【００９８】
また、投与・摂取形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株あるいはその抽出物（例えば、当該株の、有機溶媒抽出液、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液）等の有効成分を、添加剤（食品添加剤など）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、またはうがい剤等に添加することができる。
【００９９】
なお、上記において、特定保健用食品は、その食品が持つ健康機能の表示が認められる食品（食品ごとに厚生労働省の許可を必要とする）をいい、栄養機能食品は栄養成分の機能を明記できる食品（厚生労働省が作成した規格基準を満たす必要あり）をいい、いわゆる健康食品とは上記保健機能食品以外の食品一般を広く意味するもので、健康補助食品等を含むものである。
【実施例】
【０１００】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によってなんら限定されるものでない。
【０１０１】
（実施例１）
［天然由来ホンシメジ子実体の粉末、および該子実体抽出画分の調製］
福島県南会津郡で採取したホンシメジＣＭ５０２−２株〔＝ホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株〕の子実体１，０５０ｇを軽く水洗した後、凍結乾燥し、得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末９２ｇを得た（なお、本子実体組織の一部は無菌状態で切り出し、試験管内で培養して菌糸継代株樹立に用いた）。
【０１０２】
上記子実体粉末１．０ｇを、３００ｍＬ容のビーカーに入れ、次いでクロロホルムとメタノールとの混合液（２：１、ｖ／ｖ。以下、「ＣｈＭｅ液」と記す）５０ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出した。この操作を３回繰り返した後、水層部、中間層、およびＣｈＭｅ液層をそれぞれ回収した。ＣｈＭｅ液層と中間層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．５５ｇ（以下、「天然子実体抽出画分」と記す）を得た。
【０１０３】
（実施例２）
［菌床栽培由来ホンシメジ子実体の培養物、および該子実体抽出画分の調製］
ホンシメジＣＭ５０２−２株の菌床栽培は、吉田らの方法に準じた（吉田ら、日菌報、日本菌学会、１９９４年、第３５巻、１９２頁）。すなわち、可溶性デンプン１００ｇ、グルコース２５ｇ、ペクチン１ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．５ｇ、チアミン塩酸塩１．０ｍｇおよび炭酸カルシウム５ｇに蒸留水１０００ｍＬを加えた後、活性炭粉末５ｇを加え、均一に分散するようによく攪拌した。
【０１０４】
ピートモスを充填した市販のフィルター付菌床栽培袋に、ピートモス０．１６ｇ／培地ｍＬになるように上記培地を加え、中央部に径１．５ｃｍの穴をあけた後、１２１℃、７５分間の滅菌処理を施した。滅菌済み培養基の水分含量は８４〜６５％、ｐＨは５．５であった。
【０１０５】
この培養基に、株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を接種し、２３℃、湿度７５％に調整した恒温器内で、遮光下、３ヶ月間培養して菌糸を生育・熟成させた。次に、温度１７℃、湿度９０％に調整した培養器に上記培養基を移し、約５０ルクスの白色蛍光灯を照射したところ、２０日目頃から子実体原基が生じ、３０日頃から子実体が発生した。培養開始３５日目の成熟子実体収量は４１．１ｇ湿質量／培地ｍＬであった。
【０１０６】
培養終了後、子実体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末３．２９ｇを得た。さらに、実施例１と同様にして有機溶媒抽出（ＣｈＭｅ液抽出）を行い、回収した中間層とＣｈＭｅ液層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．１９ｇ（以下、「菌床栽培子実体由来抽出画分」と記す）を得た。
【０１０７】
（実施例３）
［静置培養菌糸体の培養物、および該菌糸体抽出画分の調製］
株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース、０．２％麦芽エキス、０．７５％酵母エキス、ｐＨ６．５）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２５℃の恒温器中で２１日間静置培養を行った。培養終了後、濾紙濾過により菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末６．５０ｇを得た。
【０１０８】
実施例１と同様の方法で、上記菌糸体粉末１．０ｇを、３００ｍＬ容のビーカーに入れ、次いでＣｈＭｅ液５０ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出した。この操作を３回繰り返した後、水層部、中間層、およびＣｈＭｅ液層をそれぞれ回収した。ＣｈＭｅ液層と中間層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．３２ｇ（以下、「静置菌糸体抽出画分」と記す）を得た。
【０１０９】
（実施例４）
［振盪培養由来ホンシメジ菌糸体の培養物、および該菌糸体抽出画分の調製］
株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース、０．２％麦芽エキス、０．７５％酵母エキス、ｐＨ６．５）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で３週間培養を行った。培養終了後、培養物（Broth）を濾紙濾過により、菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末８．５０ｇを得た。
【０１１０】
実施例１と同様の方法で、上記菌糸体粉末１．０ｇを、３００ｍＬ容のビーカーに入れ、次いでＣｈＭｅ液５０ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出した。この操作を３回繰り返した後、水層部、中間層、およびＣｈＭｅ液層をそれぞれ回収した。ＣｈＭｅ液層と中間層とを合わせ（「非水層」）、ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、乾固物０．４１ｇ（以下、「菌糸体抽出画分」と記す）を得た。
【０１１１】
（実施例５）
［ジャーファメンター培養由来ホンシメジ菌糸体の培養物、および該菌糸体抽出画分の調製］
株式会社クレハ・生物医学研究所で樹立および維持しているホンシメジＣＭ５０２−２株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース、０．２％麦芽エキス、０．７５％酵母エキス、ｐＨ６．５）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で２週間培養を行った。得られた培養物（Broth）から菌糸体ペレットを回収し、滅菌蒸留水で洗浄後、ホモゲナイザー処理によりペレットを軽く解砕したものを種菌懸濁液とした。また、グルコース３０ｇおよび酵母エキス３ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解し、塩酸にて液のｐＨを５．５に調整後、当該液を１２１℃、２０分間の滅菌処理したものを培地とした。
【０１１２】
