イメージ内のウィルス顆粒を集計及び区分する方法
イメージ内のウィルス顆粒の細胞内の集計及び区分をする方法である。イメージは、その中に多数の対象物を有するものを提供する。ウィルス顆粒の半径範囲を特定する。所定の半径範囲内にある半径を有する、イメージ内の円形のアイテムを同定する。所定の半径範囲から形成し得る楕円形のアイテムが同定される。同定された円形及び楕円形のアイテムをグループに振り分ける。円形及び楕円形のアイテムにおけるウィルス顆粒が同定される。例えば、かかる方法は、ＴＥＭイメージ内における、ｓｉＲＮＡ処理を施した人間のサイトメガロウィルス顆粒の細胞内における集計及び区分に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、電子顕微鏡イメージ等のイメージとして表されたウィルス顆粒等の対象物の集計、区分及び同定に関するものである。
【０００２】
これまで、ウィルス及びその他の成分を含んだ細胞の構造を分類し分析するために多くの努力が払われてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
利用可能なイメージ技術を用いて、ウィルスを描写、区分及び分類するための多様なイメージ分析方法が開発されてきた。例えば、低温電子顕微鏡観察が用いられてきたが、細胞の構造及びウィルス顆粒を充分に示すものではなかった。また、細胞成分を、対象物として、再現性を有し、信頼性を有するように表し、細胞成分の成熟ステージを正確に同定することは困難であった。
【０００４】
とりわけ、ウィルス集合は複雑な過程であり、徹底した研究の課題となっている。ウィルスは宿主細胞を利用して、成熟及び細胞内輸送の複雑な過程を経て、その子孫であるウィルス顆粒を生産する。電子顕微鏡（ＥＭ）を用いて、この過程を高倍率にてモニタリングし、異なる細胞内区分にて、異なる型のウィルス顆粒を同定することが可能となっている。未だ、未解決である重要な問題は、それらウィルス集合過程の夫々のステップ、並びに、ウィルスの成熟過程における異なる型のウィルス顆粒の細胞内輸送及び局在に関するウィルスタンパク質を識別することにある。トモグラフィーや低温ＥＭなどの可視化技術がウィルス構造の利用可能な情報の提供に貢献してきたが、一般に、ウィルス成熟を構造的な観点から取り扱うことは困難である。これら技術は、安定的で成熟したウィルス顆粒の情報を提供するものである。また、鍵となるウィルスタンパク質成分の変異体を生産するために遺伝的手段が利用可能である。ＥＭは、構造に与える影響を可視化するために使用することができる。しかし、構造的な影響、特には、中間的で不明瞭な顆粒の形態を特徴付け、それらを客観的な方法により適切に定量化するための適切な手段が未だに無い。
【０００５】
このことは、過去の分析方法が充分に効果を奏するものではなく、細胞及びウィルス顆粒の構造をより効果的な方法の需要があることの理由付けを部分的に説明するものである。また、異なるウィルス集合の客観性のある研究を促進すべく、ウィルス顆粒の成熟及び細胞内輸送を特徴付けて定量化する、イメージ分析手段の需要もある。更に、イメージ内に示されたウィルス顆粒を同定し、定量化する効果的な方法の需要もある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明の方法は、上記に概略を説明した問題の解決策を提供するものである。かかる方法は、電子顕微鏡イメージなどのイメージ内にあるウィルス顆粒の細胞内集計及び区分に用いることができる。提供されるイメージは、多数の対象物／アイテムを含むものである。イメージ内の全ての円形及び楕円形の対象物が同定される。そして、円形及び楕円形の対象物は、グループに振り分けられる。円形のウィルス顆粒の半径密度プロファイルが特定される。また、円形のウィルス顆粒の半径密度プロファイルから得られる楕円形のアイテムについても特定される。ウィルス顆粒は、選択されたグループの対象物の半径密度プロファイルを分析することにより、振り分けられた円形及び楕円形の対象物のグループから特定される。かかる方法は、ＴＥＭイメージ内における、ｓｉＲＮＡ処理を施した、人間のサイトメガロウィルス顆粒の細胞内における集計及び区分に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ａは、回転不変量イメージを示した例の概略図であり、Ｂは、角度不変量イメージを示した例の概略図である。
【図２】５セットのイメージの濃度測定の図である。
【図３】ＬＶＳ内に配置された全てのイメージのセットの半径密度プロファイルの概略図である。
【図４】標準偏差を平均の周囲にて点線にて示した、サブセットＡに関する平均半径プロファイルの概略図である。
【図５】標準偏差を平均の周囲にて点線にて示した、サブセットＢに関する平均半径プロファイルの概略図である。
【図６】半径３０〜４０ｎｍ間を示した図５の拡大図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明の方法は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）のイメージに表示された対象物などといった、イメージ内の顆粒／対象物を調査、区分け及び同定することに使用し得る。イメージ内にて同定された対象物は、円形又は楕円形を有するウィルス顆粒及びその他の顆粒に関するものである。楕円形は、完全な円形が１つの半径を有するのに対し、最大半径及び最小半径を有するものとして定義される。好適には、該方法は、分析対象のウィルス顆粒の半径範囲から、如何なる楕円形状のアイテムが形成され得るかを特定するものである。例えば、ウィルス顆粒が１００ユニットの半径を有する場合、楕円形の最大半径及び最小半径は、例えば、ウィルス顆粒が円形のときのウィルス顆粒の半径よりも、２０％大きく（すなわち１２０ユニット）、また、２０％小さい（すなわち８０ユニット）。最大半径又は最小半径が、許容半径の範囲外にある場合には、そのアイテムは許容されずに、ウィルス顆粒としては同定されない。円形及び楕円形のものは、振り分けられ、類似の半径範囲のものを同一のグループとしてグループ化する。次いで、ウィルス顆粒は、アイテムのグループ化された形状において、同定、定量される。また、２つの異なる成熟ステージ、すなわち、２つの異なる成熟グループ間の成熟ステージにあるウィルス顆粒を同定することも可能である。ウィルス顆粒は、所定の半径密度プロファイルを有することから、フーリエ変換などの数学的方程式を使用して、ウィルス顆粒に典型的な所定の半径密度プロファイルに基づき、どの楕円形の対象物がウィルス顆粒であるかを特定することができる。また、損傷を受けたウィルス顆粒や、２つの異なる成熟ステージ間にあるウィルス顆粒は、パンフレットを使用してもみつけられないことから、特定の成熟ステージにあるウィルス顆粒の半径密度プロファイルを示すパンフレットを使用する必要が無いことが好ましい。
