アーモンド抽出物を含む抗糖化剤
【課題】飲食品または医薬品として安全性が高い抗糖化剤を提供すること。
【解決手段】本発明は、アーモンド抽出物を含む抗糖化剤を提供する。本発明の抗糖化剤は、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防および治療に用いられ得る。
【解決手段】本発明は、アーモンド抽出物を含む抗糖化剤を提供する。本発明の抗糖化剤は、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防および治療に用いられ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アーモンド抽出物を含む抗糖化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Advanced Glycation End-product；ＡＧＥ）は、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応から始まる一連の反応（メイラード反応）により生じる不可逆的な高分子架橋物質である。これらの反応は、生体内で長期間にわたりゆっくり進行する。例えば、糖尿病の臨床検査項目の１つとして挙げられているヘモグロビンＡ１Ｃ（HbA1c）は、赤血球のタンパク質であるヘモグロビンの糖化物であり、ＡＧＥｓの１種である。
【０００３】
ＡＧＥは、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病による合併症の原因物質である。また、ＡＧＥは、血管内皮細胞に存在する特異的な受容体（ＲＡＧＥ）に結合して糖尿病性血管症の発症に関連することも知られている。現在、わが国において、糖尿病の潜在患者数が１６３０万人にのぼり、特に中高年の４．５人に１人が糖尿病予備軍であるとの報告を考慮すると、体内のＡＧＥを除去することは、今後の糖尿病合併症の発症・進行を予防する上で非常に重要である。さらに、ＡＧＥは、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどの種々の衰弱性疾患の発症にも関与している。
【０００４】
ＡＧＥは、グルコースだけではなく、グルコースの自動酸化および分解産物などの種々の糖から生成される。このうち、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥは、ＡＧＥレセプター（ＲＡＧＥ）との結合能力が高く、このＲＡＧＥを介して、糖尿病性網膜症もしくは糖尿病性腎症のような糖尿病血管合併症の発症および進展に強く関与していることが知られている（非特許文献１および２）。このように、糖尿病の予防および治療を目的として、ＡＧＥ、特に、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）はその役割が注目されており、研究が続けられている。
【０００５】
一方で、ＡＧＥは、食品中にも存在する。そもそも、ＡＧＥは、食品化学の研究において発表された非酵素的糖化反応（メイラード反応）による褐変において注目された物質である。ＡＧＥは、煮る・蒸すなどの調理方法ではほとんど含まれず、逆に焼く・炒める・揚げるなどの調理方法では多く含まれることが分かっている。また、ＡＧＥは、コーラ、味噌、および醤油のような食材に多く含まれていることも知られている。このように、人間は、生活上、常に多量のＡＧＥを食品（特に加工食品）から摂取している。食材としてＡＧＥを取り込むことに関してはほとんど害がないと考えられているが、腎臓を悪くしている場合は注意が必要であり、また無害の食品性ＡＧＥが体内に吸収された後、有害性のＡＧＥ（例えばＡＧＥ−２）に転換される可能性がある。
【０００６】
このようにＡＧＥは生体内でも生成され、また生体外からも摂取される。このため、生体内での過剰なＡＧＥの蓄積を抑制するために、種々の薬剤が提案されている。例えば、ＡＧＥ生成抑制剤として、従来からアミノグアニジン、ピリドキサミン誘導体などが知られている。さらに特許文献１には、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンが開示されている。
【０００７】
確立されたＡＧＥ架橋を破壊する物質も検討されており、例えば、Ｎ−臭化フェナシルチアゾリウム（ＰＴＢ）などが知られている。最近では、１，４−ベンゼン−ｂｉｓ［４−メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］などの７種の化合物が報告されている（例えば、特許文献２）。しかし、これらのＡＧＥ分解効果は、必ずしも十分とはいえない。
【０００８】
近年の研究では、ビタミンＢ６が、ＡＧＥ阻害作用を有することが見出され、そのＡＧＥ阻害剤としての利用が期待されている。
【０００９】
ところで、ＡＧＥは、加齢と共にその蓄積が認められること、およびＡＧＥがコラーゲンとコラーゲンとの間の結合物質として働くことが知られており、これにより、皮膚の老化に関与すると考えられている。アミノグアニジンを投与することにより、加齢に伴う様々な体内組織の老化現象を抑制することができたことが報告され（非特許文献３）、アミノグアニジンは、欧米では、アンチエージング物質として汎用されている。しかし、アミノグアニジンは、毒性を有することが米国の第III相臨床試験で明らかとなっており、その使用および用量に大きな制限が加えられている。
【００１０】
その他のＡＧＥ形成阻害剤としては、アミノグアニジンの誘導体であるＯＰＢ−９１９５、ＬＲ−９０、ＡＬＴ−９４６、天然化合物及びその類縁体であるチアミン（ビタミンＢ１）、チアミンピロリン酸、ベンフォチアミンなど幾つかの化合物が知られている（非特許文献４〜９）が、いずれも実用化には至っていない。
【００１１】
このような背景から、副作用の問題が少ない天然物由来の糖化阻害剤の開発が期待されている。例えば、生活習慣病の予防食品として有用な抗糖化食品群として、レモン、レモン皮、発酵米ぬか、赤唐辛子、りんご皮、アボガド、発芽玄米、玉ねぎ皮、バナナ皮、クコの実、りんご、黒大豆、キウイ皮、黒米、黒こしょう、シナモン、わかめ、かいわれ、緑茶、白ゴマ、及びピーナッツ皮からなる群から選択される食品からの抽出物の１種又は２種以上を主成分として含有する、アミノリン脂質の糖化抑制物質などが知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−３００１５３号公報
【特許文献２】特表２００４−５２９１２６号公報
【特許文献３】特開２００７−２２３９７７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Yamagishi S.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002年, 290巻, 973-978頁
【非特許文献２】Okamoto T.ら, FASEB J., 2002年, 16巻, 1928-1930頁
【非特許文献３】Li Y.M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996年, 93巻, 3902-3907頁
【非特許文献４】Price D.L.ら, J. Biol. Chem., 2001年, 276巻, 48967-48972頁
【非特許文献５】Rahbar S.ら, Mol. Cell. Biol. Res. Commun., 2000年, 3巻, 360-366頁
【非特許文献６】Forbes J.M.ら, Diabetologia., 2001年, 44巻, 108-114頁
【非特許文献７】La Selvaら, Diabetologia, 1996年, 39巻, 1263-1268頁