培養装置として「サクラ・バイオリアクターＴＢＲ−１」（サクラ精機（株））を用い、２Ｌ容培養用ポットおよび付属部品を１２１℃、２０分間の滅菌処理した後、培養システムを組み立てた。培養用ポットに培地１Ｌを入れた後、エタノール火炎下、導入口の部分から種菌懸濁液をポット容器に入れた。空気導入用滅菌フィルター口に空気導入管を接続し、容器内に滅菌空気を導入、空気排出口のシリコン栓を抜き取った。培地温度を２４℃、攪拌速度を２００ｒｐｍ、通気量を０．６〜０．９Ｌ／ｍｉｎとし、１４日間培養した。
【０１１３】
培養終了後、濾紙濾過により菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕、メッシュを通して粉末５．１６ｇを得た。この粉末５．０ｇに蒸留水５００ｍＬを加え、９８℃の湯浴下、２時間の攪拌抽出を行い、室温まで冷却した後に８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清１を得た。残渣に蒸留水５００ｍＬを加え同様の操作を行い、上清２を得た。次に、残渣に０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５００ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌抽出を行った後、遠心分離して上清３を得た。
【０１１４】
塩酸にて、上清３のｐＨを７．０に調整した後、上清１および上清２と混合し、透析膜チューブ（分画分子量：約８，０００）に入れて流水中で４８時間透析した。透析終了後、透析内液を回収、ロータリーエバポレーターを用いて約２００ｍＬまでに濃縮し、凍結乾燥したところ、粉末８５３ｍｇを得た。
【０１１５】
（実施例６）
［Ｉ型アレルギーに対する作用の検討−１］
Ｉ型アレルギーは抗原刺激後数秒から数分で起こる免疫反応である。抗原感作によりＩｇＥ抗体が産生されると、ＩｇＥはマスト細胞や好塩基性白血球膜上のＦｃεＲＩ（高親和性ＩｇＥ受容体）に結合する。曝露抗原が細胞膜に結合しているＩｇＥに結合すると、それらの細胞からヒスタミンやセロトニン、ロイコトリエンなどの化学伝達物質が放出され、血管の透過性が亢進し、平滑筋の強い収縮が起こり、発疹、嘔吐、くしゃみ、ふるえ、腹痛、下痢、呼吸困難などの症状を呈し、場合によっては死に至る。そこで、能動的全身アナフィラキシーを指標として、ラットのＩ型アレルギーモデルに対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１１６】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雄性Wistarラットを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１１７】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１１８】
（iii）実験群構成および処置
能動的全身性アナフィラキシー反応は、S. Nakamuraらの方法に準じて実施した（S. Nakamura他、Effects of N-556 on experimental allergy models in rats、"Jpn J Allergol"、39：1621−1628、1990）。すなわち、ジニトロフェニル結合アスカリス（以下、「ＤＮＰ−Ａｓ」と記す。コスモバイオ（株））のＰＢＳ（＝リン酸緩衝化生理食塩水）溶液 ２．５ｍｇ／０．１ｍＬと百日咳死菌（コスモバイオ（株））のＰＢＳ懸濁液１×１０10細胞／０．１ｍＬを混合し、その０．２ｍＬをラット四肢足蹠部に注射した。５日後、ＤＮＰ−ＡｓのＰＢＳ溶液 ０．５ｍｇ／０．１ｍＬをラット背部筋肉内に注射することにより、追加免疫を行った。
【０１１９】
最終注射９日後、ジニトロフェニル結合卵白アルブミン（以下「ＤＮＰ−ＯＶＡ」と記す。コスモバイオ（株））のＰＢＳ溶液 ０．５ｍｇ／０．１ｍＬまたは０．１ｍｇ／０．１ｍＬをラット静脈内に注射することにより、アナフィラキシーを誘導した。注射後２時間目までは、２０分ごとに症状および生死を観察した。最終観察は、注射後２４時間目に行った。
【０１２０】
実験群は以下の１２群からなる。
【０１２１】
実験群６−Ｉ： ＤＮＰ−Ａｓで免疫したWistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する感作・対照群−１（ｎ＝６）、
実験群６−II： ＤＮＰ−Ａｓで免疫したWistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する感作・対照群−２（ｎ＝６）、
実験群６−III： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する感作・子実体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−IＶ： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する感作・子実体群−２（ｎ＝６）、
実験群６−Ｖ： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する感作・菌糸体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−ＶI： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する感作・菌糸体群−２（ｎ＝６）、
実験群６−ＶII： 健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する非感作・対照群−１（ｎ＝６）、
実験群６−ＶIII： 健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する非感作・対照群−２（ｎ＝６）、
実験群６−IＸ： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する非感作・子実体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−Ｘ： 実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する非感作・子実体群−２（ｎ＝６）、
実験群６−ＸI： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．５ｍｇ静脈内注射する非感作・菌糸体群−１（ｎ＝６）、
実験群６−ＸII： 実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与した健常Wistarラットに、ＤＮＰ−ＯＶＡを０．１ｍｇ静脈内注射する非感作・菌糸体群−２（ｎ＝６）。
【０１２２】
（iv）成績
下記表５に示すように、ＤＮＰ−Ａｓ感作ラットに０．５ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射して能動的アナフィラキシーを誘導した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈して２０分以内に死亡した（実験群６−Ｉ；死亡率１００％）。一方、ＤＮＰ−Ａｓ感作ラットに０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈したものの、実験群６−Ｉに比して比較的軽度であり、静脈内注射２４時間後の観察では、６匹中４匹が死亡し、２匹がショック死を免れた（実験群６−II；死亡率６７％）。
【０１２３】
