インターフェロンに対する感受性又は応答性を予測する方法、キット及びマーカー遺伝子
【課題】ＩＦＮ投与を必要としている患者及び被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法であって、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、上記被検細胞が、ＩＦＮ非感受性若しくはＩＦＮ非応答性の細胞、又は、ＩＦＮ感受性若しくはＩＦＮ応答性の細胞、であると予測する予測ステップと、を備える方法を提供する。
【解決手段】本発明は、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法であって、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、上記被検細胞が、ＩＦＮ非感受性若しくはＩＦＮ非応答性の細胞、又は、ＩＦＮ感受性若しくはＩＦＮ応答性の細胞、であると予測する予測ステップと、を備える方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロンに対する感受性又は応答性を予測する方法、キット及びマーカー遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者の個人差を考慮した医療、すなわち個別化医療が重要視されており、患者に対する薬剤の効果を予測する方法が積極的に探索されている。患者の薬剤に対する感受性又は応答性を薬剤の投与前や投与初期に予測してから薬剤を投与していくことは、薬剤の有効性や有用性を高めるだけでなく、無意味な薬剤投与を控えて治療費用を節減し、さらには副作用を回避する面からも重要である。
【０００３】
肝癌とは、肝内に発生する悪性腫瘍をいい、肝臓で原発性に発生する肝細胞癌と、肝外臓器で発生して肝内に転移した肝転移肝癌とに大別される。肝癌患者の９０％以上は肝炎ウィルスの感染者であり、肝癌の発症リスクを有するウィルス性肝炎患者の数は、日本全国で３００万人ともいわれている。
【０００４】
インターフェロン（以下、ＩＦＮ）は、Ｃ型慢性肝炎や肝硬変に対するウィルス駆除剤として使用されている。ＩＦＮ投与によるウィルス駆除療法は、ウィルス駆除又は肝機能改善効果を示すばかりか、結果的にＣ型慢性肝炎・肝硬変から肝癌への移行を抑制することが明らかとなっているため、Ｃ型慢性肝炎及び肝硬変に対してＩＦＮを積極的に使用することが推奨されている。このＩＦＮ投与による肝癌発生の抑制メカニズムとしては、極初期の不顕性な段階にある肝癌細胞に対してＩＦＮが直接的に増殖抑制作用を示すことが寄与すると考えられている。実際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ＩＦＮは肝癌細胞の増殖を抑制することが知られており、肝癌の発生又は進行を抑える治療剤としての効果も認められつつある。
【０００５】
ＩＦＮの投与前に患者のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法としては、Ｃ型肝炎患者から採取した肝細胞におけるＪＡＫ結合タンパク質遺伝子又はＣＩＳ３遺伝子の発現量を測定する方法（特許文献１）が報告され、肝癌におけるＩＦＮ及び５−ＦＵの併用療法に対する感受性又は応答性を予測する方法としては、ＩＦＮＡＲ２遺伝子の発現を解析対象とする方法（非特許文献１）が報告されている。
【０００６】
一方、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４（ＫＬＦ４と略される。）は、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ（ＫＬＦと略される。）ファミリーに属する転写因子であり、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＺＦと略される。）やＧｕｔ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＧＫＬＦと略される。）とも呼ばれるタンパク質である。ＫＬＦ４は、細胞の成長、増殖、分化及び胚発生において様々な制御を行っていることが知られ（非特許文献２）、消化管癌及び白血病では腫瘍抑制因子として働くことを示唆する報告（非特許文献３〜５）、乳癌（非特許文献６）及び口腔扁平上皮細胞癌（非特許文献７）では癌の進行期に発現量が増加することを示す報告、早期浸潤乳管癌においては悪性表現型のマーカー遺伝子であるとする報告（非特許文献８）がなされているが、その機能の詳細や癌の増殖における役割については未だ明らかになっていない。
【０００７】
Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＦ２ＢＰと略される。）は、熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を制御する転写因子であるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２に結合して相互作用をするタンパク質であるが、その機能の詳細については明らかになっていない（非特許文献９）。
【０００８】
Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２（ＡＮＫＲＤ１２と略される。）は、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ ２（ＡＮＣＯ２と略される。）又はＫＩＡＡ０８７４とも呼ばれるタンパク質であるが、その機能についてはほとんど明らかになっていない（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１２５６８３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎａｇａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ、２００７年、第１１０巻、ｐ．２４９３−２５０１
【非特許文献２】Ｇｈａｌｅｂら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ.、２００５年、第１５巻、第２号、ｐ．９２−９６
【非特許文献３】Ｄａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００３年、第２２巻、第２２号、ｐ．３４２４−３４３０
【非特許文献４】Ｗｅｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２００５年、第６５巻、第７号、ｐ．２７４６−２７５４
【非特許文献５】Ｙａｓｕｎａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２００４年、第６４巻、第１７号、ｐ．６００２−６００９
【非特許文献６】Ｆｏｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２０００年、第６０巻、第２２号、ｐ．６４８８−６４９５
【非特許文献７】Ｆｏｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ.、１９９９年、第１０巻、第６号、ｐ．４２３−４３４
【非特許文献８】Ｐａｎｄｙａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２００４年、第１０巻、第８号、ｐ．２７０９−２７１９
【非特許文献９】Ｙｏｓｈｉｍａら、Ｇｅｎｅ、１９９８年、第２１４巻、ｐ．１３９−１４６
【非特許文献１０】Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．、１９９８年、第５巻、ｐ．３５５−３６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ＩＦＮの投与はすべてのＣ型慢性肝炎患者、肝硬変患者及び肝癌患者に対してその効果を示すわけではなく、重篤な副作用を伴う可能性もあることから、ＩＦＮに対する感受性又は応答性の低い患者、すなわちＩＮＦ非感受性又は非応答性の患者に対するＩＦＮの投与は慎重にすべきであると考えられる。
