アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド及びその製造方法。
【課題】
少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が少ない安全なアンジオテンシン変換酵素阻害剤、ならびにそれを配合した食品、医薬品および飼料並びにその製造方法を提供する。
【解決手段】
下記の構造式（１）〜（４）で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は前記ペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、食品、医薬品、飼料とすることにより、安全性に優れ、高血圧症の予防、高血圧傾向の緩和または血圧調節を目的として、継続的に摂取することが可能となる。前記アミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織又は前記植物素材組織若しくは動物素材組織から抽出された蛋白質にプロテアーゼを作用させることにより得られる。（１）Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、（２）Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、（３）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、（４）Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が少ない安全なアンジオテンシン変換酵素阻害剤、ならびにそれを配合した食品、医薬品および飼料並びにその製造方法を提供する。
【解決手段】
下記の構造式（１）〜（４）で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又は前記ペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、食品、医薬品、飼料とすることにより、安全性に優れ、高血圧症の予防、高血圧傾向の緩和または血圧調節を目的として、継続的に摂取することが可能となる。前記アミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織又は前記植物素材組織若しくは動物素材組織から抽出された蛋白質にプロテアーゼを作用させることにより得られる。（１）Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、（２）Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、（３）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、（４）Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略す。）の働きを阻害する作用を有するＡＣＥ阻害ペプチド及びそれを含有する食品、医薬品および飼料並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的な生活習慣病の一つとされている高血圧症の患者数は年々増加している。高血圧症は、それ自体自覚症状のない疾病であるが、放置すると、心臓病や脳血管障害といった合併症を引き起こすため、その治療あるいは予防は重大な課題となっている。
【０００３】
血圧の調節には、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧酵素系とカリクレイン・キニン系と呼ばれる降圧酵素系が関与している。アンジオテンシンＩはＡＣＥによりアンジオテンシンＩＩに変換され、アンジオテンシンＩＩは血管収縮やアルドステロン分泌などを通して血圧上昇を引き起こす。また、ＡＣＥは、降圧作用を持つブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有する。したがって、ＡＣＥの働きを阻害することにより、アンジオテンシンＩＩの生成を抑制し、また、ブラジキニンの分解も抑制されて血圧の降下が可能となる。
【０００４】
ＡＣＥを阻害することによる高血圧治療薬として、例えば、カプトプリルなどの合成治療薬が多数知られているが、空咳などの副作用を起こす場合がある。高血圧を予防または治療するためには、ＡＣＥ阻害作用を有する化合物を長期間服用する必要があり、ＡＣＥ阻害作用を有しながらも副作用が低いことが重要となる。
【０００５】
一方、上述のような副作用のない天然物またはその分解物を用いる試みもなされ、ＡＣＥ阻害活性を有する種々のペプチドが報告されている（例えば、特許文献1〜８参照）。これらのペプチドは、作用が穏やかであることから安全性が高いと期待される一方、有効量を摂取するためには、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを大量に摂取する必要性があり、高コストとなる問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−１１０９７号公報
【特許文献２】特開平４−１４４６９６号公報
【特許文献３】特開平７−１８８２８２号公報
【特許文献４】特開平１０−１７５９９７号公報
【特許文献５】特開２００２−１４５８９９号公報
【特許文献６】特開２００２−３３８５９４号公報
【特許文献７】特開２００５−２５５６７０号公報
【特許文献８】特開２００７−２６１９９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が少ない安全なアンジオテンシン変換酵素阻害剤、ならびにそれを配合した食品、医薬品および飼料並びにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、植物素材組織や動物素材組織のプロテアーゼ分解物は、従来知られているペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する新規ペプチドを含み、これら新規ペプチドは高いＡＣＥ阻害活性を有することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒで表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（２）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
（３）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有する食品。
（４）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有する医薬品。
（５）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有する飼料。
