イソプレノイドの生成
本発明は、微生物による、イソプレノイド、具体的にはコエンザイムＱ−１０の生成の方法に関する。より具体的には、本発明は、異なる微生物、好ましくはパラコッカス属、より好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス種由来のメバロン酸（ｍｅｖ）オペロンの１つ以上の遺伝子で形質転換され、それによってｍｅｖオペロンが変異して向上したコエンザイムＱ−１０生成につながるロドバクター属、好ましくはロドバクター・スフェロイデス種の微生物による、コエンザイムＱ−１０の向上した生成の方法に関する。かかる変異を担持する配列ならびにかかる変異ｍｅｖオペロンを担持する微生物もまた、含まれる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、イソプレノイド、具体的には微生物によるコエンザイムＱ−１０の生成の方法に関する。より具体的には、本発明は、異なる微生物由来、好ましくはパラコッカス属、より好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス種のメバロン酸（ｍｅｖ）オペロンの１つ以上の遺伝子で形質転換された、それによってｍｅｖオペロンが変異して、増大したコエンザイムＱ−１０生成につながるロドバクター属の微生物、好ましくはロドバクター・スフェロイデス（Ｒ.ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）種の微生物による、コエンザイムＱ−１０の増大した生成の方法に関する。かかる変異を担持する配列ならびにかかる変異ｍｅｖオペロンを担持する微生物もまた、含まれる。
【０００２】
コエンザイムＱ−１０（２，３−ジメトキシ−ジメチル−６−デカプレニル−１，４−ベンゾキノン）は、ユビキノン１０としても公知であり、１０個のＣ−５イソプレノイド単位で構成されるイソプレノイド側鎖を有する脂溶性ベンゾキノンである。コエンザイムＱ−１０（以下ＣｏＱ１０と略す）は、微生物および植物において、ならびに動物において見られる。これは、ヒトおよび殆どの哺乳動物における、ユビキノンの最も一般的な形態である。ＣｏＱ１０がヒトの健康状態および疾患からのその防御における重要な因子であるという、確立され、かつ発展中の証拠がある。ＣｏＱ１０の医学的および健康上の有益な効果は、その２つの主要な生理学的機能、すなわちミトコンドリアの電子伝達系（アデノシン三リン酸の合成に連結されている）の必須の補因子としての機能および脂溶性抗酸化物質としての作用と関連づけられている。
【０００３】
ＣｏＱ１０の健康上の利益により、この化合物の商業的重要性が高まった。ＣｏＱ１０は、化学合成によって、または微生物を用いた発酵によって生成され得る。これらの微生物は、遺伝子工学によってＣｏＱ１０生成に関して改良された天然のＣｏＱ１０生産者であり得るか、またはそれらは天然にＣｏＱ１０を生成し得ないが遺伝子工学によってそれを合成できるように操作され得る。
【０００４】
細菌においては、ユビキノンのイソプレノイド尾部はＣ−５化合物イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に由来するが、ユビキノンのキノイド環は芳香族化合物の生合成における中心的中間体であるコリスミ酸に由来する。キノイド環に付加されるイソプレノイド尾部の長さは、細菌中に存在する特定のプレニルトランスフェラーゼ酵素に依存する。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、オクタプレニルピロリン酸シンターゼが、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ、Ｃ−１５）および５個のＩＰＰ単位からのオクタプレニルピロリン酸（Ｃ−４０）の形成を触媒する。キノイド環へのこの分子の付加は、結果としてユビキノン−８の形成を生じる。パラコッカスおよびロドバクター種においては、デカプレニルピロリン酸（ＤＰＰ）シンターゼが、ＦＰＰ（Ｃ−１５）および７個のＩＰＰ単位からのＤＰＰ（Ｃ−５０）の形成を触媒する。次いで、キノイド環へのＤＰＰの付加が、結果としてユビキノン−１０（ＣｏＱ１０）の形成を生じる。
【０００５】
自然界においては、２つの異なる経路がＩＰＰの生合成で知られている（図１）。メバロン酸経路は、その名前が含意するように、中心的中間体としてメバロン酸を利用し、真核生物においてよく研究されている。メバロン酸経路は、長年の間、自然界におけるＩＰＰ合成の普遍的な経路と考えられてきた。しかしながら、この十年間に、非メバロン酸経路またはＭＥＰ経路（中間体として２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を有するため）と呼ばれるＩＰＰ生合成の第二の経路が発見された。ＭＥＰ経路は、これまでに、多くの真正細菌中および高等植物のプラスチド区画中に存在することが示されている。
【０００６】
ロドバクター・スフェロイデス中の、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードするｙａｅＭ遺伝子（現在ｉｓｐＣと呼ばれている）の存在および殆ど完了しているロドバクター・スフェロイデスのゲノム配列の精査に基づくと、この細菌は、ＩＰＰの生合成にＭＥＰ経路を排他的に使用するようである。ロドバクター・スフェロイデスにおけるＭＥＰ経路の排他的使用を支持するさらなる証拠は、密接に関連する種、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）が、イソプレノイド生合成にＭＥＰ経路のみを使用するという発見である。
【０００７】
国際公開第０２／２６９３３Ａ１号パンフレットは、ＭＥＰ経路の酵素のいくつかをコードする数個の天然および／または異種の遺伝子を過剰発現することによってロドバクター・スフェロイデスにおけるＣｏＱ１０の生成を増大させる方法を開示している。しかしながら、これらの遺伝子の過剰発現は、結果として、ＣｏＱ１０生成の、非常に穏当な改良を生じた。
【０００８】
上述のように、いくつかの細菌は、ＩＰＰの生合成に、メバロン酸経路のみを使用する。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスは、かかる細菌の一例である。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスにおいて、メバロン酸経路の５つの遺伝子をコードする遺伝子に加えてＩＰＰイソメラーゼをコードする遺伝子（図１参照）が、染色体上の単一の転写単位、すなわち以下メバロン酸（ｍｅｖ）オペロンと呼ばれるオペロンに、共にクラスター化される（フンベリン（Ｈｕｅｍｂｅｌｉｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２９７、１２９−１３９頁、２００２年）。
【０００９】
イソプレノイド、具体的にはＣｏＱ１０の生成は、ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を天然に欠損した、すなわち天然にイソプレノイド生成に非メバロン酸経路を使用する微生物への変異ｍｅｖオペロンの導入によって、相当に増大され得ることがわかっており、ここで、１つ以上の変異を含む、完全なｍｅｖオペロンまたは前記ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子のいずれかが導入され得る。１つ以上の変異は、例えば、以下の遺伝子の１つまたは全てにあり得る。ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードするｍｖａＡ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードするｉｄｉ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードするｈｃｓ、メバロン酸キナーゼをコードするｍｖｋ、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするｐｍｋ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするｍｖｄ。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性、メバロン酸キナーゼ活性、ホスホメバロン酸キナーゼ活性、および／またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を提供し、前記ポリヌクレオチド配列は、微生物中に存在する場合にイソプレノイドの向上した生成につながる１つ以上の変異を担持する。イソプレノイド生成の向上は、例えば、前記ポリヌクレオチド配列を担持しない、すなわちｍｅｖ経路を使用しない野生型微生物における生成と、本発明におけるポリヌクレオチド配列を担持する微生物との比較によって、測定され得る。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１または２から入手可能な、すなわち野生型ｍｅｖオペロンの遺伝子またはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列に関し、ここで断片は、ｍｅｖオペロンの遺伝子、例えばヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードするｍｖａＡ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードするｉｄｉ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードするｈｃｓ、メバロン酸キナーゼをコードするｍｖｋ、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするｐｍｋ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするｍｖｄの、少なくとも１つの活性を有する。好ましくは、変異ポリヌクレオチド配列は配列番号３またはその断片によって表され、微生物中に存在する場合に、例えばＣｏＱ１０生成の増大につながる。
【００１２】
ある態様において、本発明は、変異を担持するｍｅｖオペロンを含むＤＮＡ配列に関し、前記ＤＮＡ配列は配列番号３によって表される。
【００１３】
用語「向上したイソプレノイド生成」、具体的には向上したＣｏＱ１０生成は、本明細書中で使用される場合、例えば、それぞれの野生型ポリヌクレオチドを担持するそれぞれの微生物と比較した場合に、上述のように１つ以上の変異を含むポリヌクレオチドを担持する微生物によって得られる、少なくとも約１０％の増大を意味する。イソプレノイドの生成は、標準的な方法、例えばＨＰＬＣ（実施例２参照）によって測定され、ｍｇ／ｌで、またはｍｇ／ｌ／ＯＤ６００として表され得る（実施例５参照）。
【００１４】
完全なｍｅｖオペロンまたは１つ以上の変異を担持するその１つ以上の遺伝子は、例えば、完全に合成されるか、または部分的に単離および合成されるかのいずれかであり得る。単離されたｍｅｖオペロンまたはその１つ以上の遺伝子は、メバロン酸経路を使用する任意の微生物から生じ得、すなわち、ここで前記オペロン内に含まれる１つ以上の遺伝子は、天然に生じる。好ましくは、微生物はパラコッカス属に属し、より好ましくは、例えばパラコッカス種Ｒ１１４またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８等のパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）に由来する。完全に機能的であるオペロンのＤＮＡ配列の対立遺伝子の変異および突然変異もまた、上記の用語に含まれる。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８の完全なｍｅｖオペロンは配列番号１に示され、パラコッカス種Ｒ１１４の完全なｍｅｖオペロンは配列番号２に示される（国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの配列番号４２も参照）。
【００１５】
系統パラコッカス種Ｒ１１４は、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８の派生物であり、ブダペスト条約の合意の下、特許寄託名称ＰＴＡ−３３３５で２００１年４月２４日にＡＴＣＣと共に寄託されている。本発明に使用され得るパラコッカス種および系統ならびにパラコッカスとしてのフラボバクテリウム種の分類学的再分類に関しては、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレット、４７頁が参照される。使用され得るかかる種の例は、パラコッカス・マルクシイ（Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉ）、パラコッカス・カロチニファシエンス（Ｐ．ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・ソルベンティボランス（Ｐ．ｓｏｌｖｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスまたはパラコッカス種Ｒ１１４である。
【００１６】
本発明のｍｅｖオペロンは、オペロン内の任意の位置に位置し得る１つ以上の変異を担持し、前記オペロン内の１つ以上の遺伝子の活性の変化につながり、結果として、かかるポリヌクレオチドを担持する微生物内の、イソプレノイドの向上した生成を生じる。
【００１７】
ある実施形態において、ｍｅｖオペロンは少なくとも１つの変異を担持し、これは好ましくはｍｅｖオペロンのｈｃｓ遺伝子中、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのｍｅｖオペロンのｈｃｓ遺伝子中、例えばパラコッカス種Ｒ１１４またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８のｍｅｖオペロンのｈｃｓ遺伝子中に位置する。より好ましくは、変異ｍｅｖオペロンは、本発明において使用される場合、配列番号３によって表される。パラコッカス種Ｒ１１４の野生型ｈｃｓ遺伝子の配列およびそれぞれのタンパク質は、それぞれ配列番号４および５に示される。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は、ｈｃｓ遺伝子に１つ以上の変異を含むポリヌクレオチド、好ましくは配列番号７に示されるヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼを有するタンパク質をコードする、配列番号６に示されるポリヌクレオチドに関し、ここで配列番号５の９０位に存在するグルタミンはリシンに置換される。
