アンチエイジング剤
【課題】 桑の新規な薬理用途を提供すること。
【解決手段】 本発明のアンチエイジング剤は、桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【解決手段】 本発明のアンチエイジング剤は、桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、桑の新規な薬理用途に関する。より詳細には、桑の葉由来の新規なアンチエイジング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
クワ科クワ属に属する桑は、日本人の他、中国人や韓国人にも古くから親しみのある植物である。その葉には、血糖値の上昇を抑える効果がある１−デオキシノジリマイシンや、カルシウム、鉄、マグネシウム、亜鉛などのミネラルが含まれていることが知られており、桑の葉のお茶は健康茶として飲用されている。また、桑の根皮（桑白皮）は、利尿作用や降圧作用を有することが知られており、漢方薬として用いられている。さらに、近年、桑の樹皮の抽出物に、ビフィズス菌増殖促進作用があることが特許文献１において報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−８３６５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、桑に含まれる成分やその機能性の全容が解明されるには至っておらず、桑は未だ明らかにされていない薬理作用を有する可能性を秘めている。
そこで本発明は、桑の新規な薬理用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記に点に鑑みて鋭意研究を進めた結果、桑の葉の抽出物が優れたアンチエイジング（抗加齢・抗老化）活性を有することを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明のアンチエイジング剤は、請求項１記載の通り、桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項２記載のアンチエイジング剤は、請求項１記載のアンチエイジング剤において、抽出溶媒として加温されていてもよい水または水を含んでいてもよい有機溶媒を用いることを特徴とする。
また、請求項３記載のアンチエイジング剤は、請求項２記載のアンチエイジング剤において、有機溶媒がアルコールであることを特徴とする。
また、請求項４記載のアンチエイジング剤は、請求項１乃至３のいずれかに記載のアンチエイジング剤において、桑の葉として桑の葉の荒茶を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、桑の新規な薬理用途として、桑の葉の抽出物を有効成分とするアンチエイジング剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１における７０％アセトン抽出物の線虫に対する寿命延長作用を示すグラフである。
【図２】同、超純水抽出物の作用を示すグラフである。
【図３】同、荒茶６０℃熱水抽出物の作用を示すグラフである。
【図４】実施例２におけるエタノール抽出物の線虫に対する寿命延長作用を示すグラフである。
【図５】同、エタノール抽出物から得られたＦ４画分の作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のアンチエイジング剤は、桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とするものである。本発明において用いることができる桑としては、例えば、カラヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）、ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｋｏｉｄｚ）、ログワ（Ｍｏｒｕｓ ｌａｔｉｆｏｌｉａ Ｐｏｉｒ．）、シマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｃｉｄｏｓａ Ｇｒｉｆｆ．）、これらの交配種や交雑種などが挙げられる。
【００１０】