【非特許文献８】Booth A.A.ら, J. Biol. Chem., 1997年, 2729巻, 5430-5437頁
【非特許文献９】Stracke H.ら, Nat. Med., 2003年, 9巻, 294-299頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、飲食品や医薬品として安全性が高い抗糖化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、アーモンド抽出物を含む抗糖化剤を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、飲食品や医薬品として安全性が高い抗糖化剤を提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】アーモンド水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。
【図２】アーモンド熱水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。
【図３】オレイン酸を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中で「アーモンド抽出物」とは、以下に説明するように、アーモンド材料を抽出して得られた産物をいう。
【００１９】
アーモンド（学名：Prunus dulcis）は、バラ科サクラ属に分類される植物であり、アーモンドの実は、外側より果皮、果肉、殻、種皮、仁から構成される。アーモンドは種子の仁を食用とする落葉果樹である。主として、フランス、スペイン、イスラエル、アメリカなどで栽培されている。殻の砕きやすさによって、軟殻種（ソフトシェル）と硬殻種（ハードシェル）に分類することができる。風味によって、スイート種（甘扁桃）とビター種（苦扁桃）があり、食用にされるのはスイート種である。スイート種には100以上の品種があるとされるが、食用とされる主な品種は、ノンパレイユ（Nonpareil）、カリフォルニア（California）、カーメル（Carmel）、ミッション（Mission）、ビュート（Bute）などである。
【００２０】
アーモンド抽出物の調製のために、アーモンドの種皮、仁、殻などの材料が用いられる。用いられるアーモンドの種類は特に限定されない。食用品種が好ましい。
【００２１】
アーモンド抽出には、アーモンド材料を乾燥した後粉砕したものが用いられ得る。種皮および仁は、乾燥前に必要に応じて裁断され得る。乾燥法としては、公知の任意の方法が用いられ得るが、例えば、風乾法、加熱乾燥法、スプレードライ法、減圧乾燥法、凍結乾燥法などが挙げられる。粉砕法は、例えば、粉砕機や摩砕機を使用して微粉末化または微粒化するなどの手段を含む。
【００２２】
抽出溶媒としては、水、エタノールなどが挙げられる。抽出溶媒に水を用いる場合、抽出法としては、熱水抽出法および水抽出法が挙げられる。熱水抽出法としては、上記材料を熱水に浸漬する方法または蒸気で蒸す方法が挙げられる。熱水の温度は好ましくは40〜100℃、より好ましくは70〜100℃であり、熱水の処理時間は、好ましくは10〜120分、より好ましくは20〜40分である。蒸気で蒸す場合には、沸騰した湯を用いて蒸し、蒸す時間は、好ましくは10〜120分、より好ましくは30〜60分である。水抽出法としては、水あるいは他の成分を加えた水溶液に上記材料を浸漬する方法が挙げられる。水の温度は好ましくは0〜40℃、より好ましくは10〜40℃である。抽出後、遠心分離、濾過などの適当な分離手段により沈殿物または不溶性画分を除き、上清または可溶性画分を回収し得る。さらに、上記抽出後の沈殿物または不溶性画分について再度同様の抽出処理を行って、上清または可溶性画分を回収することもできる。アーモンド抽出物は、オレイン酸を含有する。
【００２３】
アーモンド抽出物は、さらに、乾燥、粉砕などの処理に供してもよい。乾燥法としては、公知の任意の方法が用いられ得るが、例えば、風乾法、加熱乾燥法、スプレードライ法、凍結乾燥法などが挙げられる。アーモンド抽出物に、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン）を添加したものをスプレードライなどにより乾燥し得る。粉砕法は、例えば、粉砕機や摩砕機を使用して微粉末化または微粒化するなどの手段を含む。
【００２４】
アーモンド抽出物は、液状または溶媒除去した固形のいずれの形態でも用いられ得る。
【００２５】
アーモンド抽出物は、終末糖化産物（ＡＧＥ）に対する結合性および終末糖化産物生成阻害活性を有する。「終末糖化産物（ＡＧＥ）」とは、グルコースなどの還元糖とタンパク質のアミノ基とが非酵素的に反応し、シッフ塩基、アマドリ転移化合物を経て形成される不可逆的な架橋物質の総称である。ＡＧＥは、反応性に富むグリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドなどのアルデヒド、およびメチルグリオキサール、グリオキサール、3-デオキシグルコソンのような各種中間代謝産物から、あるいはアマドリ転移化合物の酸化的分解、グルコースの自動酸化、脂質の過酸化などによっても生じ得る。生体内に存在するタンパク質（例えば、赤血球膜蛋白、アルブミン、リポプロテイン、アンチトロンビン、トロンボモジュリンなどの血中血漿タンパク質、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカンなどの細胞外基質構成タンパク質など）、核酸などがＡＧＥ化することにより機能障害が生ずると考えられている。
【００２６】
アーモンド抽出物を経口摂取した場合、生体外由来（例えば、食物性）および生体内のＡＧＥを吸着して、腸管からの吸収を阻害し得る。例えば、生体外からの食物性ＡＧＥから体内で転換されるＡＧＥ−２量を減じ得る。また、生体内におけるＡＧＥの生成も抑制し得る。
【００２７】
アーモンド抽出物は、毒性の強い終末糖化産物であるグリセロアルデヒド由来糖化産物であるＡＧＥ−２による細胞アポトーシス抑制活性も有し得る。
【００２８】
アーモンド抽出物は、経口、経管、経皮、経粘膜投与などによる体内への導入によって、抗糖化剤として、ならびに終末糖化産物が関与する疾患、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防および治療に用いられ得る。
【００２９】
アーモンド抽出物は、抗糖化剤として利用できる。「抗糖化剤」とは、終末糖化産物への結合または終末糖化産物生成の阻害などにより体内での終末糖化産物の蓄積を抑制し得、あるいはＡＧＥ−２による細胞アポトーシスのようなＡＧＥ−２による細胞への有害作用を抑制し得る因子であり得る。このような抗糖化剤は、飲食品、医薬品、化粧品、石鹸、皮膚塗布剤、点鼻剤、坐剤などに配合され得る。
【００３０】
アーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、飲食品および医薬品の素材として用いられ得る。アーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、飲食品組成物（例えば、経口用サプリメントのような健康食品）および医薬品組成物に含有することができる。これらの飲食品組成物および医薬品組成物は、特に、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防または治療のために用いられ得る。
【００３１】