初回感作から１４日間、天然子実体抽出画分（実施例１で調製）３００ｍｇ／ｋｇ／日を投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、０．５ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射して能動的アナフィラキシーを誘導した実験群では、６匹中５匹がアナフィラキシー症状を呈して２４時間以内に死亡した（実験群６−III；死亡率８３％）。一方、同ラットに０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈したが、その程度は実験群６−IIIに比して軽度であり、静脈内注射２４時間後の観察では、６匹中２匹が死亡したものの、４匹がショック死を免れた（実験群６−IＶ；死亡率３３％）。
【０１２４】
初回感作から１４日間、静置菌糸体抽出画分（実施例３で調製）３００ｍｇ／ｋｇ／日を投与したＤＮＰ−Ａｓ免疫Wistarラットに、０．５ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射して能動的アナフィラキシーを誘導した実験群では、６匹中４匹がアナフィラキシー症状を呈して２４時間以内に死亡した（実験群６−Ｖ；死亡率６７％）。一方、同ラットに０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡを静脈内注射した実験群では、全例がアナフィラキシー症状を呈したが、その程度は実験群６−Ｖに比して軽度であり、静脈内注射２４時間後の観察では、６匹中２匹が死亡したものの、４匹がショック死を免れた（実験群６−ＶI；死亡率３３％）。
【０１２５】
なお、ＤＮＰ−Ａｓ非感作ラットに、０．５ｍｇまたは０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡ抗原を静脈内注射しても、アナフィラキシー症状は全くみられなかった（実験群６−ＶIIおよび６−ＶIII；死亡率０％）。また、初回感作から１４日間、天然子実体抽出画分または静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与したＤＮＰ−Ａｓ非感作ラットに、０．５ｍｇまたは０．１ｍｇのＤＮＰ−ＯＶＡ抗原を静脈内注射しても、アナフィラキシー症状は全くみられなかった（実験群６−IＸ、６−Ｘ、６−ＸIおよび６−ＸII；死亡率０％）。
【０１２６】
これらの成績は、低用量の抗原（１ｍｇ／匹）を用いて能動的アナフィラキシー反応を誘導する系において、ホンシメジ子実体抽出画分および菌糸体抽出画分が、上記反応を抑制することを示している。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】
（実施例７）
［Ｉ型アレルギーに対する作用検討−２］
１９５０年代に米国のZ. Ovaryにより確立された受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ；passive cutaneous anaphylaxis）反応は、細胞親和性をもつＩｇＧ抗体やＩｇＥ抗体を高感度に検出するために開発されたものである。その原理は、動物の皮膚をあらかじめ抗体で受動感作した後、抗原と色素の混液を注射し、Ｉ型免疫反応により誘導される皮膚小血管の透過性亢進状態を、漏出色素量を指標として判定する。本反応は、抗体検出やＩ型アレルギー反応の発生・抑制メカニズム解析だけでなく、抗アレルギー活性をもつ薬剤や天然由来物質のスクリーニングに広く用いられる。
【０１２９】
そこで、ＰＣＡ反応を指標として、ラットのＩ型アレルギーモデルに対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１３０】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雄性Wistarラットを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１３１】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分、実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１３２】
（iii）実験群構成および処置
ＰＣＡ反応は、塩崎らの方法に準じて実施した（塩崎哲也ら、「緑茶抽出成分（茶ポリフェノール、カフェイン）のＩ型アレルギーに対する効果」、薬学雑誌、社団法人日本薬学会、１９９７年、第１１７巻、４４８−４５４頁）。すなわち、上記ラット背部の背中線に沿って、縦横：約４ｃｍ×約５ｃｍを剃毛し、剃毛部の右背側部２箇所に抗ジニトロフェニル（以下、ＤＮＰ）ＩｇＥ抗体（Sera-Labo）溶液２５ｎｇ／ｍＬを０．０５ｍＬ皮内注射し、左背側部２箇所にリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）を同量注射した。
【０１３３】
注射２４時間後、ＤＮＰ−ＯＶＡ（＝ジニトロフェニル結合卵白アルブミン）溶液２０μｇ／ｍＬとエバンスブルー（ＥＢ：Evans blue。シグマアルドリッチジャパン（株））溶液５ｍｇ／ｍＬの等量混合溶液１．０ｍＬを、上記ラット尾静脈内に注射し、３０分後にラットを放血致死させて、皮内注射部位の青染部を切り取り、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液１．０ｍＬ中に２５℃で２４時間漬け込むことにより色素を可溶化させた。次いで、濾紙濾過により固形物を除去し、色素溶解液を５Ｍリン酸溶液で中和し、アセトン３．０ｍＬを加えて青色色素を抽出した。分光光度計を用いて、抽出液の６２０ｎｍ吸収を測定し、次式：〔ＤＮＰ皮内注射部位（２箇所）の平均吸光度−ＰＢＳ注射部位（２箇所）の平均吸光度〕から、各被検個体の色素漏出度を算出した。
【０１３４】
実験群は、
（１）Wistarラットに溶媒を投与し、３０分、６０分または１８０分後にＰＣＡを実施する対照群（ｎ＝６×３）、
（２）Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与し、３０分、６０分または１８０分後にＰＣＡを実施する子実体群（ｎ＝６×３）、
（３）Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与し、３０分、６０分または１８０分後にＰＣＡを実施する菌糸体群（ｎ＝６×３）、
からなる。
【０１３５】
（iv）成績
抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体感作ラットにＤＮＰ−ＯＶＡ抗原を静脈内投与する前、時間を変えてＣＭ５０２−２株を経口投与した際の、ＰＣＡ反応抑制率を下記表６に示す。ＰＣＡ反応による局部皮膚での色素漏出状況を検討したところ、抗原静注６０分前に、子実体抽出画分または菌糸体抽出画分を経口投与した区の漏出量が最も少なく、その前後では色素漏出量は大きくなる傾向がみられた。
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
上記表６の結果をもとに、ＣＭ５０２−２株投与６０分後にＰＣＡ反応を実施するスケジュールで、ＣＭ５０２−２株の用量依存性を検討した結果を下記表７に示す。
【０１３８】
なおＣＭ５０２−２株として、実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分、実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１３９】
実験群は以下のとおりである。
【０１４０】
実験群７−Ｉ： 健常Wistarラットを用いる対照群（ｎ＝６）、
実験群７−II： Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇを投与する子実体１群（ｎ＝６）、
実験群７−III： Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分１５０ｍｇ／ｋｇを投与する子実体２群（ｎ＝６）、