本発明において、桑の葉の抽出物は、例えば、摘み取った桑の葉をそのまま、あるいはこれを細断した後、また、荒茶（生葉を蒸してから、揉捻工程（粗揉、中揉、精揉）を経て、乾燥させたもの）に加工した後、さらには、乾燥させた桑の葉を粉砕して粉末にした後、抽出溶媒としての水や各種の有機溶媒、例えばメタノールやエタノールやイソプロピルアルコールなどのアルコール（水を含んでいてもよい）、アセトン（水を含んでいてもよい）、エーテル、ヘキサン、酢酸エチルなどに投入し、３℃〜１００℃で１時間〜１週間震盪や静置させて成分抽出してからろ過することで、ろ液として得ることができる。抽出溶媒は、単一の溶媒を用いてもよいし複数の溶媒を混合して用いてもよい。得られたろ液は、そのまま液状抽出物として用いてもよいし、凍結乾燥や減圧濃縮を行って固形物や粉末にして用いてもよい。なお、ろ液をさらに硫安分画、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィーなどによって精製し、得られた画分を液状抽出物として用いてもよい。また、例えば最初にヘキサンを用いて抽出操作を行った後、順次、酢酸エチル、アセトン、水といったように、用いる溶媒の極性をだんだんと高くして抽出操作を行い、いずれかの溶媒を用いることで得られたろ液を液状抽出物として用いてもよい。好適な態様としては、抽出溶媒として加温（例えば５０℃〜７０℃）されていてもよい水または水を含んでいてもよい有機溶媒（例えばエタノールや水を１０％〜５０％含むアセトンなど）を用いる態様や、桑の葉として桑の葉の荒茶を用いる態様が挙げられる。
【００１１】
本発明におけるアンチエイジング剤の有効成分である桑の葉の抽出物は、例えば、医薬部外品、医薬品、飲食品（各種の食材に添加する態様を含む）などの形態で人体に対して経口的に投与することができる。これらの形態における製剤組成は特段限定されるものではなく、自体公知の一般的なものを採用することができる。桑の葉の抽出物の投与量は、適用対象者の年齢や性別、症状の程度などに基づいて適宜決定することができ、適切な投与量を投与することにより、アンチエイジング活性に基づいて例えば寿命延長などの効果をもたらすことができる。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１３】
実施例１：桑の葉の抽出物の調製とそのアンチエイジング活性（その１）
（桑の葉の抽出物の調製その１：７０％アセトン抽出物）
岩手県花泉産の桑の葉（カラヤマグワ系統の品種：改良鼠返し）を乾燥させてから粉砕して粉末にし、これに３倍量のｎ−ヘキサンを添加して１２０ｒｐｍでの２４時間の震盪洗浄を３回行い、続いて３倍量の酢酸エチルを用いた同じ条件での震盪洗浄を２回行った後、３倍量の７０％アセトン（水３０％含有）を用いて同じ条件で３回成分抽出を行って抽出液を回収した。それぞれの抽出液を減圧ろ過することで得られたろ液をあわせ、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−８１０：東京理化機械社製、以下同じ）で凍結乾燥することにより、褐色粉末の７０％アセトン抽出物を得た（収率：３．２１％）。
【００１４】
（桑の葉の抽出物の調製その２：超純水抽出物）
桑の葉の抽出物の調製その１で得た７０％アセトン抽出物に対し、酢酸エチルと超純水（ＭＱ水）を用いた二層分配を行い、超純水画分を減圧ろ過することで得られたろ液を凍結乾燥することにより、褐色粉末の超純水抽出物を得た（収率：９０．００％）。
【００１５】
（桑の葉の抽出物の調製その３：荒茶６０℃熱水抽出物）
トヨタマ健康食品社製の桑の葉茶（荒茶、水分量：３％〜５％）に３０倍量の超純水（ＭＱ水）を加え、６０℃に設定した乾熱滅菌機内で１２時間静置することで成分抽出を行って抽出液を回収した後、さらに抽出残渣に２０倍量の超純水（ＭＱ水）を加え、同じ条件で成分抽出を行って抽出液を回収した。それぞれの抽出液を減圧ろ過することで得られたろ液をあわせ、凍結乾燥することにより、褐色粉末の荒茶６０℃熱水抽出物を得た（収率：２９．４０％）。
【００１６】
（アンチエイジング活性試験）
上記の３種類の桑の葉の抽出物のアンチエイジング活性を、以下の方法による線虫（C. elegans）に対する寿命延長作用に基づいて評価した（必要であればKimberley Evason, et al. Anticonvulsant Medications Extend Worm Life-Span, Science 307, 258(2005)やf.a.c. Wiegant, et al. Plant adaptogens increase Lifespan and stress resistance in C. elegans, Biogerontology, DOI 10.1007/s10522-008-9151-9, Accepted: 20 May, 2008を参照のこと）。
