イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型
イヌからＤＮＡ試料を得、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基に該当する塩基を決定することにより、薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する方法を開示する。 前記方法によれば、イヌ（特にはビーグル犬）における薬理効果試験及び毒性試験の実施に先立ち、使用される個体のＣＹＰ１Ａ２の遺伝子診断を迅速に実施し、正常な代謝能力を持つ群（エクステンスィブ・メタボライザー群）、又は、薬物代謝能力が低い群（プアー・メタボライザー群）に、簡便に群分けすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の試験に用いるイヌ（特にはビーグル犬）のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；以下、ＳＮＰと称する）決定に基づく薬剤代謝における個体間変動の検出，医薬品の試験に用いるイヌの選別方法，及び多型領域の配列決定のためのＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物代謝とは生体内における酵素による化合物の化学構造の変化である。これら薬物代謝に関与する酵素を薬物代謝酵素という。薬物代謝酵素は、元来、生体内物質（ステロイド、脂肪酸、及び胆汁酸など）の合成又は分解反応を触媒していたものと考えられるが、体内に摂取される薬物又は侵入してくる薬物（異物）を代謝して体外に排出させる役目を持つ。
薬物代謝反応は第Ｉ相反応と第ＩＩ相反応に大別される。第Ｉ相反応では、酸化、還元、及び／又は加水分解により、薬物に極性官能基が導入される。第ＩＩ相反応では、第Ｉ相反応で生成した極性官能基にグルクロン酸、硫酸、又はグルタチオンなどの生体成分を結合させる。これらの反応により薬物はより高度な水溶性を獲得し、体外に排泄されやすくなる。
【０００３】
第Ｉ相薬物代謝反応の約８割に関与するともいわれる代謝酵素は、チトクロームＰ４５０（以下ＣＹＰ；ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０の略）と呼ばれている。ＣＹＰは分子量約５００００（１個のアミノ酸の分子量を平均１００とすると約５００個のアミノ酸から成る）で、補欠分子族として１個のプロトヘムを有する。ＣＹＰの分類と命名法は、ＣＹＰの後にファミリー（アラビア数字）及びサブファミリー（アルファベッド）を付けた系統的名称を用いる。すなわち、アミノ酸配列の相同性が４０％を超える分子種を一つのファミリーとする。また、５５％を超えるグループをサブファミリーとして小分類する。一つのファミリーに、二つ以上のサブファミリーがあるときはアルファベット順にする（例えば、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、及びＣＹＰ２Ｃ）。更に、一つのサブファミリー内の複数の分子種は、表示の最後にアラビア数字を入れる（例えば、ＣＹＰ１Ａ１）。現在のところ、哺乳類の薬物代謝型ＣＹＰは１から４ファミリーまでがある（非特許文献１）。
【０００４】
実験用大動物として望まれるイヌの条件としては、（１）形態又は生理反応等が均一であること、（２）遺伝的な欠落を持たないこと、及び（３）両親や生年月日の明らかであること等が挙げられる。現在ある品種でこれらの条件を最もよく満たしてくれるのはビーグル犬であるといえる（非特許文献２）。そのため、ビーグル犬は、探索段階の化合物スクリーニング時において安全毒性及び薬物動態大動物試験で繁用される動物種である。近年、ビーグル犬薬物代謝機構を担うイヌＣＹＰに関しても次第に明らかにされつつある。いくつかのイヌＣＹＰファミリーは多彩なクローニング技術により同定されている。ＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ１Ａ２（非特許文献３）、ＣＹＰ２Ｂ１１（非特許文献４）、ＣＹＰ２Ｃ２１及びＣＹＰ２Ｃ４１（非特許文献３及び非特許文献５）、ＣＹＰ２Ｄ１５（非特許文献６）、ＣＹＰ２Ｅ１（非特許文献７）、並びにＣＹＰ３Ａ１２及びＣＹＰ３Ａ２６（非特許文献８及び非特許文献９）をコードする全又は部分遺伝子は既にクローニングされている。これらＣＹＰの殆どはオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；以下、ＯＲＦと称する）を含む全配列が明らかにされているが、ＣＹＰ１Ａ２に関しては部分配列しか明らかになっていない。ヒトにおいてＣＹＰ１ファミリーはＡとＢの二つのサブファミリーがある。３−メチルコラントレンなどの多環式芳香族炭化水素や２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ，ダイオキシン）などで誘導される分子種である。ＣＹＰ１ファミリーはＣＹＰの中で最もその機構が保存されており、ヒトと実験動物の基質特異性もよく類似している。がん原性多環式芳香族炭化水素又はマイコトキシン類の酸化、又は、芳香族アミン又は複素環式アミンの窒素原子の水酸化などが代表的な反応であり、がん原物質の代謝的活性化との関係がきわめて深い（非特許文献１０）。
ビーグル犬においてＣＹＰ１Ａ１は肺に微量ながら発現が確認されているが、肝臓には発現していない。ＣＹＰ１Ａ２は肝臓のみに発現しており、全肝臓ＣＹＰの約４％を占める（非特許文献３及び非特許文献１１）。
【０００５】
薬物応答性の個体差は薬物代謝能力の差によるものが大きい。薬物代謝能力の差は、最近までは体内動態の違いから見出されてきた。トルブタマイド、デブリソキン、又はスパルテインが典型例として知られている。これらの薬物体内動態の差は、それぞれを代謝するＣＹＰ遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）による代謝酵素活性の違いに起因することが明らかにされている。すなわち、ＤＮＡを構成する４つの塩基の置換により酵素タンパク質のアミノ酸の置換、ストップコドンの導入、又はフレームシフトの形成が生じる。アミノ酸置換では、酵素活性の低下を伴い、ストップコドンの導入及びフレームシフトの形成では、未成熟タンパク質の生成を伴う。そのため、薬物代謝酵素のＳＮＰにより体内動態に大きな個体差が認められる薬物が知られている（非特許文献１２）。
【０００６】
ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰでは、遺伝子上流領域にある−３８５８Ｇ＞Ａ ＳＮＰを生じるＣＹＰ１Ａ２＊１Ｃ及び−１６４Ｃ＞Ａ ＳＮＰを生じるＣＹＰ１Ａ２＊１Ｆにおいて、ＣＹＰ１Ａ２の発現量が低下するという報告がある。しかしながら、−１６４Ｃ＞Ａにおいては、遺伝的要因よりも喫煙による環境的要因により発現量が増加するという報告もある。また、他のヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰに関してはその機能的な意義についてはまだ不明である（非特許文献１３、非特許文献１４、及び非特許文献１５）。
【０００７】
ＳＮＰは、ＣＹＰにおいて最も広範に検討されているが、ＣＹＰ以外の酵素又は薬物輸送担体での知見も多い。チオプリンメチル転移酵素（ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ Ｓ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下、ＴＰＭＴと称する）はいくつかのチオプリン系薬物のメチル化反応を触媒する酵素である。ＴＰＭＴは、主に肝臓に存在するが、赤血球にも存在が認められることから、赤血球を用いたヒトにおける表現型解析が行われてきた。赤血球中の活性を指標とした場合、白人種の活性は三相性を示し、活性の高い者が８８．６％、中間の者が１１．１％、及び低い者が０．３％存在する。エバンス（Ｅｖａｎｓ）らは、６−メルカプトプリンにより急性の汎血球減少を起こした白血病患者のＴＭＰＴの遺伝子を解析し、酵素活性を消失させるようなアミノ酸置換を伴う点突然変異が３つ（ＴＰＭＴ＊２，ＴＰＭＴ＊３Ａ及びＴＰＭＴ＊３Ｃ）存在することを明らかとした（非特許文献１６）。サラバジオン（Ｓａｌａｖａｇｇｉｏｎｅ）らは、同様にイヌＴＰＭＴに関しても多型性を検討した。表現型解析の結果は、ヒトと同様の個体差が存在することを示したが、遺伝子診断の結果では有意なＴＰＭＴのＳＮＰを発見するには至らなかった（非特許文献１７）。
【０００８】
また、薬物輸送担体であるＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下、Ｐ−ｇｐと称する）をコードするＭＤＲ１（ｍｕｌｔｉ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）遺伝子では、ヒトにおいていくつかのＳＮＰが報告されている。ホフマイヤー（Ｈｏｆｆｍｅｙｅｒ）らは、白人被験者を対象として、Ｐ−ｇｐをコードするＭＤＲ１遺伝子の第２６エキソン３４３５番目の塩基がＣからＴに置換する遺伝子変異に伴い、消化管におけるＭＤＲ１発現量が低下し、ジゴキシンの経口投与後の血漿中濃度が高くなることを報告した（非特許文献１８）。ミレイ（Ｍｅａｌｅｙ）らは，中枢神経系におけるマクロライド系抗生物質アイバメクチンのコリー犬感受性の違いは，ｍｄｒ１遺伝子に生じるフレームシフト変異によって引き起こされる未成熟Ｐ−ｇｐによることを明らかとした（非特許文献１９）。
【０００９】
薬物代謝酵素に関与するイヌ関連のＳＮＰでは、ポールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）らが、ビーグル犬においてシクロオキシゲナーゼＩＩ阻害剤であるセレコキシブの代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザー（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ；以下、ＥＭと称する）群及びプアー・メタボライザー（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ；以下、ＰＭと称する）群に分類することができることを報告している。この多型性にはＣＹＰ２Ｄサブファミリーの関与が示唆されているが、詳細については不明である（非特許文献２０）。
【００１０】
宮下（Ｍｉｙａｓｈｉｔａ）らは、フォスフォジエステラーゼＩＶ阻害薬である４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンの血漿中代謝物パターンが異なる２群のビーグル犬が存在することを明らかとしている（非特許文献２１）。
東（Ａｚｕｍａ）らは、α７−ニコチンアセチルコリンレセプターアゴニストであるＧＴＳ−２１のビーグル犬における代謝物血漿中濃度に個体差が生じることを報告している。この個体差にＣＹＰ１Ａの発現量の違いが関与していることを示唆している（非特許文献２２）。
三瀬（Ｍｉｓｅ）らも、東（Ａｚｕｍａ）らと同様に、ＣＹＰ１Ａの発現量差によって抗ベンゾジアゼピン系アンタゴニストであるＡＣ−３９３３のビーグル犬血漿中濃度に個体間でのバラツキが生じることを報告している（非特許文献２３）。
しかしながら、ビーグル犬薬物代謝能力の表現型解析の個体差を明らかとするイヌＣＹＰのＳＮＰに関する遺伝子診断での解明はまだなされていない。
【００１１】
【非特許文献１】：加藤隆一・鎌滝哲也編，「薬物代謝学 医療薬学・毒性学の基礎として」，第２版，東京化学同人，２０００年１０月，ｐ．９−１９
【非特許文献２】：及川弘著，「犬の生物学」，初版，朝倉書店，１９６９年９月，ｐ．１７９−１８７
【非特許文献３】：「モルキュラー・ファマーコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」，（アメリカ），１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１
【非特許文献４】：「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」，（アメリカ），１９９０年，第２８１巻，ｐ．１０６−１１５
【非特許文献５】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），１９９８年，第２６巻，ｐ．２７８−２８３
【非特許文献６】：「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」，（アメリカ），１９９５年，第３１９巻，ｐ．３７２−３８２
【非特許文献７】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），２０００年，第２８巻，ｐ．９８１−９８６
【非特許文献８】：「バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ）」，（アメリカ）１９９１年，第１０８８巻，ｐ．３１９−３２２
【非特許文献９】：「ザ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペェリメンタル・セラピューティクッス（Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」，（アメリカ）１９９７年，第２８３巻，ｐ．１４２５−１４３２
【非特許文献１０】：加藤隆一・鎌滝哲也編，「薬物代謝学 医療薬学・毒性学の基礎として」，第２版，東京化学同人，２０００年１０月，ｐ．１９−２０
【非特許文献１１】：「ゼノビオティカ（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ）」，（イギリス），１９９６年，第２６巻，ｐ．７５５−７６３
【非特許文献１２】：ワナー・カロウ（Ｗａｒｎｅｒ Ｋａｌｏｗ），ウルス・メイヤー（ＵｒｓＭｅｙｅｒ），レイチェル・ティンダル（Ｒａｃｈｅｌ Ｔｙｎｄａｌｅ）編，石川智久監訳，「ファーマコゲノミクス２１世紀の創薬と個の医療」，第１版，テクノミック，２００２年１２月，ｐ．２９−４３
【非特許文献１３】：「ザ・ジャパニーズ・バイオケミカル・ソサイェティー（ＴｈｅＪａｐａｎｅｓｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｏｃｉｅｔｙ）」，（日本），１９９９年，第１２５巻，ｐ．８０３−８０８
【非特許文献１４】：「ブリティシュ・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」，（イギリス），１９９９年，第４７巻，ｐ．４４５−４４９
【非特許文献１５】：「ファーマコジェネティクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，（アメリカ），１９９９年，第９巻，ｐ．３６７−３７５
【非特許文献１６】：加藤隆一・鎌滝哲也編，「薬物代謝学 医療薬学・毒性学の基礎として」，第２版，東京化学同人，２０００年１０月，ｐ．１４１−１５５
【非特許文献１７】：「ファーマコジェネティクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，（アメリカ），２００２年，第１２巻，ｐ．７１３−７２４
【非特許文献１８】：「プロシディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，（アメリカ），２０００年，第９７巻，ｐ．３４７３−３４７８
【非特許文献１９】：「ファーマコジェネティクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，（アメリカ），２００１年，第１１巻，ｐ．７２−７３３
【非特許文献２０】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），１９９９年，第２７巻，ｐ．１１３３−１１４２
【非特許文献２１】：「第１７回日本薬物動態学会年会ポスター発表」，（日本），２００２年，２０ＰＥ−４６
【非特許文献２２】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ファーマコキネティクス（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）」，（日本），２００２年，ｐ．７５−８２
【非特許文献２３】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），２００４年，第３２巻，ｐ．２４０−２４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
化合物の薬理効果及び毒性の発現が依存する体内動態に大きな影響を与える、代謝能力の個体差が大きいイヌを用いて、医薬品候補である化合物の薬理効果試験及び毒性試験を行っているため、薬理効果及び毒性評価において個体差が大きく、データがばらつくという問題が生じている。
本発明の課題は、イヌ（特にはビーグル犬）における薬理効果試験及び毒性試験の実施に先立ち、使用される個体のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の遺伝子診断を迅速に実施し、正常な代謝能力を持つ群（ＥＭ群）、又は、薬物代謝能力が低い群（ＰＭ群）に、群分けすることができる簡便な方法を提供し、遺伝的に均質な個体により薬理効果試験及び毒性試験を実現することができ、正確な薬理効果及び毒性評価を可能とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である試験化合物として４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンを選択し、そのＥＭ型及びＰＭ型を決定するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰを決定し、ＰＭ型では、塩基置換により、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＯＲＦの途中でストップコドンが生じていることを見出した。次いで、血液サンプルより前記ＳＮＰの位置の配列を検出する簡便な方法（ＡＳＰ−ＰＣＲ法及びダイレクトシークエンス法）を確立し、４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンを投与したＥＭ群及びＰＭ群各５例について前記ＳＮＰ領域の配列を決定し、ＰＭ群ではいずれも塩基置換によりストップコドンが生じていること、ＥＭ群では、ヘテロ又はホモでストップコドンを生じずにＣＹＰ１Ａ２をコードする遺伝子を有していることを確認し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
［１］イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定することを特徴とするイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型の検出方法；
［２］イヌから核酸試料を得、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基に該当する塩基を決定する工程を含む、薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する方法；
［３］［２］記載の方法により薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する工程を含む、医薬品の試験に用いるイヌを選別する方法；
［４］［３］記載の方法で選別したエクステンスィブ・メタボライザー群又はプアー・メタボライザー群に被験薬を投与する工程を含む、被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する方法；
［５］ストリンジェントな条件で、配列番号１で表される塩基配列若しくは配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列又はその遺伝子多型を有するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖にハイブリダイズし、
（１）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＣである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、
（２）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＴである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、及び
（３）（１）若しくは（２）の相補鎖である、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ；
［６］配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなる、［５］記載の一本鎖ＤＮＡ；並びに
［７］イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を検出するための試薬を有効成分として含有する、イヌＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である薬物の代謝活性多型の診断剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明においては、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基に該当する塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを見い出した。このＳＮＰによりＣＹＰ１Ａ２の３７３番目のアルギニンに対応するコドンがストップコドンへと変化する。従って、Ｔ／Ｔ遺伝子型を有するイヌではＣＹＰ１Ａ２が発現しないため、Ｃ／Ｃ遺伝子型又はＣ／Ｔ遺伝子型を有するイヌと比較して、ＣＹＰ１Ａ２で代謝される薬物の血漿中濃度が極めて高くなることが予測される。このことは、本発明の実施例で述べたように、フォスフォジエステラーゼＩＶ阻害剤である化合物Ａの体内動態から証明されている。また、本発明においては、このＳＮＰを簡便に検出する方法としてＡＳＰ−ＰＣＲ法及びダイレクトシークエンス法を確立した。これらの方法を用いてイヌ６５例のＣＹＰ１Ａ２の遺伝子診断を実施することによりアレル頻度を明らかにした。
【００１６】
本発明で明らかにしたように、イヌＣＹＰ１Ａ２には１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）に該当する塩基にストップコドンを生じるＳＮＰが存在し、約１５％のイヌがこのＳＮＰをホモで有している。このＳＮＰは化合物Ａで認められたように、ＣＹＰ１Ａ２で代謝される薬物のイヌにおける体内動態の個体差の大きな要因となっている。化合物の薬理効果及び毒性の発現は体内動態に依存している。そのため、前記化合物がＣＹＰ１Ａ２で代謝される場合には、薬理効果及び毒性評価においても大きな個体差が生じるものと考えられる。本発明によれば、イヌにおける薬理効果試験及び毒性試験の実施に先立ち、使用される個体のＣＹＰ１Ａ２の遺伝子診断を迅速に実施することができる。これにより、遺伝的に均質な個体により薬理効果試験及び毒性試験を実現することができ、本発明以前より正確な薬理効果及び毒性評価が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［Ａ］本発明の検出方法及びイヌ選別方法