【００１２】
また、現在、ＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法で明確な判定基準のある方法はないため、臨床の現場において、患者へのＩＦＮの投与前に適用可能な新たな方法の開発が必要であると考えられる。
【００１３】
そこで本発明は、ＩＦＮの投与を必要としている患者及び被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、肝癌細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２の発現量と、ＩＦＮによる肝癌細胞の増殖抑制効果に相関があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）に記載した、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法を提供する。
（１） 被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法であって、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおける、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４（以下、ＫＬＦ４）遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＨＳＦ２ＢＰ）遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２（以下、ＡＮＫＲＤ１２）遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測する予測ステップと、を備える方法。
（ａ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（２） 上記被検細胞は、ヒト由来の癌細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３） 上記癌細胞は、肝癌細胞である、上記（２）に記載の方法。
（４） 上記ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 上記Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮβ又はＩＦＮαである、上記（４）に記載の方法。
（６） 下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含む、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するキット。
（ｇ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 上記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
（７） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するマーカー遺伝子。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、患者から採取した被検細胞におけるマーカー遺伝子であるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量を測定し、対照細胞におけるそれらの発現量と比較することによって、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４のｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）の相関を表すグラフである。
【図２】ヒト肝癌細胞におけるＨＳＦ２ＢＰのｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）の相関を表すグラフである。
【図３】ヒト肝癌細胞におけるＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）の相関を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法は、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおける、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測する予測ステップと、を備えることを特徴としている。
（ａ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
【００１９】
「ＩＦＮに対する感受性又は応答性」とは、細胞においてＩＦＮの刺激又は作用により反応又は効果が誘発され得る性質や、細胞のＩＦＮ受容性をいう。ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞とは、ＩＦＮ受容性が高く、ＩＦＮにより反応又は効果が誘発される細胞のことをいい、ＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞とは、ＩＦＮ受容性がないか又は低く、ＩＦＮにより反応又は効果が誘発されない又は誘発されても十分ではない細胞のことをいう。
【００２０】
ＩＦＮの刺激又は作用により誘発される反応又は効果としては、例えば、抗ウィルス効果や癌細胞の増殖抑制効果が挙げられる。
【００２１】
「被検細胞」とは、患者の罹患部位から採取した細胞をいうが、癌患者から採取した癌細胞、すなわちヒト由来の癌細胞であることが好ましく、肝癌患者から採取した肝癌細胞であることがより好ましい。
【００２２】
被検細胞としては、例えば癌細胞のような病巣となる細胞が、正常細胞の一部に含まれる状態のものであってもよいが、できるだけ正常細胞を除去した細胞であることが好ましい。
【００２３】
「対照細胞」とは、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量と、ＩＦＮに対する感受性又は応答性の関係が既知である細胞をいい、ＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であるヒト肝癌細胞株のＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞又はＨｅｐ３Ｂ細胞から選択されるのが好ましい。
【００２４】
一方で、ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞を対照細胞とするのであれば、ヒト肝癌細胞株であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が好ましい。
【００２５】
被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量の測定としては、被検細胞における該ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定すればよいが、該ｍＲＮＡの発現量を測定することが好ましい。
【００２６】
細胞におけるｍＲＮＡの発現量の測定は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法等、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）で測定することができるが、ＲＴ−ＰＣＲ法で測定することが好ましい。