【０００９】
また、図３に示し、以下に詳細に説明するように、クラスター状の半径範囲又は半径密度プロファイルの分布を特定することも可能である。また、以下に記載にされているように、ウィルス顆粒を薬剤などの化学物質に曝露し、次いで、修正されたイメージに基づき、この発明に従う方法を再度実施し、化学物質又は薬剤処理に曝露した後に、顆粒の寸法又は半径密度プロファイルの分布がどのように変化したかを特定することができる。この方法により、ウィルス顆粒に対する化学物質処理による効果を特定することができる。
【００１０】
更に、ｐｐ１５０タンパク質をターゲットとし、ｃｍｖ顆粒の生産をブロックするなどといった、特定の構築要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）をブロックするｓｉＲＮＡ技術を使用することも可能である。そのようなｓｉＲＮＡ処理の後、ウィルス顆粒への影響と、ウィルス顆粒の形態的／構造的な変化を分析することができる。また、影響を受けたウィルス顆粒の量的な数値を調査することができる。
【００１１】
更にまた、半径密度プロファイルを分析してウィルス顆粒を同定するこの発明に従う方法を使用して、どのようなウィルス顆粒がイメージ内に表示されているかを判別することも可能である。イメージ内の全ての円形及び楕円形の対象物を見つけ、対象物をグループに振り分けた後に、次のステップでは、特定のウィルス顆粒の半径の特徴を同定する。８０±３ユニットの半径範囲内などといった、ウィルス顆粒の所定の半径範囲内にある半径の特徴を有する全ての対象物のクラスターは、ウィルスを同定するために使用し得る。半径特性の範囲を使用すると、変形した又は楕円の顆粒が含まれることとなる。この許容可能な範囲外にある半径範囲を有する顆粒は、放棄され、ウィルス顆粒ではないものとしてカテゴライズされる。また、所望の半径範囲内に複数種のウィルス顆粒が存在する場合には、ウィルス顆粒を薬剤又は化学物質により処理してから、再度この方法を実施して、ウィルス顆粒が該処理に対しどのように反応するかを特定することができる。この反応に基づき、ウィルス顆粒が何であるのかを同定することができる。例えば、ＰＣＲ技術等を使用し、ＤＮＡを増幅して、ウィルス顆粒を同定することに使用し得る参考パンフレットを作成することができる。このように、付加的な試験を使用して、同定されたウィルス顆粒を検証又は確認することができる。
【００１２】
このように、この発明に従う方法は、以下に詳細に説明するように、ＴＥＭイメージ内のウィルス顆粒を調査し、振り分け、同定することができる。ウィルス顆粒のカプシドは、中心からの半径が固定されており、同一のタンパク質濃度を有する略円形の対象物であることから、回転不変対象物と呼ばれ、図１Ａに最も良く示されている。回転不変量の基準値を得るために、対応して回転不変量を測定するための「反対」の特性が必要となる。このため、同一のタンパク質密度を有し、中心から固定された角度にある、角度不変量対象物を使用することができ、これは図１Ｂに最も良く示されている。
【００１３】
対応するフーリエ周波数（ｗｒ）を導く、中心からの半径ｒ、及び、対応するフーリエ周波数（ｗｔ）を導く、中心からの任意の固定された方向にある角度（ｔ）により特定される、関数（ｆ）のフーリエスペクトルの値は、回転不変対象物及び角度不変対象物を図示するために使用することができる。完全な回転不変量関数は、エネルギーをｗｔ＝０に有し、完全なる角度不変関数は、エネルギーをｗｒ＝０に有し、その間の全ての対象物は両周波数帯域にエネルギーを有する。このように、合理的で好適な測定は、これらエネルギーの差異を比較し、ネガティブコントロールとして与えられる、唯一の未知の定数として測定値の閾値を有する推測的な測定をすることにある。
【００１４】
ＴＥＭイメージ内のウィルス構造の密度測定を以下に示す。異なるイメージ間におけるウィルス顆粒の個数を比較する密度測定は、イメージの面積ユニットＡ当りのイメージ内の特定の個数（ｎ）として取り込まれる。
ｄ＝ｎ/Ａ
【００１５】
異なるウィルス顆粒の区分けを以下に示す。発見された対象物すなわちアイテム／顆粒の夫々の半径密度プロファイルは、ウィルス顆粒の好適な近似値を提供するものである。かかるプロファイルを、該プロファイルの慣性主軸を基軸にセットするように、線形ベクトル空間（ＬＶＳ）にセットし、特異値分解（ＳＶＤ）を算出し、異なるウィルス構造のクラスターの挙動について映像的な解釈が得られる。この情報により、異なるクラスターを抽出し、個々を集計することができ、薬剤を添加した場合に、イメージの夫々のセットから、平均的な構造を算出して、構造的な違いを識別することが可能となる。
【００１６】
以下の表１に示すように、４種の異なるｓｉＲＮＡを添加した感染細胞について、約５００ＭＢのイメージが３．３ｎｍ／ピクセルの解像度にて電子顕微鏡により得られた。イメージは回転不変性測定法により処理された。回転不変量のコントロール半径は、１５ピクセル（約５０ｎｍ）に設定され、イメージ内の対象物は、半径不変量測定値が１５のレベルで超過し、１５ピクセルの局所半径最大値にて得られる。半径密度プロファイルが得られると、異なるイメージ間における異なる照度レベルを補正するために、夫々のプロファイルの平均が取り除かれる。平均は、１００ピクセルの半径にて得られ、約３３０ｎｍである。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表２は、平均値及び算出された密度の平均値の標準偏差を示したものである。スチューデントのＴ検定により、ポジティブコントロールと、ｐｐ１５０とＭＣＰのイメージの結果を比較すると、７，２１＊１０−１３及び２，１９＊１０−１１のＰ値が夫々得られ、同一の平均の分布から密度がなるとの仮説を覆すものである。
【００１９】
【表２】
【００２０】
図２は、１標準偏差を有する、５セットのイメージ（ポジティブコントロール、ＭＣＰ、ｇＢ、ＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０及びｐｐ１５０）の密度測定値を示したものである。ＭＣＰ及びｐｐ１５０ポジティブコントロールよりも顕著に小さな密度を示した。
【００２１】
ウィルス顆粒の区分けを以下に示す。図３にて最も適切に示されるように、半径密度プロファイルはＬＶＳ内にてプロットされ、２つの最大の慣性主軸からの情報を示す。図３は、ＬＶＳ内に配された全てのセットのイメージの半径密度プロファイルを示す。イメージは、以下に更に詳細に示すように、Ａ及びＢとして示される２つの充分に分離されたクラスターを示す。二つのクラスター間にある顆粒の重要な特性も示されている。例えば、それらの顆粒は、クラスターにより示される成熟ステージ間にある成熟ステージにある。また、薬剤の効果を特定することができることから、ウィルス顆粒が薬剤に曝露された際に、クラスター間にある顆粒又は顆粒のグループを調査することは特に重要である。