本発明の検出方法では、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定することによりイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型を検出する。本明細書において「イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目の塩基に該当する塩基」とは、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子において、「配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目の塩基」に該当する塩基を意味する。イヌＣＹＰ１Ａ２の塩基配列としては、種々の塩基配列、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１に記載のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の部分塩基配列、本発明者が本発明において初めて決定した配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列、又はそのアレル変異体の塩基配列などが存在する。従って、本発明においては、「配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目の塩基」に該当する塩基とは、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目であれば、前後の配列が配列番号２２で表される塩基配列と完全に一致する必要はないことを意味する。
【００１８】
また、本発明の検出方法では、イヌから核酸試料を得、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目、すなわち、第４エキソン８７番目の塩基に該当する塩基を決定することにより、薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザー（ＥＭ）であるか、又は、プアー・メタボライザー（ＰＭ）であるかを検出する。前記塩基が、Ｃ／Ｃ遺伝子型又はＣ／Ｔ遺伝子型である場合には、ＥＭであると判定することができ、Ｔ／Ｔ遺伝子型である場合には、ＰＭであると判定することができる。ＥＭとしては、Ｃ／Ｃ遺伝子型がより好ましい。
また、本発明のイヌ選別方法では、本発明の検出方法によりＥＭ又はＰＭのいずれであるかを検出し、医薬品の試験に用いるイヌを選別する。
【００１９】
１．イヌの核酸を含む試料の調製
本発明の方法で用いられる核酸試料、好ましくはイヌゲノムＤＮＡを含む試料は、イヌ（特にはビーグル犬）から単離されたあらゆる細胞（但し、生殖細胞を除く）、組織、又は臓器等を材料として調製することができる。前記材料としては，末梢血から分離した白血球又は単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、生化学検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００２０】
例えば、白血球を材料とする場合、まずイヌ（例えば、ビーグル犬）より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで，得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解及び変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮアーゼにより除去することができる。但し、ゲノムＤＮＡの抽出は、前記方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ］や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行うこともできる。また、常法で抽出したイヌｍＲＮＡからｃＤＮＡを製造し、遺伝子多型の検出に用いることもできる。
【００２１】
２．遺伝子多型の検出
次に、得られたイヌ核酸を含む試料から、本発明者らによって解明された、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子１１１７番目（すなわち、第４エキソンの８７番目）の塩基に該当する塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰの遺伝子型を診断する。以下、本発明方法で用いることができる代表的な遺伝子多型検出方法について説明する。
【００２２】
（１）ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法
遺伝子多型部位が制限酵素認識部位に含まれる場合、その制限酵素の消化により生じるＤＮＡ断片の長さの違いから、前記遺伝子多型の検出が可能である。この場合、（ａ）ＤＮＡを制限酵素で分解後、サザンブロットを行う方法と、（ｂ）多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、制限酵素で切断し、電気泳動により切断されるＤＮＡ断片の大きさを解析する方法とが挙げられる。
（ａ）の方法で用いられるプローブとしては、目的の多型部位を含んで、且つその多型部位から５’末端側及び３’末端側にそれぞれ約０．５〜２ｋｂにわたる配列に相当するＤＮＡ断片（アイソトープ、ビオチン、又は蛍光色素等で標識されたもの）が好ましい。また、（ｂ）の方法で用いられるＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２３】
（２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅後、熱変性し、電気泳動により、高次構造の異なる１本鎖ＤＮＡを分離する方法［「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９４年，第１６巻，ｐ．２９６−２９７；及び「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９６年，第２１巻，ｐ．５１０−５１４］である。遺伝子多型の有無により、１本鎖ＤＮＡの泳動距離が異なるため、そのパターンを解析することにより、多型のタイピングが可能である。タイピングの標準とするために、予め多型部位の塩基配列が確認されているＤＮＡ試料を、ＰＣＲの際の鋳型ＤＮＡとして、被験試料と同時に用いることが好ましい。ＰＣＲ増幅用プライマーとしては，５’末端を蛍光標識した、多型部位を含む約５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２４】
（３）ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法
ＡＳＯハイブリダイゼーション法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片を支持体（例えば、ナイロンフィルター等）にドットブロットし、それぞれの遺伝子多型に対応したプローブとのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴｍ値（溶解温度：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に準じた洗浄操作を行い、多型を検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）する方法［「クリニカ・ケミカ・アクタ；インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ ａｃｔａ；ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９０年，第１８９巻，ｐ．１５３−１５７］である。プローブとしては、１５〜２５塩基程度の合成オリゴヌクレオチド（シグナルを得るためには、ラジオアイソトープ、ビオチン、又は蛍光色素による標識が必要）が好ましい。
【００２５】
（４）ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡの塩基配列を直接ダイデオキシ法により解析する方法［「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９１年，第１１巻，ｐ．２４６−２４９］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５’末端側の位置に相当する１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドを用いる。
【００２６】
（５）ＡＳＰ−ＰＣＲ（Ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ＰＣＲ）法
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’末端側から３’末端側に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末端塩基にミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下し、電気泳動による検出が不可能になる。ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、その３’末端塩基が検出しようとする変異塩基に相補的になるように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無で遺伝子多型を検出する方法［「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９１年，第１９巻，ｐ．３５６１−３５６７；及び「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９２年，第２０巻，ｐ．４８３１−４８３７］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、一方は、３’末端に多型部位が位置するように設計された、好ましくは、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドであり、もう一方は、好ましくは、多型部位から０．０５〜２ｋｂ程度離れた部分の１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
（６）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動［Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）］法
ＤＧＧＥ法は、ＤＮＡ断片中の、ミスマッチを有するヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりも解離が容易であることを利用して遺伝子多型を検出する方法［「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９９年，第２７巻，ｐ．１０１６−１０１８］である。ヘテロデュプレックスは、解離が進むにつれ、ゲル電気泳動における移動度が低下するので、使用するポリアクリルアミドゲル中に尿素及びホルムアミドの密度勾配を設定しておくと、ホモデュプレックスとの移動度の差が更に強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、すなわち、変異の存在が検出される。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２８】
（７）ＲＮアーゼＡ切断法
ＲＮアーゼＡ（ＲＮＡ分解酵素）は、２本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。従って、多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、アイソトープ標識したＲＮＡプローブを、変性して１本鎖にしたＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ、ＲＮアーゼＡ処理後、電気泳動により分解すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるため、２本のバンドとして検出することができる［「ディエヌエー・アンド・セル・バイオロジー（ＤＮＡ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９９５年，第１４巻，ｐ．８７−９４］。この方法で用いられるＲＮＡプローブとしては、多型部位を含む通常１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２９】
（８）化学切断法
多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅後、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「Ｃ（シトシン）」に対してはヒドロキシルアミン、「Ｔ（チミン）」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾し、ピペリジン処理をすると、糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、前記処理を行った後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなっていれば変異が検出されたことになる［バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９６年，第２１巻，ｐ．２１６−２１８］。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３０】
（９）ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）法
ＤＯＬ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、蛍光標識された多型部位の直前の塩基まで含むダイプライマーと、それぞれのアレルに特異的な蛍光色素で標識されたダイターミネーターを耐熱性ＤＮＡリガーゼで連結させる方法［「ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９９８年，第８巻，ｐ．５４９−５５６」］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３１】
（１０）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法［「ジェネティック・アナリシス：バイオモルキュラー・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，１９９９年，第１４巻，ｐ．１４３−１４９；及び「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９９６年，第３４巻，ｐ．２９３３−２９３６］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１５〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドが好ましく、５’末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３’末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型の塩基変化の検出が可能である。
【００３２】
（１１）インベーダー法
インベーダー法では、２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチドと１種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドが使用される。非蛍光標識オリゴヌクレオチドの一つは、その５’末端側に、検出しようとする多型部位の存在するゲノム配列（以下、「鋳型」と称する）とは無関係な配列（以下、「フラップ」と称する）を有しており、フラップより３’末端側は、鋳型の多型部位から５’末端側の配列に特異的な相補配列となっている（以下、「アレルプローブ」と称する）。すなわち、アレルプローブの鋳型に特異的な相補配列部位の５’末端は鋳型の多型部位に相当する。もう一つの非蛍光標識オリゴヌクレオチドは、鋳型の多型部位から３’末端側の配列に特異的な相補配列を有する（以下、「インベーダープローブ」と称する）。インベーダープローブの３’末端も鋳型の多型部位に相当するが、鋳型の多型部位の塩基とは相補的ではなくてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチド［以下、「ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブ」と称する］は、３’末端側部分がフラップと相補的な配列であり、５’末端側はパリンドローム配列になっているため、自ら二本鎖を形成している。また、ＦＲＥＴプローブの５’末端近傍は蛍光色素で標識され、５’末端にはその蛍光を打ち消すクエンチャーが結合している。
【００３３】
まず、鋳型にアレルプローブとインベーダープローブをハイブリダイズさせると、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的である場合は、その多型部位において、鋳型、アレルプローブの５’末端、及びインベーダープローブの３’末端が特殊な構造を形成する。この構造を特異的に認識してエンドヌクレアーゼ活性を表す酵素（以下、「クリベース」と称する）が、アレルプローブからフラップ部分を切り離す。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズする。このとき、フラップとＦＲＥＴプローブとが、ＦＲＥＴプローブのクエンチャーが結合している５’末端の位置において、クリベースに特異的に認識される構造を形成するため、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによりＦＲＥＴプローブから切り離されて、ＦＲＥＴプローブに残った蛍光色素が蛍光を発する。
【００３４】
一方、鋳型配列に変異が存在し、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的でなく、ミスマッチとなっている場合は、クリベースに特異的に認識される構造が形成されないため、フラップはアレルプローブから切り離されない。このとき、切り離されずにアレルプローブに残ったままのフラップもＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズ可能であるが、アレルプローブから切り離されたフラップがハイブリダイズした場合と比較すると、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによってＦＲＥＴプローブから切り離される反応効率が低いため、ＦＲＥＴプローブが発する蛍光強度も低い。以上の原理により、多型の検出が可能となる［「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９３年，第５１０９巻，７７８−７８３；「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９９年，第３０巻，ｐ．２１３８７−２１３９４；及び「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９９９年，第１７巻，ｐ．２９２−２９６］。
【００３５】
（１２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、遺伝子多型のアレルに対応して異なる塩基配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドを合成してその質量を測定し、その差異を質量分析器により検出することによりタイピングする方法［「ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９９７年，第７巻，ｐ．３７８−３８８」；「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミストリー：ジャーナル・オブ・ザ・フォーラム・オブ・ヨーロピアン・クリニカル・ケミストリー・ソサイエティ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｒｕｍ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）」，１９９７年，第３５巻，ｐ．５４５−５４８］である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法では、はじめに多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、その後、多型部位に隣接するプライマーを用いた伸張反応により、それぞれのアレルに特異的なＤＮＡ伸張反応物をマススペクトルに基づき解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、多型を検出するためのプライマーは、多型部位に隣接した１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。
【００３６】
（１３）ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法
ＴＤＩ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた後、多型部位の直前に設計されたプライマーを用いて、プライマー伸張反応により、それぞれのアレルに対応する異なる蛍光色素で標識されたダイデオキシヌクレオチドを多型部位に取り込ませる方法で［「プロシィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステェィト・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９９７年，第９４巻，ｐ．１０７５６−１０７６１］である。プライマー伸張産物は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩプリズム３７７，アプライドバイオシステム社）などを用いて解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３７】
（１４）モレキュラー・ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）法
