イソプレノイド化合物、その製造方法、及び抗酸化剤
【課題】新規なイソプレノイド化合物、及び抗酸化剤を提供する。
【解決手段】イソプレノイド化合物は下記一般式（１）で示される構造を有する。抗酸化剤は下記一般式（１）で示される構造を有するイソプレノイド化合物を有効成分として含有する。
【解決手段】イソプレノイド化合物は下記一般式（１）で示される構造を有する。抗酸化剤は下記一般式（１）で示される構造を有するイソプレノイド化合物を有効成分として含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性を有するイソプレノイド化合物、その製造方法、及び抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレノイド化合物はイソプレンを構成単位とするテルペン炭化水素、及びその含酸素誘導体（アルデヒド、カルボン酸誘導体等）の総称であり、これらイソプレノイド化合物には様々な生理活性を有するものが多く存在する。たとえば、抗菌活性及び抗真菌活性を有するイソプレノイド化合物として、ゲラニオール、ファルネソール、及びシトラールが知られている（特許文献１参照）。また、特許文献１には、ゲラニオール等のイソプレノイド化合物を複数組合せた場合に、抗菌活性が相乗的に増加することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２３１０５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、イシクラゲから新規なイソプレノイド化合物を単離したことによりなされたものである。また、かかる化合物について抗酸化活性を見出したことによりなされたものである。本発明の目的は、医薬品・食品等の様々な用途に適用することができるイソプレノイド化合物、及びその製造方法を提供することにある。また、有用な抗酸化活性を発揮する抗酸化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために請求項１に記載のイソプレノイド化合物は、下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とする。
【０００６】
請求項２に記載の抗酸化剤は、請求項１に記載のイソプレノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
請求項３に記載のイソプレノイド化合物の製造方法は、下記一般式（１）：
【化２】
で示されるイソプレノイド化合物の製造方法であって、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いてイシクラゲから前記イソプレノイド化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、前記抽出物から前記イソプレノイド化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新規なイソプレノイド化合物、その製造方法、及び抗酸化剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を具体化した実施形態のイソプレノイド化合物及び抗酸化剤を詳細に説明する。
本実施形態のイソプレノイド化合物は、下記一般式（１）：
【化３】
で示される有機化合物である。上記イソプレノイド化合物はイシクラゲ（Ｎｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ）を原料として、抽出工程及び単離工程を経ることにより得られる。イシクラゲは、シアノバクテリア（藍色細菌）、ネンジュモ科ネンジュモ属の陸生藍藻の一種であり、世界各地の裸地の地表などに生育し、寒天状の群体を形成する。日本では本州中部以西、四国、九州の各地に分布している。
【０００９】
［原料］
原料となるイシクラゲは、天然に自生する藻体であってもよいし、人工的に培養した藻体であってもよい。なお、安定供給が可能である点や品質保持が容易である点から、人工的に培養した藻体を用いることが工業的に好適である。また、原料としての上記イシクラゲは採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、採取後に乾燥処理した状態、並びに採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態のいずれの状態であってもよい。
【００１０】
［抽出工程］
抽出工程は、原料としての上記イシクラゲから、上記イソプレノイド化合物を含む抽出物を抽出する工程である。抽出工程に用いる抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。上記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等の低級アルコール類、アセトン、及び酢酸エチルが挙げられるが、特に低級アルコール類を用いることが好ましい。なお、抽出溶媒中に、水及び親水性有機溶媒以外の溶媒が少量含有されていてもよいし、その他の添加剤、例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、及び乳化剤等が溶解されていてもよい。
【００１１】
抽出方法としては、公知の抽出方法、例えば冷水抽出、温水抽出、熱水抽出、及び蒸気抽出のいずれの方法を用いてもよい。また、抽出温度は３０〜６０℃であることが好ましい。なお、抽出時間は特に限定されるものではないが、１２０〜１８０分間程度であることが好ましい。
【００１２】
