インターフェロンα産生阻害剤
【課題】本発明は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤や、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤や、全身性エリテマトーデスの予防・治療剤を提供することを目的とする。
【解決手段】Ｈｓｐ９０阻害物質を用いることを特徴とする。Ｈｓｐ９０阻害物質としては、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されるものを好適に例示することができる。
【解決手段】Ｈｓｐ９０阻害物質を用いることを特徴とする。Ｈｓｐ９０阻害物質としては、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されるものを好適に例示することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤や、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤や、全身性エリテマトーデスの予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（Dendritic cell）（以下、単に「ＤＣ」とも表示する。）は、抗原の取り込み、抗原の提示、サイトカインの産生など、自然免疫において重要な役割を担う細胞である。ＤＣは、従来型樹状細胞（conventional DC）（以下、単に「ｃＤＣ」とも表示する。)と、形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DC）（以下、単に「ｐＤＣ」とも表示する。）に大別される。
【０００３】
ｐＤＣは、Ｂ細胞と似た特徴を持つ樹状細胞で、典型的な樹状突起を持たず、生体内を循環している。また、ｐＤＣのエンドソームやリソソームには、核酸を認識するToll-like receptor（以下、単に「ＴＬＲ」とも表示する。）のうち、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９が選択的に発現している。ＴＬＲ７はウイルスの一本鎖ＲＮＡをリガンドとしており、ＴＬＲ９は非メチル化ＣｐＧをリガンドとしている。ｐＤＣは、ＴＬＲ７やＴＬＲ９を介するこれらのリガンド刺激によって、体細胞の１００〜１０００倍もの大量のインターフェロン（以下、単に「ＩＦＮ」とも表示する。）を生産することができるため、近年注目を集めている。かかるＩＦＮの中でも、インターフェロンα（ＩＦＮα）は、ＤＣ自身の活性化、細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte）（以下、単に「ＣＴＬ」とも表示する。）の誘導、及び、Ｂ細胞からの抗体産生を促進する。
【０００４】
一方、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）（以下、単に「ＳＬＥ」とも表示する。）では、血清中のインターフェロンα高値が病態増悪の原因の一つと考えられている。ＳＬＥ患者の血清では、抗ＤＮＡ抗体が存在し、自己ゲノムＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体からなる抗原抗体複合体が形成される。この複合体が、Ｆｃ受容体を介してＢ細胞やｐＤＣに取り込まれてそれらの細胞のエンドソームへ効率よく輸送され、その結果、ＴＬＲ９依存性に樹状細胞を強く活性化し、インターフェロンαを産生することがＳＬＥの病態増悪の大きな原因であることが知られている（非特許文献１及び２）。
【０００５】
また、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）は、熱ショックにより発現が増加する細胞内タンパク質で、熱以外の放射線・低栄養などのストレスにも反応し増加することが知られている。ヒートショックプロテインの機能としては、細胞内でさまざまなタンパク質と複合体を形成し、そのタンパク質を安定化させ正常に機能にさせる分子シャペロンとしての機能があり、特にヒートショックプロテイン９０（Ｈｓｐ９０）のクライアントタンパク質にはプロテインキナーゼやステロイドホルモン受容体などの細胞増殖や分化に重要な役割を果たすシグナル伝達分子が多い。また、ヒートショックプロテインは、ペプチドと複合体を形成し、ストレスに曝露されると腫瘍細胞や感染細胞から細胞外に放出されて、免疫応答に寄与していることも知られている。
【０００６】
Ｈｓｐ９０阻害剤は様々な用途に用いられており、例えば特許文献１には、Ｈｓｐ９０阻害剤を抗癌剤として用いることが記載されている。また、非特許文献３には、Ｈｓｐ９０がインターフェロンγやインターフェロンαを活性化することや、Ｈｓｐ９０の阻害物質であるゲルダナマイシンにより、インターフェロンγやインターフェロンαの抗ウイルス効果が抑制されることが記載されている。また、特許文献２には、Ｈｓｐ９０が腫瘍壊死因子α（Tumor Necrosis Factor α：ＴＮＦα）とインターロイキン６（ＩＬ−６）を活性化することが記載されており、そのクレーム２１には、Ｈｓｐ９０阻害物質を全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の患者に投与することにより、ＴＮＦα及びＩＬ−６を低下させる方法が記載されている。
【０００７】
しかし、Ｈｓｐ９０阻害物質が、ｐＤＣからのインターフェロンαの産生自体を阻害することや、インビボにおいて、全身性エリテマトーデスに対して予防・治療効果を実際に発揮することはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５２９１８８号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０７７４５４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Clin.Invest. 2005 Feb;115(2):407-17
【非特許文献２】Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005 Dec;1062:242-51
【非特許文献３】J. Biol. Chem. 2006;281:1876-1884
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤や、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤や、全身性エリテマトーデスの予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前述の背景技術に記載したような状況下、鋭意研究を行った結果、（ａ）Ｈｓｐ９０阻害物質が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルマウスの病態を改善し得ること、（ｂ）Ｈｓｐ９０阻害物質が、マウスやヒト由来の形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生を阻害し得ること、（ｃ）かかるインターフェロンα産生の阻害が、Ａｋｔタンパク質やｍＴＯＲタンパク質のリン酸化が抑制されることによるものであること、及び、（ｄ）かかるインターフェロンα産生の阻害が、ＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行が阻害されることによるものであることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤や、（２）Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする上記（１）に記載のインターフェロンα産生阻害剤に関する。
【００１３】
また、本発明は、（３）Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤や、（４）Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする上記（３）に記載の移行阻害剤に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、（５）上記（１）若しくは（２）に記載のインターフェロンα産生阻害剤、又は、上記（３）若しくは（４）に記載の移行阻害剤を含有する全身性エリテマトーデスの予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生を阻害することや、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行を阻害することができる。また、本発明によれば、全身性エリテマトーデスを予防・治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＳＬＥ発症モデルマウスの腎臓組織切片をヘマトキシリン・エオシン染色し、光学顕微鏡で観察した結果を示す図である。図１Ａ：コントロール群のマウスの結果を表す。図１Ｂ：１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン塩酸塩（１７−ＤＭＡＧ）を投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの結果を表す。
【図２】ＳＬＥ発症モデルマウスの腎組織切片をＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。図２Ａ：コントロール群のマウスの結果を表す。図２Ｂ：図２Ａの一部を拡大した結果を表す。図２Ｃ：１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの結果を表す。図２Ｄ：図２Ｃの一部を拡大した結果を表す。
【図３】ＳＬＥ発症モデルマウスの脾臓及び皮膚の観察結果、並びに、血清中の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定結果を示す図である。図３Ａ：左は１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの脾臓を表し、右はコントロール群のマウスの脾臓を表す。図３Ｂ：左は１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの頭部の様子を表し、右はコントロール群のマウスの頭部の様子を表す。図３Ｃ：“control”はコントロール群のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度を表し、“geldanamycin treated”は１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度を表す。
【図４】マウスｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養した培養液中に含まれるインターフェロンα濃度を測定した結果を示す図である。“control”はＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM”はゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 100ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、１００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 200ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、２００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 300ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、３００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 400ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 500ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、５００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 600ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、６００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表す。
【図５】マウスｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣについて、リン酸化Ａｋｔタンパク質及びリン酸化ｍＴＯＲタンパク質等に対するウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す図である。左のレーンは、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したマウスｐＤＣの結果を表し、真ん中のレーンは、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、右のレーンは、ＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表す。
【図６】マウスｐＤＣにおけるＴＬＲ９、ＫＤＥＬ（小胞体のマーカー）、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を免疫蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図などである。上段は、ウイルスや細菌が細胞に感染したときの、ＴＬＲ９の局在の変化を示した模式図である。下段左パネルの左列はＴＬＲ９の緑色蛍光を表し、中央列はＫＤＥＬ（小胞体のマーカー）の赤色蛍光を表し、右列は対応する左列と中央列の蛍光を重ね合わせた蛍光を表し、上段列は“control”の場合の蛍光を表し、中段列は“CpG”の場合の蛍光を表し、下段列は“CpG＋geldanamycin”の場合の蛍光を表す。下段右パネルの左列はＴＬＲ９の緑色蛍光を表し、中央列はＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）の赤色蛍光を表し、右列は対応する左列と中央列の蛍光を重ね合わせた蛍光を表し、上段列は“control”の場合の蛍光を表し、中段列は“CpG”の場合の蛍光を表し、下段列は“CpG＋geldanamycin”の場合の蛍光を表す。