【００２７】
ＲＴ−ＰＣＲ法とは、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出し、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）する方法をいうが、ＰＣＲとしてはリアルタイムＰＣＲが好ましい。また、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列は既に公知であるため、ＰＣＲする場合は、該ＤＮＡ塩基配列に基づいてプライマーを適宜設定することができる。このプライマーとしては、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列を増幅するものが好ましい。
【００２８】
ＰＣＲについては、ＰＣＲ増幅産物の収率及び特異性が最適化された反応条件を選択可能であるが、重要な反応パラメータとしては、例えば、プライマーの長さ及び塩基配列、アニーリング及び伸長工程の温度並びに反応時間、Ｍｇイオン濃度又は塩濃度が挙げられる。
【００２９】
ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法としては、例えば、サザンブロット法、ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料を用いるＤＮＡマイクロアレイ法、又は、細胞からＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡをポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせるノーザンブロット法若しくはＲＮａｓｅプロテクションアッセイが挙げられるが、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ又はＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列に特異的な配列をポリヌクレオチドプローブとして設計する必要がある。ここで、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列かどうかは、ＢＬＡＳＴ解析により確認することができる。
【００３０】
また、ｍＲＮＡの発現量の測定において標準化のために用いるハウスキーピング遺伝子としては、例えば、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ又はＧ３ＰＤＨと略される。）、β−アクチン又はβ２−マイクログロブリンあるいはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３１】
タンパク質の発現量の測定は、細胞をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで溶解後、抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又はウェスタンブロッティング等、公知の方法で測定することが出来る。
【００３２】
タンパク質の発現量の測定には特異的抗体が必要であるが、特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも構わない。ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列は既に公知であるため、これらのタンパク質の特異的抗体は、これらのタンパク質を抗原として用い、公知の抗体又は抗血清の製造方法で製造することができる。以下に、これらの製造方法を例示する。
【００３３】
モノクローナル抗体産生細胞の製造においては、まず、抗原で免疫された温血動物を準備する。抗原で免疫された温血動物は、抗原となるタンパク質を、温血動物の抗体産生が可能な部位に投与することで得られる。抗原となるタンパク質は単独で投与してもよいし、担体又は希釈剤とともに投与しても構わない。また、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント等のアジュバントを同時に投与してもよい。
【００３４】
抗原となるタンパク質は、通常、２〜６週毎に１回ずつの頻度で、計２〜１０回程度投与する。抗原となるタンパク質を投与する温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ又はニワトリが挙げられるが、マウス又はラットが好ましい。
【００３５】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、すなわちモノクローナル抗体産生細胞は、抗原で免疫された温血動物、すなわち抗体価の認められた温血動物から、抗原となるタンパク質の最終投与より２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることによって製造することができる。なお、温血動物の抗血清中の抗体価の測定方法としては、例えば、標識化ペプチドと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識化ペプチドの活性を測定する方法が挙げられる。
【００３６】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、公知の方法（ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、ｐ．２５６−４９５）で融合させることができる。融合に用いる融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）又はセンダイウィルスなどが挙げられるが、ＰＥＧが好ましく、ＰＥＧ１０００又はＰＥＧ６０００がより好ましい。また、融合促進剤は１０〜８０％の濃度で添加されることが好ましい。
【００３７】
異種動物の骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ＳＰ２／０細胞、ＡＰ−１細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１細胞が好ましい。融合に用いる抗体産生細胞の数と骨髄腫細胞の数の比率は、１：１〜２０：１が好ましい。インキュベート温度は、２０〜４０℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。また、インキュベート時間は、１〜１０分間が好ましい。
【００３８】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法としては、例えば、ペプチド抗原を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを加えて、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法、又は、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法が挙げられる。
【００３９】
モノクローナル抗体は、自体公知又はそれに準じる方法で選別できるが、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）を添加した動物細胞用培地が用いられる。動物細胞用培地としては、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが生育できれば特に限定はないが、例えば、牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１；日水製薬（株））が挙げられる。ＲＰＭＩ １６４０培地に含まれる牛胎児血清は、１〜２０％が好ましく、１０〜２０％がより好ましい。
