アンモニウム吸収能が強化された形質転換イネ
【課題】 本発明は、窒素源の輸送体である窒素トランスポーターの改良によって、地球環境に配慮された高い生産性を有する作物、好ましくはイネを作出することを目的としている。
【解決手段】 本発明は、アンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換植物に関し、より詳細には、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物、及びその製造方法に関する。
【解決手段】 本発明は、アンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換植物に関し、より詳細には、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物、及びその製造方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換植物に関し、より詳細には、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球規模での人口の増加に伴い、食料の増産の必要性がいわれてきている。国連では国際コメ年などを設けて稲作などの作物の増産を推進してきている。作物の作付け面積の拡大と同時に、作物の品種改良や作物の生産性の向上が必要とされてきている。現代では、農業技術の発達によって作物生産性が急激に上昇してきており、その一端を担っているものに化学肥料の進歩があげられる。その反面，過剰な施肥が土壌環境・地球環境を悪化させてきたことは否定しがたい事実である。今日、人類総人口の爆発的増加、地球環境の悪化が深刻と指摘される状況下で、今後の育種日標として、環境汚染を伴わずに持続的かつ限られた農地で高い生産効率を維持した作物の生産が重要であるとされている。そのため現代の農業が目指すべき理想の姿は、低施肥条件下でも高い効率を維持した持続的な作物生産であると考えられることから、効率の良い栄養源の取り込み機能を有する作物の開発が重要な課題となっている。
【０００３】
植物の獲得した独立栄養性は、必要なすべてのアミノ酸や核酸などの含窒素有機化合物を自ら合成できることにある。アミノ酸は炭素を中心とするカルボキシル基と窒素を中心とするアミノ基より重要な骨格が形成される。光合成によって供給される炭素の初発物質である炭酸ガスは大気中に無尽蔵にあるのに対して、窒素は根よりの吸収が唯一無二の供給手段であり、窒素の供給は光合成機能の律速過程であるといえる。
これらのことから、植物における窒素の取り込み機構の解明は重要であり、最終的には植物における窒素源の取り込みが効率的に行える作物の開発が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】Suenaga, A., Moriya, K., Sonoda, Y., Ikeda, A., Von Wiren, N., Hayakawa, T.,Yamaguchi, J. and Yamaya, T. (2003) Constitutive expression of a novel-type ammonium transporter OsAMT2 in rice plants. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 206-211.
【非特許文献２】Sonoda, Y., Ikeda, A., Saiki, S., Von Wiren, N., Yamaya, T. and Yamaguchi J. (2003) Distinct expression and function of three ammonium transporter genes (OsAMT1;1-1;3) in rice. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 726-734.
【非特許文献３】Sonoda, Y., Ikeda, A., Saiki, S., Yamaya, T. and Yamaguchi, J. (2003) Feedback regulation of the ammonium transporter genefamily AMT1 by glutamine in rice. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 1396-1402.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
植物の窒素イオンの細胞内への取り込み・細胞間への移動には、膜貫通型タンパク質である窒素トランスポーターの”能動的な輸送システム”が必要とされる。水田に代表される湛水土壌では、アンモニウムイオンは主たる窒素源として存在し、その取り込みにはアンモニウムトランスポーター（Ammonium Transporter：ＡＭＴ）が機能している。そのために、本発明者らは、イネのＡＭＴに着目して研究を行ってきた（非特許文献１〜３参照）。イネは世界的に見ても主要作物として農業的に重要であり、基礎研究からより応用に実現しやすい生物種でもある。そのため、例えば、高い窒素取り込み能が付加されたイネを開発することにより、肥料の使用を減らして環境に配慮しつつ、高い生産効率を維持できる形質転換イネの作出が可能となる。
したがって、本発明は、窒素源の輸送体である窒素トランスポーターの改良によって、地球環境に配慮された高い生産性を有する作物、好ましくはイネを作出することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、イネのアンモニウムトランスポーター１（ＯｓＡＭＴ１）に着目して、イネなどの植物における窒素源の取り込み効率の改良を検討してきた。その結果、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）の存在により発現が誘発されるＡＭＴ遺伝子を植物に導入することにより、植物の窒素源の取り込みを大きく改善させることができることを見出した。
【０００７】
本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物、好ましくはイネのＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が導入された形質転換イネに関する。
また、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を、プロモーターの下流に結合させた遺伝子構築物を、植物細胞に導入することからなる植物のアンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換体を製造する方法に関する。
【０００８】
イネのゲノムには３種類のＯｓＡＭＴ１遺伝子（ＯｓＡＭＴ１；１、１：２、及び１；３）が存在していることが知られている。本発明者らは、まずこれらのＡＭＴの機能について検討した。
これらのＡＭＴ１の発現について、窒素飢餓条件（−Ｎ）、アンモニウムイオン存在条件（＋ＮＨ４＋）、及び硝酸イオン存在条件（＋ＮＯ３−）について検討した。これらの条件における、ＡＭＴ１の茎葉部および根における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＴＲ法により検討した。結果を図１に図面に代わる写真で示す。図１の上段から、ＯｓＡＭＴ１；１、ＯｓＡＭＴ１；２、ＯｓＡＭＴ１；３、及び陽性コントロールのアクチン（Actin）を示す。図１の左側は茎葉部（Shoot）についてであり、右側は根（Root）についてである。それぞれ左側から窒素飢餓条件（−Ｎ）、アンモニウムイオン存在条件（＋ＮＨ４＋）、及び硝酸イオン存在条件（＋ＮＯ３−）を示す。
この結果、ＯｓＡＭＴ１；１は茎葉部および根のいずれでも発現し、構成的な発現様式を示している（図１の上段）。これに対し、ＯｓＡＭＴ１；２は根で特異的に発現しており、アンモニウムイオン存在下で顕著な発現促進が認められる（図１の中段）。また、ＯｓＡＭＴ１；３も根で特異的な発現を示したが、窒素飢餓条件下で最も顕著な発現が認められる（図１下段）。
【０００９】
この様にイネには複数かつ発現制御の異なるＡＭＴ１群が存在し、外界のさまざまな窒素栄養環境に適応して窒素源を取り込んでいることがわかる。また、この中でＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の翻訳産物は根に特異的に発現し、かつ窒素充足条件下、即ちアンモニウムイオンが存在しているときに発現し、アンモニウムイオンの取り込みに機能している。このことから、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子を植物体全体で過剰に発現させることにより、土中に存在しているアンモニウムイオンを効率的に取り込むことができる形質転換体をえることが可能ではないかと考えられた。
そこで、本発明者らは、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子を植物体全体で過剰に発現させることができる形質転換体を実際に作出し、そのアンモニウムイオン吸収能が強化されるか否かを検討した。
【００１０】
カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターの下流にＯｓＡＭＴ１；２遺伝子を融合させたキメラ遺伝子をイネに導入した、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子過剰発現型形質転換イネを作成した。
ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が導入された形質転換体Ｆ１を作成し、これを自家受粉させて種子を得た。この種子には、Ｓ１〜Ｓ７までの７系統のものがあった。これら形質転換体系統の導入遺伝子のコピー数は，次世代種子の遺伝子型の分離から1コピーと推定される。このＯｓＡＭＴ１；２遺伝子過剰発現型形質転換イネ（以下、過剰発現型イネＳ１〜Ｓ７と略称する。）について、アンモニウムイオン吸収能に関するデータを収集した。
【００１１】
まず、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現を過剰発現型イネのＳ１系統を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の上段はＯｓＡＭＴ１；２遺伝子のブロットを示し、下段は陽性コントロールのアクチンを示す。図２のレーン１は野生型イネの葉での発現を示し、レーン２は過剰発現型イネＳ１の葉での発現を示し、レーン３は野生型イネの根での発現を示し、レーン４は過剰発現型イネＳ１の根での発現を示す。
図２の結果から，過剰発現型形質転換イネの葉では，本来葉では発現しないＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が発現しており，根においてはＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現が野生型イネと比較して約３−４倍増加していることがわかる（図２のレーン４参照）。このことから，実際にＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が過剰発現型イネＳ１において強く発現していることがわかった。
【００１２】
次に、これらのイネの栽培実験を行った。まず、温室における過剰発現型イネの検定に先立ち，人工気象器を用いた栽培実験を行った。
０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと過剰発現型イネＳ１とを３週間生育させた。その結果を図３に図面に代わる写真で示す。この結果、野生型イネと過剰発現型イネＳ１では表現型に顕著な差は認められず、アンモニウムイオンが希薄な状態では、過剰発現型イネＳ１も野生型イネと同様に生育できることがわかった。
これに対して、１．５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で同様に３週間栽培した。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の左側は野生型イネの場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ１の場合を示す。左端と右端は、それぞれの拡大写真である。この結果、野生型イネの葉は正常な生長を示したが、過剰発現型イネＳ１の葉は枯死することがわかった（図４右端参照）。この原因は、アンモニウムイオンの過剰な蓄積によるものと考えられた。そこでこれらの植物体について、葉におけるアンモニウム含量を測定した。結果を図５にグラフで示す。図５のグラフの左側は野生型の場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ１の場合を示す。図５のグラフの縦軸は地上部におけるアンモニウムイオンの含量（μモル／ｇＦＷ）を示す。その結果、過剰発現型イネＳ１の葉は、野生型イネと比較してアンモニウムイオンが約２倍蓄積していたことが明らかとなった（図５参照）。
【００１３】
アンモニウムイオンの含量の測定結果から、過剰発現型イネＳ１の葉にはアンモニウムイオンが過剰に蓄積していることが明らかとなった。このことから、過剰発現型イネＳ１はアンモニウムイオンの吸収量が増加したために、過剰のアンモニウムイオンが蓄積され、枯死したと考えられる。さらに、栽培期間中の水耕液中のアンモニウムイオンの量の変化を測定した。結果を図６のグラフで示す。図６の横軸は時間（時間）を示し、縦軸は水耕液中の全アンモニウムイオンの量（μｇ）を示す。この結果，過剰発現型イネＳ１では、野生型イネと比較して水耕液中のアンモニウム含量が速やかに減少していくことが明らかとなった。このことからも、過剰発現型イネＳ１においてはアンモニウムイオンの吸収量が増加していることが明らかとなった。
【００１４】
同様に、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源として、過剰発現型イネＳ５系統を３週間生育させた。結果を図７に図面に代わる写真で示す。図７の左側の２本は野生型の場合であり、右側の２本は過剰発現型イネＳ５の場合である。Ｓ５系統の場合には、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度においても根の生長が阻害され、その結果、葉が枯死してしまった。この結果もアンモニウムイオンの過剰な蓄積によるものと考えられる。
そこでアンモニウムイオンの過剰蓄積による影響を検討するために、野生型イネを用いて、種々の濃度の硫酸アンモニウムでの栽培実験を行った。その結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８の左側から２本づつ、０．１５ｍＭ、１．５ｍＭ、及び５ｍＭの硫酸アンモニウム濃度の場合をそれぞれ示す。この結果、野生型イネに高濃度のアンモニウム処理（１．５ｍＭおよび５ｍＭの硫酸アンモニウム処理）をした場合、根の生長阻害効果が観察された。この結果は、過剰発現型イネＳ５の場合と同様であり、過剰発現型イネＳ５においては、アンモニウムイオンの吸収能が極めて高められており、０．３ｍＭの硫酸アンモニウム濃度であっても、アンモニウムイオンが過剰となり、その結果、根の成長が阻害されたと考えられる。
これらの結果から、過剰発現型イネにおける根の生育阻害効果は、アンモニウムの過剰蓄積によるものと考えられた。また、形質転換体イネは、系統によりアンモニウムイオンの吸収能に大きな相違が見られることがわかった。
【００１５】
次に、温室における過剰発現型イネの栽培実験を行った。温室における過剰発現型イネの検定には、過剰発現型イネのＳ５系統を用いた。過剰発現型イネＳ５を７週間、１／５０００ａポットで、窒素源として１／５０００ａポット当たり約０．３９ｇ含まれているポットで栽培したところ、茎葉部に顕著な生育阻害が認められたこの結果を図９に図面に代わる写真で示す。図９の左側は野生型イネの場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ５の場合を示す。この実験に用いた過剰発現型イネＳ５は、温室において０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で３週間生育させた場合であっても、根の生長が阻害され、葉が枯死したものであり（図７参照）、野生型イネが正常に生育する程度のアンモニウムイオンが存在していても、アンモニウムイオンが過剰に吸収され、過剰蓄積を生起するものである。
【００１６】
次に、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の導入により、イネのアンモニウム同化能力に変化が生じたかどうかを検討するために、過剰発現型イネＳ５系統を用いて、以下の分子マーカーを用いた発現解析を行った。この実験で用いた分子マーカーは、主に根においてアンモニウム同化を担う酵素であるＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴと、主に地上部において光呼吸時に放出されるアンモニウムの再同化に働くＦｄ−ＧＯＧＡＴである。結果を図１０に図面に代わる写真で示す。図１０の最上段はＯｓＡＭＴ１；２の発現を示し、上から２段目はＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現を示し、上から３段目はＦｄ−ＧＯＧＡＴの発現をそれぞれ示す。最下段は陽性コントロールのアクチンを示す。図１０のレーン１は野生型イネの葉を示し、レーン２は過剰発現型イネＳ５の葉を示し、レーン３は野生型イネの根を示し、レーン４は過剰発現型イネＳ５の根を示す。この結果、図２で示したのと同様に、過剰発現型イネＳ５系統でも、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が植物体全体で過剰に発現していた（図１０のレーン２及び４参照）。またＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現が根において野生型イネと比較するとおよそ３〜４倍増加しており、葉においても発現がやや増加していた。これに対して、Ｆｄ−ＧＯＧＡＴの発現にはほとんど変化は認められなかった（図１０の上から３段目参照）。
【００１７】
以上の結果から、過剰発現型イネは、アンモニウム吸収能が増加して過剰にアンモニウムが取り込まれるために、ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現が上昇しアンモニウムの代謝もしくは解毒化を活発におこなっているものと考えられた。
このことは、アンモニウムイオンを取り込むトランスポーターのうち、アンモニウムイオンの存在下に発現するトランスポーターの遺伝子を植物に導入することにより、アンモニウムイオンの取り込み能力を飛躍的に増大させることが示されたことになる。
即ち、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物を提供するものである。