実験群７−IＶ： Wistarラットに実施例２で調製した菌床栽培子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与する子実体３群（ｎ＝６）、
実験群７−Ｖ： Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇを投与する菌糸体１群（ｎ＝６）、
実験群７−ＶI： Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分１５０ｍｇ／ｋｇを投与する菌糸体２群（ｎ＝６）、および
実験群７−ＶII： Wistarラットに実施例４で調製した振盪培養菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを投与する菌糸体３群（ｎ＝６）。
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
表７に示すように、子実体および菌糸体由来のいずれのＣＭ５０２−２株でも、投与量に依存して、色素漏出量はほぼ同程度抑制された。これらの成績は、ＣＭ５０２−２株が、アナフィラキシー反応の諸過程うち、皮膚小血管の透過性亢進抑制を介して、抗アレルギー作用を発現していることを示している。
【０１４３】
（実施例８）
［II型アレルギーに対する作用検討−１］
１９７３年にJH.PlayfairとS.Marshall-Clarkeにより、異種赤血球の頻回注射が、マウスにヒト自己免疫疾患類似の貧血症状を誘導することが報告された（JH. Playfair & S.Marshall-Clarke："Induction of red cell autoantibodies in normal mice"、Nature New Biology、243：213-214、1973）。本症状は、自己抗体と補体による赤血球障害により誘導されるものであり、典型的なII型アレルギーモデルとされている。そこで、本モデルを用いて、II型アレルギーに対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１４４】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ（以下、Ｃ５７ＢＬ／６）マウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１４５】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１４６】
（iii）実験群構成および処置
自己免疫溶血症状の誘導は、A. Mqadmiらの方法に準じた（A.Mqadmiら：CD4+CD25+ regulatory T cells control induction of autoimmune hemolytic anemia．"Blood"、105、3746−3748、2005）。すなわち、エーテル麻酔下、雌性Ｆ３４４ラット（８週齢、日本チャールス・リバー（株）から購入）の腹部大静脈から採血し、凝固防止のためにへパリンを加えた後、histopaqueTM−1077（シグマアルドリッチ社）を用いて、試薬添付マニュアルの方法に準じて赤血球を分離・回収した。ＲＰＭＩ培地で上記赤血球を１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整し、その０．２ｍＬ（２×１０8ｃｅｌｌｓ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス尾静脈に注射した。本処置は週１回、１０週間継続した。最終処置１週間後に、エーテル麻酔下、マウス腹部大静脈から採血し、凝固防止のためにへパリンを加えた後、末梢血液中の赤血球数を計数した。さらに、histopaqueTM−1077を用いて赤血球と血漿を分離・回収した。次に、所定量の赤血球と蛍光色素標識抗マウスＩｇＧ（Fluorescence-labeled anti-mouse IgG、Vector Lab.社、米国）の１０００倍希釈液とを２５℃で１時間反応後、フローサイトメトリー（Flow Cytometry）を用いて蛍光色素標識赤血球数を測定し、陽性率（全赤血球に対するマウスＩｇＧ結合赤血球数％）を算出した。さらに、標識赤血球懸濁液（５×１０7ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ）を健常Ｃ５７ＢＬ／６マウス尾静脈に注射し、毛細管を用いて経時的に眼窩静脈叢から採血し、フローサイトメトリーにより蛍光色素標識赤血球数を測定して、次式：〔注入１０分後の赤血球中の標識赤血球数×１００／注入直後の赤血球中の標識赤血球数〕からクリアランス率（％）を算出した。結果を表８に示す。
【０１４７】
実験群は下記構成とした。
【０１４８】
実験群８−Ｉ： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラット赤血球を週１回、１０週間処置する感作・対照群（ｎ＝８）、
実験群８−II： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラット赤血球を週１回、１０週間処置する期間中、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・子実体群（ｎ＝８）、
実験群８−III： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラット赤血球を週１回、１０週間処置する期間中、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・菌糸体群（ｎ＝８）、
実験群８−IＶ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いる非感作・対照群（ｎ＝８）、
実験群８−Ｖ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、経口投与する非感作・子実体群（ｎ＝８）、
実験群８−ＶI： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した静置菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、経口投与する非感作・菌糸体群（ｎ＝８）。
【０１４９】
（iv）成績
下記表８に示すように、実験群８−Ｉ（感作・対照群）では、実験群８−IＶ（非感作・対照群）に比べ、末梢赤血球数は有意に少なく、マウスＩｇＧ結合赤血球の陽性率は８１％、クリアランス率は２３％で、自己免疫性溶血疾患の症状を明らかに呈していた。一方、実験群８−II（感作・子実体群）および実験群８−III（感作・菌糸体群）では、実験群８−Ｉに比し、感作による末梢赤血球数の減少は防止され、マウスＩｇＧ結合赤血球の陽性率は低値傾向にあり、標識赤血球の残存率も高値であった。すなわち、ＣＭ５０２−２株の投与により、自己免疫性溶血疾患の症状は軽減された。
【０１５０】
なお、実験群８−Ｖ（非感作・子実体群）および実験群８−ＶI（非感作・菌糸体群）では、末梢赤血球数は実験群８−IＶとほぼ同レベルであり、マウスＩｇＧ結合赤血球は検出限界以下で、クリアランス％も実験群８−IＶとほとんど変わりなかった。
【０１５１】
【表８】
【０１５２】
（実施例９）
［II型アレルギーに対する作用検討−２］
実施例８においてＣＭ５０２−２株のII型アレルギー改善作用が示されたので、そのメカニズムを解析するため、ＣＭ５０２−２株の補体に対する作用を調べた。
【０１５３】
（i）試験材料と方法
