アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物及びその製造方法並びにそれを含む飲食品
【課題】本発明は、食品として安全性の高く活性の高い天然物由来のＡＣＥ活性阻害物及びその製造方法並びにそれを含有する飲食品を提供することを目的とする。
【解決手段】カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、それを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物を脱ポリフェノール処理することからなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法、及びその製造方法により得られるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品。
【解決手段】カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、それを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物を脱ポリフェノール処理することからなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法、及びその製造方法により得られるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカカオ豆由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、特に、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなり、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物及びその製造方法並びにそれを含む飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は糖尿病、高脂血症、肥満などと共に、動脈硬化の起因となっている。また、重篤な合併症を伴うこともあるため、その治療法や予防には従来から大きな注目が集まっている。
【０００３】
高血圧症の解決策の一つとして、血圧上昇機構として知られているレニン−アンジオテンシン系内のアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、ＡＣＥと略す）を阻害することが有効であると知られている。ＡＣＥは主に肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在しており、基質であるアンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する酵素である。このアンジオテンシンＩＩは強力な血圧上昇ホルモンとして作用し、血管に存在するレセプターと結合することによって血管収縮を促進する。また、ＡＣＥはキニン−カリクレイン系（降圧系）のブラジキニンを分解する活性を有していることも分かっている。ＡＣＥ活性の阻害はアンジオテンシンＩＩの産生やブラジキニンの分解を抑制することから、ＡＣＥ阻害剤は臨床面において高血圧症の治療や予防に有効である。
【０００４】
最近では、食品や天然物由来の成分にＡＣＥ阻害活性が存在することが見出されている。例えば、カゼイン（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）、いわし（例えば、特許文献２、非特許文献２参照）、わかめ（例えば、特許文献３，４，５，６，７参照）、鮭卵（例えば、特許文献８参照）などから得られるペプチド体や、茶ポリフェノール（例えば、非特許文献３参照）、果実ポリフェノール（例えば、特許文献９参照）などのポリフェノール類、その他ユーカリ抽出物（例えば、特許文献１０参照）、大豆抽出物（例えば、特許文献１１参照）などの植物由来抽出物が挙げられる。
【０００５】
一方、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）についてもその血圧降下作用が認められており、製造工程で発酵の程度を弱くすることによりポリフェノールの損失を抑え、カカオポリフェノール量を高めたココア抽出物などに血圧降下活性があるという報告（例えば、特許文献１２，１３参照）やカカオ中に含まれるポリフェノールの一種であるリグニンが高血圧自然発症ラットの血圧を降下させたという報告がなされている（例えば、非特許文献４参照）。また、コレステロール降下剤及びカカオポリフェノールを含有する組成物（例えば、特許文献１４参照）あるいはＬ−アルギニン及びカカオポリフェノールを含有する組成物（例えば、特許文献１５参照）に心疾患の治療及び予防効果があることが明らかにされている。ただし、カカオのポリフェノール以外の成分がＡＣＥ阻害活性を示すことや、カカオ由来のアミノ酸組成物がＡＣＥ阻害活性を示すことは明らかになっていない。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−１２８２８７号公報
【特許文献２】特開平７−１８８２８２号公報
【特許文献３】特開２００２−１３８１００号公報
【特許文献４】特開２００３−２４６７９５号公報
【特許文献５】特開２００３−２４６７９６号公報
【特許文献６】特開２００３−２４６７９７号公報
【特許文献７】特開２００３−２５２８９７号公報
【特許文献８】特開２００５−１４５８２７号公報
【特許文献９】特開２００２−４７１９６号公報
【特許文献１０】特開平１１−６０４９８号公報
【特許文献１１】特開２００５−９５１５６号公報
【特許文献１２】特開２００３−２０４７５８号公報
【特許文献１３】特開２００１−５０００１６号公報
【特許文献１４】特開２００３−５３０４１０号公報
【特許文献１５】特開２００２−５０５８６４号公報
【非特許文献１】バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー，５８，１２，２２４４−２２４５，１９９４
【非特許文献２】日本栄養・食糧学会誌，５３，２，７７−８５，２０００
【非特許文献３】日本農芸化学会誌，６１，８０３−８０８，１９８７
【非特許文献４】日本農芸化学会誌，６８，９５７−９６５，１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らはカカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を行い、得られた処理物が高いＡＣＥ阻害活性を有することを見出した。また、本発明者らは特にカカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物が高いＡＣＥ阻害活性を有することを見出した。先に示したようにカカオの血圧降下作用に対する報告は多数あるが、カカオ中に含有されるポリフェノールが効能成分として示されているのみであり、カカオ中のポリフェノール以外の成分がＡＣＥ阻害活性を示すことが明らかになったのは本発明が初めてである。
【０００８】
即ち、本発明の目的は食品として安全性の高く活性の高い天然物由来のＡＣＥ活性阻害物及びその製造方法並びにそれを含有する飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは前記課題を解決するため、カカオ豆及び／又はカカオ豆抽出物に脱ポリフェノール処理を施し、ＡＣＥ活性阻害試験を実施した。具体的には、抽出処理を行っていないカカオ豆及び／又はカカオ豆を水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルなどの溶媒またはこれらの混合溶媒を用いて抽出して得られたカカオ豆抽出物に対し、ポリビニルピロリドン等の吸着助剤による処理や酵素処理等を施すことにより、ポリフェノールを効率良く除去し、さらにカラム分画等のアミノ酸組成物濃縮処理を行うことによりアミノ酸を高含有する画分を得、これらの画分が有意なＡＣＥ阻害活性を有していることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明はカカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、及びそれを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品である。
【００１１】
本発明はまた、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物を脱ポリフェノール処理することからなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法、及びその製造方法により得られるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品である。
【発明の効果】
【００１２】
以上に示したように、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は、血圧上昇に関与するＡＣＥを効果的に阻害する作用を有する。従って本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を様々な飲食品に含有させることにより、高血圧症の治療もしくは予防に利用できる。なお、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は血圧降下に有効とされているサーデンペプチドと比較して顕著に高いＡＣＥ阻害効果を有している。