【図７】マウスｐＤＣのライセートを抗ＴＬＲ９抗体、又は、抗Ｈｓｐ９０抗体を用いて免疫沈降した物を電気泳動した後にウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。上段パネルは抗Ｈｓｐ９０抗体を用いた場合の結果を表し、中段パネル及び下段パネルは抗ＴＬＲ９抗体を用いた場合の結果を表す。また、各パネルの左列は“control”の場合の結果を表し、中央列は“CpGA”の場合の結果を表し、右列は“CpGA＋geldanamycin”の場合の結果を表す。
【図８】ヒトｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養した培養液中に含まれるインターフェロンα濃度を測定した結果を示す図である。“control”はＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM”はゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 200ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、２００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 400ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 600ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、６００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 800ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、８００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 1000ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、１０００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表す。
【図９】ヒトｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣについて、リン酸化Ａｋｔタンパク質及びリン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す図である。左のレーンは、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したヒトｐＤＣの結果を表し、真ん中のレーンは、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、右のレーンは、ＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表す。
【図１０】ヒトｐＤＣにおけるＴＬＲ９、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を免疫蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図などである。左パネルの左列はＴＬＲ９の緑色蛍光を表し、中央列はＥＥＡ−１の赤色蛍光を表し、右列は対応する左列と中央列の蛍光を重ね合わせた蛍光を表し、上段列は“control”の場合の蛍光を表し、中段列は“CpG”の場合の蛍光を表し、下段列は“CpG＋geldanamycin”の場合の蛍光を表す。右パネルは、蛍光画像中のｐＤＣをランダムに１００個選択し、そのうち、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在しているｐＤＣを計測して、それらが共局在しているｐＤＣの割合（％）を示した図である。
【図１１】ヒトＰＢＭＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養した培養液中に含まれるインターフェロンα濃度を測定した結果を示す図である。“control”はＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したヒトＰＢＭＣの結果を表し、“CpG”はゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したヒトＰＢＭＣの結果を表し、“CpG + geldanamycin”はＣｐＧ−Ａと、ゲルダナマイシンを添加して培養したヒトＰＢＭＣの結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の「形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤」（以下、単に「本発明のインターフェロンα産生阻害剤」とも表示する。）や、本発明の「形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤」（以下、単に「本発明の移行阻害剤」とも表示する。）としては、Ｈｓｐ９０阻害物質を含有している限り特に制限されない。また、かかる本発明のインターフェロンα産生阻害剤や、本発明の移行阻害剤は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の予防・治療剤（以下、「本発明のＳＬＥ予防・治療剤」とも表示する。）としても用いることができる。これらの剤の作用機序の詳細は明らかではないが、Ｈｓｐ９０阻害物質が、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の、小胞体から初期エンドソームへの移行を抑制し、かかるＴＬＲ９が自己ＤＮＡを認識することを抑制し、インターフェロンα産生に重要なＡｋｔタンパク質やｍＴＯＲタンパク質を介するシグナル伝達を抑制することによって、インターフェロンα産生を阻害し、その結果、ＳＬＥに対する予防及び／又は治療効果が発揮されるものと考えられる。なお、本明細書において、「阻害」なる語と、「抑制」なる語は特に区別なく用いられる。
【００１８】
上記のＨｓｐ９０阻害物質とは、いずれかの哺乳動物のＨｓｐ９０の機能を阻害する物質を意味するが、かかるＨｓｐ９０の機能としては、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の、小胞体から初期エンドソームへの移行を介助する機能や、形質細胞様樹状細胞におけるＡｋｔタンパク質及び／又はｍＴＯＲタンパク質をリン酸化する機能を好適に例示することができる。上記のＨｓｐ９０阻害物質としては、Ｈｓｐ９０阻害物質である限り特に制限されないが、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体、及びエーテル体（以下、まとめて「ゲルダナマイシン等」とも表示する。）を好適に例示することができ、中でも、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、及び、それらの塩をより好適に例示することができる。また、Ｈｓｐ９０阻害物質を有効成分とする抗がん剤として、現在、ＫＷ−２４７８（American Association for Cancer Research, Published OnlineFirst on April 20, 2010, 10.1158/1078-0432.CCR-09-3112）の臨床試験が行われている。ＫＷ−２４７８では、Ｈｓｐ９０阻害物質として、2-{2-エチル-3,5-ジヒドロキシ-6-[3-メトキシ-4-(2-モルホリン-4-イルエトキシ)ベンゾイル]フェニル}-N,N-ビス(2-メトキシエチル)アセトアミド モノヒドロクロライドが用いられている。かかる物質は、医薬としての実用化の可能性が高いため、本発明に用いるＨｓｐ９０阻害物質として特に好適に例示することができる。本発明のインターフェロンα産生阻害剤や移行阻害剤やＳＬＥ予防・治療剤（以下、これらを３つまとめて「本発明の剤」とも表示する。）には、本発明に用いるＨｓｐ９０阻害物質を２種類以上併用してもよい。また、本発明におけるゲルダナマイシン等は市販のものを使用することができ、また、適宜エステル体やエーテル体とすることができる。
【００１９】
上記の哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。
【００２０】
ある物質がＨｓｐ９０阻害物質であるかどうかは、例えば、
哺乳動物（好ましくはヒト）の形質細胞様樹状細胞を、被検物質存在下で培養する工程Ａ；
前述の形質細胞様樹状細胞を刺激するＣｐＧ−Ａ存在下で培養する工程Ｂ；
前述の形質細胞様樹状細胞についてウエスタンブロッティングを行い、リン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ｍＴＯＲタンパク質のシグナル強度を検出する工程Ｃ；
工程Ｃにおいて検出したシグナル強度を、被検物質の非存在下において検出したシグナル強度と比較する工程Ｄ；
工程Ｃにおいて検出したシグナル強度が、被検物質の非存在下において検出したシグナル強度よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｅ；
を有する方法Ｘや、
哺乳動物（好ましくはヒト）の形質細胞様樹状細胞を、被検物質存在下で培養する工程Ａ；
前述の形質細胞様樹状細胞を刺激するＣｐＧ−Ａ存在下で培養する工程Ｂ；
培養液中のインターフェロンα濃度を測定する工程Ｃ’；
工程Ｃ’で測定したインターフェロンα濃度の測定値を、被検物質非存在下で培養した場合のインターフェロンα濃度の測定値と比較する工程Ｄ’；
工程Ｃ’で測定したインターフェロンα濃度の測定値が、被検物質非存在下で培養した場合の測定値よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｅ’；
を有する方法Ｙや、
ＳＬＥモデル哺乳動物に被検物質を投与する工程Ｆ；
ＳＬＥモデル哺乳動物から血清を採取し、血清中の抗ＤＮＡ抗体濃度を測定する工程Ｇ；
工程Ｇで測定した抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値を、被検物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値と比較する工程Ｈ；
工程Ｇで測定した抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値が、被検物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｉ；
を有する方法Ｚや、
哺乳動物（好ましくはヒト）の形質細胞様樹状細胞を、被検物質存在下で培養する工程Ａ；
前述の形質細胞様樹状細胞を刺激するＣｐＧ−Ａ存在下で培養する工程Ｂ；
前述の形質細胞様樹状細胞において、ＴＬＲ９が初期エンドソームに局在する割合を測定する工程Ｃ”；
工程Ｃ”において測定した割合を、被検物質の非存在下において測定した割合と比較する工程Ｄ”；
工程Ｃ”において測定した割合が、被検物質の非存在下において測定した割合よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｅ”；
を有する方法Ｖ等により、容易に確認することができる。
【００２１】
前述の哺乳動物の形質細胞様樹状細胞は、例えば、かかる形質細胞様樹状細胞特異的な抗体等を用いて、哺乳動物の末梢血から分離、精製することができる。また、前述のリン酸化Ａｋｔタンパク質や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質の検出は、リン酸化Ａｋｔタンパク質に対する特異的抗体や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対する特異的抗体等を利用して行うことができる。また、前述のインターフェロンα濃度の測定は、そのインターフェロンαに特異的な抗体を含む市販のキット等を用いて、ＥＬＩＳＡ法により行うことができる。また、ＳＬＥモデル哺乳動物は、公知のものや、市販のものを利用することができる。さらに、抗ＤＮＡ抗体濃度の測定は、ＥＬＩＳＡ法により行うことができる。また、形質細胞様樹状細胞において、ＴＬＲ９が初期エンドソームに局在する割合の測定は、形質細胞様樹状細胞を抗ＴＬＲ９抗体又は抗ＥＥＡ−１抗体で蛍光染色し、抗ＴＬＲ９抗体の蛍光と抗ＥＥＡ−１抗体の蛍光とが共局在している形質細胞様樹状細胞の割合を測定すること等により行うことができる。
【００２２】
本発明の剤は、所望の「インターフェロンα抑制効果」や、所望の「形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行抑制効果（以下、単に「移行抑制効果」とも表示する。）や、所望の「ＳＬＥの予防・治療効果」が得られる限り、前述のＨｓｐ９０阻害物質の他に、他のインターフェロンα産生阻害剤や、他の移行阻害剤や、他のＳＬＥの予防・治療剤等の任意成分を含んでいてもよい。
【００２３】
Ｈｓｐ９０阻害物質のインターフェロンα産生阻害効果は、例えば、前述の方法Ｙにおいて、工程Ｃ’で測定したインターフェロンα濃度の測定値が、被検物質非存在下で培養した場合の測定値と比較して低下した程度を調べることによって算出することができる。また、Ｈｓｐ９０阻害物質の移行抑制効果は、例えば、前述の方法Ｖにおいて、工程Ｃ”において測定した割合が、被検物質の非存在下において測定した割合と比較して低下した程度を調べることによって算出することができる。さらに、Ｈｓｐ９０阻害物質のＳＬＥの予防・治療効果は、例えば、前述の方法Ｚにおいて、工程Ｇで測定した抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値が、被検物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値と比較して低下した程度を調べることによって算出することができる。
【００２４】