モレキュラー・ビーコンは、両末端に発光抑制体（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と蛍光体（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を持ったオリゴヌクレオチドである。ステム部分が５〜７塩基でループ構造が１５〜３０塩基のシステムループ構造が好ましい。従って、蛍光体は発光抑制体の働きにより、励起光照射下でも発光しない。一方、ループ構造内の塩基配列と相同なターゲットのＤＮＡとループ構造内の塩基配列がハイブリダイズすると、発光抑制体と蛍光体の距離が離れるために、蛍光体が励起光下で励起し蛍光を発する［「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９９８年，第１巻，ｐ．４９−５３；及び「遺伝子医学」２０００年，第４巻，ｐ．４６−４８］。モレキュラー・ビーコンのステム部分の塩基配列は、ターゲットＤＮＡとは相補的ではない。モレキュラー・ビーコンのステム構造のＴｍ値は、ターゲット領域をＰＣＲで増幅させるときにモレキュラー・ビーコンを反応液にいれて、ＰＣＲのアニーリング温度で励起光を当て蛍光を測定すると、モレキュラー・ビーコンがターゲット遺伝子に完全に相同な配列であれば、ハイブリダイズするため蛍光を発する。逆にミスマッチがあれば、モレキュラー・ビーコンはターゲットにハイブリダイズできず、蛍光を発することができない。この方法により遺伝子多型を検出することができる。
【００３８】
（１５）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション［Ｄｙｎａｍｉｃ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＤＡＳＨ）］法
ターゲットＤＮＡ（６０〜９０塩基対）をゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅する際に、末端をビオチン化したプライマーを用いて行う方法［「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９９８年，第１巻，ｐ．８７−８８；及び「遺伝子医学」２０００年，第４巻，ｐ．４７−４８］である。ＰＣＲ終了後、ビオチン化したプライマー側のストランド（ｓｔｒａｎｄ）は、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたマイクロタイターウェルに結合する。これに対して、未修飾のプライマー側のストランドは結合することができず、アルカリ溶液でリンスすると除去される。その後、このビオチン化したプライマーのストランドに対して、プローブＤＮＡ（好ましくは１５〜２１塩基）をハイブリダイズさせる。この時に２本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、蛍光を発する蛍光物質（ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｅ）を一緒に取り込ませる。その後、この蛍光強度を観察しながら変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させる。ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡが完全に相補的でなくミスマッチが有ったときには、完全に相補的である場合に比べ、変性し、発光しなくなる温度が低くなる。この温度の違いを観察することにより、遺伝子多型を検出することができる。
【００３９】
（１６）パドロック・プローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）法
リザルジィ（Ｌｉｚａｒｄｉ）らによって開発された方法［「ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，１９９８年，第３巻，ｐ．２２５−２３２；及び「遺伝子医学」，２０００年，第４巻，ｐ．５０−５１］である。一本鎖ターゲットＤＮＡにハイブリダイズするとプローブが環状になるように設計したプローブを用い、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズした後にＤＮＡリガーゼで結合させて完全な環状にし、その後アルカリホスファターゼ［Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ）］の脱リン酸化酵素でリン酸基を除去する。末端にミスマッチがあり環状になれなかった場合、リン酸基がなくなり環状化できなくなる。この環状ＤＮＡに対してプライマー（１）を設計し、ＤＮＡポリメラーゼで複製してレプリコン多量体を得る。このレプリコンに対してもプライマー（２）を設計し、この２種類のプライマーを一緒に混ぜてＤＮＡポリメラーゼで反応し、２本鎖ＤＮＡを増幅する。プライマー（１）は、ターゲットＤＮＡとは相補的でない部分に設計し、プライマー（２）は、環状になったプローブ（パドロック・プローブ：ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）の末端部分（ターゲットＤＮＡ）と相補的な配列（３’末端に遺伝子多型を含む）に設計し、多型検出には３’末端の一塩基置換させたプライマーを用いる。パドロック・プローブに対してローリング・サイクル反応（Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ−ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＣＡ）を改良したハイパーブランチド・ローリング−サークル増幅法（Ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＨＲＣＡ）法を用いて増幅させた後に、パドロック・プローブ内にある制限酵素認識サイトの制限酵素で処理し、電気泳動でバンドの有無を確認する。
【００４０】
（１７）ＵＣＡＮ法
ＵＣＡＮ法［タカラ酒造株式会社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏ．ｊｐ）参照］は、ＲＮＡをＤＮＡが両側からはさんだ型のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプライマー（ＤＲＤプライマー）の３’末端のＤＮＡを化学変化させておき、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないようにしておく。次に、一塩基変換が起こっている可能性のある塩基部位に、ＲＮＡ部分が結合するように設計したＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡを対合させる。ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみＲＮアーゼＨにより、対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分が切断される。この切断によって３’末端が新しく出現するので、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方，ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがその場所でマッチしていない場合、つまり、ＳＮＰが存在するときは、ＲＮアーゼＨがＤＲＤプライマーを切断しないので、ＤＮＡ増幅が起こらない。この遺伝子増幅の有無を検出することで遺伝子多型を検出することができる。
【００４１】
（１８）ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイは、多種類の多型部位を含むＤＮＡプローブをガラス基盤上に固定したもので、これに標識した核酸試料をハイブリダイゼーションして、蛍光シグナルによって多型の有無を検出する。一般に、ＤＮＡをガラス基盤上で合成していくものをＤＮＡチップ（オリゴＤＮＡチップ）と称し、ガラス基盤上にｃＤＮＡを乗せていくものをＤＮＡマイクロアレイと称する。基盤上に固定（又は合成）されるプローブは、オリゴＤＮＡチップであれば、多型部位を含む２０塩基程度のオリゴヌクレオチドが好ましく、ｃＤＮＡマイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基程度の２本鎖ＤＮＡが好ましい。
【００４２】
（１９）ＥＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｒｒａｙ）法
ＥＣＡ法は、ＤＮＡの２本鎖に結合するインターカレーターの電気化学的性質を利用した遺伝子タイピング法である。すなわち、多型を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、基盤に固定化したそれぞれのアレルと相補するプローブとハイブリダイズ後にインターカレーターを作用させる。このとき，プローブに対して完全相補と不完全相補の場合で結合するインターカレーターの量が異なる。ＥＣＡ法で用いるインターカレーターは、電気化学的性質を有するフェロセンという物質を含有するため、結合したインターカレーターの量に比例して電気的シグナルが異なる．ＥＣＡ法は、この違いを利用して遺伝子多型を検出する方法［「アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２０００年，第７２巻，ｐ．１３３４−１３４１］である。
【００４３】
以上は、本発明で用いることができる代表的な遺伝子多型検出方法であるが、これらに限定されず、他の遺伝子多型検出方法も本発明方法のために利用することができる。また、本発明方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、又は、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。後述する実施例では、ＡＳＰ−ＰＣＲ法又はダイレクトシークエンス法を用いた本発明方法の具体的実施態様を示す。
【００４４】
［Ｂ］本発明の試験方法
本発明の試験方法では、本発明の検出方法により薬物代謝速度がＥＭか、ＰＭかを検出し、医薬品の試験に用いるイヌを選別し、次いでＥＭ群又はＰＭ群のイヌに被験薬を投与し、被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する。この際ＥＭ群、特にＣ／Ｃ遺伝子型のイヌを用いることがより好ましい。
【００４５】
被験薬の薬理効果を試験する方法は、被験薬の適応症により適宜選択することができる。
毒性を試験する方法としては常法を用いることができ、例えば、ビーグル犬における単回経口投与毒性試験、ビーグル犬における２週間経口投与毒性試験、ビーグル犬における単回静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における１週間静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における４週間静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における１週間静脈内持続投与毒性試験、ビーグル犬における４週間静脈内持続投与毒性試験、ビーグル犬における単回静脈内増量方式投与試験、ビーグル犬における２週間反復静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における４週間反復経口投与毒性試験、ビーグル犬における１３週間反復経口投与毒性試験、又はビーグル犬における５２週間反復経口投与毒性試験等が挙げられる［マーヒン・メイナス（Ｍａｈｉｎ・Ｍａｉｎｅｓ）主著「カレント プロトコールズ イン トキシコロジー ボリューム１，２（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ１，２）」，ジョンウィリィ＆ソンズ社（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．），２００１年，ｐ．１．０．１−１６．６．５；及び白須泰彦，吐山豊秋編「毒性試験ハンドブック」，株式会社サイエンスフォーラム，１９８０年５月，ｐ．８１−２８２］。
【００４６】
本発明の試験方法は、イヌの選別と、被験薬の薬理効果及び／又は毒性の試験とを分担して行うこともでき、本発明の方法によりＥＭ群又はＰＭ群に選別されたイヌを入手し、ＥＭ群又はＰＭ群のみを用いて被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する方法も、本発明に含まれる。
【００４７】
［Ｃ］本発明の一本鎖ＤＮＡ及び代謝活性多型の診断剤
本発明の一本鎖ＤＮＡは、ストリンジェントな条件で、配列番号１で表される塩基配列若しくは配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列又はその遺伝子多型を有するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖にハイブリダイズし、
（１）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＣである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ［好ましくは、配列番号１４で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ（すなわち、実施例４で使用したプライマーＳ０７ｗｉｌｄ）］、
（２）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＴである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ［好ましくは、配列番号１６で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ（すなわち、実施例４で使用したプライマーＳ０７ｍｕｔａｎｔ）］、及び
（３）（１）若しくは（２）の相補鎖である、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡである。
「配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基」とは、配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基であれば、前後の配列が配列番号１又は配列番号２２で表される塩基配列と完全に一致する必要はないことを意味する。
【００４８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、特に限定されるものではないが、好ましくは、実施例４に記載した反応系（ＫＯＤ用ＰＣＲバッファー最終濃度１Ｘ、ｄＮＴＰミックス最終濃度各０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸マグネシウム最終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＣＲプライマーセット最終濃度各０．３μｍｏｌ／Ｌ、及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−最終濃度０．０２Ｕｎｉｔ）及びＰＣＲ反応条件（９４℃２分の後、９４℃１５秒、５６℃３０秒、及び６８℃３０秒からなるサイクルを３５サイクル行い、更に６８℃１．５分）である。
【００４９】
本発明の一本鎖ＤＮＡは、本発明方法における、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソンの８７番目）の塩基に該当する塩基（つまり、配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目又は配列番号１で表される塩基配列における４０５番目に該当する塩基）の遺伝子多型の検出において、前記塩基がＣ又はＴのいずれであるかを決定するのに用いることができる。
本発明の一本鎖ＤＮＡとして、配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡが特に好ましい。
また、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目における塩基に該当する塩基を検出するための試薬を有効成分として含有する、イヌＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である薬物の代謝活性多型の診断剤も本発明に含まれる。検出するための試薬としては、例えば、本発明の一本鎖ＤＮＡが含まれる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
《実施例１：ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰ決定》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ビーグル犬肝臓より単離したトータルＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡの部分塩基配列を同定し、更には一部のビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰを決定した。
【００５２】
すなわち、予備検討試験（後述する実施例７を参照）において群分けされたＥＭ型ビーグル犬Ａ及びＰＭ型ビーグル犬Ｂの各１例ずつ（計２例）をペントバルビタール５０ｍｇ／ｍＬ／ｋｇ静脈内投与麻酔下において安楽死させ、動物解剖後、それぞれの肝臓を摘出した。摘出後、急速凍結させた肝臓よりＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて付随のプロトコールに従い、トータルＲＮＡを回収した。
【００５３】
回収したトータルＲＮＡを用いて、５００ｎｇトータルＲＮＡを鋳型に逆転写酵素によってＲＮＡからｃＤＮＡ合成を、ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ Ｖｅｒ．１．１（宝酒造株式会社）で実施した。逆転写反応における条件を表１に示す。なお、「ＲＮアーゼフリー滅菌水」の容量「ＸμＬ」は、ＲＮアーゼフリー滅菌水の量を調整することにより、反応系の総容量を４０．０μＬにすることを意味する。
【００５４】
【００５５】
続いて、逆転写反応において合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。イヌＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ部分塩基配列を認識するＰＣＲプライマーとしては、プライマーＳ０１（配列番号２）及びプライマーＡ０１（配列番号３）のセット、プライマーＳ０２（配列番号４）及びプライマーＡ０２（配列番号５）のセット、プライマーＳ０３（配列番号６）及びプライマーＡ０３（配列番号７）のセット、並びにプライマーＳ０４（配列番号８）及びプライマーＡ０４（配列番号９）のセットからなる、計４つのＰＣＲプライマーセットを用いた。なお、プライマーは、Ｅａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表２に示す。
【００５６】
【００５７】
ＰＣＲの結果、増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、Ｓ０１及びＡ０１のプライマーセットからは７９８ｂｐであり、Ｓ０２及びＡ０２のプライマーセットからは９５１ｂｐであり、Ｓ０３及びＡ０３のプライマーセットからは５５１ｂｐであり、Ｓ０４及びＡ０４のプライマーセットからは６５８ｂｐであった。増幅された各ＤＮＡ断片は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）を用いて付随のプロトコールに従い精製した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の各多型部位を同定するための塩基配列の決定は、精製したＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７：アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により解析した。シークエンス解析に用いたプライマーとして、ＰＣＲプライマーＳ０１、Ｓ０２、Ｓ０３、Ｓ０４、Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、及びＡ０４を用いた。
【００５８】
その結果、存在することが確認された遺伝子多型を表３にまとめた。なお、塩基配列の番号は、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子に関する既知の部分塩基配列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１）の最初の塩基を１番とする番号とし、前述の既知配列を公知塩基配列とした。
【００５９】
【００６０】
これらＳＮＰの中で、特に既知ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１０８７番目の塩基がＣからＴへと置換されており、アミノ酸がアルギニンからストップコドンに変換するＳＮＰがビーグル犬Ｂより見いだされたことが、最もＰＭ型ビーグル犬ＢのＣＹＰ１Ａ２の代謝活性能を著しく変化させていると推察された。
【００６１】
《実施例２：５’ＲＡＣＥ法を用いたビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子５’末端領域の塩基配列同定試験》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ビーグル犬肝臓より単離したトータルＲＮＡを鋳型として、５’ＲＡＣＥ（５’ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法により、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子５’末端未同定領域の塩基配列を同定し、開始コドンであるメチオニンからストップコドンまでを含むビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ全塩基配列を同定した。
【００６２】
すなわち、実施例１において摘出したＥＭ型ビーグル犬Ａの肝臓組織の約０．１ｇを用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて付随のプロトコールに従いトータルＲＮＡを抽出した。
摘出後速やかに急速凍結されたビーグル犬肝臓組織約０．１ｇをすり鉢で細かく粉砕し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１ｍＬに懸濁した。その懸濁液にクロロホルム０．２ｍＬを加え、振とう後、遠心分離し、水層のみ回収し、イソプロパノール沈殿法により、ＲＮＡをペレット状にし、ＲＮアーゼフリー水１００μＬにてペレットを溶解した。
抽出したトータルＲＮＡ溶液６．５μＬ（１０μｇ量）に、１０×ＤＮアーゼＩリアクションバッファー１μＬ、１Ｕ／μＬ−ＤＮアーゼＩ１μＬ、及びＲＮアーゼフリー水１．５μＬをそれぞれ加え、室温１５分間インキュベートした。次に、２５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ１μＬを加え、６５℃にて１０分間インキュベートした。
【００６３】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマニュアルに記載されているプロトコールに従い、抽出したトータルＲＮＡ３μｇ量を用いて５’ＲＡＣＥ法を実施した。