【００１３】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は食品（カカオ豆）由来であることから安全面に問題はない。
【００１４】
また、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は脱ポリフェノール処理が施されていることから、ポリフェノール特有の苦味が少なく呈味性に優れており従来よりも容易に摂取することができるという効果が期待できる。
【００１５】
本発明品は、種々の飲食品、製剤への応用が可能である。また、本発明品の原料となるカカオ豆は、いずれも飲食品素材や天然添加物として古くより用いられているものであり、その安全性については全く問題ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明について詳細に記載する。
【００１７】
本発明品の原料であるカカオ豆としては、通常は加熱処理したカカオニブ（可食部分）もしくはカカオジャーム（胚芽部分）が用いられ、その加熱処理方法及び部位はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
カカオ豆からカカオ豆抽出物を得る方法については特に限定しないが、水、メタノール、エタノール並びにｎ−プロパノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の有機溶剤の１種または２種以上の混合溶媒を加え、従来行われている抽出方法によって、本発明のカカオ豆抽出物を得ることができる。しかし、本発明品はヒトが飲食品あるいは製剤として用いるものであることを考慮すると、抽出溶剤としては安全性の面から水とエタノールとの組み合わせを用いるのが好ましい。
【００１９】
抽出条件としては２０〜９０℃のいずれの温度で抽出することもできるが、５０〜８０℃で１〜５時間程度が好ましい。得られた抽出液は、濾過し、さらに、減圧下において濃縮または凍結乾燥して使用することができる。
【００２０】
上記カカオ豆抽出物又はカカオ豆自体からポリフェノールを除去する処理としては、水アセトンなどの溶剤抽出処理や、セファデックス、メタクリル酸エステル重合体、ポリビニルポリピロリドンなどの吸着助剤処理や、ポリフェノールオキシダーゼなどの酵素処理や、塩化第二鉄法や、これらの方法を組み合わせが挙げられる。
【００２１】
さらにアミノ酸組成物濃縮処理としては、カラム分画等、有機溶剤やイオン交換カラムクロマトグラフィなどを用いて処理物の精製を行うことにより、アミノ酸高含有組成物を得ることができる。本アミノ酸高含有組成物はタンパク質の分解物、ペプチド、アミノ酸から成るものと考えられる。
【００２２】
また、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は香り、呈味性に優れ、安全性が高いことから、例えば、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート等の菓子、シャーベット、飲料等の飲食品及び錠剤、含そう剤等の製剤に配合し、日常的に利用することが可能である。
【００２３】
その添加量としては、飲食品又は製剤に対して乾燥処理物の状態で約０．００１重量％以上、好ましくは約０．０１重量％以上添加するとよい。
【００２４】
本発明品の原料となるカカオ豆は、食品素材や天然添加物として古くより用いられているものであり、これらの処理物や、これを配合した飲食品及び製剤の安全性については全く問題ない。
【００２５】
以下、試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、それらによって本発明品の範囲を制限するものではない。
【試験例１】
【００２６】
本試験は、カカオ豆より抽出物を調製するために実施した。
【００２７】
１） 供試試料
カカオニブ、カカオジジャームを用いた。
【００２８】
２） 試験法
以下の如く、抽出物を調製した。
【００２９】
ｉ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに５０％エタノールを１．５Ｌ加え、８０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＡを２５ｇ得た。
【００３０】
ｉｉ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに水を１．５Ｌ加え、７０℃で３時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＢを３０ｇ得た。
【００３１】
ｉｉｉ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに１００％エタノールを１Ｌ加え、６０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＣを１０ｇ得た。
【００３２】
ｉｖ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに１００％メタノールを１Ｌ加え、６０℃で２時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＤを１１ｇ得た。
【００３３】
ｖ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに１００％酢酸エチルを１Ｌ加え、７０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＥを１０ｇ得た。
【００３４】
ｖｉ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム９０ｇに５０％エタノールを６００ｍＬ加え、５０℃で３時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＡを１２ｇ得た。
【００３５】
ｖｉｉ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム１８０ｇに水を１．２Ｌ加え、７０℃で３時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＢを１２ｇ得た。
【００３６】
ｖｉｉｉ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム２００ｇに１００％エタノールを１．５Ｌ加え、６０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＣを１０ｇ得た。
【００３７】
ｉｘ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム１８０ｇに１００％メタノールを１．２Ｌ加え、６０℃で２時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＤを１２ｇ得た。
【００３８】
ｘ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム２００ｇに１００％酢酸エチルを１．５Ｌ加え、７０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＥを１２．５g得た。
【００３９】
３） 試験結果
本処理によりカカオマスより抽出物ＮＡ〜ＮＥを得た。また、カカオジャームより抽出物ＪＡ〜ＪＥを得た。
【試験例２】
【００４０】
本試験は、カカオ豆抽出物より脱ポリフェノール処理物を調製するために実施した。
【００４１】
１） 供試試料
試験例１にて調製したカカオニブの各溶媒抽出物（ＮＡ〜ＮＥ）及びカカオジャームの各溶媒抽出物（ＪＡ〜ＪＥ）を用いた。
【００４２】
２） 試験法
各抽出物１０ｇを抽出溶媒と同じ溶媒５００ｍＬに溶解し、そこへポリフェノール吸着剤であるポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）５０ｇを付加して２時間攪拌吸着させることにより、ポリフェノールを除去した。その後、吸引濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥を行った。
【００４３】
３） 試験結果
各カカオニブ抽出物（ＮＡ〜ＮＥ）の脱ポリフェノール処理物（ＮＡＰ〜ＮＥＰ）をそれぞれ６．０ｇ、５．０ｇ、５．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ得た。各カカオジャーム抽出物（ＪＡ〜ＪＥ）の脱ポリフェノール処理物（ＪＡＰ〜ＪＥＰ）をそれぞれ６．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ得た。
【試験例３】
【００４４】
本試験はカカオ豆より脱ポリフェノール処理物を調製するために実施した。
【００４５】
１）供試試料
カカオニブ、カカオジャームを用いた。
【００４６】
２）試験法
以下の如く、抽出物を調製した。
【００４７】
ｉ）カカオニブの脱ポリフェノール処理
粉砕したカカオニブ２００ｇに水１．５Ｌを加え、さらにポリフェノール吸着剤であるポリビニルピロリドン（ＰＰＶＰ）５０ｇを付加し、２４時間撹拌吸着させることにより、ポリフェノールを除去した。その後、８０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことにより抽出乾燥物ＮＰ２．５ｇを得た。