【００１９】
したがって、ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を含む上述のようなポリヌクレオチド配列を提供することが本発明の目的であり、前記ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号７を一致させるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片または派生物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで前記派生物において、前記ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸残基が保存的に置換され、前記断片または派生物がヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（Ｈｃｓ）活性を有する、ポリヌクレオチド、
（ｄ）ストリンジェントな条件下でその相補鎖が（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドにハイブリダイズし、Ｈｃｓタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド
からなる群より選択される。
【００２０】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは、均質になるまで精製される。
【００２１】
用語「単離された」は、物質がその元々の環境（例えば、それが天然に生じる場合、天然の環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている微生物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に共存する物質の一部または全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、かつ／またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得、さらに、かかるベクターまたは組成物が天然の環境の一部でないという点で、単離され得る。
【００２２】
単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、本明細書中で使用される場合、それが由来する生物の天然に生じるゲノムにおいて直接隣接している（一方は５’末端で、一方は３'末端で）コード配列の両方に直接隣接していないＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。したがって、ある実施形態において、核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列の一部または全てを含む。用語「単離されたポリヌクレオチド」は、そのため、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたか、または他の配列から独立した分離した分子として存在する（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生じたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）、組み換えＤＮＡを含む。これはまた、実質的に細胞性物質、ウイルス性物質または培地（組み換えＤＮＡ技術によって生成された場合）または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成された場合）を含まないさらなるポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡを含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として天然に生じず、天然の状態で見られない核酸断片である。
【００２３】
遺伝子は、コード配列、例えば遺伝子のコード領域の３’および５’末端に位置する非翻訳配列等の非コード配列、ならびに制御配列を含み得る。さらに、遺伝子は、本明細書中に定義される単離された核酸分子をいう。タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が集団内に存在し得ることが、当業者によってさらに理解される。
【００２４】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、例えば配列番号６に示されるポリヌクレオチド等の本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズできる、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」は、互いに少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％〜９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明するよう意図される。
【００２６】
かかるハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃での１回以上の洗浄である。
【００２７】
高度にストリンジェントな条件としては、例えば、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡありもしくはなしのＤｉｇイージーハイブ（ＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ）溶液（ロシュ・ダイアグノスティクス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ））、または５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび２％ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ））を含有する溶液等の溶液中のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識システムを用いて調製される、ドイツ連邦共和国マンハイム６８２９８のロシュ・ダイアグノスティクス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、６８２９８Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いた２時間〜４日間４２℃でのインキュベーション、それに続く、５〜１５分２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中室温で２回のフィルターの洗浄ならびにそれに次ぐ１５〜３０分０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中６５〜６８℃で２回の洗浄が挙げられる。
【００２８】
当業者は、ストリンジェントおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のいずれの条件を適用すべきかを知るであろう。かかる条件に関するさらなる手引きは、当該分野において、例えばサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、モレキュラー・クローニング、ラボラトリー・マニュアル、ニューヨーク州のコールドスプリングハーバープレス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、１９９５年、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ニューヨークのジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．））において容易に入手可能である。勿論、（ｍＲＮＡの３’末端のポリ（Ａ）域等の）ポリ（Ａ）配列またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的伸展のみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドはポリ（Ａ）伸展またはその相補物を含む任意の核酸分子（例えば、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズするのに用いられる本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
【００２９】
本発明を、イソプレノイド、具体的にはユビキノン、好ましくはＣｏＱ１０の生成から使用し得る。好ましくは、１つ以上の変異を含むポリヌクレオチド、すなわち完全なｍｅｖオペロン、またはその断片のみが、ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子が元々欠損している、すなわちイソプレノイドの生成に天然にＭＥＰ経路のみを使用している、適した微生物に導入される。
【００３０】
変異ｍｅｖオペロンまたは上述のその１つ以上の遺伝子は、例えば、ロドバクター属の微生物に導入され得る。
【００３１】
具体的には、本発明は、（１）本発明におけるポリヌクレオチドを、前記ポリヌクレオチドを元々欠損している微生物に導入する工程、および（２）工程（１）の微生物を、イソプレノイドの生成を可能にする条件下で培養する工程を含む、イソプレノイド、具体的にはユビキノン、好ましくはＣｏＱ１０の生成の方法に関する。好ましくは、パラコッカス属に属する微生物の変異ｍｅｖオペロンまたはその断片が、ロドバクター属に属する微生物に導入される。より好ましくは、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子に１つ以上の変異を含むポリヌクレオチドが前記微生物に導入され、配列番号３によって表されるポリヌクレオチド配列の導入が最も好ましい。
【００３２】
ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を元々欠損している、すなわちイソプレノイドの生成にＭＥＰ経路を使用する任意の微生物が、本発明の目的のために使用され得る。具体的には、ロドバクター属の微生物が、例えばロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・アドリアティクス（Ｒ．ａｄｒｉａｔｉｃｕｓ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スルフィドフィルス（Ｒ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、またはロドバクター・ベルドカンピイ（Ｒ．ｖｅｌｄｋａｍｐｉｉ）等の、本発明における変異ポリヌクレオチドの導入に使用され得る。好ましい系統はロドバクター・スフェロイデスであり、ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３が、さらにより好ましい。
【００３３】
本明細書中に挙げられた微生物はまた、国際原核生物命名規約に定義される、同じ物理化学的特性を有するかかる種の異名または基礎異名も含むことが理解される。
【００３４】
本発明はさらに、上述のポリヌクレオチドを導入した、すなわち１つ以上の変異を担持するｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を含む、組み換え微生物を提供し、ここでそれぞれの野生型微生物は、元々ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を欠損しており、すなわちイソプレノイドの生成にＭＥＰ経路を使用しており、それぞれの野生型微生物と比較して、イソプレノイド、具体的にはユビキノン、好ましくはＣｏＱ１０の、向上した生成につながる。
【００３５】
上述のｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子内の変異の他に、組み換え微生物は、前記微生物内のイソプレノイドの生成の向上につながる限りは、さらなる修飾／変化を含み得る。
【００３６】
ある実施形態において、かかるさらなる修飾は、デカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の、好ましくはパラコッカス属の微生物、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス、具体的にはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８から入手可能な、前記組み換え微生物への導入である。配列番号８におけるポリヌクレオチド配列または配列番号９におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００３７】
したがって、本発明は、上述のような、デカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、ＭＥＰ経路を天然に使用していて上述のように導入された１つ以上の変異を含むｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を有する微生物、例えばロドバクター属の微生物にさらに導入される、イソプレノイド、好ましくはＣｏＱ１０の生成の方法に関する。
【００３８】
デカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする任意のＤＮＡ配列が、本発明に使用され得る。かかるＤＮＡの例は、パラコッカス属、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス、より好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８の微生物のデカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする、ｄｄｓＡ遺伝子またはその部分配列である。デカプレニル二リン酸シンターゼ（配列番号７）をコードする、配列番号６によって表されるパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子が最も好ましい。
【００３９】
したがって、（１）メバロン酸（ｍｅｖ）オペロン、およびパラコッカス属に属する微生物のデカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の両方を、ロドバクター属に属する微生物に導入する工程であって、ここで前記ｍｅｖオペロンが１つ以上の変異を担持する、工程、ならびに（２）修飾されたロドバクター系統を培養する工程を含む、ＣｏＱ１０の生成の方法を提供することは、本発明のある態様である。
