説明

アンチトロンビンIII含有止血用組成物

新規な止血用組成物もしくは止血用製剤を提供する。分離精製した活性化血液凝固第VII因子(FVIIa)及び血液凝固第X因子(FX)を単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物に、さらにアンチトロンビンIII(AT−III)を加えたことを特徴とする、薬剤学的に安定な溶液状止血用組成物。混合溶液中のFVIIa、FX及びAT−IIIの濃度は各々1〜20μM、5〜400μM及び0.1〜5.0国際単位/mLの範囲である。さらに、FVIIa及びFXを同一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物にAT−IIIを加えることを特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定化方法を提供する。当該溶液状止血用組成物のpHは、5.0を超える範囲、好ましくは5.0を超え、7.0未満、さらに好ましくは5.5以上、6.5以下である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は医療用医薬品の分野に関し、血漿蛋白質を含有する新たな止血用組成物及び製剤に関する。詳細には、活性化血液凝固第VII因子(以下、「FVIIa」と称することがある)及び血液凝固第X因子(以下、「FX」と称することがある)を単一容器内に混合して含有し、これにさらにアンチトロンビンIII(以下、「AT−III」と称することがある)を加えたことを特徴とする治療用薬剤に関する。さらに本発明は、FVIIa及びFXを同一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物にAT−IIIを加えることを特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定化方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血友病インヒビター患者の止血管理には、活性型プロトロンビン複合体製剤(APCC製剤)や遺伝子組換え活性型血液凝固第VII因子製剤(rFVIIa製剤)等が用いられている。しかしながら、前者は安全性において、後者は有効性において満足のいくものとはいえず、本発明者等はこれらの欠点を補った止血剤として、FVIIaとFXを複合した医薬組成物の有用性を示した(特許文献1参照)。
【0003】
これら止血管理に用いる蛋白質を主要成分とする医薬組成物は、静脈内投与が最適であり、使用に適した形態でアンプル、注射器やバイアル等の容器に封入した剤型として供給される。より一般的には、蛋白質を凍結乾燥物として含有する容器と、その凍結乾燥物の溶解に適した溶液を含有する容器とからなるセットが用いられている。血液凝固因子に関連した蛋白質濃縮物は、血漿由来もしくは遺伝子組換え技術を用いて調製された薬剤が製剤化されているが、それらの殆どが上記のような凍結乾燥粉末と溶解液のセットとして供給されている。
【0004】
FVIIaとFXを複合した製剤の剤型を考案する場合、2つの方策がある。1つはFVIIaとFXとを別々の容器に入れて用意する方策であり、もう1つはFVIIaとFXとを混合して単一の容器に入れて用意する方策である。後者は混合した溶液の凍結乾燥粉末と溶解液からなるセットとなり、1セット計2個の容器で足りるのに対し、前者はそれぞれの因子につき凍結乾燥粉末と溶解液のセットとなり、2セット計4個の容器が必要となる。加えて、前者は溶解液を凍結乾燥粉末の容器に移注する装置や操作を余分に必要とするため、利便性の観点からも好ましくない。このようにFVIIaとFXとを混合して調製し、単一の容器に封入することができれば、薬剤本来の薬力学的な有用性だけでなく、さらに製剤学的な利便性をも兼ね備えた製剤となり得る。
【0005】
図1に示すようにFVIIaとFXは酵素と基質の関係にあり、生理的条件下でFVIIaは、リン脂質やCa2+存在下に、血管傷害部位に現れる組織因子と複合体を形成してFXを加水分解する。その結果生じたFXaは引き続き生じる酵素反応を惹起し、最終的には、不溶性のフィブリンを形成することで止血に至る。しかしながら、このFXaは、血管傷害部位のような出血局所にて産生される場合には、止血効果を示す有効な因子である一方で、全身循環で過剰に存在する場合には、全身的な過凝固を誘引することが報告されているだけでなく(非特許文献1参照)、血管内皮細胞や糸球体間質細胞の活性化を介した炎症の惹起にも寄与している(非特許文献2及び非特許文献3参照)という好ましくない一面が示唆されている。
【0006】
FVIIaによるFXの加水分解は、両者が非生理的な高濃度で存在する場合にはFXaの産生はもはや制御することができず、その結果、大量のFXa産生を生じる。また、それらにより生じるFXaは、FVIIaを基質として分解不活化してしまうために(非特許文献4参照)、安定な溶液として存在することは困難である。このように、不安定な状態のままで製剤化することもできないし、ましてやそのような溶液を患者へ投与することはできない。