【００２２】
図４には、クラスターＡの夫々のセット（ポジティブコントロール、ＭＣＰ、ｐｐ１５０、ｇＢ及びＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０）の平均半径密度プロファイルが示されている。このことは、従来から知られているＨＣＭＶ成熟中間産物のＡ（空のウィルス殻）分類を表している。この種の見つかった対象物の数が少なく、対象物の半径及び角度エネルギーが小さく、また、多数のその他の非ウィルス構造が存在することから、中心から約４０μｍに配されたカプシド壁に関する情報以外の情報は抽出されない。
【００２３】
図５には、クラスターＢの夫々のセット（ポジティブコントロール、ＭＣＰ、ｐｐ１５０、ｇＢ及びＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０）の平均半径密度プロファイルが示されている。このことは、従来から知られているＨＣＭＶ成熟中間産物のＢ（半透明のコアを有するカプシド）及びＣ（密なコアを有する成熟したカプシド）の分類を表している。図６の拡大図にて最も適切に示されているように、中心おいにおいて、ポジティブコントロール及びｇＢのセットは、ＭＣＰ、ｐｐ１５０及びＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０のセットとは、半径が３０〜４０ｎｍ異なる。
【００２４】
その結果、ＴＥＭイメージ内にあるウィルス顆粒のモデルが発展した。回転不変量特性を比較するための測定法に、角度不変両特性を利用することは、回転不変量対象物及び全エネルギーにより表される関数エネルギーのフラクションに置き換えることができる。しかし、全エネルギーが小さい場合には、フラクションは数値を算出するに不安的となる。
【００２５】
このことを解消するために、閾値のレベルが使用される。設定された閾値レベルを使用すると、主観性の源となってしまう。しかし、このレベルでは、誤って計測される数が大変少ない。しかし、ネガティブコントロールのグループを閾値の設定に使用して、ｓｉＲＮＡ分子の影響を調べることができる。
【００２６】
慣性主軸を含む密度プロファイルの如何なる正規変形であっても、Ｌ２−ＬＶＳ内の距離及び内部産物を保持している。そのことから、異なるサブ構造のクラスターは、基礎となる選択から独立している。
【実施例】
【００２７】
使用に供した実施例の材料と方法を以下に示す。ヒト胚肺繊維芽細胞（ＨＦ）は、Ｈａｎｋ’ｓ塩（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）が、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ[４-（２ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸] 、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製、グランドアイランド、ニューヨーク、米国）を含む、重炭酸塩フリーの最小の基本的媒質において維持されている。かかる細胞は、１７５ｃｍ２組織培養フラスコ（コーニング社製、ニューヨーク、米国）で培養され、１７回継代されるまで使用された。また、細胞は、１の感染多重度（ＭＯＩ）にて、ＨＣＭＶに感染させた。ウイルスの上澄液は、感染後（ｐｉ）、７又は１０日後に集められた。次いで、ウイルスの上澄液は、細胞片から低速走行速度遠心分離によって綺麗にされ、使用に供されるまで−７０℃にて保存された。９６穴プレートまたはチャンバスライド上にて培養した単層のＨＦ細胞は、１の感染多重度（ＭＯＩ）にて、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９に感染させた。
【００２８】
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、カルフォルニア、米国から得た。かかる細胞は、成長因子を有するＥＢＭ-２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製、カリフォルニア、米国）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件にて維持された。感染の１時間前に、培地は、５％のウシ胎仔血清を有するＥＢＭに取り替えられ、感染プロセスの間、この培地で培養された。細胞は、０．２％ゼラチンにより被覆された１７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ファルコン社製）又は８ウェル・チャンバスライド（ナルゲヌンクインターナショナル社製）を用いて培養され、第８の継代まで実験に使用された。ヒト臍の静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＥＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製、カリフォルニア、米国）で培養された。感染の１時間前に、培地は、５％のウシ胎仔血清を有するＥＢＭに取り替えられ、感染プロセスの間、この培地で培養された。細胞は、１７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ファルコン社製）又は８ウェル・チャンバスライド（ナルゲヌンクインターナショナル社製）を用いて培養され、第８の継代まで実験に使用された。細胞は、１のＭＯＩにて内皮細胞性適合株であるＴＢ４０により感染させた。
【００２９】
平滑筋細胞は、大動脈の移植片の挿入をする大動脈瘤の外科手術を受けている患者から、或いは、移植提供者の腸骨血管の大動脈の移植片又は移植から得られた大動脈の移植片から単離された。細胞は、鋭利器具で細胞をひっかいて、最初に内皮細胞を取り除くことによって単離された。次いで、血管は、一対のピンセットを用いて２枚の層へと穏やかに分離することによって、２つの異なる層、すなわち、最内層（血管の内膜に対応する）及び最外層（血管中膜に対応する）へと分けられた。大動脈の移植片は、小さな１ｍｍの断片に分割され、ＳｍＧＭ−２ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔｅｓ（ｈＥＧＦ ０．５μｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ; インシュリン５ｍｇ／ｍｌ、０.５ｍｌ； ｈＦＧＦ−ｂ １μｇ／ｍｌ、１ｍｌ；ＦＢＳ、２５ｍｌ； ＧＡ−１０００、０．５ｍｌ）が添加されたＳＭＧＭ２培地内の細胞ペトリ皿上にて、外植片からのＳＭＣ細胞移行が発生するまで、約２週間培養された。細胞は、１７５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（ファルコン社製）にて培養された。ＳＭＣ培養組織の純度を決定するために、細胞は、３％ホルムアルデヒドでチャンバスライドにより４℃で４５分間固定され、０．３％トリトンＸによって５分間透明化に供された。固定後、細胞は、平滑筋細胞特異的なＦＩＴＣ複合抗アクチン（ＳＩＧＭＡ社製）により染色され、蛍光顕微鏡により評価した。細胞はメタノール：アセトン（１：１）により４℃で５分間固定され、ＦＩＴＣ複合抗フォン−ウィルブランド因子（抗ｖＷＦ）及び内皮細胞特異的フォン−ウィルブランド因子によって染色され、蛍光顕微鏡により評価された。抗体のアイソタイプのコントロールが、実験にて使用された。培養組織は、抗ａ−ａｃｔｉｎに１００％陽性であり、フォン−ウィルブランド因子に陰性であった。