【００４０】
用語「に導入する」は、本明細書および特許請求の範囲において、微生物または宿主生物、例えばロドバクター属の形質転換に関して、遺伝物質、具体的には変異メバロン酸オペロンまたは１つ以上のその遺伝子を宿主生物に効率的にもたらすよう、すなわち生物によって発現されるように使用され得る、当業者に周知の任意の方法を含むよう使用される。導入は、標準的な方法に従って、例えばベクター、好ましくは発現プラスミドによって、または宿主のゲノムへの組み込みによって、実施され得る。好ましい方法は、例えばＰｃｒｔＥプロモーター制御下の発現プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ（このプラスミドの構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの９１頁１２〜２７行目、実施例６に詳細に記載されている）にクローニングされる遺伝子等の、プラスミドを介した遺伝子の導入である。例えば発現プラスミド等のＤＮＡを、ロドバクター属の微生物に導入する好ましい方法は、例えばロドバクター系統への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１由来のプラスミドのコンジュゲーション転移等の、プラスミドのコンジュゲーション転移である（ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８、６１６９頁、１９９０年、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１９８３年、７８４−９１頁）。
【００４１】
ｍｅｖオペロンまたはその１つ以上の遺伝子の変異は、例えば、当業者が熟知していて具体的な説明を必要としない方法を用いた、ＰＣＲ部位特異的変異誘発によって生じ得る。さらなる変異誘発方法は、これも本発明の目的に用いられ得、当業者に公知であるが、例えば、ＵＶ照射、転位または化学的変異誘発を含む。増大したイソプレノイド、例えばＣｏＱ１０の生産性を示す変異の同定のためのスクリーニング方法は、例えば、ＵＶ光、ＨＰＬＣ、ＮＭＲまたは薄層クロマトグラフィーによる、イソプレノイド、例えばＣｏＱ１０の直接の測定から選択され得る。イソプレノイド、例えばＣｏＱ１０の生成はまた、当業者が熟知しているカロテノイド色強度の増大を測定することによって、間接的に測定され得る。
【００４２】
本発明における、変異ｍｅｖオペロンまたはその１つ以上の遺伝子で形質転換された宿主は、公知の方法に従って、すなわち、例えば宿主に同化され得る炭素および窒素源、無機塩等を含有する培地中、効率的な増殖および所望の生成物、具体的にはＣｏＱ１０の発現に適した温度、ｐＨおよび通気条件下で、培養され得る。
【００４３】
発酵培地および／または形質転換体、すなわち例えばパラコッカス属に属する微生物の変異メバロン酸オペロンが導入された微生物からの単離、ならびに任意に、例えばヒトまたは動物用途のためのかかる生成されたＣｏＱ１０の製剤化を含む得られたイソプレノイド、具体的にはＣｏＱ１０の、精製およびさらなる処理が、当該分野で周知の方法に従って実施され得る。しかしながら、動物の健康および栄養物摂取における使用のためには、特別の精製が必要でなくてもよい。この場合、ＣｏＱ１０のような生成されたイソプレノイドは、バイオマスおよび／または発酵培地の他の成分とともに、さらに処理されて商業的に魅力的な製品を生じ得る。
【００４４】
本発明の方法は、結果として、高収量の、例えばＣｏＱ１０等のイソプレノイドを生じる。増大は、例えばロドバクターの非組み換え系統を用いた、または例えば、例えばパラコッカス系統の野生型ｍｅｖオペロンを担持するロドバクター等の組み換え系統を用いた方法と比較して、例えば少なくとも約１０％であり得る。
【００４５】
以下の実施例は、本発明を全く制限することなく、本発明を説明する。
【００４６】
実施例１：細菌および培養条件
ロドバクター・スフェロイデス系統ＡＴＣＣ ３５０５３（アメリカ合衆国ヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ、ＵＳＡ）から入手）を、ＣｏＱ１０の向上した生成を有する組み換え系統の構築の基本宿主として用いた。全てのロドバクター・スフェロイデス系統を、３０℃で、培地ＲＳ１００中で増殖させた。培地ＲＳ１００の組成および調製を、表１に要約する。５０ｍｇ／ｌカナマイシンを、組み換え系統の増殖のために培地に添加した。大腸菌系統を３７℃、ＬＢ培地（アメリカ合衆国メリーランド州スパークスのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ））中で増殖させた。組み換え大腸菌系統中でのプラスミドの維持のために、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）および／またはカナマイシン（２５〜５０ｍｇ／ｌ、プラスミドによる）を、培地に添加した。大腸菌およびロドバクター・スフェロイデスの液体培養物を、通法により、ロータリーシェイカー中、２００ｒｐｍで好気的に増殖させた。固形培地が必要な場合は、寒天（１．５％終濃度）を添加した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
実施例２：ＣｏＱ１０の分析的アッセイ
４００μｌの全培地（実施例５参照）を、使い捨ての１５ｍｌポリプロピレン遠心チューブに移した。４ｍｌの滅菌抽出溶液（１：１（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／ＴＨＦ中の０．５ｇ／ｌ ＢＨＴ）を添加し、試料をラボラトリーシェイカー（ＩＫＡ、ドイツ連邦共和国（Ｇｅｒｍａｎｙ））中で２０分間混合し、抽出を促進した。最後に、試料を遠心分離し、逆相ＨＰＬＣによる分析のために、上清を琥珀色のガラスバイアルに移した。この方法は、カロテノイドのフィトエン、スフェロイデノン、スフェロイデンおよびニューロスポレンからのＣｏＱ１０の明らかな分離を有する、ユビキノンおよびその対応するヒドロキノンの同時測定のために開発された。温度制御自動サンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステム（アメリカ合衆国のアジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ））を用いて、クロマトグラフィーを行った。方法パラメータは、以下の通りである。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
実施例３：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスからの変異ｍｅｖオペロンのクローニング
プラスチドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４の構築
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４（メバロン酸オペロンの最初の４つの遺伝子を含むプラスミド）の構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例１３（１０５頁１０行目〜１０６頁８行目）に詳細に記載されている。
【００５２】
パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、プライマーｈｃｓ−５３２６（配列番号１０）およびｍｖｄ−９０００（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行う。プライマーｍｖｄ−９０００は配列番号２のヌクレオチド６９７７〜６９９６からの配列の逆の相補物に対応するが、プライマーｈｃｓ−５３２６は、配列番号２のヌクレオチド３３２１〜３３４０からのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスｍｅｖオペロンの配列に対応する。３６７５ｂｐの、得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））にクローニングし、結果としてプラスミドＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１−ｍｅｖ−ｏｐ−ｄ−３ｗｔを生じる。このため、このプラスミドは、ｈｃｓの３'末端ならびに最後の３つの遺伝子ｍｖｋ、ｐｍｋおよびｍｖｄを含むメバロン酸オペロンの下流半分を含む。
【００５３】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４およびＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１−ｍｅｖ−ｏｐ−ｄ−３ｗｔを、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＮｄｅＩで消化し、ＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１−ｍｅｖ−ｏｐ−ｄ−３ｗｔ由来の得られた３３１９ｂｐ断片を、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４由来の８０２７ｂｐ断片とライゲートする。得られたプラスミド、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４は、その（推定）プロモーターを含む、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来の完全なメバロン酸オペロンを含む。
【００５４】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥの構築
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥの構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例６（９２頁１０〜１７行目）に詳細に記載されている。プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥをＮａｅＩで切断し、１．３３ｋｂ断片を単離し、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４のＥｃｌ１３６ＩＩ部位に挿入した。挿入の方向をチェックし、メバロン酸オペロン遺伝子と同じ方向でｃｒｔＥ遺伝子を担持するプラスミドを、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥ−２と呼んだ。
【００５５】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥ−２をＳｐｈＩおよびＳｐｅＩで切断し、ｃｒｔＥ遺伝子を含む得られた５５６６ｂｐ断片を単離した。この断片を、同じ酵素を用いたｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔまたはｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４の制限消化後に得られた７１３２ｂｐのＳｐｈＩ−ＳｐｅＩ断片とライゲートし、結果としてプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥをそれぞれ生じた。
【００５６】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔの構築
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥの構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例６（９１頁１２〜２７行目）に詳細に記載されている。
【００５７】
パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス系統ＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子（ｄｄｓＡｗｔと呼ぶ）を、プライマーｄｄｓ−Ｎｄｅ（配列番号１２）およびｄｄｓ−Ｂａｍ（配列番号１３）を用いたＰＣＲ（ＧＣリッチＰＣＲシステム、ドイツ連邦共和国マンハイムのロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））によって増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））にクローニングし、結果としてプラスミドＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔを生じた。
【００５８】
プラスミドＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｄｄｓＡ遺伝子を含む１００５ｂｐの得られた断片を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥにクローニングし、結果としてプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを生じた。オリゴヌクレオチドｄｄｓ−Ｒ−１（配列番号１４）およびｄｄｓ−Ｒ−２（配列番号１５）を用いたクイックチェンジＸＬサイト・ディレクティド・ミュータジェネシス・キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ））でサイレント変異を導入することによって、ｄｄｓＡ遺伝子内のエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの認識部位を排除した。得られたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔ−Ｒを、ＥｃｏＲＩおよびＭａｍＩで切断し、ｄｄｓＡ遺伝子を含む断片１２７８ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで切断したＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔに挿入し、結果としてプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔ−Ｒを生じた。このプラスミドをＣｅｌＩＩおよびＸｂａＩで切断し、ｄｄｓＡ遺伝子を含む得られた１２１１ｂｐの断片を、ＣｅｌＩＩおよびＢｌｎＩでのｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥそれぞれの消化から得られた１１．６ｋｐの制限断片とライゲートした。得られたプラスミドを、それぞれｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔと名づけた。