【0007】
これまで述べてきたように、精製分取された酵素と基質を混合して単一容器内に封入するような概念の既存製剤はなかったため、本発明者等はこれらの課題を克服する技術の1つを示した(特許文献2参照)。当該発明はFVIIa及びFXの混合液状組成物並びに当該組成物の凍結乾燥製剤に関するものであり、FVIIaをその至適pHであるpH6.5〜10.0を外れた酸性領域下(pH5.0〜6.5)においてFXと混合することを特徴とするものである。すなわち、FVIIa自体の加水分解活性を制御することによってFXaの産生を低下せしめようとするものである。
【0008】
【特許文献1】特開2001−181204号公報
【特許文献2】国際公開第03/006054号パンフレット
【非特許文献1】ガイルズ(Giles,A.R.)ら、British Journal of Haematology,1988,69:p.491−497
【非特許文献2】カメラー(Camerer E.)ら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97:p.5255−5260
【非特許文献3】モンノ(Monno R.)ら、Journal of the American Society of Nephrology,2001,12:p.891−899
【非特許文献4】バジャジ(Bajaj,S.P.)ら、The Journal of Biological Chemistry,1973,248:p.7729−7741
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
一方、血友病という患者の特殊性から、しばしば血液凝固因子製剤の投与は患者自らもしくはその保護者による注射という方法が取られる。このような使用時の態様に配慮した製剤化を考慮すると、製剤の投与容量は少ないほうが好ましく、すなわち酵素FVIIa及び基質FXを極めて高濃度にすることが望まれる。さらに、そのような場合であってもFXa量の増加を極力抑制することが必要である。その意味においては、先述した国際公開第03/006054号パンフレットに開示された、FVIIa及びFXの混合溶液を酸性領域下(pH5.0〜6.5)におくことによりFXaの産生を抑制する方法には限界があり、極めて少量のFXa量を高感度に測定すると、それら酸性領域の緩衝液においてさえも僅かではあるが経時的なFXa量の増大が認められる。
【0010】
このように、極めて高濃度のFVIIa及びFXからなる混合溶液中に存在し、増加するFXa量を、薬剤の使用に際して必要な一定の時間、一定の濃度に制御する方法はなく、従来、この課題に対して克服する技術がなかった。
【課題を解決するための手段】
【0011】
そこで、本発明者らは酵素であるFVIIaと基質であるFXとを極めて高濃度に混合して単一容器内へ封入し、さらに極めて安定な状態を保持し得る剤型を開発すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、FVIIaとFXとの極めて高濃度の混合物にアンチトロンビンIII(AT−III)を加えることによって産生されたFXaが特異的に阻害される結果、従来の活性型血液凝固因子製剤では試みられることのなかった酵素・基質の極めて安定な混合組成物及び当該混合組成物からなる止血用製剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
すなわち、本発明は、FVIIa及びFXを単一容器内にて混合した溶液状止血用組成物にさらにAT−IIIを混合してなる安定化された溶液状止血用組成物、及び当該組成物を凍結乾燥して得られる止血用の治療用薬剤を提供するものである。本発明は、FVIIaとFXとの混合溶液状止血用組成物中に所要量のAT−IIIを加えることにより、産生されたFXaを特異的に阻害させることによって、遊離FXa量を制御するものである。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、安全性及び有効性に優れ、かつ安定性と利便性が向上した新規な止血用製剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】内因系凝固と外因系凝固に関する二つの経路の血液凝固カスケードを示す図である。
【0015】
【図2】FVIIa及びFXを混合してなる溶液状組成物に対し、所定のpH条件下におけるFXaの生成状況を示す図である。
【0016】
【図3】FVIIa及びFXを混合してなる溶液状組成物に対し、所定のpH条件下にAT−IIIを加えた場合の遊離FXaの生成状況を示す図である。
【0017】
【図4】FVIIa及びFXを混合してなる溶液状組成物に対し、異なる濃度のAT−IIIを加えた場合の遊離FXaの生成状況を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0018】
本発明に使用されるFVIIa、FX及びAT−IIIを製造する方法は特に限定されることはなく、例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組換え技術により作製する方法などによって製造することができる。