【００４８】
ｉｉ）カカオジャームの脱ポリフェノール処理
粉砕したカカオジャーム２００ｇに５０％アセトン１．５Ｌを加え、さらにポリフェノール吸着剤であるポリビニルピロリドン（ＰＰＶＰ）５０ｇを付加し、２４時間撹拌吸着させることにより、ポリフェノールを除去した。その後、４５℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことにより抽出乾燥物ＪＰ３ｇを得た。
【試験例４】
【００４９】
本試験は、脱ポリフェノール処理物のアミノ酸組成物を濃縮するために実施した。
【００５０】
１） 供試試料
試験例２で調製したＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰを用いた。
【００５１】
２） 試験法
ｉ）陽イオン交換樹脂による処理
ＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰをＨ＋フォームに調製したＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４（ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー社）によって、カラム吸着画分と非吸着画分に分画した。即ち、５ｇの供試試料をＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４に供し、水３Ｌで溶出させて未吸着部分を除去した後、２Ｎアンモニア水２．５Ｌで溶出した。得られた溶出画物を濃縮後、凍結乾燥を行った。
【００５２】
ｉｉ）イオン交換ゲル濾過による処理
ＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰをＨ＋フォームに調製したＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、カラム吸着画分と非吸着画分に分画した。即ち、５ｇの供与試料をＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５に供し、水３Ｌで溶出させて未吸着部分を除去した後、２％ＮａＣｌ水溶液２．５Ｌで溶出した。その画分をさらにＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４（ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー社）により分画して脱塩操作を行った。得られた溶出画物を濃縮後、凍結乾燥を行った。
【００５３】
３） 試験結果
陽イオン交換樹脂による処理にて、ＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰよりアミノ酸組成物が濃縮された画分ＮＡＰＤ、ＮＢＰＤ、ＪＡＰＤ、ＪＢＰＤを得た。また、イオン交換ゲル濾過による処理にてＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰよりアミノ酸組成物が濃縮された画分ＮＡＰＳ、ＮＢＰＳ、ＪＡＰＳ、ＪＢＰＳを得た。
【試験例５】
【００５４】
本試験は、各試料のＡＣＥ阻害活性、ポリフェノール含量、アミノ酸含量を測定するために実施した。
【００５５】
１） 供試試料
試験例１〜４にて調製した試料を用いた。
【００５６】
２） 試験法
ｉ）ＡＣＥ阻害活性の測定
バイオケミカルファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２０．１６３７，１９７１記載の方法に準じて行なった。
【００５７】
供試試料が終濃度５００ｐｐｍになるように１０％ジメチルスルホキシドで溶解した被試験液を調製した。また、基質となるヒプリルヒスチジイルロイシンを、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液に溶解させ、２ｍｇ／ｍｌにした反応液を調製した。前記被試験液０．０５ｍｌに反応液０．１ｍｌを添加して３７℃３分間振とうし、この混合溶液に０．１Ｕ／ｍｌに調製したＡＣＥ０．１ｍｌを添加して３７℃、１時間反応させた。１時間後に１Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加することにより、反応を停止した。この反応で生成するヒプリル酸を得るため、反応溶液に酢酸エチル１．５ｍｌを加えて抽出した。ヒプリル酸はＨＰＬＣによって定量し、以下に示す式（Ａ＝供試試料より抽出されたヒプリル酸のピーク面積、Ｂ＝１０％ジメチルスルホキシドより抽出されたヒプリル酸のピーク面積）により供試試料のＡＣＥ阻害率を求めた。
【００５８】
ＡＣＥ阻害率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
【００５９】
ｉｉ）ポリフェノール含量の測定
フォーリンチオカルト（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ）法を用いて測定した。
【００６０】
５０ｍＬ容メスフラスコに供試試料０．１ｇ、蒸留水３５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（Ｓｉｇｍａ社）５ｍｌを添加し、混合して１分間静置した。その後２０％炭酸ナトリウム溶液５ｍｌを添加し、直ちに５０ｍｌにメスアップした。これらを混合し、１時間静置した後、波長７６５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線用試料としては（−）−エピカテキン（Ｓｉｇｍａ社）を用い、これをもとに各試料のポリフェノール量を求めた。
【００６１】
ｉｉｉ）タンパク質量の測定
ケルダール法を用いてタンパク質量（アミノ酸組成物量）を測定した。
【００６２】
ケルダール反応用分解チューブに供試試料１ｇ、硫酸１０ｍｌ、３０％過酸化水素水８ｍｌ、適量の分解促進剤を添加し、分解用加熱装置（ティケーター社）を用いて４２０℃下、タンパク質の分解を行った。この分解液に純水を１００ｍｌ加え、蒸留・滴定装置（ティケーター社）によって窒素含有量を求めた。窒素含有量は次式で表される。
【００６３】
窒素（％）＝０．００１４×（Ｖ１−Ｖ０）×ｆ／Ｓ×１００
Ｖ０：滴定に要した０．１Ｎ硫酸標準用液体積（ｍＬ）：ブランク
Ｖ１：滴定に要した０．１Ｎ硫酸標準用液体積（ｍＬ）：供試試料
ｆ：０．１Ｎ硫酸標準用液ファクター
Ｓ：供試試料量（ｇ）
【００６４】
タンパク質含有量は次式より求めた。
【００６５】
タンパク質含有量（％）＝窒素（％）*×６．２５**
*：カフェイン・テオブロミン窒素（％）を差し引いた値
**：タンパク質換算係数
【００６６】
３） 試験結果
結果は表１、２に示した。
【００６７】
表１、２の如く、上記の方法で得た本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は、アミノ酸からなる組成物を主成分としており、脱ポリフェノール処理することによりアミノ酸組成物量を増加させ、有意に高い活性を示すＡＣＥ阻害物である。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【試験例６】
【００７０】
本試験は、カカオ豆抽出物のアミノ酸組成物が有するＡＣＥ阻害活性効果が、主に、アミノ酸組成物に由来することを検討するために実施した。
【００７１】
１） 供試試料
試験例１で得られたＮＡのポリフェノール含量が、試験例４で得られたＮＡＰのポリフェノール含有量と同じ値になるように、１０％ジメチルスルホキシドで希釈して調製したＮＡｄとＮＡＰを用いた。
【００７２】
２） 試験方法
バイオケミカルファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２０．１６３７，１９７１記載の方法に準じてＡＣＥ阻害を測定した。
【００７３】
供試試料が終濃度５００ｐｐｍになるように１０％ジメチルスルホキシドで溶解した被試験液を調製した。また、基質となるヒプリルヒスチジイルロイシンを、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液に溶解させ、２ｍｇ／ｍｌにした反応液を調製した。前記被試験液０．０５ｍｌに反応液０．１ｍｌを添加して３７℃３分間振とうし、この混合溶液に０．１Ｕ／ｍｌに調製したＡＣＥ０．１ｍｌを添加して３７℃、１時間反応させた。１時間後に１Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加することにより、反応を停止した。この反応で生成するヒプリル酸を得るため、反応溶液に酢酸エチル１．５ｍｌを加えて抽出した。ヒプリル酸はＨＰＬＣによって定量し、以下に示す式（Ａ＝供試試料より抽出されたヒプリル酸のピーク面積、Ｂ＝１０％ジメチルスルホキシドより抽出されたヒプリル酸のピーク面積）により供試試料のＡＣＥ阻害率を求めた。
【００７４】
ＡＣＥ阻害率（％）＝(１−Ａ／Ｂ)×１００
【００７５】
３） 試験結果
結果を表３に示した。
【００７６】
【表３】
【００７７】
表３の如く、ポリフェノール含量が同一にも係らず、本発明のカカオ抽出物ＮＡＰはＮＡｄよりも高いＡＣＥ阻害活性を示した。以上のことから、カカオ抽出物のアミノ酸組成物が高いＡＣＥ阻害活性を有していることが明らかになった。
【試験例７】
【００７８】