免疫溶血試験は森らの方法に準じた（森陸司ら、「アミノ安息香酸誘導体のin vitroにおける溶血反応阻害作用」、薬学雑誌、社団法人日本薬学学会、１９７５年、第９５巻、１４７７−１４８２頁）。すなわち、アルセバー氏液に保存された緬羊血液（（株）日本バイオテスト研究所から購入）を２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、生理食塩水で３回洗浄後、得られたパック細胞（packed cells）（赤血球）にｐＨ７．５のゼラチン・ベロナール緩衝液を加えて１０％懸濁液（ｖ／ｖ）とした。次に、この懸濁液０．２５ｍＬに３．０５ｍＬの０．１％炭酸ナトリウム溶液を加えて完全溶血させたとき、５４１ｎｍにおける吸光度が０．４５５になるように、同緩衝液を適量加えて調整したものを、羊赤血球懸濁液として実験に用いた。試験管に上記緩衝液５ｍＬ、被検液１ｍＬ、羊赤血球懸濁液０．５ｍＬ、２，５００倍希釈の抗羊赤血球家兎血清０．５ｍＬ、補体溶液（モルモットの新鮮血清を緩衝液で１００倍希釈したもの）１ｍＬを順次加えて静かに攪拌し、３７℃で９０分間反応させた。氷冷により反応を停止させ、５℃、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離の後、分光光度計を用いて５４０ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。なお、ゼラチン・ベロナール緩衝液のみを添加したものを対照とし、補体の代わりにゼラチン・ベロナール緩衝液を加えたものを検体ごとにとり、それぞれの盲検値として補正した。被検物質による溶血阻害率は次式：［｛１−（被検物質添加群の吸光度−対応する盲検値）／（対照群の吸光度−対照群の盲検値）｝×１００％］に従って算出した。
【０１５４】
（ii）被検液（ＣＭ５０２−２株抽出物）の調製
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例５で調製した菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。
【０１５５】
（iii）成績
免疫溶血反応に及ぼすＣＭ５０２−２株のインビトロ（in vitro）添加の影響を下記表９に示す。ＣＭ５０２−２株添加により、反応は用量依存的に阻害された。特に、２００μｇ／ｍＬ添加時の溶血阻害率は、実施例１で調製した子実体由来画分で３５％、実施例５で調製した菌糸体抽出画分で２７％に達した。
【０１５６】
免疫溶血反応においてはＣａ2+およびＭｇ2+が重要な役割を演じており、これらの陽イオンを捕捉若しくは不活性化する物質は阻害活性を有することが知られている。また、アミノ安息香酸誘導体など、ある種の化合物は赤血球に作用し、膜の安定化を介して抗補体作用を示す。現在のところＣＭ５０２−２株の作用メカニズムは不明であるが、特定金属イオンとのキレート形成の可能性は低く、細胞膜を安定化させ、補体の作用を阻害しているものと推測される。
【０１５７】
【表９】
【０１５８】
（実施例１０）
［III型アレルギーに対する作用検討］
III型アレルギーは、抗原と抗体の凝集体である免疫複合体が組織に沈着することにより生じる。免疫複合体が補体を活性化しＣ５ａなどのアナフィラトキシンが放出され、血管透過性を亢進させることにより、好中球、単球、リンパ球、肥満細胞（マスト細胞）の遊走および活性化が起こり、組織傷害が惹起される。局所に免疫複合体が沈着することにより生じるアルサス反応（Arthus reaction）は、典型的なIII型アレルギーとされている。そこで、マウスを用いて、本反応に対するＣＭ５０２−２株の作用を検討した。
【０１５９】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１６０】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例４で調製した菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１６１】
（iii）実験群構成および処置
能動的アルサス反応の誘導は小谷らの方法に準じた（小谷敬子ら、「サラゾスルファピリジンおよびブシラミンのIII型およびIＶ型アレルギー反応に対する抑制効果」、炎症、日本炎症・再生医学会、１９９７年、第１７巻、８７〜８９頁）。すなわち、緬羊血液（（株）日本バイオテスト研究所）を２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、生理食塩水で３回洗浄後、得られたパック細胞（packed cells）（羊赤血球）にＰＢＳを加えて、２．５×１０9ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整し、その０．２ｍＬ（５×１０8ｃｅｌｌｓ）を、マウス尾静脈に２週間隔で２回注射した。２回目処置の５日後、ノギスを用いてマウス右足蹠部の厚さを測定した後、同部位皮下に０．０５ｍＬの赤血球（２×１０8ｃｅｌｌｓ）を注射し、３時間後、再び同部位の足蹠厚を測定した。反応の強さは、注射前後の足蹠厚さの差により算出した。
【０１６２】
実験群は以下のとおりである。
【０１６３】
実験群１０−Ｉ： ＢＡＬＢ／ｃマウスを羊赤血球で感作する感作・対照群（ｎ＝６）、
実験群１０−II： ＢＡＬＢ／ｃマウスを羊赤血球で感作する期間中、実施例１で調製した子実体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・子実体群（ｎ＝６）、
実験群１０−III： ＢＡＬＢ／ｃマウスを羊赤血球で感作する期間中、実施例４で調製した菌糸体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する感作・菌糸体群（ｎ＝６）、
実験群１０−IＶ： 健常ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いる非感作・対照群（ｎ＝６）、
実験群１０−Ｖ： 健常ＢＡＬＢ／ｃマウスに、実施例１で調製した子実体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する非感作・子実体群（ｎ＝６）、
実験群１０−ＶI： 健常ＢＡＬＢ／ｃマウスに、実施例４で調製した菌糸体由来抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を経口投与する非感作・菌糸体群（ｎ＝６）。
【０１６４】
（iv）成績
下記表１０に示すように、羊赤血球感作マウス足蹠部に抗原を注射して能動アルサス反応を誘導した時、対照群の足蹠厚の増加は０．５８±０．１９ｍｍであった（実験群１０−Ｉ）。一方、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の抽出画分を経口投与した群の足蹠厚の増加は、それぞれ、０．２７±０．１１ｍｍおよび０．２２±０．１０ｍｍであり（実験群１０−IIおよび１０−III）、ＣＭ５０２−２株により反応は明らかに抑制された。なお、非感作マウス足蹠部に抗原を注射しても、足蹠部はほとんど腫脹せず、ＣＭ５０２−２株を投与しても影響を認めなかった（実験群１０−IＶ、１０−Ｖ、および１０−ＶI）。すなわち、ＣＭ５０２−２株によるIII型アレルギー反応の抑制が示された。
【０１６５】
【表１０】
【０１６６】
（実施例１１）
［IＶ型アレルギーに対する作用検討−１］
化学物質や薬品、植物成分などのハプテンの皮膚接触により、自己免疫性の皮膚炎を発生することが知られている。実験的には、塩化ピクリルやジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ：dinitrochlorbenzene）のような化学物質をマウスやモルモットの皮膚に塗布後、しばらくしてから、同物質を再接触させると、軽度の紅斑や腫脹、硬結を伴う遅延型反応が再現性よく出現する。そこで、IＶ型アレルギーモデルとして汎用されている塩化ピクリル接触性皮膚炎に対するＣＭ５０２−２株の作用を調べた。
【０１６７】
