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アンチトロンビンIII組成物の製造方法
説明

アンチトロンビンIII組成物の製造方法

本発明は、N−グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビンIII分子からなる組成物であって、N−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有するアンチトロンビンIII組成物の製造方法を提供する。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子組換えにより改変された宿主にアンチトロンビンIIIをコードするDNAを導入して得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にN−グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビンIII分子からなる組成物であって、N−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビンIII組成物を生成蓄積させ、該培養物から該アンチトロンビンIII組成物を採取することを特徴とする、アンチトロンビンIII組成物の製造方法。
【請求項2】
N−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位が結合していない糖鎖である、請求項1記載の製造方法。
【請求項3】
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素、またはN−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞である請求項1または2記載の製造方法。
【請求項4】
宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素、またはN−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた宿主細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項5】
細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素が、GDP−マンノース4,6−デヒドラターゼ(GMD)及びGDP−4−ケト−6−デオキシ−D−マンノース−3,5−エピメラーゼ(Fx)からなる群から選ばれる酵素である、請求項3または4に記載の製造方法。
【請求項6】
GDP−マンノース4,6−デヒドラターゼが、以下の(a)及び(b)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質である、請求項5に記載の製造方法。
(a)配列番号7で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号7で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDP−マンノース4,6−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項7】
GDP−マンノース4,6−デヒドラターゼが、以下の(a)、(b)及び(C)からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項5に記載の製造方法。
(a)配列番号8で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(b)配列番号8で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGDP−マンノース4,6−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質;
(e)配列番号8で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGDP−マンノース4,6−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項8】
GDP−4−ケト−6−デオキシ−D−マンノース−3,5−エピメラーゼが、以下の(a)及び(b)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質である、請求項5に記載の製造方法。
(a)配列番号9で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号9で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDP−4−ケト−6−デオキシ−D−マンノース−3,5−エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項9】
GDP−4−ケト−6−デオキシ−D−マンノース−3,5−エピメラーゼが、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項5に記載の製造方法。
(a)配列番号10で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(b)配列番号10で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGDP−4−ケト−6−デオキシ−D−マンノースー3,5−エピメラーゼ活性を有する蛋白質;
(c)配列番号10で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGDP−4−ケト−6−デオキシ−D−マンノース−3,5−エピメラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項10】
N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα1,6−フコシルトランスフェラーゼである請求項3または4に記載の製造方法。
【請求項11】
α1,6−フコシルトランスフェラーゼが、以下の(a)、(b)、(c)及び(d)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質である、請求項10に記載の製造方法。
(a)配列番号11で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号12で表される塩基配列からなるDNA;
(c)配列番号11で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(d)配列番号12で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項12】
α1,6−フコシルトランスフェラーゼが、以下の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)および(f)からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項10に記載の製造方法。
(a)配列番号13で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(b)配列番号14で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(c)配列番号13で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(d)配列番号14で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(e)配列番号13で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(f)配列番号14で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項13】
形質転換体がFERM BP−08472、FERM BP−10083、FERM BP−10084、FERM−10088またはFERM BP−10089である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項14】
宿主細胞が、下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)及び(j)からなる群から選ばれる細胞である請求項1〜12のいずれか1項に記載の製造方法。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)マウスミエローマ細胞株NS0細胞;
(d)マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞;
(e)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(f)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(g)胚性幹細胞;
(h)受精卵細胞;
(i)植物細胞;
(j)酵母。
【請求項15】
アンチトロンビンIII組成物が、N−グリコシド結合複合型糖鎖を有し、かつN−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項16】
N−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位が結合していない糖鎖である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項17】
アンチトロンビンIIIが、配列番号4に示されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドである、請求項1〜16のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項18】
アンチトロンビンIIIが、配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項19】
アンチトロンビンIIIが、配列番号4に示されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン結合活性を有するポリペプチドである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項20】
アンチトロンビンIIIが、以下の(a)または(b)から選ばれるDNAがコードするポリペプチドである、請求項1〜19のいずれか1項に記載の製造方法。
(a) 配列番号1で表される塩基配列からなるDNA;
(b) 配列番号1で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン結合活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項21】
アンチトロンビンIIIが、哺乳動物由来である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項22】
請求項1〜21のいずれか1項に記載の製造方法により得られる、アンチトロンビンIII組成物。
【請求項23】
請求項22記載のアンチトロンビンIII組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項24】
医薬が、血液凝固を伴う疾患に対する診断薬、予防薬又は治療薬である、請求項23に記載の医薬。

【国際公開番号】WO2005/035563
【国際公開日】平成17年4月21日(2005.4.21)
【発行日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−514674(P2005−514674)
【国際出願番号】PCT/JP2004/015324
【国際出願日】平成16年10月8日(2004.10.8)
【出願人】(000001029)協和醗酵工業株式会社 (276)
【Fターム(参考)】