（６）（１）のアミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織又は前記植物素材組織若しくは動物素材組織から抽出された蛋白質にプロテアーゼを作用させることを特徴とする（１）のペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、アンジオテンシンＩＩの生成を抑制することにより、降圧作用を示すことから、血圧降下剤として有用である。また、植物素材組織若しくは動物素材組織又は該蛋白質にプロテアーゼを作用させることにより効率よく得られ、さらに天然物由来であり安全性に優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のペプチドは、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒで表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであることが必要である。
【００１１】
本発明のＡＣＥ阻害剤とは、前記４種のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのうち、少なくとも１種を含有することが必要である。
【００１２】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、前記ペプチド以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等の成分を、必要に応じて含有していてもよい。
【００１３】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、後述するように、前記アミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織にプロテアーゼを作用させることにより得られる天然物由来であり、安全性に優れていることから、高血圧症の予防、高血圧傾向の緩和または血圧調節を目的として、継続的に摂取することが可能であり、血圧が正常高値（収縮期血圧が１３０〜１３９ｍｍＨｇ、拡張期血圧が８５〜８９ｍｍＨｇ）及び軽症高血圧（収縮期血圧１４０〜１５９ｍｍＨｇないし拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇ）の両方のヒトに対して好適に用いることができる。
【００１４】
本発明におけるＡＣＥ阻害剤は、高血圧を予防する目的で用いる場合、年齢、性別、体重、症状等によっても異なるが、前記ペプチドとして成人１日あたりの摂取量が０．１〜１０００ｍｇとなるように摂取することが好ましく、さらに１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇがいっそう好ましい。また、１日２〜４回程度に分けて摂取することもできる。なお、成人１日あたりの摂取量が０．１ｍｇ未満であると、前記のＡＣＥ阻害効果などの前記ペプチドが本来有している効果が低くなる場合がある。一方、成人１日あたりの摂取量が１０００ｍｇを超えると、ＡＣＥ阻害効果に対して原料コストが高くなる場合がある。
【００１５】
本発明におけるＡＣＥ阻害剤中、前記ペプチドの含有量は特に限定されないが、ＡＣＥ阻害効果との関係から、乾燥固形分として０．０１〜１００質量％であることが好ましく、０．５〜１００質量％であることがより好ましく、１〜１００質量％であることがいっそう好ましい。前記ペプチドの含有量が多いほど、単位乾燥固形分当たりのＡＣＥ阻害効果が高くなり、好ましい。なお、ＡＣＥ阻害作用は、後述する実施例１に記載する方法によって評価することができる。
【００１６】
また、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤を、既存の飲料、食品に含有させることにより飲食品とし、経口投与に付してもよい。また、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤は、ヒトに対してだけではなく、動物に対しても、高いＡＣＥ阻害剤効果を発現しうるものであるため、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤は動物の飼料に含有され、経口投与に付してもよい。
【００１７】
前記ペプチド又はＡＣＥ阻害剤を飲料、食品に添加する場合においては、その配合量は、前記ペプチドとして成人１日あたりの摂取量が０．１〜１０００ｍｇとなるように飲料、食品に対して添加するのが好ましく、さらに１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇが一層好ましい。前記ペプチドは、飲料、食品中に、０．０００５〜１００質量％という割合で添加するのが好ましく、さらに０．００５〜５０質量％という割合で添加するのが好ましく、０．０２５〜２５質量％という割合で添加するのが一層好ましい。なお、成人１日あたりの摂取量が０．１ｍｇ未満であると、前記のＡＣＥ阻害効果などの前記ペプチドが本来有している効果が低くなる場合がある。一方、成人１日あたりの摂取量が１０００ｍｇを超えると、ＡＣＥ阻害効果に対して原料コストが高くなる場合がある。
【００１８】
前記ペプチド又はＡＣＥ阻害剤を飼料に添加する場合においては、その配合量は、前記ペプチドとして動物の体重１ｋｇあたりの1日の摂取量が０．１〜１００ｍｇとなるように飼料に対して添加するのが好ましく、さらに０．５〜５０ｍｇが好ましく、１〜１０ｍｇが一層好ましい。前記ペプチドは、飼料中に、０．０００５〜１００質量％という割合で添加するのが好ましく、さらに０．００２５〜５０質量％という割合で添加するのがより好ましく、０．００５〜２５質量％という割合で添加するのが一層好ましい。なお、動物の体重１ｋｇあたりの1日の摂取量が０．１ｍｇ未満であると、前記のＡＣＥ阻害効果などの前記ペプチドが本来有している効果が低くなる場合がある。一方、動物の体重１ｋｇあたりの１日の摂取量が１００ｍｇを超えると、ＡＣＥ阻害効果に対して原料コストが高くなる場合がある。
【００１９】
本発明における食品（飲料を含む）の形態としては固形状、半流動状、流動状等を挙げることができる。固形状食品としては、ビスケット状、シート状、タブレットやカプセル等の錠剤、顆粒粉末等の形態、半流動状食品としては、ペースト状、ゼリー状、ゲル状等の形態、また、流動状食品としては、ジュース、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤等の形態が挙げられる。
具体的には、次のものを挙げることができる。例えば、グレープフルーツ、オレンジ、レモン等の柑橘類及びこれらを含む果汁、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガス等の野菜及びこれらを含む野菜汁及び野菜ジュース、ソース、醤油、味噌、うま味調味料及び唐辛子等の調味料；豆乳、豆乳などの大豆食品、クリーム、ドレッシング、マヨネーズ及びマーガリン等の乳化食品；魚肉、すり身及び魚卵等の水産加工食品、ピーナツ等のナッツ類、納豆等の発酵商品、肉類及び食肉加工品、ビール、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、発酵茶、半発酵茶、清涼飲料、及び機能性飲料等の飲料、漬物類、めん類、粉末スープを含むスープ類；チーズ、牛乳等の乳製品類、パン・ケーキ類、スナック菓子、チューインガム、チョコレートなどの菓子類、キャンディー類、美容飲食品を含む健康食品等が挙げられる。
【００２０】
本発明の飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。尚、飼料を製造する場合には、ペプチドの他に、食肉、穀物類、ぬか類、粕類、野菜、糖類、油脂、ビタミン類、アミノ酸類、微量無機塩類等の一般に用いられる飼料原料を適宜混合し、常法により加工製造することができる。
【００２１】