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１６８】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例１で調製した天然子実体抽出画分、実施例３で調製した菌糸体抽出画分を、それぞれ所定量をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１６９】
（iii）実験群構成および処置
接触性皮膚炎の誘発は、G.L. Asherson & W. Ptakの方法に準じて実施した（”Contact and delayed hypersensitivity in the mouse I. Active sensitization and passive transfer”、Immunology、15：405−416、1968）。すなわち、前日に腹部を剃毛したマウスの腹部に、木綿棒を用いて、７％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．１ｍＬを塗布することにより、マウスを抗原感作した。７日後、マウスの両耳朶に、それぞれ、１％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．０２ｍＬを塗布して接触性皮膚炎を誘発させた。さらに、その３日後に再び、腹部に７％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．１ｍＬを塗布して再感作した。その後、７日目に再びマウスの両耳朶に１％塩化ピクリル・エチルアルコール溶液０．０２ｍＬを塗布し、２４時間後の耳朶の厚さを、ダイアルシックネスゲージ（Dial Thickness Gauge）を用いて測定し、誘発前の耳朶の厚さを差し引き、接触性皮膚炎による腫脹度とした。
【０１７０】
実験群は以下の構成とした。
【０１７１】
実験群１１−Ｉ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに塩化ピクリルを感作する対照群（ｎ＝８）、
実験群１１−II： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する子実体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−III： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する子実体群−２（ｎ＝８）、
実験群１１−IＶ： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する菌糸体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−Ｖ： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する菌糸体群−２（ｎ＝８）、
実験群１１−ＶI： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両耳朶に塩化ピクリルを塗布する非感作・対照群（ｎ＝８）、
実験群１１−ＶII： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−IIと同期間経口投与する非感作・子実体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−ＶIII： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１で調製した天然子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−IIIと同期間経口投与する非感作・子実体群−２（ｎ＝８）、
実験群１１−IＸ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分７５ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−IＶと同期間経口投与する非感作・菌糸体群−１（ｎ＝８）、
実験群１１−Ｘ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で調製した菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇ量を、実験群１１−Ｖと同期間経口投与する非感作・菌糸体群−２（ｎ＝８）。
【０１７２】
（iv）成績
下記表１１に示すように、塩化ピクリル感作マウス耳朶に抗原液を塗布してIＶ型アレルギー反応を誘導した時、対照群の耳朶厚の増加は０．５８±０．０９ｍｍであった（実験群１１−Ｉ）。一方、子実体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇおよび菌糸体抽出画分３００ｍｇ／ｋｇを経口投与した群の耳朶厚の増加は、それぞれ、０．３４±０．０９ｍｍおよび０．２９±０．０７ｍｍであり（実験群１１−IIIおよび１１−Ｖ）、ＣＭ５０２−２株により反応は明らかに抑制された。なお、非感作マウス足蹠部に抗原を注射しても、足蹠部はほとんど腫脹せず、ＣＭ５０２−２株を投与しても影響を認めなかった（実験群１１−ＶI、１１−ＶII、１１−ＶIII、１１−IＸおよび１１−Ｘ）。すなわち、ＣＭ５０２−２株によるIＶ型アレルギー反応の抑制が示された。
【０１７３】
【表１１】
【０１７４】
（実施例１２）
［IＶ型アレルギーに対する作用検討−２］
（i）試験動物
日本チャールス・リバー（株）から７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１７５】
（ii）ＣＭ５０２−２株の投与
実施例３で得た静置培養菌糸体の培養物（粉末）、実施例４で得た振盪培養由来菌糸体の培養物（粉末）の所定量をＰＢＳに均一分散させた後、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液（ＣＭＣ溶液）に懸濁させ、ゾンデを用いて経口投与した。
【０１７６】
（iii）実験群構成および処置
実験群１２−Ｉ： 無処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに塩化ピクリルを感作する対照群（ｎ＝８）、
実験群１２−II： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で得た静置培養菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する子実体粉末群（ｎ＝８）、
実験群１２−III： 塩化ピクリルで感作したＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例４で得た振盪培養由来菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する菌糸体粉末群（ｎ＝８）、
実験群１２−IＶ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で得た静置培養菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を実験群１２−IIと同期間経口投与する非感作・子実体粉末群（ｎ＝８）、
実験群１２−Ｖ： 非感作Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、実施例４で得た振盪培養由来菌糸体の培養物（粉末）５００ｍｇ／ｋｇ量を、感作３日前から実験終了時まで連日経口投与する非感作・菌糸体粉末群（ｎ＝８）。
【０１７７】
上記各群に、実施例１１と同様のプロトコールを用いて接触性皮膚炎に及ぼす作用を評価した。
【０１７８】
（iv）成績