【００１７】
（ア）試験方法
（１）実験動物
線虫の野生型であるN2系統を用いた。線虫は下記の飼育プレート上で20℃で飼育した。
（２）培地組成とプレート作製
培地は、0.3% NaCl，0.25%ポリペプトン，1.7%寒天，5mg/mlコレステロール，1mM CaCl2，1mM MgSO4，25mM KH2PO4-KOH(pH6.0)を含むNematode Growth Medium(NGM)寒天培地を用いた。ポジティブコントロールには抗痙攣剤のエソスクシミドを用い、プレート作製前の培地に対して2mg/mlとなるように添加した。各供試試料についてはプレート作製前の培地に対して5mg/mlとなるように添加した。プレートは滅菌シャーレ(直径60mm)に各NGM寒天培地を約7ml分注して作製した。
（３）大腸菌の調製と飼育プレート
線虫の飼育には餌として大腸菌E. coli(OP50)を用いた。この大腸菌B株由来OP50はウラシル要求株であり、栄養を制限した寒天培地での過剰な増殖が抑えられ、線虫の形態や行動を実体顕微鏡で観察するのに適した食餌源となる。餌とする大腸菌は、5mlのLB brothに一白銀耳懸濁させ、バイオシェーカーで37℃，120rpm，15時間培養したものを用いた。この懸濁液を1プレートあたり約30μl滴下し、壁面に当らない程度にスプレッダーで広げた。こうして大腸菌を塗布したポジティブコントロールまたは各供試試料を含有するNGM寒天培地(以下「飼育プレート」)は室温で12時間培養した後、使用するまで4℃で保存した。なお、試薬や器材は全て滅菌したものを用いた。また、実験操作は安全キャビネット内で行い、微生物による汚染を防いだ。
（４）線虫の生存率と平均寿命の測定
生存率と平均寿命の測定に用いる線虫は4齢幼虫(L4)とした。線虫は孵化直後からポジティブコントロールまたは各供試試料を与えるために、あらかじめ飼育プレートで飼育しておいた。飼育プレート中の線虫の多くがL4に成長するまで飼育した後、1試料に対して4枚の新しい飼育プレートを準備して、15頭ずつ植え継いだ。この日を観察0日目とし、線虫が卵を産まなくなるまで1日おきに新しい飼育プレートに植え継いだ。観察は毎日定時±2時間の範囲で行い、試験中に体内で卵が孵化してしまった個体や植え継ぎの際に外傷を負った個体はその都度除外し、日数の経過に伴う線虫の生存率の変動を調べるとともに、平均寿命(日数)=(線虫が死亡し始めた観察日+線虫が生きていた最後の観察日)/2の数式により線虫の平均寿命を算出した。
【００１８】
（イ）試験結果
７０％アセトン抽出物、超純水抽出物、荒茶６０℃熱水抽出物のそれぞれの、日数の経過に伴う線虫の生存率の変動に対する作用を図１〜図３に示すとともに（コントロールはポジティブコントロールも各供試試料も添加していないプレートを用いた試験結果を意味する、以下同じ）、線虫の平均寿命に対する作用を表１〜表３に示す。各図と各表から明らかなように、３種類の桑の葉の抽出物には線虫に対する寿命延長作用があり、それぞれのアンチエイジング活性を確認することができた。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
実施例２：桑の葉の抽出物の調製とそのアンチエイジング活性（その２）
４℃に保存しておいた岩手県花泉産の桑の葉（カラヤマグワ系統の品種：あおばねずみ）に５倍量のエタノールを添加して１２０ｒｐｍでの２４時間の震盪抽出を行った後、さらにもう１回、同じ条件で成分抽出を行って抽出液を回収した。それぞれの抽出液を減圧ろ過することで得られたろ液をあわせ、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ Ｎ−１０００：東京理化機械社製、以下同じ）で濃縮後、凍結乾燥することにより、緑色粉末のエタノール抽出物を得た（収率：１．６２％）。