本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤を含む食品又は飼料には、味質の改善を目的として、本発明の効果を損なわない範囲で糖類、糖アルコール類、塩類、油脂類、アミノ酸類、有機酸類、果汁、野菜汁、香料、アルコール類、グリセリン等を含有することができる。なお、食品として生理学的に許容されるイオンとの塩であっても、同様の効果が期待できる。
【００２２】
本発明における医薬品を摂取する方法としては、特に限定されないが、経口投与により摂取することが好ましい。経口投与するためには、例えば、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤を添加した後、公知慣用の方法により、丸剤、散剤、顆粒状、細粒剤、粒状、錠剤、カプセル、ゲル状、ペースト状、シロップ、乳状、懸濁状、液状等の経口投与に適した形態に成形すればよい。また、坐剤、注射剤、舌下錠、皮膚外用剤（軟膏やハップ剤を含む）等としても好適に使用できる。
【００２３】
本発明の医薬品として前記ペプチドを添加する場合には、その含有量は、摂取する対象者の年齢、体重などにより変わり得るが、前記ペプチド換算で成人1日あたり、０．１〜１０００ｍｇ服用できるように含有するものが好ましく、さらに１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇが一層好ましい。
【００２４】
次に、本発明のペプチドの製造方法について説明する。
本発明のペプチドは、前記アミノ酸配列を含む植物素材組織又は動物素材組織にプロテアーゼを作用させることにより調製することができる。
【００２５】
本発明における植物素材組織又は動物素材組織とは、前記アミノ酸配列を含む植物素材組織又は動物素材組織であれば、その取得の由来や取得方法によって特に限定されるものではないが、安全かつACE阻害作用が強いことから、こんにゃく芋が好ましい。例えば、こんにゃく芋を抽出原料として使用する場合には、そのまま用いても良いし、乾燥、すりつぶし、粉砕、加熱などの操作によって加工されたこんにゃく芋を用いてもよい。また、こんにゃく精粉、こんにゃく荒粉、こんにゃくトビ粉や食用として市販されているこんにゃくを用いても良い。その中でもペプチドの含有量が多いこんにゃくトビ粉が好ましい。
【００２６】
本発明の製造方法においては、植物素材組織又は動物素材組織にプロテアーゼをそのまま作用させても良いが、ペプチド分解効率の観点から、植物素材組織又は動物素材組織からいったん蛋白質を抽出して、その蛋白質にプロテアーゼを作用させることが好ましい。蛋白質を抽出する際には、水や有機溶媒を用いることができる。
【００２７】
有機溶媒としては、本発明の効果を損なうものでなければ、いかなるものを用いても良い。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類、トルエン等の芳香族炭化水素類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル類、ピリジン類等が挙げられる。これらは、単独でもしくは二種以上を組み合わせて用いることができる。また、抽出は複数回行ってもよい。
【００２８】
植物素材組織若しくは動物素材組織又は該蛋白質に作用させるプロテアーゼとしては特に限定されないが、動物由来のプロテアーゼ、植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼが好ましい。動物由来のプロテアーゼとしては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼが好ましく、植物由来のプロテアーゼとしては、パパイン、ブロメレイン、フィシンが好ましく、微生物由来のプロテアーゼとしては、ズブチリシン、サーモライシンが好ましい。それらの中でも、本発明のＡＣＥ阻害ペプチドを効率良く得るために、特にサーモライシンが好ましい。これらのプロテアーゼは精製されていてもされていなくてもよい。
【００２９】
プロテアーゼを作用させる場合、酵素反応は一般的な反応条件で行なうことができる。
例えば、プロテアーゼとしてサーモライシンを用いる場合、緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液）中で行い、反応溶液中の基質濃度は、反応時に十分攪拌できる濃度であれば特に限定されず、例えば攪拌が容易な２〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲で行なうのが好ましい。サーモライシンの添加量は、その力価により異なるが、通常は蛋白質あたり０．０１重量％以上、好ましくは０．１〜１０重量％が適当である。反応時の温度、ｐＨはサーモライシンの至適温度、至適ｐＨ付近を用いればよく、温度は３０〜８０℃、好ましくは６０〜７０℃、ｐＨはｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜８が適当である。反応時間は酵素の添加量や反応温度、反応ｐＨによって異なるが、１〜５０時間程度である。反応の停止は、加熱や塩酸等の酸の添加によるｐＨ変化により酵素を失活させることにより行なうことができる。
【００３０】
上記のプロテアーゼによる加水分解物は、本発明のペプチドを含む組成物としてそのまま食品、飼料に用いても十分なＡＣＥ阻害活性を得ることができる。また、必要により、ペプチドを高濃度に精製しても良い。精製する場合は、ゲルろ過、膜ろ過等の分子量で分画する手法や、吸着樹脂やイオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手法により分画、精製することができる。さらに、苦味やえぐみ、悪臭の改善のために、活性炭処理を行なってもよい。これらの精製方法は単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また、反復して適用することができる。
【００３１】
また、本発明のペプチドは、液相法または固相法等の通常の合成方法によっても得ることができる。例えば、アミノ末端側のアミノ酸のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護し、カルボキシル基をｐ−ニトロフェニルエステル基で活性化し、カルボキシル末端側のアミノ酸とトリエチルアミン存在下で縮合させた後、接触還元やトリフルオロ酢酸により保護基を除去する液相法や、ポリマー性の固相支持体にカルボキシル末端側のアミノ酸を結合し、アミノ基の保護とカルボキシル基の活性化を施したアミノ酸を順次ペプチド結合により結合した後、トリフルオロ酢酸やフッ化水素などを用いて固相支持体から切断し、アミノ酸側鎖の保護基を除去する固相法によって得られる。合成によって得られた本発明のペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー等を用いた通常の精製法により精製することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって、本発明を具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
（調製例１）
ペプチドの分画、同定