飲食品組成物は、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、マルチトール、ソルビトール、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、アミノ酸類、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料、保存料などをさらに適宜含有し得る。このような飲食品は、用途に応じて、粉末、顆粒、カプセル、錠、シロップ、懸濁液などの形態に成形され得、飴などにも加工され得る。飲食品組成物（例えば、経口用サプリメント）の製造は、当業者が通常用いる方法によって行われ得る。飲食品組成物への抗糖化剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。飲食品組成物は、飲食品組成物全量に対して抗糖化剤を、0.1〜100質量％、より好ましくは10〜80質量％（アーモンド抽出物基準）で含有し得る。
【００３２】
抗糖化剤または飲食品組成物は、そのまま摂取することができ、水などの溶媒に溶かすまたは懸濁させるなどしても摂取することができ、食事の前後、または食間に経口摂取することができる。抗糖化剤または飲食品組成物を飲食品に添加して、飲食することもできる。
【００３３】
抗糖化剤または飲食品組成物が添加される飲食品としては、例えば、在宅用糖尿病食、流動食、病者用食品（糖尿病食調製用組み合わせ食品など）、特定保健用食品、ダイエット食品、あるいは炭水化物を主成分とする飲食品が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な食品形態としては、例えば、米飯製品、麦製品、野菜製品、乳飲料、清涼飲料などが挙げられるが、これらに限定されない。抗糖化剤または飲食品組成物の飲食品への添加または加工は、当業者が通常用いる方法によって行われ得、配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。人間以外の動物、例えば家畜またはペット用の飼料への添加も可能である。
【００３４】
医薬品組成物は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分をさらに適宜含み得る。これらの医薬品組成物は、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液剤などの剤型で経口的あるいは経管的に投与することができる。医薬品組成物の製造は当業者が通常用いる方法によって行われ得、配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。医薬品組成物の投与量は、肥満の程度、患者の体重、投与形態などに応じて適宜選定することができる。医薬品組成物は、医薬品組成物全量に対して抗糖化剤を好ましくは20〜100質量％、より好ましくは60〜100質量％（アーモンド抽出物基準）で含有し得る。
【００３５】
医薬品組成物は、そのまま投与することができ、水などの溶媒に溶かすまたは懸濁させるなどしても投与することができる。投与は１日に１回または複数回に分けて行われ得る。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（調製例１：アーモンド水抽出物）
株式会社デルタ・インターナショナル（東京）から購入したカリフォルニア産アーモンドの種皮および仁を一緒に細かく裁断し凍結乾燥機で乾燥させ、十分に乾燥を終えた後、粉砕機で粉砕した。粉砕サンプル1gを100ｍLのビーカーに測り取り、20〜25℃の超純水20ｍLを入れ、超音波で約5分処理した後、４℃にて一晩攪拌した。撹拌後の液状物を、４℃にて20分間、3000rpmで遠心分離し、上清を回収した。この遠心分離による沈澱を10ｍLの超純水で洗い、もう一度、同条件で遠心分離を行い、上清を回収した。回収した２つの上清を合わせて凍結乾燥、粉末化した（以下、「アーモンド水抽出物」）。
【００３８】
（調製例２：アーモンド熱水抽出物）
抽出のために、20〜25℃の超純水の代わりに95℃の熱水を用いたことおよび撹拌時間を一晩ではなく１時間にしたこと以外は、調製例１と同様にして、アーモンド熱水抽出物を調製した。
【００３９】
調製例１のアーモンド水抽出物および調製例２の熱水抽出物について、財団法人日本食品分析センターに分析を依頼し、これらの抽出物がオレイン酸を含有することを確認した。
【００４０】
（実施例１：ＡＧＥとの結合作用）
被験物質として、アーモンド水抽出物、アーモンド熱水抽出物、またはオレイン酸（和光純薬株式会社より購入）を用いて、グルコース由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−１）およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）との相互作用（解離定数）を調べた。
【００４１】
ＡＧＥ−１は以下のように調製した（以下に示す試薬は全てシグマ社から購入）：
（１）360mgのDL-グルコースと39mgのジエチレントリアミン五酢酸（キレート剤）をそれぞれ秤量し、50ｍLのファルコンチューブに移した；
（２）当該ファルコンチューブに0.2Mリン酸緩衝液（ｐH7.4）を20ｍL添加して、ボルテックスミキサーにて溶解した；
（３）当該ファルコンチューブにHSAを500mg添加し、ボルテックスミキサーにて再度溶解した；
（４）溶解後、当該溶液をクリーンベンチ内でポアサイズ0.22μｍのフィルターを通すことによって無菌溶液とした；
（５）パラフィルムにて50ｍLファルコンチューブの蓋を密封し、37℃で１週間インキュベートした；そして
（６）未反応のDL-グルコースを除くために、PD-10カラムにかけて、その結果をHPLCで確認した。
【００４２】
ＡＧＥ−２は以下のように調製した（以下に示す試薬は全てシグマ社から購入）：
（１）180mgのDL-グリセルアルデヒドと39mgのジエチレントリアミン五酢酸（キレート剤）をそれぞれ秤量し、50ｍLのファルコンチューブに移した；
（２）当該ファルコンチューブに0.2Mリン酸緩衝液（ｐH7.4）を20ｍL添加して、ボルテックスミキサーにて溶解した；
（３）当該ファルコンチューブにHSAを500mg添加し、ボルテックスミキサーにて再度溶解した；
（４）溶解後、当該溶液をクリーンベンチ内でポアサイズ0.22μｍのフィルターを通すことによって無菌溶液とした；
（５）パラフィルムにて50ｍLファルコンチューブの蓋を密封し、37℃で１週間インキュベートした；そして
（６）未反応のDL-グリセルアルデヒドを除くために、PD-10カラムにかけて、その結果をHPLCで確認した。
【００４３】
分子間相互作用定量QCM装置「AFFINIXQ」（型番：QCM2000；株式会社イニシアム）の専用センサーチップに、100μg／ｍLのグルコース由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−１）またはグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）を１μL滴下し、十分に風乾した後、超純水で当該チップを洗浄した。チップを装置に装着し、試験容器に入れた８ｍLの超純水にチップを浸漬させた。被験物質の凍結乾燥物を超純水で１mg／ｍLとなるように溶解し、この被験物質溶液８μLを取り、試験容器内の超純水に添加した。装置のディスプレイ上でチップ上のグルコース由来ＡＧＥあるいはグリセルアルデヒド由来ＡＧＥと被験物質との結合が安定になったことを確認し、被験物質溶液８μLをさらに添加した。この操作を２〜４回繰り返し、グルコース由来ＡＧＥまたはグリセルアルデヒド由来ＡＧＥと被験物質との相互作用（平衡曲線）を作成した。装置に内蔵した専用測定解析ソフトウェアで結果を解析し、解離定数を算出した。
【００４４】
アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物の結果をそれぞれ表１および表２に示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
表１および表２に示されるように、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥへの結合活性を有することが分かった。アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物は、グルコース由来ＡＧＥへの結合活性もまた有していた。オレイン酸では、測定できなかった。
【００４８】
（実施例２：ＡＧＥ生成阻害作用）
被験物質として、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物については、それぞれの水溶液を、最終濃度が100μg/ｍLまたは1mg/ｍLとなるように調製した。オレイン酸については、水溶液を、最終濃度が100μg/ｍLとなるように調製した。オレイン酸は、超音波を用いて溶解させた。
【００４９】
以下の量の成分を含む水溶液を調製した：D-(+)-グリセルアルデヒド（シグマ社より購入）180mg；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ、シグマ社より購入）39mg；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ社より購入）500mg；被験物質；0.2Mリン酸緩衝液(pH7.4)（和光純薬より購入）20mL。コントロールには、被験物質を添加しなかった。
【００５０】
上記のように調製した水溶液を試験管に入れ、該試験管に滅菌済みの蓋をし、蓋の周囲をパラフィルムで密封し、更にアルミ箔で試験管全体を覆い遮光して、37℃にて1週間インキュベートした。次いで、これに、最終濃度が50mMとなるよう予めメタノールに溶解しそして水の添加により5Mに調整した水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)溶液を加え、37℃にて4時間インキュベートした。
【００５１】
上記インキュベーション後にＡＧＥが生成したか否かを、ＡＧＥ検出キットとしてグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ測定ELISAキット（株式会社アップウェル製）を用いて確認した。
【００５２】
結果は、コントロール（被験物質を混和しないサンプル）を100％とし、コントロールに対するグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ生成率を百分率で表した。
【００５３】
また、「180mgのD-(+)-グリセルアルデヒド」を「360mgのＤ-グルコース（シグマ社より購入）」に代え、ＡＧＥ検出キットをヒトグルコース由来ＡＧＥポリクローナル抗体測定キット（株式会社アップウェル製）に代えたこと以外、同様にして、グルコース由来ＡＧＥの生成を調べた。結果は、コントロール（被験物質を混和しないサンプル）を100％とし、コントロールに対するグルコース由来ＡＧＥ生成率を百分率で表した。
【００５４】
これらの結果を合わせて、図１〜３に示す。図１は、アーモンド水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。図２は、アーモンド熱水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。図３は、オレイン酸を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。各図とも、縦軸はグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率（％）を表す。図１および図２は、横軸のコントロール、グルコース由来ＡＧＥ、およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥのそれぞれについて、左側が100μg/ｍLの結果および右側が1mg/ｍLの結果を表す。図３は、横軸のコントロール、グルコース由来ＡＧＥ、およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥのそれぞれについて、100μg/ｍLオレイン酸の結果を表す。
【００５５】
これらの図に示されるように、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物とも、グリセルアルデヒドおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成を阻害した。グルコースおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成もまた阻害した。オレイン酸もまた、グリセルアルデヒドおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成、ならびにグルコースおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成を阻害した。
【００５６】
（実施例３：ウシ周皮細胞アポトーシス抑制試験）
ウシ周皮細胞を、久留米大学医学部糖尿病性血管合併症診断・治療講座の山岸昌一教授から提供してもらった。ウシ周皮細胞を、250μg/ｍLのグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（実施例１で調製したＡＧＥ−２）または250μgのウシ血清アルブミン（シグマ社より購入）の存在下で、100μg/ｍLの被験物質と共に10日間培養した。10日間の培養後、細胞を溶解し、ENzyme-linked immunosorbant assay for DNA fragments (Cell Death Detection enzyme-linked immunosorbent assay, Roche Molecular Biochemicals社)を用いて生存細胞数を測定した。
【００５７】
この結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３に示されるように、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥによる細胞アポトーシスを抑制することが明らかになった。オレイン酸もまた、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥによる細胞アポトーシスを抑制した。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、終末糖化産物（ＡＧＥ）に結合し、ＡＧＥの生成を抑制し、そして細胞への毒性が強いと考えられるグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）による細胞アポトーシスを抑制し得る物質が提供される。本発明のアーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防および治療に用いられ得る。本発明のアーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、食物由来であるので、飲食品、医薬品、化粧品、石鹸、皮膚塗布剤、点鼻剤、坐剤などに安全に配合され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アーモンド抽出物を含む抗糖化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Advanced Glycation End-product；ＡＧＥ）は、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応から始まる一連の反応（メイラード反応）により生じる不可逆的な高分子架橋物質である。これらの反応は、生体内で長期間にわたりゆっくり進行する。例えば、糖尿病の臨床検査項目の１つとして挙げられているヘモグロビンＡ１Ｃ（HbA1c）は、赤血球のタンパク質であるヘモグロビンの糖化物であり、ＡＧＥｓの１種である。