本試験は、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物のＡＣＥ阻害活性と、特定保健用食品の一つで、血圧降下に有効とされているサーデンペプチドを配合した「マリンペプチド」（日清オイリオグループ株式会社）のＡＣＥ阻害活性を比較、検討するために実施した。
【００７９】
１） 供試試料
特定保健用食品の一つで、血圧降下に有効とされているサーデンペプチドを配合した「マリンペプチド」（日清オイリオグループ株式会社、タンパク質含量４４％）と、試験例４で得られた分画物ＮＡＰ（カカオニブ抽出物の脱ポリフェノール処理物であって、タンパク質含量３０．６％）を供試試料とした。
【００８０】
２） 試験法
バイオケミカルファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２０．１６３７，１９７１記載の方法に準じてＡＣＥ阻害を測定した。
【００８１】
その際、両者間のタンパク質含有率の差を考慮し、タンパク質の終濃度を揃えた上で試験を実施した。
【００８２】
即ち、ＮＡＰが終濃度５００ｐｐｍ（マリンペプチドは３４８ｐｐｍ）になるように１０％ジメチルスルホキシドで溶解した被試験液を調製した。また、基質となるヒプリルヒスチジイルロイシンを、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液に溶解させ、２ｍｇ／ｍｌにした反応液を調製した。前記被試験液０．０５ｍｌに反応液０．１ｍｌを添加して３７℃３分間振とうし、この混合溶液に０．１Ｕ／ｍｌに調製したＡＣＥ０．１ｍｌを添加して３７℃、１時間反応させた。１時間後に１Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加することにより、反応を停止した。この反応で生成するヒプリル酸を得るため、反応溶液に酢酸エチル１．５ｍｌを加えて抽出した。ヒプリル酸はＨＰＬＣによって定量し、以下に示す式（Ａ＝供試試料より抽出されたヒプリル酸のピーク面積、Ｂ＝１０％ジメチルスルホキシドより抽出されたヒプリル酸のピーク面積）により供試試料のＡＣＥ阻害率を求めた。
【００８３】
ＡＣＥ阻害率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
【００８４】
３） 試験結果
結果を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
表４の如く、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物であるカカオニブ抽出物の脱ポリフェノール処理物ＮＡＰはマリンペプチドよりも顕著に高いＡＣＥ阻害率を示した。
【００８７】
以上の検討により、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は血圧降下に有効とされているサーデンペプチドと比較して顕著に高いＡＣＥ阻害効果を示すことが明らかになった。
【００８８】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、それらによって本発明品の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００８９】
試験例４にて得られたＮＡＰＳを用い、以下の処方にて、錠剤を調製した。
【００９０】
Ｄ−マンニトール ４４．０部
乳糖 ４０．０部
結晶セルロース １０．０部
ヒドロキシプロピルセルロース ５．０部
分画物ＮＡＰＳ １．０部
【実施例２】
【００９１】
試験例４にて得られたＮＢＰＳを用い、以下の処方にて、トローチ剤を調製した。
【００９２】
ブドウ糖 ７２．３部
乳糖 １９．０部
アラビアゴム ６、０部
香料 １．０部
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７部
分画物ＮＢＰＳ １．０部
【実施例３】
【００９３】
試験例４にて得られたＮＢＰＤを用い、以下の処方にて、チューインガムを調製した。
【００９４】
ガムベース ２０．０部
砂糖 ５５．０部
グルコース １５．０部
水飴 ９．０部
香料 ０．５部
分画物ＮＢＰＤ ０．５部
【実施例４】
【００９５】
試験例４にて得られたＪＡＰＳを用い、以下の処方にて、キャンディを調製した。
【００９６】
砂糖 ５０．０部
水飴 ３４．０部
香料 ０．５部
分画物ＪＡＰＳ ０．５部
水 １５．０部
【実施例５】
【００９７】
試験例４にて得られたＪＢＰＤを用い、以下の処方にて、錠菓を調製した。
【００９８】
砂糖 ７６．４部
グルコース １９．０部
ショ糖脂肪酸エステル ０．２部
香料 ０．２部
分画物ＪＢＰＤ ０．１部
水 ４．１部
【実施例６】
【００９９】
試験例４にて得られたＪＢＰＳを用い、以下の処方にて、グミゼリーを調製した。
【０１００】
ゼラチン ６０．０部
水飴 ２３．０部
砂糖 ８．５部
植物油脂 ４．５部
マンニトール ２．９部
レモン果汁 １．０部
分画物ＪＢＰＳ ０．１部
【実施例７】
【０１０１】
試験例４にて得られたＮＢＰＤを用い、以下の処方にて、チョコレートを調製した。
【０１０２】
粉糖 ４０．８部
カカオビター ２０．０部
全脂粉乳 ２０．０部
カカオバター １７．０部
マンニトール １．０部
分画物ＮＢＰＤ １．０部
香料 ０．２部
【実施例８】
【０１０３】
試験例２にて得られたＪＡＰを用い、以下の処方にて、シャーベットを調製した。
【０１０４】
オレンジ果汁 ２５．０部
砂糖 ２５．０部
卵白 １０．０部
分画物ＪＡＰ ２．０部
水 ３８．０部
【実施例９】
【０１０５】
試験例２にて得られたＮＢＰを用い、以下の処方にて、ビスケットを調製した。
【０１０６】
薄力粉１級 ２５．０部
中力粉１級 ２２．０部
精白糖 ５．０部
食塩 １．０部
ブドウ糖 １．０部
パームショートニング １２．０部
炭酸水素ナトリウム ０．２部
重亜硫酸ナトリウム ０．２部
米粉 ２．０部
全脂粉乳 １．０部
代用粉乳 ０．６部
分画物ＮＢＰ １．０部
水 ２９．０部
【実施例１０】
【０１０７】
試験例２にて得られたＪＡＰを用い、以下の処方にて、アイスクリームを調製した。
【０１０８】
脱脂粉乳 ５０．０部
生クリーム ２５．０部
砂糖 １０．０部
卵黄 １０．０部
分画物ＪＡＰ １．０部
香料 ０．１部
水 ３．９部
【実施例１１】
【０１０９】
試験例２にて得られたＪＢＰを用い、以下の処方にて、粉末剤を調製した。
【０１１０】
トウモロコシ澱粉 ５５．０部
カルボキシメチルセルロース ４０．０部
分画物ＪＢＰ ５．０部
【実施例１２】
【０１１１】
試験例１にて得られたＮＣを用い、以下の処方にて、チューインガムを調製した。
【０１１２】
ガムベース ２０．０部
砂糖 ５５．０部
グルコース １５．０部
水飴 ９．０部
香料 ０．５部
抽出物ＮＣ ０．５部
【実施例１３】
【０１１３】
試験例１にて得られたＪＡＰを用い、以下の処方にて、アイスクリームを調製した。
【０１１４】
脱脂粉乳 ５０．０部
生クリーム ２５．０部
砂糖 １０．０部
卵黄 １０．０部
抽出物ＮＡ １．０部
香料 ０．１部
水 ３．９部
【実施例１４】
【０１１５】
試験例３にて得られたＮＰを用い、以下の処方にて、飲料を調製した。
【０１１６】
オレンジ果汁 ３０．０部
異性化糖 １５．０部
クエン酸 ０．１部
ビタミンＣ ０．１部
分画物ＮＰ ０．１部
香料 ０．１部
水 ５４．６部
【実施例１５】
【０１１７】
試験例３にて得られたＪＰを用い、以下の処方にて、ジャムを調製した。
【０１１８】
果肉 ４．０部
砂糖 ６５．０部
清澄果汁 ２５．０部
クエン酸 ０．５部
分画物ＪＰ ２．０部
水 ３．５部
【技術分野】
【０００１】
本発明はカカオ豆由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、特に、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなり、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物及びその製造方法並びにそれを含む飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は糖尿病、高脂血症、肥満などと共に、動脈硬化の起因となっている。また、重篤な合併症を伴うこともあるため、その治療法や予防には従来から大きな注目が集まっている。
【０００３】
高血圧症の解決策の一つとして、血圧上昇機構として知られているレニン−アンジオテンシン系内のアンジオテンシンＩ変換酵素（以下、ＡＣＥと略す）を阻害することが有効であると知られている。ＡＣＥは主に肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在しており、基質であるアンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する酵素である。このアンジオテンシンＩＩは強力な血圧上昇ホルモンとして作用し、血管に存在するレセプターと結合することによって血管収縮を促進する。また、ＡＣＥはキニン−カリクレイン系（降圧系）のブラジキニンを分解する活性を有していることも分かっている。ＡＣＥ活性の阻害はアンジオテンシンＩＩの産生やブラジキニンの分解を抑制することから、ＡＣＥ阻害剤は臨床面において高血圧症の治療や予防に有効である。
【０００４】