【００４０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養は、通常、５％炭酸ガス下で行われるが、その培養温度は、２０〜４０℃が好ましく、約３７℃がより好ましい。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養期間は、５日〜３週間が好ましく、１〜２週間がより好ましい。また、ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価と同様に測定できる。
【００４１】
モノクローナル抗体の分離精製方法としては、例えば、免疫グロブリンの分離精製方法が挙げられる。ここで、免疫グロブリンの分離精製方法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、ＤＥＡＥ等のイオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡ若しくはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取する特異的精製法が挙げられる。
【００４２】
ポリクローナル抗体は、例えば、免疫抗原となるタンパク質又は免疫抗原となるタンパク質とキャリアータンパク質との複合体を、上記のモノクローナル抗体産生細胞の製造と同様に温血動物に投与し、免疫された温血動物から抗体含有物を採取して製造することができる。
【００４３】
キャリアータンパク質との複合体を形成して免疫抗原となるタンパク質、すなわちハプテンの種類としては、ハプテンがキャリアータンパク質と結合することによりポリクローナル抗体が効率良く産生されるものであれば、特に限定はない。一方、キャリアータンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はヘモシアニンが挙げられる。
【００４４】
複合体形成におけるハプテンとキャリアータンパク質との重量比としては、ハプテン１に対し、キャリアータンパク質が０．１〜２０が好ましく、１〜５がより好ましい。また、ハプテンとキャリアータンパク質との結合に用いる縮合剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル又はチオール基若しくはジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬が挙げられる。
【００４５】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水等から採取することができるが、血液から採取することが好ましい。
【００４６】
ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と同様に分離精製することができる。
【００４７】
「発現量」とは、絶対量である必要はなく、相対量であってもよい。また、必ずしも数値的に表現される必要はなく、例えば、色素や蛍光標識等の可視的な標識を用い、目視により判定する場合も、発現量の測定に含まれる。
【００４８】
対照細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量は、被検細胞におけるそれらの発現量と同時に測定してもよいし、事前に測定しておいてもよい。事前の測定をしておく場合には、予め対照細胞における該ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の絶対量又はある標準物質に換算した相対量を求めておき、それを被検細胞における発現量と比較してもよいし、対照細胞における絶対量に相当する量の該ＤＮＡ又はタンパク質を対照として、被検細胞における発現量と同時に測定してもよい。
【００４９】
被検細胞及び対照細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量の比較は、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量が、対照細胞におけるそれと比較して何倍であるかを指標にすることもできる。
【００５０】
対照細胞がＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であるＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞又はＨｅｐ３Ｂ細胞の場合には、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量のうち、１以上が対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測することが好ましい。また、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、対照細胞における発現量と比較して４倍以上であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測することも好ましい。さらには、被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量が、対照細胞における発現量と比較して２倍以上であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測することも好ましい。
【００５１】
上記の指標以外にも、対照細胞としてＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞及びＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞の両方を用い、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量がＩＦＮ感受性若しくはＩＦＮ応答性の細胞又はＩＦＮ非感受性若しくはＩＦＮ非応答性の細胞のどちらに近いかを指標とすることも可能である。
【００５２】
被検細胞の感受性又は応答性を予測するＩＦＮは、α型、β型、γ型、τ型、ω型、λ型、コンセンサス型又はハイブリット型のいずれでもよく、また由来も天然型、遺伝子組換え型又は化学合成型のいずれでもよいが、Ｉ型ＩＦＮが好ましく、α型ＩＦＮ又はβ型ＩＦＮすなわちＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βがより好ましく、ＩＦＮ−βがさらに好ましい。なお、ＩＦＮは高分子等により修飾されていてもよく、例えば、ＰＥＧと結合したＰＥＧ−ＩＦＮであってもよい。
【００５３】
患者にＩＦＮを投与する方法としては、例えば、製剤化したＩＦＮを投与する方法又はＩＦＮ遺伝子を直接患部に投与する方法が挙げられる。
【００５４】
また、本発明の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するキットは、下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含むことを特徴としている。
（ｇ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 上記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
【００５５】
上記キットは、ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の診断をするために必要な試薬や器材を含むものである。これらの試薬の中には、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液なども含まれる。さらに、反応条件を最適化したプロトコルなどを含んでいてもよい。また、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートや蛍光／発光強度の測定に必要な器材等の一式を含んでいるとさらに好ましい。
【００５６】