【０００３】
ＡＧＥは、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病による合併症の原因物質である。また、ＡＧＥは、血管内皮細胞に存在する特異的な受容体（ＲＡＧＥ）に結合して糖尿病性血管症の発症に関連することも知られている。現在、わが国において、糖尿病の潜在患者数が１６３０万人にのぼり、特に中高年の４．５人に１人が糖尿病予備軍であるとの報告を考慮すると、体内のＡＧＥを除去することは、今後の糖尿病合併症の発症・進行を予防する上で非常に重要である。さらに、ＡＧＥは、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、慢性関節リウマチなどの種々の衰弱性疾患の発症にも関与している。
【０００４】
ＡＧＥは、グルコースだけではなく、グルコースの自動酸化および分解産物などの種々の糖から生成される。このうち、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥは、ＡＧＥレセプター（ＲＡＧＥ）との結合能力が高く、このＲＡＧＥを介して、糖尿病性網膜症もしくは糖尿病性腎症のような糖尿病血管合併症の発症および進展に強く関与していることが知られている（非特許文献１および２）。このように、糖尿病の予防および治療を目的として、ＡＧＥ、特に、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）はその役割が注目されており、研究が続けられている。
【０００５】
一方で、ＡＧＥは、食品中にも存在する。そもそも、ＡＧＥは、食品化学の研究において発表された非酵素的糖化反応（メイラード反応）による褐変において注目された物質である。ＡＧＥは、煮る・蒸すなどの調理方法ではほとんど含まれず、逆に焼く・炒める・揚げるなどの調理方法では多く含まれることが分かっている。また、ＡＧＥは、コーラ、味噌、および醤油のような食材に多く含まれていることも知られている。このように、人間は、生活上、常に多量のＡＧＥを食品（特に加工食品）から摂取している。食材としてＡＧＥを取り込むことに関してはほとんど害がないと考えられているが、腎臓を悪くしている場合は注意が必要であり、また無害の食品性ＡＧＥが体内に吸収された後、有害性のＡＧＥ（例えばＡＧＥ−２）に転換される可能性がある。
【０００６】
このようにＡＧＥは生体内でも生成され、また生体外からも摂取される。このため、生体内での過剰なＡＧＥの蓄積を抑制するために、種々の薬剤が提案されている。例えば、ＡＧＥ生成抑制剤として、従来からアミノグアニジン、ピリドキサミン誘導体などが知られている。さらに特許文献１には、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンが開示されている。
【０００７】
確立されたＡＧＥ架橋を破壊する物質も検討されており、例えば、Ｎ−臭化フェナシルチアゾリウム（ＰＴＢ）などが知られている。最近では、１，４−ベンゼン−ｂｉｓ［４−メチレンアミノフェノキシイソ酪酸］などの７種の化合物が報告されている（例えば、特許文献２）。しかし、これらのＡＧＥ分解効果は、必ずしも十分とはいえない。
【０００８】
近年の研究では、ビタミンＢ６が、ＡＧＥ阻害作用を有することが見出され、そのＡＧＥ阻害剤としての利用が期待されている。
【０００９】
ところで、ＡＧＥは、加齢と共にその蓄積が認められること、およびＡＧＥがコラーゲンとコラーゲンとの間の結合物質として働くことが知られており、これにより、皮膚の老化に関与すると考えられている。アミノグアニジンを投与することにより、加齢に伴う様々な体内組織の老化現象を抑制することができたことが報告され（非特許文献３）、アミノグアニジンは、欧米では、アンチエージング物質として汎用されている。しかし、アミノグアニジンは、毒性を有することが米国の第III相臨床試験で明らかとなっており、その使用および用量に大きな制限が加えられている。
【００１０】
その他のＡＧＥ形成阻害剤としては、アミノグアニジンの誘導体であるＯＰＢ−９１９５、ＬＲ−９０、ＡＬＴ−９４６、天然化合物及びその類縁体であるチアミン（ビタミンＢ１）、チアミンピロリン酸、ベンフォチアミンなど幾つかの化合物が知られている（非特許文献４〜９）が、いずれも実用化には至っていない。
【００１１】
このような背景から、副作用の問題が少ない天然物由来の糖化阻害剤の開発が期待されている。例えば、生活習慣病の予防食品として有用な抗糖化食品群として、レモン、レモン皮、発酵米ぬか、赤唐辛子、りんご皮、アボガド、発芽玄米、玉ねぎ皮、バナナ皮、クコの実、りんご、黒大豆、キウイ皮、黒米、黒こしょう、シナモン、わかめ、かいわれ、緑茶、白ゴマ、及びピーナッツ皮からなる群から選択される食品からの抽出物の１種又は２種以上を主成分として含有する、アミノリン脂質の糖化抑制物質などが知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−３００１５３号公報
【特許文献２】特表２００４−５２９１２６号公報
【特許文献３】特開２００７−２２３９７７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Yamagishi S.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002年, 290巻, 973-978頁
【非特許文献２】Okamoto T.ら, FASEB J., 2002年, 16巻, 1928-1930頁
【非特許文献３】Li Y.M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996年, 93巻, 3902-3907頁
【非特許文献４】Price D.L.ら, J. Biol. Chem., 2001年, 276巻, 48967-48972頁
【非特許文献５】Rahbar S.ら, Mol. Cell. Biol. Res. Commun., 2000年, 3巻, 360-366頁
【非特許文献６】Forbes J.M.ら, Diabetologia., 2001年, 44巻, 108-114頁
【非特許文献７】La Selvaら, Diabetologia, 1996年, 39巻, 1263-1268頁
【非特許文献８】Booth A.A.ら, J. Biol. Chem., 1997年, 2729巻, 5430-5437頁
【非特許文献９】Stracke H.ら, Nat. Med., 2003年, 9巻, 294-299頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、飲食品や医薬品として安全性が高い抗糖化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、アーモンド抽出物を含む抗糖化剤を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、飲食品や医薬品として安全性が高い抗糖化剤を提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】アーモンド水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。