最近では、食品や天然物由来の成分にＡＣＥ阻害活性が存在することが見出されている。例えば、カゼイン（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）、いわし（例えば、特許文献２、非特許文献２参照）、わかめ（例えば、特許文献３，４，５，６，７参照）、鮭卵（例えば、特許文献８参照）などから得られるペプチド体や、茶ポリフェノール（例えば、非特許文献３参照）、果実ポリフェノール（例えば、特許文献９参照）などのポリフェノール類、その他ユーカリ抽出物（例えば、特許文献１０参照）、大豆抽出物（例えば、特許文献１１参照）などの植物由来抽出物が挙げられる。
【０００５】
一方、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）についてもその血圧降下作用が認められており、製造工程で発酵の程度を弱くすることによりポリフェノールの損失を抑え、カカオポリフェノール量を高めたココア抽出物などに血圧降下活性があるという報告（例えば、特許文献１２，１３参照）やカカオ中に含まれるポリフェノールの一種であるリグニンが高血圧自然発症ラットの血圧を降下させたという報告がなされている（例えば、非特許文献４参照）。また、コレステロール降下剤及びカカオポリフェノールを含有する組成物（例えば、特許文献１４参照）あるいはＬ−アルギニン及びカカオポリフェノールを含有する組成物（例えば、特許文献１５参照）に心疾患の治療及び予防効果があることが明らかにされている。ただし、カカオのポリフェノール以外の成分がＡＣＥ阻害活性を示すことや、カカオ由来のアミノ酸組成物がＡＣＥ阻害活性を示すことは明らかになっていない。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−１２８２８７号公報
【特許文献２】特開平７−１８８２８２号公報
【特許文献３】特開２００２−１３８１００号公報
【特許文献４】特開２００３−２４６７９５号公報
【特許文献５】特開２００３−２４６７９６号公報
【特許文献６】特開２００３−２４６７９７号公報
【特許文献７】特開２００３−２５２８９７号公報
【特許文献８】特開２００５−１４５８２７号公報
【特許文献９】特開２００２−４７１９６号公報
【特許文献１０】特開平１１−６０４９８号公報
【特許文献１１】特開２００５−９５１５６号公報
【特許文献１２】特開２００３−２０４７５８号公報
【特許文献１３】特開２００１−５０００１６号公報
【特許文献１４】特開２００３−５３０４１０号公報
【特許文献１５】特開２００２−５０５８６４号公報
【非特許文献１】バイオサイエンス バイオテクノロジー アンド バイオケミストリー，５８，１２，２２４４−２２４５，１９９４
【非特許文献２】日本栄養・食糧学会誌，５３，２，７７−８５，２０００
【非特許文献３】日本農芸化学会誌，６１，８０３−８０８，１９８７
【非特許文献４】日本農芸化学会誌，６８，９５７−９６５，１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らはカカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を行い、得られた処理物が高いＡＣＥ阻害活性を有することを見出した。また、本発明者らは特にカカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物が高いＡＣＥ阻害活性を有することを見出した。先に示したようにカカオの血圧降下作用に対する報告は多数あるが、カカオ中に含有されるポリフェノールが効能成分として示されているのみであり、カカオ中のポリフェノール以外の成分がＡＣＥ阻害活性を示すことが明らかになったのは本発明が初めてである。
【０００８】
即ち、本発明の目的は食品として安全性の高く活性の高い天然物由来のＡＣＥ活性阻害物及びその製造方法並びにそれを含有する飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは前記課題を解決するため、カカオ豆及び／又はカカオ豆抽出物に脱ポリフェノール処理を施し、ＡＣＥ活性阻害試験を実施した。具体的には、抽出処理を行っていないカカオ豆及び／又はカカオ豆を水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルなどの溶媒またはこれらの混合溶媒を用いて抽出して得られたカカオ豆抽出物に対し、ポリビニルピロリドン等の吸着助剤による処理や酵素処理等を施すことにより、ポリフェノールを効率良く除去し、さらにカラム分画等のアミノ酸組成物濃縮処理を行うことによりアミノ酸を高含有する画分を得、これらの画分が有意なＡＣＥ阻害活性を有していることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明はカカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物、及びそれを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品である。
【００１１】
本発明はまた、カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物を脱ポリフェノール処理することからなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法、及びその製造方法により得られるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品である。
【発明の効果】
【００１２】
以上に示したように、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は、血圧上昇に関与するＡＣＥを効果的に阻害する作用を有する。従って本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を様々な飲食品に含有させることにより、高血圧症の治療もしくは予防に利用できる。なお、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は血圧降下に有効とされているサーデンペプチドと比較して顕著に高いＡＣＥ阻害効果を有している。
【００１３】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は食品（カカオ豆）由来であることから安全面に問題はない。
【００１４】
また、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は脱ポリフェノール処理が施されていることから、ポリフェノール特有の苦味が少なく呈味性に優れており従来よりも容易に摂取することができるという効果が期待できる。
【００１５】
本発明品は、種々の飲食品、製剤への応用が可能である。また、本発明品の原料となるカカオ豆は、いずれも飲食品素材や天然添加物として古くより用いられているものであり、その安全性については全く問題ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明について詳細に記載する。
【００１７】
本発明品の原料であるカカオ豆としては、通常は加熱処理したカカオニブ（可食部分）もしくはカカオジャーム（胚芽部分）が用いられ、その加熱処理方法及び部位はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
カカオ豆からカカオ豆抽出物を得る方法については特に限定しないが、水、メタノール、エタノール並びにｎ−プロパノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の有機溶剤の１種または２種以上の混合溶媒を加え、従来行われている抽出方法によって、本発明のカカオ豆抽出物を得ることができる。しかし、本発明品はヒトが飲食品あるいは製剤として用いるものであることを考慮すると、抽出溶剤としては安全性の面から水とエタノールとの組み合わせを用いるのが好ましい。
【００１９】
抽出条件としては２０〜９０℃のいずれの温度で抽出することもできるが、５０〜８０℃で１〜５時間程度が好ましい。得られた抽出液は、濾過し、さらに、減圧下において濃縮または凍結乾燥して使用することができる。
【００２０】
上記カカオ豆抽出物又はカカオ豆自体からポリフェノールを除去する処理としては、水アセトンなどの溶剤抽出処理や、セファデックス、メタクリル酸エステル重合体、ポリビニルポリピロリドンなどの吸着助剤処理や、ポリフェノールオキシダーゼなどの酵素処理や、塩化第二鉄法や、これらの方法を組み合わせが挙げられる。
【００２１】
さらにアミノ酸組成物濃縮処理としては、カラム分画等、有機溶剤やイオン交換カラムクロマトグラフィなどを用いて処理物の精製を行うことにより、アミノ酸高含有組成物を得ることができる。本アミノ酸高含有組成物はタンパク質の分解物、ペプチド、アミノ酸から成るものと考えられる。
【００２２】
また、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は香り、呈味性に優れ、安全性が高いことから、例えば、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート等の菓子、シャーベット、飲料等の飲食品及び錠剤、含そう剤等の製剤に配合し、日常的に利用することが可能である。
【００２３】
その添加量としては、飲食品又は製剤に対して乾燥処理物の状態で約０．００１重量％以上、好ましくは約０．０１重量％以上添加するとよい。
【００２４】
本発明品の原料となるカカオ豆は、食品素材や天然添加物として古くより用いられているものであり、これらの処理物や、これを配合した飲食品及び製剤の安全性については全く問題ない。