下記表１２に示すように、感作・対照群（実験群１２−Ｉ）の耳朶厚の増加に比し、感作・子実体粉末群（実験群１２−II）および感作・菌糸体粉末群（実験群１２−III）において、耳朶厚の増加は抑制された。なお、非感作マウス足蹠部に抗原を注射しても、足蹠部はほとんど腫脹せず、ＣＭ５０２−２株を投与してもほとんど影響なかった。
【０１７９】
【表１２】
【０１８０】
（実施例１３）
［Ｖ型アレルギーに対する作用検討］
バセドウ病（若しくはグレイブス病）は、甲状腺自己抗体によって甲状腺が微慢性に腫大する自己免疫疾患である。本疾患はＶ型アレルギーに分類され、甲状腺肥大に加え、眼球突出、頻脈、甲状腺機能亢進症などをきたす。抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体（ＴＳＲＡｂ）による甲状腺の過剰刺激が、病態発現に密接に関与していると考えられている。
【０１８１】
バセドウ病の病態を反映する動物モデルは少ないが、１９９６年、下条らは、ヒト甲状腺ホルモン（ＴＳＨ）遺伝子とＭＨＣクラスＩＩ抗原遺伝子導入線維芽細胞を用いたモデルを開発し、病態誘導におけるＴｈ２関連の免疫応答の重要性を報告した（Shimojo N., et al., "Induction of Graves-like disease in mice by immunization with fibroblasts transfected with the thyrotropin receptor and a class II molecule", Proc. Acad. Sci., U.S.A., 93, 11074-79, 1996）。以降、類似のモデル系を用い、病態解析や新規治療方法が検討されている。最近では、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）や、インターロイキン−４、インターロイキン−１０などを用いた免疫調節療法による症状制御の可能性が注目されている。
【０１８２】
そこで、本発明では、抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体によるマウス甲状腺細胞のインビトロ（in vitro）3Ｈチミジン取り込み反応に及ぼすＣＭ５０２−２株の影響を検討した。
【０１８３】
（i）マウス甲状腺細胞懸濁液の調製
日本チャールス・リバー（株）から７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを購入した。飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。マウスが８週齢になった時点で、エーテル麻酔によりマウスを屠殺し、ピンセットとハサミを用いて、甲状腺を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地入りのシャーレ中にて組織を軽く解してピペッティングした後、２００メッシュのステンレス製フィルターを通して単細胞懸濁液を得た。ＲＰＭＩ１６４０培地にて、本細胞を３回洗浄後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ培地に調整した。
【０１８４】
（ii）ＣＭ５０２−２株由来成分の調製
実施例３で調製したホンシメジ静置培養菌糸体抽出画分の所定量をＤＭＳＯに溶解させ、サンプルとした。
【０１８５】
（iii）抗体溶液の調製
マウス由来受容体と反応することが知られている抗ヒト甲状腺刺激ホルモン受容体抗体〔ＴＳＨＲ（Ｈ−１５５）：ｓｃ−１３９３６、Santa Cruz Biotechnology Inc.、米国〕をＲＰＭＩ１６４０培地に溶解し、２ｍｇ／ｍＬ濃度に調整した。
【０１８６】
（iv）補体溶液の調製
モルモットをエーテル麻酔により屠殺し、注射針を装着した１０ｍＬ容注射筒を用いて、腹部大静脈から血清を採取し、室温にて１時間放置後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（血清）を回収して補体とした。本補体は、使用時に、ＲＰＭＩ１６４０培地で１００倍希釈した。
【０１８７】
（v）甲状腺細胞培養反応
９６ウエルの培養用平底プレートの各ウエルに、上記（i）で調製した細胞懸濁液１５０μＬに上記（ii）で調製した溶液（ＣＭ５０２−２株菌糸体抽出画分）を加え、３７℃の炭酸ガス培養器中で３時間反応させた後、上記（iii）で調製した抗体溶液５０μＬおよび上記（iv）で調製した補体溶液２５μＬを加え、さらに４８時間培養した。培養終了４時間前に、各ウエルに、3Ｈチミジン（アマーシャム社）１．０μＣｉ加えた。培養終了後、セルハーベスターを用いて、細胞をフィルター上に回収し、室温乾燥させた。フィルターをバイアルに入れ、シンチレーターを加えた後、シンチレーションカウンターを用いて、放射能を測定した。なお、甲状腺細胞の3Ｈチミジン取り込み阻害率は次式：［｛１−（実験群１３−II〜実験群１３−ＶIIの放射能）／（実験群１３−Ｉの放射能）｝×１００％］に従って算出した。
【０１８８】
なお上記実験手続において、菌糸体抽出画分、抗体溶液、補体溶液については、下記のとおり実験群に応じて無添加とした。実験群は以下の構成とした（各群：ｎ＝３）。
【０１８９】
実験群１３−Ｉ： 細胞懸濁液のみの対照群（菌糸体抽出画分、抗体溶液、補体溶液のいずれも添加せず）、
実験群１３−II： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を１００μｇ／ｍＬ添加した菌糸体抽出画分添加群（抗体溶液、補体溶液の添加なし）、
実験群１３−III： 細胞懸濁液に抗体溶液（５０μＬ）を添加した抗体溶液添加群（菌糸体抽出画分、補体溶液の添加なし）、
実験群１３−IＶ： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を１００μｇ／ｍＬ、および補体溶液（２５μＬ）を添加した補体溶液・菌糸体画分添加群（抗体溶液の添加なし）、
実験群１３−Ｖ： 細胞懸濁液に抗体溶液（５０μＬ）、および補体溶液（２５μＬ）を添加した抗体溶液・補体溶液添加群（菌糸体抽出画分の添加なし）
実験群１３−ＶI： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を５０μｇ／ｍＬ、抗体溶液（５０μＬ）、および補体溶液（２５μＬ）を添加した抗体溶液・補体溶液・菌糸体抽出画分添加群、
実験群１３−ＶII： 細胞懸濁液に菌糸体抽出画分を１００μｇ／ｍＬ、抗体溶液（５０μＬ）、および補体溶液（２５μＬ）を添加した抗体溶液・補体溶液・菌糸体抽出画分添加群。
【０１９０】
（vi）成績
細胞の放射能取り込みに及ぼすＣＭ５０２−２株静置培養菌糸体由来物のインビトロ（in vitro）添加の影響を下記表１３に示す。ＣＭ５０２−２株由来物の添加により、3Ｈチミジン取り込み反応は用量依存的に阻害された。特に、実験群１３−ＶのＣＭ５０２−２株非添加・コントロールの阻害率５８．０％に比し、実験群１３−ＶIIのＣＭ５０２−２株１００μｇ／ｍＬ添加時の阻害率は３５．８％であり、抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体による甲状腺機能変化は明らかに軽減されていた。
【０１９１】
現在のところ、作用メカニズムは不明であるが、ＣＭ５０２−２株が甲状腺細胞の抗体感受性に影響を及ぼしているのか、またはＣＭ５０２−２株が補体の作用を阻害しているものと推測される。
【０１９２】
【表１３】
【０１９３】
（まとめ）
Ｉ〜Ｖ型アレルギーのモデル動物を作成し、ホンシメジＣＭ５０２−２株の活性を評価した。
（１）ＤＮＰ結合卵白アルブミン（ＤＮＰ−ＯＶＡ）に対するラットの能動的全身アナフィラキシー反応は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。受身アナフィラキシー反応を用いたメカニズム解析により、これら画分は皮膚小血管の透過性亢進抑制を介して作用を発現していると考えられた。