例えば、上記（ｇ）のＰＣＲプライマーセットを含むキットの構成品としては、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出する試薬、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素や試薬、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子を増幅するプライマー、ハウスキーピング遺伝子を増幅するプライマー及びＰＣＲ関連試薬が挙げられる。ＰＣＲを実施するために必要な上記試薬やプライマーは、予めマイクロチューブに添加された状態であってもよく、ＰＣＲのアニーリング及び伸長工程の温度及び反応時間を最適化したプロトコルがキットに含まれていればより好ましい。
【００５７】
上記（ｈ）のポリヌクレオチドプローブ又は上記（ｉ）のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料を含むキットの構成品としては、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出する試薬、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素や試薬、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ、ハウスキーピング遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズ関連試薬が挙げられる。ポリヌクレオチドプローブは固相化試料に固定された状態で提供されてもよい。
【００５８】
上記（ｊ）の抗体を含むキットの構成品としては、細胞を溶解するＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及び／又はＡＮＫＲＤ１２タンパク質と特異的に結合する抗体及びその関連試薬が挙げられる。ＥＬＩＳＡやＲＩＡのより正確な実施のためには、検量線作成のための標準物質がキットに含まれていればより好ましい。
【００５９】
また本発明のマーカー遺伝子は、上記の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法やキットで使用され、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する用途を提供することを特徴としている。
【００６０】
ＫＬＦ４遺伝子は、亜鉛フィンガードメインを有する転写因子をコードするＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０３０８１１）から入手することができる。
【００６１】
ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子は、熱ショックタンパク質の発現を制御する転写因子の１つであるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２に結合して相互作用をするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０００１５３）から入手することができる。
【００６２】
ＡＮＫＲＤ１２遺伝子は、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ ２（ＡＮＣＯ２と略される。）又はＫＩＡＡ０８７４とも呼ばれるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０５７２２５）から入手することができる。
【００６３】
なお、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子のクローニング及び翻訳産物の調製は、常法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）に記載の分子生物学手法及びそれらを基にした改良法に従って行なうことができる。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）ＩＦＮ感受性肝癌細胞及びＩＦＮ非感受性肝癌細胞の同定：
ヒト肝癌由来株化細胞として、ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の６種の細胞を使用した。ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐＧ２細胞はヒューマンサイエンス振興財団から、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞は大日本製薬株式会社から購入した。ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞は１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＭＥＭ培地を用いて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡを含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下の細胞培養器内で培養した。
【００６５】
細胞増殖抑制試験は、以下の手順で実施した。まず、サブコンフルエント状態の細胞をフラスコから剥離し、培養培地で細胞を一定密度となるよう調製した。検量線作成用９６穴プレートには、１００、３００、１０００、３０００、１００００、１５０００ｃｅｌｌｓ／穴となるように、また、評価用９６穴プレートには、細胞を３０００ｃｅｌｌｓ／穴となるように、細胞懸濁液を１００μＬ／穴でそれぞれ播種した。
【００６６】
播種した細胞を一晩培養後、評価用プレートの培養培地を除去し、コントロール用に培養培地１００μＬ／穴を、また、ＩＦＮ処置用に調製したＩＦＮ溶液を１００μＬ／穴で添加した。ＩＦＮ処置後は、評価用プレートを細胞培養器内に入れて培養した。ＩＦＮ溶液は、天然型ＩＦＮ−β製剤であるフエロン（登録商標；東レ株式会社）を培養培地にて濃度範囲１０−１０００００国際単位（以下、ＩＵ）／ｍＬの１０倍希釈系列にて調製した。
【００６７】
検量線作成用プレートに関しては、播種した細胞を一晩培養後、評価用プレートに関してはＩＦＮ処置した細胞をさらに３日間培養後、細胞増殖抑制試験を行った。各測定ポイントにおいて、プレートの培養培地を除去し、新しい培地を５０μＬ／穴で添加した。その後、ＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；プロメガ株式会社）をプレートの各ウェルに１０μＬ／穴ずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下の細胞培養器内で培養した。各細胞の評価用プレートは１時間後又は３時間後にプレートリーダーで吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。検量線から評価用プレートの各穴の細胞数を算出し、コントロールの細胞数を１００％とした時の、ＩＦＮ処理時の細胞増殖率を濃度別に求め、そのＩＣ３０値（３０％増殖阻害濃度）を算出した。
【００６８】
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞及びＨｕＨ−７細胞の増殖は、それぞれ１８．７ ＩＵ／ｍＬ及び２９１ ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β濃度によって３０％抑制されたが、ＨｅｐＧ２細胞のＩＣ３０値はＨｕＨ−７細胞の１０倍以上高い濃度である３９００ ＩＵ／ｍＬであった。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞においては１００００ ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β濃度でもほとんどＩＦＮによる細胞増殖抑制作用は認められなかった。これらの結果、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞及びＨｕＨ−７細胞はＩＦＮ感受性肝癌細胞であり、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞はＩＦＮ非感受性肝癌細胞であることが確認された。