【００２５】
以下、試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、それらによって本発明品の範囲を制限するものではない。
【試験例１】
【００２６】
本試験は、カカオ豆より抽出物を調製するために実施した。
【００２７】
１） 供試試料
カカオニブ、カカオジジャームを用いた。
【００２８】
２） 試験法
以下の如く、抽出物を調製した。
【００２９】
ｉ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに５０％エタノールを１．５Ｌ加え、８０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＡを２５ｇ得た。
【００３０】
ｉｉ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに水を１．５Ｌ加え、７０℃で３時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＢを３０ｇ得た。
【００３１】
ｉｉｉ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに１００％エタノールを１Ｌ加え、６０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＣを１０ｇ得た。
【００３２】
ｉｖ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに１００％メタノールを１Ｌ加え、６０℃で２時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＤを１１ｇ得た。
【００３３】
ｖ） カカオニブの溶媒抽出
カカオニブ２００ｇに１００％酢酸エチルを１Ｌ加え、７０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＮＥを１０ｇ得た。
【００３４】
ｖｉ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム９０ｇに５０％エタノールを６００ｍＬ加え、５０℃で３時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＡを１２ｇ得た。
【００３５】
ｖｉｉ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム１８０ｇに水を１．２Ｌ加え、７０℃で３時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＢを１２ｇ得た。
【００３６】
ｖｉｉｉ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム２００ｇに１００％エタノールを１．５Ｌ加え、６０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＣを１０ｇ得た。
【００３７】
ｉｘ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム１８０ｇに１００％メタノールを１．２Ｌ加え、６０℃で２時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＤを１２ｇ得た。
【００３８】
ｘ） カカオジャームの溶媒抽出
カカオジャーム２００ｇに１００％酢酸エチルを１．５Ｌ加え、７０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧乾燥した。この操作を２回繰り返すことによって抽出乾燥物ＪＥを１２．５g得た。
【００３９】
３） 試験結果
本処理によりカカオマスより抽出物ＮＡ〜ＮＥを得た。また、カカオジャームより抽出物ＪＡ〜ＪＥを得た。
【試験例２】
【００４０】
本試験は、カカオ豆抽出物より脱ポリフェノール処理物を調製するために実施した。
【００４１】
１） 供試試料
試験例１にて調製したカカオニブの各溶媒抽出物（ＮＡ〜ＮＥ）及びカカオジャームの各溶媒抽出物（ＪＡ〜ＪＥ）を用いた。
【００４２】
２） 試験法
各抽出物１０ｇを抽出溶媒と同じ溶媒５００ｍＬに溶解し、そこへポリフェノール吸着剤であるポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）５０ｇを付加して２時間攪拌吸着させることにより、ポリフェノールを除去した。その後、吸引濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥を行った。
【００４３】
３） 試験結果
各カカオニブ抽出物（ＮＡ〜ＮＥ）の脱ポリフェノール処理物（ＮＡＰ〜ＮＥＰ）をそれぞれ６．０ｇ、５．０ｇ、５．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ得た。各カカオジャーム抽出物（ＪＡ〜ＪＥ）の脱ポリフェノール処理物（ＪＡＰ〜ＪＥＰ）をそれぞれ６．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、６．０ｇ得た。
【試験例３】
【００４４】
本試験はカカオ豆より脱ポリフェノール処理物を調製するために実施した。
【００４５】
１）供試試料
カカオニブ、カカオジャームを用いた。
【００４６】
２）試験法
以下の如く、抽出物を調製した。
【００４７】
ｉ）カカオニブの脱ポリフェノール処理
粉砕したカカオニブ２００ｇに水１．５Ｌを加え、さらにポリフェノール吸着剤であるポリビニルピロリドン（ＰＰＶＰ）５０ｇを付加し、２４時間撹拌吸着させることにより、ポリフェノールを除去した。その後、８０℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことにより抽出乾燥物ＮＰ２．５ｇを得た。
【００４８】
ｉｉ）カカオジャームの脱ポリフェノール処理
粉砕したカカオジャーム２００ｇに５０％アセトン１．５Ｌを加え、さらにポリフェノール吸着剤であるポリビニルピロリドン（ＰＰＶＰ）５０ｇを付加し、２４時間撹拌吸着させることにより、ポリフェノールを除去した。その後、４５℃で１時間静置して抽出を行った。これを濾過し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を２回繰り返すことにより抽出乾燥物ＪＰ３ｇを得た。
【試験例４】
【００４９】
本試験は、脱ポリフェノール処理物のアミノ酸組成物を濃縮するために実施した。
【００５０】
１） 供試試料
試験例２で調製したＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰを用いた。
【００５１】
２） 試験法
ｉ）陽イオン交換樹脂による処理
ＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰをＨ＋フォームに調製したＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４（ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー社）によって、カラム吸着画分と非吸着画分に分画した。即ち、５ｇの供試試料をＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４に供し、水３Ｌで溶出させて未吸着部分を除去した後、２Ｎアンモニア水２．５Ｌで溶出した。得られた溶出画物を濃縮後、凍結乾燥を行った。
【００５２】
ｉｉ）イオン交換ゲル濾過による処理
ＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰをＨ＋フォームに調製したＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、カラム吸着画分と非吸着画分に分画した。即ち、５ｇの供与試料をＳＰ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５に供し、水３Ｌで溶出させて未吸着部分を除去した後、２％ＮａＣｌ水溶液２．５Ｌで溶出した。その画分をさらにＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４（ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー社）により分画して脱塩操作を行った。得られた溶出画物を濃縮後、凍結乾燥を行った。
【００５３】
３） 試験結果
陽イオン交換樹脂による処理にて、ＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰよりアミノ酸組成物が濃縮された画分ＮＡＰＤ、ＮＢＰＤ、ＪＡＰＤ、ＪＢＰＤを得た。また、イオン交換ゲル濾過による処理にてＮＡＰ、ＮＢＰ、ＪＡＰ、ＪＢＰよりアミノ酸組成物が濃縮された画分ＮＡＰＳ、ＮＢＰＳ、ＪＡＰＳ、ＪＢＰＳを得た。
【試験例５】
【００５４】
本試験は、各試料のＡＣＥ阻害活性、ポリフェノール含量、アミノ酸含量を測定するために実施した。
【００５５】
１） 供試試料
試験例１〜４にて調製した試料を用いた。
【００５６】
２） 試験法
ｉ）ＡＣＥ阻害活性の測定
バイオケミカルファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２０．１６３７，１９７１記載の方法に準じて行なった。
【００５７】
