イムノクロマトキット及び検出装置
【課題】植物組織成分による目詰まり、判定結果の信頼性低下を防止し、かつ余分な手間がかからないイムノクロマトキットを提供する。
【解決手段】本イムノクロマトキットは、磨砕容器と、植物病原体を検出する検出装置とを備える。検出装置は、滴下部１１と、標識区域１２と、検出区域１４と、対照区域１５とを備え、試料磨砕液の流動方向において摩砕容器内がイムノクロマトキットにおいて最も上流側であり、滴下部１１、標識区域１２及び検出区域１４が検出装置内において、流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設される。糖鎖分解酵素が、検出装置内の検出区域１４より上流側か、あるいは、摩砕容器の濾過部に乾燥状態で保持される。
【解決手段】本イムノクロマトキットは、磨砕容器と、植物病原体を検出する検出装置とを備える。検出装置は、滴下部１１と、標識区域１２と、検出区域１４と、対照区域１５とを備え、試料磨砕液の流動方向において摩砕容器内がイムノクロマトキットにおいて最も上流側であり、滴下部１１、標識区域１２及び検出区域１４が検出装置内において、流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設される。糖鎖分解酵素が、検出装置内の検出区域１４より上流側か、あるいは、摩砕容器の濾過部に乾燥状態で保持される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体を試料とし、試料中の病原体を、イムノクロマト法を用いて検出するイムノクロマトキット及び検出装置に関するものである。更に詳しくは、検出過程で植物組織成分による偽陽性の発生、粘性増加による展開の遅延を取り除き、容易かつ、短時間に精度よく検出できる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病原体は、接ぎ木、虫あるいは土壌などを介して広く植物間に伝搬し増殖する。
【０００３】
植物病原体を高感度に検出する方法として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が知られている。即ち、乳鉢に緩衝液と植物試料とを入れ、乳棒にて磨砕して試料磨砕液を調製し、この試料磨砕液を用いて酵素免疫測定法による測定を行う。
【０００４】
特許文献１（特許４２７３１１１号公報）及び非特許文献１（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．（２００７）７３，６６−７１）に記載されているように、酵素免疫測定法よりも更に迅速で容易に診断できる手段としてイムノクロマト法が開発された。
【０００５】
特許文献１、非特許文献１には、カンキツ類におけるＳＤＶ（Ｓａｔｓｕｍａ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ：温州委縮ウイルス）の検出において、柔らかい葉を磨砕して測定用の試料磨砕液としてイムノクロマト法に用いることで、比較的容易に高感度に植物病原体を検出可能である旨記載されている。
【０００６】
さらに、特許文献２（特開２００７−２１８９０３号公報）は、より容易に病原体を植物体から抽出する技術として、磨砕容器（アシスト社：フィンガーマッシャー（商品名））を使用する方法を開示する。
【０００７】
イムノクロマト法では、ニトロセルロースが試料液を一定の流動方向に流動（毛細管現象によるクロマト展開）させる多孔質坦体として使用されるが、ここで、サイズの比較を行う。
【０００８】
まず、ニトロセルロース自体の孔サイズは約１０μｍ程度である。
【０００９】
ニトロセルロースにおいて、抗体が固相化される検出区域の孔サイズは、ニトロセルロース自体の孔サイズよりも小さく、おおよそ１〜３μｍ程度である。
【００１０】
また、植物体が乳鉢乳棒や上記の磨砕容器を使用して磨砕された後、その試料磨砕液中には比較的大きな植物組織成分（数μｍ〜数百μｍ）が残存することがあるし、多糖体などの強粘性成分が含まれる事がある。
【００１１】
ニトロセルロースの中を一定の流動方向に試料磨砕液が流れるとき、試料磨砕液中の物質のサイズが１０μｍ以下であれば、その物質は流れることができるが、サイズが１０μｍよりも大きい物質は、目詰まりして流れづらくなる。
【００１２】
さらに、植物体が多糖体などの強粘性成分を多く含むような場合、試料磨砕液の粘性が高くなり毛細管現象によるクロマト展開が阻害されて検出に長時間を要することも問題である。
【００１３】
より具体的には、規定時間内に判定ができない、あるいは、例え判定ができたとしても検出区域を通過する試料磨砕液中の植物病原体などの検出対象物や標識粒子の量が過小になり、規定時間での免疫反応量が不足して、その結果、感度が不十分になってしまう。
【００１４】
上記現象への対策として、単にニトロセルロースの孔サイズを大きくすると、目詰まりは解消するとしても、固相化される抗体量が少なくなったり、抗原と抗体の物理的距離も離れてしまったりと、抗原抗体反応量が低下し感度の低下につながる。
【００１５】
検出区域では、ニトロセルロース自体よりも孔サイズが小さくなっているため、上記阻害の問題はより深刻になる。
【００１６】
即ち、第１に、検出区域に試料磨砕液中の植物組織成分がひっかかり、葉緑体などの着色成分ではそのまま緑色のラインが出現する。本来の呈色が緑色以外であれば擬陽性であると判断できるが、本来の呈色も緑色であるときは、かかる判断はできない。
【００１７】
第２に、植物組織が着色成分でないときにも植物組織と標識物とが絡み合って、結果的に捕捉されるべきでない標識物が捕捉され、本来は陰性であるのに、標識物による呈色が観察されるため、陰性を陽性と誤判定されることになる。こうなると、判定結果の信頼性が著しく損なわれる。
【００１８】
以上のように、植物体を試料として用いるとき比較的大きな植物組織成分が存在すると、偽陽性や、展開時間の遅延を発生させ、いずれも判定の時間及び／又は精度に影響を及ぼしてしまう。この植物組織成分をイムノクロマト展開前に、取り除くか分解せざるを得ないが、この要請にイムノクロマト法の利点を損なわず適切に対応できる技術は知られていない。
【特許文献１】特許第４２７３１１１号公報
【特許文献２】特開２００７−２１８９０３号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．（２００７）７３，６６−７１
【非特許文献２】福岡農総試県報 Ｂ−９ ５７〜６３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
そこで本発明は、植物組織成分による目詰まり、判定結果の信頼性低下を防止し、かつ余分な手間がかからないイムノクロマトキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明のイムノクロマトキットは、磨砕容器と、植物病原体を検出する検出装置とを備える。
【００２１】
検出装置は、植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、植物病原体に対して特異結合性を有する第１の抗体を有色粒子により標識したものを試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、植物病原体に対して特異結合性を有する第２の抗体が固相化される検出区域と、検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備える。
【００２２】
試料磨砕液の流動方向において摩砕容器内がイムノクロマトキットにおいて最も上流側であり、滴下部、標識区域及び検出区域が検出装置内において、流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設される。
【００２３】
そして、糖鎖分解酵素が、検出装置内の検出区域より上流側か、あるいは、試料摩砕液が流動方向において接触する摩砕容器の濾過部に乾燥状態で保持されている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、酵素の調製や酵素と試料を予め６０分も反応させる必要がなくなり、検査者は、一連の作業の中で意識せずに、しかも追加的手間をかけることもなく、植物体組織の酵素による分解反応を行える。
【００２５】
このため、分解された植物体組織成分が偽陽性や流れの遅延を防止し、規定時間内に判定ができ、かつ本来の感度を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
＜前提事項の比較検討＞
まず、本発明の実施の形態の具体的説明に先立ち、ニトロセルロースに滴下する前、あるいは遅くとも、検出区域に試料が到達するまでに、比較的大きな植物組織成分を取り除くか、あるいはより小さくする代表的な手法を比較検討し、次に、本発明で採用する糖鎖分解酵素について説明する。
【００２７】
（濾過）
第１に、滴下前に濾過作業により比較的大きな植物組織成分のみを除去するという方法が考えられる。
【００２８】
しかしながら、濾過フィルターの孔サイズが微小になればなるほど濾過自体に時間が必要となり、さらには濾過作業自体も手間がかかるため、簡便、迅速というイムノクロマトの本来の目的に沿わず、不適である。
【００２９】