抽出操作としては、抽出溶媒中に原料である上記イシクラゲを所定時間浸漬させる。その際、抽出溶媒中における原料の濃度は特に限定されないが、５〜８０質量％とすることが好ましく、１０〜２０質量％とすることがより好ましい。原料の濃度を５％未満とした場合には、得られる抽出液（抽出物）中における上記イソプレノイド化合物の濃度が低くなることから濃縮処理等の後処理が煩雑となる。一方、原料の濃度が８０％を超える場合には、上記イソプレノイド化合物の回収率が低くなるおそれがある。
【００１３】
こうした抽出操作においては、抽出効率を高めるべく、必要に応じて攪拌処理、加圧処理、及び超音波処理等の処理をさらに行ってもよい。また、抽出操作は同一の原料に対して一回のみ行なってもよいし、複数回繰り返して行なってもよい。そして、抽出操作の後に固液分離操作が行われることで、抽出液（抽出物）と原料の残渣とを分離する。固液分離処理の方法としては、例えばろ過や遠心分離等の公知の分離法を用いることができる。また、必要に応じて得られた抽出液（抽出物）の濃縮を行う。
【００１４】
［単離工程］
単離工程は、抽出工程にて得られた抽出物中に含まれる上記イソプレノイド化合物を単離する工程である。上記イソプレノイド化合物は、上記抽出物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いて精製することにより単離される。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えば液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えばイオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、より具体的にはシリカゲル担体やＯＤＳ担体を用いることが分離効率の観点から好ましい。それらのクロマトグラフィを適宜組み合わせて、公知の使用方法で上記イソプレノイド化合物を単離・精製することができる。上記イソプレノイド化合物の同定は、構造決定により、又は精製品を指標とすることにより行うことが出来る。
【００１５】
なお、本実施形態のイソプレノイド化合物は、イシクラゲから抽出及び単離する方法に限らず、有機化学合成（半合成を含む）等により製造してもよい。
次に、本実施形態の抗酸化剤について説明する。
【００１６】
本実施形態の抗酸化剤は、上記一般式（１）で示されるイソプレノイド化合物を有効成分として含有する。この抗酸化剤は、例えば健康食品や食品等の飲食品等の添加剤、医薬品、及び医薬部外品として有用である。抗酸化剤は液状であってもよいし、固体状であってもよい。それらの剤形としては、特に限定されないが、例えば散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、賦形剤、基剤、乳化剤、安定剤、溶剤、香料、甘味料等の添加剤を配合してもよい。
【００１７】
次に、本実施形態における効果について以下に記載する。
（１）本実施形態のイソプレノイド化合物は新規化合物であり、医薬品・飲食品等の様々な用途に適用することができる。
【００１８】
（２）本実施形態のイソプレノイド化合物は抗酸化活性を発揮する。したがって、同イソプレノイド化合物を有効成分とする抗酸化剤を提供することができる。
（３）本実施形態のイソプレノイド化合物は、イシクラゲに含まれる天然成分であることから、抗酸化剤として用いた場合に、副作用が少なく、生体に対してより安全に適用することができる。
【００１９】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について記載する。
（イ）イシクラゲ由来であることを特徴とする前記イソプレノイド化合物。
（ロ）前記イソプレノイド化合物を含有することを特徴とする飲食品、医薬品、及び医薬部外品。
【実施例】
【００２０】
次に、実施例を挙げて上記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜抽出工程＞
イシクラゲの乾燥粉体（２００ｇ）にエタノール（２Ｌ）を添加して、室温にて２時間攪拌するとともに３０分間静置した後、上清を回収した。また、沈殿物に対して、エタノール（２Ｌ）を添加して、室温℃にて２時間攪拌するとともに３０分間静置した後、上清を回収した。そして、この沈殿物に対する再抽出操作を合計１０回繰り返した。得られた全ての上清をろ紙によりろ過するとともに、そのろ液を減圧濃縮することにより、イシクラゲ抽出物（１０ｇ）を得た。
【００２１】
＜単離工程＞
イシクラゲ抽出物に対して、複数のクロマトグラフィによる分画を組み合わせて行うことにより目的物の単離を行った。まず、イシクラゲ抽出物（１１ｇ）を中性シリカゲルに吸着させ、液体クロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）による分画を行った。そして、イシクラゲ抽出物を順相ＴＬＣ（展開溶媒／クロロホルム：メタノール＝１００：１）にて分析したときに、Ｒｆ値が０．５となるスポットを含む画分を回収するとともに、同画分を濃縮することにより第１粗精製物を得た。
【００２２】
第１粗精製物に対してシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）による分画を行い、上記スポットを含む画分を回収するとともに、同画分を濃縮することにより第２粗精製物を得た。その後、第２粗精製物に対してシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム）による分画を行い、上記スポットを含む画分を回収するとともに、同画分を濃縮することにより第３粗精製物を得た。