次に、上記のエタノール抽出物を精製するため、逆相フラッシュクロマトグラフィーによる分離を行った。カラムの作製は、乾式充填法に従い、担体であるシリカゲル（Ｗａｋｏｓｉｌ ４０Ｃ１８：和光純薬工業社製）を、カラム体積が１００ｃｍ３になるように内径が３．５ｃｍのフラッシュカラムクロマト管に１０ｃｍの高さまで充填し、担体表面を乱さぬように溶媒として１０％メタノール（水９０％含有）をカラム体積の３倍容加え、ポンプで加圧することで溶媒と担体内の気泡を押し出し、担体を膨潤させて行った。エタノール抽出物に３倍量の担体を加えた後、エタノールを添加することでエタノール抽出物を溶解して担体に吸着させ、ダイヤフラムによる減圧乾燥を行った後、クロマト管にチャージした。カラム体積の３倍容の５０％メタノール（水５０％含有）、３倍容の７５％メタノール（水２５％含有）、１０倍容の１００％メタノールを順番に流し、５０％メタノール溶出液と７５％メタノール溶出液をそれぞれ三角フラスコに回収し、凍結乾燥した。また、１００％メタノール溶出液を１０ｍｌずつ試験管に分取した。次に、それぞれの試験管に分取した１００％メタノール溶出液の精製度を逆相シリカゲルプレート（ＴＬＣ−ｐｌａｔｅ ＲＰ−１８Ｆ２５４ｓ：メルク社製）で確認した。確認は、展開溶媒として１００％メタノールを用い、硫酸発色法と紫外線発色法（２５４ｎｍ、３６５ｎｍ：ＵＶランプはアズワン社のＳＬＵＶ−６を使用）によりスポットを可視化させて行った。それぞれのスポットのＲｆ値が近似の画分を同一物質含有画分として１つにまとめ、濃縮後、凍結乾燥した。以上の工程から、以下の６つの画分を得た。
・ Ｆ１画分（５０％メタノール溶出画分、収率：２６．６％、褐色粉末）
・ Ｆ２画分（７５％メタノール溶出画分、収率：２．２％、黄色粉末）
１００％メタノール溶出画分
・ Ｆ３画分（Ｒｆ：０．３７以上、収率：３．３％、ダークブラウン色粉末）
・ Ｆ４画分（Ｒｆ：０．２０〜０．２６、収率：６．２％、濃緑色粉末）
・ Ｆ５画分（Ｒｆ：０．１１〜０．１４、収率：３．４％、淡緑色粉末）
・ Ｆ６画分（Ｒｆ：０．１０以下、収率：１．８％、ライトブラウン色粉末）
【００２３】
実施例１と同様の方法で測定したエタノール抽出物の日数の経過に伴う線虫の生存率の変動に対する作用を図４に、線虫の平均寿命に対する作用を表４にそれぞれ示す。また、Ｆ２画分の線虫の平均寿命に対する作用を表５に示す。さらに、Ｆ４画分の日数の経過に伴う線虫の生存率の変動に対する作用を図５に、線虫の平均寿命に対する作用を表５にそれぞれ示す。図４と表４から明らかなように、エタノール抽出物は７０％アセトン抽出物などよりも低濃度で高いアンチエイジング活性を発揮した。図５と表５から明らかなように、エタノール抽出物から得られた画分の中では、とりわけＦ４画分が極めて低濃度で非常に高いアンチエイジング活性を発揮した。
【００２４】
【表４】
【００２５】
【表５】
【００２６】
製剤例１：錠剤
以下の成分組成からなるアンチエイジングのための錠剤を自体公知の方法で製造した。
桑の葉の荒茶６０℃熱水抽出物 １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９ （単位：重量％）
【００２７】
製剤例２：ビスケット
以下の成分組成からなるアンチエイジングのためのビスケットを自体公知の方法で製造した。
桑の葉の荒茶６０℃熱水抽出物 １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １ （単位：重量％）
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、桑の新規な薬理用途として、桑の葉の抽出物を有効成分とするアンチエイジング剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、桑の新規な薬理用途に関する。より詳細には、桑の葉由来の新規なアンチエイジング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
クワ科クワ属に属する桑は、日本人の他、中国人や韓国人にも古くから親しみのある植物である。その葉には、血糖値の上昇を抑える効果がある１−デオキシノジリマイシンや、カルシウム、鉄、マグネシウム、亜鉛などのミネラルが含まれていることが知られており、桑の葉のお茶は健康茶として飲用されている。また、桑の根皮（桑白皮）は、利尿作用や降圧作用を有することが知られており、漢方薬として用いられている。さらに、近年、桑の樹皮の抽出物に、ビフィズス菌増殖促進作用があることが特許文献１において報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−８３６５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、桑に含まれる成分やその機能性の全容が解明されるには至っておらず、桑は未だ明らかにされていない薬理作用を有する可能性を秘めている。