本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質のインターフェロンα産生阻害効果の好適な程度としては、Ｈｓｐ９０阻害物質を６００ｎｇ／ｍｌ含む培養液にて、ヒトの形質細胞様樹状細胞を３時間培養し、次いで、ＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、添加してから２４時間後に測定した培養液中のインターフェロンα濃度が、該Ｈｓｐ９０阻害物質を添加しなかった場合のインターフェロンα濃度に対して、割合として好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上低下することを例示することができる。
【００２５】
本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質の移行抑制効果の好適な程度としては、Ｈｓｐ９０阻害物質を４００ｎｇ／ｍｌ含む培養液にて、ヒトの形質細胞様樹状細胞を３時間培養し、次いで、ＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、添加してから２４時間後に測定した培養液から分離した形質細胞様樹状細胞のうち、抗ＴＬＲ９抗体の蛍光と抗ＥＥＡ−１抗体の蛍光とが共局在している形質細胞様樹状細胞の割合（％）が、該Ｈｓｐ９０阻害物質を添加しなかった場合のその割合（％）に対して、割合として好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上低下することを例示することができる。
【００２６】
また、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質のＳＬＥの予防・治療効果の好適な程度としては、２１週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Jackson Laboratory社製）に、０．１２５ｍｇ／ｄａｙのＨｓｐ９０阻害物質を５０日間連続して経口投与した後に採取した血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度が、Ｈｓｐ９０阻害物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体の濃度に対して、割合として好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上低下することを例示することができる。
【００２７】
本発明の剤に含有されるＨｓｐ９０阻害物質は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、優れたインターフェロンα産生効果や、移行抑制効果や、ＳＬＥの予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＨｓｐ９０阻害物質を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００２８】
本発明の剤の投与方法としては、所望のインターフェロンα産生阻害効果や、所望の移行抑制効果や、所望のＳＬＥの予防・治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を例示することができる。また本発明の剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができる。
【００２９】
本発明のＳＬＥ予防・治療剤が対象とする疾患としては全身性エリテマトーデスである限り特に制限されない。また、本発明の剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明の剤に含有されるＨｓｐ９０阻害物質が阻害作用を発揮するＨｓｐ９０の由来である哺乳動物の種類は、本発明の剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、より安定して優れたインターフェロンα産生阻害効果や、移行抑制効果や、ＳＬＥの予防・治療効果を得る観点から、好ましい。
【００３０】
なお、本発明の他の態様として、本発明のインターフェロンα産生阻害剤、移行阻害剤、又は、ＳＬＥ予防・治療剤の製造における、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質の使用；や、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質を、本発明のインターフェロンα産生阻害剤、移行阻害剤、又は、ＳＬＥ予防・治療剤に使用する方法；や、ＳＬＥの予防・治療における、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質の使用；や、本発明のインターフェロンα産生阻害剤を対象に投与することにより、対象の形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生を阻害する方法；や、本発明の移行阻害剤を対象に投与することにより、対象の形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行を抑制する方法；や、本発明のＳＬＥ予防・治療剤を対象に投与することにより、対象のＳＬＥを予防・治療する方法；も例示することができる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。また、本発明の移行阻害剤は、形質細胞様樹状細胞におけるＨｓｐ９０とＴＬＲ９の分子会合阻害剤としても利用することができる。
【００３１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【実施例１】
【００３２】
［ＳＬＥ発症モデルマウスに対するＨｓｐ９０阻害物質の投与アッセイ］
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ＳＬＥに対してどのような効果を発揮するかを調べるために、以下のようなアッセイを行った。
【００３３】
まず、ＳＬＥ発症モデルマウスであるＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Jackson Laboratory社製）を用意し、２１週齢になるまで生育させた。これらのマウスを２つのグループに分けて、一方のグループをゲルダナマイシン処理群とし、他方をコントロール群とした。そして、ゲルダナマイシン処理群のマウスには、０．１２５ｍｇ／ｄａｙの１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン塩酸塩（17-dimethyl aminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride:１７−ＤＭＡＧ）を、５０日間連続して経口投与し、コントロール群のマウスにはＰＢＳを同様に投与した。投与終了後、両群のマウスから腎臓を取り出し、腎臓組織の凍結切片を作製した。以下、作製したこれらの凍結切片を凍結切片Ｘとも表示する。
【００３４】
これらの凍結切片Ｘをヘマトキシリン・エオシン染色した後、光学顕微鏡で観察して得られた腎臓組織所見を図１に示す。図１Ｂは、ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの腎臓組織所見を示し、図１Ａは、コントロール群（control）のマウスの腎臓組織所見を示す。コントロール群のマウスの腎臓組織（図１Ａ）では、糸球体基底膜は明らかに肥厚し、半月体形成を示す糸球体が目立ったのに対し、ゲルダナマイシン処理群のマウスの腎臓組織（図１Ｂ）では、糸球体基底膜肥厚の改善、半月体形成の抑制が明らかに認められ、著明な組織学的改善を認めた。
【００３５】
また、前述の投与終了後の両群のマウスにおけるＩｇＧの腎糸球体基底膜への沈着の程度を調べるために、前述の凍結切片Ｘを、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色した後、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図２に示す。図２Ｃは、ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの腎臓組織切片の蛍光画像を表し、図２Ｄは、図２Ｃの一部を拡大した蛍光画像を表す。また、図２Ａは、コントロール群（control）のマウスの腎臓組織切片の蛍光画像を表し、図２Ｂは、図２Ａの一部を拡大した蛍光画像を表す。コントロール群のマウスの腎臓組織（図２Ａ及びＢ）では、腎糸球体基底膜への厚いＩｇＧ沈着が見られたのに対し、ゲルダナマイシン処理群のマウスの腎臓組織（図２Ｃ及びＤ）では、明らかにＩｇＧ沈着が軽度で、腎糸球体基底膜の肥厚も軽度であった。
【００３６】
さらに、前述の投与終了後の両群のマウスにおける脾腫の程度を調べるために、前述の投与終了後の両群のマウスから脾臓を取り出した。両群のマウスの脾臓の所見を図３Ａに示し、皮膚の所見を図３Ｂに示す。ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの脾臓（図３Ａ左）は、コントロール群（control）のそれ（図３Ａ右）と比較してサイズが小さく、脾腫は明らかに改善していた。また、皮膚に関して言えば、コントロール群のマウス（図３Ｂ右）では、眼瞼周囲の紅斑が明らかに認められたのに対し、ゲルダナマイシン処理群のマウス（図３Ｂ左）ではその紅斑は非常に軽度であった。
【００３７】
また、前述の投与終了後の両群のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体濃度を調べるために、前述の投与終了後の両群のマウスから血清を採取し、血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度をＥＬＩＳＡ（Mouse Anti ds ELISA KIT（AKRDD-061,Shibayagi（Gunma,Japan））で測定した。その結果を図３Ｃに示す。ＳＬＥでは血清中の抗ＤＮＡ抗体が高濃度になることが知られているが、ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度は、コントロール群（control）のそれと比較して明らかに低下していた（図３Ｃ）。
【００３８】
図１〜図３の結果から、Ｈｓｐ９０阻害物質である１７−ＤＭＡＧの経口投与によって、明らかにＳＬＥによる腎病変、皮膚病変の改善が認められた。また、ＳＬＥの活動度の指標となる抗ＤＮＡ抗体についても、明らかに低値を示した。これらの結果は、ＳＬＥの治療薬としてＨｓｐ９０阻害物質が有効であることを示すものである。
【実施例２】
【００３９】
［マウスの形質細胞様樹状細胞を用いたＨｓｐ９０阻害アッセイ］
Ｈｓｐ９０阻害物質による効果とその作用機序を検討するために、以下のようなアッセイを行った。
【００４０】
（１）インターフェロンα測定アッセイ
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの骨髄細胞を、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；５μｇ／ｍｌ）を用いて培養し、培養から５日目に、ｐＤＣ特異的な単クローン抗体ｍＰＤＣＡ１を用いて、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を分離、精製し、精製ｐＤＣを得た。Ｈｓｐ９０阻害物質であるゲルダナマイシンを各種濃度（１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、又は、６００ｎｇ／ｍｌ）で含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、培養を継続した。２４時間後に、培養液を採取し、これらの培養液中に含まれるインターフェロンα濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したもの（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したもの（CpG-A 3μM）についても、同様に、インターフェロンα濃度を測定した。これらの結果を図４に示す。
【００４１】
図４の結果から分かるように、ＣｐＧ−Ａの添加によって誘導されたインターフェロンα産生は、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に抑制された。なお、Ｈｓｐ９０阻害物質として、ゲルダナマイシンに代えて、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン（17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin：１７−ＡＡＧ）、又は、１７−ＤＭＡＧを用いて同様のアッセイを行ったところ、１７−ＡＡＧや１７−ＤＭＡＧを用いた場合も、ゲルダナマイシンを用いた場合と同様に、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に、インターフェロンα産生が抑制されることが示された。
【００４２】
（２）シグナル伝達分子に関するウエスタンブロッティング解析
ＣｐＧ−ＡによるｐＤＣからのインターフェロンα産生には、シグナル伝達分子であるＡｋｔタンパク質及びｍＴＯＲタンパク質のリン酸化が重要であることが知られている。そこで、ｐＤＣにおけるこれらの分子のリン酸化をウエスタンブロッティング法（イムノブロット法）により解析することとした。
【００４３】
前述の実施例２の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣを分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG-A 3μM）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣ（それぞれ約１×１０６cellずつ）からライセートを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動を行った。このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をメンブレンに転写し、次いで、かかるメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした。その後、メンブレンに各種の１次抗体を反応させてから、メンブレンを洗浄した。１次抗体としては、Ａｋｔタンパク質に対する抗体、４７３番目のセリンがリン酸化されたＡｋｔタンパク質に対する抗体、３０８番目のスレオニンがリン酸化されたＡｋｔタンパク質に対する抗体、ｍＴＯＲタンパク質に対する抗体、リン酸化されたｍＴＯＲタンパク質に対する抗体、又は、β−アクチンに対する抗体をそれぞれ用いた。洗浄したメンブレンに、１次抗体を認識する標識２次抗体を反応させて、各種の１次抗体のシグナルを検出した。その結果を図５に示す。