【００１８】
本発明における植物としては、窒素源としてアンモニウムイオンを取り込む植物であって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターを有するものであれば特に制限はないが、穀物植物などの作物となる植物が好ましい。穀物植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシなどが挙げられるが、好ましい穀物植物としては、イネが挙げられる。
本発明におけるアンモニウムイオンの存在下に発現するアンモニウムトランスポーターの遺伝子としては、野生型においてアンモニウムイオンの存在下に発現するアンモニウムトランスポーターの遺伝子であればよく、アンモニウムイオンの存在下、及び非存在下における発現の確認試験により本発明において使用できる遺伝子あるか否かを確認することができる。本発明のアンモニウムイオンの存在下に発現するアンモニウムトランスポーターの遺伝子は、形質転換される植物由来のものが好ましいが、これに限定されるものではない。好ましい本発明の遺伝子としては、例えば、イネの場合には、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が挙げられる。当該ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子はイネ由来のものであるから、イネに導入すのが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の形質転換植物は、植物全体の形態であってもよいが、種子や栽培可能なカルスや、場合によっては細胞の状態であってもよい。一般的には種子の形態が栽培可能な状態として好ましい。
【００２０】
また、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を、プロモーターの下流に結合させた遺伝子構築物を、植物細胞に導入することからなる植物のアンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換体を製造する方法を提供する。
本発明の方法におけるプロモーターとしては、形質転換された植物において発現可能なものであれば特に制限はないが、常時発現させることを望むばあいには、強力なプロモーターを選択することができるし、条件付きで発現を制御したい場合には、条件により作動するプロモーターを選択することもできる。本発明の方法において使用されるプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターや、形質転換される植物のゲノム由来の各種のプロモーターを使用することもできる。
遺伝子を導入する手法としては、公知の各種の方法を使用することができる。たとえば、カルスを形成させてエレクトロポーレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などによる方法、またプロトプラストを用いて、エレクトロポーレーション法やＰＥＧ法などにより遺伝子を導入することができる。
得られた形質転換体は、そのまま使用することもできるが、野生型または形質転換体同士を掛け合わせて第２世代の種子として使用するのが好ましい。
【００２１】
本発明の形質転換植物は、遺伝子を導入しただけでは、アンモニウムイオンの吸収能が強くなりすぎて、通常の栽培条件ではアンモニウム過剰となり枯死する場合もあるので、遺伝子導入後のスクリーニングの段階において、導入された遺伝子のコピー数を確認するなどの方法により、適度のアンモニウムイオンの吸収能を有するクローンを選別しておくことが好ましい。
アンモニウムイオンの取り込み活性は導入遺伝子の発現量とリンクしている。したがって，導入遺伝子が適度に発現した形質転換イネを選抜することにより，適度のアンモニウムイオンの吸収能を有する形質転換イネの選抜が可能である。
【発明の効果】
【００２２】
作物の生産性を向上させるために、多量の肥料を与える方法が行われているが、過剰の肥料は環境汚染の要因となり、最小限の肥料で最大の生産性を確保することが望まれている。本発明は、植物の窒素源となるアンモニウムイオンの吸収能を改善した新規な形質転換植物を提供するものである。本発明の形質転換植物は、遺伝子の可変により根からのアンモニウムイオンの吸収能が強化されているために、多量の肥料を必要とせず、作物の生産性を維持しつつ、環境汚染を防止することができるものである。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた野生型イネにおけるＯｓＡＭＴ１遺伝子群の発現解析
窒素源を含まない水耕液で３週間生育させた野生型イネを実験材料として用いた。実験区として、窒素源処理を施さない実験区（−Ｎ）、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウム処理を施した実験区(ＮＨ４＋）および０．３ｍＭの硝酸カリウム処理を施した実験区(ＮＯ３−）を設けた。それぞれの処理を２時間おこなった後，茎葉部および根より全ＲＮＡの抽出をおこない，得られた全ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡの合成をおこなった。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＯｓＡＭＴ１；１，ＯｓＡＭＴ１；２およびＯｓＡＭＴ１；３のそれぞれ特異的なプライマーを用いてＰＣＲをおこなった。また，イネアクチン遺伝子(RAc1; Mcelroy et al. 1990)を陽性コントロールとして用いた。これらのＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドによる染色により確認した。本実験で用いたプライマーを以下に示す。
ＯｓＡＭＴ１；１プライマー
5’-AAGAAGCTCGGCCTGCTCCGC-3’
5’-TGTGCAAAAGAAAATTAAACC-3’
ＯｓＡＭＴ１；２プライマー
5’-AACAAGCTGGGCTTGCTGCGC -3’
5’-ACTATCTTTTTCTTCCTATTA -3’
ＯｓＡＭＴ１；３プライマー
5’-GCACATCGTGCAGATCCTGG -3’
5’-CTGATACAAACAGGACACGTC -3’
Actinプライマー
5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA -3’
5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA -3’
結果を図１に示す。
【実施例２】
【００２５】
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１におけるＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現解析
野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１を、窒素源を含まない水耕液で１週間生育させた後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液に移し２週間生育させた。水耕液は２日に一度交換し、全期間を通して３０℃・連続明期条件・湿度６０％の人工気象器内で栽培した。実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲ法を用いて野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１におけるＯｓＡＭＴ１；２およびＡｃｔｉｎの発現解析をおこなった。本実験で用いたＯｓＡＭＴ１；２およびＡｃｔｉｎのプライマーは実施例１で用いたプライマーと同一である。
結果を図２に示す。
【実施例３】
【００２６】
０．３ ｍＭの硫酸アンモニウム処理を施した過剰発現型イネＳ１の人工気象器における生育試験
窒素を含まない水耕液で一週間生育させた後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液に移し２週間生育させた。水耕液は２日に一度交換し、全期間を通して３０℃・連続明期条件・湿度６０％の人工気象器内で栽培した。
結果を図３に示す。
【実施例４】
【００２７】
３ｍＭの硫酸アンモニウムでの過剰発現型イネＳ１の人工気象器における生育試験
水耕液の硫酸アンモニウムの濃度を３ｍＭとした以外は実施例３と同様にして、剰発現型イネＳ１の生育試験を行った。
結果を図４に示す。
【実施例５】
【００２８】
実施例４と同様にして栽培した野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１の茎葉部を１ｍＭＣａＣｌ２溶液中で洗浄した後、新鮮重を測定した。その後、氷上で冷却した乳鉢・乳棒を用いて０．４ｍｌの０．０１Ｎ ＨＣｌ中で磨砕した。磨砕液を１．５ｍｌ容遠心チューブに移し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を限外フィルターに移し、４，４００×ｇ，４℃で遠心し、ろ液をサンプルとして使用した。茎葉部に含まれるアンモニウムイオン濃度をアギレント（Agilent）キャピラリー電気泳動システム（G1600A, Agilent Technologeies, Tokyo）を用いて測定した。
結果を図５に示す。
【実施例６】
【００２９】
水耕液中のアンモニウムイオン濃度の変化の測定