そこで本発明は、桑の新規な薬理用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記に点に鑑みて鋭意研究を進めた結果、桑の葉の抽出物が優れたアンチエイジング（抗加齢・抗老化）活性を有することを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明のアンチエイジング剤は、請求項１記載の通り、桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項２記載のアンチエイジング剤は、請求項１記載のアンチエイジング剤において、抽出溶媒として加温されていてもよい水または水を含んでいてもよい有機溶媒を用いることを特徴とする。
また、請求項３記載のアンチエイジング剤は、請求項２記載のアンチエイジング剤において、有機溶媒がアルコールであることを特徴とする。
また、請求項４記載のアンチエイジング剤は、請求項１乃至３のいずれかに記載のアンチエイジング剤において、桑の葉として桑の葉の荒茶を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、桑の新規な薬理用途として、桑の葉の抽出物を有効成分とするアンチエイジング剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１における７０％アセトン抽出物の線虫に対する寿命延長作用を示すグラフである。
【図２】同、超純水抽出物の作用を示すグラフである。
【図３】同、荒茶６０℃熱水抽出物の作用を示すグラフである。
【図４】実施例２におけるエタノール抽出物の線虫に対する寿命延長作用を示すグラフである。
【図５】同、エタノール抽出物から得られたＦ４画分の作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のアンチエイジング剤は、桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とするものである。本発明において用いることができる桑としては、例えば、カラヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）、ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｋｏｉｄｚ）、ログワ（Ｍｏｒｕｓ ｌａｔｉｆｏｌｉａ Ｐｏｉｒ．）、シマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｃｉｄｏｓａ Ｇｒｉｆｆ．）、これらの交配種や交雑種などが挙げられる。
【００１０】
本発明において、桑の葉の抽出物は、例えば、摘み取った桑の葉をそのまま、あるいはこれを細断した後、また、荒茶（生葉を蒸してから、揉捻工程（粗揉、中揉、精揉）を経て、乾燥させたもの）に加工した後、さらには、乾燥させた桑の葉を粉砕して粉末にした後、抽出溶媒としての水や各種の有機溶媒、例えばメタノールやエタノールやイソプロピルアルコールなどのアルコール（水を含んでいてもよい）、アセトン（水を含んでいてもよい）、エーテル、ヘキサン、酢酸エチルなどに投入し、３℃〜１００℃で１時間〜１週間震盪や静置させて成分抽出してからろ過することで、ろ液として得ることができる。抽出溶媒は、単一の溶媒を用いてもよいし複数の溶媒を混合して用いてもよい。得られたろ液は、そのまま液状抽出物として用いてもよいし、凍結乾燥や減圧濃縮を行って固形物や粉末にして用いてもよい。なお、ろ液をさらに硫安分画、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィーなどによって精製し、得られた画分を液状抽出物として用いてもよい。また、例えば最初にヘキサンを用いて抽出操作を行った後、順次、酢酸エチル、アセトン、水といったように、用いる溶媒の極性をだんだんと高くして抽出操作を行い、いずれかの溶媒を用いることで得られたろ液を液状抽出物として用いてもよい。好適な態様としては、抽出溶媒として加温（例えば５０℃〜７０℃）されていてもよい水または水を含んでいてもよい有機溶媒（例えばエタノールや水を１０％〜５０％含むアセトンなど）を用いる態様や、桑の葉として桑の葉の荒茶を用いる態様が挙げられる。