【００２３】
第３粗精製物に対して分取薄層クロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝１００：１）による分離処理を行い、目的物質が吸着した部位のシリカゲル単体（Ｒｆ値０．５）を回収した。回収したシリカゲル単体をアセトンに浸漬させて目的物をアセトン中に溶出させ、その溶出液を濃縮することにより目的物（２２．３ｍｇ）を得た。
【００２４】
＜実施例の構造解析＞
目的物（以下、実施例と記載する。）の分子量を特定するためにＨＲＦＡＢＭＳ分析を行った。その結果、ｍ／ｚ３５７．０２９［Ｍ＋Ｈ］＋に分子イオンピークが認められたことから、実施例の組成式はＣ２２Ｈ２８Ｏ４（分子量３５６）であると推定した。
【００２５】
実施例の有する官能基を特定するためにＩＲスペクトル分析を行った。その結果、ヒドロキシ基（３３６３ｃｍ−１）、カルボニル基（１６００ｃｍ−１）、オレフィン（１５１３ｃｍ−１）の存在が示唆された。また、その他に１４５７，１１１４，６７２ｃｍ−１にピークが認められた。
【００２６】
実施例の分子構造を特定するために各種ＮＭＲ分析（１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）を行った。１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を表１に示す。なお、ＮＭＲ分析の条件は以下のとおりである。
【００２７】
１３Ｃ−ＮＭＲ：１００ＭＨｚ
１Ｈ−ＮＭＲ：４００ＭＨｚ
重溶媒：クロロホルム−ｄ
基準物質：トリメチルシラン
【００２８】
【表１】
表１に示す１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値、並びにＤＥＰＴスペクトルから、δＣ２２．０，２９．０，５６．５の３本の炭素シグナルがメチル炭素であり、δＣ１９．０，３３．８，３９．９の３本の炭素シグナルがメチレン炭素であり、δＣ１０５．４，１２４．３，１２９．３，１４２．９，１４３．２の５本の炭素シグナルがメチン炭素であると推定した。また、δＣ１８８．９の炭素シグナルはカルボニル炭素であると推定した。さらに、ＨＭＱＣスペクトルから、δＨ１．０９，１．４８，１．６３，１．８１，２．０７，３．９１，６．４８，６．８２（ｓ），６．８２（ｄ），７．４８，７．５６の水素シグナルは、それぞれδＣ２９．０，３９．９，１９．０，２２．０，３３．８，５６．５，１２９．３，１０５．４，１２４．３，１４２．９，１４３．２の炭素シグナルに対して相関が認められた。
【００２９】
そして、ＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルから、Ｈ（Ｆ）、Ｈ（Ａ）、Ｈ（Ｄ）の３個のメチレン水素の相関が認められた。ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｆ）とＣ（Ａ）、Ｃ（Ｃ）、Ｃ（Ｄ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｄ）とＣ（Ｌ）とに相関が認められた。また、メチル水素であるＨ（Ｃ）は、Ｃ（Ｃ）、Ｃ（Ｅ）、Ｃ（Ｆ）、Ｃ（Ｍ）のそれぞれに対して相関が認められた。さらに、ケミカルシフト値よりＣ（Ｍ）及びＣ（Ｌ）は二重結合を形成する炭素であると推定した。
【００３０】
さらに、ＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルから、Ｈ（Ｋ）及びＨ（Ｏ）の２個のメチン水素の相関が認められた。この２個の水素の結合定数は共にＪ＝１６．０Ｈｚであることから、Ｈ（Ｋ）及びＨ（Ｏ）はトランス二重結合を形成する炭素に結合する水素であると推定した。また、ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｋ）とＣ（Ｍ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｏ）とＣ（Ｌ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められ、メチル水素であるＨ（Ｂ）とＣ（Ｄ）及びＣ（Ｌ）とに相関が認められた。これらの分析結果から、実施例は下記一般式（２）に示すような六員環を含む部分構造を有していると考えられる。
【００３１】
【化４】
（式中、矢印はＨＭＢＣスペクトルに現れる相関を示し、太線はＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルに現れる相関を示す。）
一方、ＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルから、Ｈ（Ｉ）及びＨ（Ｐ）の２個のメチン水素の相関が認められた。この２個の水素の結合定数は共にＪ＝１６．０Ｈｚであることから、Ｈ（Ｉ）及びＨ（Ｐ）はトランス二重結合を形成する炭素に結合する水素であると推定した。ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｉ）とＣ（Ｊ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｐ）とＣ（Ｈ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められた。また、ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｇ）とＣ（Ｑ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｈ）とＣ（Ｈ）、Ｃ（Ｎ）、Ｃ（Ｐ）、及びＣ（Ｑ）とに相関が認められた。さらに、ケミカルシフト値より、Ｈ（Ｇ）はメトキシ基に結合する水素、Ｈ（Ｄ）はベンゼン環における等価な位置の炭素に結合する水素であると推定した。これらの分析結果から、実施例は下記一般式（３）に示す部分構造を有していると考えられる。