実施例４と同様に野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１を栽培した。それらの植物体を、窒素を含まない水耕液に移し３日間の窒素飢餓処理をおこなった後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウム処理をおこなった。硫酸アンモニウム処理開始時間を０時間とし、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間後の水耕液をサンプルとした。実施例５と同様の方法を用いて，水耕液中に含まれるアンモニウムイオン濃度を測定した。
結果を図６に示す。
【実施例７】
【００３０】
０．３ｍＭの硫酸アンモニウムでの過剰発現型イネＳ５の人工気象器における生育試験
過剰発現型イネとしてＳ５系統を使用した以外は実施例３と同様にして、剰発現型イネＳ５の生育試験を行った。
結果を図７に示す。
【実施例８】
【００３１】
各種の濃度の硫酸アンモニウムでの野生型イネの人工気象器における生育試験
硫酸アンモニウムが０．３ｍＭ、３ｍＭ、及び１０ｍＭのそれぞれの濃度の水耕液を使用して、実施例３と同様にして野生型イネの生育試験を行った。
結果を図８に示す。
【実施例９】
【００３２】
０．３ｍＭの硫酸アンモニウムでの過剰発現型イネＳ５の温室における生育試験
野生型イネおよび過剰発現型イネＳ５を、窒素を含まない水耕液で一週間生育させた後、１／５０００ａポットに移植し、温室内で７週間栽培した。
結果を図９に示す。
【実施例１０】
【００３３】
過剰発現型イネＳ５のアンモニア同化能力の測定
実施例６と同様に野生型イネおよび過剰発現型イネＳ５を栽培した。それらの植物体を、窒素を含まない水耕液に移し３日間の窒素飢餓処理をおこなった後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウム処理を４時間おこなった。実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲ法を用いて野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１におけるＯｓＡＭＴ１；２、アンモニウム同化酵素をコードするＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴおよびＦｄ−ＧＯＧＡＴ、さらに陽性コントロールであるＡｃｔｉｎの発現解析をおこなった。本実験で用いたＯｓＡＭＴ１；２およびＡｃｔｉｎのプライマーは実施例１で用いたプライマーと同一である。また、本実験で用いたＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴおよびＦｄ−ＧＯＧＡＴのプライマーを以下に示す。
ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴプライマー
5’- CAGATTGCATTGGTACATCT-3’
5’- TACAAAACGGCATTTCACCA-3’
Ｆｄ−ＧＯＧＡＴプライマー
5’- TGCCACGATTTTGAGAGAAT-3’
5’- CAACAACCTGAGAAAACTAC-3’
結果を図１０に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、作物の生産性を維持しつつ、環境汚染を防止することができる新規な形質転換植物を提供するものであり、少量の窒素肥料又は窒素肥料なしで生育可能な植物であることから、産業上極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、イネの３種類のＯｓＡＭＴ１遺伝子の発現について、窒素飢餓条件（−Ｎ）、アンモニウムイオン存在条件（＋ＮＨ４＋）、及び硝酸イオン存在条件（＋ＮＯ３−）について検討した結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の過剰発現型イネのＳ１系統におけるＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現を検討した結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】図３は、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ１とを３週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ１とを３週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、野生型イネと本発明の過剰発現型イネＳ１における葉におけるアンモニウム含量を測定した結果を示すグラフである。図５のグラフの左側は野生型の場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ１の場合を示す。図５のグラフの縦軸は地上部におけるアンモニウムイオンの含量（μモル／ｇＦＷ）を示す。
【図６】図６は、野生型イネと本発明の過剰発現型イネＳ１における栽培期間中の水耕液中のアンモニウムイオンの量の変化を測定した結果を示すグラフである。図６の横軸は時間（時間）を示し、縦軸は水耕液中の全アンモニウムイオンの量（μｇ）を示す。
【図７】図７は、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ５とを３週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】図８は、野生型イネを用いて、種々の濃度の硫酸アンモニウムでの栽培実験を行った結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】図９は、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源として野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ５とを、温室で７週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、本発明の過剰発現型イネＳ５系統を用いて、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の導入により、イネのアンモニウム同化能力に変化が生じたかどうかを検討した結果を示す図面に代わる写真である。図１０の最上段はＯｓＡＭＴ１；２の発現を示し、上から２段目はＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現を示し、上から３段目はＦｄ−ＧＯＧＡＴの発現をそれぞれ示す。最下段は陽性コントロールのアクチンを示す。図１０のレーン１は野生型イネの葉を示し、レーン２は過剰発現型イネＳ５の葉を示し、レーン３は野生型イネの根を示し、レーン４は過剰発現型イネＳ５の根を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１；本発明の形質転換に使用したＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の塩基配列。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換植物に関し、より詳細には、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球規模での人口の増加に伴い、食料の増産の必要性がいわれてきている。国連では国際コメ年などを設けて稲作などの作物の増産を推進してきている。作物の作付け面積の拡大と同時に、作物の品種改良や作物の生産性の向上が必要とされてきている。現代では、農業技術の発達によって作物生産性が急激に上昇してきており、その一端を担っているものに化学肥料の進歩があげられる。その反面，過剰な施肥が土壌環境・地球環境を悪化させてきたことは否定しがたい事実である。今日、人類総人口の爆発的増加、地球環境の悪化が深刻と指摘される状況下で、今後の育種日標として、環境汚染を伴わずに持続的かつ限られた農地で高い生産効率を維持した作物の生産が重要であるとされている。そのため現代の農業が目指すべき理想の姿は、低施肥条件下でも高い効率を維持した持続的な作物生産であると考えられることから、効率の良い栄養源の取り込み機能を有する作物の開発が重要な課題となっている。
【０００３】
植物の獲得した独立栄養性は、必要なすべてのアミノ酸や核酸などの含窒素有機化合物を自ら合成できることにある。アミノ酸は炭素を中心とするカルボキシル基と窒素を中心とするアミノ基より重要な骨格が形成される。光合成によって供給される炭素の初発物質である炭酸ガスは大気中に無尽蔵にあるのに対して、窒素は根よりの吸収が唯一無二の供給手段であり、窒素の供給は光合成機能の律速過程であるといえる。
これらのことから、植物における窒素の取り込み機構の解明は重要であり、最終的には植物における窒素源の取り込みが効率的に行える作物の開発が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】Suenaga, A., Moriya, K., Sonoda, Y., Ikeda, A., Von Wiren, N., Hayakawa, T.,Yamaguchi, J. and Yamaya, T. (2003) Constitutive expression of a novel-type ammonium transporter OsAMT2 in rice plants. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 206-211.