さらには、濾過作業により細菌等の植物病原体自体も取り除かれてしまう可能性も十分にあり、そうなると、感度及び判定結果の信頼性が著しく損なわれる。
【００３０】
（遠心分離）
遠心分離により除去を行うには、専用の装置が必要であり操作の手間がかかる。これも、簡便、迅速というイムノクロマトの本来の目的に沿わず、不適である。
【００３１】
（ＥＬＩＳＡ法と酵素）
非特許文献２（福岡農総試県報 Ｂ−９ ５７〜６３（１９８９））には、ＥＬＩＳＡ法においては酵素を使用する例が記載されている。
【００３２】
植物体には多くの糖鎖が存在しており、この糖鎖は、糖同士が化学的に結合し長い鎖状の形態をしている。この糖鎖の結合はセルロースやヘミセルロースなどからなり、非常に強力であり、さらに、これが複数・複雑にからみ合って大きな糖鎖の集合体が形成される。
【００３３】
非特許文献２は、さらに、このセルロースやヘミセルロースを分解するため、セルラーゼやヘミセルラーゼのような糖鎖分解酵素を使用することを開示する。非特許文献２には、従来からある乳鉢乳棒を用いる磨砕方法に対しての操作労力の軽減と時間短縮を行うため、酵素を使用しており、酵素を使用した磨砕の程度は同等であると報告されている。
【００３４】
しかしながら、実際には、検体を前もって凍結して粉砕する必要があり、酵素を別途用意して調製しなければならない。更に、反応時間に６０分以上も要するし、酵素活性を常に気にしておかなければならない。
【００３５】
以上に鑑みると、短時間で簡便さを求められるイムノクロマト法の検査においては、作業工程を増やしてしまうばかりか、かえって時間や労力を要してしまう結果となるから、これも不適である。
【００３６】
（界面活性剤）
植物組織成分を分解するのに界面活性剤の使用も考えられるため、検討を行ったが、植物組織成分による影響は取り除けず、実際にはむしろ免疫反応に阻害がかかり感度が低下する結果となった。よって、これも不適である。
【００３７】
（その他）
他に、分解する方法として、熱分解、超臨界水処理による分解、マイクロ波照射による分解等の物理的な処理方法や、酸処理、アルカリ処理等の化学的処理方法がある。
【００３８】
しかし、これらの方法を前処理として行うと手間がかかる上、処理できる施設や機器が必要となってしまい、植物体の試料を採取後に、迅速に診断でき、かつ検査場所を選ばないというようなイムノクロマトの優位性を著しく損ねてしまう。
【００３９】
また、これらの処理により試料磨砕液中のウイルスや細菌等の病原体を検出不可能な状態にしてしまう可能性も十分に考えられ、そうなってしまえば本末転倒である。よって、これら他の方法は、いずれも不適である。
【００４０】
（実施の形態１）
（糖鎖分解酵素）
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。以上の検討結果を踏まえ、本発明では、比較的大きな植物組織成分を取り除くか、あるいはより小さくする代表的な手法として、糖鎖分解酵素を使用する。
【００４１】
糖鎖分解酵素の作用について、図３を参照しながら説明する。図３（ａ）〜（ｃ）は、本発明の糖類分解酵素が糖鎖及び多糖類を分解する過程を示す模式図（図３左側）及びその一部拡大図（図３右側）である。
【００４２】
この糖鎖分解酵素は、植物組織成分の主要素である糖鎖や多糖体を特異的に分解する。図３は、その分解の様子を模式的に示す。図３に示されているように、糖鎖や多糖体は、糖鎖分解酵素の作用により、段階的に、経時的に小さくなっていく。
【００４３】
以下の説明により明らかになるとおり、糖鎖分解酵素は、上述した他の手段に比べ、イムノクロマト法への適応性が高く、イムノクロマト法の本来の目的を損なわないだけでなく、かえってその効果を促進することもできる。しかも、以下の説明により明らかなように、検査者の手間は増えない。
【００４４】
この糖鎖分解酵素には、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクトリアーゼ、および、これらの組み合わせからなる群より選択される。この時、装置に滴下される試料磨砕液１ｇに対し、酵素が１ｍｇから１００ｍｇ含有されることが好ましく、更には１０ｍｇから５０ｍｇ含有されることがより好ましい。
【００４５】
（検出装置）
図１（ａ）は、本発明の一実施の形態における検査装置の正面図、図１（ｂ）は、同側面図である。図２は、本発明の一実施の形態における磨砕容器の正面図である。
【００４６】
図１に示すように、本形態の検出装置は、短冊形状の多孔質坦体１３（例えば、ニトロセルロース膜からなる。）を主材として構成される。試料磨砕液のクロマト的な流動方向に沿って、上流側から順に、滴下部１１と標識区域１２と検出区域１４と対照区域１５と吸液部１６とが、連設される。
【００４７】
多孔質坦体１３あるいはその他の要素は、更に、プラスチック等よりなる基体に固定されて強度が付与されていてもよく、また、保護のために表面に透明なテープ等が貼られていてもよい。
【００４８】
標識区域１２は、保水性担体を含み、保水性担体は、第１の抗体であるモノクローナル抗体（Ｂ）を有色粒子により標識したものを試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する。
【００４９】
保水性担体としては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン等からなる不織布、あるいはセルロース、パルプ、ガラス繊維等からなる濾紙を挙げることができる。
【００５０】
有色粒子としては、例えば、金、セレンからなる金属コロイド、あるいは、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなるラテックス微粒子を挙げることができる。
【００５１】
これらのうち、抗体又は抗原の吸着性が優れ、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、金コロイド、またはポリスチレン系のラテックス粒子が有色粒子として好適に用いられる。
【００５２】
なお、いずれにしても、色は、葉緑素の色である緑とは異なる色とするのが好ましい。
【００５３】
抗体を有色粒子に結合するには、例えば、物理的又は化学的な吸着法等によることができる。
【００５４】
標識区域１２には、更に、有色粒子に抗体等を固定した第２有色粒子標織物が含浸されていてもよい。このような第２有色粒子標織物は、マーカーとして用いることができる。
【００５５】
検出区域１４は、果樹病原体と抗原抗体反応を行う、第２の抗体としてのモノクローナル抗体（Ａ）が多孔質坦体１３上に固相化されている。
【００５６】
固相化されたモノクローナル抗体（Ａ）は、測定用の試料磨砕液中の病原体（Ｘ）を認識する。病原体（Ｘ）が試料磨砕液中に存在すれば、モノクローナル抗体（Ａ）と病原体（Ｘ）とモノクローナル抗体（Ｂ）と有色粒子とからなる複合体が生成され、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に固相されているため、この複合体は、検出区域１４に捕捉される。
【００５７】
例えば、本形態のように、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に線状に固相化されていれば、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、線状のサインがあらわれることになる。
【００５８】
検出区域１４は、モノクローナル抗体（Ａ）を含む緩衝液を、ニトロセルロース膜に塗布し、乾燥することにより得ることができる。この時、塗布用の緩衝液としては、得られた検出装置の検出感度の点から、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が好ましい。
【００５９】
対照区域１５には、モノクローナル抗体（Ｂ）に対する抗体を固相化するのが好ましい。対照区域１５の呈色の有無により、イムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定できる。
【００６０】
滴下部１１は滴下された試料磨砕液を標識区域１２へと展開させることができる。
【００６１】
（磨砕容器）
図２に示すように、本形態の磨砕容器は、容器本体１７とノズルキャップ１８とからなり、容器本体１７にノズルキャップ１８を装着して使用される。容器本体１７の中に植物体と磨砕用の緩衝液を入れ、外から手揉みすることで植物体を磨砕することができる。
【００６２】
この時に使用する磨砕用の緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等が好ましい。
【００６３】
ノズルキャップ１８には、植物体組織成分を粗く濾過することが可能な濾過部１９が組み込まれる。濾過部１９には、濾紙や焼結フィルターを使用することが可能である。
【００６４】
容器本体１７で磨砕した試料磨砕液はノズルキャップ１８内の濾過部１９を経て、滴下部１１へと滴下される。
【００６５】
試料が検出区域１４に到達するよりも前に植物体組織成分を分解する必要があるため、検出区域１４よりも上流側に糖鎖分解酵素を保持することが必要である。これに適した場所として、試料磨砕液を滴下する滴下部１１、もしくは、濾過部１９を挙げることができる。
【００６６】