【００３２】
【化５】
（式中、矢印はＨＭＢＣスペクトルに現れる相関を示し、太線はＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルに現れる相関を示す。）
さらに、Ｃ（Ｎ）に結合する官能基は、ケミカルシフト値よりフェノール性水酸基であると推定した。これらの分析結果を総合して、実施例は下記一般式（４）に示す構造を有する化合物であると構造決定した。
【００３３】
【化６】
（式中、矢印はＨＭＢＣスペクトルに現れる相関を示し、太線はＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルに現れる相関を示す。）
＜実施例の理化学的性質＞
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ：ｆｏｕｎｄ［Ｍ＋Ｈ］＋３５７，Ｃ２２Ｈ２８Ｏ４
ＨＲＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ：ｆｏｕｎｄ［Ｍ＋Ｈ］＋３５７．２０９１，Ｃ２２Ｈ２８Ｏ４ ｃａｌｃｄ［Ｍ＋Ｈ］＋３５７．２０６６
ＩＲ（ｆｉｌｍ）：３３６３，１６００，１５１３，１４５７，１１１４，６７２ｃｍ−１
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）：δＨ１．０９（ｓ，６Ｈ），１．４７−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｓ，６Ｈ），５．８７（ｂｓ，１Ｈ），６．４８（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｓ，２Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ；Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）：δＣ１９．０，２２．０，２９．０，３３．８，３４．３，３９．９，５６．５，１０５．４，１２４．３，１２６．５，１２９．３，１３６．５，１３６．７，１３７．４，１４２．９，１４３．２，１４７．４，１８８．９
＜抗酸化活性の評価＞
実施例の抗酸化活性をカロテン退色法により評価した。
【００３４】
まず、実施例をそれぞれ０．２５，０．５，１．０ｍＭとなるようにエタノールに溶解させて濃度の異なる３種類の試験試料を調製した。また、試験試料とは別にカロテン溶液を調製した。カロテン溶液は、１ｍｇ／ｍＬのβ−カロテンのクロロホルム溶液（３．０ｍＬ）、０．１ｍｇ／ｍＬのリノール酸のクロロホルム溶液（０．４ｍＬ）、０．２ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ（２０） ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ（ツイーン４０）のクロロホルム溶液（２．０ｍＬ）を混合し、窒素雰囲気下でクロロホルムを除去したのちに蒸留水（２００ｍＬ）を加えることにより調製した。
【００３５】
次に、三角フラスコに、カロテン溶液（１８．６ｍＬ）、試験試料（０．４ｍＬ）、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液（１．６ｍＬ）を加え、これを５５℃温浴中で加熱した。なお、カロテン溶液は試験試料等を混合する直前に毎回調製した。そして、加熱前、及び加熱開始から６０分経過時の４７０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、その吸光度の変化量に基づいてβ−カロテンの残存量（％）を算出した。また、上記試験試料に代えて、酸化防止剤として使用されるブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）のエタノール溶液、又は１００％エタノールを用いて同様の試験を行い、それぞれ陽性対照及び陰性対照とした。これらの結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
表２に示すように、陰性対照と比較して実施例を用いた場合にはβ−カロテンの残存量が高くなることから、実施例は抗酸化活性を有していることが分かる。また、実施例の抗酸化活性はブチルヒドロキシアニソールの７〜８割程度であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性を有するイソプレノイド化合物、その製造方法、及び抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレノイド化合物はイソプレンを構成単位とするテルペン炭化水素、及びその含酸素誘導体（アルデヒド、カルボン酸誘導体等）の総称であり、これらイソプレノイド化合物には様々な生理活性を有するものが多く存在する。たとえば、抗菌活性及び抗真菌活性を有するイソプレノイド化合物として、ゲラニオール、ファルネソール、及びシトラールが知られている（特許文献１参照）。