【非特許文献２】Sonoda, Y., Ikeda, A., Saiki, S., Von Wiren, N., Yamaya, T. and Yamaguchi J. (2003) Distinct expression and function of three ammonium transporter genes (OsAMT1;1-1;3) in rice. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 726-734.
【非特許文献３】Sonoda, Y., Ikeda, A., Saiki, S., Yamaya, T. and Yamaguchi, J. (2003) Feedback regulation of the ammonium transporter genefamily AMT1 by glutamine in rice. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 1396-1402.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
植物の窒素イオンの細胞内への取り込み・細胞間への移動には、膜貫通型タンパク質である窒素トランスポーターの”能動的な輸送システム”が必要とされる。水田に代表される湛水土壌では、アンモニウムイオンは主たる窒素源として存在し、その取り込みにはアンモニウムトランスポーター（Ammonium Transporter：ＡＭＴ）が機能している。そのために、本発明者らは、イネのＡＭＴに着目して研究を行ってきた（非特許文献１〜３参照）。イネは世界的に見ても主要作物として農業的に重要であり、基礎研究からより応用に実現しやすい生物種でもある。そのため、例えば、高い窒素取り込み能が付加されたイネを開発することにより、肥料の使用を減らして環境に配慮しつつ、高い生産効率を維持できる形質転換イネの作出が可能となる。
したがって、本発明は、窒素源の輸送体である窒素トランスポーターの改良によって、地球環境に配慮された高い生産性を有する作物、好ましくはイネを作出することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、イネのアンモニウムトランスポーター１（ＯｓＡＭＴ１）に着目して、イネなどの植物における窒素源の取り込み効率の改良を検討してきた。その結果、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）の存在により発現が誘発されるＡＭＴ遺伝子を植物に導入することにより、植物の窒素源の取り込みを大きく改善させることができることを見出した。
【０００７】
本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物、好ましくはイネのＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が導入された形質転換イネに関する。
また、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を、プロモーターの下流に結合させた遺伝子構築物を、植物細胞に導入することからなる植物のアンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換体を製造する方法に関する。
【０００８】
イネのゲノムには３種類のＯｓＡＭＴ１遺伝子（ＯｓＡＭＴ１；１、１：２、及び１；３）が存在していることが知られている。本発明者らは、まずこれらのＡＭＴの機能について検討した。
これらのＡＭＴ１の発現について、窒素飢餓条件（−Ｎ）、アンモニウムイオン存在条件（＋ＮＨ４＋）、及び硝酸イオン存在条件（＋ＮＯ３−）について検討した。これらの条件における、ＡＭＴ１の茎葉部および根における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＴＲ法により検討した。結果を図１に図面に代わる写真で示す。図１の上段から、ＯｓＡＭＴ１；１、ＯｓＡＭＴ１；２、ＯｓＡＭＴ１；３、及び陽性コントロールのアクチン（Actin）を示す。図１の左側は茎葉部（Shoot）についてであり、右側は根（Root）についてである。それぞれ左側から窒素飢餓条件（−Ｎ）、アンモニウムイオン存在条件（＋ＮＨ４＋）、及び硝酸イオン存在条件（＋ＮＯ３−）を示す。
この結果、ＯｓＡＭＴ１；１は茎葉部および根のいずれでも発現し、構成的な発現様式を示している（図１の上段）。これに対し、ＯｓＡＭＴ１；２は根で特異的に発現しており、アンモニウムイオン存在下で顕著な発現促進が認められる（図１の中段）。また、ＯｓＡＭＴ１；３も根で特異的な発現を示したが、窒素飢餓条件下で最も顕著な発現が認められる（図１下段）。
【０００９】
この様にイネには複数かつ発現制御の異なるＡＭＴ１群が存在し、外界のさまざまな窒素栄養環境に適応して窒素源を取り込んでいることがわかる。また、この中でＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の翻訳産物は根に特異的に発現し、かつ窒素充足条件下、即ちアンモニウムイオンが存在しているときに発現し、アンモニウムイオンの取り込みに機能している。このことから、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子を植物体全体で過剰に発現させることにより、土中に存在しているアンモニウムイオンを効率的に取り込むことができる形質転換体をえることが可能ではないかと考えられた。
そこで、本発明者らは、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子を植物体全体で過剰に発現させることができる形質転換体を実際に作出し、そのアンモニウムイオン吸収能が強化されるか否かを検討した。
【００１０】
カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターの下流にＯｓＡＭＴ１；２遺伝子を融合させたキメラ遺伝子をイネに導入した、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子過剰発現型形質転換イネを作成した。
ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が導入された形質転換体Ｆ１を作成し、これを自家受粉させて種子を得た。この種子には、Ｓ１〜Ｓ７までの７系統のものがあった。これら形質転換体系統の導入遺伝子のコピー数は，次世代種子の遺伝子型の分離から1コピーと推定される。このＯｓＡＭＴ１；２遺伝子過剰発現型形質転換イネ（以下、過剰発現型イネＳ１〜Ｓ７と略称する。）について、アンモニウムイオン吸収能に関するデータを収集した。
【００１１】
まず、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現を過剰発現型イネのＳ１系統を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の上段はＯｓＡＭＴ１；２遺伝子のブロットを示し、下段は陽性コントロールのアクチンを示す。図２のレーン１は野生型イネの葉での発現を示し、レーン２は過剰発現型イネＳ１の葉での発現を示し、レーン３は野生型イネの根での発現を示し、レーン４は過剰発現型イネＳ１の根での発現を示す。
図２の結果から，過剰発現型形質転換イネの葉では，本来葉では発現しないＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が発現しており，根においてはＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現が野生型イネと比較して約３−４倍増加していることがわかる（図２のレーン４参照）。このことから，実際にＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が過剰発現型イネＳ１において強く発現していることがわかった。
【００１２】
次に、これらのイネの栽培実験を行った。まず、温室における過剰発現型イネの検定に先立ち，人工気象器を用いた栽培実験を行った。
０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと過剰発現型イネＳ１とを３週間生育させた。その結果を図３に図面に代わる写真で示す。この結果、野生型イネと過剰発現型イネＳ１では表現型に顕著な差は認められず、アンモニウムイオンが希薄な状態では、過剰発現型イネＳ１も野生型イネと同様に生育できることがわかった。