（２）異種細胞（ラット赤血球）の頻回注射により誘導される自己免疫溶血反応は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。抗体と補体を用いたインビトロ（in vitro）メカニズム解析により、これら画分は補体を介して作用を発現していると考えられた。
（３）羊赤血球に対するマウスの能動的アルサス反応は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。
（４）マウスの塩化ピクリル接触性皮膚炎は、ＣＭ５０２−２株の子実体および菌糸体の各抽出画分の投与により抑制された。
（５）抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体によるマウス甲状腺細胞の3Ｈチミジン取り込み反応低下は、ＣＭ５０２−２株の子実体抽出画分の共存により軽減された。
【０１９４】
以上により、ホンシメジＣＭ５０２−２株（＝ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株）は、Ｉ型、II、III、IＶおよびＶ型アレルギーを抑制することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】ＰＤＹ寒天平板で生育したホンシメジＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸の顕微鏡写真（図面代用写真）である。
【図２】図１に示す顕微鏡写真の部分拡大写真（図面代用写真）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株。
【請求項２】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む、アレルギー予防・治療剤。
【請求項３】
ホンシメジ（L. shimeji）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項２記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項４】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株である、請求項２または３記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項５】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、乾燥粉末である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項６】
ホンシメジ抽出物が、ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、または有機溶媒抽出液である、請求項２〜５のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項７】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む、アレルギー予防・治療のための食品。
【請求項８】
ホンシメジ（L. shimeji）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項７記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【請求項９】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株である、請求項７または８記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【請求項１０】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、乾燥粉末である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【請求項１１】
ホンシメジ抽出物が、ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、または有機溶媒抽出液である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【請求項１】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株。
【請求項２】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む、アレルギー予防・治療剤。
【請求項３】
ホンシメジ（L. shimeji）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項２記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項４】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株である、請求項２または３記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項５】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、乾燥粉末である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項６】
ホンシメジ抽出物が、ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、または有機溶媒抽出液である、請求項２〜５のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療剤。
【請求項７】
ホンシメジ（Lyopyhyllum shimeji）またはその抽出物を含む、アレルギー予防・治療のための食品。
【請求項８】
ホンシメジ（L. shimeji）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項７記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【請求項９】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株である、請求項７または８記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【請求項１０】
ホンシメジ（L. shimeji）がＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、乾燥粉末である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【請求項１１】
ホンシメジ抽出物が、ＮＩＴＥ Ｐ−２６０株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）の、熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液、または有機溶媒抽出液である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のアレルギー予防・治療のための食品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１３７９１２（Ｐ２００８−１３７９１２Ａ）
【公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３２３６２２（Ｐ２００６−３２３６２２）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]