【００３０】
電子顕微鏡法によってウィルス感染細胞を検査するために、感染してない及びＨＣＭＶ感染している、（１のＭＯＩ）細胞が、３、５、７及び１０ｄｐｉにて集められ、０．１Ｍスクロース及び３ｍＭＣａＣｌ２（ｐＨ ７．４）を含む１Ｍ塩化カコジル緩衝液中の２％グルタルアルデヒドにて、ｐＨ７．４、室温にて３０分間固定された。細胞は、木製の棒によりかきとられ、エッペンドルフチューブに移され、更に、冷蔵庫内にて一晩固定された。細胞を固定した後、ｐＨ７．４、３ｍＭのＣａＣｌ２を含む０．１５Ｍの塩化カコジル緩衝液によりリンスされ、遠心される。次いで、得られたペレットは、ｐＨ７．４、１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含んでいる０．０７Ｍの塩化カコジル緩衝液中の２％四酸化オスミウムにより、４℃で２時間事後的に固定され、エタノールついでアセトンにより脱水され、ＬＸ-１１２（ラッド社製、バーリントン、ヴァーモント、米国）に埋め込まれる。切片標本は、クエン酸鉛、次いで、酢酸ウラニルと比較され、８０ｋＶにてＴｅｃｎａｉ １０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ社製、オランダ）によって検討された。デジタルイメージは、ＭｅｇａＶｉｅｗＩＩデジタルカメラ（ソフトイメージングシステムゲーエムベーハー社製、マンスター、独国）によりキャプチャされる。
【００３１】
電子顕微鏡写真の処理を以下に説明する。切片標本は、クエン酸鉛、次いで、酢酸ウラニルと比較され、８０ｋＶにてＴｅｃｎａｉ １０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ社製、オランダ）によって検討された。デジタルイメージは、ＭｅｇａＶｉｅｗＩＩデジタルカメラ（ソフトイメージングシステムゲーエムベーハー社製、マンスター、独国）によりキャプチャされる、又は、デジタル化のために、電子顕微鏡写真がキャプチャ、展開、及びスキャンされる。顕微鏡写真は、ＨＰ社のＳｃａｎＪｅｔ ６２００Ｃ ｆｌａｔｂｅｄスキャナにより、ピクセルサイズが２×２ｎｍｍ又は３×３ｎｍの、８ビットイメージにデジタル化され、カプシドの半径を夫々２５又は１７ピクセルにてデジタル化した顕微鏡写真を提供する。夫々のデジタルイメージは、凡そ１０００×１０００ピクセル（１メガバイト）の寸法を有する。解像度は、ここに調査された３種のカプシドのクラスを判別するに充分であるが、非常にきめ細かいバックグラウンドがカプシドの同定作業を困難としている。Ｈｐ者のＴｒｕ４ ＵＮＩＸ（登録商標）を動かしているＤＥＣ ａｌｐｈａ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ４３３は、この発明に従う方法の開発及び評価に使用された。実施及び試験はＭａｔｌａｂ ７．０．１ (ザマスワーク（ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ， Ｉｎｃ）社製、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ)を使用して行われた。得られたグレーレベルプロファイル図は、ＣｏｒａｌＤｒａｗ１０（Ｃｏｒｅｌ社製、オタワ、カナダ）及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ（アドビシステムズ社製、サンノゼ、カルフォルニア、米国）により処理された。
【００３２】
この発明は好適な組成及び実施形態にて説明されているが、特許請求の範囲に記載のこの発明の範囲内であれば、その他の置き換え及び変更が可能であることには留意されたい。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、電子顕微鏡イメージ等のイメージとして表されたウィルス顆粒等の対象物の集計、区分及び同定に関するものである。
【０００２】
これまで、ウィルス及びその他の成分を含んだ細胞の構造を分類し分析するために多くの努力が払われてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
利用可能なイメージ技術を用いて、ウィルスを描写、区分及び分類するための多様なイメージ分析方法が開発されてきた。例えば、低温電子顕微鏡観察が用いられてきたが、細胞の構造及びウィルス顆粒を充分に示すものではなかった。また、細胞成分を、対象物として、再現性を有し、信頼性を有するように表し、細胞成分の成熟ステージを正確に同定することは困難であった。
【０００４】
とりわけ、ウィルス集合は複雑な過程であり、徹底した研究の課題となっている。ウィルスは宿主細胞を利用して、成熟及び細胞内輸送の複雑な過程を経て、その子孫であるウィルス顆粒を生産する。電子顕微鏡（ＥＭ）を用いて、この過程を高倍率にてモニタリングし、異なる細胞内区分にて、異なる型のウィルス顆粒を同定することが可能となっている。未だ、未解決である重要な問題は、それらウィルス集合過程の夫々のステップ、並びに、ウィルスの成熟過程における異なる型のウィルス顆粒の細胞内輸送及び局在に関するウィルスタンパク質を識別することにある。トモグラフィーや低温ＥＭなどの可視化技術がウィルス構造の利用可能な情報の提供に貢献してきたが、一般に、ウィルス成熟を構造的な観点から取り扱うことは困難である。これら技術は、安定的で成熟したウィルス顆粒の情報を提供するものである。また、鍵となるウィルスタンパク質成分の変異体を生産するために遺伝的手段が利用可能である。ＥＭは、構造に与える影響を可視化するために使用することができる。しかし、構造的な影響、特には、中間的で不明瞭な顆粒の形態を特徴付け、それらを客観的な方法により適切に定量化するための適切な手段が未だに無い。
【０００５】