すなわち、トータルＲＮＡを仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ；Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理した。ＣＩＰ処理後、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ；ｔｏｂａｃｃｏ ａｃｉｄ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理し、キャップ化されたｍＲＮＡからキャップ構造を取り除き、５’末端のリン酸を露出させた。ＴＡＰで処理したＲＮＡにＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ（配列番号１９）をＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて結合させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて５０℃にて６０分間処理した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’プライマー（配列番号２０）と遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ；ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２１）でＰＣＲを行い、５’末端を増幅した。反応条件を表４に示す。
【００６４】
【００６５】
ＰＣＲ反応物を電気泳動により分析した結果、大きさが約２５０ｂｐの増幅されたＤＮＡ断片を確認した。確認されたＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｏｒｇｅｎ Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＫｉｔによりベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングした。
ベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングしたＤＮＡ断片のシークエンス解析を行った。その結果、既知のビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２部分塩基配列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１）とのオーバーラップが確認された。５’ＲＡＣＥ法によって得られた６クローンのコンセンス配列は、配列番号２２で表される塩基配列における１番目から１７０番目までの塩基配列である。
また、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子に関する既知の部分塩基配列と今回我々が得たＣＹＰ１Ａ２部分配列とのオーバーラップにより得られた、実施例１のＥＭ型ビーグル犬ＡのＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ全塩基配列は、配列番号２２で表される塩基配列であり、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は６３番目〜１６０１番目である。
なお、９例のＥＭ型ビーグル犬についても同様にＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ全塩基配列を決定した。ビーグル犬Ａでは、配列番号２２で表される塩基配列における１３０５、１３６１、１３６５、及び１６１５番目は、それぞれ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ａ、及びＣ／Ｔとヘテロであったが、他のビーグル犬においてはＣ、Ｃ、Ｇ、及びＣであった
以上の結果より、実施例１において同定されたストップコドンを生じる既知ＣＹＰ１Ａ２遺伝子部分塩基配列の１０８７番目のＳＮＰは、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基がＣからＴへと置換されており、３７３番目のアミノ酸がアルギニンからストップコドンに変換するＳＮＰであることが明らかとなった。
【００６６】
《実施例３：ＣＹＰ１Ａ２遺伝子第４エキソンの８７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰ》
続いて、このビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを容易に検出するために、ゲノムＤＮＡ上でのＳＮＰの位置を探索した。
本実施例では、以下に示す手順に従って、他の哺乳類ＣＹＰ１ファミリーのゲノム情報を参考に目的ＳＮＰの位置を予測し、ビーグル犬白血球中のゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを実施後、ダイレクトシークエンス法により目的ＳＮＰ周辺のゲノムＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００６７】
すなわち、ヒトＣＹＰ１Ａ１（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：ＡＦ２５３３２２）、ヒトＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：ＡＦ２５３３２２）、マウスＣＹＰ１Ａ１（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｘ０１６８１）、マウスＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｘ０１６８２）、ラットＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｋ０２２４６）、及びラットＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｋ０３２４１）のエキソン及びイントロンの大きさを比較すると、イントロンの大きさは各分子種で異なっていたが、エキソンの大きさはそれぞれのエキソンで種を超えて保存されていた。つまり、これらの哺乳類ＣＹＰ１ファミリーの第１エキソンの大きさは約８３０ｂｐであり、第２エキソンの大きさは約１２０ｂｐであり、第３エキソンの大きさは約８９ｂｐであり、第４エキソンの大きさは約１２３ｂｐであり、第５エキソンの大きさは約８６ｂｐであり、第６エキソンの大きさは約２８５ｂｐであった。この情報を踏まえて目的ＳＮＰの位置を第４エキソン内に存在すると予測した。
【００６８】
イヌゲノムＤＮＡは、ビーグル犬より無処理注射針で採血した全血をＥＤＴＡ・２Ｋ入り滅菌済みバキュティナ採血管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）にて確保した。全血よりＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）（宝酒造株式会社）を用いて付随しているプロトコールに従い、イヌゲノムＤＮＡを抽出した。
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いて目的のＳＮＰを含有するゲノムＤＮＡ領域を増幅させるために、ＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。プライマーセットとして、第４エキソン前後の第３イントロン及び第４イントロンの塩基配列を明らかにするために、予想される第３エキソン内にセンス方向のプライマーＳ０５（配列番号１０）を、第５エキソン内にアンチセンス方向のプライマーＡ０５（配列番号１１）を設計した。プライマーはＥａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表５に示す。
【００６９】
【００７０】
ＰＣＲの結果、Ｓ０５及びＡ０５のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の大きさは１３８０ｂｐであった。増幅されたＤＮＡ断片は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）を用いて付随のプロトコールに従い精製した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の多型部位を同定するための塩基配列の決定は、精製したＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７：アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により解析した。シークエンス解析に用いたプライマーとして、ＰＣＲプライマーＳ０５、Ａ０５、Ｓ０６（配列番号１２）、及びＡ０６（配列番号１３）を用いた。
【００７１】
その結果、配列番号１で表される塩基配列が決定された。配列番号１で表される塩基配列における４０５番目のＴが目的ＳＮＰ箇所（すなわち、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目）である。
ＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ塩基配列及び高等真核生物のイントロンの両端には、ＧＴ及びＡＧというコンセサス配列が存在する。「ＧＴ−ＡＧ」ルールに従って、ＣＹＰ１Ａ２ゲノムＤＮＡにおける第３イントロン、第４エキソン、及び第４イントロンの塩基配列を同定した。その結果、配列番号１で表される塩基配列において、６３番目〜３１８番目が第３イントロンであり、３１９番目〜４４２番目が第４エキソンであり、４４３番目〜１３３８番目が第４イントロンであると考えられる。
以上の結果より、目的ＳＮＰは、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第４エキソン８７番目の塩基におけるＣからＴへの置換であることが判明した。
【００７２】
《実施例４：ＡＳＰ−ＰＣＲ法によるＳＮＰ検出》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを検出するため、ビーグル犬白血球中のゲノムＤＮＡを単離し、ＡＳＰ−ＰＣＲを実施後、アガロースゲル電気泳動パターンによってＳＮＰの存在を判定した。
【００７３】
すなわち、イヌゲノムＤＮＡは、実施例３で述べた方法と同一の方法で抽出した。
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。アレル特異的に反応するＰＣＲプライマーセットとしては、プライマーＳ０７ｗｉｌｄ（配列番号１４）及びプライマーＡ０７（配列番号１５）のセット、並びにプライマーＳ０７ｍｕｔａｎｔ（配列番号１６）及びプライマーＡ０７のセットの、２つのＰＣＲプライマーセットを用いた。配列番号１４で表される塩基配列における１９番目（Ｃ）及び配列番号１６で表される塩基配列における１９番目（Ｔ）が目的ＳＮＰを認識する箇所である。プライマーは、Ｅａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表６に示す。
【００７４】
【００７５】
ＰＣＲの結果、増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、Ｓ０７ ｗｉｌｄ及びＡ０７プライマーセット、並びにＳ０７ ｍｕｔａｎｔ及びＡ０７プライマーセットからはいずれも３６５ｂｐであった。アガロースゲル電気泳動の結果、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第４エキソン８７番目の塩基がＣからＴへと変異するＳＮＰにおいて、Ｃアレルをホモで持つ場合は、Ｓ０７ ｗｉｌｄ及びＡ０７プライマーセットでのみ、ＤＮＡ断片が増幅された。両アレルをヘテロで持つ場合は、Ｓ０７ ｗｉｌｄ及びＡ０７プライマーセット、並びにＳ０７ ｍｕｔａｎｔ及びＡ０７プライマーセットのいずれにおいても、ＤＮＡ断片が増幅された。Ｔアレルをホモで持つ場合は、Ｓ０７ ｍｕｔａｎｔ及びＡ０７プライマーセットでのみ、ＤＮＡ断片が増幅された。
【００７６】
《実施例５：ダイレクトシークエンス法によるＳＮＰ検出》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを検出するため、ビーグル犬白血球中のゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを実施後、ダイレクトシークエンスによってＳＮＰの存在を判定した。
【００７７】
すなわち、イヌゲノムＤＮＡは、実施例３で述べた方法と同一の方法で抽出した。
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲプライマーとして、プライマーＳ０５及びプライマーＡ０７がセットのＰＣＲプライマーセットを用いた。プライマーはＥａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表７に示す。
【００７８】
【００７９】
ＰＣＲの結果、増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、Ｓ０５及びＡ０７プライマーセットからは７５２ｂｐであった。増幅されたＤＮＡ断片は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）を用いて付随のプロトコールに従い精製した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の各多型部位を同定するための塩基配列の決定は、精製したＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７：アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により解析した。シークエンス解析に用いたプライマーとして、ＰＣＲプライマーＳ０８（配列番号１７）及びＡ０８（配列番号１８）を用いた。
【００８０】
その結果、シークエンス波形によりＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰの塩基配列を同定した。Ｃアレルをホモで持つ場合は、Ｃの波形のみが検出された。両アレルをヘテロで持つ場合は、Ｃ及びＴ両方の波形が検出された。Ｔアレルをホモで持つ場合は、Ｔの波形のみが検出された。
【００８１】
《実施例６：アレル頻度解析》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰのアレル頻度を解析するため、実施例４及び実施例５の試験結果を採用した。
ビーグル犬６５例のＣＹＰ１Ａ２遺伝子１１１７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰ遺伝子診断結果を、表８に示す。
【００８２】
【００８３】
表８において、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソンの８７番目）がＣである遺伝子をホモで有するものは「Ｃ／Ｃ」、前記部位がＴである遺伝子をホモで有するものは「Ｔ／Ｔ」、そして、両遺伝子をヘテロで有するものは「Ｃ／Ｔ」として表記する。表８に示すとおり、Ｃ／Ｃが２５例（３８％）であり、Ｃ／Ｔが２９例（４５％）であり、Ｔ／Ｔが１１例（１７％）であった。アレル頻度は、Ｃアレルが０．６１であり、Ｔアレルが０．３９であった。
【００８４】
《実施例７：ビーグル犬を用いた薬物動態試験》
フォスフォジエステラーゼＩＶ阻害薬である４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（国際公開ＷＯ９７／１９０７８号パンフレット又は特許第３１１０７６５号明細書の実施例７参照；以下、化合物Ａと称する）は、ビーグル犬において、ＭＭ−１からＭＭ−５までの５種の代謝物に代謝されることが知られている。これらはいずれも一水酸化体であり、第一相薬物代謝反応による生成物と考えられている。宮下（Ｍｉｙａｓｈｉｔａ）らは、ビーグル犬をＭＭ−２が血漿中主代謝物である群及びＭＭ−１ならびにＭＭ−５が主代謝物である群に大別できることを報告している［「第１７回日本薬物動態学会年会ポスター発表」，（日本），２００２年，２０ＰＥ−４６］。
【００８５】
本実施例では、以下に示す手順に従って、化合物Ａを経口投与後、未変化体及び代謝物の濃度推移を測定する薬物動態試験を実施した。
すなわち、雄性ビーグル犬１０例に、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁させた化合物Ａ投与液を経口投与（０．３ｍｇ／ｋｇ）後、０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、及び８．０時間後に採血を実施した。血漿を液−液抽出後、未変化体及び代謝物の高性能液体クロマトグラフィーを用いた蛍光検出器による同時測定法（以下、ＨＰＬＣ−ＦＬ法と称する）に従い血漿中濃度推移を測定した。
化合物Ａ及び代謝物同時測定ＨＰＬＣ−ＦＬ法の条件を表９に、移動相濃度勾配を表１０に、それぞれ示す。
【００８６】
【００８７】
【００８８】
本実施例に用いた薬物動態試験用ビーグル犬は、表現型解析の予備検討を行なうことにより選択し、ＭＭ−２が主代謝物であるイヌ（Ｉ型）を５例、ＭＭ−１及びＭＭ−５が主代謝物であるイヌ（ＩＩ型）を５例用いた。化合物Ａ及び代謝物の血漿中濃度推移について、Ｉ型の結果を図１に、ＩＩ型の結果を図２にそれぞれ示す。
【００８９】
薬物動力学パラメータである最高血漿中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）、最高血中薬物濃度（Ｃｍａｘ）、無限大時間までの血中濃度下面積（ＡＵＣｉｎｆ）、及び血中半減期（Ｔ１／２）を算出した。結果を表１１に示す。
【００９０】
【００９１】
未変化体に関する薬物動力学パラメータは、ＣｍａｘではＩＩ型はＩ型の７．５倍であり、ＡＵＣｉｎｆではＩＩ型はＩ型の９．７倍であった。以上より、Ｉ型がＥＭ型であり、ＩＩ型がＰＭ型であることがわかる。
また、実施例６におけるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰ遺伝子診断の結果、ＥＭ群のビーグル犬はＣ／Ｃ遺伝子型が２例で、Ｃ／Ｔ遺伝子型が３例であり、一方、ＰＭ群のビーグル犬においては５例全てがＴ／Ｔ遺伝子型であった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、例えば、薬理効果試験又は毒性試験などに使用するイヌの薬剤代謝能力の個体差を、前記試験に先立って検出することができ、化合物の薬理効果又は毒性の評価の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
［図１］Ｉ型ビーグル犬における、４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オン及び代謝物の血漿中濃度推移を示すグラフである。横軸は時間（ｈｒ）を、縦軸は血漿中濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、記号「Ａ」は化合物Ａを意味する。
［図２］ＩＩ型ビーグル犬における、４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オン及び代謝物の血漿中濃度推移を示すグラフである。横軸は時間（ｈｒ）を、縦軸は血漿中濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、記号「Ａ」は化合物Ａを意味する。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号１９の配列で表される塩基配列は、人工的に合成したＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏである。
配列番号２０の配列で表される塩基配列は、人工的に合成したＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’ｐｒｉｍｅｒである。
配列番号２３の配列で表されるアミノ酸配列において、４１５番の位置の記号「Ｘａａ」はＧｌｕ又はＧｌｎを意味し、４３３番の位置の記号「Ｘａａ」はＧｌｙを意味し、４３５番の位置の記号「Ｘａａ」はＡｌａ又はＴｈｒを意味する。
【図１】
【図２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の試験に用いるイヌ（特にはビーグル犬）のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；以下、ＳＮＰと称する）決定に基づく薬剤代謝における個体間変動の検出，医薬品の試験に用いるイヌの選別方法，及び多型領域の配列決定のためのＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物代謝とは生体内における酵素による化合物の化学構造の変化である。これら薬物代謝に関与する酵素を薬物代謝酵素という。薬物代謝酵素は、元来、生体内物質（ステロイド、脂肪酸、及び胆汁酸など）の合成又は分解反応を触媒していたものと考えられるが、体内に摂取される薬物又は侵入してくる薬物（異物）を代謝して体外に排出させる役目を持つ。
薬物代謝反応は第Ｉ相反応と第ＩＩ相反応に大別される。第Ｉ相反応では、酸化、還元、及び／又は加水分解により、薬物に極性官能基が導入される。第ＩＩ相反応では、第Ｉ相反応で生成した極性官能基にグルクロン酸、硫酸、又はグルタチオンなどの生体成分を結合させる。これらの反応により薬物はより高度な水溶性を獲得し、体外に排泄されやすくなる。
【０００３】
第Ｉ相薬物代謝反応の約８割に関与するともいわれる代謝酵素は、チトクロームＰ４５０（以下ＣＹＰ；ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０の略）と呼ばれている。ＣＹＰは分子量約５００００（１個のアミノ酸の分子量を平均１００とすると約５００個のアミノ酸から成る）で、補欠分子族として１個のプロトヘムを有する。ＣＹＰの分類と命名法は、ＣＹＰの後にファミリー（アラビア数字）及びサブファミリー（アルファベッド）を付けた系統的名称を用いる。すなわち、アミノ酸配列の相同性が４０％を超える分子種を一つのファミリーとする。また、５５％を超えるグループをサブファミリーとして小分類する。一つのファミリーに、二つ以上のサブファミリーがあるときはアルファベット順にする（例えば、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、及びＣＹＰ２Ｃ）。更に、一つのサブファミリー内の複数の分子種は、表示の最後にアラビア数字を入れる（例えば、ＣＹＰ１Ａ１）。現在のところ、哺乳類の薬物代謝型ＣＹＰは１から４ファミリーまでがある（非特許文献１）。
【０００４】