【００５９】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔの構築
クイックチェンジＸＬサイト・ディレクティド・ミュータジェネシス・キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ））ならびにプライマーｍｕｔ４−８９−１−ｆｗ（配列番号１６）およびｍｕｔ４−８９−１−ｒｅｖ（配列番号１７）を用いた２回のＰＣＲ部位特異的変異誘発によって、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを得る。両方のプライマーは互いに相補的であり、配列番号４の２６８位に対応する配列番号３の２９４９位にＣの代わりに所望の変異Ａを含む。第一の変異誘発反応を、以下のように製造業者の使用説明書に従って設定する。５μｌの１０×反応バッファー、１０ｎｇのプラスミドＤＮＡｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔ、１２５ｎｇのプライマーｍｕｔ４−８９−１−ｆｗ、１２５ｎｇのｍｕｔ４−８９−１−ｒｅｖ、１μｌのｄＮＴＰミックス、３μｌのクイックソリューション（ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ）および２．５ＵのＰｆｕターボ（ＰｆｕＴｕｒｂｏ）ＤＮＡポリメラーゼを、５０μｌの最終体積で混合する。以下のパラメータを用いてサイクルを行う。１サイクル：９５℃１分、１８サイクル：９５℃５０秒、６０℃５０秒、６８℃３０分、１サイクル：６８℃７分。反応混合物を３７℃まで冷却した後、１０Ｕの制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩを添加し、反応物を３７℃で２時間インキュベートする。製造業者のプロトコルに従って、大腸菌ＸＬ１０−ゴールド・ウルトラコンポーネント（Ｇｏｌｄ Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）細胞（アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ））をＤｐｎＩ処理ＤＮＡで形質転換する。
【００６０】
得られたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを単離し、配列番号３の６９４８位でＴの代わりに所望の変異Ｃを含むプライマーｍｕｔ４−８９−２−ｆｗ（配列番号１８）およびｍｕｔ４−８９−２−ｒｅｖ（配列番号１９）を用いた二回目のＰＣＲ部位特異的変異誘発の鋳型ＤＮＡとして使用する。上述のように変異誘発を行う。得られたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを単離し、マイクロシンス・ゲーエムベーハー（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＧｍｂＨ）（スイス連邦バルガッハ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））で配列決定した。変異ｍｅｖオペロンの完全な配列は配列番号３に表され、以下の遺伝子を含む。６１７〜１６３９位のｍｖａＡ（ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードする）、１６３６〜２６８５位のｉｄｉ（イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする）、２６８２〜３８４８位のｈｃｓ（ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードする）、３８２９〜４９６５位のｍｖｋ（メバロン酸キナーゼをコードする）、４９６５〜５８８２位のｐｍｋ（ホスホメバロン酸キナーゼをコードする）、および５８７５〜６８７３位のｍｖｄ（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする）。
【００６１】
実施例４：ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３への変異ｍｅｖオペロンの導入
変異ｍｅｖオペロンを担持するプラスミドでの大腸菌Ｓ１７−１の形質転換（サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１１、７８４−７９１頁、１９８３年）、およびそれに続く、コンジュゲーションによる大腸菌Ｓ１７−１からロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３へのプラスミドの転移を、標準的な手順を用いて行った（ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８、６１６９頁、１９９０年、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１９８３年、７８４−９１頁）。
【００６２】
１００ｍｇ／ｌリファンピシンを補給したＲＳ１００液体培地中で系統ＡＴＣＣ３５０５３を増殖させること、１００ｍｇ／ｌリファンピシンを含むＲＳ１００プレート上に細胞を平板培養すること、およびシングルコロニーを単離することによって、ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３の自然発生リファンピシン耐性突然変異をまず単離した。コンジュゲーションのために、１００ｍｇ／ｌのリファンピシンおよびドナー細胞（５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地中で増殖させた、転移されるプラスミドを担持する大腸菌Ｓ１７−１）を含有するＲＳ１００培地中で増殖させたレシピエント細胞（リファンピシン耐性ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３）の培養物の１ミリリットルのアリコートを、遠心分離によってペレット化した。上清を廃棄し、新鮮なＲＳ１００培地で細胞を２回洗浄して抗生物質を除去した。次いで、１ｍｌの新鮮なＲＳ１００培地に各ペレットを再懸濁した。５０μｌのドナー細胞および０．４５ｍｌのレシピエント細胞を混合し、遠心分離によってペレット化し、０．０３ｍｌの新鮮なＲＳ１００培地に再懸濁し、ＲＳ１００プレート上に点在させた。３０℃で一晩のインキュベーションの後、接種ループで細胞を採取し、０．３ｍｌのＲＳ１００培地に再懸濁した。この懸濁液の希釈溶液を、１００ｍｇ／ｌリファンピシンおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＲＳ１００プレート上に広げ、３０℃でインキュベーションした。コロニー（ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３の、推定の形質転換細胞）をプレートから選び取り、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有する液体ＲＳ１００培地中で増殖させ、５６℃のアニーリング温度および以下の２つの異なるプライマー対を用いた１分、１５秒の伸長時間でＰＣＲ反応においてプラスミドの存在を試験した。
ｐＢＢＲ−Ｋ−ｕｐ（配列番号２０）／ＰｃｒｔＥ−２４４２（配列番号２１）
Ｋａｎ３ｏｕｔ（配列番号２２）／ｍｖａＡ３２５６（配列番号２３）
【００６３】
５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＲＳ１００プレート上に、陽性のクローンで筋をつけ、シングルコロニーを得た。各クローン由来の１つのシングルコロニーを、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有する液体ＲＳ１００培地中で再度増殖させ、上述のように、期待されるプラスミドの存在をＰＣＲによって確認した。得られた組み換え系統を、ＡＴＣＣ３５０５３／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔと呼んだ。
【００６４】
実施例５：ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３の形質転換系統におけるＣｏＱ１０の生成
ロドバクター・スフェロイデス系統ＡＴＣＣ３５０５３、ＡＴＣＣ３５０５３／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびＡＴＣＣ３５０５３／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを、ＲＳ１００培地中の振とうフラスコ培養において増殖させた。組み換えロドバクター・スフェロイデスを含む培養物は、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含んでいた。２５ｍｌの培養物を３０℃で２５０ｍｌのバッフル三角フラスコ中、２００ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。ＣｏＱ１０生成を試験するために、ロドバクター・スフェロイデス系統の凍結したグリセロール化ストック培養物を用い、２５ｍｌの種培養物を接種した。２４〜２８時間の種培養物の増殖の後、適した体積の培養物を用いて、６６０ナノメートルでの初期光学密度（ＯＤ６６０）が０．１６であるように、実験フラスコを接種した。２ｍｌの試料を、２４時間間隔で無菌的に採取した。分析は、増殖（ＯＤ６６０として測定される）、ｐＨ、培養物上清中のグルコースならびに実施例２に記載されるＣｏＱ１０およびカロテノイド（ＨＰＬＣによって測定される）を含んだ。結果を表３に要約する。これらの結果は、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス由来のクローン化変異メバロン酸オペロンの発現がロドバクター・スフェロイデスにおけるＣｏＱ１０生成を有意に向上させたことを明らかに示す。
【００６５】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ロドバクター・スフェロイデスにおけるＣｏＱ１０生合成の経路を表し、これはＩＰＰ形成にＭＥＰ経路を使用する。囲まれた領域は、（ＩＰＰの形成につながる）メバロン酸経路に加えてＩＰＰイソメラーゼ段階を含む、反応順序を示す。メバロン酸経路は、ロドバクター・スフェロイデスにおいては天然に生じない。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスにおいては、メバロン酸経路の５つの酵素に加えてＩＰＰイソメラーゼをコードする遺伝子が、以下メバロン酸オペロンと呼ばれる、オペロンを形成する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、イソプレノイド、具体的には微生物によるコエンザイムＱ−１０の生成の方法に関する。より具体的には、本発明は、異なる微生物由来、好ましくはパラコッカス属、より好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス種のメバロン酸（ｍｅｖ）オペロンの１つ以上の遺伝子で形質転換された、それによってｍｅｖオペロンが変異して、増大したコエンザイムＱ−１０生成につながるロドバクター属の微生物、好ましくはロドバクター・スフェロイデス（Ｒ.ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）種の微生物による、コエンザイムＱ−１０の増大した生成の方法に関する。かかる変異を担持する配列ならびにかかる変異ｍｅｖオペロンを担持する微生物もまた、含まれる。
【０００２】
コエンザイムＱ−１０（２，３−ジメトキシ−ジメチル−６−デカプレニル−１，４−ベンゾキノン）は、ユビキノン１０としても公知であり、１０個のＣ−５イソプレノイド単位で構成されるイソプレノイド側鎖を有する脂溶性ベンゾキノンである。コエンザイムＱ−１０（以下ＣｏＱ１０と略す）は、微生物および植物において、ならびに動物において見られる。これは、ヒトおよび殆どの哺乳動物における、ユビキノンの最も一般的な形態である。ＣｏＱ１０がヒトの健康状態および疾患からのその防御における重要な因子であるという、確立され、かつ発展中の証拠がある。ＣｏＱ１０の医学的および健康上の有益な効果は、その２つの主要な生理学的機能、すなわちミトコンドリアの電子伝達系（アデノシン三リン酸の合成に連結されている）の必須の補因子としての機能および脂溶性抗酸化物質としての作用と関連づけられている。
【０００３】
ＣｏＱ１０の健康上の利益により、この化合物の商業的重要性が高まった。ＣｏＱ１０は、化学合成によって、または微生物を用いた発酵によって生成され得る。これらの微生物は、遺伝子工学によってＣｏＱ１０生成に関して改良された天然のＣｏＱ１０生産者であり得るか、またはそれらは天然にＣｏＱ１０を生成し得ないが遺伝子工学によってそれを合成できるように操作され得る。
【０００４】
細菌においては、ユビキノンのイソプレノイド尾部はＣ−５化合物イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に由来するが、ユビキノンのキノイド環は芳香族化合物の生合成における中心的中間体であるコリスミ酸に由来する。キノイド環に付加されるイソプレノイド尾部の長さは、細菌中に存在する特定のプレニルトランスフェラーゼ酵素に依存する。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、オクタプレニルピロリン酸シンターゼが、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ、Ｃ−１５）および５個のＩＰＰ単位からのオクタプレニルピロリン酸（Ｃ−４０）の形成を触媒する。キノイド環へのこの分子の付加は、結果としてユビキノン−８の形成を生じる。パラコッカスおよびロドバクター種においては、デカプレニルピロリン酸（ＤＰＰ）シンターゼが、ＦＰＰ（Ｃ−１５）および７個のＩＰＰ単位からのＤＰＰ（Ｃ−５０）の形成を触媒する。次いで、キノイド環へのＤＰＰの付加が、結果としてユビキノン−１０（ＣｏＱ１０）の形成を生じる。
【０００５】
自然界においては、２つの異なる経路がＩＰＰの生合成で知られている（図１）。メバロン酸経路は、その名前が含意するように、中心的中間体としてメバロン酸を利用し、真核生物においてよく研究されている。メバロン酸経路は、長年の間、自然界におけるＩＰＰ合成の普遍的な経路と考えられてきた。しかしながら、この十年間に、非メバロン酸経路またはＭＥＰ経路（中間体として２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を有するため）と呼ばれるＩＰＰ生合成の第二の経路が発見された。ＭＥＰ経路は、これまでに、多くの真正細菌中および高等植物のプラスチド区画中に存在することが示されている。