以下に、温州萎縮ウイルス（以下「ＳＤＶ」という。）ならびにリンゴステムグルービングウイルス（以下「ＡＳＧＶ」という。）の検出について実施例をあげて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この実施例に限定されるものではない。
【００６７】
＜実施例１＞
ＳＤＶの検出キットを使用し、酵素の存在の有無によって偽陽性発色の相違があることを確認した。
【００６８】
（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）の方法に準じて調製した。ＳＤＶを免疫したマウスの脾臓から抗体を産生する細胞を取り出し、別に用意したマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６産生ハイブリドーマ細胞ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２産生ハイブリドーマ細胞を得た。
【００６９】
それぞれのハイブリドーマ細胞を培養し、マウス腹腔内に注射し、腹水を得た。得られた腹水を硫酸アンモニウム分画し、プロテインＧカラム精製により、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を得た。
【００７０】
（標識成分の調製）
Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い金コロイド粒子を作製した。この金コロイドの１０ｍＬに対し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を４０μｇ、室温にて混合し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００７１】
（標識区域１２の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝１．０となるように調製し、反応確認のために対照としてウサギγグロブリン結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．２となるように調製したものを混合し調製液を作製した。
【００７２】
この調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μＬ塗布し、凍結乾燥させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド（標識区域１２）を調製した。
【００７３】
（検出区域１４の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６を、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ（商標））の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。
【００７４】
また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００７５】
（滴下部１１の調製）
糖鎖分解酵素のマセロチームＲ−１０（商標）（ヤクルト薬品工業株式会社，Ｃａｔ．３７３−１）を１テスト当たり２．５μｇとなるように、濾紙パッドに塗布し、凍結乾燥させ、酵素添加滴下部濾紙パッドを作製した。
【００７６】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙パッド、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してＳＤＶの検出装置を作製した。
【００７７】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにＳＤＶに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにＳＤＶ感染樹の新梢を使用した。
【００７８】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これら新梢が０．１ｇとなるように添加した。手揉みで３０回程度磨砕後、未処理の濾過部１９を通して濾過したものを試料磨砕液とし、これを滴下することでイムノクロマトに供した。この時、濾過部１９には東洋濾紙株式会社ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用いた。
【００７９】
＜実施例２＞
（検出装置の作製）
実施例１における（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（検出装置の作製）までと同様に検出装置が作製されるが、（滴下部１１の調製）において、酵素を添加せず、未処理の滴下部濾紙パッドを使用し、検出装置を作製した。
【００８０】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにＳＤＶに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにＳＤＶ感染樹の新梢を使用した。
【００８１】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これら新梢が０．１ｇとなるように添加した。濾過部１９には実施例１と同様にＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用いた。
【００８２】
この濾紙に対し糖鎖分解酵素のマセロチームＲ−１０（商標）を１テスト当たり２．５μｇとなるように塗布し、凍結乾燥させたものを使用した。手揉みで３０回程度磨砕後、酵素を添加した濾過部１９を通して濾過したものを試料磨砕液とし、これを滴下することでイムノクロマトに供した。
【００８３】
＜比較例１＞
（検出装置の作製）
実施例１における、（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）までと同様に検出装置が作製されるが、（滴下部１１の調製）において、酵素を添加せず、未処理の滴下部濾紙パッドを使用し、検出装置を作製した。
【００８４】
（反応性試験）
実施例１、実施例２、比較例１ついて、調製したそれぞれの試料磨砕液１００μＬを作製したクロマトの滴下部に滴下し、反応性を確認した。反応性の確認は、滴下を行ってから１０分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
【００８５】
（結果の検討）
実施例１、２と比較例１による結果をまとめると次の通りである。
酵 素 試料摩砕液
有無 部位 正常樹（判定） 感染樹（判定）
実施例１ 有り 滴下部１１に塗布 発色無し(-) 陽性(+++)
実施例２ 有り 濾過部１９に塗布 発色無し(-) 陽性(+++)
比較例１ 無し − 緑色の偽陽性発色 陽性(+++)
なお、+++:強陽性、++,+:陽性、-:陰性
【００８６】
酵素を乾燥状態で滴下部１１に添加した実施例１、および濾過部１９に添加した実施例２では、正常樹において発色はなかった。一方、酵素を添加していない比較例１では緑色の線が生じ、偽陽性発色となった。このことから、酵素存在下において、植物体の色素由来の偽陽性発色を抑制することが確認できた。
【００８７】
＜実施例３＞
ＡＳＧＶ検出キットを使用し糖鎖分解酵素の種類と効果について確認した。
【００８８】
（検出装置の作製）
ここからＳＤＶの検出キットではなくＡＳＧＶの検出キットを使用し検討を行う。実施例１における、（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）までと同様に検出装置が作製されるが、抗ＳＤＶモノクローナル抗体の代わりに抗ＡＳＧＶモノクローナル抗体を使用し、ＡＳＧＶ検出装置を作製した。
【００８９】
モノクローナル抗体がＳＤＶとＡＳＧＶとで異なるだけで、抗体以外の部材、作製方法は両者同じである。また、（滴下部１１の調製）においてマセロチームＲ−１０（商標）添加の滴下部濾紙パッドに加え、ペクトリアーゼＹ−２３（商標）（協和化成株式会社）、セルラーゼ”オノズカ”Ｒ１０（商標）（ヤクルト薬品工業株式会社）を別個に加えた滴下部濾紙パッドを作製した。対照として、酵素を添加せず、未処理の滴下部塗布パッドも使用した。
【００９０】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにＡＳＧＶに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにＡＳＧＶ感染樹の新梢を使用した。
【００９１】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これら新梢が０．１ｇとなるように添加した。これを手揉みで３０回程度磨砕後、未処理のＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を使用した濾過部１９を通して濾過したものを試料磨砕液とし、これを滴下することでイムノクロマトに供した。
【００９２】
（反応性試験）
調製したそれぞれの試料磨砕液１００μＬを作製したクロマトの滴下部に滴下し、反応性を確認した。反応性の確認は、滴下を行ってから１０分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
【００９３】
（結果の検討）