【００１１】
本発明におけるアンチエイジング剤の有効成分である桑の葉の抽出物は、例えば、医薬部外品、医薬品、飲食品（各種の食材に添加する態様を含む）などの形態で人体に対して経口的に投与することができる。これらの形態における製剤組成は特段限定されるものではなく、自体公知の一般的なものを採用することができる。桑の葉の抽出物の投与量は、適用対象者の年齢や性別、症状の程度などに基づいて適宜決定することができ、適切な投与量を投与することにより、アンチエイジング活性に基づいて例えば寿命延長などの効果をもたらすことができる。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１３】
実施例１：桑の葉の抽出物の調製とそのアンチエイジング活性（その１）
（桑の葉の抽出物の調製その１：７０％アセトン抽出物）
岩手県花泉産の桑の葉（カラヤマグワ系統の品種：改良鼠返し）を乾燥させてから粉砕して粉末にし、これに３倍量のｎ−ヘキサンを添加して１２０ｒｐｍでの２４時間の震盪洗浄を３回行い、続いて３倍量の酢酸エチルを用いた同じ条件での震盪洗浄を２回行った後、３倍量の７０％アセトン（水３０％含有）を用いて同じ条件で３回成分抽出を行って抽出液を回収した。それぞれの抽出液を減圧ろ過することで得られたろ液をあわせ、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−８１０：東京理化機械社製、以下同じ）で凍結乾燥することにより、褐色粉末の７０％アセトン抽出物を得た（収率：３．２１％）。
【００１４】
（桑の葉の抽出物の調製その２：超純水抽出物）
桑の葉の抽出物の調製その１で得た７０％アセトン抽出物に対し、酢酸エチルと超純水（ＭＱ水）を用いた二層分配を行い、超純水画分を減圧ろ過することで得られたろ液を凍結乾燥することにより、褐色粉末の超純水抽出物を得た（収率：９０．００％）。
【００１５】
（桑の葉の抽出物の調製その３：荒茶６０℃熱水抽出物）
トヨタマ健康食品社製の桑の葉茶（荒茶、水分量：３％〜５％）に３０倍量の超純水（ＭＱ水）を加え、６０℃に設定した乾熱滅菌機内で１２時間静置することで成分抽出を行って抽出液を回収した後、さらに抽出残渣に２０倍量の超純水（ＭＱ水）を加え、同じ条件で成分抽出を行って抽出液を回収した。それぞれの抽出液を減圧ろ過することで得られたろ液をあわせ、凍結乾燥することにより、褐色粉末の荒茶６０℃熱水抽出物を得た（収率：２９．４０％）。
【００１６】
（アンチエイジング活性試験）
上記の３種類の桑の葉の抽出物のアンチエイジング活性を、以下の方法による線虫（C. elegans）に対する寿命延長作用に基づいて評価した（必要であればKimberley Evason, et al. Anticonvulsant Medications Extend Worm Life-Span, Science 307, 258(2005)やf.a.c. Wiegant, et al. Plant adaptogens increase Lifespan and stress resistance in C. elegans, Biogerontology, DOI 10.1007/s10522-008-9151-9, Accepted: 20 May, 2008を参照のこと）。
【００１７】
（ア）試験方法
（１）実験動物
線虫の野生型であるN2系統を用いた。線虫は下記の飼育プレート上で20℃で飼育した。
（２）培地組成とプレート作製
培地は、0.3% NaCl，0.25%ポリペプトン，1.7%寒天，5mg/mlコレステロール，1mM CaCl2，1mM MgSO4，25mM KH2PO4-KOH(pH6.0)を含むNematode Growth Medium(NGM)寒天培地を用いた。ポジティブコントロールには抗痙攣剤のエソスクシミドを用い、プレート作製前の培地に対して2mg/mlとなるように添加した。各供試試料についてはプレート作製前の培地に対して5mg/mlとなるように添加した。プレートは滅菌シャーレ(直径60mm)に各NGM寒天培地を約7ml分注して作製した。
（３）大腸菌の調製と飼育プレート