このことは、過去の分析方法が充分に効果を奏するものではなく、細胞及びウィルス顆粒の構造をより効果的な方法の需要があることの理由付けを部分的に説明するものである。また、異なるウィルス集合の客観性のある研究を促進すべく、ウィルス顆粒の成熟及び細胞内輸送を特徴付けて定量化する、イメージ分析手段の需要もある。更に、イメージ内に示されたウィルス顆粒を同定し、定量化する効果的な方法の需要もある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明の方法は、上記に概略を説明した問題の解決策を提供するものである。かかる方法は、電子顕微鏡イメージなどのイメージ内にあるウィルス顆粒の細胞内集計及び区分に用いることができる。提供されるイメージは、多数の対象物／アイテムを含むものである。イメージ内の全ての円形及び楕円形の対象物が同定される。そして、円形及び楕円形の対象物は、グループに振り分けられる。円形のウィルス顆粒の半径密度プロファイルが特定される。また、円形のウィルス顆粒の半径密度プロファイルから得られる楕円形のアイテムについても特定される。ウィルス顆粒は、選択されたグループの対象物の半径密度プロファイルを分析することにより、振り分けられた円形及び楕円形の対象物のグループから特定される。かかる方法は、ＴＥＭイメージ内における、ｓｉＲＮＡ処理を施した、人間のサイトメガロウィルス顆粒の細胞内における集計及び区分に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ａは、回転不変量イメージを示した例の概略図であり、Ｂは、角度不変量イメージを示した例の概略図である。
【図２】５セットのイメージの濃度測定の図である。
【図３】ＬＶＳ内に配置された全てのイメージのセットの半径密度プロファイルの概略図である。
【図４】標準偏差を平均の周囲にて点線にて示した、サブセットＡに関する平均半径プロファイルの概略図である。
【図５】標準偏差を平均の周囲にて点線にて示した、サブセットＢに関する平均半径プロファイルの概略図である。
【図６】半径３０〜４０ｎｍ間を示した図５の拡大図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明の方法は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）のイメージに表示された対象物などといった、イメージ内の顆粒／対象物を調査、区分け及び同定することに使用し得る。イメージ内にて同定された対象物は、円形又は楕円形を有するウィルス顆粒及びその他の顆粒に関するものである。楕円形は、完全な円形が１つの半径を有するのに対し、最大半径及び最小半径を有するものとして定義される。好適には、該方法は、分析対象のウィルス顆粒の半径範囲から、如何なる楕円形状のアイテムが形成され得るかを特定するものである。例えば、ウィルス顆粒が１００ユニットの半径を有する場合、楕円形の最大半径及び最小半径は、例えば、ウィルス顆粒が円形のときのウィルス顆粒の半径よりも、２０％大きく（すなわち１２０ユニット）、また、２０％小さい（すなわち８０ユニット）。最大半径又は最小半径が、許容半径の範囲外にある場合には、そのアイテムは許容されずに、ウィルス顆粒としては同定されない。円形及び楕円形のものは、振り分けられ、類似の半径範囲のものを同一のグループとしてグループ化する。次いで、ウィルス顆粒は、アイテムのグループ化された形状において、同定、定量される。また、２つの異なる成熟ステージ、すなわち、２つの異なる成熟グループ間の成熟ステージにあるウィルス顆粒を同定することも可能である。ウィルス顆粒は、所定の半径密度プロファイルを有することから、フーリエ変換などの数学的方程式を使用して、ウィルス顆粒に典型的な所定の半径密度プロファイルに基づき、どの楕円形の対象物がウィルス顆粒であるかを特定することができる。また、損傷を受けたウィルス顆粒や、２つの異なる成熟ステージ間にあるウィルス顆粒は、パンフレットを使用してもみつけられないことから、特定の成熟ステージにあるウィルス顆粒の半径密度プロファイルを示すパンフレットを使用する必要が無いことが好ましい。
【０００９】
また、図３に示し、以下に詳細に説明するように、クラスター状の半径範囲又は半径密度プロファイルの分布を特定することも可能である。また、以下に記載にされているように、ウィルス顆粒を薬剤などの化学物質に曝露し、次いで、修正されたイメージに基づき、この発明に従う方法を再度実施し、化学物質又は薬剤処理に曝露した後に、顆粒の寸法又は半径密度プロファイルの分布がどのように変化したかを特定することができる。この方法により、ウィルス顆粒に対する化学物質処理による効果を特定することができる。
【００１０】
更に、ｐｐ１５０タンパク質をターゲットとし、ｃｍｖ顆粒の生産をブロックするなどといった、特定の構築要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）をブロックするｓｉＲＮＡ技術を使用することも可能である。そのようなｓｉＲＮＡ処理の後、ウィルス顆粒への影響と、ウィルス顆粒の形態的／構造的な変化を分析することができる。また、影響を受けたウィルス顆粒の量的な数値を調査することができる。
【００１１】
更にまた、半径密度プロファイルを分析してウィルス顆粒を同定するこの発明に従う方法を使用して、どのようなウィルス顆粒がイメージ内に表示されているかを判別することも可能である。イメージ内の全ての円形及び楕円形の対象物を見つけ、対象物をグループに振り分けた後に、次のステップでは、特定のウィルス顆粒の半径の特徴を同定する。８０±３ユニットの半径範囲内などといった、ウィルス顆粒の所定の半径範囲内にある半径の特徴を有する全ての対象物のクラスターは、ウィルスを同定するために使用し得る。半径特性の範囲を使用すると、変形した又は楕円の顆粒が含まれることとなる。この許容可能な範囲外にある半径範囲を有する顆粒は、放棄され、ウィルス顆粒ではないものとしてカテゴライズされる。また、所望の半径範囲内に複数種のウィルス顆粒が存在する場合には、ウィルス顆粒を薬剤又は化学物質により処理してから、再度この方法を実施して、ウィルス顆粒が該処理に対しどのように反応するかを特定することができる。この反応に基づき、ウィルス顆粒が何であるのかを同定することができる。例えば、ＰＣＲ技術等を使用し、ＤＮＡを増幅して、ウィルス顆粒を同定することに使用し得る参考パンフレットを作成することができる。このように、付加的な試験を使用して、同定されたウィルス顆粒を検証又は確認することができる。
【００１２】