【0019】
血液由来のFVIIaの製法としては、例えば、特開平3−155797号公報、特開平10−059866号公報及び特開平10−059867号公報に示される方法がある。また、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗FVIIモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってFVIIを精製した後、他の血漿蛋白質、例えば活性化血液凝固第XII因子、FXaなどによりFVIIをFVIIaに活性化する方法がある。なお得られるFVIIaは、プロトロンビン、トロンビン、FIX及びFIXaを可能な限り伴なわない方が好ましい。
【0020】
血液由来のFXの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗FXモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってFXを精製する方法がある。前記と同様、得られるFXは、プロトロンビン、トロンビン、FIX及びFIXaを可能な限り伴なわない方が好ましい。
【0021】
血液由来のAT−IIIの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより粗精製後、沈殿分画により製する方法がある。
【0022】
AT−IIIを添加する際の濃度は0.1〜5.0国際単位/mLの範囲であることが好適であり、これより低濃度では十分なFXa阻害効果を得ることができず、遊離のFXa量は増加する。また、これより高濃度ではFXa阻害効果を得るという目的に対し過剰量過ぎる。その意味で添加量は通常0.2〜2.0国際単位/mL、好ましくは0.5〜1.0国際単位/mLが用いられ、その範囲ではFVIIa及びFX各々の成分の活性低下や遊離FXa量の増加は全く問題にならない。
【0023】
AT−IIIを添加する際の緩衝液のpHは、5.0を超える範囲、好ましくは5.0を超え、7.0未満の酸性領域、さらに好ましくは5.5以上、6.5以下の酸性領域であればよい。pH5.0以下の酸性領域では酵素であるFXaとその阻害剤であるATIIIの反応が起こらなくなり、FXa阻害効果を得ることができない。一方、pH7.0以上のpH領域でもATIIIによる一応のFXa阻害効果は得られるが、FXaの増加水準が高いため実用的ではない。
【0024】
本発明のAT−IIIを添加する溶液状組成物に使用される成分組成の、好適な含量は、FVIIa及びFXの濃度が各々1〜20μM、5〜400μMであり、さらに、好ましい態様として、0.001〜1重量%の非イオン性界面活性剤並びに0.01重量%以上のアルブミン、糖類及びアミノ酸からなる群から選ばれた1種または2種以上の化合物の共存により、組成物の保存安定性のみならず、当該液状組成物を凍結乾燥した場合はその再構成時の溶解を容易にする。
【0025】
当該組成物もしくは止血用製剤の投与対象は、様々な止血障害を有し出血傾向にある患者であれば特に限定されることはない。
【0026】
以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例1】
【0027】
AT−III不在下での遊離FXaの生成
FVIIa/FX混合物の緩衝溶液中の安定性を調べる目的で、所定のpHを有する各々の緩衝液(CaCl非存在下、クエン酸緩衝液:10mMクエン酸ナトリウム、120mM NaCl、0.5%グリシン、2%アルブミン、50ppmツイーン80)下に、FVIIa及びFXを終濃度0.6mg/mL(約12μM)及び6.0mg/mL(約100μM)になるよう混合し、室温で放置した。各放置時間後のサンプル中のFVIIa活性、FX活性及びFXa活性はそれぞれの因子が影響することのない系を用いて測定した。なお、ここで用いたFVIIaは、特開平3−155797号公報に記載の方法による血液由来の標品である。また、ここで用いたFXは、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗FXモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによって製された血液由来の標品であった。
【0028】
その結果、FVIIa及びFXの両活性ともに、緩衝溶液中どのpHにおいても18時間のインキュベーションにおいて90%以上の活性を保持していた。FXa含量は、特異的な合成基質(S2765)水解活性から算出し、FXとのモル比として図2に示した。その結果、図2に示すように高感度の測定系を用いてFXa量を定量することにより、pH6.0及びpH5.5の溶液中においても僅かではあるがFXa量の増加が認められた。
【実施例2】
【0029】
AT−III添加によるFXa阻害効果