【図２】アーモンド熱水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。
【図３】オレイン酸を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中で「アーモンド抽出物」とは、以下に説明するように、アーモンド材料を抽出して得られた産物をいう。
【００１９】
アーモンド（学名：Prunus dulcis）は、バラ科サクラ属に分類される植物であり、アーモンドの実は、外側より果皮、果肉、殻、種皮、仁から構成される。アーモンドは種子の仁を食用とする落葉果樹である。主として、フランス、スペイン、イスラエル、アメリカなどで栽培されている。殻の砕きやすさによって、軟殻種（ソフトシェル）と硬殻種（ハードシェル）に分類することができる。風味によって、スイート種（甘扁桃）とビター種（苦扁桃）があり、食用にされるのはスイート種である。スイート種には100以上の品種があるとされるが、食用とされる主な品種は、ノンパレイユ（Nonpareil）、カリフォルニア（California）、カーメル（Carmel）、ミッション（Mission）、ビュート（Bute）などである。
【００２０】
アーモンド抽出物の調製のために、アーモンドの種皮、仁、殻などの材料が用いられる。用いられるアーモンドの種類は特に限定されない。食用品種が好ましい。
【００２１】
アーモンド抽出には、アーモンド材料を乾燥した後粉砕したものが用いられ得る。種皮および仁は、乾燥前に必要に応じて裁断され得る。乾燥法としては、公知の任意の方法が用いられ得るが、例えば、風乾法、加熱乾燥法、スプレードライ法、減圧乾燥法、凍結乾燥法などが挙げられる。粉砕法は、例えば、粉砕機や摩砕機を使用して微粉末化または微粒化するなどの手段を含む。
【００２２】
抽出溶媒としては、水、エタノールなどが挙げられる。抽出溶媒に水を用いる場合、抽出法としては、熱水抽出法および水抽出法が挙げられる。熱水抽出法としては、上記材料を熱水に浸漬する方法または蒸気で蒸す方法が挙げられる。熱水の温度は好ましくは40〜100℃、より好ましくは70〜100℃であり、熱水の処理時間は、好ましくは10〜120分、より好ましくは20〜40分である。蒸気で蒸す場合には、沸騰した湯を用いて蒸し、蒸す時間は、好ましくは10〜120分、より好ましくは30〜60分である。水抽出法としては、水あるいは他の成分を加えた水溶液に上記材料を浸漬する方法が挙げられる。水の温度は好ましくは0〜40℃、より好ましくは10〜40℃である。抽出後、遠心分離、濾過などの適当な分離手段により沈殿物または不溶性画分を除き、上清または可溶性画分を回収し得る。さらに、上記抽出後の沈殿物または不溶性画分について再度同様の抽出処理を行って、上清または可溶性画分を回収することもできる。アーモンド抽出物は、オレイン酸を含有する。
【００２３】
アーモンド抽出物は、さらに、乾燥、粉砕などの処理に供してもよい。乾燥法としては、公知の任意の方法が用いられ得るが、例えば、風乾法、加熱乾燥法、スプレードライ法、凍結乾燥法などが挙げられる。アーモンド抽出物に、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン）を添加したものをスプレードライなどにより乾燥し得る。粉砕法は、例えば、粉砕機や摩砕機を使用して微粉末化または微粒化するなどの手段を含む。
【００２４】
アーモンド抽出物は、液状または溶媒除去した固形のいずれの形態でも用いられ得る。
【００２５】
アーモンド抽出物は、終末糖化産物（ＡＧＥ）に対する結合性および終末糖化産物生成阻害活性を有する。「終末糖化産物（ＡＧＥ）」とは、グルコースなどの還元糖とタンパク質のアミノ基とが非酵素的に反応し、シッフ塩基、アマドリ転移化合物を経て形成される不可逆的な架橋物質の総称である。ＡＧＥは、反応性に富むグリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドなどのアルデヒド、およびメチルグリオキサール、グリオキサール、3-デオキシグルコソンのような各種中間代謝産物から、あるいはアマドリ転移化合物の酸化的分解、グルコースの自動酸化、脂質の過酸化などによっても生じ得る。生体内に存在するタンパク質（例えば、赤血球膜蛋白、アルブミン、リポプロテイン、アンチトロンビン、トロンボモジュリンなどの血中血漿タンパク質、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカンなどの細胞外基質構成タンパク質など）、核酸などがＡＧＥ化することにより機能障害が生ずると考えられている。
【００２６】
アーモンド抽出物を経口摂取した場合、生体外由来（例えば、食物性）および生体内のＡＧＥを吸着して、腸管からの吸収を阻害し得る。例えば、生体外からの食物性ＡＧＥから体内で転換されるＡＧＥ−２量を減じ得る。また、生体内におけるＡＧＥの生成も抑制し得る。
【００２７】
アーモンド抽出物は、毒性の強い終末糖化産物であるグリセロアルデヒド由来糖化産物であるＡＧＥ−２による細胞アポトーシス抑制活性も有し得る。
【００２８】
アーモンド抽出物は、経口、経管、経皮、経粘膜投与などによる体内への導入によって、抗糖化剤として、ならびに終末糖化産物が関与する疾患、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防および治療に用いられ得る。
【００２９】
アーモンド抽出物は、抗糖化剤として利用できる。「抗糖化剤」とは、終末糖化産物への結合または終末糖化産物生成の阻害などにより体内での終末糖化産物の蓄積を抑制し得、あるいはＡＧＥ−２による細胞アポトーシスのようなＡＧＥ−２による細胞への有害作用を抑制し得る因子であり得る。このような抗糖化剤は、飲食品、医薬品、化粧品、石鹸、皮膚塗布剤、点鼻剤、坐剤などに配合され得る。
【００３０】
アーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、飲食品および医薬品の素材として用いられ得る。アーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、飲食品組成物（例えば、経口用サプリメントのような健康食品）および医薬品組成物に含有することができる。これらの飲食品組成物および医薬品組成物は、特に、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防または治療のために用いられ得る。
【００３１】
飲食品組成物は、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、マルチトール、ソルビトール、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、アミノ酸類、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料、保存料などをさらに適宜含有し得る。このような飲食品は、用途に応じて、粉末、顆粒、カプセル、錠、シロップ、懸濁液などの形態に成形され得、飴などにも加工され得る。飲食品組成物（例えば、経口用サプリメント）の製造は、当業者が通常用いる方法によって行われ得る。飲食品組成物への抗糖化剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。飲食品組成物は、飲食品組成物全量に対して抗糖化剤を、0.1〜100質量％、より好ましくは10〜80質量％（アーモンド抽出物基準）で含有し得る。
【００３２】