【００６９】
（実施例２）ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４、ＨＳＢＰ２及びＡＮＫＲＤ１２の発現量の解析：
通常の培養条件（ＩＦＮ無刺激）で培養した肝癌細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。細胞（２５ｃｍ２フラスコ）にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン） １．０ｍＬを加え、さらにクロロホルム０．２ｍＬを加え混合、室温で３分間静置したのち、１２０００×ｇ、１５分間遠心した。得られた水相に０．５ｍＬのイソプロパノールを加えて混合、室温で１０分間静置したのち、さらに１２０００×ｇ、１５分間遠心した。上清を除き、沈渣を７０％エタノールで洗浄後、ＤＥＰＣ処理水に溶解し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液を得た。そのＲＮＡ溶液について、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定してｔｏｔａｌ ＲＮＡ量を算出した。続いて、得られたＲＮＡから、常法に従って、ｃＤＮＡ合成を行った。すなわち５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡを、１μＬのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー：Ｒａｎｄｏｍプライマー（５：１）ＤＥＰＣ処理水溶液と混和し、７０℃で５分間加温後、氷上で１０分間冷却した。その後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を用いて逆転写を行った。逆転写反応条件は、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間反応後４℃保持とした。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて各遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法にて定量した。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲ法による測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５；ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。ＰＣＲ増幅産物の検出には二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する色素であるＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いた（インターカレーター法）。測定にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用い、常法に従って実施した。なお、上記のＰＣＲにおいて、遺伝子の増幅のために用いたプライマーセットは、表１に示す通りである。また、上記ＰＣＲの温度サイクル条件は、９５℃で１０秒、６２℃で１０秒、７２℃で１０秒を１サイクルとし、４０サイクルを実施した。なお、ＰＣＲプログラムはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５を用い設定した。目的遺伝子のｍＲＮＡ発現量解析は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＤＰＨ）の発現量により標準化し、相対定量した。標準化した発現量比（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は下記式で表される。下記式中の、ＣｔとはＣｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを表す。
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ＝２（Ｃｔ（ＧＡＤＰＨ）−Ｃｔ（Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）
【００７１】
【表１】
【００７２】
（実施例３）ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２の発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果の相関及び比較：
実施例２の方法で測定したヒト肝癌細胞のＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ又はＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量及び実施例１で測定した肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）との相関を検討した。その結果、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる増殖抑制効果の相関は、図１〜３に示すように、決定係数（Ｒ２乗値）でそれぞれ０．９１、０．９３及び０．７６であった。なお、図１〜３の縦軸は、ＨｅｐＧ２細胞の該ｍＲＮＡ発現量を１としたときの相対値を表し、横軸はＩＦＮの肝癌細胞増殖抑制効果のＩＣ３０値（ＩＵ／ｍＬ）を表す。
【００７３】
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞をＩＦＮ非感受性細胞群として、ＩＦＮ非感受性細胞群とＩＦＮ感受性細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の各遺伝子の発現量の比較を行ったところ、ＩＦＮ感受性細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞のＫＬＦ４発現量は３．９〜２９．７倍、ＨＳＦ２ＢＰ発現量は２．２〜９．６倍、ＡＮＫＲＤ１２発現量は２．２〜８．２倍であった。さらに、ＩＦＮ非感受性細胞群をＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＨｅｐＧ２細胞として、この細胞間で各遺伝子の発現量の比較を行ったところ、最低発現比の平均値は、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２の遺伝子でそれぞれ０．５６倍、０．５８倍及び０．５８倍であった。
【００７４】
（実施例４）ヒト肝癌細胞におけるその他の遺伝子の発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果の相関：