【００４４】
図５の結果から分かるように、左のレーン（control）や真ん中のレーン（CpG-A 3μM）などのコントロール群のｐＤＣでは、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）が認められたのに対して、ゲルダナマイシン処理したｐＤＣ（右のレーン：Geldanamycin 400ng/ml）では、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）の低下が認められ、それらの分子のリン酸化が抑制されたことが示された。
【００４５】
（３）ｐＤＣにおけるＴＬＲ９等の蛍光アッセイ
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９の局在に影響を与えるかどうかを調べるために、以下のような蛍光アッセイを行うこととした。
【００４６】
前述の実施例２の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣ（CpG＋geldanamycin）を分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣにおいて蛍光色素ラベルしたＴＬＲ９、ＫＤＥＬ（小胞体のマーカー）、及び、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を蛍光顕微鏡で観察した結果を図６の下段に示す。なお、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＫＤＥＬ又はＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在すると、黄色の蛍光が確認される。
【００４７】
コントロールでは、ＴＬＲ９はほとんどが小胞体（Endoplasmic Reticulum: ＥＲ）に存在し、初期エンドソーム（Early endosome）では見られなかった（図６下段の左パネル及び右パネルの上段列（control））が、ＣｐＧ−Ａを添加培養したｐＤＣでは、ＴＬＲ９が小胞体から初期エンドソームに移動したことが示された（図６下段の左パネル及び右パネルの中段列（CpG））。これに対し、あらかじめゲルダナマイシン処理をしたｐＤＣでは、ＣｐＧ−Ａを添加培養しても、ＴＬＲ９は小胞体にとどまっており、初期エンドソームへの移行が抑制された（図６下段の左パネル及び右パネルの下段列（CpG＋geldanamycin））。これらの結果から、Ｈｓｐ９０は、ＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行の際の、分子シャペロンとして働いていると考えられた。
【００４８】
（４）ＴＬＲ９とＨｓｐ９０の免疫沈降
前述の実施例２の（３）の結果を踏まえて、ＴＬＲ９とＨｓｐ９０の分子会合の有無を調べるために、以下のような免疫沈降を行うこととした。
【００４９】
前述の実施例２の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣ（CpGA＋geldanamycin）を分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpGA）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣからそれぞれライセートを調製し、抗ＴＬＲ９抗体、又は、抗Ｈｓｐ９０抗体を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した後にウエスタンブロッティングを行った結果を図７に示す。
【００５０】
図７の結果から分かるように、Ｈｓｐ９０とＴＬＲ９は分子会合しており（上段パネル及び中段パネルの中央列（CpGA））、その分子会合はゲルダナマイシンで抑制されることが示された（上段パネル及び中段パネルの右列（CpGA＋geldanamycin））。
【実施例３】
【００５１】
［ヒトの形質細胞様樹状細胞を用いたＨｓｐ９０阻害アッセイ］
前述の実施例２では、マウスの形質細胞様樹状細胞を用いたアッセイを行った。そこで、ヒトの形質細胞様樹状細胞を用いた場合についても、Ｈｓｐ９０阻害物質による効果とその作用機序を検討するために、以下のようなアッセイを行った。
【００５２】
（１）インターフェロンα測定アッセイ
まず、ヒト末梢血を用意した。このヒト末梢血から、ｐＤＣ特異的な単クローン抗体ＢＤＣＡ−４を用いて、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を分離、精製し、精製ｐＤＣを得た。Ｈｓｐ９０阻害物質であるゲルダナマイシンを各種濃度（２００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ）で含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、培養を継続した。２４時間後に、培養液を採取し、これらの培養液中に含まれるインターフェロンα濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したもの（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したもの（CpG-A 3μM）についても、同様に、インターフェロンα濃度を測定した。これらの結果を図８に示す。
【００５３】
図８の結果から分かるように、ＣｐＧ−Ａの添加によって誘導されたインターフェロンα産生は、ヒトｐＤＣにおいても、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に抑制された。なお、Ｈｓｐ９０阻害物質として、ゲルダナマイシンに代えて、１７−ＡＡＧ、又は、１７−ＤＭＡＧを用いて同様のアッセイを行ったところ、１７−ＡＡＧや１７−ＤＭＡＧを用いた場合も、ゲルダナマイシンを用いた場合と同様に、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に、インターフェロンα産生が抑制されることが示された。
【００５４】
（２）シグナル伝達分子に関するウエスタンブロッティング解析
前述の実施例３の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣを分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG-A 3μM）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣ（それぞれ約１×１０６cellずつ）からライセートを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動を行った。このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をメンブレンに転写し、次いで、かかるメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした。その後、メンブレンに各種の１次抗体を反応させてから、メンブレンを洗浄した。１次抗体としては、３０８番目のスレオニンがリン酸化されたＡｋｔタンパク質に対する抗体、Ａｋｔタンパク質に対する抗体、又は、リン酸化されたｍＴＯＲタンパク質に対する抗体をそれぞれ用いた。洗浄したメンブレンに、１次抗体を認識する標識２次抗体を反応させて、各種の１次抗体のシグナルを検出した。その結果を図９に示す。
【００５５】
図９の結果から分かるように、左のレーン（control）や真ん中のレーン（CpG-A 3μM）などのコントロール群のｐＤＣでは、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）が認められたのに対して、ゲルダナマイシン処理したｐＤＣ（右のレーン：Geldanamycin 400ng/ml）では、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）の低下が認められ、それらの分子のリン酸化が抑制されたことが示された。この結果は、マウスｐＤＣを用いた前述の実施例２（２）のウエスタンブロッティング解析の結果と同様であった。
【００５６】
（３）ｐＤＣにおけるＴＬＲ９等の蛍光アッセイ
前述の実施例２の（３）において、あらかじめゲルダナマイシン処理をしたマウスｐＤＣでは、ＣｐＧ−Ａを添加培養しても、ＴＬＲ９は小胞体にとどまっており、初期エンドソームへの移行が抑制することが示された。この現象が、ヒトｐＤＣでも生じるかを確認するために、以下のような蛍光アッセイを行うこととした。
【００５７】
前述の実施例３の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣを分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG-A 3μM）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣにおいて蛍光色素ラベルしたＴＬＲ９、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を蛍光顕微鏡で観察した結果を図１０の左パネルに示す。なお、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在すると、黄色の蛍光が確認される。また、蛍光画像中のｐＤＣをランダムに１００個選択し、そのうち、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在しているｐＤＣを計測して、それらが共局在しているｐＤＣの割合（％）を図１０の右パネルに示す。
【００５８】
図１０の左パネル及び右パネルから分かるように、ヒトｐＤＣでも、ＣｐＧ−Ａの添加培養により、ＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行が生じ（図１０左パネルの中段列（CpG））、その移行はゲルダナマイシンにより抑制されることが示された。これらの結果から、ヒトｐＤＣにおいても、Ｈｓｐ９０は、ＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行の際の、分子シャペロンとして働いていると考えられた。
【００５９】
［実施例１〜３の結果のまとめ］
前述の実施例２や３の結果から分かるように、Ｈｓｐ９０阻害物質の投与により、マウスｐＤＣやヒトｐＤＣからのインターフェロンα産生が抑制された。そして、これは、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９の、小胞体から初期エンドソームへの移行が抑制され、かかるＴＬＲ９が自己ＤＮＡを認識することが抑制されることや、インターフェロンα産生に重要なＡｋｔタンパク質やｍＴＯＲタンパク質を介するシグナル伝達が抑制されることによることが示された。また、前述の実施例１におけるＳＬＥマウスモデルの結果と総合すると、Ｈｓｐ９０阻害物質によってＳＬＥの病態が改善した機序の１つは、Ｈｓｐ９０阻害物質によりｐＤＣからのインターフェロンα産生が抑制されたことによるものと考えられた。
【実施例４】
【００６０】
［ヒトの末梢血単核球を用いたＨｓｐ９０阻害アッセイ］
前述の実施例３では、ヒトの形質細胞様樹状細胞を用いたアッセイを行った。そこで、ヒトの未成熟形質細胞様樹状細胞を含む末梢血単核球（ＰＢＭＣ）についても、インターフェロンα測定アッセイを行った。
【００６１】
（１）インターフェロンα測定アッセイ
まず、ヒト末梢血を用意した。このヒト末梢血から、ｐＤＣ特異的な単クローン抗体ＢＤＣＡ−４を用いて、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を分離、精製し、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、培養を継続した。２４時間後に、培養液を採取し、これらの培養液中に含まれるインターフェロンα濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したもの（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したもの（CpG-A）についても、同様に、インターフェロンα濃度を測定した。これらの結果を図１１に示す。
【００６２】
図１１の結果から分かるように、ＣｐＧ−Ａの添加によって誘導されたインターフェロンα産生は、ヒトｐＤＣを含むヒトＰＢＭＣにおいても、Ｈｓｐ９０阻害物質により抑制された。このように、Ｈｓｐ９０阻害物質はｐＤＣを含む末梢血に作用して、ＣｐＧ−Ａによるインターフェロンα産生を抑制する効果を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤の分野や、形質細胞様樹状細胞におけるＡｋｔタンパク質又はｍＴＯＲタンパク質のリン酸化抑制剤の分野や、全身性エリテマトーデスの予防・治療の分野に好適に例示することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤や、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤や、全身性エリテマトーデスの予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（Dendritic cell）（以下、単に「ＤＣ」とも表示する。）は、抗原の取り込み、抗原の提示、サイトカインの産生など、自然免疫において重要な役割を担う細胞である。ＤＣは、従来型樹状細胞（conventional DC）（以下、単に「ｃＤＣ」とも表示する。)と、形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DC）（以下、単に「ｐＤＣ」とも表示する。）に大別される。