【０００６】
ロドバクター・スフェロイデス中の、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードするｙａｅＭ遺伝子（現在ｉｓｐＣと呼ばれている）の存在および殆ど完了しているロドバクター・スフェロイデスのゲノム配列の精査に基づくと、この細菌は、ＩＰＰの生合成にＭＥＰ経路を排他的に使用するようである。ロドバクター・スフェロイデスにおけるＭＥＰ経路の排他的使用を支持するさらなる証拠は、密接に関連する種、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）が、イソプレノイド生合成にＭＥＰ経路のみを使用するという発見である。
【０００７】
国際公開第０２／２６９３３Ａ１号パンフレットは、ＭＥＰ経路の酵素のいくつかをコードする数個の天然および／または異種の遺伝子を過剰発現することによってロドバクター・スフェロイデスにおけるＣｏＱ１０の生成を増大させる方法を開示している。しかしながら、これらの遺伝子の過剰発現は、結果として、ＣｏＱ１０生成の、非常に穏当な改良を生じた。
【０００８】
上述のように、いくつかの細菌は、ＩＰＰの生合成に、メバロン酸経路のみを使用する。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスは、かかる細菌の一例である。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスにおいて、メバロン酸経路の５つの遺伝子をコードする遺伝子に加えてＩＰＰイソメラーゼをコードする遺伝子（図１参照）が、染色体上の単一の転写単位、すなわち以下メバロン酸（ｍｅｖ）オペロンと呼ばれるオペロンに、共にクラスター化される（フンベリン（Ｈｕｅｍｂｅｌｉｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２９７、１２９−１３９頁、２００２年）。
【０００９】
イソプレノイド、具体的にはＣｏＱ１０の生成は、ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を天然に欠損した、すなわち天然にイソプレノイド生成に非メバロン酸経路を使用する微生物への変異ｍｅｖオペロンの導入によって、相当に増大され得ることがわかっており、ここで、１つ以上の変異を含む、完全なｍｅｖオペロンまたは前記ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子のいずれかが導入され得る。１つ以上の変異は、例えば、以下の遺伝子の１つまたは全てにあり得る。ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードするｍｖａＡ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードするｉｄｉ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードするｈｃｓ、メバロン酸キナーゼをコードするｍｖｋ、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするｐｍｋ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするｍｖｄ。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性、メバロン酸キナーゼ活性、ホスホメバロン酸キナーゼ活性、および／またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を提供し、前記ポリヌクレオチド配列は、微生物中に存在する場合にイソプレノイドの向上した生成につながる１つ以上の変異を担持する。イソプレノイド生成の向上は、例えば、前記ポリヌクレオチド配列を担持しない、すなわちｍｅｖ経路を使用しない野生型微生物における生成と、本発明におけるポリヌクレオチド配列を担持する微生物との比較によって、測定され得る。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１または２から入手可能な、すなわち野生型ｍｅｖオペロンの遺伝子またはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列に関し、ここで断片は、ｍｅｖオペロンの遺伝子、例えばヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードするｍｖａＡ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードするｉｄｉ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードするｈｃｓ、メバロン酸キナーゼをコードするｍｖｋ、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするｐｍｋ、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするｍｖｄの、少なくとも１つの活性を有する。好ましくは、変異ポリヌクレオチド配列は配列番号３またはその断片によって表され、微生物中に存在する場合に、例えばＣｏＱ１０生成の増大につながる。
【００１２】
ある態様において、本発明は、変異を担持するｍｅｖオペロンを含むＤＮＡ配列に関し、前記ＤＮＡ配列は配列番号３によって表される。
【００１３】
用語「向上したイソプレノイド生成」、具体的には向上したＣｏＱ１０生成は、本明細書中で使用される場合、例えば、それぞれの野生型ポリヌクレオチドを担持するそれぞれの微生物と比較した場合に、上述のように１つ以上の変異を含むポリヌクレオチドを担持する微生物によって得られる、少なくとも約１０％の増大を意味する。イソプレノイドの生成は、標準的な方法、例えばＨＰＬＣ（実施例２参照）によって測定され、ｍｇ／ｌで、またはｍｇ／ｌ／ＯＤ６００として表され得る（実施例５参照）。
【００１４】
完全なｍｅｖオペロンまたは１つ以上の変異を担持するその１つ以上の遺伝子は、例えば、完全に合成されるか、または部分的に単離および合成されるかのいずれかであり得る。単離されたｍｅｖオペロンまたはその１つ以上の遺伝子は、メバロン酸経路を使用する任意の微生物から生じ得、すなわち、ここで前記オペロン内に含まれる１つ以上の遺伝子は、天然に生じる。好ましくは、微生物はパラコッカス属に属し、より好ましくは、例えばパラコッカス種Ｒ１１４またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８等のパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）に由来する。完全に機能的であるオペロンのＤＮＡ配列の対立遺伝子の変異および突然変異もまた、上記の用語に含まれる。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８の完全なｍｅｖオペロンは配列番号１に示され、パラコッカス種Ｒ１１４の完全なｍｅｖオペロンは配列番号２に示される（国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの配列番号４２も参照）。
【００１５】
系統パラコッカス種Ｒ１１４は、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８の派生物であり、ブダペスト条約の合意の下、特許寄託名称ＰＴＡ−３３３５で２００１年４月２４日にＡＴＣＣと共に寄託されている。本発明に使用され得るパラコッカス種および系統ならびにパラコッカスとしてのフラボバクテリウム種の分類学的再分類に関しては、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレット、４７頁が参照される。使用され得るかかる種の例は、パラコッカス・マルクシイ（Ｐ．ｍａｒｃｕｓｉｉ）、パラコッカス・カロチニファシエンス（Ｐ．ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・ソルベンティボランス（Ｐ．ｓｏｌｖｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスまたはパラコッカス種Ｒ１１４である。
【００１６】
本発明のｍｅｖオペロンは、オペロン内の任意の位置に位置し得る１つ以上の変異を担持し、前記オペロン内の１つ以上の遺伝子の活性の変化につながり、結果として、かかるポリヌクレオチドを担持する微生物内の、イソプレノイドの向上した生成を生じる。
【００１７】
ある実施形態において、ｍｅｖオペロンは少なくとも１つの変異を担持し、これは好ましくはｍｅｖオペロンのｈｃｓ遺伝子中、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのｍｅｖオペロンのｈｃｓ遺伝子中、例えばパラコッカス種Ｒ１１４またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８のｍｅｖオペロンのｈｃｓ遺伝子中に位置する。より好ましくは、変異ｍｅｖオペロンは、本発明において使用される場合、配列番号３によって表される。パラコッカス種Ｒ１１４の野生型ｈｃｓ遺伝子の配列およびそれぞれのタンパク質は、それぞれ配列番号４および５に示される。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は、ｈｃｓ遺伝子に１つ以上の変異を含むポリヌクレオチド、好ましくは配列番号７に示されるヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼを有するタンパク質をコードする、配列番号６に示されるポリヌクレオチドに関し、ここで配列番号５の９０位に存在するグルタミンはリシンに置換される。
【００１９】
したがって、ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を含む上述のようなポリヌクレオチド配列を提供することが本発明の目的であり、前記ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号７を一致させるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片または派生物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで前記派生物において、前記ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸残基が保存的に置換され、前記断片または派生物がヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（Ｈｃｓ）活性を有する、ポリヌクレオチド、
（ｄ）ストリンジェントな条件下でその相補鎖が（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドにハイブリダイズし、Ｈｃｓタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド
からなる群より選択される。
【００２０】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは、均質になるまで精製される。
【００２１】
用語「単離された」は、物質がその元々の環境（例えば、それが天然に生じる場合、天然の環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている微生物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に共存する物質の一部または全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、かつ／またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得、さらに、かかるベクターまたは組成物が天然の環境の一部でないという点で、単離され得る。
【００２２】
単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、本明細書中で使用される場合、それが由来する生物の天然に生じるゲノムにおいて直接隣接している（一方は５’末端で、一方は３'末端で）コード配列の両方に直接隣接していないＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。したがって、ある実施形態において、核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列の一部または全てを含む。用語「単離されたポリヌクレオチド」は、そのため、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたか、または他の配列から独立した分離した分子として存在する（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生じたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）、組み換えＤＮＡを含む。これはまた、実質的に細胞性物質、ウイルス性物質または培地（組み換えＤＮＡ技術によって生成された場合）または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成された場合）を含まないさらなるポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡを含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として天然に生じず、天然の状態で見られない核酸断片である。
【００２３】
遺伝子は、コード配列、例えば遺伝子のコード領域の３’および５’末端に位置する非翻訳配列等の非コード配列、ならびに制御配列を含み得る。さらに、遺伝子は、本明細書中に定義される単離された核酸分子をいう。タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が集団内に存在し得ることが、当業者によってさらに理解される。