このように、この発明に従う方法は、以下に詳細に説明するように、ＴＥＭイメージ内のウィルス顆粒を調査し、振り分け、同定することができる。ウィルス顆粒のカプシドは、中心からの半径が固定されており、同一のタンパク質濃度を有する略円形の対象物であることから、回転不変対象物と呼ばれ、図１Ａに最も良く示されている。回転不変量の基準値を得るために、対応して回転不変量を測定するための「反対」の特性が必要となる。このため、同一のタンパク質密度を有し、中心から固定された角度にある、角度不変量対象物を使用することができ、これは図１Ｂに最も良く示されている。
【００１３】
対応するフーリエ周波数（ｗｒ）を導く、中心からの半径ｒ、及び、対応するフーリエ周波数（ｗｔ）を導く、中心からの任意の固定された方向にある角度（ｔ）により特定される、関数（ｆ）のフーリエスペクトルの値は、回転不変対象物及び角度不変対象物を図示するために使用することができる。完全な回転不変量関数は、エネルギーをｗｔ＝０に有し、完全なる角度不変関数は、エネルギーをｗｒ＝０に有し、その間の全ての対象物は両周波数帯域にエネルギーを有する。このように、合理的で好適な測定は、これらエネルギーの差異を比較し、ネガティブコントロールとして与えられる、唯一の未知の定数として測定値の閾値を有する推測的な測定をすることにある。
【００１４】
ＴＥＭイメージ内のウィルス構造の密度測定を以下に示す。異なるイメージ間におけるウィルス顆粒の個数を比較する密度測定は、イメージの面積ユニットＡ当りのイメージ内の特定の個数（ｎ）として取り込まれる。
ｄ＝ｎ/Ａ
【００１５】
異なるウィルス顆粒の区分けを以下に示す。発見された対象物すなわちアイテム／顆粒の夫々の半径密度プロファイルは、ウィルス顆粒の好適な近似値を提供するものである。かかるプロファイルを、該プロファイルの慣性主軸を基軸にセットするように、線形ベクトル空間（ＬＶＳ）にセットし、特異値分解（ＳＶＤ）を算出し、異なるウィルス構造のクラスターの挙動について映像的な解釈が得られる。この情報により、異なるクラスターを抽出し、個々を集計することができ、薬剤を添加した場合に、イメージの夫々のセットから、平均的な構造を算出して、構造的な違いを識別することが可能となる。
【００１６】
以下の表１に示すように、４種の異なるｓｉＲＮＡを添加した感染細胞について、約５００ＭＢのイメージが３．３ｎｍ／ピクセルの解像度にて電子顕微鏡により得られた。イメージは回転不変性測定法により処理された。回転不変量のコントロール半径は、１５ピクセル（約５０ｎｍ）に設定され、イメージ内の対象物は、半径不変量測定値が１５のレベルで超過し、１５ピクセルの局所半径最大値にて得られる。半径密度プロファイルが得られると、異なるイメージ間における異なる照度レベルを補正するために、夫々のプロファイルの平均が取り除かれる。平均は、１００ピクセルの半径にて得られ、約３３０ｎｍである。
【００１７】
【表１】
【００１８】
表２は、平均値及び算出された密度の平均値の標準偏差を示したものである。スチューデントのＴ検定により、ポジティブコントロールと、ｐｐ１５０とＭＣＰのイメージの結果を比較すると、７，２１＊１０−１３及び２，１９＊１０−１１のＰ値が夫々得られ、同一の平均の分布から密度がなるとの仮説を覆すものである。
【００１９】
【表２】
【００２０】
図２は、１標準偏差を有する、５セットのイメージ（ポジティブコントロール、ＭＣＰ、ｇＢ、ＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０及びｐｐ１５０）の密度測定値を示したものである。ＭＣＰ及びｐｐ１５０ポジティブコントロールよりも顕著に小さな密度を示した。
【００２１】
ウィルス顆粒の区分けを以下に示す。図３にて最も適切に示されるように、半径密度プロファイルはＬＶＳ内にてプロットされ、２つの最大の慣性主軸からの情報を示す。図３は、ＬＶＳ内に配された全てのセットのイメージの半径密度プロファイルを示す。イメージは、以下に更に詳細に示すように、Ａ及びＢとして示される２つの充分に分離されたクラスターを示す。二つのクラスター間にある顆粒の重要な特性も示されている。例えば、それらの顆粒は、クラスターにより示される成熟ステージ間にある成熟ステージにある。また、薬剤の効果を特定することができることから、ウィルス顆粒が薬剤に曝露された際に、クラスター間にある顆粒又は顆粒のグループを調査することは特に重要である。
【００２２】
図４には、クラスターＡの夫々のセット（ポジティブコントロール、ＭＣＰ、ｐｐ１５０、ｇＢ及びＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０）の平均半径密度プロファイルが示されている。このことは、従来から知られているＨＣＭＶ成熟中間産物のＡ（空のウィルス殻）分類を表している。この種の見つかった対象物の数が少なく、対象物の半径及び角度エネルギーが小さく、また、多数のその他の非ウィルス構造が存在することから、中心から約４０μｍに配されたカプシド壁に関する情報以外の情報は抽出されない。
【００２３】
図５には、クラスターＢの夫々のセット（ポジティブコントロール、ＭＣＰ、ｐｐ１５０、ｇＢ及びＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０）の平均半径密度プロファイルが示されている。このことは、従来から知られているＨＣＭＶ成熟中間産物のＢ（半透明のコアを有するカプシド）及びＣ（密なコアを有する成熟したカプシド）の分類を表している。図６の拡大図にて最も適切に示されているように、中心おいにおいて、ポジティブコントロール及びｇＢのセットは、ＭＣＰ、ｐｐ１５０及びＭＣＰ＋ｇＢ＋ｐｐ１５０のセットとは、半径が３０〜４０ｎｍ異なる。
【００２４】
その結果、ＴＥＭイメージ内にあるウィルス顆粒のモデルが発展した。回転不変量特性を比較するための測定法に、角度不変両特性を利用することは、回転不変量対象物及び全エネルギーにより表される関数エネルギーのフラクションに置き換えることができる。しかし、全エネルギーが小さい場合には、フラクションは数値を算出するに不安的となる。
【００２５】
このことを解消するために、閾値のレベルが使用される。設定された閾値レベルを使用すると、主観性の源となってしまう。しかし、このレベルでは、誤って計測される数が大変少ない。しかし、ネガティブコントロールのグループを閾値の設定に使用して、ｓｉＲＮＡ分子の影響を調べることができる。
【００２６】
慣性主軸を含む密度プロファイルの如何なる正規変形であっても、Ｌ２−ＬＶＳ内の距離及び内部産物を保持している。そのことから、異なるサブ構造のクラスターは、基礎となる選択から独立している。
【実施例】
【００２７】