実験用大動物として望まれるイヌの条件としては、（１）形態又は生理反応等が均一であること、（２）遺伝的な欠落を持たないこと、及び（３）両親や生年月日の明らかであること等が挙げられる。現在ある品種でこれらの条件を最もよく満たしてくれるのはビーグル犬であるといえる（非特許文献２）。そのため、ビーグル犬は、探索段階の化合物スクリーニング時において安全毒性及び薬物動態大動物試験で繁用される動物種である。近年、ビーグル犬薬物代謝機構を担うイヌＣＹＰに関しても次第に明らかにされつつある。いくつかのイヌＣＹＰファミリーは多彩なクローニング技術により同定されている。ＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ１Ａ２（非特許文献３）、ＣＹＰ２Ｂ１１（非特許文献４）、ＣＹＰ２Ｃ２１及びＣＹＰ２Ｃ４１（非特許文献３及び非特許文献５）、ＣＹＰ２Ｄ１５（非特許文献６）、ＣＹＰ２Ｅ１（非特許文献７）、並びにＣＹＰ３Ａ１２及びＣＹＰ３Ａ２６（非特許文献８及び非特許文献９）をコードする全又は部分遺伝子は既にクローニングされている。これらＣＹＰの殆どはオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；以下、ＯＲＦと称する）を含む全配列が明らかにされているが、ＣＹＰ１Ａ２に関しては部分配列しか明らかになっていない。ヒトにおいてＣＹＰ１ファミリーはＡとＢの二つのサブファミリーがある。３−メチルコラントレンなどの多環式芳香族炭化水素や２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ，ダイオキシン）などで誘導される分子種である。ＣＹＰ１ファミリーはＣＹＰの中で最もその機構が保存されており、ヒトと実験動物の基質特異性もよく類似している。がん原性多環式芳香族炭化水素又はマイコトキシン類の酸化、又は、芳香族アミン又は複素環式アミンの窒素原子の水酸化などが代表的な反応であり、がん原物質の代謝的活性化との関係がきわめて深い（非特許文献１０）。
ビーグル犬においてＣＹＰ１Ａ１は肺に微量ながら発現が確認されているが、肝臓には発現していない。ＣＹＰ１Ａ２は肝臓のみに発現しており、全肝臓ＣＹＰの約４％を占める（非特許文献３及び非特許文献１１）。
【０００５】
薬物応答性の個体差は薬物代謝能力の差によるものが大きい。薬物代謝能力の差は、最近までは体内動態の違いから見出されてきた。トルブタマイド、デブリソキン、又はスパルテインが典型例として知られている。これらの薬物体内動態の差は、それぞれを代謝するＣＹＰ遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）による代謝酵素活性の違いに起因することが明らかにされている。すなわち、ＤＮＡを構成する４つの塩基の置換により酵素タンパク質のアミノ酸の置換、ストップコドンの導入、又はフレームシフトの形成が生じる。アミノ酸置換では、酵素活性の低下を伴い、ストップコドンの導入及びフレームシフトの形成では、未成熟タンパク質の生成を伴う。そのため、薬物代謝酵素のＳＮＰにより体内動態に大きな個体差が認められる薬物が知られている（非特許文献１２）。
【０００６】
ヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰでは、遺伝子上流領域にある−３８５８Ｇ＞Ａ ＳＮＰを生じるＣＹＰ１Ａ２＊１Ｃ及び−１６４Ｃ＞Ａ ＳＮＰを生じるＣＹＰ１Ａ２＊１Ｆにおいて、ＣＹＰ１Ａ２の発現量が低下するという報告がある。しかしながら、−１６４Ｃ＞Ａにおいては、遺伝的要因よりも喫煙による環境的要因により発現量が増加するという報告もある。また、他のヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰに関してはその機能的な意義についてはまだ不明である（非特許文献１３、非特許文献１４、及び非特許文献１５）。
【０００７】
ＳＮＰは、ＣＹＰにおいて最も広範に検討されているが、ＣＹＰ以外の酵素又は薬物輸送担体での知見も多い。チオプリンメチル転移酵素（ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ Ｓ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下、ＴＰＭＴと称する）はいくつかのチオプリン系薬物のメチル化反応を触媒する酵素である。ＴＰＭＴは、主に肝臓に存在するが、赤血球にも存在が認められることから、赤血球を用いたヒトにおける表現型解析が行われてきた。赤血球中の活性を指標とした場合、白人種の活性は三相性を示し、活性の高い者が８８．６％、中間の者が１１．１％、及び低い者が０．３％存在する。エバンス（Ｅｖａｎｓ）らは、６−メルカプトプリンにより急性の汎血球減少を起こした白血病患者のＴＭＰＴの遺伝子を解析し、酵素活性を消失させるようなアミノ酸置換を伴う点突然変異が３つ（ＴＰＭＴ＊２，ＴＰＭＴ＊３Ａ及びＴＰＭＴ＊３Ｃ）存在することを明らかとした（非特許文献１６）。サラバジオン（Ｓａｌａｖａｇｇｉｏｎｅ）らは、同様にイヌＴＰＭＴに関しても多型性を検討した。表現型解析の結果は、ヒトと同様の個体差が存在することを示したが、遺伝子診断の結果では有意なＴＰＭＴのＳＮＰを発見するには至らなかった（非特許文献１７）。
【０００８】
また、薬物輸送担体であるＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下、Ｐ−ｇｐと称する）をコードするＭＤＲ１（ｍｕｌｔｉ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）遺伝子では、ヒトにおいていくつかのＳＮＰが報告されている。ホフマイヤー（Ｈｏｆｆｍｅｙｅｒ）らは、白人被験者を対象として、Ｐ−ｇｐをコードするＭＤＲ１遺伝子の第２６エキソン３４３５番目の塩基がＣからＴに置換する遺伝子変異に伴い、消化管におけるＭＤＲ１発現量が低下し、ジゴキシンの経口投与後の血漿中濃度が高くなることを報告した（非特許文献１８）。ミレイ（Ｍｅａｌｅｙ）らは，中枢神経系におけるマクロライド系抗生物質アイバメクチンのコリー犬感受性の違いは，ｍｄｒ１遺伝子に生じるフレームシフト変異によって引き起こされる未成熟Ｐ−ｇｐによることを明らかとした（非特許文献１９）。
【０００９】
薬物代謝酵素に関与するイヌ関連のＳＮＰでは、ポールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）らが、ビーグル犬においてシクロオキシゲナーゼＩＩ阻害剤であるセレコキシブの代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザー（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ；以下、ＥＭと称する）群及びプアー・メタボライザー（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ；以下、ＰＭと称する）群に分類することができることを報告している。この多型性にはＣＹＰ２Ｄサブファミリーの関与が示唆されているが、詳細については不明である（非特許文献２０）。
【００１０】
宮下（Ｍｉｙａｓｈｉｔａ）らは、フォスフォジエステラーゼＩＶ阻害薬である４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンの血漿中代謝物パターンが異なる２群のビーグル犬が存在することを明らかとしている（非特許文献２１）。
東（Ａｚｕｍａ）らは、α７−ニコチンアセチルコリンレセプターアゴニストであるＧＴＳ−２１のビーグル犬における代謝物血漿中濃度に個体差が生じることを報告している。この個体差にＣＹＰ１Ａの発現量の違いが関与していることを示唆している（非特許文献２２）。
三瀬（Ｍｉｓｅ）らも、東（Ａｚｕｍａ）らと同様に、ＣＹＰ１Ａの発現量差によって抗ベンゾジアゼピン系アンタゴニストであるＡＣ−３９３３のビーグル犬血漿中濃度に個体間でのバラツキが生じることを報告している（非特許文献２３）。
しかしながら、ビーグル犬薬物代謝能力の表現型解析の個体差を明らかとするイヌＣＹＰのＳＮＰに関する遺伝子診断での解明はまだなされていない。
【００１１】
【非特許文献１】：加藤隆一・鎌滝哲也編，「薬物代謝学 医療薬学・毒性学の基礎として」，第２版，東京化学同人，２０００年１０月，ｐ．９−１９
【非特許文献２】：及川弘著，「犬の生物学」，初版，朝倉書店，１９６９年９月，ｐ．１７９−１８７
【非特許文献３】：「モルキュラー・ファマーコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」，（アメリカ），１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１
【非特許文献４】：「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」，（アメリカ），１９９０年，第２８１巻，ｐ．１０６−１１５
【非特許文献５】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），１９９８年，第２６巻，ｐ．２７８−２８３
【非特許文献６】：「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」，（アメリカ），１９９５年，第３１９巻，ｐ．３７２−３８２
【非特許文献７】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），２０００年，第２８巻，ｐ．９８１−９８６
【非特許文献８】：「バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ）」，（アメリカ）１９９１年，第１０８８巻，ｐ．３１９−３２２
【非特許文献９】：「ザ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペェリメンタル・セラピューティクッス（Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」，（アメリカ）１９９７年，第２８３巻，ｐ．１４２５−１４３２
【非特許文献１０】：加藤隆一・鎌滝哲也編，「薬物代謝学 医療薬学・毒性学の基礎として」，第２版，東京化学同人，２０００年１０月，ｐ．１９−２０
【非特許文献１１】：「ゼノビオティカ（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ）」，（イギリス），１９９６年，第２６巻，ｐ．７５５−７６３
【非特許文献１２】：ワナー・カロウ（Ｗａｒｎｅｒ Ｋａｌｏｗ），ウルス・メイヤー（ＵｒｓＭｅｙｅｒ），レイチェル・ティンダル（Ｒａｃｈｅｌ Ｔｙｎｄａｌｅ）編，石川智久監訳，「ファーマコゲノミクス２１世紀の創薬と個の医療」，第１版，テクノミック，２００２年１２月，ｐ．２９−４３
【非特許文献１３】：「ザ・ジャパニーズ・バイオケミカル・ソサイェティー（ＴｈｅＪａｐａｎｅｓｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｏｃｉｅｔｙ）」，（日本），１９９９年，第１２５巻，ｐ．８０３−８０８
【非特許文献１４】：「ブリティシュ・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」，（イギリス），１９９９年，第４７巻，ｐ．４４５−４４９
【非特許文献１５】：「ファーマコジェネティクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，（アメリカ），１９９９年，第９巻，ｐ．３６７−３７５
【非特許文献１６】：加藤隆一・鎌滝哲也編，「薬物代謝学 医療薬学・毒性学の基礎として」，第２版，東京化学同人，２０００年１０月，ｐ．１４１−１５５
【非特許文献１７】：「ファーマコジェネティクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，（アメリカ），２００２年，第１２巻，ｐ．７１３−７２４
【非特許文献１８】：「プロシディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，（アメリカ），２０００年，第９７巻，ｐ．３４７３−３４７８
【非特許文献１９】：「ファーマコジェネティクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，（アメリカ），２００１年，第１１巻，ｐ．７２−７３３
【非特許文献２０】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），１９９９年，第２７巻，ｐ．１１３３−１１４２
【非特許文献２１】：「第１７回日本薬物動態学会年会ポスター発表」，（日本），２００２年，２０ＰＥ−４６
【非特許文献２２】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ファーマコキネティクス（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）」，（日本），２００２年，ｐ．７５−８２
【非特許文献２３】：「ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」，（アメリカ），２００４年，第３２巻，ｐ．２４０−２４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
化合物の薬理効果及び毒性の発現が依存する体内動態に大きな影響を与える、代謝能力の個体差が大きいイヌを用いて、医薬品候補である化合物の薬理効果試験及び毒性試験を行っているため、薬理効果及び毒性評価において個体差が大きく、データがばらつくという問題が生じている。
本発明の課題は、イヌ（特にはビーグル犬）における薬理効果試験及び毒性試験の実施に先立ち、使用される個体のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の遺伝子診断を迅速に実施し、正常な代謝能力を持つ群（ＥＭ群）、又は、薬物代謝能力が低い群（ＰＭ群）に、群分けすることができる簡便な方法を提供し、遺伝的に均質な個体により薬理効果試験及び毒性試験を実現することができ、正確な薬理効果及び毒性評価を可能とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である試験化合物として４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンを選択し、そのＥＭ型及びＰＭ型を決定するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰを決定し、ＰＭ型では、塩基置換により、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＯＲＦの途中でストップコドンが生じていることを見出した。次いで、血液サンプルより前記ＳＮＰの位置の配列を検出する簡便な方法（ＡＳＰ−ＰＣＲ法及びダイレクトシークエンス法）を確立し、４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンを投与したＥＭ群及びＰＭ群各５例について前記ＳＮＰ領域の配列を決定し、ＰＭ群ではいずれも塩基置換によりストップコドンが生じていること、ＥＭ群では、ヘテロ又はホモでストップコドンを生じずにＣＹＰ１Ａ２をコードする遺伝子を有していることを確認し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
［１］イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定することを特徴とするイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型の検出方法；
［２］イヌから核酸試料を得、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基に該当する塩基を決定する工程を含む、薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する方法；
［３］［２］記載の方法により薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する工程を含む、医薬品の試験に用いるイヌを選別する方法；
［４］［３］記載の方法で選別したエクステンスィブ・メタボライザー群又はプアー・メタボライザー群に被験薬を投与する工程を含む、被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する方法；
［５］ストリンジェントな条件で、配列番号１で表される塩基配列若しくは配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列又はその遺伝子多型を有するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖にハイブリダイズし、
（１）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＣである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、
（２）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＴである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、及び
（３）（１）若しくは（２）の相補鎖である、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ；
［６］配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなる、［５］記載の一本鎖ＤＮＡ；並びに
［７］イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を検出するための試薬を有効成分として含有する、イヌＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である薬物の代謝活性多型の診断剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明においては、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基に該当する塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを見い出した。このＳＮＰによりＣＹＰ１Ａ２の３７３番目のアルギニンに対応するコドンがストップコドンへと変化する。従って、Ｔ／Ｔ遺伝子型を有するイヌではＣＹＰ１Ａ２が発現しないため、Ｃ／Ｃ遺伝子型又はＣ／Ｔ遺伝子型を有するイヌと比較して、ＣＹＰ１Ａ２で代謝される薬物の血漿中濃度が極めて高くなることが予測される。このことは、本発明の実施例で述べたように、フォスフォジエステラーゼＩＶ阻害剤である化合物Ａの体内動態から証明されている。また、本発明においては、このＳＮＰを簡便に検出する方法としてＡＳＰ−ＰＣＲ法及びダイレクトシークエンス法を確立した。これらの方法を用いてイヌ６５例のＣＹＰ１Ａ２の遺伝子診断を実施することによりアレル頻度を明らかにした。
【００１６】
本発明で明らかにしたように、イヌＣＹＰ１Ａ２には１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）に該当する塩基にストップコドンを生じるＳＮＰが存在し、約１５％のイヌがこのＳＮＰをホモで有している。このＳＮＰは化合物Ａで認められたように、ＣＹＰ１Ａ２で代謝される薬物のイヌにおける体内動態の個体差の大きな要因となっている。化合物の薬理効果及び毒性の発現は体内動態に依存している。そのため、前記化合物がＣＹＰ１Ａ２で代謝される場合には、薬理効果及び毒性評価においても大きな個体差が生じるものと考えられる。本発明によれば、イヌにおける薬理効果試験及び毒性試験の実施に先立ち、使用される個体のＣＹＰ１Ａ２の遺伝子診断を迅速に実施することができる。これにより、遺伝的に均質な個体により薬理効果試験及び毒性試験を実現することができ、本発明以前より正確な薬理効果及び毒性評価が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［Ａ］本発明の検出方法及びイヌ選別方法
本発明の検出方法では、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定することによりイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型を検出する。本明細書において「イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目の塩基に該当する塩基」とは、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子において、「配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目の塩基」に該当する塩基を意味する。イヌＣＹＰ１Ａ２の塩基配列としては、種々の塩基配列、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１に記載のＣＹＰ１Ａ２遺伝子の部分塩基配列、本発明者が本発明において初めて決定した配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列、又はそのアレル変異体の塩基配列などが存在する。従って、本発明においては、「配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目の塩基」に該当する塩基とは、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目であれば、前後の配列が配列番号２２で表される塩基配列と完全に一致する必要はないことを意味する。
【００１８】
また、本発明の検出方法では、イヌから核酸試料を得、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目、すなわち、第４エキソン８７番目の塩基に該当する塩基を決定することにより、薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザー（ＥＭ）であるか、又は、プアー・メタボライザー（ＰＭ）であるかを検出する。前記塩基が、Ｃ／Ｃ遺伝子型又はＣ／Ｔ遺伝子型である場合には、ＥＭであると判定することができ、Ｔ／Ｔ遺伝子型である場合には、ＰＭであると判定することができる。ＥＭとしては、Ｃ／Ｃ遺伝子型がより好ましい。
また、本発明のイヌ選別方法では、本発明の検出方法によりＥＭ又はＰＭのいずれであるかを検出し、医薬品の試験に用いるイヌを選別する。
【００１９】
１．イヌの核酸を含む試料の調製
本発明の方法で用いられる核酸試料、好ましくはイヌゲノムＤＮＡを含む試料は、イヌ（特にはビーグル犬）から単離されたあらゆる細胞（但し、生殖細胞を除く）、組織、又は臓器等を材料として調製することができる。前記材料としては，末梢血から分離した白血球又は単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、生化学検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００２０】
例えば、白血球を材料とする場合、まずイヌ（例えば、ビーグル犬）より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで，得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解及び変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮアーゼにより除去することができる。但し、ゲノムＤＮＡの抽出は、前記方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ］や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行うこともできる。また、常法で抽出したイヌｍＲＮＡからｃＤＮＡを製造し、遺伝子多型の検出に用いることもできる。