FVIIa/FX混合物の緩衝溶液中の安定性を高める目的で、実施例1に示した各pHを有する各々の緩衝液下に、FVIIaおよびFXを終濃度0.6mg/mL及び6.0mg/mLになるよう混合し、さらにAT−IIIを終濃度1.0国際単位/mLになるよう添加し、室温で放置した。各放置時間後のサンプル中のFVIIa活性、FX活性及びFXa活性はそれぞれの因子が影響することのない系を用いて測定した。なお、ここで用いたFVIIa、FXは実施例1と同じく調製した。また、ここで用いたAT−IIIは、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより粗精製後、沈殿分画により製された血液由来の標品であった。
【0030】
その結果、FVIIa及びFXの両活性ともに、緩衝溶液中どのpHにおいても18時間のインキュベーションにおいて90%以上の活性を保持していた。すなわち、活性化された凝固因子であるFVIIaはAT−III 1.0国際単位/mL存在下においても何ら影響されなかった。FXa含量は、特異的な合成基質(S2765)水解活性から算出し、FXとのモル比として図3に示した。図3から明らかなように、AT−III非存在下では著しいFXa量の増加を示すpH6.5の溶液中において、AT−III存在下ではFXa量の増加が顕著に抑制された。さらに、AT−III非存在下では僅かながらもFXa量の増加を示すpH6.0及びpH5.5の溶液中において、AT−III存在下ではFXa量の増加は殆ど認められなかった。一方、pH5.0の緩衝液では、AT−IIIによる当該阻害効果は認められなかった(データは示していない)。
【実施例3】
【0031】
各種濃度のAT−III添加によるFXa阻害効果
FVIIa/FX混合物の緩衝溶液中の安定性を高めるために要するAT−IIIの濃度を調べる目的で、実施例1に示した緩衝液組成のpH5.7条件下に、FVIIaおよびFXを終濃度0.6mg/mL及び6.0mg/mLになるよう混合し、さらにAT−IIIを終濃度0、0.1、0.2、0.5、1.0国際単位/mLになるよう添加し、室温で放置した。各放置時間後のサンプル中のFVIIa活性、FX活性及びFXa活性については実施例1と同様の方法にて測定した。なお、ここで用いたFVIIa、FXは実施例1と同じく調製した。また、ここで用いたAT−IIIは、実施例2と同じく調製した。
【0032】
その結果、FVIIa及びFXの両活性ともに、緩衝溶液中どのAT−III濃度においても18時間のインキュベーションにおいて90%以上の活性を保持していた。FXa含量は、特異的な合成基質(S2765)水解活性から算出し、FXとのモル比として図4に示した。図4から明らかなように、用いたどの濃度のAT−III存在下においてもFXa量の増加は殆ど認められなかった。また、そのときのFXa量はAT−III濃度依存的に低下しており、その低下効果は0.5国際単位/mL以上ではほぼプラトーであった。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
分離精製した活性化血液凝固第VII因子(FVIIa)及び血液凝固第X因子(FX)を単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物に、さらにアンチトロンビンIII(AT−III)を加えたことを特徴とする、薬剤学的に安定な溶液状止血用組成物。
【請求項2】
含有されるFVIIa、FX及びAT−IIIの濃度が各々1〜20μM、5〜400μM及び0.1〜5.0国際単位/mLである、請求項1記載の溶液状止血用組成物。
【請求項3】
pHが5.0を超える範囲である、請求項1または2記載の溶液状止血用組成物。
【請求項4】
pHが5.0を超え、7.0未満の酸性領域にある、請求項3記載の溶液状止血用組成物。
【請求項5】
pHが5.5以上、6.5以下の酸性領域にある、請求項3記載の溶液状止血用組成物。
【請求項6】
請求項1〜5のいずれかに記載の溶液状止血用組成物を凍結乾燥してなる凍結乾燥止血用製剤。
【請求項7】
FVIIa及びFXを単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物にAT−IIIを加えることを特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定化方法。
【請求項8】
該組成物のpHが5.0を超える範囲である、請求項7記載の方法。
【請求項9】
該組成物のpHが5.0を超え、7.0未満の酸性領域にある、請求項8記載の方法。
【請求項10】
該組成物のpHが5.5以上、6.5以下の酸性領域にある、請求項8記載の方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【国際公開番号】WO2005/034990
【国際公開日】平成17年4月21日(2005.4.21)
【発行日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−514578(P2005−514578)
【国際出願番号】PCT/JP2004/014731
【国際出願日】平成16年10月6日(2004.10.6)
【出願人】(000173555)財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【Fターム(参考)】