実施例２の方法でリアルタイムＰＣＲにおいて、プライマーセットを変えて、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２以外の目的遺伝子２０種類の遺伝子（ＨＡＳ２、ＳＤＣ、ＴＧＦＢＲ３などを含む）の発現量をＧＡＤＰＨの発現量で標準化し相対定量した。測定したヒト肝癌細胞における２０種類の遺伝子の発現量及び、実施例１で測定した肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）との相関を検討した結果、いずれもｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる増殖抑制効果の相関は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、医薬医療分野において、患者又は被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性の予測に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロンに対する感受性又は応答性を予測する方法、キット及びマーカー遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者の個人差を考慮した医療、すなわち個別化医療が重要視されており、患者に対する薬剤の効果を予測する方法が積極的に探索されている。患者の薬剤に対する感受性又は応答性を薬剤の投与前や投与初期に予測してから薬剤を投与していくことは、薬剤の有効性や有用性を高めるだけでなく、無意味な薬剤投与を控えて治療費用を節減し、さらには副作用を回避する面からも重要である。
【０００３】
肝癌とは、肝内に発生する悪性腫瘍をいい、肝臓で原発性に発生する肝細胞癌と、肝外臓器で発生して肝内に転移した肝転移肝癌とに大別される。肝癌患者の９０％以上は肝炎ウィルスの感染者であり、肝癌の発症リスクを有するウィルス性肝炎患者の数は、日本全国で３００万人ともいわれている。
【０００４】
インターフェロン（以下、ＩＦＮ）は、Ｃ型慢性肝炎や肝硬変に対するウィルス駆除剤として使用されている。ＩＦＮ投与によるウィルス駆除療法は、ウィルス駆除又は肝機能改善効果を示すばかりか、結果的にＣ型慢性肝炎・肝硬変から肝癌への移行を抑制することが明らかとなっているため、Ｃ型慢性肝炎及び肝硬変に対してＩＦＮを積極的に使用することが推奨されている。このＩＦＮ投与による肝癌発生の抑制メカニズムとしては、極初期の不顕性な段階にある肝癌細胞に対してＩＦＮが直接的に増殖抑制作用を示すことが寄与すると考えられている。実際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ＩＦＮは肝癌細胞の増殖を抑制することが知られており、肝癌の発生又は進行を抑える治療剤としての効果も認められつつある。
【０００５】
ＩＦＮの投与前に患者のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法としては、Ｃ型肝炎患者から採取した肝細胞におけるＪＡＫ結合タンパク質遺伝子又はＣＩＳ３遺伝子の発現量を測定する方法（特許文献１）が報告され、肝癌におけるＩＦＮ及び５−ＦＵの併用療法に対する感受性又は応答性を予測する方法としては、ＩＦＮＡＲ２遺伝子の発現を解析対象とする方法（非特許文献１）が報告されている。
【０００６】
一方、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４（ＫＬＦ４と略される。）は、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ（ＫＬＦと略される。）ファミリーに属する転写因子であり、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＺＦと略される。）やＧｕｔ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＧＫＬＦと略される。）とも呼ばれるタンパク質である。ＫＬＦ４は、細胞の成長、増殖、分化及び胚発生において様々な制御を行っていることが知られ（非特許文献２）、消化管癌及び白血病では腫瘍抑制因子として働くことを示唆する報告（非特許文献３〜５）、乳癌（非特許文献６）及び口腔扁平上皮細胞癌（非特許文献７）では癌の進行期に発現量が増加することを示す報告、早期浸潤乳管癌においては悪性表現型のマーカー遺伝子であるとする報告（非特許文献８）がなされているが、その機能の詳細や癌の増殖における役割については未だ明らかになっていない。
【０００７】
Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＦ２ＢＰと略される。）は、熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を制御する転写因子であるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２に結合して相互作用をするタンパク質であるが、その機能の詳細については明らかになっていない（非特許文献９）。
【０００８】
Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２（ＡＮＫＲＤ１２と略される。）は、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ ２（ＡＮＣＯ２と略される。）又はＫＩＡＡ０８７４とも呼ばれるタンパク質であるが、その機能についてはほとんど明らかになっていない（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１２５６８３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎａｇａｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ、２００７年、第１１０巻、ｐ．２４９３−２５０１
【非特許文献２】Ｇｈａｌｅｂら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ.、２００５年、第１５巻、第２号、ｐ．９２−９６
【非特許文献３】Ｄａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００３年、第２２巻、第２２号、ｐ．３４２４−３４３０
【非特許文献４】Ｗｅｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２００５年、第６５巻、第７号、ｐ．２７４６−２７５４
【非特許文献５】Ｙａｓｕｎａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２００４年、第６４巻、第１７号、ｐ．６００２−６００９
【非特許文献６】Ｆｏｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２０００年、第６０巻、第２２号、ｐ．６４８８−６４９５
【非特許文献７】Ｆｏｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ.、１９９９年、第１０巻、第６号、ｐ．４２３−４３４
【非特許文献８】Ｐａｎｄｙａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、２００４年、第１０巻、第８号、ｐ．２７０９−２７１９
【非特許文献９】Ｙｏｓｈｉｍａら、Ｇｅｎｅ、１９９８年、第２１４巻、ｐ．１３９−１４６
【非特許文献１０】Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．、１９９８年、第５巻、ｐ．３５５−３６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ＩＦＮの投与はすべてのＣ型慢性肝炎患者、肝硬変患者及び肝癌患者に対してその効果を示すわけではなく、重篤な副作用を伴う可能性もあることから、ＩＦＮに対する感受性又は応答性の低い患者、すなわちＩＮＦ非感受性又は非応答性の患者に対するＩＦＮの投与は慎重にすべきであると考えられる。
【００１２】
また、現在、ＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法で明確な判定基準のある方法はないため、臨床の現場において、患者へのＩＦＮの投与前に適用可能な新たな方法の開発が必要であると考えられる。
【００１３】