【００２１】
２．遺伝子多型の検出
次に、得られたイヌ核酸を含む試料から、本発明者らによって解明された、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子１１１７番目（すなわち、第４エキソンの８７番目）の塩基に該当する塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰの遺伝子型を診断する。以下、本発明方法で用いることができる代表的な遺伝子多型検出方法について説明する。
【００２２】
（１）ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法
遺伝子多型部位が制限酵素認識部位に含まれる場合、その制限酵素の消化により生じるＤＮＡ断片の長さの違いから、前記遺伝子多型の検出が可能である。この場合、（ａ）ＤＮＡを制限酵素で分解後、サザンブロットを行う方法と、（ｂ）多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、制限酵素で切断し、電気泳動により切断されるＤＮＡ断片の大きさを解析する方法とが挙げられる。
（ａ）の方法で用いられるプローブとしては、目的の多型部位を含んで、且つその多型部位から５’末端側及び３’末端側にそれぞれ約０．５〜２ｋｂにわたる配列に相当するＤＮＡ断片（アイソトープ、ビオチン、又は蛍光色素等で標識されたもの）が好ましい。また、（ｂ）の方法で用いられるＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２３】
（２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅後、熱変性し、電気泳動により、高次構造の異なる１本鎖ＤＮＡを分離する方法［「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９４年，第１６巻，ｐ．２９６−２９７；及び「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９６年，第２１巻，ｐ．５１０−５１４］である。遺伝子多型の有無により、１本鎖ＤＮＡの泳動距離が異なるため、そのパターンを解析することにより、多型のタイピングが可能である。タイピングの標準とするために、予め多型部位の塩基配列が確認されているＤＮＡ試料を、ＰＣＲの際の鋳型ＤＮＡとして、被験試料と同時に用いることが好ましい。ＰＣＲ増幅用プライマーとしては，５’末端を蛍光標識した、多型部位を含む約５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２４】
（３）ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法
ＡＳＯハイブリダイゼーション法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片を支持体（例えば、ナイロンフィルター等）にドットブロットし、それぞれの遺伝子多型に対応したプローブとのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴｍ値（溶解温度：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に準じた洗浄操作を行い、多型を検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）する方法［「クリニカ・ケミカ・アクタ；インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ ａｃｔａ；ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９０年，第１８９巻，ｐ．１５３−１５７］である。プローブとしては、１５〜２５塩基程度の合成オリゴヌクレオチド（シグナルを得るためには、ラジオアイソトープ、ビオチン、又は蛍光色素による標識が必要）が好ましい。
【００２５】
（４）ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡの塩基配列を直接ダイデオキシ法により解析する方法［「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９１年，第１１巻，ｐ．２４６−２４９］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５’末端側の位置に相当する１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドを用いる。
【００２６】
（５）ＡＳＰ−ＰＣＲ（Ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ＰＣＲ）法
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’末端側から３’末端側に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末端塩基にミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下し、電気泳動による検出が不可能になる。ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、その３’末端塩基が検出しようとする変異塩基に相補的になるように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無で遺伝子多型を検出する方法［「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９１年，第１９巻，ｐ．３５６１−３５６７；及び「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９９２年，第２０巻，ｐ．４８３１−４８３７］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、一方は、３’末端に多型部位が位置するように設計された、好ましくは、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドであり、もう一方は、好ましくは、多型部位から０．０５〜２ｋｂ程度離れた部分の１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
（６）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動［Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）］法
ＤＧＧＥ法は、ＤＮＡ断片中の、ミスマッチを有するヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりも解離が容易であることを利用して遺伝子多型を検出する方法［「バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９９年，第２７巻，ｐ．１０１６−１０１８］である。ヘテロデュプレックスは、解離が進むにつれ、ゲル電気泳動における移動度が低下するので、使用するポリアクリルアミドゲル中に尿素及びホルムアミドの密度勾配を設定しておくと、ホモデュプレックスとの移動度の差が更に強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、すなわち、変異の存在が検出される。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２８】
（７）ＲＮアーゼＡ切断法
ＲＮアーゼＡ（ＲＮＡ分解酵素）は、２本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。従って、多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、アイソトープ標識したＲＮＡプローブを、変性して１本鎖にしたＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ、ＲＮアーゼＡ処理後、電気泳動により分解すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるため、２本のバンドとして検出することができる［「ディエヌエー・アンド・セル・バイオロジー（ＤＮＡ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９９５年，第１４巻，ｐ．８７−９４］。この方法で用いられるＲＮＡプローブとしては、多型部位を含む通常１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２９】
（８）化学切断法
多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅後、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「Ｃ（シトシン）」に対してはヒドロキシルアミン、「Ｔ（チミン）」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾し、ピペリジン処理をすると、糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、前記処理を行った後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなっていれば変異が検出されたことになる［バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，１９９６年，第２１巻，ｐ．２１６−２１８］。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３０】
（９）ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）法
ＤＯＬ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、蛍光標識された多型部位の直前の塩基まで含むダイプライマーと、それぞれのアレルに特異的な蛍光色素で標識されたダイターミネーターを耐熱性ＤＮＡリガーゼで連結させる方法［「ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９９８年，第８巻，ｐ．５４９−５５６」］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３１】
（１０）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法［「ジェネティック・アナリシス：バイオモルキュラー・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，１９９９年，第１４巻，ｐ．１４３−１４９；及び「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９９６年，第３４巻，ｐ．２９３３−２９３６］である。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１５〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドが好ましく、５’末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３’末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型の塩基変化の検出が可能である。
【００３２】
（１１）インベーダー法
インベーダー法では、２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチドと１種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドが使用される。非蛍光標識オリゴヌクレオチドの一つは、その５’末端側に、検出しようとする多型部位の存在するゲノム配列（以下、「鋳型」と称する）とは無関係な配列（以下、「フラップ」と称する）を有しており、フラップより３’末端側は、鋳型の多型部位から５’末端側の配列に特異的な相補配列となっている（以下、「アレルプローブ」と称する）。すなわち、アレルプローブの鋳型に特異的な相補配列部位の５’末端は鋳型の多型部位に相当する。もう一つの非蛍光標識オリゴヌクレオチドは、鋳型の多型部位から３’末端側の配列に特異的な相補配列を有する（以下、「インベーダープローブ」と称する）。インベーダープローブの３’末端も鋳型の多型部位に相当するが、鋳型の多型部位の塩基とは相補的ではなくてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチド［以下、「ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブ」と称する］は、３’末端側部分がフラップと相補的な配列であり、５’末端側はパリンドローム配列になっているため、自ら二本鎖を形成している。また、ＦＲＥＴプローブの５’末端近傍は蛍光色素で標識され、５’末端にはその蛍光を打ち消すクエンチャーが結合している。
【００３３】
まず、鋳型にアレルプローブとインベーダープローブをハイブリダイズさせると、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的である場合は、その多型部位において、鋳型、アレルプローブの５’末端、及びインベーダープローブの３’末端が特殊な構造を形成する。この構造を特異的に認識してエンドヌクレアーゼ活性を表す酵素（以下、「クリベース」と称する）が、アレルプローブからフラップ部分を切り離す。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズする。このとき、フラップとＦＲＥＴプローブとが、ＦＲＥＴプローブのクエンチャーが結合している５’末端の位置において、クリベースに特異的に認識される構造を形成するため、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによりＦＲＥＴプローブから切り離されて、ＦＲＥＴプローブに残った蛍光色素が蛍光を発する。
【００３４】
一方、鋳型配列に変異が存在し、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的でなく、ミスマッチとなっている場合は、クリベースに特異的に認識される構造が形成されないため、フラップはアレルプローブから切り離されない。このとき、切り離されずにアレルプローブに残ったままのフラップもＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズ可能であるが、アレルプローブから切り離されたフラップがハイブリダイズした場合と比較すると、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによってＦＲＥＴプローブから切り離される反応効率が低いため、ＦＲＥＴプローブが発する蛍光強度も低い。以上の原理により、多型の検出が可能となる［「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９３年，第５１０９巻，７７８−７８３；「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９９年，第３０巻，ｐ．２１３８７−２１３９４；及び「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９９９年，第１７巻，ｐ．２９２−２９６］。
【００３５】
（１２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、遺伝子多型のアレルに対応して異なる塩基配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドを合成してその質量を測定し、その差異を質量分析器により検出することによりタイピングする方法［「ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９９７年，第７巻，ｐ．３７８−３８８」；「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミストリー：ジャーナル・オブ・ザ・フォーラム・オブ・ヨーロピアン・クリニカル・ケミストリー・ソサイエティ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｒｕｍ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）」，１９９７年，第３５巻，ｐ．５４５−５４８］である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法では、はじめに多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、その後、多型部位に隣接するプライマーを用いた伸張反応により、それぞれのアレルに特異的なＤＮＡ伸張反応物をマススペクトルに基づき解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、多型を検出するためのプライマーは、多型部位に隣接した１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。
【００３６】
（１３）ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法
ＴＤＩ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた後、多型部位の直前に設計されたプライマーを用いて、プライマー伸張反応により、それぞれのアレルに対応する異なる蛍光色素で標識されたダイデオキシヌクレオチドを多型部位に取り込ませる方法で［「プロシィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステェィト・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９９７年，第９４巻，ｐ．１０７５６−１０７６１］である。プライマー伸張産物は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩプリズム３７７，アプライドバイオシステム社）などを用いて解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、多型部位を含む約０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３７】
（１４）モレキュラー・ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）法
モレキュラー・ビーコンは、両末端に発光抑制体（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と蛍光体（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を持ったオリゴヌクレオチドである。ステム部分が５〜７塩基でループ構造が１５〜３０塩基のシステムループ構造が好ましい。従って、蛍光体は発光抑制体の働きにより、励起光照射下でも発光しない。一方、ループ構造内の塩基配列と相同なターゲットのＤＮＡとループ構造内の塩基配列がハイブリダイズすると、発光抑制体と蛍光体の距離が離れるために、蛍光体が励起光下で励起し蛍光を発する［「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９９８年，第１巻，ｐ．４９−５３；及び「遺伝子医学」２０００年，第４巻，ｐ．４６−４８］。モレキュラー・ビーコンのステム部分の塩基配列は、ターゲットＤＮＡとは相補的ではない。モレキュラー・ビーコンのステム構造のＴｍ値は、ターゲット領域をＰＣＲで増幅させるときにモレキュラー・ビーコンを反応液にいれて、ＰＣＲのアニーリング温度で励起光を当て蛍光を測定すると、モレキュラー・ビーコンがターゲット遺伝子に完全に相同な配列であれば、ハイブリダイズするため蛍光を発する。逆にミスマッチがあれば、モレキュラー・ビーコンはターゲットにハイブリダイズできず、蛍光を発することができない。この方法により遺伝子多型を検出することができる。
【００３８】
（１５）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション［Ｄｙｎａｍｉｃ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＤＡＳＨ）］法
ターゲットＤＮＡ（６０〜９０塩基対）をゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅する際に、末端をビオチン化したプライマーを用いて行う方法［「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９９８年，第１巻，ｐ．８７−８８；及び「遺伝子医学」２０００年，第４巻，ｐ．４７−４８］である。ＰＣＲ終了後、ビオチン化したプライマー側のストランド（ｓｔｒａｎｄ）は、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたマイクロタイターウェルに結合する。これに対して、未修飾のプライマー側のストランドは結合することができず、アルカリ溶液でリンスすると除去される。その後、このビオチン化したプライマーのストランドに対して、プローブＤＮＡ（好ましくは１５〜２１塩基）をハイブリダイズさせる。この時に２本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、蛍光を発する蛍光物質（ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｅ）を一緒に取り込ませる。その後、この蛍光強度を観察しながら変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させる。ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡが完全に相補的でなくミスマッチが有ったときには、完全に相補的である場合に比べ、変性し、発光しなくなる温度が低くなる。この温度の違いを観察することにより、遺伝子多型を検出することができる。
【００３９】
（１６）パドロック・プローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）法