抗糖化剤または飲食品組成物は、そのまま摂取することができ、水などの溶媒に溶かすまたは懸濁させるなどしても摂取することができ、食事の前後、または食間に経口摂取することができる。抗糖化剤または飲食品組成物を飲食品に添加して、飲食することもできる。
【００３３】
抗糖化剤または飲食品組成物が添加される飲食品としては、例えば、在宅用糖尿病食、流動食、病者用食品（糖尿病食調製用組み合わせ食品など）、特定保健用食品、ダイエット食品、あるいは炭水化物を主成分とする飲食品が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な食品形態としては、例えば、米飯製品、麦製品、野菜製品、乳飲料、清涼飲料などが挙げられるが、これらに限定されない。抗糖化剤または飲食品組成物の飲食品への添加または加工は、当業者が通常用いる方法によって行われ得、配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。人間以外の動物、例えば家畜またはペット用の飼料への添加も可能である。
【００３４】
医薬品組成物は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分をさらに適宜含み得る。これらの医薬品組成物は、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液剤などの剤型で経口的あるいは経管的に投与することができる。医薬品組成物の製造は当業者が通常用いる方法によって行われ得、配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。医薬品組成物の投与量は、肥満の程度、患者の体重、投与形態などに応じて適宜選定することができる。医薬品組成物は、医薬品組成物全量に対して抗糖化剤を好ましくは20〜100質量％、より好ましくは60〜100質量％（アーモンド抽出物基準）で含有し得る。
【００３５】
医薬品組成物は、そのまま投与することができ、水などの溶媒に溶かすまたは懸濁させるなどしても投与することができる。投与は１日に１回または複数回に分けて行われ得る。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（調製例１：アーモンド水抽出物）
株式会社デルタ・インターナショナル（東京）から購入したカリフォルニア産アーモンドの種皮および仁を一緒に細かく裁断し凍結乾燥機で乾燥させ、十分に乾燥を終えた後、粉砕機で粉砕した。粉砕サンプル1gを100ｍLのビーカーに測り取り、20〜25℃の超純水20ｍLを入れ、超音波で約5分処理した後、４℃にて一晩攪拌した。撹拌後の液状物を、４℃にて20分間、3000rpmで遠心分離し、上清を回収した。この遠心分離による沈澱を10ｍLの超純水で洗い、もう一度、同条件で遠心分離を行い、上清を回収した。回収した２つの上清を合わせて凍結乾燥、粉末化した（以下、「アーモンド水抽出物」）。
【００３８】
（調製例２：アーモンド熱水抽出物）
抽出のために、20〜25℃の超純水の代わりに95℃の熱水を用いたことおよび撹拌時間を一晩ではなく１時間にしたこと以外は、調製例１と同様にして、アーモンド熱水抽出物を調製した。
【００３９】
調製例１のアーモンド水抽出物および調製例２の熱水抽出物について、財団法人日本食品分析センターに分析を依頼し、これらの抽出物がオレイン酸を含有することを確認した。
【００４０】
（実施例１：ＡＧＥとの結合作用）
被験物質として、アーモンド水抽出物、アーモンド熱水抽出物、またはオレイン酸（和光純薬株式会社より購入）を用いて、グルコース由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−１）およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）との相互作用（解離定数）を調べた。
【００４１】
ＡＧＥ−１は以下のように調製した（以下に示す試薬は全てシグマ社から購入）：
（１）360mgのDL-グルコースと39mgのジエチレントリアミン五酢酸（キレート剤）をそれぞれ秤量し、50ｍLのファルコンチューブに移した；
（２）当該ファルコンチューブに0.2Mリン酸緩衝液（ｐH7.4）を20ｍL添加して、ボルテックスミキサーにて溶解した；
（３）当該ファルコンチューブにHSAを500mg添加し、ボルテックスミキサーにて再度溶解した；
（４）溶解後、当該溶液をクリーンベンチ内でポアサイズ0.22μｍのフィルターを通すことによって無菌溶液とした；
（５）パラフィルムにて50ｍLファルコンチューブの蓋を密封し、37℃で１週間インキュベートした；そして
（６）未反応のDL-グルコースを除くために、PD-10カラムにかけて、その結果をHPLCで確認した。
【００４２】
ＡＧＥ−２は以下のように調製した（以下に示す試薬は全てシグマ社から購入）：
（１）180mgのDL-グリセルアルデヒドと39mgのジエチレントリアミン五酢酸（キレート剤）をそれぞれ秤量し、50ｍLのファルコンチューブに移した；
（２）当該ファルコンチューブに0.2Mリン酸緩衝液（ｐH7.4）を20ｍL添加して、ボルテックスミキサーにて溶解した；
（３）当該ファルコンチューブにHSAを500mg添加し、ボルテックスミキサーにて再度溶解した；
（４）溶解後、当該溶液をクリーンベンチ内でポアサイズ0.22μｍのフィルターを通すことによって無菌溶液とした；
（５）パラフィルムにて50ｍLファルコンチューブの蓋を密封し、37℃で１週間インキュベートした；そして
（６）未反応のDL-グリセルアルデヒドを除くために、PD-10カラムにかけて、その結果をHPLCで確認した。
【００４３】
分子間相互作用定量QCM装置「AFFINIXQ」（型番：QCM2000；株式会社イニシアム）の専用センサーチップに、100μg／ｍLのグルコース由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−１）またはグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）を１μL滴下し、十分に風乾した後、超純水で当該チップを洗浄した。チップを装置に装着し、試験容器に入れた８ｍLの超純水にチップを浸漬させた。被験物質の凍結乾燥物を超純水で１mg／ｍLとなるように溶解し、この被験物質溶液８μLを取り、試験容器内の超純水に添加した。装置のディスプレイ上でチップ上のグルコース由来ＡＧＥあるいはグリセルアルデヒド由来ＡＧＥと被験物質との結合が安定になったことを確認し、被験物質溶液８μLをさらに添加した。この操作を２〜４回繰り返し、グルコース由来ＡＧＥまたはグリセルアルデヒド由来ＡＧＥと被験物質との相互作用（平衡曲線）を作成した。装置に内蔵した専用測定解析ソフトウェアで結果を解析し、解離定数を算出した。
【００４４】
アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物の結果をそれぞれ表１および表２に示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
表１および表２に示されるように、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥへの結合活性を有することが分かった。アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物は、グルコース由来ＡＧＥへの結合活性もまた有していた。オレイン酸では、測定できなかった。
【００４８】
（実施例２：ＡＧＥ生成阻害作用）