また、特許文献１には、ゲラニオール等のイソプレノイド化合物を複数組合せた場合に、抗菌活性が相乗的に増加することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２３１０５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、イシクラゲから新規なイソプレノイド化合物を単離したことによりなされたものである。また、かかる化合物について抗酸化活性を見出したことによりなされたものである。本発明の目的は、医薬品・食品等の様々な用途に適用することができるイソプレノイド化合物、及びその製造方法を提供することにある。また、有用な抗酸化活性を発揮する抗酸化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために請求項１に記載のイソプレノイド化合物は、下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とする。
【０００６】
請求項２に記載の抗酸化剤は、請求項１に記載のイソプレノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
請求項３に記載のイソプレノイド化合物の製造方法は、下記一般式（１）：
【化２】
で示されるイソプレノイド化合物の製造方法であって、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いてイシクラゲから前記イソプレノイド化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、前記抽出物から前記イソプレノイド化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新規なイソプレノイド化合物、その製造方法、及び抗酸化剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を具体化した実施形態のイソプレノイド化合物及び抗酸化剤を詳細に説明する。
本実施形態のイソプレノイド化合物は、下記一般式（１）：
【化３】
で示される有機化合物である。上記イソプレノイド化合物はイシクラゲ（Ｎｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ）を原料として、抽出工程及び単離工程を経ることにより得られる。イシクラゲは、シアノバクテリア（藍色細菌）、ネンジュモ科ネンジュモ属の陸生藍藻の一種であり、世界各地の裸地の地表などに生育し、寒天状の群体を形成する。日本では本州中部以西、四国、九州の各地に分布している。
【０００９】
［原料］
原料となるイシクラゲは、天然に自生する藻体であってもよいし、人工的に培養した藻体であってもよい。なお、安定供給が可能である点や品質保持が容易である点から、人工的に培養した藻体を用いることが工業的に好適である。また、原料としての上記イシクラゲは採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、採取後に乾燥処理した状態、並びに採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態のいずれの状態であってもよい。
【００１０】
［抽出工程］
抽出工程は、原料としての上記イシクラゲから、上記イソプレノイド化合物を含む抽出物を抽出する工程である。抽出工程に用いる抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。上記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等の低級アルコール類、アセトン、及び酢酸エチルが挙げられるが、特に低級アルコール類を用いることが好ましい。なお、抽出溶媒中に、水及び親水性有機溶媒以外の溶媒が少量含有されていてもよいし、その他の添加剤、例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、及び乳化剤等が溶解されていてもよい。
【００１１】
抽出方法としては、公知の抽出方法、例えば冷水抽出、温水抽出、熱水抽出、及び蒸気抽出のいずれの方法を用いてもよい。また、抽出温度は３０〜６０℃であることが好ましい。なお、抽出時間は特に限定されるものではないが、１２０〜１８０分間程度であることが好ましい。
【００１２】
抽出操作としては、抽出溶媒中に原料である上記イシクラゲを所定時間浸漬させる。その際、抽出溶媒中における原料の濃度は特に限定されないが、５〜８０質量％とすることが好ましく、１０〜２０質量％とすることがより好ましい。原料の濃度を５％未満とした場合には、得られる抽出液（抽出物）中における上記イソプレノイド化合物の濃度が低くなることから濃縮処理等の後処理が煩雑となる。一方、原料の濃度が８０％を超える場合には、上記イソプレノイド化合物の回収率が低くなるおそれがある。
【００１３】
こうした抽出操作においては、抽出効率を高めるべく、必要に応じて攪拌処理、加圧処理、及び超音波処理等の処理をさらに行ってもよい。また、抽出操作は同一の原料に対して一回のみ行なってもよいし、複数回繰り返して行なってもよい。そして、抽出操作の後に固液分離操作が行われることで、抽出液（抽出物）と原料の残渣とを分離する。固液分離処理の方法としては、例えばろ過や遠心分離等の公知の分離法を用いることができる。また、必要に応じて得られた抽出液（抽出物）の濃縮を行う。
【００１４】
［単離工程］