供試試料が終濃度５００ｐｐｍになるように１０％ジメチルスルホキシドで溶解した被試験液を調製した。また、基質となるヒプリルヒスチジイルロイシンを、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液に溶解させ、２ｍｇ／ｍｌにした反応液を調製した。前記被試験液０．０５ｍｌに反応液０．１ｍｌを添加して３７℃３分間振とうし、この混合溶液に０．１Ｕ／ｍｌに調製したＡＣＥ０．１ｍｌを添加して３７℃、１時間反応させた。１時間後に１Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加することにより、反応を停止した。この反応で生成するヒプリル酸を得るため、反応溶液に酢酸エチル１．５ｍｌを加えて抽出した。ヒプリル酸はＨＰＬＣによって定量し、以下に示す式（Ａ＝供試試料より抽出されたヒプリル酸のピーク面積、Ｂ＝１０％ジメチルスルホキシドより抽出されたヒプリル酸のピーク面積）により供試試料のＡＣＥ阻害率を求めた。
【００５８】
ＡＣＥ阻害率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
【００５９】
ｉｉ）ポリフェノール含量の測定
フォーリンチオカルト（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ）法を用いて測定した。
【００６０】
５０ｍＬ容メスフラスコに供試試料０．１ｇ、蒸留水３５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（Ｓｉｇｍａ社）５ｍｌを添加し、混合して１分間静置した。その後２０％炭酸ナトリウム溶液５ｍｌを添加し、直ちに５０ｍｌにメスアップした。これらを混合し、１時間静置した後、波長７６５ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線用試料としては（−）−エピカテキン（Ｓｉｇｍａ社）を用い、これをもとに各試料のポリフェノール量を求めた。
【００６１】
ｉｉｉ）タンパク質量の測定
ケルダール法を用いてタンパク質量（アミノ酸組成物量）を測定した。
【００６２】
ケルダール反応用分解チューブに供試試料１ｇ、硫酸１０ｍｌ、３０％過酸化水素水８ｍｌ、適量の分解促進剤を添加し、分解用加熱装置（ティケーター社）を用いて４２０℃下、タンパク質の分解を行った。この分解液に純水を１００ｍｌ加え、蒸留・滴定装置（ティケーター社）によって窒素含有量を求めた。窒素含有量は次式で表される。
【００６３】
窒素（％）＝０．００１４×（Ｖ１−Ｖ０）×ｆ／Ｓ×１００
Ｖ０：滴定に要した０．１Ｎ硫酸標準用液体積（ｍＬ）：ブランク
Ｖ１：滴定に要した０．１Ｎ硫酸標準用液体積（ｍＬ）：供試試料
ｆ：０．１Ｎ硫酸標準用液ファクター
Ｓ：供試試料量（ｇ）
【００６４】
タンパク質含有量は次式より求めた。
【００６５】
タンパク質含有量（％）＝窒素（％）*×６．２５**
*：カフェイン・テオブロミン窒素（％）を差し引いた値
**：タンパク質換算係数
【００６６】
３） 試験結果
結果は表１、２に示した。
【００６７】
表１、２の如く、上記の方法で得た本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は、アミノ酸からなる組成物を主成分としており、脱ポリフェノール処理することによりアミノ酸組成物量を増加させ、有意に高い活性を示すＡＣＥ阻害物である。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【試験例６】
【００７０】
本試験は、カカオ豆抽出物のアミノ酸組成物が有するＡＣＥ阻害活性効果が、主に、アミノ酸組成物に由来することを検討するために実施した。
【００７１】
１） 供試試料
試験例１で得られたＮＡのポリフェノール含量が、試験例４で得られたＮＡＰのポリフェノール含有量と同じ値になるように、１０％ジメチルスルホキシドで希釈して調製したＮＡｄとＮＡＰを用いた。
【００７２】
２） 試験方法
バイオケミカルファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２０．１６３７，１９７１記載の方法に準じてＡＣＥ阻害を測定した。
【００７３】
供試試料が終濃度５００ｐｐｍになるように１０％ジメチルスルホキシドで溶解した被試験液を調製した。また、基質となるヒプリルヒスチジイルロイシンを、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液に溶解させ、２ｍｇ／ｍｌにした反応液を調製した。前記被試験液０．０５ｍｌに反応液０．１ｍｌを添加して３７℃３分間振とうし、この混合溶液に０．１Ｕ／ｍｌに調製したＡＣＥ０．１ｍｌを添加して３７℃、１時間反応させた。１時間後に１Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加することにより、反応を停止した。この反応で生成するヒプリル酸を得るため、反応溶液に酢酸エチル１．５ｍｌを加えて抽出した。ヒプリル酸はＨＰＬＣによって定量し、以下に示す式（Ａ＝供試試料より抽出されたヒプリル酸のピーク面積、Ｂ＝１０％ジメチルスルホキシドより抽出されたヒプリル酸のピーク面積）により供試試料のＡＣＥ阻害率を求めた。
【００７４】
ＡＣＥ阻害率（％）＝(１−Ａ／Ｂ)×１００
【００７５】
３） 試験結果
結果を表３に示した。
【００７６】
【表３】
【００７７】
表３の如く、ポリフェノール含量が同一にも係らず、本発明のカカオ抽出物ＮＡＰはＮＡｄよりも高いＡＣＥ阻害活性を示した。以上のことから、カカオ抽出物のアミノ酸組成物が高いＡＣＥ阻害活性を有していることが明らかになった。
【試験例７】
【００７８】
本試験は、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物のＡＣＥ阻害活性と、特定保健用食品の一つで、血圧降下に有効とされているサーデンペプチドを配合した「マリンペプチド」（日清オイリオグループ株式会社）のＡＣＥ阻害活性を比較、検討するために実施した。
【００７９】
１） 供試試料
特定保健用食品の一つで、血圧降下に有効とされているサーデンペプチドを配合した「マリンペプチド」（日清オイリオグループ株式会社、タンパク質含量４４％）と、試験例４で得られた分画物ＮＡＰ（カカオニブ抽出物の脱ポリフェノール処理物であって、タンパク質含量３０．６％）を供試試料とした。
【００８０】
２） 試験法
バイオケミカルファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２０．１６３７，１９７１記載の方法に準じてＡＣＥ阻害を測定した。
【００８１】
その際、両者間のタンパク質含有率の差を考慮し、タンパク質の終濃度を揃えた上で試験を実施した。
【００８２】
即ち、ＮＡＰが終濃度５００ｐｐｍ（マリンペプチドは３４８ｐｐｍ）になるように１０％ジメチルスルホキシドで溶解した被試験液を調製した。また、基質となるヒプリルヒスチジイルロイシンを、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）に６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液に溶解させ、２ｍｇ／ｍｌにした反応液を調製した。前記被試験液０．０５ｍｌに反応液０．１ｍｌを添加して３７℃３分間振とうし、この混合溶液に０．１Ｕ／ｍｌに調製したＡＣＥ０．１ｍｌを添加して３７℃、１時間反応させた。１時間後に１Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加することにより、反応を停止した。この反応で生成するヒプリル酸を得るため、反応溶液に酢酸エチル１．５ｍｌを加えて抽出した。ヒプリル酸はＨＰＬＣによって定量し、以下に示す式（Ａ＝供試試料より抽出されたヒプリル酸のピーク面積、Ｂ＝１０％ジメチルスルホキシドより抽出されたヒプリル酸のピーク面積）により供試試料のＡＣＥ阻害率を求めた。
【００８３】
ＡＣＥ阻害率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
【００８４】
３） 試験結果
結果を表４に示す。
【００８５】
【表４】
【００８６】
表４の如く、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物であるカカオニブ抽出物の脱ポリフェノール処理物ＮＡＰはマリンペプチドよりも顕著に高いＡＣＥ阻害率を示した。
【００８７】
以上の検討により、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物は血圧降下に有効とされているサーデンペプチドと比較して顕著に高いＡＣＥ阻害効果を示すことが明らかになった。
【００８８】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、それらによって本発明品の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００８９】
試験例４にて得られたＮＡＰＳを用い、以下の処方にて、錠剤を調製した。
【００９０】
Ｄ−マンニトール ４４．０部
乳糖 ４０．０部
結晶セルロース １０．０部
ヒドロキシプロピルセルロース ５．０部
分画物ＮＡＰＳ １．０部
【実施例２】
【００９１】
試験例４にて得られたＮＢＰＳを用い、以下の処方にて、トローチ剤を調製した。
【００９２】
ブドウ糖 ７２．３部
乳糖 １９．０部
アラビアゴム ６、０部
香料 １．０部