こんにゃくトビ粉１０ｇに水２００ｍｌを加え、室温で１６時間攪拌後、濾過、濃縮してこんにゃくとび粉抽出蛋白質（１．８ｇ）を得た。得られたこんにゃくとび粉抽出蛋白質１ｇに水３０ｍｌを加え、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調整し、サーモライシン１ｍｇ（ナカライテスク社製)を添加して、６５℃で６時間攪拌した。反応後に塩酸を加えてｐＨを４．０に調整し、９０℃、１０分間加温してサーモライシンを失活させた。加温後、遠心分離し、上清を濾過、濃縮し、０．４ｇのペプチド画分を得た。このペプチド画分０．３ｇをゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付した。以下に条件を記す。
カラム：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（２．５×７０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製)
溶出液：精製水
流 速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ２１５ｎｍ
カラムからの溶出液はフラクションコレクターにより５ｍｌずつ採集し、後述する実施例１の方法によって、各フラクションのＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果、フラクション２０および３０に強いＡＣＥ阻害活性が認められた。
【００３４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析（ＡＰＩ２０００）により、このフラクションに含まれているペプチドの同定を行なったところ、フラクション２０には、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、フラクション３０には、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するペプチドが主要成分として含まれていることが確認された。以下に同定条件を記す。
【００３５】
＜ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析条件＞
カラム：Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｃ１８（２ｍｍφ×５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：（Ａ液）水（０．１％ギ酸含有）
（Ｂ液）アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）、Ａ／Ｂ＝５０／５０（１０ｍｉｎ）のグラジ エント
流速：２００μｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
ＩｏｎＳｐｒａｙ Ｖｏｌｔａｇｅ：５５００Ｖ
イオン化温度：５００℃
【００３６】
得られたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
ＡＣＥ阻害活性の測定
（実施例１）
前述の固相法及び同定方法により合成・同定した合成ペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕの水溶液１００μｌを試験管にとり、これにウサギ肺由来の２５ｍＵ／ｍｌＡＣＥ（シグマ社製）・ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）１００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした。基質として１２．５ｍＭのｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（シグマ社製）・ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）１００μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。１Ｍ塩酸溶液２５０μｌを加えて反応を停止した後、酢酸エチル１．５ｍｌを加えてボルテックスミキサーにより攪拌、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）した。その酢酸エチル層１ｍｌを採取し、減圧下で蒸発乾固し、残留物を１ｍｌの精製水に溶解し、２２８ｎｍの吸光度により抽出された馬尿酸の量を測定して酵素活性とした。ＡＣＥ阻害活性は次式により算出した。
ＡＣＥ阻害活性（％）＝{１−（ＯＤｓ−ＯＤｓｂ）／（ＯＤｃ−ＯＤｃｂ）}×１００
ＯＤｓ ：試料を添加して反応させた時の吸光度
ＯＤｓｂ：あらかじめ塩酸を入れて反応させた時の吸光度
ＯＤｃ ：試料の代わりに緩衝液を添加して反応させた時の吸光度
ＯＤｃｂ：試料の代わりに緩衝液を添加し、かつあらかじめ塩酸を入れて反応させた時の吸光度
【００３９】
（実施例２）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＧｌｕをＴｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒに変更した以外は、実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００４０】
（実施例３）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＧｌｕをＶａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏに変更した以外は、実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００４１】
（実施例４）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＧｌｕをＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒに変更した以外は、実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００４２】
得られた結果を表２に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性は、ＩＣ５０（阻害率５０％の時の試料濃度）で示した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
通常、ＡＣＥ阻害剤として効果ありとされているＩＣ５０値は３０〜５０μＭであるが、表２に挙げた実施例のペプチドのＡＣＥ阻害活性は、いずれもこの値よりもはるかに小さく、ＡＣＥ阻害剤として優れたものであった。このことから、抗高血圧症剤、すなわち、高血圧症の治療または予防剤の有効成分として有用であると考えられる。
【００４５】
以下に、本発明のペプチドを含む処方例を示す。
（実施例５）
ドリンクの製造
下記の原料を混合し、ドリンクとした。
（１本分の組成）
実施例１〜４のいずれかのペプチド ３ｍｇ
エリスリトール ６．０ｇ
クエン酸 ０．２ｇ
香料 ０．４ｇ
水 残量
合 計 １００ｍｌ
【００４６】
（実施例６）
錠剤の製造
下記の原料を混合し、打錠機で成型して錠剤とした。
（１粒当たりの組成）
実施例１〜４のいずれかのペプチド ３ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １０ｍｇ
結晶セルロース ４５ｍｇ
乳糖 ７０ｍｇ
デキストリン ７０ｍｇ
甘味料 ２ｍｇ
合 計 ２００ｍｇ
【技術分野】
【０００１】