【００２４】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、例えば配列番号６に示されるポリヌクレオチド等の本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズできる、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」は、互いに少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％〜９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明するよう意図される。
【００２６】
かかるハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃での１回以上の洗浄である。
【００２７】
高度にストリンジェントな条件としては、例えば、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡありもしくはなしのＤｉｇイージーハイブ（ＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ）溶液（ロシュ・ダイアグノスティクス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ））、または５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび２％ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ））を含有する溶液等の溶液中のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識システムを用いて調製される、ドイツ連邦共和国マンハイム６８２９８のロシュ・ダイアグノスティクス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、６８２９８Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いた２時間〜４日間４２℃でのインキュベーション、それに続く、５〜１５分２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中室温で２回のフィルターの洗浄ならびにそれに次ぐ１５〜３０分０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中６５〜６８℃で２回の洗浄が挙げられる。
【００２８】
当業者は、ストリンジェントおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のいずれの条件を適用すべきかを知るであろう。かかる条件に関するさらなる手引きは、当該分野において、例えばサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、モレキュラー・クローニング、ラボラトリー・マニュアル、ニューヨーク州のコールドスプリングハーバープレス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、１９９５年、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ニューヨークのジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．））において容易に入手可能である。勿論、（ｍＲＮＡの３’末端のポリ（Ａ）域等の）ポリ（Ａ）配列またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的伸展のみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドはポリ（Ａ）伸展またはその相補物を含む任意の核酸分子（例えば、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズするのに用いられる本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
【００２９】
本発明を、イソプレノイド、具体的にはユビキノン、好ましくはＣｏＱ１０の生成から使用し得る。好ましくは、１つ以上の変異を含むポリヌクレオチド、すなわち完全なｍｅｖオペロン、またはその断片のみが、ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子が元々欠損している、すなわちイソプレノイドの生成に天然にＭＥＰ経路のみを使用している、適した微生物に導入される。
【００３０】
変異ｍｅｖオペロンまたは上述のその１つ以上の遺伝子は、例えば、ロドバクター属の微生物に導入され得る。
【００３１】
具体的には、本発明は、（１）本発明におけるポリヌクレオチドを、前記ポリヌクレオチドを元々欠損している微生物に導入する工程、および（２）工程（１）の微生物を、イソプレノイドの生成を可能にする条件下で培養する工程を含む、イソプレノイド、具体的にはユビキノン、好ましくはＣｏＱ１０の生成の方法に関する。好ましくは、パラコッカス属に属する微生物の変異ｍｅｖオペロンまたはその断片が、ロドバクター属に属する微生物に導入される。より好ましくは、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子に１つ以上の変異を含むポリヌクレオチドが前記微生物に導入され、配列番号３によって表されるポリヌクレオチド配列の導入が最も好ましい。
【００３２】
ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を元々欠損している、すなわちイソプレノイドの生成にＭＥＰ経路を使用する任意の微生物が、本発明の目的のために使用され得る。具体的には、ロドバクター属の微生物が、例えばロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・アドリアティクス（Ｒ．ａｄｒｉａｔｉｃｕｓ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スルフィドフィルス（Ｒ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、またはロドバクター・ベルドカンピイ（Ｒ．ｖｅｌｄｋａｍｐｉｉ）等の、本発明における変異ポリヌクレオチドの導入に使用され得る。好ましい系統はロドバクター・スフェロイデスであり、ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３が、さらにより好ましい。
【００３３】
本明細書中に挙げられた微生物はまた、国際原核生物命名規約に定義される、同じ物理化学的特性を有するかかる種の異名または基礎異名も含むことが理解される。
【００３４】
本発明はさらに、上述のポリヌクレオチドを導入した、すなわち１つ以上の変異を担持するｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を含む、組み換え微生物を提供し、ここでそれぞれの野生型微生物は、元々ｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を欠損しており、すなわちイソプレノイドの生成にＭＥＰ経路を使用しており、それぞれの野生型微生物と比較して、イソプレノイド、具体的にはユビキノン、好ましくはＣｏＱ１０の、向上した生成につながる。
【００３５】
上述のｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子内の変異の他に、組み換え微生物は、前記微生物内のイソプレノイドの生成の向上につながる限りは、さらなる修飾／変化を含み得る。
【００３６】
ある実施形態において、かかるさらなる修飾は、デカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の、好ましくはパラコッカス属の微生物、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス、具体的にはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８から入手可能な、前記組み換え微生物への導入である。配列番号８におけるポリヌクレオチド配列または配列番号９におけるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００３７】
したがって、本発明は、上述のような、デカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、ＭＥＰ経路を天然に使用していて上述のように導入された１つ以上の変異を含むｍｅｖオペロンの１つ以上の遺伝子を有する微生物、例えばロドバクター属の微生物にさらに導入される、イソプレノイド、好ましくはＣｏＱ１０の生成の方法に関する。
【００３８】
デカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする任意のＤＮＡ配列が、本発明に使用され得る。かかるＤＮＡの例は、パラコッカス属、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス、より好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８の微生物のデカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする、ｄｄｓＡ遺伝子またはその部分配列である。デカプレニル二リン酸シンターゼ（配列番号７）をコードする、配列番号６によって表されるパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子が最も好ましい。
【００３９】
したがって、（１）メバロン酸（ｍｅｖ）オペロン、およびパラコッカス属に属する微生物のデカプレニル二リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の両方を、ロドバクター属に属する微生物に導入する工程であって、ここで前記ｍｅｖオペロンが１つ以上の変異を担持する、工程、ならびに（２）修飾されたロドバクター系統を培養する工程を含む、ＣｏＱ１０の生成の方法を提供することは、本発明のある態様である。
【００４０】
用語「に導入する」は、本明細書および特許請求の範囲において、微生物または宿主生物、例えばロドバクター属の形質転換に関して、遺伝物質、具体的には変異メバロン酸オペロンまたは１つ以上のその遺伝子を宿主生物に効率的にもたらすよう、すなわち生物によって発現されるように使用され得る、当業者に周知の任意の方法を含むよう使用される。導入は、標準的な方法に従って、例えばベクター、好ましくは発現プラスミドによって、または宿主のゲノムへの組み込みによって、実施され得る。好ましい方法は、例えばＰｃｒｔＥプロモーター制御下の発現プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ（このプラスミドの構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの９１頁１２〜２７行目、実施例６に詳細に記載されている）にクローニングされる遺伝子等の、プラスミドを介した遺伝子の導入である。例えば発現プラスミド等のＤＮＡを、ロドバクター属の微生物に導入する好ましい方法は、例えばロドバクター系統への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１由来のプラスミドのコンジュゲーション転移等の、プラスミドのコンジュゲーション転移である（ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８、６１６９頁、１９９０年、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１９８３年、７８４−９１頁）。
【００４１】
ｍｅｖオペロンまたはその１つ以上の遺伝子の変異は、例えば、当業者が熟知していて具体的な説明を必要としない方法を用いた、ＰＣＲ部位特異的変異誘発によって生じ得る。さらなる変異誘発方法は、これも本発明の目的に用いられ得、当業者に公知であるが、例えば、ＵＶ照射、転位または化学的変異誘発を含む。増大したイソプレノイド、例えばＣｏＱ１０の生産性を示す変異の同定のためのスクリーニング方法は、例えば、ＵＶ光、ＨＰＬＣ、ＮＭＲまたは薄層クロマトグラフィーによる、イソプレノイド、例えばＣｏＱ１０の直接の測定から選択され得る。イソプレノイド、例えばＣｏＱ１０の生成はまた、当業者が熟知しているカロテノイド色強度の増大を測定することによって、間接的に測定され得る。
【００４２】
本発明における、変異ｍｅｖオペロンまたはその１つ以上の遺伝子で形質転換された宿主は、公知の方法に従って、すなわち、例えば宿主に同化され得る炭素および窒素源、無機塩等を含有する培地中、効率的な増殖および所望の生成物、具体的にはＣｏＱ１０の発現に適した温度、ｐＨおよび通気条件下で、培養され得る。
【００４３】
発酵培地および／または形質転換体、すなわち例えばパラコッカス属に属する微生物の変異メバロン酸オペロンが導入された微生物からの単離、ならびに任意に、例えばヒトまたは動物用途のためのかかる生成されたＣｏＱ１０の製剤化を含む得られたイソプレノイド、具体的にはＣｏＱ１０の、精製およびさらなる処理が、当該分野で周知の方法に従って実施され得る。しかしながら、動物の健康および栄養物摂取における使用のためには、特別の精製が必要でなくてもよい。この場合、ＣｏＱ１０のような生成されたイソプレノイドは、バイオマスおよび／または発酵培地の他の成分とともに、さらに処理されて商業的に魅力的な製品を生じ得る。
【００４４】
本発明の方法は、結果として、高収量の、例えばＣｏＱ１０等のイソプレノイドを生じる。増大は、例えばロドバクターの非組み換え系統を用いた、または例えば、例えばパラコッカス系統の野生型ｍｅｖオペロンを担持するロドバクター等の組み換え系統を用いた方法と比較して、例えば少なくとも約１０％であり得る。
【００４５】
以下の実施例は、本発明を全く制限することなく、本発明を説明する。
【００４６】
実施例１：細菌および培養条件
ロドバクター・スフェロイデス系統ＡＴＣＣ ３５０５３（アメリカ合衆国ヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ、ＵＳＡ）から入手）を、ＣｏＱ１０の向上した生成を有する組み換え系統の構築の基本宿主として用いた。全てのロドバクター・スフェロイデス系統を、３０℃で、培地ＲＳ１００中で増殖させた。培地ＲＳ１００の組成および調製を、表１に要約する。５０ｍｇ／ｌカナマイシンを、組み換え系統の増殖のために培地に添加した。大腸菌系統を３７℃、ＬＢ培地（アメリカ合衆国メリーランド州スパークスのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ））中で増殖させた。組み換え大腸菌系統中でのプラスミドの維持のために、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）および／またはカナマイシン（２５〜５０ｍｇ／ｌ、プラスミドによる）を、培地に添加した。大腸菌およびロドバクター・スフェロイデスの液体培養物を、通法により、ロータリーシェイカー中、２００ｒｐｍで好気的に増殖させた。固形培地が必要な場合は、寒天（１．５％終濃度）を添加した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