単離工程は、抽出工程にて得られた抽出物中に含まれる上記イソプレノイド化合物を単離する工程である。上記イソプレノイド化合物は、上記抽出物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いて精製することにより単離される。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えば液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えばイオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、より具体的にはシリカゲル担体やＯＤＳ担体を用いることが分離効率の観点から好ましい。それらのクロマトグラフィを適宜組み合わせて、公知の使用方法で上記イソプレノイド化合物を単離・精製することができる。上記イソプレノイド化合物の同定は、構造決定により、又は精製品を指標とすることにより行うことが出来る。
【００１５】
なお、本実施形態のイソプレノイド化合物は、イシクラゲから抽出及び単離する方法に限らず、有機化学合成（半合成を含む）等により製造してもよい。
次に、本実施形態の抗酸化剤について説明する。
【００１６】
本実施形態の抗酸化剤は、上記一般式（１）で示されるイソプレノイド化合物を有効成分として含有する。この抗酸化剤は、例えば健康食品や食品等の飲食品等の添加剤、医薬品、及び医薬部外品として有用である。抗酸化剤は液状であってもよいし、固体状であってもよい。それらの剤形としては、特に限定されないが、例えば散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、賦形剤、基剤、乳化剤、安定剤、溶剤、香料、甘味料等の添加剤を配合してもよい。
【００１７】
次に、本実施形態における効果について以下に記載する。
（１）本実施形態のイソプレノイド化合物は新規化合物であり、医薬品・飲食品等の様々な用途に適用することができる。
【００１８】
（２）本実施形態のイソプレノイド化合物は抗酸化活性を発揮する。したがって、同イソプレノイド化合物を有効成分とする抗酸化剤を提供することができる。
（３）本実施形態のイソプレノイド化合物は、イシクラゲに含まれる天然成分であることから、抗酸化剤として用いた場合に、副作用が少なく、生体に対してより安全に適用することができる。
【００１９】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について記載する。
（イ）イシクラゲ由来であることを特徴とする前記イソプレノイド化合物。
（ロ）前記イソプレノイド化合物を含有することを特徴とする飲食品、医薬品、及び医薬部外品。
【実施例】
【００２０】
次に、実施例を挙げて上記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜抽出工程＞
イシクラゲの乾燥粉体（２００ｇ）にエタノール（２Ｌ）を添加して、室温にて２時間攪拌するとともに３０分間静置した後、上清を回収した。また、沈殿物に対して、エタノール（２Ｌ）を添加して、室温℃にて２時間攪拌するとともに３０分間静置した後、上清を回収した。そして、この沈殿物に対する再抽出操作を合計１０回繰り返した。得られた全ての上清をろ紙によりろ過するとともに、そのろ液を減圧濃縮することにより、イシクラゲ抽出物（１０ｇ）を得た。
【００２１】
＜単離工程＞
イシクラゲ抽出物に対して、複数のクロマトグラフィによる分画を組み合わせて行うことにより目的物の単離を行った。まず、イシクラゲ抽出物（１１ｇ）を中性シリカゲルに吸着させ、液体クロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）による分画を行った。そして、イシクラゲ抽出物を順相ＴＬＣ（展開溶媒／クロロホルム：メタノール＝１００：１）にて分析したときに、Ｒｆ値が０．５となるスポットを含む画分を回収するとともに、同画分を濃縮することにより第１粗精製物を得た。
【００２２】
第１粗精製物に対してシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）による分画を行い、上記スポットを含む画分を回収するとともに、同画分を濃縮することにより第２粗精製物を得た。その後、第２粗精製物に対してシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム）による分画を行い、上記スポットを含む画分を回収するとともに、同画分を濃縮することにより第３粗精製物を得た。
【００２３】
第３粗精製物に対して分取薄層クロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝１００：１）による分離処理を行い、目的物質が吸着した部位のシリカゲル単体（Ｒｆ値０．５）を回収した。回収したシリカゲル単体をアセトンに浸漬させて目的物をアセトン中に溶出させ、その溶出液を濃縮することにより目的物（２２．３ｍｇ）を得た。
【００２４】
＜実施例の構造解析＞
目的物（以下、実施例と記載する。）の分子量を特定するためにＨＲＦＡＢＭＳ分析を行った。その結果、ｍ／ｚ３５７．０２９［Ｍ＋Ｈ］＋に分子イオンピークが認められたことから、実施例の組成式はＣ２２Ｈ２８Ｏ４（分子量３５６）であると推定した。
【００２５】
実施例の有する官能基を特定するためにＩＲスペクトル分析を行った。その結果、ヒドロキシ基（３３６３ｃｍ−１）、カルボニル基（１６００ｃｍ−１）、オレフィン（１５１３ｃｍ−１）の存在が示唆された。また、その他に１４５７，１１１４，６７２ｃｍ−１にピークが認められた。
【００２６】
実施例の分子構造を特定するために各種ＮＭＲ分析（１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）を行った。１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を表１に示す。なお、ＮＭＲ分析の条件は以下のとおりである。