【０００３】
ｐＤＣは、Ｂ細胞と似た特徴を持つ樹状細胞で、典型的な樹状突起を持たず、生体内を循環している。また、ｐＤＣのエンドソームやリソソームには、核酸を認識するToll-like receptor（以下、単に「ＴＬＲ」とも表示する。）のうち、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９が選択的に発現している。ＴＬＲ７はウイルスの一本鎖ＲＮＡをリガンドとしており、ＴＬＲ９は非メチル化ＣｐＧをリガンドとしている。ｐＤＣは、ＴＬＲ７やＴＬＲ９を介するこれらのリガンド刺激によって、体細胞の１００〜１０００倍もの大量のインターフェロン（以下、単に「ＩＦＮ」とも表示する。）を生産することができるため、近年注目を集めている。かかるＩＦＮの中でも、インターフェロンα（ＩＦＮα）は、ＤＣ自身の活性化、細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte）（以下、単に「ＣＴＬ」とも表示する。）の誘導、及び、Ｂ細胞からの抗体産生を促進する。
【０００４】
一方、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）（以下、単に「ＳＬＥ」とも表示する。）では、血清中のインターフェロンα高値が病態増悪の原因の一つと考えられている。ＳＬＥ患者の血清では、抗ＤＮＡ抗体が存在し、自己ゲノムＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体からなる抗原抗体複合体が形成される。この複合体が、Ｆｃ受容体を介してＢ細胞やｐＤＣに取り込まれてそれらの細胞のエンドソームへ効率よく輸送され、その結果、ＴＬＲ９依存性に樹状細胞を強く活性化し、インターフェロンαを産生することがＳＬＥの病態増悪の大きな原因であることが知られている（非特許文献１及び２）。
【０００５】
また、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）は、熱ショックにより発現が増加する細胞内タンパク質で、熱以外の放射線・低栄養などのストレスにも反応し増加することが知られている。ヒートショックプロテインの機能としては、細胞内でさまざまなタンパク質と複合体を形成し、そのタンパク質を安定化させ正常に機能にさせる分子シャペロンとしての機能があり、特にヒートショックプロテイン９０（Ｈｓｐ９０）のクライアントタンパク質にはプロテインキナーゼやステロイドホルモン受容体などの細胞増殖や分化に重要な役割を果たすシグナル伝達分子が多い。また、ヒートショックプロテインは、ペプチドと複合体を形成し、ストレスに曝露されると腫瘍細胞や感染細胞から細胞外に放出されて、免疫応答に寄与していることも知られている。
【０００６】
Ｈｓｐ９０阻害剤は様々な用途に用いられており、例えば特許文献１には、Ｈｓｐ９０阻害剤を抗癌剤として用いることが記載されている。また、非特許文献３には、Ｈｓｐ９０がインターフェロンγやインターフェロンαを活性化することや、Ｈｓｐ９０の阻害物質であるゲルダナマイシンにより、インターフェロンγやインターフェロンαの抗ウイルス効果が抑制されることが記載されている。また、特許文献２には、Ｈｓｐ９０が腫瘍壊死因子α（Tumor Necrosis Factor α：ＴＮＦα）とインターロイキン６（ＩＬ−６）を活性化することが記載されており、そのクレーム２１には、Ｈｓｐ９０阻害物質を全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の患者に投与することにより、ＴＮＦα及びＩＬ−６を低下させる方法が記載されている。
【０００７】
しかし、Ｈｓｐ９０阻害物質が、ｐＤＣからのインターフェロンαの産生自体を阻害することや、インビボにおいて、全身性エリテマトーデスに対して予防・治療効果を実際に発揮することはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５２９１８８号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０７７４５４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Clin.Invest. 2005 Feb;115(2):407-17
【非特許文献２】Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005 Dec;1062:242-51
【非特許文献３】J. Biol. Chem. 2006;281:1876-1884
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤や、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤や、全身性エリテマトーデスの予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前述の背景技術に記載したような状況下、鋭意研究を行った結果、（ａ）Ｈｓｐ９０阻害物質が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルマウスの病態を改善し得ること、（ｂ）Ｈｓｐ９０阻害物質が、マウスやヒト由来の形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生を阻害し得ること、（ｃ）かかるインターフェロンα産生の阻害が、Ａｋｔタンパク質やｍＴＯＲタンパク質のリン酸化が抑制されることによるものであること、及び、（ｄ）かかるインターフェロンα産生の阻害が、ＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行が阻害されることによるものであることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤や、（２）Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする上記（１）に記載のインターフェロンα産生阻害剤に関する。
【００１３】
また、本発明は、（３）Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤や、（４）Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする上記（３）に記載の移行阻害剤に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、（５）上記（１）若しくは（２）に記載のインターフェロンα産生阻害剤、又は、上記（３）若しくは（４）に記載の移行阻害剤を含有する全身性エリテマトーデスの予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生を阻害することや、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行を阻害することができる。また、本発明によれば、全身性エリテマトーデスを予防・治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＳＬＥ発症モデルマウスの腎臓組織切片をヘマトキシリン・エオシン染色し、光学顕微鏡で観察した結果を示す図である。図１Ａ：コントロール群のマウスの結果を表す。図１Ｂ：１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン塩酸塩（１７−ＤＭＡＧ）を投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの結果を表す。
【図２】ＳＬＥ発症モデルマウスの腎組織切片をＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。図２Ａ：コントロール群のマウスの結果を表す。図２Ｂ：図２Ａの一部を拡大した結果を表す。図２Ｃ：１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの結果を表す。図２Ｄ：図２Ｃの一部を拡大した結果を表す。
【図３】ＳＬＥ発症モデルマウスの脾臓及び皮膚の観察結果、並びに、血清中の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定結果を示す図である。図３Ａ：左は１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの脾臓を表し、右はコントロール群のマウスの脾臓を表す。図３Ｂ：左は１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの頭部の様子を表し、右はコントロール群のマウスの頭部の様子を表す。図３Ｃ：“control”はコントロール群のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度を表し、“geldanamycin treated”は１７−ＤＭＡＧを投与したゲルダナマイシン処理群のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度を表す。
【図４】マウスｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養した培養液中に含まれるインターフェロンα濃度を測定した結果を示す図である。“control”はＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM”はゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 100ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、１００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 200ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、２００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 300ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、３００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 400ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 500ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、５００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 600ng/ml 3h”はＣｐＧ−Ａと、６００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表す。
【図５】マウスｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣについて、リン酸化Ａｋｔタンパク質及びリン酸化ｍＴＯＲタンパク質等に対するウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す図である。左のレーンは、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したマウスｐＤＣの結果を表し、真ん中のレーンは、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表し、右のレーンは、ＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したマウスｐＤＣの結果を表す。
【図６】マウスｐＤＣにおけるＴＬＲ９、ＫＤＥＬ（小胞体のマーカー）、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を免疫蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図などである。上段は、ウイルスや細菌が細胞に感染したときの、ＴＬＲ９の局在の変化を示した模式図である。下段左パネルの左列はＴＬＲ９の緑色蛍光を表し、中央列はＫＤＥＬ（小胞体のマーカー）の赤色蛍光を表し、右列は対応する左列と中央列の蛍光を重ね合わせた蛍光を表し、上段列は“control”の場合の蛍光を表し、中段列は“CpG”の場合の蛍光を表し、下段列は“CpG＋geldanamycin”の場合の蛍光を表す。下段右パネルの左列はＴＬＲ９の緑色蛍光を表し、中央列はＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）の赤色蛍光を表し、右列は対応する左列と中央列の蛍光を重ね合わせた蛍光を表し、上段列は“control”の場合の蛍光を表し、中段列は“CpG”の場合の蛍光を表し、下段列は“CpG＋geldanamycin”の場合の蛍光を表す。
【図７】マウスｐＤＣのライセートを抗ＴＬＲ９抗体、又は、抗Ｈｓｐ９０抗体を用いて免疫沈降した物を電気泳動した後にウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。上段パネルは抗Ｈｓｐ９０抗体を用いた場合の結果を表し、中段パネル及び下段パネルは抗ＴＬＲ９抗体を用いた場合の結果を表す。また、各パネルの左列は“control”の場合の結果を表し、中央列は“CpGA”の場合の結果を表し、右列は“CpGA＋geldanamycin”の場合の結果を表す。
【図８】ヒトｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養した培養液中に含まれるインターフェロンα濃度を測定した結果を示す図である。“control”はＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM”はゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 200ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、２００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 400ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 600ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、６００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 800ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、８００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、“CpG A 3μM + geldanamycin 1000ng/ml”はＣｐＧ−Ａと、１０００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表す。