酵素の種類 正常樹（判定） 感染樹（判定）
なし 緑色の偽陽性発色 陽性(+++)
マセロチームR-10 発色無し(-) 陽性(+++)
ペクトリアーゼY-23 発色無し(-) 陽性(+++)
セルラーゼR10 発色無し(-) 陽性(+++)
なお、+++:強陽性、++,+:陽性、-:陰性
【００９４】
マセロチームＲ−１０（商標）以外の糖鎖分解酵素であるペクトリアーゼＹ−２３（商標）、セルラーゼ”オノズカ”Ｒ−１０（商標）においても実施例１と同様に、偽発色を抑制する効果が認められた。
【００９５】
さらに、感染樹においては感度を向上させる効果も同じく認められた。これは、糖鎖分解酵素が検出キットに含有されていれば、種類によらず、偽発色を抑制でき、さらに感度を向上させられることを示唆するものである。
【００９６】
＜実施例４＞
ＡＳＧＶ検出キットを使用し、酵素の有無によって、滴下した試料磨砕液が検出装置を流れる速さの相違があること、さらに、流れる速さの違いにより感度に相違があることを実証した。
【００９７】
（検出装置の作製）
実施例１における、（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（検出装置の作製）までと同様かつ、実施例３の様にモノクローナル抗体をＳＤＶからＡＳＧＶに置き換えて検出装置が作製されるが、（滴下部１１の調製）において、滴下部１１へマセロチームＲ−１０（商標）を添加した滴下部濾紙パッドに加え、酵素未添加の滴下部濾紙パッドを使用したものを用い、それぞれ検出装置を作製した。
【００９８】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料として磨砕時に粘性の低い果皮１と、粘性の高い果皮２および、果皮３を用いた。
【００９９】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これらの果皮が０．１ｇとなるように添加した。手揉みで３０回程度磨砕後、未処理のＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を使用した濾過部１９を通して濾過した試料磨砕液を滴下することでイムノクロマトに供した。いずれの植物体もＡＳＧＶに感染していない正常樹より採取したものである。また、対照としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のみのものも使用した。
【０１００】
試料磨砕液の流れる速さを観測するのと同時に、陽性感度の観測もするために、この試料とは別のＡＳＧＶに保毒している感染樹から得られた植物試料０．１ｇを使用し、この植物試料に対しＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が０．５ｍＬの割合になるように調製したものを上述と同様に磨砕して、陽性の試料磨砕液を得た。
【０１０１】
この陽性の試料磨砕液を果皮１〜３の緩衝液および、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に１０％の割合で添加し、最終的にこれをイムノクロマトに供する試料磨砕液として用いた。
【０１０２】
（反応性試験）
調製した試料磨砕液１００μＬを作製したクロマトの滴下部に滴下し、標識区域１２、多孔質担体１３を流れながら経て、その滴下した試料磨砕液の最先端部が吸収部１６に到達するまでの時間を計測し、到達時間の違いを確認した。さらに、感度を確認するために、５分、１０分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
（結果の検討）
結果は、上記表の通りとなり、粘性の低い植物体においては、酵素の有無による相違は見られなかったが、粘性の高い果皮において、酵素を添加した検出装置では、酵素を添加していない検出装置と比べ、流れる時間を半分以下に短縮することが観測された。
【０１０５】
感度に関し、低粘性の試料磨砕液においては酵素の有無で感度は５分、１０分と相違は無いが、強粘性の試料磨砕液において、酵素を添加していない検出装置では、低粘性の試料磨砕液と比較し感度が低くなる現象が観測された。
【０１０６】
一方で、酵素を添加した検出装置では低粘性の試料磨砕液と比較して、感度の低下は認められず、従来の感度で観測することが可能であった。
【０１０７】
従来は強粘性の物質が流れるのに時間を要していたが、低粘性の試料磨砕液に比べ強粘性の試料磨砕液中に多く含有されている多糖類を酵素活性により分解することで、到達時間が低粘性の試料磨砕液と変わらなくなり、粘性が低くなることで、流速が上がり、その結果、検出区域１４に達する時間が速くなり、発色時間も短縮された。このことはイムノクロマトの特徴である迅速診断というメリットをさらに向上させるものである。
【０１０８】
今まで粘性が高くイムノクロマト上を流すことが困難な試料磨砕液を用いても、低粘性の試料磨砕液と同様にスムーズに流せるため、従来、粘性が高く、希釈することで粘度を下げ測定していた試料磨砕液でも、希釈の工程を経ずに直接検査することができ、手間を省け、さらに希釈による感度低下を招くことなく、本来の感度で検出可能となるというメリットが得られる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】（ａ）本発明の一実施の形態における検出装置の正面図、（ｂ）本発明の一実施の形態における検出装置の側面図
【図２】本発明の一実施の形態における磨砕容器の正面図
【図３】（ａ）〜（ｃ）本発明の糖類分解酵素が糖鎖及び多糖類を分解する過程を示す模式図及びその一部拡大図
【符号の説明】
【０１１０】
１１ 滴下部
１２ 標識区域
１３ 多孔質担体
１４ 検出区域
１５ 対照区域
１６ 吸液部
１７ 容器本体
１８ ノズルキャップ
１９ 濾過部
Ａ モノクローナル抗体
Ｂ 固相化されたモノクローナル抗体
Ｘ 病原体
Ｆ 流れ方向
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体を試料とし、試料中の病原体を、イムノクロマト法を用いて検出するイムノクロマトキット及び検出装置に関するものである。更に詳しくは、検出過程で植物組織成分による偽陽性の発生、粘性増加による展開の遅延を取り除き、容易かつ、短時間に精度よく検出できる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病原体は、接ぎ木、虫あるいは土壌などを介して広く植物間に伝搬し増殖する。
【０００３】
植物病原体を高感度に検出する方法として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が知られている。即ち、乳鉢に緩衝液と植物試料とを入れ、乳棒にて磨砕して試料磨砕液を調製し、この試料磨砕液を用いて酵素免疫測定法による測定を行う。
【０００４】
特許文献１（特許４２７３１１１号公報）及び非特許文献１（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．（２００７）７３，６６−７１）に記載されているように、酵素免疫測定法よりも更に迅速で容易に診断できる手段としてイムノクロマト法が開発された。
【０００５】
特許文献１、非特許文献１には、カンキツ類におけるＳＤＶ（Ｓａｔｓｕｍａ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ：温州委縮ウイルス）の検出において、柔らかい葉を磨砕して測定用の試料磨砕液としてイムノクロマト法に用いることで、比較的容易に高感度に植物病原体を検出可能である旨記載されている。
【０００６】
さらに、特許文献２（特開２００７−２１８９０３号公報）は、より容易に病原体を植物体から抽出する技術として、磨砕容器（アシスト社：フィンガーマッシャー（商品名））を使用する方法を開示する。
【０００７】
イムノクロマト法では、ニトロセルロースが試料液を一定の流動方向に流動（毛細管現象によるクロマト展開）させる多孔質坦体として使用されるが、ここで、サイズの比較を行う。
【０００８】
まず、ニトロセルロース自体の孔サイズは約１０μｍ程度である。
【０００９】
ニトロセルロースにおいて、抗体が固相化される検出区域の孔サイズは、ニトロセルロース自体の孔サイズよりも小さく、おおよそ１〜３μｍ程度である。
【００１０】
また、植物体が乳鉢乳棒や上記の磨砕容器を使用して磨砕された後、その試料磨砕液中には比較的大きな植物組織成分（数μｍ〜数百μｍ）が残存することがあるし、多糖体などの強粘性成分が含まれる事がある。
【００１１】
ニトロセルロースの中を一定の流動方向に試料磨砕液が流れるとき、試料磨砕液中の物質のサイズが１０μｍ以下であれば、その物質は流れることができるが、サイズが１０μｍよりも大きい物質は、目詰まりして流れづらくなる。
【００１２】
さらに、植物体が多糖体などの強粘性成分を多く含むような場合、試料磨砕液の粘性が高くなり毛細管現象によるクロマト展開が阻害されて検出に長時間を要することも問題である。
【００１３】
より具体的には、規定時間内に判定ができない、あるいは、例え判定ができたとしても検出区域を通過する試料磨砕液中の植物病原体などの検出対象物や標識粒子の量が過小になり、規定時間での免疫反応量が不足して、その結果、感度が不十分になってしまう。
【００１４】