【００２７】
１３Ｃ−ＮＭＲ：１００ＭＨｚ
１Ｈ−ＮＭＲ：４００ＭＨｚ
重溶媒：クロロホルム−ｄ
基準物質：トリメチルシラン
【００２８】
【表１】
表１に示す１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値、並びにＤＥＰＴスペクトルから、δＣ２２．０，２９．０，５６．５の３本の炭素シグナルがメチル炭素であり、δＣ１９．０，３３．８，３９．９の３本の炭素シグナルがメチレン炭素であり、δＣ１０５．４，１２４．３，１２９．３，１４２．９，１４３．２の５本の炭素シグナルがメチン炭素であると推定した。また、δＣ１８８．９の炭素シグナルはカルボニル炭素であると推定した。さらに、ＨＭＱＣスペクトルから、δＨ１．０９，１．４８，１．６３，１．８１，２．０７，３．９１，６．４８，６．８２（ｓ），６．８２（ｄ），７．４８，７．５６の水素シグナルは、それぞれδＣ２９．０，３９．９，１９．０，２２．０，３３．８，５６．５，１２９．３，１０５．４，１２４．３，１４２．９，１４３．２の炭素シグナルに対して相関が認められた。
【００２９】
そして、ＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルから、Ｈ（Ｆ）、Ｈ（Ａ）、Ｈ（Ｄ）の３個のメチレン水素の相関が認められた。ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｆ）とＣ（Ａ）、Ｃ（Ｃ）、Ｃ（Ｄ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｄ）とＣ（Ｌ）とに相関が認められた。また、メチル水素であるＨ（Ｃ）は、Ｃ（Ｃ）、Ｃ（Ｅ）、Ｃ（Ｆ）、Ｃ（Ｍ）のそれぞれに対して相関が認められた。さらに、ケミカルシフト値よりＣ（Ｍ）及びＣ（Ｌ）は二重結合を形成する炭素であると推定した。
【００３０】
さらに、ＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルから、Ｈ（Ｋ）及びＨ（Ｏ）の２個のメチン水素の相関が認められた。この２個の水素の結合定数は共にＪ＝１６．０Ｈｚであることから、Ｈ（Ｋ）及びＨ（Ｏ）はトランス二重結合を形成する炭素に結合する水素であると推定した。また、ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｋ）とＣ（Ｍ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｏ）とＣ（Ｌ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められ、メチル水素であるＨ（Ｂ）とＣ（Ｄ）及びＣ（Ｌ）とに相関が認められた。これらの分析結果から、実施例は下記一般式（２）に示すような六員環を含む部分構造を有していると考えられる。
【００３１】
【化４】
（式中、矢印はＨＭＢＣスペクトルに現れる相関を示し、太線はＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルに現れる相関を示す。）
一方、ＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルから、Ｈ（Ｉ）及びＨ（Ｐ）の２個のメチン水素の相関が認められた。この２個の水素の結合定数は共にＪ＝１６．０Ｈｚであることから、Ｈ（Ｉ）及びＨ（Ｐ）はトランス二重結合を形成する炭素に結合する水素であると推定した。ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｉ）とＣ（Ｊ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｐ）とＣ（Ｈ）及びＣ（Ｒ）とに相関が認められた。また、ＨＭＢＣスペクトルから、Ｈ（Ｇ）とＣ（Ｑ）とに相関が認められ、Ｈ（Ｈ）とＣ（Ｈ）、Ｃ（Ｎ）、Ｃ（Ｐ）、及びＣ（Ｑ）とに相関が認められた。さらに、ケミカルシフト値より、Ｈ（Ｇ）はメトキシ基に結合する水素、Ｈ（Ｄ）はベンゼン環における等価な位置の炭素に結合する水素であると推定した。これらの分析結果から、実施例は下記一般式（３）に示す部分構造を有していると考えられる。
【００３２】
【化５】
（式中、矢印はＨＭＢＣスペクトルに現れる相関を示し、太線はＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルに現れる相関を示す。）
さらに、Ｃ（Ｎ）に結合する官能基は、ケミカルシフト値よりフェノール性水酸基であると推定した。これらの分析結果を総合して、実施例は下記一般式（４）に示す構造を有する化合物であると構造決定した。
【００３３】
【化６】
（式中、矢印はＨＭＢＣスペクトルに現れる相関を示し、太線はＨＨ−ＣＯＳＹスペクトルに現れる相関を示す。）
＜実施例の理化学的性質＞
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ：ｆｏｕｎｄ［Ｍ＋Ｈ］＋３５７，Ｃ２２Ｈ２８Ｏ４
ＨＲＦＡＢＭＳ：ｍ／ｚ：ｆｏｕｎｄ［Ｍ＋Ｈ］＋３５７．２０９１，Ｃ２２Ｈ２８Ｏ４ ｃａｌｃｄ［Ｍ＋Ｈ］＋３５７．２０６６
ＩＲ（ｆｉｌｍ）：３３６３，１６００，１５１３，１４５７，１１１４，６７２ｃｍ−１