被験物質として、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物については、それぞれの水溶液を、最終濃度が100μg/ｍLまたは1mg/ｍLとなるように調製した。オレイン酸については、水溶液を、最終濃度が100μg/ｍLとなるように調製した。オレイン酸は、超音波を用いて溶解させた。
【００４９】
以下の量の成分を含む水溶液を調製した：D-(+)-グリセルアルデヒド（シグマ社より購入）180mg；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ、シグマ社より購入）39mg；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ社より購入）500mg；被験物質；0.2Mリン酸緩衝液(pH7.4)（和光純薬より購入）20mL。コントロールには、被験物質を添加しなかった。
【００５０】
上記のように調製した水溶液を試験管に入れ、該試験管に滅菌済みの蓋をし、蓋の周囲をパラフィルムで密封し、更にアルミ箔で試験管全体を覆い遮光して、37℃にて1週間インキュベートした。次いで、これに、最終濃度が50mMとなるよう予めメタノールに溶解しそして水の添加により5Mに調整した水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)溶液を加え、37℃にて4時間インキュベートした。
【００５１】
上記インキュベーション後にＡＧＥが生成したか否かを、ＡＧＥ検出キットとしてグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ測定ELISAキット（株式会社アップウェル製）を用いて確認した。
【００５２】
結果は、コントロール（被験物質を混和しないサンプル）を100％とし、コントロールに対するグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ生成率を百分率で表した。
【００５３】
また、「180mgのD-(+)-グリセルアルデヒド」を「360mgのＤ-グルコース（シグマ社より購入）」に代え、ＡＧＥ検出キットをヒトグルコース由来ＡＧＥポリクローナル抗体測定キット（株式会社アップウェル製）に代えたこと以外、同様にして、グルコース由来ＡＧＥの生成を調べた。結果は、コントロール（被験物質を混和しないサンプル）を100％とし、コントロールに対するグルコース由来ＡＧＥ生成率を百分率で表した。
【００５４】
これらの結果を合わせて、図１〜３に示す。図１は、アーモンド水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。図２は、アーモンド熱水抽出物を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。図３は、オレイン酸を用いた場合のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率をコントロールと比較したグラフである。各図とも、縦軸はグリセルアルデヒド由来ＡＧＥまたはグルコース由来ＡＧＥの生成率（％）を表す。図１および図２は、横軸のコントロール、グルコース由来ＡＧＥ、およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥのそれぞれについて、左側が100μg/ｍLの結果および右側が1mg/ｍLの結果を表す。図３は、横軸のコントロール、グルコース由来ＡＧＥ、およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥのそれぞれについて、100μg/ｍLオレイン酸の結果を表す。
【００５５】
これらの図に示されるように、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物とも、グリセルアルデヒドおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成を阻害した。グルコースおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成もまた阻害した。オレイン酸もまた、グリセルアルデヒドおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成、ならびにグルコースおよびＨＳＡによるＡＧＥの生成を阻害した。
【００５６】
（実施例３：ウシ周皮細胞アポトーシス抑制試験）
ウシ周皮細胞を、久留米大学医学部糖尿病性血管合併症診断・治療講座の山岸昌一教授から提供してもらった。ウシ周皮細胞を、250μg/ｍLのグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（実施例１で調製したＡＧＥ−２）または250μgのウシ血清アルブミン（シグマ社より購入）の存在下で、100μg/ｍLの被験物質と共に10日間培養した。10日間の培養後、細胞を溶解し、ENzyme-linked immunosorbant assay for DNA fragments (Cell Death Detection enzyme-linked immunosorbent assay, Roche Molecular Biochemicals社)を用いて生存細胞数を測定した。
【００５７】
この結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】
表３に示されるように、アーモンド水抽出物およびアーモンド熱水抽出物は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥによる細胞アポトーシスを抑制することが明らかになった。オレイン酸もまた、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥによる細胞アポトーシスを抑制した。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、終末糖化産物（ＡＧＥ）に結合し、ＡＧＥの生成を抑制し、そして細胞への毒性が強いと考えられるグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ（ＡＧＥ−２）による細胞アポトーシスを抑制し得る物質が提供される。本発明のアーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、例えば、糖尿病合併症（血管症、腎症、網膜症など）、神経障害、アルツハイマー病、動脈硬化症、悪性腫瘍、骨疾患、神経変性疾患、皮膚の老化などの疾患や症状の予防および治療に用いられ得る。本発明のアーモンド抽出物を含む抗糖化剤は、食物由来であるので、飲食品、医薬品、化粧品、石鹸、皮膚塗布剤、点鼻剤、坐剤などに安全に配合され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アーモンド抽出物を含む抗糖化剤。
【請求項１】
アーモンド抽出物を含む抗糖化剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−７２１０３（Ｐ２０１２−７２１０３Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２０００８（Ｐ２０１０−２２０００８）
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【出願人】（５０６３０７８０９）株式会社アップウェル (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【出願人】（５０６３０７８０９）株式会社アップウェル (9)
【Ｆターム（参考）】
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