上記現象への対策として、単にニトロセルロースの孔サイズを大きくすると、目詰まりは解消するとしても、固相化される抗体量が少なくなったり、抗原と抗体の物理的距離も離れてしまったりと、抗原抗体反応量が低下し感度の低下につながる。
【００１５】
検出区域では、ニトロセルロース自体よりも孔サイズが小さくなっているため、上記阻害の問題はより深刻になる。
【００１６】
即ち、第１に、検出区域に試料磨砕液中の植物組織成分がひっかかり、葉緑体などの着色成分ではそのまま緑色のラインが出現する。本来の呈色が緑色以外であれば擬陽性であると判断できるが、本来の呈色も緑色であるときは、かかる判断はできない。
【００１７】
第２に、植物組織が着色成分でないときにも植物組織と標識物とが絡み合って、結果的に捕捉されるべきでない標識物が捕捉され、本来は陰性であるのに、標識物による呈色が観察されるため、陰性を陽性と誤判定されることになる。こうなると、判定結果の信頼性が著しく損なわれる。
【００１８】
以上のように、植物体を試料として用いるとき比較的大きな植物組織成分が存在すると、偽陽性や、展開時間の遅延を発生させ、いずれも判定の時間及び／又は精度に影響を及ぼしてしまう。この植物組織成分をイムノクロマト展開前に、取り除くか分解せざるを得ないが、この要請にイムノクロマト法の利点を損なわず適切に対応できる技術は知られていない。
【特許文献１】特許第４２７３１１１号公報
【特許文献２】特開２００７−２１８９０３号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．（２００７）７３，６６−７１
【非特許文献２】福岡農総試県報 Ｂ−９ ５７〜６３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
そこで本発明は、植物組織成分による目詰まり、判定結果の信頼性低下を防止し、かつ余分な手間がかからないイムノクロマトキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明のイムノクロマトキットは、磨砕容器と、植物病原体を検出する検出装置とを備える。
【００２１】
検出装置は、植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、植物病原体に対して特異結合性を有する第１の抗体を有色粒子により標識したものを試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、植物病原体に対して特異結合性を有する第２の抗体が固相化される検出区域と、検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備える。
【００２２】
試料磨砕液の流動方向において摩砕容器内がイムノクロマトキットにおいて最も上流側であり、滴下部、標識区域及び検出区域が検出装置内において、流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設される。
【００２３】
そして、糖鎖分解酵素が、検出装置内の検出区域より上流側か、あるいは、試料摩砕液が流動方向において接触する摩砕容器の濾過部に乾燥状態で保持されている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、酵素の調製や酵素と試料を予め６０分も反応させる必要がなくなり、検査者は、一連の作業の中で意識せずに、しかも追加的手間をかけることもなく、植物体組織の酵素による分解反応を行える。
【００２５】
このため、分解された植物体組織成分が偽陽性や流れの遅延を防止し、規定時間内に判定ができ、かつ本来の感度を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
＜前提事項の比較検討＞
まず、本発明の実施の形態の具体的説明に先立ち、ニトロセルロースに滴下する前、あるいは遅くとも、検出区域に試料が到達するまでに、比較的大きな植物組織成分を取り除くか、あるいはより小さくする代表的な手法を比較検討し、次に、本発明で採用する糖鎖分解酵素について説明する。
【００２７】
（濾過）
第１に、滴下前に濾過作業により比較的大きな植物組織成分のみを除去するという方法が考えられる。
【００２８】
しかしながら、濾過フィルターの孔サイズが微小になればなるほど濾過自体に時間が必要となり、さらには濾過作業自体も手間がかかるため、簡便、迅速というイムノクロマトの本来の目的に沿わず、不適である。
【００２９】
さらには、濾過作業により細菌等の植物病原体自体も取り除かれてしまう可能性も十分にあり、そうなると、感度及び判定結果の信頼性が著しく損なわれる。
【００３０】
（遠心分離）
遠心分離により除去を行うには、専用の装置が必要であり操作の手間がかかる。これも、簡便、迅速というイムノクロマトの本来の目的に沿わず、不適である。
【００３１】
（ＥＬＩＳＡ法と酵素）
非特許文献２（福岡農総試県報 Ｂ−９ ５７〜６３（１９８９））には、ＥＬＩＳＡ法においては酵素を使用する例が記載されている。
【００３２】
植物体には多くの糖鎖が存在しており、この糖鎖は、糖同士が化学的に結合し長い鎖状の形態をしている。この糖鎖の結合はセルロースやヘミセルロースなどからなり、非常に強力であり、さらに、これが複数・複雑にからみ合って大きな糖鎖の集合体が形成される。
【００３３】
非特許文献２は、さらに、このセルロースやヘミセルロースを分解するため、セルラーゼやヘミセルラーゼのような糖鎖分解酵素を使用することを開示する。非特許文献２には、従来からある乳鉢乳棒を用いる磨砕方法に対しての操作労力の軽減と時間短縮を行うため、酵素を使用しており、酵素を使用した磨砕の程度は同等であると報告されている。
【００３４】
しかしながら、実際には、検体を前もって凍結して粉砕する必要があり、酵素を別途用意して調製しなければならない。更に、反応時間に６０分以上も要するし、酵素活性を常に気にしておかなければならない。
【００３５】
以上に鑑みると、短時間で簡便さを求められるイムノクロマト法の検査においては、作業工程を増やしてしまうばかりか、かえって時間や労力を要してしまう結果となるから、これも不適である。
【００３６】
（界面活性剤）
植物組織成分を分解するのに界面活性剤の使用も考えられるため、検討を行ったが、植物組織成分による影響は取り除けず、実際にはむしろ免疫反応に阻害がかかり感度が低下する結果となった。よって、これも不適である。
【００３７】
（その他）
他に、分解する方法として、熱分解、超臨界水処理による分解、マイクロ波照射による分解等の物理的な処理方法や、酸処理、アルカリ処理等の化学的処理方法がある。
【００３８】
しかし、これらの方法を前処理として行うと手間がかかる上、処理できる施設や機器が必要となってしまい、植物体の試料を採取後に、迅速に診断でき、かつ検査場所を選ばないというようなイムノクロマトの優位性を著しく損ねてしまう。
【００３９】
また、これらの処理により試料磨砕液中のウイルスや細菌等の病原体を検出不可能な状態にしてしまう可能性も十分に考えられ、そうなってしまえば本末転倒である。よって、これら他の方法は、いずれも不適である。
【００４０】
（実施の形態１）
（糖鎖分解酵素）
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。以上の検討結果を踏まえ、本発明では、比較的大きな植物組織成分を取り除くか、あるいはより小さくする代表的な手法として、糖鎖分解酵素を使用する。
【００４１】
糖鎖分解酵素の作用について、図３を参照しながら説明する。図３（ａ）〜（ｃ）は、本発明の糖類分解酵素が糖鎖及び多糖類を分解する過程を示す模式図（図３左側）及びその一部拡大図（図３右側）である。
【００４２】
この糖鎖分解酵素は、植物組織成分の主要素である糖鎖や多糖体を特異的に分解する。図３は、その分解の様子を模式的に示す。図３に示されているように、糖鎖や多糖体は、糖鎖分解酵素の作用により、段階的に、経時的に小さくなっていく。
【００４３】
以下の説明により明らかになるとおり、糖鎖分解酵素は、上述した他の手段に比べ、イムノクロマト法への適応性が高く、イムノクロマト法の本来の目的を損なわないだけでなく、かえってその効果を促進することもできる。しかも、以下の説明により明らかなように、検査者の手間は増えない。
【００４４】
この糖鎖分解酵素には、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクトリアーゼ、および、これらの組み合わせからなる群より選択される。この時、装置に滴下される試料磨砕液１ｇに対し、酵素が１ｍｇから１００ｍｇ含有されることが好ましく、更には１０ｍｇから５０ｍｇ含有されることがより好ましい。
【００４５】
（検出装置）
図１（ａ）は、本発明の一実施の形態における検査装置の正面図、図１（ｂ）は、同側面図である。図２は、本発明の一実施の形態における磨砕容器の正面図である。
【００４６】
図１に示すように、本形態の検出装置は、短冊形状の多孔質坦体１３（例えば、ニトロセルロース膜からなる。）を主材として構成される。試料磨砕液のクロマト的な流動方向に沿って、上流側から順に、滴下部１１と標識区域１２と検出区域１４と対照区域１５と吸液部１６とが、連設される。
【００４７】
多孔質坦体１３あるいはその他の要素は、更に、プラスチック等よりなる基体に固定されて強度が付与されていてもよく、また、保護のために表面に透明なテープ等が貼られていてもよい。