実施例２：ＣｏＱ１０の分析的アッセイ
４００μｌの全培地（実施例５参照）を、使い捨ての１５ｍｌポリプロピレン遠心チューブに移した。４ｍｌの滅菌抽出溶液（１：１（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／ＴＨＦ中の０．５ｇ／ｌ ＢＨＴ）を添加し、試料をラボラトリーシェイカー（ＩＫＡ、ドイツ連邦共和国（Ｇｅｒｍａｎｙ））中で２０分間混合し、抽出を促進した。最後に、試料を遠心分離し、逆相ＨＰＬＣによる分析のために、上清を琥珀色のガラスバイアルに移した。この方法は、カロテノイドのフィトエン、スフェロイデノン、スフェロイデンおよびニューロスポレンからのＣｏＱ１０の明らかな分離を有する、ユビキノンおよびその対応するヒドロキノンの同時測定のために開発された。温度制御自動サンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステム（アメリカ合衆国のアジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ））を用いて、クロマトグラフィーを行った。方法パラメータは、以下の通りである。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
実施例３：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスからの変異ｍｅｖオペロンのクローニング
プラスチドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４の構築
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４（メバロン酸オペロンの最初の４つの遺伝子を含むプラスミド）の構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例１３（１０５頁１０行目〜１０６頁８行目）に詳細に記載されている。
【００５２】
パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、プライマーｈｃｓ−５３２６（配列番号１０）およびｍｖｄ−９０００（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行う。プライマーｍｖｄ−９０００は配列番号２のヌクレオチド６９７７〜６９９６からの配列の逆の相補物に対応するが、プライマーｈｃｓ−５３２６は、配列番号２のヌクレオチド３３２１〜３３４０からのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスｍｅｖオペロンの配列に対応する。３６７５ｂｐの、得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））にクローニングし、結果としてプラスミドＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１−ｍｅｖ−ｏｐ−ｄ−３ｗｔを生じる。このため、このプラスミドは、ｈｃｓの３'末端ならびに最後の３つの遺伝子ｍｖｋ、ｐｍｋおよびｍｖｄを含むメバロン酸オペロンの下流半分を含む。
【００５３】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４およびＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１−ｍｅｖ−ｏｐ−ｄ−３ｗｔを、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＮｄｅＩで消化し、ＴＯＰＯ−ｐＣＲ２．１−ｍｅｖ−ｏｐ−ｄ−３ｗｔ由来の得られた３３１９ｂｐ断片を、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４由来の８０２７ｂｐ断片とライゲートする。得られたプラスミド、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４は、その（推定）プロモーターを含む、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来の完全なメバロン酸オペロンを含む。
【００５４】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥの構築
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥの構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例６（９２頁１０〜１７行目）に詳細に記載されている。プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥをＮａｅＩで切断し、１．３３ｋｂ断片を単離し、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４のＥｃｌ１３６ＩＩ部位に挿入した。挿入の方向をチェックし、メバロン酸オペロン遺伝子と同じ方向でｃｒｔＥ遺伝子を担持するプラスミドを、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥ−２と呼んだ。
【００５５】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｕｐ−４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥ−２をＳｐｈＩおよびＳｐｅＩで切断し、ｃｒｔＥ遺伝子を含む得られた５５６６ｂｐ断片を単離した。この断片を、同じ酵素を用いたｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔまたはｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４の制限消化後に得られた７１３２ｂｐのＳｐｈＩ−ＳｐｅＩ断片とライゲートし、結果としてプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥをそれぞれ生じた。
【００５６】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔの構築
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥの構築は、国際公開第０２／０９９０９５号パンフレットの実施例６（９１頁１２〜２７行目）に詳細に記載されている。
【００５７】
パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス系統ＡＴＣＣ２１５８８由来のｄｄｓＡ遺伝子（ｄｄｓＡｗｔと呼ぶ）を、プライマーｄｄｓ−Ｎｄｅ（配列番号１２）およびｄｄｓ−Ｂａｍ（配列番号１３）を用いたＰＣＲ（ＧＣリッチＰＣＲシステム、ドイツ連邦共和国マンハイムのロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））によって増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））にクローニングし、結果としてプラスミドＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔを生じた。
【００５８】
プラスミドＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｄｄｓＡ遺伝子を含む１００５ｂｐの得られた断片を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥにクローニングし、結果としてプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを生じた。オリゴヌクレオチドｄｄｓ−Ｒ−１（配列番号１４）およびｄｄｓ−Ｒ−２（配列番号１５）を用いたクイックチェンジＸＬサイト・ディレクティド・ミュータジェネシス・キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ））でサイレント変異を導入することによって、ｄｄｓＡ遺伝子内のエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの認識部位を排除した。得られたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔ−Ｒを、ＥｃｏＲＩおよびＭａｍＩで切断し、ｄｄｓＡ遺伝子を含む断片１２７８ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで切断したＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔに挿入し、結果としてプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｄｄｓＡｗｔ−Ｒを生じた。このプラスミドをＣｅｌＩＩおよびＸｂａＩで切断し、ｄｄｓＡ遺伝子を含む得られた１２１１ｂｐの断片を、ＣｅｌＩＩおよびＢｌｎＩでのｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｃｒｔＥそれぞれの消化から得られた１１．６ｋｐの制限断片とライゲートした。得られたプラスミドを、それぞれｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔと名づけた。
【００５９】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔの構築
クイックチェンジＸＬサイト・ディレクティド・ミュータジェネシス・キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ））ならびにプライマーｍｕｔ４−８９−１−ｆｗ（配列番号１６）およびｍｕｔ４−８９−１−ｒｅｖ（配列番号１７）を用いた２回のＰＣＲ部位特異的変異誘発によって、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを得る。両方のプライマーは互いに相補的であり、配列番号４の２６８位に対応する配列番号３の２９４９位にＣの代わりに所望の変異Ａを含む。第一の変異誘発反応を、以下のように製造業者の使用説明書に従って設定する。５μｌの１０×反応バッファー、１０ｎｇのプラスミドＤＮＡｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔ、１２５ｎｇのプライマーｍｕｔ４−８９−１−ｆｗ、１２５ｎｇのｍｕｔ４−８９−１−ｒｅｖ、１μｌのｄＮＴＰミックス、３μｌのクイックソリューション（ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ）および２．５ＵのＰｆｕターボ（ＰｆｕＴｕｒｂｏ）ＤＮＡポリメラーゼを、５０μｌの最終体積で混合する。以下のパラメータを用いてサイクルを行う。１サイクル：９５℃１分、１８サイクル：９５℃５０秒、６０℃５０秒、６８℃３０分、１サイクル：６８℃７分。反応混合物を３７℃まで冷却した後、１０Ｕの制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩを添加し、反応物を３７℃で２時間インキュベートする。製造業者のプロトコルに従って、大腸菌ＸＬ１０−ゴールド・ウルトラコンポーネント（Ｇｏｌｄ Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）細胞（アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ））をＤｐｎＩ処理ＤＮＡで形質転換する。
【００６０】
得られたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを単離し、配列番号３の６９４８位でＴの代わりに所望の変異Ｃを含むプライマーｍｕｔ４−８９−２−ｆｗ（配列番号１８）およびｍｕｔ４−８９−２−ｒｅｖ（配列番号１９）を用いた二回目のＰＣＲ部位特異的変異誘発の鋳型ＤＮＡとして使用する。上述のように変異誘発を行う。得られたプラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを単離し、マイクロシンス・ゲーエムベーハー（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＧｍｂＨ）（スイス連邦バルガッハ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））で配列決定した。変異ｍｅｖオペロンの完全な配列は配列番号３に表され、以下の遺伝子を含む。６１７〜１６３９位のｍｖａＡ（ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼをコードする）、１６３６〜２６８５位のｉｄｉ（イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする）、２６８２〜３８４８位のｈｃｓ（ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをコードする）、３８２９〜４９６５位のｍｖｋ（メバロン酸キナーゼをコードする）、４９６５〜５８８２位のｐｍｋ（ホスホメバロン酸キナーゼをコードする）、および５８７５〜６８７３位のｍｖｄ（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする）。
【００６１】
実施例４：ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３への変異ｍｅｖオペロンの導入