本発明はアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略す。）の働きを阻害する作用を有するＡＣＥ阻害ペプチド及びそれを含有する食品、医薬品および飼料並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的な生活習慣病の一つとされている高血圧症の患者数は年々増加している。高血圧症は、それ自体自覚症状のない疾病であるが、放置すると、心臓病や脳血管障害といった合併症を引き起こすため、その治療あるいは予防は重大な課題となっている。
【０００３】
血圧の調節には、レニン・アンジオテンシン系と呼ばれる昇圧酵素系とカリクレイン・キニン系と呼ばれる降圧酵素系が関与している。アンジオテンシンＩはＡＣＥによりアンジオテンシンＩＩに変換され、アンジオテンシンＩＩは血管収縮やアルドステロン分泌などを通して血圧上昇を引き起こす。また、ＡＣＥは、降圧作用を持つブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有する。したがって、ＡＣＥの働きを阻害することにより、アンジオテンシンＩＩの生成を抑制し、また、ブラジキニンの分解も抑制されて血圧の降下が可能となる。
【０００４】
ＡＣＥを阻害することによる高血圧治療薬として、例えば、カプトプリルなどの合成治療薬が多数知られているが、空咳などの副作用を起こす場合がある。高血圧を予防または治療するためには、ＡＣＥ阻害作用を有する化合物を長期間服用する必要があり、ＡＣＥ阻害作用を有しながらも副作用が低いことが重要となる。
【０００５】
一方、上述のような副作用のない天然物またはその分解物を用いる試みもなされ、ＡＣＥ阻害活性を有する種々のペプチドが報告されている（例えば、特許文献1〜８参照）。これらのペプチドは、作用が穏やかであることから安全性が高いと期待される一方、有効量を摂取するためには、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを大量に摂取する必要性があり、高コストとなる問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−１１０９７号公報
【特許文献２】特開平４−１４４６９６号公報
【特許文献３】特開平７−１８８２８２号公報
【特許文献４】特開平１０−１７５９９７号公報
【特許文献５】特開２００２−１４５８９９号公報
【特許文献６】特開２００２−３３８５９４号公報
【特許文献７】特開２００５−２５５６７０号公報
【特許文献８】特開２００７−２６１９９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が少ない安全なアンジオテンシン変換酵素阻害剤、ならびにそれを配合した食品、医薬品および飼料並びにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、植物素材組織や動物素材組織のプロテアーゼ分解物は、従来知られているペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する新規ペプチドを含み、これら新規ペプチドは高いＡＣＥ阻害活性を有することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒで表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（２）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
（３）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有する食品。
（４）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有する医薬品。
（５）（１）のペプチドの少なくとも１種を含有する飼料。
（６）（１）のアミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織又は前記植物素材組織若しくは動物素材組織から抽出された蛋白質にプロテアーゼを作用させることを特徴とする（１）のペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、アンジオテンシンＩＩの生成を抑制することにより、降圧作用を示すことから、血圧降下剤として有用である。また、植物素材組織若しくは動物素材組織又は該蛋白質にプロテアーゼを作用させることにより効率よく得られ、さらに天然物由来であり安全性に優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のペプチドは、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒで表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであることが必要である。
【００１１】
本発明のＡＣＥ阻害剤とは、前記４種のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのうち、少なくとも１種を含有することが必要である。
【００１２】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、前記ペプチド以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤等の成分を、必要に応じて含有していてもよい。
【００１３】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、後述するように、前記アミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織にプロテアーゼを作用させることにより得られる天然物由来であり、安全性に優れていることから、高血圧症の予防、高血圧傾向の緩和または血圧調節を目的として、継続的に摂取することが可能であり、血圧が正常高値（収縮期血圧が１３０〜１３９ｍｍＨｇ、拡張期血圧が８５〜８９ｍｍＨｇ）及び軽症高血圧（収縮期血圧１４０〜１５９ｍｍＨｇないし拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇ）の両方のヒトに対して好適に用いることができる。
【００１４】
本発明におけるＡＣＥ阻害剤は、高血圧を予防する目的で用いる場合、年齢、性別、体重、症状等によっても異なるが、前記ペプチドとして成人１日あたりの摂取量が０．１〜１０００ｍｇとなるように摂取することが好ましく、さらに１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇがいっそう好ましい。また、１日２〜４回程度に分けて摂取することもできる。なお、成人１日あたりの摂取量が０．１ｍｇ未満であると、前記のＡＣＥ阻害効果などの前記ペプチドが本来有している効果が低くなる場合がある。一方、成人１日あたりの摂取量が１０００ｍｇを超えると、ＡＣＥ阻害効果に対して原料コストが高くなる場合がある。
【００１５】
本発明におけるＡＣＥ阻害剤中、前記ペプチドの含有量は特に限定されないが、ＡＣＥ阻害効果との関係から、乾燥固形分として０．０１〜１００質量％であることが好ましく、０．５〜１００質量％であることがより好ましく、１〜１００質量％であることがいっそう好ましい。前記ペプチドの含有量が多いほど、単位乾燥固形分当たりのＡＣＥ阻害効果が高くなり、好ましい。なお、ＡＣＥ阻害作用は、後述する実施例１に記載する方法によって評価することができる。