【００４８】
標識区域１２は、保水性担体を含み、保水性担体は、第１の抗体であるモノクローナル抗体（Ｂ）を有色粒子により標識したものを試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する。
【００４９】
保水性担体としては、例えば、ポリエステル、レーヨン、ポリプロピレン等からなる不織布、あるいはセルロース、パルプ、ガラス繊維等からなる濾紙を挙げることができる。
【００５０】
有色粒子としては、例えば、金、セレンからなる金属コロイド、あるいは、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等に着色してなるラテックス微粒子を挙げることができる。
【００５１】
これらのうち、抗体又は抗原の吸着性が優れ、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、金コロイド、またはポリスチレン系のラテックス粒子が有色粒子として好適に用いられる。
【００５２】
なお、いずれにしても、色は、葉緑素の色である緑とは異なる色とするのが好ましい。
【００５３】
抗体を有色粒子に結合するには、例えば、物理的又は化学的な吸着法等によることができる。
【００５４】
標識区域１２には、更に、有色粒子に抗体等を固定した第２有色粒子標織物が含浸されていてもよい。このような第２有色粒子標織物は、マーカーとして用いることができる。
【００５５】
検出区域１４は、果樹病原体と抗原抗体反応を行う、第２の抗体としてのモノクローナル抗体（Ａ）が多孔質坦体１３上に固相化されている。
【００５６】
固相化されたモノクローナル抗体（Ａ）は、測定用の試料磨砕液中の病原体（Ｘ）を認識する。病原体（Ｘ）が試料磨砕液中に存在すれば、モノクローナル抗体（Ａ）と病原体（Ｘ）とモノクローナル抗体（Ｂ）と有色粒子とからなる複合体が生成され、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に固相されているため、この複合体は、検出区域１４に捕捉される。
【００５７】
例えば、本形態のように、モノクローナル抗体（Ａ）が検出区域１４に線状に固相化されていれば、検出区域１４が有色粒子により色づけされ、線状のサインがあらわれることになる。
【００５８】
検出区域１４は、モノクローナル抗体（Ａ）を含む緩衝液を、ニトロセルロース膜に塗布し、乾燥することにより得ることができる。この時、塗布用の緩衝液としては、得られた検出装置の検出感度の点から、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等が好ましい。
【００５９】
対照区域１５には、モノクローナル抗体（Ｂ）に対する抗体を固相化するのが好ましい。対照区域１５の呈色の有無により、イムノクロマトグラフィー試験が正常に行われたかどうかを判定できる。
【００６０】
滴下部１１は滴下された試料磨砕液を標識区域１２へと展開させることができる。
【００６１】
（磨砕容器）
図２に示すように、本形態の磨砕容器は、容器本体１７とノズルキャップ１８とからなり、容器本体１７にノズルキャップ１８を装着して使用される。容器本体１７の中に植物体と磨砕用の緩衝液を入れ、外から手揉みすることで植物体を磨砕することができる。
【００６２】
この時に使用する磨砕用の緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等が好ましい。
【００６３】
ノズルキャップ１８には、植物体組織成分を粗く濾過することが可能な濾過部１９が組み込まれる。濾過部１９には、濾紙や焼結フィルターを使用することが可能である。
【００６４】
容器本体１７で磨砕した試料磨砕液はノズルキャップ１８内の濾過部１９を経て、滴下部１１へと滴下される。
【００６５】
試料が検出区域１４に到達するよりも前に植物体組織成分を分解する必要があるため、検出区域１４よりも上流側に糖鎖分解酵素を保持することが必要である。これに適した場所として、試料磨砕液を滴下する滴下部１１、もしくは、濾過部１９を挙げることができる。
【００６６】
以下に、温州萎縮ウイルス（以下「ＳＤＶ」という。）ならびにリンゴステムグルービングウイルス（以下「ＡＳＧＶ」という。）の検出について実施例をあげて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この実施例に限定されるものではない。
【００６７】
＜実施例１＞
ＳＤＶの検出キットを使用し、酵素の存在の有無によって偽陽性発色の相違があることを確認した。
【００６８】
（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）の方法に準じて調製した。ＳＤＶを免疫したマウスの脾臓から抗体を産生する細胞を取り出し、別に用意したマウスの骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６産生ハイブリドーマ細胞ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２産生ハイブリドーマ細胞を得た。
【００６９】
それぞれのハイブリドーマ細胞を培養し、マウス腹腔内に注射し、腹水を得た。得られた腹水を硫酸アンモニウム分画し、プロテインＧカラム精製により、抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６ならびに抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を得た。
【００７０】
（標識成分の調製）
Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０−２２，１９７３）の方法に従い金コロイド粒子を作製した。この金コロイドの１０ｍＬに対し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体２Ｇ２を４０μｇ、室温にて混合し、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド（標識成分）を調製した。
【００７１】
（標識区域１２の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイドをＯＤ５２０＝１．０となるように調製し、反応確認のために対照としてウサギγグロブリン結合金コロイドをＯＤ５２０＝０．２となるように調製したものを混合し調製液を作製した。
【００７２】
この調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μＬ塗布し、凍結乾燥させ、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド（標識区域１２）を調製した。
【００７３】
（検出区域１４の調製）
抗ＳＤＶモノクローナル抗体４Ｅ６を、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ（商標））の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。
【００７４】
また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。
【００７５】
（滴下部１１の調製）
糖鎖分解酵素のマセロチームＲ−１０（商標）（ヤクルト薬品工業株式会社，Ｃａｔ．３７３−１）を１テスト当たり２．５μｇとなるように、濾紙パッドに塗布し、凍結乾燥させ、酵素添加滴下部濾紙パッドを作製した。
【００７６】
（検出装置の作製）
滴下部１１としての濾紙パッド、抗ＳＤＶモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド、抗ＳＤＶモノクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してＳＤＶの検出装置を作製した。
【００７７】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにＳＤＶに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにＳＤＶ感染樹の新梢を使用した。
【００７８】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これら新梢が０．１ｇとなるように添加した。手揉みで３０回程度磨砕後、未処理の濾過部１９を通して濾過したものを試料磨砕液とし、これを滴下することでイムノクロマトに供した。この時、濾過部１９には東洋濾紙株式会社ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用いた。
【００７９】
＜実施例２＞
（検出装置の作製）
実施例１における（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（検出装置の作製）までと同様に検出装置が作製されるが、（滴下部１１の調製）において、酵素を添加せず、未処理の滴下部濾紙パッドを使用し、検出装置を作製した。
【００８０】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにＳＤＶに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにＳＤＶ感染樹の新梢を使用した。