変異ｍｅｖオペロンを担持するプラスミドでの大腸菌Ｓ１７−１の形質転換（サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１１、７８４−７９１頁、１９８３年）、およびそれに続く、コンジュゲーションによる大腸菌Ｓ１７−１からロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３へのプラスミドの転移を、標準的な手順を用いて行った（ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８、６１６９頁、１９９０年、サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１９８３年、７８４−９１頁）。
【００６２】
１００ｍｇ／ｌリファンピシンを補給したＲＳ１００液体培地中で系統ＡＴＣＣ３５０５３を増殖させること、１００ｍｇ／ｌリファンピシンを含むＲＳ１００プレート上に細胞を平板培養すること、およびシングルコロニーを単離することによって、ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３の自然発生リファンピシン耐性突然変異をまず単離した。コンジュゲーションのために、１００ｍｇ／ｌのリファンピシンおよびドナー細胞（５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地中で増殖させた、転移されるプラスミドを担持する大腸菌Ｓ１７−１）を含有するＲＳ１００培地中で増殖させたレシピエント細胞（リファンピシン耐性ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３）の培養物の１ミリリットルのアリコートを、遠心分離によってペレット化した。上清を廃棄し、新鮮なＲＳ１００培地で細胞を２回洗浄して抗生物質を除去した。次いで、１ｍｌの新鮮なＲＳ１００培地に各ペレットを再懸濁した。５０μｌのドナー細胞および０．４５ｍｌのレシピエント細胞を混合し、遠心分離によってペレット化し、０．０３ｍｌの新鮮なＲＳ１００培地に再懸濁し、ＲＳ１００プレート上に点在させた。３０℃で一晩のインキュベーションの後、接種ループで細胞を採取し、０．３ｍｌのＲＳ１００培地に再懸濁した。この懸濁液の希釈溶液を、１００ｍｇ／ｌリファンピシンおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＲＳ１００プレート上に広げ、３０℃でインキュベーションした。コロニー（ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３の、推定の形質転換細胞）をプレートから選び取り、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有する液体ＲＳ１００培地中で増殖させ、５６℃のアニーリング温度および以下の２つの異なるプライマー対を用いた１分、１５秒の伸長時間でＰＣＲ反応においてプラスミドの存在を試験した。
ｐＢＢＲ−Ｋ−ｕｐ（配列番号２０）／ＰｃｒｔＥ−２４４２（配列番号２１）
Ｋａｎ３ｏｕｔ（配列番号２２）／ｍｖａＡ３２５６（配列番号２３）
【００６３】
５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＲＳ１００プレート上に、陽性のクローンで筋をつけ、シングルコロニーを得た。各クローン由来の１つのシングルコロニーを、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有する液体ＲＳ１００培地中で再度増殖させ、上述のように、期待されるプラスミドの存在をＰＣＲによって確認した。得られた組み換え系統を、ＡＴＣＣ３５０５３／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔと呼んだ。
【００６４】
実施例５：ロドバクター・スフェロイデスＡＴＣＣ３５０５３の形質転換系統におけるＣｏＱ１０の生成
ロドバクター・スフェロイデス系統ＡＴＣＣ３５０５３、ＡＴＣＣ３５０５３／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔおよびＡＴＣＣ３５０５３／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−４−８９−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡｗｔを、ＲＳ１００培地中の振とうフラスコ培養において増殖させた。組み換えロドバクター・スフェロイデスを含む培養物は、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含んでいた。２５ｍｌの培養物を３０℃で２５０ｍｌのバッフル三角フラスコ中、２００ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。ＣｏＱ１０生成を試験するために、ロドバクター・スフェロイデス系統の凍結したグリセロール化ストック培養物を用い、２５ｍｌの種培養物を接種した。２４〜２８時間の種培養物の増殖の後、適した体積の培養物を用いて、６６０ナノメートルでの初期光学密度（ＯＤ６６０）が０．１６であるように、実験フラスコを接種した。２ｍｌの試料を、２４時間間隔で無菌的に採取した。分析は、増殖（ＯＤ６６０として測定される）、ｐＨ、培養物上清中のグルコースならびに実施例２に記載されるＣｏＱ１０およびカロテノイド（ＨＰＬＣによって測定される）を含んだ。結果を表３に要約する。これらの結果は、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス由来のクローン化変異メバロン酸オペロンの発現がロドバクター・スフェロイデスにおけるＣｏＱ１０生成を有意に向上させたことを明らかに示す。
【００６５】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ロドバクター・スフェロイデスにおけるＣｏＱ１０生合成の経路を表し、これはＩＰＰ形成にＭＥＰ経路を使用する。囲まれた領域は、（ＩＰＰの形成につながる）メバロン酸経路に加えてＩＰＰイソメラーゼ段階を含む、反応順序を示す。メバロン酸経路は、ロドバクター・スフェロイデスにおいては天然に生じない。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスにおいては、メバロン酸経路の５つの酵素に加えてＩＰＰイソメラーゼをコードする遺伝子が、以下メバロン酸オペロンと呼ばれる、オペロンを形成する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性、メバロン酸キナーゼ活性、ホスホメバロン酸キナーゼ活性、および／またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、微生物中に存在する場合にイソプレノイドの向上した生成につながる１つ以上の変異を担持する、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１もしくは２またはその断片から入手可能であり、かつ１つ以上の変異を担持する、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするｈｃｓ遺伝子に１つ以上の変異を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号３またはその断片によって表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで前記誘導体において、１つ以上のアミノ酸残基が前記ポリペプチドと比較して保存的に置換され、前記断片または誘導体がヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有する、ポリヌクレオチド、
（ｄ）ストリンジェントな条件下でその相補鎖が（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドにハイブリダイズし、Ｈｃｓタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
イソプレノイド、好ましくはコエンザイムＱ１０の生成のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項７】
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を、元々前記ポリヌクレオチドを欠損した微生物に導入する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の微生物を、イソプレノイドの生成を可能にする条件下で培養する工程
を含む、イソプレノイドの生成の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが導入される微生物が、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、好ましくはロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
導入されたポリヌクレオチドが、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）から選択される微生物から入手可能である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む微生物。
【請求項１１】
ロドバクター属、好ましくはロドバクター・スフェロイデスから選択される、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
パラコッカス属から選択される微生物から入手可能である請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが導入される、請求項１０または１１に記載の微生物。
【請求項１３】
イソプレノイドの生成のための、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の微生物の使用。
【請求項１】
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性、メバロン酸キナーゼ活性、ホスホメバロン酸キナーゼ活性、および／またはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を含むポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、微生物中に存在する場合にイソプレノイドの向上した生成につながる１つ以上の変異を担持する、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１もしくは２またはその断片から入手可能であり、かつ１つ以上の変異を担持する、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするｈｃｓ遺伝子に１つ以上の変異を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号３またはその断片によって表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで前記誘導体において、１つ以上のアミノ酸残基が前記ポリペプチドと比較して保存的に置換され、前記断片または誘導体がヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ活性を有する、ポリヌクレオチド、
（ｄ）ストリンジェントな条件下でその相補鎖が（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドにハイブリダイズし、Ｈｃｓタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
イソプレノイド、好ましくはコエンザイムＱ１０の生成のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項７】
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を、元々前記ポリヌクレオチドを欠損した微生物に導入する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の微生物を、イソプレノイドの生成を可能にする条件下で培養する工程
を含む、イソプレノイドの生成の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが導入される微生物が、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、好ましくはロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
導入されたポリヌクレオチドが、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐ．ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）から選択される微生物から入手可能である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む微生物。
【請求項１１】
ロドバクター属、好ましくはロドバクター・スフェロイデスから選択される、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
パラコッカス属から選択される微生物から入手可能である請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが導入される、請求項１０または１１に記載の微生物。
【請求項１３】
イソプレノイドの生成のための、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の微生物の使用。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５０９６８９（Ｐ２００８−５０９６８９Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２６３５６（Ｐ２００７−５２６３５６）
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８７０２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１８２１１
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８７０２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１８２１１
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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