【００１６】
また、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤を、既存の飲料、食品に含有させることにより飲食品とし、経口投与に付してもよい。また、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤は、ヒトに対してだけではなく、動物に対しても、高いＡＣＥ阻害剤効果を発現しうるものであるため、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤は動物の飼料に含有され、経口投与に付してもよい。
【００１７】
前記ペプチド又はＡＣＥ阻害剤を飲料、食品に添加する場合においては、その配合量は、前記ペプチドとして成人１日あたりの摂取量が０．１〜１０００ｍｇとなるように飲料、食品に対して添加するのが好ましく、さらに１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇが一層好ましい。前記ペプチドは、飲料、食品中に、０．０００５〜１００質量％という割合で添加するのが好ましく、さらに０．００５〜５０質量％という割合で添加するのが好ましく、０．０２５〜２５質量％という割合で添加するのが一層好ましい。なお、成人１日あたりの摂取量が０．１ｍｇ未満であると、前記のＡＣＥ阻害効果などの前記ペプチドが本来有している効果が低くなる場合がある。一方、成人１日あたりの摂取量が１０００ｍｇを超えると、ＡＣＥ阻害効果に対して原料コストが高くなる場合がある。
【００１８】
前記ペプチド又はＡＣＥ阻害剤を飼料に添加する場合においては、その配合量は、前記ペプチドとして動物の体重１ｋｇあたりの1日の摂取量が０．１〜１００ｍｇとなるように飼料に対して添加するのが好ましく、さらに０．５〜５０ｍｇが好ましく、１〜１０ｍｇが一層好ましい。前記ペプチドは、飼料中に、０．０００５〜１００質量％という割合で添加するのが好ましく、さらに０．００２５〜５０質量％という割合で添加するのがより好ましく、０．００５〜２５質量％という割合で添加するのが一層好ましい。なお、動物の体重１ｋｇあたりの1日の摂取量が０．１ｍｇ未満であると、前記のＡＣＥ阻害効果などの前記ペプチドが本来有している効果が低くなる場合がある。一方、動物の体重１ｋｇあたりの１日の摂取量が１００ｍｇを超えると、ＡＣＥ阻害効果に対して原料コストが高くなる場合がある。
【００１９】
本発明における食品（飲料を含む）の形態としては固形状、半流動状、流動状等を挙げることができる。固形状食品としては、ビスケット状、シート状、タブレットやカプセル等の錠剤、顆粒粉末等の形態、半流動状食品としては、ペースト状、ゼリー状、ゲル状等の形態、また、流動状食品としては、ジュース、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤等の形態が挙げられる。
具体的には、次のものを挙げることができる。例えば、グレープフルーツ、オレンジ、レモン等の柑橘類及びこれらを含む果汁、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガス等の野菜及びこれらを含む野菜汁及び野菜ジュース、ソース、醤油、味噌、うま味調味料及び唐辛子等の調味料；豆乳、豆乳などの大豆食品、クリーム、ドレッシング、マヨネーズ及びマーガリン等の乳化食品；魚肉、すり身及び魚卵等の水産加工食品、ピーナツ等のナッツ類、納豆等の発酵商品、肉類及び食肉加工品、ビール、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、発酵茶、半発酵茶、清涼飲料、及び機能性飲料等の飲料、漬物類、めん類、粉末スープを含むスープ類；チーズ、牛乳等の乳製品類、パン・ケーキ類、スナック菓子、チューインガム、チョコレートなどの菓子類、キャンディー類、美容飲食品を含む健康食品等が挙げられる。
【００２０】
本発明の飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。尚、飼料を製造する場合には、ペプチドの他に、食肉、穀物類、ぬか類、粕類、野菜、糖類、油脂、ビタミン類、アミノ酸類、微量無機塩類等の一般に用いられる飼料原料を適宜混合し、常法により加工製造することができる。
【００２１】
本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤を含む食品又は飼料には、味質の改善を目的として、本発明の効果を損なわない範囲で糖類、糖アルコール類、塩類、油脂類、アミノ酸類、有機酸類、果汁、野菜汁、香料、アルコール類、グリセリン等を含有することができる。なお、食品として生理学的に許容されるイオンとの塩であっても、同様の効果が期待できる。
【００２２】
本発明における医薬品を摂取する方法としては、特に限定されないが、経口投与により摂取することが好ましい。経口投与するためには、例えば、本発明のペプチド又はＡＣＥ阻害剤を添加した後、公知慣用の方法により、丸剤、散剤、顆粒状、細粒剤、粒状、錠剤、カプセル、ゲル状、ペースト状、シロップ、乳状、懸濁状、液状等の経口投与に適した形態に成形すればよい。また、坐剤、注射剤、舌下錠、皮膚外用剤（軟膏やハップ剤を含む）等としても好適に使用できる。
【００２３】
本発明の医薬品として前記ペプチドを添加する場合には、その含有量は、摂取する対象者の年齢、体重などにより変わり得るが、前記ペプチド換算で成人1日あたり、０．１〜１０００ｍｇ服用できるように含有するものが好ましく、さらに１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇが一層好ましい。
【００２４】
次に、本発明のペプチドの製造方法について説明する。
本発明のペプチドは、前記アミノ酸配列を含む植物素材組織又は動物素材組織にプロテアーゼを作用させることにより調製することができる。
【００２５】
本発明における植物素材組織又は動物素材組織とは、前記アミノ酸配列を含む植物素材組織又は動物素材組織であれば、その取得の由来や取得方法によって特に限定されるものではないが、安全かつACE阻害作用が強いことから、こんにゃく芋が好ましい。例えば、こんにゃく芋を抽出原料として使用する場合には、そのまま用いても良いし、乾燥、すりつぶし、粉砕、加熱などの操作によって加工されたこんにゃく芋を用いてもよい。また、こんにゃく精粉、こんにゃく荒粉、こんにゃくトビ粉や食用として市販されているこんにゃくを用いても良い。その中でもペプチドの含有量が多いこんにゃくトビ粉が好ましい。
【００２６】
本発明の製造方法においては、植物素材組織又は動物素材組織にプロテアーゼをそのまま作用させても良いが、ペプチド分解効率の観点から、植物素材組織又は動物素材組織からいったん蛋白質を抽出して、その蛋白質にプロテアーゼを作用させることが好ましい。蛋白質を抽出する際には、水や有機溶媒を用いることができる。
【００２７】
有機溶媒としては、本発明の効果を損なうものでなければ、いかなるものを用いても良い。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類、トルエン等の芳香族炭化水素類、ポリエチレングリコール等のポリエーテル類、ピリジン類等が挙げられる。これらは、単独でもしくは二種以上を組み合わせて用いることができる。また、抽出は複数回行ってもよい。
【００２８】