使用に供した実施例の材料と方法を以下に示す。ヒト胚肺繊維芽細胞（ＨＦ）は、Ｈａｎｋ’ｓ塩（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）が、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ[４-（２ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸] 、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製、グランドアイランド、ニューヨーク、米国）を含む、重炭酸塩フリーの最小の基本的媒質において維持されている。かかる細胞は、１７５ｃｍ２組織培養フラスコ（コーニング社製、ニューヨーク、米国）で培養され、１７回継代されるまで使用された。また、細胞は、１の感染多重度（ＭＯＩ）にて、ＨＣＭＶに感染させた。ウイルスの上澄液は、感染後（ｐｉ）、７又は１０日後に集められた。次いで、ウイルスの上澄液は、細胞片から低速走行速度遠心分離によって綺麗にされ、使用に供されるまで−７０℃にて保存された。９６穴プレートまたはチャンバスライド上にて培養した単層のＨＦ細胞は、１の感染多重度（ＭＯＩ）にて、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９に感染させた。
【００２８】
ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、カルフォルニア、米国から得た。かかる細胞は、成長因子を有するＥＢＭ-２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製、カリフォルニア、米国）にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件にて維持された。感染の１時間前に、培地は、５％のウシ胎仔血清を有するＥＢＭに取り替えられ、感染プロセスの間、この培地で培養された。細胞は、０．２％ゼラチンにより被覆された１７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ファルコン社製）又は８ウェル・チャンバスライド（ナルゲヌンクインターナショナル社製）を用いて培養され、第８の継代まで実験に使用された。ヒト臍の静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＥＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製、カリフォルニア、米国）で培養された。感染の１時間前に、培地は、５％のウシ胎仔血清を有するＥＢＭに取り替えられ、感染プロセスの間、この培地で培養された。細胞は、１７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ファルコン社製）又は８ウェル・チャンバスライド（ナルゲヌンクインターナショナル社製）を用いて培養され、第８の継代まで実験に使用された。細胞は、１のＭＯＩにて内皮細胞性適合株であるＴＢ４０により感染させた。
【００２９】
平滑筋細胞は、大動脈の移植片の挿入をする大動脈瘤の外科手術を受けている患者から、或いは、移植提供者の腸骨血管の大動脈の移植片又は移植から得られた大動脈の移植片から単離された。細胞は、鋭利器具で細胞をひっかいて、最初に内皮細胞を取り除くことによって単離された。次いで、血管は、一対のピンセットを用いて２枚の層へと穏やかに分離することによって、２つの異なる層、すなわち、最内層（血管の内膜に対応する）及び最外層（血管中膜に対応する）へと分けられた。大動脈の移植片は、小さな１ｍｍの断片に分割され、ＳｍＧＭ−２ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔｅｓ（ｈＥＧＦ ０．５μｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ; インシュリン５ｍｇ／ｍｌ、０.５ｍｌ； ｈＦＧＦ−ｂ １μｇ／ｍｌ、１ｍｌ；ＦＢＳ、２５ｍｌ； ＧＡ−１０００、０．５ｍｌ）が添加されたＳＭＧＭ２培地内の細胞ペトリ皿上にて、外植片からのＳＭＣ細胞移行が発生するまで、約２週間培養された。細胞は、１７５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（ファルコン社製）にて培養された。ＳＭＣ培養組織の純度を決定するために、細胞は、３％ホルムアルデヒドでチャンバスライドにより４℃で４５分間固定され、０．３％トリトンＸによって５分間透明化に供された。固定後、細胞は、平滑筋細胞特異的なＦＩＴＣ複合抗アクチン（ＳＩＧＭＡ社製）により染色され、蛍光顕微鏡により評価した。細胞はメタノール：アセトン（１：１）により４℃で５分間固定され、ＦＩＴＣ複合抗フォン−ウィルブランド因子（抗ｖＷＦ）及び内皮細胞特異的フォン−ウィルブランド因子によって染色され、蛍光顕微鏡により評価された。抗体のアイソタイプのコントロールが、実験にて使用された。培養組織は、抗ａ−ａｃｔｉｎに１００％陽性であり、フォン−ウィルブランド因子に陰性であった。
【００３０】
電子顕微鏡法によってウィルス感染細胞を検査するために、感染してない及びＨＣＭＶ感染している、（１のＭＯＩ）細胞が、３、５、７及び１０ｄｐｉにて集められ、０．１Ｍスクロース及び３ｍＭＣａＣｌ２（ｐＨ ７．４）を含む１Ｍ塩化カコジル緩衝液中の２％グルタルアルデヒドにて、ｐＨ７．４、室温にて３０分間固定された。細胞は、木製の棒によりかきとられ、エッペンドルフチューブに移され、更に、冷蔵庫内にて一晩固定された。細胞を固定した後、ｐＨ７．４、３ｍＭのＣａＣｌ２を含む０．１５Ｍの塩化カコジル緩衝液によりリンスされ、遠心される。次いで、得られたペレットは、ｐＨ７．４、１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含んでいる０．０７Ｍの塩化カコジル緩衝液中の２％四酸化オスミウムにより、４℃で２時間事後的に固定され、エタノールついでアセトンにより脱水され、ＬＸ-１１２（ラッド社製、バーリントン、ヴァーモント、米国）に埋め込まれる。切片標本は、クエン酸鉛、次いで、酢酸ウラニルと比較され、８０ｋＶにてＴｅｃｎａｉ １０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ社製、オランダ）によって検討された。デジタルイメージは、ＭｅｇａＶｉｅｗＩＩデジタルカメラ（ソフトイメージングシステムゲーエムベーハー社製、マンスター、独国）によりキャプチャされる。
【００３１】