これに対して、１．５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で同様に３週間栽培した。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の左側は野生型イネの場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ１の場合を示す。左端と右端は、それぞれの拡大写真である。この結果、野生型イネの葉は正常な生長を示したが、過剰発現型イネＳ１の葉は枯死することがわかった（図４右端参照）。この原因は、アンモニウムイオンの過剰な蓄積によるものと考えられた。そこでこれらの植物体について、葉におけるアンモニウム含量を測定した。結果を図５にグラフで示す。図５のグラフの左側は野生型の場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ１の場合を示す。図５のグラフの縦軸は地上部におけるアンモニウムイオンの含量（μモル／ｇＦＷ）を示す。その結果、過剰発現型イネＳ１の葉は、野生型イネと比較してアンモニウムイオンが約２倍蓄積していたことが明らかとなった（図５参照）。
【００１３】
アンモニウムイオンの含量の測定結果から、過剰発現型イネＳ１の葉にはアンモニウムイオンが過剰に蓄積していることが明らかとなった。このことから、過剰発現型イネＳ１はアンモニウムイオンの吸収量が増加したために、過剰のアンモニウムイオンが蓄積され、枯死したと考えられる。さらに、栽培期間中の水耕液中のアンモニウムイオンの量の変化を測定した。結果を図６のグラフで示す。図６の横軸は時間（時間）を示し、縦軸は水耕液中の全アンモニウムイオンの量（μｇ）を示す。この結果，過剰発現型イネＳ１では、野生型イネと比較して水耕液中のアンモニウム含量が速やかに減少していくことが明らかとなった。このことからも、過剰発現型イネＳ１においてはアンモニウムイオンの吸収量が増加していることが明らかとなった。
【００１４】
同様に、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源として、過剰発現型イネＳ５系統を３週間生育させた。結果を図７に図面に代わる写真で示す。図７の左側の２本は野生型の場合であり、右側の２本は過剰発現型イネＳ５の場合である。Ｓ５系統の場合には、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度においても根の生長が阻害され、その結果、葉が枯死してしまった。この結果もアンモニウムイオンの過剰な蓄積によるものと考えられる。
そこでアンモニウムイオンの過剰蓄積による影響を検討するために、野生型イネを用いて、種々の濃度の硫酸アンモニウムでの栽培実験を行った。その結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８の左側から２本づつ、０．１５ｍＭ、１．５ｍＭ、及び５ｍＭの硫酸アンモニウム濃度の場合をそれぞれ示す。この結果、野生型イネに高濃度のアンモニウム処理（１．５ｍＭおよび５ｍＭの硫酸アンモニウム処理）をした場合、根の生長阻害効果が観察された。この結果は、過剰発現型イネＳ５の場合と同様であり、過剰発現型イネＳ５においては、アンモニウムイオンの吸収能が極めて高められており、０．３ｍＭの硫酸アンモニウム濃度であっても、アンモニウムイオンが過剰となり、その結果、根の成長が阻害されたと考えられる。
これらの結果から、過剰発現型イネにおける根の生育阻害効果は、アンモニウムの過剰蓄積によるものと考えられた。また、形質転換体イネは、系統によりアンモニウムイオンの吸収能に大きな相違が見られることがわかった。
【００１５】
次に、温室における過剰発現型イネの栽培実験を行った。温室における過剰発現型イネの検定には、過剰発現型イネのＳ５系統を用いた。過剰発現型イネＳ５を７週間、１／５０００ａポットで、窒素源として１／５０００ａポット当たり約０．３９ｇ含まれているポットで栽培したところ、茎葉部に顕著な生育阻害が認められたこの結果を図９に図面に代わる写真で示す。図９の左側は野生型イネの場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ５の場合を示す。この実験に用いた過剰発現型イネＳ５は、温室において０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で３週間生育させた場合であっても、根の生長が阻害され、葉が枯死したものであり（図７参照）、野生型イネが正常に生育する程度のアンモニウムイオンが存在していても、アンモニウムイオンが過剰に吸収され、過剰蓄積を生起するものである。
【００１６】
次に、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の導入により、イネのアンモニウム同化能力に変化が生じたかどうかを検討するために、過剰発現型イネＳ５系統を用いて、以下の分子マーカーを用いた発現解析を行った。この実験で用いた分子マーカーは、主に根においてアンモニウム同化を担う酵素であるＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴと、主に地上部において光呼吸時に放出されるアンモニウムの再同化に働くＦｄ−ＧＯＧＡＴである。結果を図１０に図面に代わる写真で示す。図１０の最上段はＯｓＡＭＴ１；２の発現を示し、上から２段目はＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現を示し、上から３段目はＦｄ−ＧＯＧＡＴの発現をそれぞれ示す。最下段は陽性コントロールのアクチンを示す。図１０のレーン１は野生型イネの葉を示し、レーン２は過剰発現型イネＳ５の葉を示し、レーン３は野生型イネの根を示し、レーン４は過剰発現型イネＳ５の根を示す。この結果、図２で示したのと同様に、過剰発現型イネＳ５系統でも、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が植物体全体で過剰に発現していた（図１０のレーン２及び４参照）。またＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現が根において野生型イネと比較するとおよそ３〜４倍増加しており、葉においても発現がやや増加していた。これに対して、Ｆｄ−ＧＯＧＡＴの発現にはほとんど変化は認められなかった（図１０の上から３段目参照）。
【００１７】
以上の結果から、過剰発現型イネは、アンモニウム吸収能が増加して過剰にアンモニウムが取り込まれるために、ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現が上昇しアンモニウムの代謝もしくは解毒化を活発におこなっているものと考えられた。
このことは、アンモニウムイオンを取り込むトランスポーターのうち、アンモニウムイオンの存在下に発現するトランスポーターの遺伝子を植物に導入することにより、アンモニウムイオンの取り込み能力を飛躍的に増大させることが示されたことになる。
即ち、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物を提供するものである。
【００１８】
本発明における植物としては、窒素源としてアンモニウムイオンを取り込む植物であって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターを有するものであれば特に制限はないが、穀物植物などの作物となる植物が好ましい。穀物植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシなどが挙げられるが、好ましい穀物植物としては、イネが挙げられる。
本発明におけるアンモニウムイオンの存在下に発現するアンモニウムトランスポーターの遺伝子としては、野生型においてアンモニウムイオンの存在下に発現するアンモニウムトランスポーターの遺伝子であればよく、アンモニウムイオンの存在下、及び非存在下における発現の確認試験により本発明において使用できる遺伝子あるか否かを確認することができる。本発明のアンモニウムイオンの存在下に発現するアンモニウムトランスポーターの遺伝子は、形質転換される植物由来のものが好ましいが、これに限定されるものではない。好ましい本発明の遺伝子としては、例えば、イネの場合には、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子が挙げられる。当該ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子はイネ由来のものであるから、イネに導入すのが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の形質転換植物は、植物全体の形態であってもよいが、種子や栽培可能なカルスや、場合によっては細胞の状態であってもよい。一般的には種子の形態が栽培可能な状態として好ましい。