植物素材組織若しくは動物素材組織又は該蛋白質に作用させるプロテアーゼとしては特に限定されないが、動物由来のプロテアーゼ、植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼが好ましい。動物由来のプロテアーゼとしては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼが好ましく、植物由来のプロテアーゼとしては、パパイン、ブロメレイン、フィシンが好ましく、微生物由来のプロテアーゼとしては、ズブチリシン、サーモライシンが好ましい。それらの中でも、本発明のＡＣＥ阻害ペプチドを効率良く得るために、特にサーモライシンが好ましい。これらのプロテアーゼは精製されていてもされていなくてもよい。
【００２９】
プロテアーゼを作用させる場合、酵素反応は一般的な反応条件で行なうことができる。
例えば、プロテアーゼとしてサーモライシンを用いる場合、緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液）中で行い、反応溶液中の基質濃度は、反応時に十分攪拌できる濃度であれば特に限定されず、例えば攪拌が容易な２〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲で行なうのが好ましい。サーモライシンの添加量は、その力価により異なるが、通常は蛋白質あたり０．０１重量％以上、好ましくは０．１〜１０重量％が適当である。反応時の温度、ｐＨはサーモライシンの至適温度、至適ｐＨ付近を用いればよく、温度は３０〜８０℃、好ましくは６０〜７０℃、ｐＨはｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜８が適当である。反応時間は酵素の添加量や反応温度、反応ｐＨによって異なるが、１〜５０時間程度である。反応の停止は、加熱や塩酸等の酸の添加によるｐＨ変化により酵素を失活させることにより行なうことができる。
【００３０】
上記のプロテアーゼによる加水分解物は、本発明のペプチドを含む組成物としてそのまま食品、飼料に用いても十分なＡＣＥ阻害活性を得ることができる。また、必要により、ペプチドを高濃度に精製しても良い。精製する場合は、ゲルろ過、膜ろ過等の分子量で分画する手法や、吸着樹脂やイオン交換樹脂などの吸着特性を利用した分画手法により分画、精製することができる。さらに、苦味やえぐみ、悪臭の改善のために、活性炭処理を行なってもよい。これらの精製方法は単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また、反復して適用することができる。
【００３１】
また、本発明のペプチドは、液相法または固相法等の通常の合成方法によっても得ることができる。例えば、アミノ末端側のアミノ酸のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護し、カルボキシル基をｐ−ニトロフェニルエステル基で活性化し、カルボキシル末端側のアミノ酸とトリエチルアミン存在下で縮合させた後、接触還元やトリフルオロ酢酸により保護基を除去する液相法や、ポリマー性の固相支持体にカルボキシル末端側のアミノ酸を結合し、アミノ基の保護とカルボキシル基の活性化を施したアミノ酸を順次ペプチド結合により結合した後、トリフルオロ酢酸やフッ化水素などを用いて固相支持体から切断し、アミノ酸側鎖の保護基を除去する固相法によって得られる。合成によって得られた本発明のペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー等を用いた通常の精製法により精製することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって、本発明を具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
（調製例１）
ペプチドの分画、同定
こんにゃくトビ粉１０ｇに水２００ｍｌを加え、室温で１６時間攪拌後、濾過、濃縮してこんにゃくとび粉抽出蛋白質（１．８ｇ）を得た。得られたこんにゃくとび粉抽出蛋白質１ｇに水３０ｍｌを加え、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調整し、サーモライシン１ｍｇ（ナカライテスク社製)を添加して、６５℃で６時間攪拌した。反応後に塩酸を加えてｐＨを４．０に調整し、９０℃、１０分間加温してサーモライシンを失活させた。加温後、遠心分離し、上清を濾過、濃縮し、０．４ｇのペプチド画分を得た。このペプチド画分０．３ｇをゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付した。以下に条件を記す。
カラム：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（２．５×７０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製)
溶出液：精製水
流 速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ２１５ｎｍ
カラムからの溶出液はフラクションコレクターにより５ｍｌずつ採集し、後述する実施例１の方法によって、各フラクションのＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果、フラクション２０および３０に強いＡＣＥ阻害活性が認められた。
【００３４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析（ＡＰＩ２０００）により、このフラクションに含まれているペプチドの同定を行なったところ、フラクション２０には、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、フラクション３０には、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するペプチドが主要成分として含まれていることが確認された。以下に同定条件を記す。
【００３５】
＜ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析条件＞
カラム：Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｃ１８（２ｍｍφ×５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：（Ａ液）水（０．１％ギ酸含有）
（Ｂ液）アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝１００／０（０ｍｉｎ）、Ａ／Ｂ＝５０／５０（１０ｍｉｎ）のグラジ エント
流速：２００μｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
ＩｏｎＳｐｒａｙ Ｖｏｌｔａｇｅ：５５００Ｖ
イオン化温度：５００℃
【００３６】
得られたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
ＡＣＥ阻害活性の測定
（実施例１）