リザルジィ（Ｌｉｚａｒｄｉ）らによって開発された方法［「ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，１９９８年，第３巻，ｐ．２２５−２３２；及び「遺伝子医学」，２０００年，第４巻，ｐ．５０−５１］である。一本鎖ターゲットＤＮＡにハイブリダイズするとプローブが環状になるように設計したプローブを用い、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズした後にＤＮＡリガーゼで結合させて完全な環状にし、その後アルカリホスファターゼ［Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ）］の脱リン酸化酵素でリン酸基を除去する。末端にミスマッチがあり環状になれなかった場合、リン酸基がなくなり環状化できなくなる。この環状ＤＮＡに対してプライマー（１）を設計し、ＤＮＡポリメラーゼで複製してレプリコン多量体を得る。このレプリコンに対してもプライマー（２）を設計し、この２種類のプライマーを一緒に混ぜてＤＮＡポリメラーゼで反応し、２本鎖ＤＮＡを増幅する。プライマー（１）は、ターゲットＤＮＡとは相補的でない部分に設計し、プライマー（２）は、環状になったプローブ（パドロック・プローブ：ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）の末端部分（ターゲットＤＮＡ）と相補的な配列（３’末端に遺伝子多型を含む）に設計し、多型検出には３’末端の一塩基置換させたプライマーを用いる。パドロック・プローブに対してローリング・サイクル反応（Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ−ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＣＡ）を改良したハイパーブランチド・ローリング−サークル増幅法（Ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＨＲＣＡ）法を用いて増幅させた後に、パドロック・プローブ内にある制限酵素認識サイトの制限酵素で処理し、電気泳動でバンドの有無を確認する。
【００４０】
（１７）ＵＣＡＮ法
ＵＣＡＮ法［タカラ酒造株式会社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏ．ｊｐ）参照］は、ＲＮＡをＤＮＡが両側からはさんだ型のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプライマー（ＤＲＤプライマー）の３’末端のＤＮＡを化学変化させておき、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないようにしておく。次に、一塩基変換が起こっている可能性のある塩基部位に、ＲＮＡ部分が結合するように設計したＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡを対合させる。ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみＲＮアーゼＨにより、対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分が切断される。この切断によって３’末端が新しく出現するので、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方，ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがその場所でマッチしていない場合、つまり、ＳＮＰが存在するときは、ＲＮアーゼＨがＤＲＤプライマーを切断しないので、ＤＮＡ増幅が起こらない。この遺伝子増幅の有無を検出することで遺伝子多型を検出することができる。
【００４１】
（１８）ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイは、多種類の多型部位を含むＤＮＡプローブをガラス基盤上に固定したもので、これに標識した核酸試料をハイブリダイゼーションして、蛍光シグナルによって多型の有無を検出する。一般に、ＤＮＡをガラス基盤上で合成していくものをＤＮＡチップ（オリゴＤＮＡチップ）と称し、ガラス基盤上にｃＤＮＡを乗せていくものをＤＮＡマイクロアレイと称する。基盤上に固定（又は合成）されるプローブは、オリゴＤＮＡチップであれば、多型部位を含む２０塩基程度のオリゴヌクレオチドが好ましく、ｃＤＮＡマイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基程度の２本鎖ＤＮＡが好ましい。
【００４２】
（１９）ＥＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｒｒａｙ）法
ＥＣＡ法は、ＤＮＡの２本鎖に結合するインターカレーターの電気化学的性質を利用した遺伝子タイピング法である。すなわち、多型を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、基盤に固定化したそれぞれのアレルと相補するプローブとハイブリダイズ後にインターカレーターを作用させる。このとき，プローブに対して完全相補と不完全相補の場合で結合するインターカレーターの量が異なる。ＥＣＡ法で用いるインターカレーターは、電気化学的性質を有するフェロセンという物質を含有するため、結合したインターカレーターの量に比例して電気的シグナルが異なる．ＥＣＡ法は、この違いを利用して遺伝子多型を検出する方法［「アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２０００年，第７２巻，ｐ．１３３４−１３４１］である。
【００４３】
以上は、本発明で用いることができる代表的な遺伝子多型検出方法であるが、これらに限定されず、他の遺伝子多型検出方法も本発明方法のために利用することができる。また、本発明方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、又は、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。後述する実施例では、ＡＳＰ−ＰＣＲ法又はダイレクトシークエンス法を用いた本発明方法の具体的実施態様を示す。
【００４４】
［Ｂ］本発明の試験方法
本発明の試験方法では、本発明の検出方法により薬物代謝速度がＥＭか、ＰＭかを検出し、医薬品の試験に用いるイヌを選別し、次いでＥＭ群又はＰＭ群のイヌに被験薬を投与し、被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する。この際ＥＭ群、特にＣ／Ｃ遺伝子型のイヌを用いることがより好ましい。
【００４５】
被験薬の薬理効果を試験する方法は、被験薬の適応症により適宜選択することができる。
毒性を試験する方法としては常法を用いることができ、例えば、ビーグル犬における単回経口投与毒性試験、ビーグル犬における２週間経口投与毒性試験、ビーグル犬における単回静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における１週間静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における４週間静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における１週間静脈内持続投与毒性試験、ビーグル犬における４週間静脈内持続投与毒性試験、ビーグル犬における単回静脈内増量方式投与試験、ビーグル犬における２週間反復静脈内投与毒性試験、ビーグル犬における４週間反復経口投与毒性試験、ビーグル犬における１３週間反復経口投与毒性試験、又はビーグル犬における５２週間反復経口投与毒性試験等が挙げられる［マーヒン・メイナス（Ｍａｈｉｎ・Ｍａｉｎｅｓ）主著「カレント プロトコールズ イン トキシコロジー ボリューム１，２（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ１，２）」，ジョンウィリィ＆ソンズ社（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．），２００１年，ｐ．１．０．１−１６．６．５；及び白須泰彦，吐山豊秋編「毒性試験ハンドブック」，株式会社サイエンスフォーラム，１９８０年５月，ｐ．８１−２８２］。
【００４６】
本発明の試験方法は、イヌの選別と、被験薬の薬理効果及び／又は毒性の試験とを分担して行うこともでき、本発明の方法によりＥＭ群又はＰＭ群に選別されたイヌを入手し、ＥＭ群又はＰＭ群のみを用いて被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する方法も、本発明に含まれる。
【００４７】
［Ｃ］本発明の一本鎖ＤＮＡ及び代謝活性多型の診断剤
本発明の一本鎖ＤＮＡは、ストリンジェントな条件で、配列番号１で表される塩基配列若しくは配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列又はその遺伝子多型を有するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖にハイブリダイズし、
（１）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＣである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ［好ましくは、配列番号１４で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ（すなわち、実施例４で使用したプライマーＳ０７ｗｉｌｄ）］、
（２）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＴである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ［好ましくは、配列番号１６で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ（すなわち、実施例４で使用したプライマーＳ０７ｍｕｔａｎｔ）］、及び
（３）（１）若しくは（２）の相補鎖である、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡである。
「配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基」とは、配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基であれば、前後の配列が配列番号１又は配列番号２２で表される塩基配列と完全に一致する必要はないことを意味する。
【００４８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、特に限定されるものではないが、好ましくは、実施例４に記載した反応系（ＫＯＤ用ＰＣＲバッファー最終濃度１Ｘ、ｄＮＴＰミックス最終濃度各０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸マグネシウム最終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＣＲプライマーセット最終濃度各０．３μｍｏｌ／Ｌ、及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−最終濃度０．０２Ｕｎｉｔ）及びＰＣＲ反応条件（９４℃２分の後、９４℃１５秒、５６℃３０秒、及び６８℃３０秒からなるサイクルを３５サイクル行い、更に６８℃１．５分）である。
【００４９】
本発明の一本鎖ＤＮＡは、本発明方法における、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソンの８７番目）の塩基に該当する塩基（つまり、配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目又は配列番号１で表される塩基配列における４０５番目に該当する塩基）の遺伝子多型の検出において、前記塩基がＣ又はＴのいずれであるかを決定するのに用いることができる。
本発明の一本鎖ＤＮＡとして、配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなるＤＮＡが特に好ましい。
また、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目における塩基に該当する塩基を検出するための試薬を有効成分として含有する、イヌＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である薬物の代謝活性多型の診断剤も本発明に含まれる。検出するための試薬としては、例えば、本発明の一本鎖ＤＮＡが含まれる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
《実施例１：ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰ決定》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ビーグル犬肝臓より単離したトータルＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡの部分塩基配列を同定し、更には一部のビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子のＳＮＰを決定した。
【００５２】
すなわち、予備検討試験（後述する実施例７を参照）において群分けされたＥＭ型ビーグル犬Ａ及びＰＭ型ビーグル犬Ｂの各１例ずつ（計２例）をペントバルビタール５０ｍｇ／ｍＬ／ｋｇ静脈内投与麻酔下において安楽死させ、動物解剖後、それぞれの肝臓を摘出した。摘出後、急速凍結させた肝臓よりＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて付随のプロトコールに従い、トータルＲＮＡを回収した。
【００５３】
回収したトータルＲＮＡを用いて、５００ｎｇトータルＲＮＡを鋳型に逆転写酵素によってＲＮＡからｃＤＮＡ合成を、ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ Ｖｅｒ．１．１（宝酒造株式会社）で実施した。逆転写反応における条件を表１に示す。なお、「ＲＮアーゼフリー滅菌水」の容量「ＸμＬ」は、ＲＮアーゼフリー滅菌水の量を調整することにより、反応系の総容量を４０．０μＬにすることを意味する。
【００５４】
【００５５】
続いて、逆転写反応において合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。イヌＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ部分塩基配列を認識するＰＣＲプライマーとしては、プライマーＳ０１（配列番号２）及びプライマーＡ０１（配列番号３）のセット、プライマーＳ０２（配列番号４）及びプライマーＡ０２（配列番号５）のセット、プライマーＳ０３（配列番号６）及びプライマーＡ０３（配列番号７）のセット、並びにプライマーＳ０４（配列番号８）及びプライマーＡ０４（配列番号９）のセットからなる、計４つのＰＣＲプライマーセットを用いた。なお、プライマーは、Ｅａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表２に示す。
【００５６】
【００５７】
ＰＣＲの結果、増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、Ｓ０１及びＡ０１のプライマーセットからは７９８ｂｐであり、Ｓ０２及びＡ０２のプライマーセットからは９５１ｂｐであり、Ｓ０３及びＡ０３のプライマーセットからは５５１ｂｐであり、Ｓ０４及びＡ０４のプライマーセットからは６５８ｂｐであった。増幅された各ＤＮＡ断片は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）を用いて付随のプロトコールに従い精製した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の各多型部位を同定するための塩基配列の決定は、精製したＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７：アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により解析した。シークエンス解析に用いたプライマーとして、ＰＣＲプライマーＳ０１、Ｓ０２、Ｓ０３、Ｓ０４、Ａ０１、Ａ０２、Ａ０３、及びＡ０４を用いた。
【００５８】
その結果、存在することが確認された遺伝子多型を表３にまとめた。なお、塩基配列の番号は、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子に関する既知の部分塩基配列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１）の最初の塩基を１番とする番号とし、前述の既知配列を公知塩基配列とした。
【００５９】
【００６０】
これらＳＮＰの中で、特に既知ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１０８７番目の塩基がＣからＴへと置換されており、アミノ酸がアルギニンからストップコドンに変換するＳＮＰがビーグル犬Ｂより見いだされたことが、最もＰＭ型ビーグル犬ＢのＣＹＰ１Ａ２の代謝活性能を著しく変化させていると推察された。
【００６１】
《実施例２：５’ＲＡＣＥ法を用いたビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子５’末端領域の塩基配列同定試験》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ビーグル犬肝臓より単離したトータルＲＮＡを鋳型として、５’ＲＡＣＥ（５’ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法により、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子５’末端未同定領域の塩基配列を同定し、開始コドンであるメチオニンからストップコドンまでを含むビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ全塩基配列を同定した。
【００６２】
すなわち、実施例１において摘出したＥＭ型ビーグル犬Ａの肝臓組織の約０．１ｇを用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて付随のプロトコールに従いトータルＲＮＡを抽出した。
摘出後速やかに急速凍結されたビーグル犬肝臓組織約０．１ｇをすり鉢で細かく粉砕し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１ｍＬに懸濁した。その懸濁液にクロロホルム０．２ｍＬを加え、振とう後、遠心分離し、水層のみ回収し、イソプロパノール沈殿法により、ＲＮＡをペレット状にし、ＲＮアーゼフリー水１００μＬにてペレットを溶解した。
抽出したトータルＲＮＡ溶液６．５μＬ（１０μｇ量）に、１０×ＤＮアーゼＩリアクションバッファー１μＬ、１Ｕ／μＬ−ＤＮアーゼＩ１μＬ、及びＲＮアーゼフリー水１．５μＬをそれぞれ加え、室温１５分間インキュベートした。次に、２５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ１μＬを加え、６５℃にて１０分間インキュベートした。
【００６３】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマニュアルに記載されているプロトコールに従い、抽出したトータルＲＮＡ３μｇ量を用いて５’ＲＡＣＥ法を実施した。
すなわち、トータルＲＮＡを仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ；Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理した。ＣＩＰ処理後、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ；ｔｏｂａｃｃｏ ａｃｉｄ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理し、キャップ化されたｍＲＮＡからキャップ構造を取り除き、５’末端のリン酸を露出させた。ＴＡＰで処理したＲＮＡにＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ（配列番号１９）をＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて結合させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて５０℃にて６０分間処理した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’プライマー（配列番号２０）と遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ；ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号２１）でＰＣＲを行い、５’末端を増幅した。反応条件を表４に示す。
【００６４】
【００６５】
ＰＣＲ反応物を電気泳動により分析した結果、大きさが約２５０ｂｐの増幅されたＤＮＡ断片を確認した。確認されたＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｏｒｇｅｎ Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＫｉｔによりベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングした。
ベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングしたＤＮＡ断片のシークエンス解析を行った。その結果、既知のビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２部分塩基配列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９０年，第３８巻，ｐ．６４４−６５１）とのオーバーラップが確認された。５’ＲＡＣＥ法によって得られた６クローンのコンセンス配列は、配列番号２２で表される塩基配列における１番目から１７０番目までの塩基配列である。
また、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子に関する既知の部分塩基配列と今回我々が得たＣＹＰ１Ａ２部分配列とのオーバーラップにより得られた、実施例１のＥＭ型ビーグル犬ＡのＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ全塩基配列は、配列番号２２で表される塩基配列であり、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は６３番目〜１６０１番目である。
なお、９例のＥＭ型ビーグル犬についても同様にＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ全塩基配列を決定した。ビーグル犬Ａでは、配列番号２２で表される塩基配列における１３０５、１３６１、１３６５、及び１６１５番目は、それぞれ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ａ、及びＣ／Ｔとヘテロであったが、他のビーグル犬においてはＣ、Ｃ、Ｇ、及びＣであった