線虫の飼育には餌として大腸菌E. coli(OP50)を用いた。この大腸菌B株由来OP50はウラシル要求株であり、栄養を制限した寒天培地での過剰な増殖が抑えられ、線虫の形態や行動を実体顕微鏡で観察するのに適した食餌源となる。餌とする大腸菌は、5mlのLB brothに一白銀耳懸濁させ、バイオシェーカーで37℃，120rpm，15時間培養したものを用いた。この懸濁液を1プレートあたり約30μl滴下し、壁面に当らない程度にスプレッダーで広げた。こうして大腸菌を塗布したポジティブコントロールまたは各供試試料を含有するNGM寒天培地(以下「飼育プレート」)は室温で12時間培養した後、使用するまで4℃で保存した。なお、試薬や器材は全て滅菌したものを用いた。また、実験操作は安全キャビネット内で行い、微生物による汚染を防いだ。
（４）線虫の生存率と平均寿命の測定
生存率と平均寿命の測定に用いる線虫は4齢幼虫(L4)とした。線虫は孵化直後からポジティブコントロールまたは各供試試料を与えるために、あらかじめ飼育プレートで飼育しておいた。飼育プレート中の線虫の多くがL4に成長するまで飼育した後、1試料に対して4枚の新しい飼育プレートを準備して、15頭ずつ植え継いだ。この日を観察0日目とし、線虫が卵を産まなくなるまで1日おきに新しい飼育プレートに植え継いだ。観察は毎日定時±2時間の範囲で行い、試験中に体内で卵が孵化してしまった個体や植え継ぎの際に外傷を負った個体はその都度除外し、日数の経過に伴う線虫の生存率の変動を調べるとともに、平均寿命(日数)=(線虫が死亡し始めた観察日+線虫が生きていた最後の観察日)/2の数式により線虫の平均寿命を算出した。
【００１８】
（イ）試験結果
７０％アセトン抽出物、超純水抽出物、荒茶６０℃熱水抽出物のそれぞれの、日数の経過に伴う線虫の生存率の変動に対する作用を図１〜図３に示すとともに（コントロールはポジティブコントロールも各供試試料も添加していないプレートを用いた試験結果を意味する、以下同じ）、線虫の平均寿命に対する作用を表１〜表３に示す。各図と各表から明らかなように、３種類の桑の葉の抽出物には線虫に対する寿命延長作用があり、それぞれのアンチエイジング活性を確認することができた。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
実施例２：桑の葉の抽出物の調製とそのアンチエイジング活性（その２）
４℃に保存しておいた岩手県花泉産の桑の葉（カラヤマグワ系統の品種：あおばねずみ）に５倍量のエタノールを添加して１２０ｒｐｍでの２４時間の震盪抽出を行った後、さらにもう１回、同じ条件で成分抽出を行って抽出液を回収した。それぞれの抽出液を減圧ろ過することで得られたろ液をあわせ、ロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ Ｎ−１０００：東京理化機械社製、以下同じ）で濃縮後、凍結乾燥することにより、緑色粉末のエタノール抽出物を得た（収率：１．６２％）。
次に、上記のエタノール抽出物を精製するため、逆相フラッシュクロマトグラフィーによる分離を行った。カラムの作製は、乾式充填法に従い、担体であるシリカゲル（Ｗａｋｏｓｉｌ ４０Ｃ１８：和光純薬工業社製）を、カラム体積が１００ｃｍ３になるように内径が３．５ｃｍのフラッシュカラムクロマト管に１０ｃｍの高さまで充填し、担体表面を乱さぬように溶媒として１０％メタノール（水９０％含有）をカラム体積の３倍容加え、ポンプで加圧することで溶媒と担体内の気泡を押し出し、担体を膨潤させて行った。エタノール抽出物に３倍量の担体を加えた後、エタノールを添加することでエタノール抽出物を溶解して担体に吸着させ、ダイヤフラムによる減圧乾燥を行った後、クロマト管にチャージした。カラム体積の３倍容の５０％メタノール（水５０％含有）、３倍容の７５％メタノール（水２５％含有）、１０倍容の１００％メタノールを順番に流し、５０％メタノール溶出液と７５％メタノール溶出液をそれぞれ三角フラスコに回収し、凍結乾燥した。また、１００％メタノール溶出液を１０ｍｌずつ試験管に分取した。次に、それぞれの試験管に分取した１００％メタノール溶出液の精製度を逆相シリカゲルプレート（ＴＬＣ−ｐｌａｔｅ ＲＰ−１８Ｆ２５４ｓ：メルク社製）で確認した。確認は、展開溶媒として１００％メタノールを用い、硫酸発色法と紫外線発色法（２５４ｎｍ、３６５ｎｍ：ＵＶランプはアズワン社のＳＬＵＶ−６を使用）によりスポットを可視化させて行った。それぞれのスポットのＲｆ値が近似の画分を同一物質含有画分として１つにまとめ、濃縮後、凍結乾燥した。以上の工程から、以下の６つの画分を得た。