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７部
分画物ＮＢＰＳ １．０部
【実施例３】
【００９３】
試験例４にて得られたＮＢＰＤを用い、以下の処方にて、チューインガムを調製した。
【００９４】
ガムベース ２０．０部
砂糖 ５５．０部
グルコース １５．０部
水飴 ９．０部
香料 ０．５部
分画物ＮＢＰＤ ０．５部
【実施例４】
【００９５】
試験例４にて得られたＪＡＰＳを用い、以下の処方にて、キャンディを調製した。
【００９６】
砂糖 ５０．０部
水飴 ３４．０部
香料 ０．５部
分画物ＪＡＰＳ ０．５部
水 １５．０部
【実施例５】
【００９７】
試験例４にて得られたＪＢＰＤを用い、以下の処方にて、錠菓を調製した。
【００９８】
砂糖 ７６．４部
グルコース １９．０部
ショ糖脂肪酸エステル ０．２部
香料 ０．２部
分画物ＪＢＰＤ ０．１部
水 ４．１部
【実施例６】
【００９９】
試験例４にて得られたＪＢＰＳを用い、以下の処方にて、グミゼリーを調製した。
【０１００】
ゼラチン ６０．０部
水飴 ２３．０部
砂糖 ８．５部
植物油脂 ４．５部
マンニトール ２．９部
レモン果汁 １．０部
分画物ＪＢＰＳ ０．１部
【実施例７】
【０１０１】
試験例４にて得られたＮＢＰＤを用い、以下の処方にて、チョコレートを調製した。
【０１０２】
粉糖 ４０．８部
カカオビター ２０．０部
全脂粉乳 ２０．０部
カカオバター １７．０部
マンニトール １．０部
分画物ＮＢＰＤ １．０部
香料 ０．２部
【実施例８】
【０１０３】
試験例２にて得られたＪＡＰを用い、以下の処方にて、シャーベットを調製した。
【０１０４】
オレンジ果汁 ２５．０部
砂糖 ２５．０部
卵白 １０．０部
分画物ＪＡＰ ２．０部
水 ３８．０部
【実施例９】
【０１０５】
試験例２にて得られたＮＢＰを用い、以下の処方にて、ビスケットを調製した。
【０１０６】
薄力粉１級 ２５．０部
中力粉１級 ２２．０部
精白糖 ５．０部
食塩 １．０部
ブドウ糖 １．０部
パームショートニング １２．０部
炭酸水素ナトリウム ０．２部
重亜硫酸ナトリウム ０．２部
米粉 ２．０部
全脂粉乳 １．０部
代用粉乳 ０．６部
分画物ＮＢＰ １．０部
水 ２９．０部
【実施例１０】
【０１０７】
試験例２にて得られたＪＡＰを用い、以下の処方にて、アイスクリームを調製した。
【０１０８】
脱脂粉乳 ５０．０部
生クリーム ２５．０部
砂糖 １０．０部
卵黄 １０．０部
分画物ＪＡＰ １．０部
香料 ０．１部
水 ３．９部
【実施例１１】
【０１０９】
試験例２にて得られたＪＢＰを用い、以下の処方にて、粉末剤を調製した。
【０１１０】
トウモロコシ澱粉 ５５．０部
カルボキシメチルセルロース ４０．０部
分画物ＪＢＰ ５．０部
【実施例１２】
【０１１１】
試験例１にて得られたＮＣを用い、以下の処方にて、チューインガムを調製した。
【０１１２】
ガムベース ２０．０部
砂糖 ５５．０部
グルコース １５．０部
水飴 ９．０部
香料 ０．５部
抽出物ＮＣ ０．５部
【実施例１３】
【０１１３】
試験例１にて得られたＪＡＰを用い、以下の処方にて、アイスクリームを調製した。
【０１１４】
脱脂粉乳 ５０．０部
生クリーム ２５．０部
砂糖 １０．０部
卵黄 １０．０部
抽出物ＮＡ １．０部
香料 ０．１部
水 ３．９部
【実施例１４】
【０１１５】
試験例３にて得られたＮＰを用い、以下の処方にて、飲料を調製した。
【０１１６】
オレンジ果汁 ３０．０部
異性化糖 １５．０部
クエン酸 ０．１部
ビタミンＣ ０．１部
分画物ＮＰ ０．１部
香料 ０．１部
水 ５４．６部
【実施例１５】
【０１１７】
試験例３にて得られたＪＰを用い、以下の処方にて、ジャムを調製した。
【０１１８】
果肉 ４．０部
砂糖 ６５．０部
清澄果汁 ２５．０部
クエン酸 ０．５部
分画物ＪＰ ２．０部
水 ３．５部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項２】
カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項３】
カカオ豆がカカオニブ及び／又はカカオジャームである請求項１又は２記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項４】
脱ポリフェノール処理が溶剤抽出処理、吸着助剤処理、酵素処理及び塩化第二鉄法から構成される群より選択される一つ又は二つ以上の処理の組合せである請求項１記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか一項に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品。
【請求項６】
カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物を脱ポリフェノール処理することからなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項７】
脱ポリフェノール処理物に対し更にアミノ酸組成物濃縮処理することからなる請求項６記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項８】
カカオ豆がカカオニブ及び／又はカカオジャームである請求項６又は７記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項９】
脱ポリフェノール処理が溶剤抽出処理、吸着助剤処理、酵素処理及び塩化第二鉄法から構成される群より選択される一つ又は二つ以上の処理の組合せである請求項６乃至８の何れか一項に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項１０】
請求項６乃至９の何れか一項に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法により得られるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品。
【請求項１】
カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物に脱ポリフェノール処理を施してなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項２】
カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物由来のアミノ酸組成物からなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項３】
カカオ豆がカカオニブ及び／又はカカオジャームである請求項１又は２記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項４】
脱ポリフェノール処理が溶剤抽出処理、吸着助剤処理、酵素処理及び塩化第二鉄法から構成される群より選択される一つ又は二つ以上の処理の組合せである請求項１記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか一項に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品。
【請求項６】
カカオ豆及び／又はカカオ豆の抽出物を脱ポリフェノール処理することからなるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項７】
脱ポリフェノール処理物に対し更にアミノ酸組成物濃縮処理することからなる請求項６記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項８】
カカオ豆がカカオニブ及び／又はカカオジャームである請求項６又は７記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項９】
脱ポリフェノール処理が溶剤抽出処理、吸着助剤処理、酵素処理及び塩化第二鉄法から構成される群より選択される一つ又は二つ以上の処理の組合せである請求項６乃至８の何れか一項に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法。
【請求項１０】
請求項６乃至９の何れか一項に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物の製造方法により得られるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物を含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害用飲食品。
【公開番号】特開２００８−１９２２８（Ｐ２００８−１９２２８Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９４９４２（Ｐ２００６−１９４９４２）
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【出願人】（３０７０１３８５７）株式会社ロッテ (101)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【出願人】（３０７０１３８５７）株式会社ロッテ (101)
【Ｆターム（参考）】
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