電子顕微鏡写真の処理を以下に説明する。切片標本は、クエン酸鉛、次いで、酢酸ウラニルと比較され、８０ｋＶにてＴｅｃｎａｉ １０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ社製、オランダ）によって検討された。デジタルイメージは、ＭｅｇａＶｉｅｗＩＩデジタルカメラ（ソフトイメージングシステムゲーエムベーハー社製、マンスター、独国）によりキャプチャされる、又は、デジタル化のために、電子顕微鏡写真がキャプチャ、展開、及びスキャンされる。顕微鏡写真は、ＨＰ社のＳｃａｎＪｅｔ ６２００Ｃ ｆｌａｔｂｅｄスキャナにより、ピクセルサイズが２×２ｎｍｍ又は３×３ｎｍの、８ビットイメージにデジタル化され、カプシドの半径を夫々２５又は１７ピクセルにてデジタル化した顕微鏡写真を提供する。夫々のデジタルイメージは、凡そ１０００×１０００ピクセル（１メガバイト）の寸法を有する。解像度は、ここに調査された３種のカプシドのクラスを判別するに充分であるが、非常にきめ細かいバックグラウンドがカプシドの同定作業を困難としている。Ｈｐ者のＴｒｕ４ ＵＮＩＸ（登録商標）を動かしているＤＥＣ ａｌｐｈａ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ４３３は、この発明に従う方法の開発及び評価に使用された。実施及び試験はＭａｔｌａｂ ７．０．１ (ザマスワーク（ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ， Ｉｎｃ）社製、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ)を使用して行われた。得られたグレーレベルプロファイル図は、ＣｏｒａｌＤｒａｗ１０（Ｃｏｒｅｌ社製、オタワ、カナダ）及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ（アドビシステムズ社製、サンノゼ、カルフォルニア、米国）により処理された。
【００３２】
この発明は好適な組成及び実施形態にて説明されているが、特許請求の範囲に記載のこの発明の範囲内であれば、その他の置き換え及び変更が可能であることには留意されたい。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イメージ内において、細胞内のウィルス顆粒を集計し、区分する方法であって、該方法は、
その中に多数の対象物を有するイメージを提供するステップと、
円形の対象物を同定するステップと、
円形の対象物をグループに振り分けるステップと、
円形のウィルス顆粒の半径の範囲を特定するステップと、
半径の範囲から形成され得る楕円形の対象物を同定するステップと、
同定された楕円形の対象物をグループに振り分けるステップと、
円形及び楕円形の対象物の選択されたグループの半径の範囲に基づき、振り分けられた円形及び楕円形の対象物からウィルス顆粒を同定するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記イメージ内の対象物の半径密度プロファイルを分析するステップを更に含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記ウィルス顆粒を化学物質に曝露するステップを更に含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記化学物質に曝露した後に、同定された円形及び楕円形の対象物をグループに振り分け、該曝露前の半径密度プロファイルの分布と曝露後の半径密度プロファイルの分布との間の差異を分析するステップを更に含む方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記化学物質に曝露する前後における、グループとなった対象物の量的な差異を特定するステップを更に含む方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ウィルス顆粒の形態学的な構造を分析するステップを更に含む方法。
【請求項１】
イメージ内において、細胞内のウィルス顆粒を集計し、区分する方法であって、該方法は、
その中に多数の対象物を有するイメージを提供するステップと、
円形の対象物を同定するステップと、
円形の対象物をグループに振り分けるステップと、
円形のウィルス顆粒の半径の範囲を特定するステップと、
半径の範囲から形成され得る楕円形の対象物を同定するステップと、
同定された楕円形の対象物をグループに振り分けるステップと、
円形及び楕円形の対象物の選択されたグループの半径の範囲に基づき、振り分けられた円形及び楕円形の対象物からウィルス顆粒を同定するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記イメージ内の対象物の半径密度プロファイルを分析するステップを更に含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記ウィルス顆粒を化学物質に曝露するステップを更に含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記化学物質に曝露した後に、同定された円形及び楕円形の対象物をグループに振り分け、該曝露前の半径密度プロファイルの分布と曝露後の半径密度プロファイルの分布との間の差異を分析するステップを更に含む方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記化学物質に曝露する前後における、グループとなった対象物の量的な差異を特定するステップを更に含む方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ウィルス顆粒の形態学的な構造を分析するステップを更に含む方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５２９４２８（Ｐ２０１０−５２９４２８Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０３９１（Ｐ２０１０−５１０３９１）
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６１４９９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０５８８
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０７３３９８６９）インテリジェント ヴァイルス イメージング インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６１４９９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５０５８８
【国際公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０７３３９８６９）インテリジェント ヴァイルス イメージング インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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