・ Ｆ１画分（５０％メタノール溶出画分、収率：２６．６％、褐色粉末）
・ Ｆ２画分（７５％メタノール溶出画分、収率：２．２％、黄色粉末）
１００％メタノール溶出画分
・ Ｆ３画分（Ｒｆ：０．３７以上、収率：３．３％、ダークブラウン色粉末）
・ Ｆ４画分（Ｒｆ：０．２０〜０．２６、収率：６．２％、濃緑色粉末）
・ Ｆ５画分（Ｒｆ：０．１１〜０．１４、収率：３．４％、淡緑色粉末）
・ Ｆ６画分（Ｒｆ：０．１０以下、収率：１．８％、ライトブラウン色粉末）
【００２３】
実施例１と同様の方法で測定したエタノール抽出物の日数の経過に伴う線虫の生存率の変動に対する作用を図４に、線虫の平均寿命に対する作用を表４にそれぞれ示す。また、Ｆ２画分の線虫の平均寿命に対する作用を表５に示す。さらに、Ｆ４画分の日数の経過に伴う線虫の生存率の変動に対する作用を図５に、線虫の平均寿命に対する作用を表５にそれぞれ示す。図４と表４から明らかなように、エタノール抽出物は７０％アセトン抽出物などよりも低濃度で高いアンチエイジング活性を発揮した。図５と表５から明らかなように、エタノール抽出物から得られた画分の中では、とりわけＦ４画分が極めて低濃度で非常に高いアンチエイジング活性を発揮した。
【００２４】
【表４】
【００２５】
【表５】
【００２６】
製剤例１：錠剤
以下の成分組成からなるアンチエイジングのための錠剤を自体公知の方法で製造した。
桑の葉の荒茶６０℃熱水抽出物 １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９ （単位：重量％）
【００２７】
製剤例２：ビスケット
以下の成分組成からなるアンチエイジングのためのビスケットを自体公知の方法で製造した。
桑の葉の荒茶６０℃熱水抽出物 １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １ （単位：重量％）
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、桑の新規な薬理用途として、桑の葉の抽出物を有効成分とするアンチエイジング剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とするアンチエイジング剤。
【請求項２】
抽出溶媒として加温されていてもよい水または水を含んでいてもよい有機溶媒を用いることを特徴とする請求項１記載のアンチエイジング剤。
【請求項３】
有機溶媒がアルコールであることを特徴とする請求項２記載のアンチエイジング剤。
【請求項４】
桑の葉として桑の葉の荒茶を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のアンチエイジング剤。
【請求項１】
桑の葉の抽出物を有効成分とすることを特徴とするアンチエイジング剤。
【請求項２】
抽出溶媒として加温されていてもよい水または水を含んでいてもよい有機溶媒を用いることを特徴とする請求項１記載のアンチエイジング剤。
【請求項３】
有機溶媒がアルコールであることを特徴とする請求項２記載のアンチエイジング剤。
【請求項４】
桑の葉として桑の葉の荒茶を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のアンチエイジング剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１１６３９４（Ｐ２０１０−１１６３９４Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３７０３０（Ｐ２００９−２３７０３０）
【出願日】平成２１年１０月１４日（２００９．１０．１４）
【出願人】（５０４１６５５９１）国立大学法人岩手大学 (222)
【出願人】（５９７０４０７７３）トヨタマ健康食品株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１４日（２００９．１０．１４）
【出願人】（５０４１６５５９１）国立大学法人岩手大学 (222)
【出願人】（５９７０４０７７３）トヨタマ健康食品株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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