【００８１】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これら新梢が０．１ｇとなるように添加した。濾過部１９には実施例１と同様にＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用いた。
【００８２】
この濾紙に対し糖鎖分解酵素のマセロチームＲ−１０（商標）を１テスト当たり２．５μｇとなるように塗布し、凍結乾燥させたものを使用した。手揉みで３０回程度磨砕後、酵素を添加した濾過部１９を通して濾過したものを試料磨砕液とし、これを滴下することでイムノクロマトに供した。
【００８３】
＜比較例１＞
（検出装置の作製）
実施例１における、（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）までと同様に検出装置が作製されるが、（滴下部１１の調製）において、酵素を添加せず、未処理の滴下部濾紙パッドを使用し、検出装置を作製した。
【００８４】
（反応性試験）
実施例１、実施例２、比較例１ついて、調製したそれぞれの試料磨砕液１００μＬを作製したクロマトの滴下部に滴下し、反応性を確認した。反応性の確認は、滴下を行ってから１０分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
【００８５】
（結果の検討）
実施例１、２と比較例１による結果をまとめると次の通りである。
酵 素 試料摩砕液
有無 部位 正常樹（判定） 感染樹（判定）
実施例１ 有り 滴下部１１に塗布 発色無し(-) 陽性(+++)
実施例２ 有り 濾過部１９に塗布 発色無し(-) 陽性(+++)
比較例１ 無し − 緑色の偽陽性発色 陽性(+++)
なお、+++:強陽性、++,+:陽性、-:陰性
【００８６】
酵素を乾燥状態で滴下部１１に添加した実施例１、および濾過部１９に添加した実施例２では、正常樹において発色はなかった。一方、酵素を添加していない比較例１では緑色の線が生じ、偽陽性発色となった。このことから、酵素存在下において、植物体の色素由来の偽陽性発色を抑制することが確認できた。
【００８７】
＜実施例３＞
ＡＳＧＶ検出キットを使用し糖鎖分解酵素の種類と効果について確認した。
【００８８】
（検出装置の作製）
ここからＳＤＶの検出キットではなくＡＳＧＶの検出キットを使用し検討を行う。実施例１における、（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）までと同様に検出装置が作製されるが、抗ＳＤＶモノクローナル抗体の代わりに抗ＡＳＧＶモノクローナル抗体を使用し、ＡＳＧＶ検出装置を作製した。
【００８９】
モノクローナル抗体がＳＤＶとＡＳＧＶとで異なるだけで、抗体以外の部材、作製方法は両者同じである。また、（滴下部１１の調製）においてマセロチームＲ−１０（商標）添加の滴下部濾紙パッドに加え、ペクトリアーゼＹ−２３（商標）（協和化成株式会社）、セルラーゼ”オノズカ”Ｒ１０（商標）（ヤクルト薬品工業株式会社）を別個に加えた滴下部濾紙パッドを作製した。対照として、酵素を添加せず、未処理の滴下部塗布パッドも使用した。
【００９０】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにＡＳＧＶに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにＡＳＧＶ感染樹の新梢を使用した。
【００９１】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これら新梢が０．１ｇとなるように添加した。これを手揉みで３０回程度磨砕後、未処理のＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を使用した濾過部１９を通して濾過したものを試料磨砕液とし、これを滴下することでイムノクロマトに供した。
【００９２】
（反応性試験）
調製したそれぞれの試料磨砕液１００μＬを作製したクロマトの滴下部に滴下し、反応性を確認した。反応性の確認は、滴下を行ってから１０分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
【００９３】
（結果の検討）
酵素の種類 正常樹（判定） 感染樹（判定）
なし 緑色の偽陽性発色 陽性(+++)
マセロチームR-10 発色無し(-) 陽性(+++)
ペクトリアーゼY-23 発色無し(-) 陽性(+++)
セルラーゼR10 発色無し(-) 陽性(+++)
なお、+++:強陽性、++,+:陽性、-:陰性
【００９４】
マセロチームＲ−１０（商標）以外の糖鎖分解酵素であるペクトリアーゼＹ−２３（商標）、セルラーゼ”オノズカ”Ｒ−１０（商標）においても実施例１と同様に、偽発色を抑制する効果が認められた。
【００９５】
さらに、感染樹においては感度を向上させる効果も同じく認められた。これは、糖鎖分解酵素が検出キットに含有されていれば、種類によらず、偽発色を抑制でき、さらに感度を向上させられることを示唆するものである。
【００９６】
＜実施例４＞
ＡＳＧＶ検出キットを使用し、酵素の有無によって、滴下した試料磨砕液が検出装置を流れる速さの相違があること、さらに、流れる速さの違いにより感度に相違があることを実証した。
【００９７】
（検出装置の作製）
実施例１における、（抗ＳＤＶモノクローナル抗体の調製）から（検出装置の作製）までと同様かつ、実施例３の様にモノクローナル抗体をＳＤＶからＡＳＧＶに置き換えて検出装置が作製されるが、（滴下部１１の調製）において、滴下部１１へマセロチームＲ−１０（商標）を添加した滴下部濾紙パッドに加え、酵素未添加の滴下部濾紙パッドを使用したものを用い、それぞれ検出装置を作製した。
【００９８】
（イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製）
植物体の試料として磨砕時に粘性の低い果皮１と、粘性の高い果皮２および、果皮３を用いた。
【００９９】
磨砕容器の中に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液０．５ｍＬおよび、これらの果皮が０．１ｇとなるように添加した。手揉みで３０回程度磨砕後、未処理のＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を使用した濾過部１９を通して濾過した試料磨砕液を滴下することでイムノクロマトに供した。いずれの植物体もＡＳＧＶに感染していない正常樹より採取したものである。また、対照としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のみのものも使用した。
【０１００】
試料磨砕液の流れる速さを観測するのと同時に、陽性感度の観測もするために、この試料とは別のＡＳＧＶに保毒している感染樹から得られた植物試料０．１ｇを使用し、この植物試料に対しＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が０．５ｍＬの割合になるように調製したものを上述と同様に磨砕して、陽性の試料磨砕液を得た。
【０１０１】
この陽性の試料磨砕液を果皮１〜３の緩衝液および、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に１０％の割合で添加し、最終的にこれをイムノクロマトに供する試料磨砕液として用いた。
【０１０２】
（反応性試験）
調製した試料磨砕液１００μＬを作製したクロマトの滴下部に滴下し、標識区域１２、多孔質担体１３を流れながら経て、その滴下した試料磨砕液の最先端部が吸収部１６に到達するまでの時間を計測し、到達時間の違いを確認した。さらに、感度を確認するために、５分、１０分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
（結果の検討）
結果は、上記表の通りとなり、粘性の低い植物体においては、酵素の有無による相違は見られなかったが、粘性の高い果皮において、酵素を添加した検出装置では、酵素を添加していない検出装置と比べ、流れる時間を半分以下に短縮することが観測された。
【０１０５】
感度に関し、低粘性の試料磨砕液においては酵素の有無で感度は５分、１０分と相違は無いが、強粘性の試料磨砕液において、酵素を添加していない検出装置では、低粘性の試料磨砕液と比較し感度が低くなる現象が観測された。
【０１０６】
一方で、酵素を添加した検出装置では低粘性の試料磨砕液と比較して、感度の低下は認められず、従来の感度で観測することが可能であった。
【０１０７】
従来は強粘性の物質が流れるのに時間を要していたが、低粘性の試料磨砕液に比べ強粘性の試料磨砕液中に多く含有されている多糖類を酵素活性により分解することで、到達時間が低粘性の試料磨砕液と変わらなくなり、粘性が低くなることで、流速が上がり、その結果、検出区域１４に達する時間が速くなり、発色時間も短縮された。このことはイムノクロマトの特徴である迅速診断というメリットをさらに向上させるものである。
【０１０８】