【００２０】
また、本発明は、植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を、プロモーターの下流に結合させた遺伝子構築物を、植物細胞に導入することからなる植物のアンモニウムイオンの吸収能が改善された形質転換体を製造する方法を提供する。
本発明の方法におけるプロモーターとしては、形質転換された植物において発現可能なものであれば特に制限はないが、常時発現させることを望むばあいには、強力なプロモーターを選択することができるし、条件付きで発現を制御したい場合には、条件により作動するプロモーターを選択することもできる。本発明の方法において使用されるプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターや、形質転換される植物のゲノム由来の各種のプロモーターを使用することもできる。
遺伝子を導入する手法としては、公知の各種の方法を使用することができる。たとえば、カルスを形成させてエレクトロポーレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などによる方法、またプロトプラストを用いて、エレクトロポーレーション法やＰＥＧ法などにより遺伝子を導入することができる。
得られた形質転換体は、そのまま使用することもできるが、野生型または形質転換体同士を掛け合わせて第２世代の種子として使用するのが好ましい。
【００２１】
本発明の形質転換植物は、遺伝子を導入しただけでは、アンモニウムイオンの吸収能が強くなりすぎて、通常の栽培条件ではアンモニウム過剰となり枯死する場合もあるので、遺伝子導入後のスクリーニングの段階において、導入された遺伝子のコピー数を確認するなどの方法により、適度のアンモニウムイオンの吸収能を有するクローンを選別しておくことが好ましい。
アンモニウムイオンの取り込み活性は導入遺伝子の発現量とリンクしている。したがって，導入遺伝子が適度に発現した形質転換イネを選抜することにより，適度のアンモニウムイオンの吸収能を有する形質転換イネの選抜が可能である。
【発明の効果】
【００２２】
作物の生産性を向上させるために、多量の肥料を与える方法が行われているが、過剰の肥料は環境汚染の要因となり、最小限の肥料で最大の生産性を確保することが望まれている。本発明は、植物の窒素源となるアンモニウムイオンの吸収能を改善した新規な形質転換植物を提供するものである。本発明の形質転換植物は、遺伝子の可変により根からのアンモニウムイオンの吸収能が強化されているために、多量の肥料を必要とせず、作物の生産性を維持しつつ、環境汚染を防止することができるものである。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた野生型イネにおけるＯｓＡＭＴ１遺伝子群の発現解析
窒素源を含まない水耕液で３週間生育させた野生型イネを実験材料として用いた。実験区として、窒素源処理を施さない実験区（−Ｎ）、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウム処理を施した実験区(ＮＨ４＋）および０．３ｍＭの硝酸カリウム処理を施した実験区(ＮＯ３−）を設けた。それぞれの処理を２時間おこなった後，茎葉部および根より全ＲＮＡの抽出をおこない，得られた全ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡの合成をおこなった。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＯｓＡＭＴ１；１，ＯｓＡＭＴ１；２およびＯｓＡＭＴ１；３のそれぞれ特異的なプライマーを用いてＰＣＲをおこなった。また，イネアクチン遺伝子(RAc1; Mcelroy et al. 1990)を陽性コントロールとして用いた。これらのＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドによる染色により確認した。本実験で用いたプライマーを以下に示す。
ＯｓＡＭＴ１；１プライマー
5’-AAGAAGCTCGGCCTGCTCCGC-3’
5’-TGTGCAAAAGAAAATTAAACC-3’
ＯｓＡＭＴ１；２プライマー
5’-AACAAGCTGGGCTTGCTGCGC -3’
5’-ACTATCTTTTTCTTCCTATTA -3’
ＯｓＡＭＴ１；３プライマー
5’-GCACATCGTGCAGATCCTGG -3’
5’-CTGATACAAACAGGACACGTC -3’
Actinプライマー
5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA -3’
5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA -3’
結果を図１に示す。
【実施例２】
【００２５】
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１におけるＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現解析
野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１を、窒素源を含まない水耕液で１週間生育させた後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液に移し２週間生育させた。水耕液は２日に一度交換し、全期間を通して３０℃・連続明期条件・湿度６０％の人工気象器内で栽培した。実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲ法を用いて野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１におけるＯｓＡＭＴ１；２およびＡｃｔｉｎの発現解析をおこなった。本実験で用いたＯｓＡＭＴ１；２およびＡｃｔｉｎのプライマーは実施例１で用いたプライマーと同一である。
結果を図２に示す。
【実施例３】
【００２６】
０．３ ｍＭの硫酸アンモニウム処理を施した過剰発現型イネＳ１の人工気象器における生育試験
窒素を含まない水耕液で一週間生育させた後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液に移し２週間生育させた。水耕液は２日に一度交換し、全期間を通して３０℃・連続明期条件・湿度６０％の人工気象器内で栽培した。
結果を図３に示す。
【実施例４】
【００２７】
３ｍＭの硫酸アンモニウムでの過剰発現型イネＳ１の人工気象器における生育試験
水耕液の硫酸アンモニウムの濃度を３ｍＭとした以外は実施例３と同様にして、剰発現型イネＳ１の生育試験を行った。
結果を図４に示す。
【実施例５】
【００２８】
実施例４と同様にして栽培した野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１の茎葉部を１ｍＭＣａＣｌ２溶液中で洗浄した後、新鮮重を測定した。その後、氷上で冷却した乳鉢・乳棒を用いて０．４ｍｌの０．０１Ｎ ＨＣｌ中で磨砕した。磨砕液を１．５ｍｌ容遠心チューブに移し、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を限外フィルターに移し、４，４００×ｇ，４℃で遠心し、ろ液をサンプルとして使用した。茎葉部に含まれるアンモニウムイオン濃度をアギレント（Agilent）キャピラリー電気泳動システム（G1600A, Agilent Technologeies, Tokyo）を用いて測定した。
結果を図５に示す。
【実施例６】
【００２９】
水耕液中のアンモニウムイオン濃度の変化の測定
実施例４と同様に野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１を栽培した。それらの植物体を、窒素を含まない水耕液に移し３日間の窒素飢餓処理をおこなった後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウム処理をおこなった。硫酸アンモニウム処理開始時間を０時間とし、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間後の水耕液をサンプルとした。実施例５と同様の方法を用いて，水耕液中に含まれるアンモニウムイオン濃度を測定した。