【図９】ヒトｐＤＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣについて、リン酸化Ａｋｔタンパク質及びリン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するウエスタンブロッティング解析を行った結果を示す図である。左のレーンは、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したヒトｐＤＣの結果を表し、真ん中のレーンは、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表し、右のレーンは、ＣｐＧ−Ａと、４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを添加して培養したヒトｐＤＣの結果を表す。
【図１０】ヒトｐＤＣにおけるＴＬＲ９、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を免疫蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図などである。左パネルの左列はＴＬＲ９の緑色蛍光を表し、中央列はＥＥＡ−１の赤色蛍光を表し、右列は対応する左列と中央列の蛍光を重ね合わせた蛍光を表し、上段列は“control”の場合の蛍光を表し、中段列は“CpG”の場合の蛍光を表し、下段列は“CpG＋geldanamycin”の場合の蛍光を表す。右パネルは、蛍光画像中のｐＤＣをランダムに１００個選択し、そのうち、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在しているｐＤＣを計測して、それらが共局在しているｐＤＣの割合（％）を示した図である。
【図１１】ヒトＰＢＭＣにＣｐＧ−Ａを添加して培養した後、さらにゲルダナマイシンを添加して培養した培養液中に含まれるインターフェロンα濃度を測定した結果を示す図である。“control”はＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したヒトＰＢＭＣの結果を表し、“CpG”はゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したヒトＰＢＭＣの結果を表し、“CpG + geldanamycin”はＣｐＧ−Ａと、ゲルダナマイシンを添加して培養したヒトＰＢＭＣの結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の「形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤」（以下、単に「本発明のインターフェロンα産生阻害剤」とも表示する。）や、本発明の「形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤」（以下、単に「本発明の移行阻害剤」とも表示する。）としては、Ｈｓｐ９０阻害物質を含有している限り特に制限されない。また、かかる本発明のインターフェロンα産生阻害剤や、本発明の移行阻害剤は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の予防・治療剤（以下、「本発明のＳＬＥ予防・治療剤」とも表示する。）としても用いることができる。これらの剤の作用機序の詳細は明らかではないが、Ｈｓｐ９０阻害物質が、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の、小胞体から初期エンドソームへの移行を抑制し、かかるＴＬＲ９が自己ＤＮＡを認識することを抑制し、インターフェロンα産生に重要なＡｋｔタンパク質やｍＴＯＲタンパク質を介するシグナル伝達を抑制することによって、インターフェロンα産生を阻害し、その結果、ＳＬＥに対する予防及び／又は治療効果が発揮されるものと考えられる。なお、本明細書において、「阻害」なる語と、「抑制」なる語は特に区別なく用いられる。
【００１８】
上記のＨｓｐ９０阻害物質とは、いずれかの哺乳動物のＨｓｐ９０の機能を阻害する物質を意味するが、かかるＨｓｐ９０の機能としては、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の、小胞体から初期エンドソームへの移行を介助する機能や、形質細胞様樹状細胞におけるＡｋｔタンパク質及び／又はｍＴＯＲタンパク質をリン酸化する機能を好適に例示することができる。上記のＨｓｐ９０阻害物質としては、Ｈｓｐ９０阻害物質である限り特に制限されないが、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体、及びエーテル体（以下、まとめて「ゲルダナマイシン等」とも表示する。）を好適に例示することができ、中でも、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、及び、それらの塩をより好適に例示することができる。また、Ｈｓｐ９０阻害物質を有効成分とする抗がん剤として、現在、ＫＷ−２４７８（American Association for Cancer Research, Published OnlineFirst on April 20, 2010, 10.1158/1078-0432.CCR-09-3112）の臨床試験が行われている。ＫＷ−２４７８では、Ｈｓｐ９０阻害物質として、2-{2-エチル-3,5-ジヒドロキシ-6-[3-メトキシ-4-(2-モルホリン-4-イルエトキシ)ベンゾイル]フェニル}-N,N-ビス(2-メトキシエチル)アセトアミド モノヒドロクロライドが用いられている。かかる物質は、医薬としての実用化の可能性が高いため、本発明に用いるＨｓｐ９０阻害物質として特に好適に例示することができる。本発明のインターフェロンα産生阻害剤や移行阻害剤やＳＬＥ予防・治療剤（以下、これらを３つまとめて「本発明の剤」とも表示する。）には、本発明に用いるＨｓｐ９０阻害物質を２種類以上併用してもよい。また、本発明におけるゲルダナマイシン等は市販のものを使用することができ、また、適宜エステル体やエーテル体とすることができる。
【００１９】
上記の哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。
【００２０】
ある物質がＨｓｐ９０阻害物質であるかどうかは、例えば、
哺乳動物（好ましくはヒト）の形質細胞様樹状細胞を、被検物質存在下で培養する工程Ａ；
前述の形質細胞様樹状細胞を刺激するＣｐＧ−Ａ存在下で培養する工程Ｂ；
前述の形質細胞様樹状細胞についてウエスタンブロッティングを行い、リン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ｍＴＯＲタンパク質のシグナル強度を検出する工程Ｃ；
工程Ｃにおいて検出したシグナル強度を、被検物質の非存在下において検出したシグナル強度と比較する工程Ｄ；
工程Ｃにおいて検出したシグナル強度が、被検物質の非存在下において検出したシグナル強度よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｅ；
を有する方法Ｘや、
哺乳動物（好ましくはヒト）の形質細胞様樹状細胞を、被検物質存在下で培養する工程Ａ；
前述の形質細胞様樹状細胞を刺激するＣｐＧ−Ａ存在下で培養する工程Ｂ；
培養液中のインターフェロンα濃度を測定する工程Ｃ’；
工程Ｃ’で測定したインターフェロンα濃度の測定値を、被検物質非存在下で培養した場合のインターフェロンα濃度の測定値と比較する工程Ｄ’；
工程Ｃ’で測定したインターフェロンα濃度の測定値が、被検物質非存在下で培養した場合の測定値よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｅ’；
を有する方法Ｙや、
ＳＬＥモデル哺乳動物に被検物質を投与する工程Ｆ；
ＳＬＥモデル哺乳動物から血清を採取し、血清中の抗ＤＮＡ抗体濃度を測定する工程Ｇ；
工程Ｇで測定した抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値を、被検物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値と比較する工程Ｈ；
工程Ｇで測定した抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値が、被検物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｉ；
を有する方法Ｚや、
哺乳動物（好ましくはヒト）の形質細胞様樹状細胞を、被検物質存在下で培養する工程Ａ；
前述の形質細胞様樹状細胞を刺激するＣｐＧ−Ａ存在下で培養する工程Ｂ；
前述の形質細胞様樹状細胞において、ＴＬＲ９が初期エンドソームに局在する割合を測定する工程Ｃ”；
工程Ｃ”において測定した割合を、被検物質の非存在下において測定した割合と比較する工程Ｄ”；
工程Ｃ”において測定した割合が、被検物質の非存在下において測定した割合よりも低い場合に、その被検物質をＨｓｐ９０阻害物質と評価する工程Ｅ”；
を有する方法Ｖ等により、容易に確認することができる。
【００２１】
前述の哺乳動物の形質細胞様樹状細胞は、例えば、かかる形質細胞様樹状細胞特異的な抗体等を用いて、哺乳動物の末梢血から分離、精製することができる。また、前述のリン酸化Ａｋｔタンパク質や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質の検出は、リン酸化Ａｋｔタンパク質に対する特異的抗体や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対する特異的抗体等を利用して行うことができる。また、前述のインターフェロンα濃度の測定は、そのインターフェロンαに特異的な抗体を含む市販のキット等を用いて、ＥＬＩＳＡ法により行うことができる。また、ＳＬＥモデル哺乳動物は、公知のものや、市販のものを利用することができる。さらに、抗ＤＮＡ抗体濃度の測定は、ＥＬＩＳＡ法により行うことができる。また、形質細胞様樹状細胞において、ＴＬＲ９が初期エンドソームに局在する割合の測定は、形質細胞様樹状細胞を抗ＴＬＲ９抗体又は抗ＥＥＡ−１抗体で蛍光染色し、抗ＴＬＲ９抗体の蛍光と抗ＥＥＡ−１抗体の蛍光とが共局在している形質細胞様樹状細胞の割合を測定すること等により行うことができる。
【００２２】
本発明の剤は、所望の「インターフェロンα抑制効果」や、所望の「形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行抑制効果（以下、単に「移行抑制効果」とも表示する。）や、所望の「ＳＬＥの予防・治療効果」が得られる限り、前述のＨｓｐ９０阻害物質の他に、他のインターフェロンα産生阻害剤や、他の移行阻害剤や、他のＳＬＥの予防・治療剤等の任意成分を含んでいてもよい。
【００２３】
Ｈｓｐ９０阻害物質のインターフェロンα産生阻害効果は、例えば、前述の方法Ｙにおいて、工程Ｃ’で測定したインターフェロンα濃度の測定値が、被検物質非存在下で培養した場合の測定値と比較して低下した程度を調べることによって算出することができる。また、Ｈｓｐ９０阻害物質の移行抑制効果は、例えば、前述の方法Ｖにおいて、工程Ｃ”において測定した割合が、被検物質の非存在下において測定した割合と比較して低下した程度を調べることによって算出することができる。さらに、Ｈｓｐ９０阻害物質のＳＬＥの予防・治療効果は、例えば、前述の方法Ｚにおいて、工程Ｇで測定した抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値が、被検物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体濃度の測定値と比較して低下した程度を調べることによって算出することができる。
【００２４】
本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質のインターフェロンα産生阻害効果の好適な程度としては、Ｈｓｐ９０阻害物質を６００ｎｇ／ｍｌ含む培養液にて、ヒトの形質細胞様樹状細胞を３時間培養し、次いで、ＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、添加してから２４時間後に測定した培養液中のインターフェロンα濃度が、該Ｈｓｐ９０阻害物質を添加しなかった場合のインターフェロンα濃度に対して、割合として好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上低下することを例示することができる。
【００２５】
本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質の移行抑制効果の好適な程度としては、Ｈｓｐ９０阻害物質を４００ｎｇ／ｍｌ含む培養液にて、ヒトの形質細胞様樹状細胞を３時間培養し、次いで、ＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、添加してから２４時間後に測定した培養液から分離した形質細胞様樹状細胞のうち、抗ＴＬＲ９抗体の蛍光と抗ＥＥＡ−１抗体の蛍光とが共局在している形質細胞様樹状細胞の割合（％）が、該Ｈｓｐ９０阻害物質を添加しなかった場合のその割合（％）に対して、割合として好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上低下することを例示することができる。
【００２６】