以上の結果より、実施例１において同定されたストップコドンを生じる既知ＣＹＰ１Ａ２遺伝子部分塩基配列の１０８７番目のＳＮＰは、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基がＣからＴへと置換されており、３７３番目のアミノ酸がアルギニンからストップコドンに変換するＳＮＰであることが明らかとなった。
【００６６】
《実施例３：ＣＹＰ１Ａ２遺伝子第４エキソンの８７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰ》
続いて、このビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを容易に検出するために、ゲノムＤＮＡ上でのＳＮＰの位置を探索した。
本実施例では、以下に示す手順に従って、他の哺乳類ＣＹＰ１ファミリーのゲノム情報を参考に目的ＳＮＰの位置を予測し、ビーグル犬白血球中のゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを実施後、ダイレクトシークエンス法により目的ＳＮＰ周辺のゲノムＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００６７】
すなわち、ヒトＣＹＰ１Ａ１（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：ＡＦ２５３３２２）、ヒトＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：ＡＦ２５３３２２）、マウスＣＹＰ１Ａ１（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｘ０１６８１）、マウスＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｘ０１６８２）、ラットＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｋ０２２４６）、及びラットＣＹＰ１Ａ２（ＮＣＢＩアクセッション・ナンバー：Ｋ０３２４１）のエキソン及びイントロンの大きさを比較すると、イントロンの大きさは各分子種で異なっていたが、エキソンの大きさはそれぞれのエキソンで種を超えて保存されていた。つまり、これらの哺乳類ＣＹＰ１ファミリーの第１エキソンの大きさは約８３０ｂｐであり、第２エキソンの大きさは約１２０ｂｐであり、第３エキソンの大きさは約８９ｂｐであり、第４エキソンの大きさは約１２３ｂｐであり、第５エキソンの大きさは約８６ｂｐであり、第６エキソンの大きさは約２８５ｂｐであった。この情報を踏まえて目的ＳＮＰの位置を第４エキソン内に存在すると予測した。
【００６８】
イヌゲノムＤＮＡは、ビーグル犬より無処理注射針で採血した全血をＥＤＴＡ・２Ｋ入り滅菌済みバキュティナ採血管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）にて確保した。全血よりＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）（宝酒造株式会社）を用いて付随しているプロトコールに従い、イヌゲノムＤＮＡを抽出した。
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いて目的のＳＮＰを含有するゲノムＤＮＡ領域を増幅させるために、ＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。プライマーセットとして、第４エキソン前後の第３イントロン及び第４イントロンの塩基配列を明らかにするために、予想される第３エキソン内にセンス方向のプライマーＳ０５（配列番号１０）を、第５エキソン内にアンチセンス方向のプライマーＡ０５（配列番号１１）を設計した。プライマーはＥａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表５に示す。
【００６９】
【００７０】
ＰＣＲの結果、Ｓ０５及びＡ０５のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の大きさは１３８０ｂｐであった。増幅されたＤＮＡ断片は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）を用いて付随のプロトコールに従い精製した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の多型部位を同定するための塩基配列の決定は、精製したＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７：アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により解析した。シークエンス解析に用いたプライマーとして、ＰＣＲプライマーＳ０５、Ａ０５、Ｓ０６（配列番号１２）、及びＡ０６（配列番号１３）を用いた。
【００７１】
その結果、配列番号１で表される塩基配列が決定された。配列番号１で表される塩基配列における４０５番目のＴが目的ＳＮＰ箇所（すなわち、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目）である。
ＣＹＰ１Ａ２ｃＤＮＡ塩基配列及び高等真核生物のイントロンの両端には、ＧＴ及びＡＧというコンセサス配列が存在する。「ＧＴ−ＡＧ」ルールに従って、ＣＹＰ１Ａ２ゲノムＤＮＡにおける第３イントロン、第４エキソン、及び第４イントロンの塩基配列を同定した。その結果、配列番号１で表される塩基配列において、６３番目〜３１８番目が第３イントロンであり、３１９番目〜４４２番目が第４エキソンであり、４４３番目〜１３３８番目が第４イントロンであると考えられる。
以上の結果より、目的ＳＮＰは、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第４エキソン８７番目の塩基におけるＣからＴへの置換であることが判明した。
【００７２】
《実施例４：ＡＳＰ−ＰＣＲ法によるＳＮＰ検出》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ビーグル犬ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを検出するため、ビーグル犬白血球中のゲノムＤＮＡを単離し、ＡＳＰ−ＰＣＲを実施後、アガロースゲル電気泳動パターンによってＳＮＰの存在を判定した。
【００７３】
すなわち、イヌゲノムＤＮＡは、実施例３で述べた方法と同一の方法で抽出した。
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。アレル特異的に反応するＰＣＲプライマーセットとしては、プライマーＳ０７ｗｉｌｄ（配列番号１４）及びプライマーＡ０７（配列番号１５）のセット、並びにプライマーＳ０７ｍｕｔａｎｔ（配列番号１６）及びプライマーＡ０７のセットの、２つのＰＣＲプライマーセットを用いた。配列番号１４で表される塩基配列における１９番目（Ｃ）及び配列番号１６で表される塩基配列における１９番目（Ｔ）が目的ＳＮＰを認識する箇所である。プライマーは、Ｅａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表６に示す。
【００７４】
【００７５】
ＰＣＲの結果、増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、Ｓ０７ ｗｉｌｄ及びＡ０７プライマーセット、並びにＳ０７ ｍｕｔａｎｔ及びＡ０７プライマーセットからはいずれも３６５ｂｐであった。アガロースゲル電気泳動の結果、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の第４エキソン８７番目の塩基がＣからＴへと変異するＳＮＰにおいて、Ｃアレルをホモで持つ場合は、Ｓ０７ ｗｉｌｄ及びＡ０７プライマーセットでのみ、ＤＮＡ断片が増幅された。両アレルをヘテロで持つ場合は、Ｓ０７ ｗｉｌｄ及びＡ０７プライマーセット、並びにＳ０７ ｍｕｔａｎｔ及びＡ０７プライマーセットのいずれにおいても、ＤＮＡ断片が増幅された。Ｔアレルをホモで持つ場合は、Ｓ０７ ｍｕｔａｎｔ及びＡ０７プライマーセットでのみ、ＤＮＡ断片が増幅された。
【００７６】
《実施例５：ダイレクトシークエンス法によるＳＮＰ検出》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰを検出するため、ビーグル犬白血球中のゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲを実施後、ダイレクトシークエンスによってＳＮＰの存在を判定した。
【００７７】
すなわち、イヌゲノムＤＮＡは、実施例３で述べた方法と同一の方法で抽出した。
抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＤＮＡポリメラーゼ酵素としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲプライマーとして、プライマーＳ０５及びプライマーＡ０７がセットのＰＣＲプライマーセットを用いた。プライマーはＥａｓｙ Ｏｌｉｇｏｓ（プロリゴ・ジャパン株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応条件を表７に示す。
【００７８】
【００７９】
ＰＣＲの結果、増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、Ｓ０５及びＡ０７プライマーセットからは７５２ｂｐであった。増幅されたＤＮＡ断片は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ社）を用いて付随のプロトコールに従い精製した。ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の各多型部位を同定するための塩基配列の決定は、精製したＤＮＡ断片をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７：アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により解析した。シークエンス解析に用いたプライマーとして、ＰＣＲプライマーＳ０８（配列番号１７）及びＡ０８（配列番号１８）を用いた。
【００８０】
その結果、シークエンス波形によりＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰの塩基配列を同定した。Ｃアレルをホモで持つ場合は、Ｃの波形のみが検出された。両アレルをヘテロで持つ場合は、Ｃ及びＴ両方の波形が検出された。Ｔアレルをホモで持つ場合は、Ｔの波形のみが検出された。
【００８１】
《実施例６：アレル頻度解析》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰのアレル頻度を解析するため、実施例４及び実施例５の試験結果を採用した。
ビーグル犬６５例のＣＹＰ１Ａ２遺伝子１１１７番目の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰ遺伝子診断結果を、表８に示す。
【００８２】
【００８３】
表８において、ＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソンの８７番目）がＣである遺伝子をホモで有するものは「Ｃ／Ｃ」、前記部位がＴである遺伝子をホモで有するものは「Ｔ／Ｔ」、そして、両遺伝子をヘテロで有するものは「Ｃ／Ｔ」として表記する。表８に示すとおり、Ｃ／Ｃが２５例（３８％）であり、Ｃ／Ｔが２９例（４５％）であり、Ｔ／Ｔが１１例（１７％）であった。アレル頻度は、Ｃアレルが０．６１であり、Ｔアレルが０．３９であった。
【００８４】
《実施例７：ビーグル犬を用いた薬物動態試験》
フォスフォジエステラーゼＩＶ阻害薬である４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（国際公開ＷＯ９７／１９０７８号パンフレット又は特許第３１１０７６５号明細書の実施例７参照；以下、化合物Ａと称する）は、ビーグル犬において、ＭＭ−１からＭＭ−５までの５種の代謝物に代謝されることが知られている。これらはいずれも一水酸化体であり、第一相薬物代謝反応による生成物と考えられている。宮下（Ｍｉｙａｓｈｉｔａ）らは、ビーグル犬をＭＭ−２が血漿中主代謝物である群及びＭＭ−１ならびにＭＭ−５が主代謝物である群に大別できることを報告している［「第１７回日本薬物動態学会年会ポスター発表」，（日本），２００２年，２０ＰＥ−４６］。
【００８５】
本実施例では、以下に示す手順に従って、化合物Ａを経口投与後、未変化体及び代謝物の濃度推移を測定する薬物動態試験を実施した。
すなわち、雄性ビーグル犬１０例に、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁させた化合物Ａ投与液を経口投与（０．３ｍｇ／ｋｇ）後、０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、及び８．０時間後に採血を実施した。血漿を液−液抽出後、未変化体及び代謝物の高性能液体クロマトグラフィーを用いた蛍光検出器による同時測定法（以下、ＨＰＬＣ−ＦＬ法と称する）に従い血漿中濃度推移を測定した。
化合物Ａ及び代謝物同時測定ＨＰＬＣ−ＦＬ法の条件を表９に、移動相濃度勾配を表１０に、それぞれ示す。
【００８６】
【００８７】
【００８８】
本実施例に用いた薬物動態試験用ビーグル犬は、表現型解析の予備検討を行なうことにより選択し、ＭＭ−２が主代謝物であるイヌ（Ｉ型）を５例、ＭＭ−１及びＭＭ−５が主代謝物であるイヌ（ＩＩ型）を５例用いた。化合物Ａ及び代謝物の血漿中濃度推移について、Ｉ型の結果を図１に、ＩＩ型の結果を図２にそれぞれ示す。
【００８９】
薬物動力学パラメータである最高血漿中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）、最高血中薬物濃度（Ｃｍａｘ）、無限大時間までの血中濃度下面積（ＡＵＣｉｎｆ）、及び血中半減期（Ｔ１／２）を算出した。結果を表１１に示す。
【００９０】
【００９１】
未変化体に関する薬物動力学パラメータは、ＣｍａｘではＩＩ型はＩ型の７．５倍であり、ＡＵＣｉｎｆではＩＩ型はＩ型の９．７倍であった。以上より、Ｉ型がＥＭ型であり、ＩＩ型がＰＭ型であることがわかる。
また、実施例６におけるＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（すなわち、第４エキソン８７番目）の塩基がＣからＴへと置換するＳＮＰ遺伝子診断の結果、ＥＭ群のビーグル犬はＣ／Ｃ遺伝子型が２例で、Ｃ／Ｔ遺伝子型が３例であり、一方、ＰＭ群のビーグル犬においては５例全てがＴ／Ｔ遺伝子型であった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、例えば、薬理効果試験又は毒性試験などに使用するイヌの薬剤代謝能力の個体差を、前記試験に先立って検出することができ、化合物の薬理効果又は毒性の評価の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
［図１］Ｉ型ビーグル犬における、４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オン及び代謝物の血漿中濃度推移を示すグラフである。横軸は時間（ｈｒ）を、縦軸は血漿中濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、記号「Ａ」は化合物Ａを意味する。
［図２］ＩＩ型ビーグル犬における、４−シクロヘキシル−１−エチル−７−メチルピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オン及び代謝物の血漿中濃度推移を示すグラフである。横軸は時間（ｈｒ）を、縦軸は血漿中濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、記号「Ａ」は化合物Ａを意味する。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号１９の配列で表される塩基配列は、人工的に合成したＧｅｎｅＲａｃｅｒ ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏである。
配列番号２０の配列で表される塩基配列は、人工的に合成したＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’ｐｒｉｍｅｒである。
配列番号２３の配列で表されるアミノ酸配列において、４１５番の位置の記号「Ｘａａ」はＧｌｕ又はＧｌｎを意味し、４３３番の位置の記号「Ｘａａ」はＧｌｙを意味し、４３５番の位置の記号「Ｘａａ」はＡｌａ又はＴｈｒを意味する。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定することを特徴とする、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型の検出方法。
【請求項２】
イヌから核酸試料を得、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定する工程を含む、薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法により薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する工程を含む、医薬品の試験に用いるイヌを選別する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法で選別したエクステンスィブ・メタボライザー群又はプアー・メタボライザー群に被験薬を投与する工程を含む、被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する方法。
【請求項５】
ストリンジェントな条件で、配列番号１で表される塩基配列若しくは配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列又はその遺伝子多型を有するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖にハイブリダイズし、
（１）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＣである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、
（２）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＴである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、及び
（３）（１）若しくは（２）の相補鎖である、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなる、請求項５に記載の一本鎖ＤＮＡ。
【請求項７】
イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を検出するための試薬を有効成分として含有する、イヌＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である薬物の代謝活性多型の診断剤。
【請求項１】
イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定することを特徴とする、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子多型の検出方法。
【請求項２】
イヌから核酸試料を得、イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を決定する工程を含む、薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法により薬物代謝速度がエクステンスィブ・メタボライザーであるか、又は、プアー・メタボライザーであるかを検出する工程を含む、医薬品の試験に用いるイヌを選別する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法で選別したエクステンスィブ・メタボライザー群又はプアー・メタボライザー群に被験薬を投与する工程を含む、被験薬の薬理効果及び／又は毒性を試験する方法。
【請求項５】
ストリンジェントな条件で、配列番号１で表される塩基配列若しくは配列番号２２で表される塩基配列における６３番目〜１６０１番目の塩基からなる配列又はその遺伝子多型を有するイヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子のセンス鎖若しくはアンチセンス鎖にハイブリダイズし、
（１）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＣである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、
（２）配列番号１で表される塩基配列における４０５番目又は配列番号２２で表される塩基配列における１１７９番目に該当する塩基を含み、その４０５番目又は１１７９番目に該当する塩基がＴである、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ、及び
（３）（１）若しくは（２）の相補鎖である、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、１５塩基以上３０塩基以下の一本鎖ＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１４又は１６で表される塩基配列からなる、請求項５に記載の一本鎖ＤＮＡ。
【請求項７】
イヌＣＹＰ１Ａ２遺伝子の１１１７番目（配列番号２２で表される塩基配列の１１７９番目）の塩基に該当する塩基を検出するための試薬を有効成分として含有する、イヌＣＹＰ１Ａ２の特異的基質である薬物の代謝活性多型の診断剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６５２１
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６４９８（Ｐ２００５−５０６４９８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００７３５６
【国際出願日】平成１６年５月２８日（２００４．５．２８）
【特許番号】特許第３７６７６３２号（Ｐ３７６７６３２）
【特許公報発行日】平成１８年４月１９日（２００６．４．１９）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００７３５６
【国際出願日】平成１６年５月２８日（２００４．５．２８）
【特許番号】特許第３７６７６３２号（Ｐ３７６７６３２）
【特許公報発行日】平成１８年４月１９日（２００６．４．１９）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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