結果を図６に示す。
【実施例７】
【００３０】
０．３ｍＭの硫酸アンモニウムでの過剰発現型イネＳ５の人工気象器における生育試験
過剰発現型イネとしてＳ５系統を使用した以外は実施例３と同様にして、剰発現型イネＳ５の生育試験を行った。
結果を図７に示す。
【実施例８】
【００３１】
各種の濃度の硫酸アンモニウムでの野生型イネの人工気象器における生育試験
硫酸アンモニウムが０．３ｍＭ、３ｍＭ、及び１０ｍＭのそれぞれの濃度の水耕液を使用して、実施例３と同様にして野生型イネの生育試験を行った。
結果を図８に示す。
【実施例９】
【００３２】
０．３ｍＭの硫酸アンモニウムでの過剰発現型イネＳ５の温室における生育試験
野生型イネおよび過剰発現型イネＳ５を、窒素を含まない水耕液で一週間生育させた後、１／５０００ａポットに移植し、温室内で７週間栽培した。
結果を図９に示す。
【実施例１０】
【００３３】
過剰発現型イネＳ５のアンモニア同化能力の測定
実施例６と同様に野生型イネおよび過剰発現型イネＳ５を栽培した。それらの植物体を、窒素を含まない水耕液に移し３日間の窒素飢餓処理をおこなった後、０．１５ｍＭの硫酸アンモニウム処理を４時間おこなった。実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲ法を用いて野生型イネおよび過剰発現型イネＳ１におけるＯｓＡＭＴ１；２、アンモニウム同化酵素をコードするＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴおよびＦｄ−ＧＯＧＡＴ、さらに陽性コントロールであるＡｃｔｉｎの発現解析をおこなった。本実験で用いたＯｓＡＭＴ１；２およびＡｃｔｉｎのプライマーは実施例１で用いたプライマーと同一である。また、本実験で用いたＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴおよびＦｄ−ＧＯＧＡＴのプライマーを以下に示す。
ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴプライマー
5’- CAGATTGCATTGGTACATCT-3’
5’- TACAAAACGGCATTTCACCA-3’
Ｆｄ−ＧＯＧＡＴプライマー
5’- TGCCACGATTTTGAGAGAAT-3’
5’- CAACAACCTGAGAAAACTAC-3’
結果を図１０に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、作物の生産性を維持しつつ、環境汚染を防止することができる新規な形質転換植物を提供するものであり、少量の窒素肥料又は窒素肥料なしで生育可能な植物であることから、産業上極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、イネの３種類のＯｓＡＭＴ１遺伝子の発現について、窒素飢餓条件（−Ｎ）、アンモニウムイオン存在条件（＋ＮＨ４＋）、及び硝酸イオン存在条件（＋ＮＯ３−）について検討した結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の過剰発現型イネのＳ１系統におけるＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の発現を検討した結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】図３は、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ１とを３週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ１とを３週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、野生型イネと本発明の過剰発現型イネＳ１における葉におけるアンモニウム含量を測定した結果を示すグラフである。図５のグラフの左側は野生型の場合を示し、右側は過剰発現型イネＳ１の場合を示す。図５のグラフの縦軸は地上部におけるアンモニウムイオンの含量（μモル／ｇＦＷ）を示す。
【図６】図６は、野生型イネと本発明の過剰発現型イネＳ１における栽培期間中の水耕液中のアンモニウムイオンの量の変化を測定した結果を示すグラフである。図６の横軸は時間（時間）を示し、縦軸は水耕液中の全アンモニウムイオンの量（μｇ）を示す。
【図７】図７は、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液で野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ５とを３週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】図８は、野生型イネを用いて、種々の濃度の硫酸アンモニウムでの栽培実験を行った結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】図９は、０．３ｍＭの硫酸アンモニウムを単一窒素源として野生型イネと、本発明の過剰発現型イネＳ５とを、温室で７週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、本発明の過剰発現型イネＳ５系統を用いて、ＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の導入により、イネのアンモニウム同化能力に変化が生じたかどうかを検討した結果を示す図面に代わる写真である。図１０の最上段はＯｓＡＭＴ１；２の発現を示し、上から２段目はＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴの発現を示し、上から３段目はＦｄ−ＧＯＧＡＴの発現をそれぞれ示す。最下段は陽性コントロールのアクチンを示す。図１０のレーン１は野生型イネの葉を示し、レーン２は過剰発現型イネＳ５の葉を示し、レーン３は野生型イネの根を示し、レーン４は過剰発現型イネＳ５の根を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１；本発明の形質転換に使用したＯｓＡＭＴ１；２遺伝子の塩基配列。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物。
【請求項２】
アンモニウムトランスポーターの遺伝子が、遺伝子を導入される植物と同種の植物に由来するものである請求項１に記載の植物。
【請求項３】
アンモニウムトランスポーターの遺伝子が、イネのＯｓＡＭＴ１；２遺伝子である請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
遺伝子が導入される植物が、イネである請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項５】
植物が、種子である請求項１〜４のいずれかに記載の植物。
【請求項１】
植物のアンモニウムトランスポーターであって、アンモニウムイオンの存在条件により発現が誘発されるアンモニウムトランスポーターの遺伝子を導入して形質転換された植物。
【請求項２】
アンモニウムトランスポーターの遺伝子が、遺伝子を導入される植物と同種の植物に由来するものである請求項１に記載の植物。
【請求項３】
アンモニウムトランスポーターの遺伝子が、イネのＯｓＡＭＴ１；２遺伝子である請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
遺伝子が導入される植物が、イネである請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項５】
植物が、種子である請求項１〜４のいずれかに記載の植物。
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−２０６０５（Ｐ２００６−２０６０５Ａ）
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２０３８２３（Ｐ２００４−２０３８２３）
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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