前述の固相法及び同定方法により合成・同定した合成ペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕの水溶液１００μｌを試験管にとり、これにウサギ肺由来の２５ｍＵ／ｍｌＡＣＥ（シグマ社製）・ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）１００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした。基質として１２．５ｍＭのｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（シグマ社製）・ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）１００μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。１Ｍ塩酸溶液２５０μｌを加えて反応を停止した後、酢酸エチル１．５ｍｌを加えてボルテックスミキサーにより攪拌、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）した。その酢酸エチル層１ｍｌを採取し、減圧下で蒸発乾固し、残留物を１ｍｌの精製水に溶解し、２２８ｎｍの吸光度により抽出された馬尿酸の量を測定して酵素活性とした。ＡＣＥ阻害活性は次式により算出した。
ＡＣＥ阻害活性（％）＝{１−（ＯＤｓ−ＯＤｓｂ）／（ＯＤｃ−ＯＤｃｂ）}×１００
ＯＤｓ ：試料を添加して反応させた時の吸光度
ＯＤｓｂ：あらかじめ塩酸を入れて反応させた時の吸光度
ＯＤｃ ：試料の代わりに緩衝液を添加して反応させた時の吸光度
ＯＤｃｂ：試料の代わりに緩衝液を添加し、かつあらかじめ塩酸を入れて反応させた時の吸光度
【００３９】
（実施例２）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＧｌｕをＴｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒに変更した以外は、実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００４０】
（実施例３）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＧｌｕをＶａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏに変更した以外は、実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００４１】
（実施例４）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＧｌｕをＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒに変更した以外は、実施例１と同様にしてＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００４２】
得られた結果を表２に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性は、ＩＣ５０（阻害率５０％の時の試料濃度）で示した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
通常、ＡＣＥ阻害剤として効果ありとされているＩＣ５０値は３０〜５０μＭであるが、表２に挙げた実施例のペプチドのＡＣＥ阻害活性は、いずれもこの値よりもはるかに小さく、ＡＣＥ阻害剤として優れたものであった。このことから、抗高血圧症剤、すなわち、高血圧症の治療または予防剤の有効成分として有用であると考えられる。
【００４５】
以下に、本発明のペプチドを含む処方例を示す。
（実施例５）
ドリンクの製造
下記の原料を混合し、ドリンクとした。
（１本分の組成）
実施例１〜４のいずれかのペプチド ３ｍｇ
エリスリトール ６．０ｇ
クエン酸 ０．２ｇ
香料 ０．４ｇ
水 残量
合 計 １００ｍｌ
【００４６】
（実施例６）
錠剤の製造
下記の原料を混合し、打錠機で成型して錠剤とした。
（１粒当たりの組成）
実施例１〜４のいずれかのペプチド ３ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １０ｍｇ
結晶セルロース ４５ｍｇ
乳糖 ７０ｍｇ
デキストリン ７０ｍｇ
甘味料 ２ｍｇ
合 計 ２００ｍｇ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（１）〜（４）で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（１）Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、（２）Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、（３）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、（４）Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
【請求項２】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有する食品。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有する医薬品。
【請求項５】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有する飼料。
【請求項６】
請求項１記載のアミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織又は前記植物素材組織若しくは動物素材組織から抽出された蛋白質にプロテアーゼを作用させることを特徴とする請求項１記載のペプチドの製造方法。
【請求項１】
下記の構造式（１）〜（４）で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（１）Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ、（２）Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、（３）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、（４）Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
【請求項２】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有する食品。
【請求項４】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有する医薬品。
【請求項５】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有する飼料。
【請求項６】
請求項１記載のアミノ酸配列を含む植物素材組織若しくは動物素材組織又は前記植物素材組織若しくは動物素材組織から抽出された蛋白質にプロテアーゼを作用させることを特徴とする請求項１記載のペプチドの製造方法。
【公開番号】特開２０１２−４６４５０（Ｐ２０１２−４６４５０Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９０２７８（Ｐ２０１０−１９０２７８）
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
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