また、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質のＳＬＥの予防・治療効果の好適な程度としては、２１週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Jackson Laboratory社製）に、０．１２５ｍｇ／ｄａｙのＨｓｐ９０阻害物質を５０日間連続して経口投与した後に採取した血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度が、Ｈｓｐ９０阻害物質非投与の場合の抗ＤＮＡ抗体の濃度に対して、割合として好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上低下することを例示することができる。
【００２７】
本発明の剤に含有されるＨｓｐ９０阻害物質は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、優れたインターフェロンα産生効果や、移行抑制効果や、ＳＬＥの予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＨｓｐ９０阻害物質を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００２８】
本発明の剤の投与方法としては、所望のインターフェロンα産生阻害効果や、所望の移行抑制効果や、所望のＳＬＥの予防・治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を例示することができる。また本発明の剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができる。
【００２９】
本発明のＳＬＥ予防・治療剤が対象とする疾患としては全身性エリテマトーデスである限り特に制限されない。また、本発明の剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明の剤に含有されるＨｓｐ９０阻害物質が阻害作用を発揮するＨｓｐ９０の由来である哺乳動物の種類は、本発明の剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、より安定して優れたインターフェロンα産生阻害効果や、移行抑制効果や、ＳＬＥの予防・治療効果を得る観点から、好ましい。
【００３０】
なお、本発明の他の態様として、本発明のインターフェロンα産生阻害剤、移行阻害剤、又は、ＳＬＥ予防・治療剤の製造における、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質の使用；や、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質を、本発明のインターフェロンα産生阻害剤、移行阻害剤、又は、ＳＬＥ予防・治療剤に使用する方法；や、ＳＬＥの予防・治療における、本発明におけるＨｓｐ９０阻害物質の使用；や、本発明のインターフェロンα産生阻害剤を対象に投与することにより、対象の形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生を阻害する方法；や、本発明の移行阻害剤を対象に投与することにより、対象の形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行を抑制する方法；や、本発明のＳＬＥ予防・治療剤を対象に投与することにより、対象のＳＬＥを予防・治療する方法；も例示することができる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。また、本発明の移行阻害剤は、形質細胞様樹状細胞におけるＨｓｐ９０とＴＬＲ９の分子会合阻害剤としても利用することができる。
【００３１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【実施例１】
【００３２】
［ＳＬＥ発症モデルマウスに対するＨｓｐ９０阻害物質の投与アッセイ］
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ＳＬＥに対してどのような効果を発揮するかを調べるために、以下のようなアッセイを行った。
【００３３】
まず、ＳＬＥ発症モデルマウスであるＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Jackson Laboratory社製）を用意し、２１週齢になるまで生育させた。これらのマウスを２つのグループに分けて、一方のグループをゲルダナマイシン処理群とし、他方をコントロール群とした。そして、ゲルダナマイシン処理群のマウスには、０．１２５ｍｇ／ｄａｙの１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン塩酸塩（17-dimethyl aminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride:１７−ＤＭＡＧ）を、５０日間連続して経口投与し、コントロール群のマウスにはＰＢＳを同様に投与した。投与終了後、両群のマウスから腎臓を取り出し、腎臓組織の凍結切片を作製した。以下、作製したこれらの凍結切片を凍結切片Ｘとも表示する。
【００３４】
これらの凍結切片Ｘをヘマトキシリン・エオシン染色した後、光学顕微鏡で観察して得られた腎臓組織所見を図１に示す。図１Ｂは、ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの腎臓組織所見を示し、図１Ａは、コントロール群（control）のマウスの腎臓組織所見を示す。コントロール群のマウスの腎臓組織（図１Ａ）では、糸球体基底膜は明らかに肥厚し、半月体形成を示す糸球体が目立ったのに対し、ゲルダナマイシン処理群のマウスの腎臓組織（図１Ｂ）では、糸球体基底膜肥厚の改善、半月体形成の抑制が明らかに認められ、著明な組織学的改善を認めた。
【００３５】
また、前述の投与終了後の両群のマウスにおけるＩｇＧの腎糸球体基底膜への沈着の程度を調べるために、前述の凍結切片Ｘを、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色した後、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図２に示す。図２Ｃは、ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの腎臓組織切片の蛍光画像を表し、図２Ｄは、図２Ｃの一部を拡大した蛍光画像を表す。また、図２Ａは、コントロール群（control）のマウスの腎臓組織切片の蛍光画像を表し、図２Ｂは、図２Ａの一部を拡大した蛍光画像を表す。コントロール群のマウスの腎臓組織（図２Ａ及びＢ）では、腎糸球体基底膜への厚いＩｇＧ沈着が見られたのに対し、ゲルダナマイシン処理群のマウスの腎臓組織（図２Ｃ及びＤ）では、明らかにＩｇＧ沈着が軽度で、腎糸球体基底膜の肥厚も軽度であった。
【００３６】
さらに、前述の投与終了後の両群のマウスにおける脾腫の程度を調べるために、前述の投与終了後の両群のマウスから脾臓を取り出した。両群のマウスの脾臓の所見を図３Ａに示し、皮膚の所見を図３Ｂに示す。ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの脾臓（図３Ａ左）は、コントロール群（control）のそれ（図３Ａ右）と比較してサイズが小さく、脾腫は明らかに改善していた。また、皮膚に関して言えば、コントロール群のマウス（図３Ｂ右）では、眼瞼周囲の紅斑が明らかに認められたのに対し、ゲルダナマイシン処理群のマウス（図３Ｂ左）ではその紅斑は非常に軽度であった。
【００３７】
また、前述の投与終了後の両群のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体濃度を調べるために、前述の投与終了後の両群のマウスから血清を採取し、血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度をＥＬＩＳＡ（Mouse Anti ds ELISA KIT（AKRDD-061,Shibayagi（Gunma,Japan））で測定した。その結果を図３Ｃに示す。ＳＬＥでは血清中の抗ＤＮＡ抗体が高濃度になることが知られているが、ゲルダナマイシン処理群（geldanamycin treated）のマウスの血清中の抗ＤＮＡ抗体の濃度は、コントロール群（control）のそれと比較して明らかに低下していた（図３Ｃ）。
【００３８】
図１〜図３の結果から、Ｈｓｐ９０阻害物質である１７−ＤＭＡＧの経口投与によって、明らかにＳＬＥによる腎病変、皮膚病変の改善が認められた。また、ＳＬＥの活動度の指標となる抗ＤＮＡ抗体についても、明らかに低値を示した。これらの結果は、ＳＬＥの治療薬としてＨｓｐ９０阻害物質が有効であることを示すものである。
【実施例２】
【００３９】
［マウスの形質細胞様樹状細胞を用いたＨｓｐ９０阻害アッセイ］
Ｈｓｐ９０阻害物質による効果とその作用機序を検討するために、以下のようなアッセイを行った。
【００４０】
（１）インターフェロンα測定アッセイ
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの骨髄細胞を、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；５μｇ／ｍｌ）を用いて培養し、培養から５日目に、ｐＤＣ特異的な単クローン抗体ｍＰＤＣＡ１を用いて、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を分離、精製し、精製ｐＤＣを得た。Ｈｓｐ９０阻害物質であるゲルダナマイシンを各種濃度（１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、又は、６００ｎｇ／ｍｌ）で含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、培養を継続した。２４時間後に、培養液を採取し、これらの培養液中に含まれるインターフェロンα濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したもの（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したもの（CpG-A 3μM）についても、同様に、インターフェロンα濃度を測定した。これらの結果を図４に示す。
【００４１】
図４の結果から分かるように、ＣｐＧ−Ａの添加によって誘導されたインターフェロンα産生は、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に抑制された。なお、Ｈｓｐ９０阻害物質として、ゲルダナマイシンに代えて、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン（17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin：１７−ＡＡＧ）、又は、１７−ＤＭＡＧを用いて同様のアッセイを行ったところ、１７−ＡＡＧや１７−ＤＭＡＧを用いた場合も、ゲルダナマイシンを用いた場合と同様に、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に、インターフェロンα産生が抑制されることが示された。
【００４２】
（２）シグナル伝達分子に関するウエスタンブロッティング解析
ＣｐＧ−ＡによるｐＤＣからのインターフェロンα産生には、シグナル伝達分子であるＡｋｔタンパク質及びｍＴＯＲタンパク質のリン酸化が重要であることが知られている。そこで、ｐＤＣにおけるこれらの分子のリン酸化をウエスタンブロッティング法（イムノブロット法）により解析することとした。
【００４３】
前述の実施例２の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣを分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG-A 3μM）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣ（それぞれ約１×１０６cellずつ）からライセートを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動を行った。このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をメンブレンに転写し、次いで、かかるメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした。その後、メンブレンに各種の１次抗体を反応させてから、メンブレンを洗浄した。１次抗体としては、Ａｋｔタンパク質に対する抗体、４７３番目のセリンがリン酸化されたＡｋｔタンパク質に対する抗体、３０８番目のスレオニンがリン酸化されたＡｋｔタンパク質に対する抗体、ｍＴＯＲタンパク質に対する抗体、リン酸化されたｍＴＯＲタンパク質に対する抗体、又は、β−アクチンに対する抗体をそれぞれ用いた。洗浄したメンブレンに、１次抗体を認識する標識２次抗体を反応させて、各種の１次抗体のシグナルを検出した。その結果を図５に示す。
【００４４】
図５の結果から分かるように、左のレーン（control）や真ん中のレーン（CpG-A 3μM）などのコントロール群のｐＤＣでは、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）が認められたのに対して、ゲルダナマイシン処理したｐＤＣ（右のレーン：Geldanamycin 400ng/ml）では、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）の低下が認められ、それらの分子のリン酸化が抑制されたことが示された。
【００４５】
（３）ｐＤＣにおけるＴＬＲ９等の蛍光アッセイ
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９の局在に影響を与えるかどうかを調べるために、以下のような蛍光アッセイを行うこととした。
【００４６】
前述の実施例２の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣ（CpG＋geldanamycin）を分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣにおいて蛍光色素ラベルしたＴＬＲ９、ＫＤＥＬ（小胞体のマーカー）、及び、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を蛍光顕微鏡で観察した結果を図６の下段に示す。なお、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＫＤＥＬ又はＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在すると、黄色の蛍光が確認される。