今まで粘性が高くイムノクロマト上を流すことが困難な試料磨砕液を用いても、低粘性の試料磨砕液と同様にスムーズに流せるため、従来、粘性が高く、希釈することで粘度を下げ測定していた試料磨砕液でも、希釈の工程を経ずに直接検査することができ、手間を省け、さらに希釈による感度低下を招くことなく、本来の感度で検出可能となるというメリットが得られる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】（ａ）本発明の一実施の形態における検出装置の正面図、（ｂ）本発明の一実施の形態における検出装置の側面図
【図２】本発明の一実施の形態における磨砕容器の正面図
【図３】（ａ）〜（ｃ）本発明の糖類分解酵素が糖鎖及び多糖類を分解する過程を示す模式図及びその一部拡大図
【符号の説明】
【０１１０】
１１ 滴下部
１２ 標識区域
１３ 多孔質担体
１４ 検出区域
１５ 対照区域
１６ 吸液部
１７ 容器本体
１８ ノズルキャップ
１９ 濾過部
Ａ モノクローナル抗体
Ｂ 固相化されたモノクローナル抗体
Ｘ 病原体
Ｆ 流れ方向
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝液を内部に収納し、挿入される植物体を磨砕して試料摩砕液とするための磨砕容器と、
植物病原体を検出する検出装置とを備えるイムノクロマトキットであって、
前記検出装置は、
前記植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、
植物病原体に対して特異結合性を有する第１の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、
前記植物病原体に対して特異結合性を有する第２の抗体が固相化される検出区域と、
前記検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備え、
前記試料磨砕液の流動方向において前記摩砕容器内がイムノクロマトキットにおいて最も上流側であり、前記滴下部、前記標識区域及び前記検出区域が前記検出装置内において、前記流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設され、
糖鎖分解酵素が前記検出区域へ至り得るように乾燥状態で保持されていることを特徴とするイムノクロマトキット。
【請求項２】
前記糖鎖分解酵素が、前記検出装置内の前記検出区域より上流側に乾燥状態で保持されている請求項１記載のイムノクロマトキット。
【請求項３】
前記摩砕容器は、前記試料摩砕液が前記流動方向において接触する濾過部を更に備え、前記糖分解酵素は、前記濾過部に乾燥状態で保持されている請求項１記載のイムノクロマトキット。
【請求項４】
前記糖鎖分解酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクトリアーゼ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１から３のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
【請求項５】
前記試料磨砕液１０００重量部に対して前記糖鎖分解酵素は１乃至１００重量部含有されている請求項１から４のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
【請求項６】
前記植物病原体は、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）、カンキツモザイクウイルス（ＣｉＭＶ）及びリンゴステムグルービングウイルス（ＡＳＧＶ）の少なくとも一つである請求項１から５のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
【請求項７】
植物病原体を検出する検出装置であって、
前記植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、
植物病原体に対して特異結合性を有する第１の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、
前記植物病原体に対して特異結合性を有する第２の抗体が固相化される検出区域と、
前記検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備え、
前記試料磨砕液の流動方向において前記滴下部が最も上流側であり、前記滴下部、前記標識区域及び前記検出区域が前記検出装置内において、前記流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設され、
糖鎖分解酵素が前記検出区域よりも前記流動方向の上流側に乾燥状態で保持されていることを特徴とする検出装置。
【請求項８】
前記糖鎖分解酵素は、前記滴下部に乾燥状態で保持されていることを特徴とする請求項７記載の検出装置。
【請求項１】
緩衝液を内部に収納し、挿入される植物体を磨砕して試料摩砕液とするための磨砕容器と、
植物病原体を検出する検出装置とを備えるイムノクロマトキットであって、
前記検出装置は、
前記植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、
植物病原体に対して特異結合性を有する第１の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、
前記植物病原体に対して特異結合性を有する第２の抗体が固相化される検出区域と、
前記検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備え、
前記試料磨砕液の流動方向において前記摩砕容器内がイムノクロマトキットにおいて最も上流側であり、前記滴下部、前記標識区域及び前記検出区域が前記検出装置内において、前記流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設され、
糖鎖分解酵素が前記検出区域へ至り得るように乾燥状態で保持されていることを特徴とするイムノクロマトキット。
【請求項２】
前記糖鎖分解酵素が、前記検出装置内の前記検出区域より上流側に乾燥状態で保持されている請求項１記載のイムノクロマトキット。
【請求項３】
前記摩砕容器は、前記試料摩砕液が前記流動方向において接触する濾過部を更に備え、前記糖分解酵素は、前記濾過部に乾燥状態で保持されている請求項１記載のイムノクロマトキット。
【請求項４】
前記糖鎖分解酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクトリアーゼ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１から３のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
【請求項５】
前記試料磨砕液１０００重量部に対して前記糖鎖分解酵素は１乃至１００重量部含有されている請求項１から４のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
【請求項６】
前記植物病原体は、温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）、カンキツモザイクウイルス（ＣｉＭＶ）及びリンゴステムグルービングウイルス（ＡＳＧＶ）の少なくとも一つである請求項１から５のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
【請求項７】
植物病原体を検出する検出装置であって、
前記植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、
植物病原体に対して特異結合性を有する第１の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、
前記植物病原体に対して特異結合性を有する第２の抗体が固相化される検出区域と、
前記検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備え、
前記試料磨砕液の流動方向において前記滴下部が最も上流側であり、前記滴下部、前記標識区域及び前記検出区域が前記検出装置内において、前記流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設され、
糖鎖分解酵素が前記検出区域よりも前記流動方向の上流側に乾燥状態で保持されていることを特徴とする検出装置。
【請求項８】
前記糖鎖分解酵素は、前記滴下部に乾燥状態で保持されていることを特徴とする請求項７記載の検出装置。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２０７９４４（Ｐ２０１２−２０７９４４Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７１９１０（Ｐ２０１１−７１９１０）
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【出願人】（５９８０３４７２０）株式会社ミズホメディー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【出願人】（５９８０３４７２０）株式会社ミズホメディー (17)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]