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）：δＨ１．０９（ｓ，６Ｈ），１．４７−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｓ，６Ｈ），５．８７（ｂｓ，１Ｈ），６．４８（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｓ，２Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ；Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）：δＣ１９．０，２２．０，２９．０，３３．８，３４．３，３９．９，５６．５，１０５．４，１２４．３，１２６．５，１２９．３，１３６．５，１３６．７，１３７．４，１４２．９，１４３．２，１４７．４，１８８．９
＜抗酸化活性の評価＞
実施例の抗酸化活性をカロテン退色法により評価した。
【００３４】
まず、実施例をそれぞれ０．２５，０．５，１．０ｍＭとなるようにエタノールに溶解させて濃度の異なる３種類の試験試料を調製した。また、試験試料とは別にカロテン溶液を調製した。カロテン溶液は、１ｍｇ／ｍＬのβ−カロテンのクロロホルム溶液（３．０ｍＬ）、０．１ｍｇ／ｍＬのリノール酸のクロロホルム溶液（０．４ｍＬ）、０．２ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ（２０） ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ（ツイーン４０）のクロロホルム溶液（２．０ｍＬ）を混合し、窒素雰囲気下でクロロホルムを除去したのちに蒸留水（２００ｍＬ）を加えることにより調製した。
【００３５】
次に、三角フラスコに、カロテン溶液（１８．６ｍＬ）、試験試料（０．４ｍＬ）、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液（１．６ｍＬ）を加え、これを５５℃温浴中で加熱した。なお、カロテン溶液は試験試料等を混合する直前に毎回調製した。そして、加熱前、及び加熱開始から６０分経過時の４７０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、その吸光度の変化量に基づいてβ−カロテンの残存量（％）を算出した。また、上記試験試料に代えて、酸化防止剤として使用されるブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）のエタノール溶液、又は１００％エタノールを用いて同様の試験を行い、それぞれ陽性対照及び陰性対照とした。これらの結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
表２に示すように、陰性対照と比較して実施例を用いた場合にはβ−カロテンの残存量が高くなることから、実施例は抗酸化活性を有していることが分かる。また、実施例の抗酸化活性はブチルヒドロキシアニソールの７〜８割程度であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とするイソプレノイド化合物。
【請求項２】
請求項１に記載のイソプレノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項３】
下記一般式（１）：
【化２】
で示されるイソプレノイド化合物の製造方法であって、
水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いてイシクラゲから前記イソプレノイド化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、
前記抽出物から前記イソプレノイド化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とするイソプレノイド化合物の製造方法。
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とするイソプレノイド化合物。
【請求項２】
請求項１に記載のイソプレノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項３】
下記一般式（１）：
【化２】
で示されるイソプレノイド化合物の製造方法であって、
水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いてイシクラゲから前記イソプレノイド化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、
前記抽出物から前記イソプレノイド化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とするイソプレノイド化合物の製造方法。
【公開番号】特開２０１２−２２４５７６（Ｐ２０１２−２２４５７６Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９３１８４（Ｐ２０１１−９３１８４）
【出願日】平成２３年４月１９日（２０１１．４．１９）
【出願人】（５９３２０６９６４）マイクロアルジェコーポレーション株式会社 (17)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１９日（２０１１．４．１９）
【出願人】（５９３２０６９６４）マイクロアルジェコーポレーション株式会社 (17)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
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