【００４７】
コントロールでは、ＴＬＲ９はほとんどが小胞体（Endoplasmic Reticulum: ＥＲ）に存在し、初期エンドソーム（Early endosome）では見られなかった（図６下段の左パネル及び右パネルの上段列（control））が、ＣｐＧ−Ａを添加培養したｐＤＣでは、ＴＬＲ９が小胞体から初期エンドソームに移動したことが示された（図６下段の左パネル及び右パネルの中段列（CpG））。これに対し、あらかじめゲルダナマイシン処理をしたｐＤＣでは、ＣｐＧ−Ａを添加培養しても、ＴＬＲ９は小胞体にとどまっており、初期エンドソームへの移行が抑制された（図６下段の左パネル及び右パネルの下段列（CpG＋geldanamycin））。これらの結果から、Ｈｓｐ９０は、ＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行の際の、分子シャペロンとして働いていると考えられた。
【００４８】
（４）ＴＬＲ９とＨｓｐ９０の免疫沈降
前述の実施例２の（３）の結果を踏まえて、ＴＬＲ９とＨｓｐ９０の分子会合の有無を調べるために、以下のような免疫沈降を行うこととした。
【００４９】
前述の実施例２の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣ（CpGA＋geldanamycin）を分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpGA）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣからそれぞれライセートを調製し、抗ＴＬＲ９抗体、又は、抗Ｈｓｐ９０抗体を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動した後にウエスタンブロッティングを行った結果を図７に示す。
【００５０】
図７の結果から分かるように、Ｈｓｐ９０とＴＬＲ９は分子会合しており（上段パネル及び中段パネルの中央列（CpGA））、その分子会合はゲルダナマイシンで抑制されることが示された（上段パネル及び中段パネルの右列（CpGA＋geldanamycin））。
【実施例３】
【００５１】
［ヒトの形質細胞様樹状細胞を用いたＨｓｐ９０阻害アッセイ］
前述の実施例２では、マウスの形質細胞様樹状細胞を用いたアッセイを行った。そこで、ヒトの形質細胞様樹状細胞を用いた場合についても、Ｈｓｐ９０阻害物質による効果とその作用機序を検討するために、以下のようなアッセイを行った。
【００５２】
（１）インターフェロンα測定アッセイ
まず、ヒト末梢血を用意した。このヒト末梢血から、ｐＤＣ特異的な単クローン抗体ＢＤＣＡ−４を用いて、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を分離、精製し、精製ｐＤＣを得た。Ｈｓｐ９０阻害物質であるゲルダナマイシンを各種濃度（２００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ）で含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、培養を継続した。２４時間後に、培養液を採取し、これらの培養液中に含まれるインターフェロンα濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したもの（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したもの（CpG-A 3μM）についても、同様に、インターフェロンα濃度を測定した。これらの結果を図８に示す。
【００５３】
図８の結果から分かるように、ＣｐＧ−Ａの添加によって誘導されたインターフェロンα産生は、ヒトｐＤＣにおいても、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に抑制された。なお、Ｈｓｐ９０阻害物質として、ゲルダナマイシンに代えて、１７−ＡＡＧ、又は、１７−ＤＭＡＧを用いて同様のアッセイを行ったところ、１７−ＡＡＧや１７−ＤＭＡＧを用いた場合も、ゲルダナマイシンを用いた場合と同様に、Ｈｓｐ９０阻害物質濃度依存性に、インターフェロンα産生が抑制されることが示された。
【００５４】
（２）シグナル伝達分子に関するウエスタンブロッティング解析
前述の実施例３の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣを分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG-A 3μM）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣ（それぞれ約１×１０６cellずつ）からライセートを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動を行った。このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をメンブレンに転写し、次いで、かかるメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした。その後、メンブレンに各種の１次抗体を反応させてから、メンブレンを洗浄した。１次抗体としては、３０８番目のスレオニンがリン酸化されたＡｋｔタンパク質に対する抗体、Ａｋｔタンパク質に対する抗体、又は、リン酸化されたｍＴＯＲタンパク質に対する抗体をそれぞれ用いた。洗浄したメンブレンに、１次抗体を認識する標識２次抗体を反応させて、各種の１次抗体のシグナルを検出した。その結果を図９に示す。
【００５５】
図９の結果から分かるように、左のレーン（control）や真ん中のレーン（CpG-A 3μM）などのコントロール群のｐＤＣでは、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）が認められたのに対して、ゲルダナマイシン処理したｐＤＣ（右のレーン：Geldanamycin 400ng/ml）では、３０８位におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質に対するシグナル（Phospho-Akt(Thr308)）や、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質に対するシグナル（Phospho-mTOR）の低下が認められ、それらの分子のリン酸化が抑制されたことが示された。この結果は、マウスｐＤＣを用いた前述の実施例２（２）のウエスタンブロッティング解析の結果と同様であった。
【００５６】
（３）ｐＤＣにおけるＴＬＲ９等の蛍光アッセイ
前述の実施例２の（３）において、あらかじめゲルダナマイシン処理をしたマウスｐＤＣでは、ＣｐＧ−Ａを添加培養しても、ＴＬＲ９は小胞体にとどまっており、初期エンドソームへの移行が抑制することが示された。この現象が、ヒトｐＤＣでも生じるかを確認するために、以下のような蛍光アッセイを行うこととした。
【００５７】
前述の実施例３の（１）と同じ方法で、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加して１５分間培養した後、培養液からｐＤＣを分離した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したｐＤＣ（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したｐＤＣ（CpG-A 3μM）についても、同様に分離した。分離したこれらの各ｐＤＣにおいて蛍光色素ラベルしたＴＬＲ９、ＥＥＡ−１（初期エンドソームのマーカー）を蛍光顕微鏡で観察した結果を図１０の左パネルに示す。なお、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在すると、黄色の蛍光が確認される。また、蛍光画像中のｐＤＣをランダムに１００個選択し、そのうち、ＴＬＲ９（緑色蛍光）と、ＥＥＡ−１（赤色蛍光）とが共局在しているｐＤＣを計測して、それらが共局在しているｐＤＣの割合（％）を図１０の右パネルに示す。
【００５８】
図１０の左パネル及び右パネルから分かるように、ヒトｐＤＣでも、ＣｐＧ−Ａの添加培養により、ＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行が生じ（図１０左パネルの中段列（CpG））、その移行はゲルダナマイシンにより抑制されることが示された。これらの結果から、ヒトｐＤＣにおいても、Ｈｓｐ９０は、ＴＬＲ９の小胞体から初期エンドソームへの移行の際の、分子シャペロンとして働いていると考えられた。
【００５９】
［実施例１〜３の結果のまとめ］
前述の実施例２や３の結果から分かるように、Ｈｓｐ９０阻害物質の投与により、マウスｐＤＣやヒトｐＤＣからのインターフェロンα産生が抑制された。そして、これは、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９の、小胞体から初期エンドソームへの移行が抑制され、かかるＴＬＲ９が自己ＤＮＡを認識することが抑制されることや、インターフェロンα産生に重要なＡｋｔタンパク質やｍＴＯＲタンパク質を介するシグナル伝達が抑制されることによることが示された。また、前述の実施例１におけるＳＬＥマウスモデルの結果と総合すると、Ｈｓｐ９０阻害物質によってＳＬＥの病態が改善した機序の１つは、Ｈｓｐ９０阻害物質によりｐＤＣからのインターフェロンα産生が抑制されたことによるものと考えられた。
【実施例４】
【００６０】
［ヒトの末梢血単核球を用いたＨｓｐ９０阻害アッセイ］
前述の実施例３では、ヒトの形質細胞様樹状細胞を用いたアッセイを行った。そこで、ヒトの未成熟形質細胞様樹状細胞を含む末梢血単核球（ＰＢＭＣ）についても、インターフェロンα測定アッセイを行った。
【００６１】
（１）インターフェロンα測定アッセイ
まず、ヒト末梢血を用意した。このヒト末梢血から、ｐＤＣ特異的な単クローン抗体ＢＤＣＡ−４を用いて、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を分離、精製し、精製ｐＤＣを得た。４００ｎｇ／ｍｌのゲルダナマイシンを含む培養液にて、あらかじめ、前述の精製ｐＤＣを３７℃で３時間培養した。次いで、ｐＤＣを刺激するＣｐＧ−Ａ（３μＭ）を培養液に添加し、培養を継続した。２４時間後に、培養液を採取し、これらの培養液中に含まれるインターフェロンα濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、コントロールとして、ＣｐＧ−Ａもゲルダナマイシンも添加せずに培養したもの（control）や、ゲルダナマイシンを添加せず、ＣｐＧ−Ａを添加して培養したもの（CpG-A）についても、同様に、インターフェロンα濃度を測定した。これらの結果を図１１に示す。
【００６２】
図１１の結果から分かるように、ＣｐＧ−Ａの添加によって誘導されたインターフェロンα産生は、ヒトｐＤＣを含むヒトＰＢＭＣにおいても、Ｈｓｐ９０阻害物質により抑制された。このように、Ｈｓｐ９０阻害物質はｐＤＣを含む末梢血に作用して、ＣｐＧ−Ａによるインターフェロンα産生を抑制する効果を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤の分野や、形質細胞様樹状細胞におけるＡｋｔタンパク質又はｍＴＯＲタンパク質のリン酸化抑制剤の分野や、全身性エリテマトーデスの予防・治療の分野に好適に例示することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤。
【請求項２】
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のインターフェロンα産生阻害剤。
【請求項３】
Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤。
【請求項４】
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の移行阻害剤。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載のインターフェロンα産生阻害剤、又は、請求項３若しくは４に記載の移行阻害剤を含有する全身性エリテマトーデスの予防・治療剤。
【請求項１】
Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンα産生阻害剤。
【請求項２】
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のインターフェロンα産生阻害剤。
【請求項３】
Ｈｓｐ９０阻害物質を含有することを特徴とする、形質細胞様樹状細胞におけるＴＬＲ９の初期エンドソームへの移行阻害剤。
【請求項４】
Ｈｓｐ９０阻害物質が、ゲルダナマイシン、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−アリルアミノ−デメトキシゲルダナマイシン、並びに、それらの塩、エステル体及びエーテル体からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の移行阻害剤。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載のインターフェロンα産生阻害剤、又は、請求項３若しくは４に記載の移行阻害剤を含有する全身性エリテマトーデスの予防・治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−７２０９７（Ｐ２０１２−７２０９７Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１９４２２（Ｐ２０１０−２１９４２２）
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【Ｆターム（参考）】
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