そこで本発明は、ＩＦＮの投与を必要としている患者及び被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、肝癌細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２の発現量と、ＩＦＮによる肝癌細胞の増殖抑制効果に相関があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）に記載した、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法を提供する。
（１） 被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法であって、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおける、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４（以下、ＫＬＦ４）遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＨＳＦ２ＢＰ）遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２（以下、ＡＮＫＲＤ１２）遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測する予測ステップと、を備える方法。
（ａ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（２） 上記被検細胞は、ヒト由来の癌細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３） 上記癌細胞は、肝癌細胞である、上記（２）に記載の方法。
（４） 上記ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 上記Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮβ又はＩＦＮαである、上記（４）に記載の方法。
（６） 下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含む、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するキット。
（ｇ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 上記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
（７） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するマーカー遺伝子。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、患者から採取した被検細胞におけるマーカー遺伝子であるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量を測定し、対照細胞におけるそれらの発現量と比較することによって、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４のｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）の相関を表すグラフである。
【図２】ヒト肝癌細胞におけるＨＳＦ２ＢＰのｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）の相関を表すグラフである。
【図３】ヒト肝癌細胞におけるＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）の相関を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法は、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と上記被検細胞とにおける、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、上記被検細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、上記対照細胞における上記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、上記被検細胞はＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測する予測ステップと、を備えることを特徴としている。
（ａ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 上記被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 上記被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 上記被検細胞におけるＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、上記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
【００１９】
「ＩＦＮに対する感受性又は応答性」とは、細胞においてＩＦＮの刺激又は作用により反応又は効果が誘発され得る性質や、細胞のＩＦＮ受容性をいう。ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞とは、ＩＦＮ受容性が高く、ＩＦＮにより反応又は効果が誘発される細胞のことをいい、ＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞とは、ＩＦＮ受容性がないか又は低く、ＩＦＮにより反応又は効果が誘発されない又は誘発されても十分ではない細胞のことをいう。
【００２０】
ＩＦＮの刺激又は作用により誘発される反応又は効果としては、例えば、抗ウィルス効果や癌細胞の増殖抑制効果が挙げられる。
【００２１】
「被検細胞」とは、患者の罹患部位から採取した細胞をいうが、癌患者から採取した癌細胞、すなわちヒト由来の癌細胞であることが好ましく、肝癌患者から採取した肝癌細胞であることがより好ましい。
【００２２】
被検細胞としては、例えば癌細胞のような病巣となる細胞が、正常細胞の一部に含まれる状態のものであってもよいが、できるだけ正常細胞を除去した細胞であることが好ましい。
【００２３】
「対照細胞」とは、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量と、ＩＦＮに対する感受性又は応答性の関係が既知である細胞をいい、ＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であるヒト肝癌細胞株のＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞又はＨｅｐ３Ｂ細胞から選択されるのが好ましい。
【００２４】
一方で、ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞を対照細胞とするのであれば、ヒト肝癌細胞株であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞が好ましい。
【００２５】
被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量の測定としては、被検細胞における該ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定すればよいが、該ｍＲＮＡの発現量を測定することが好ましい。
【００２６】
細胞におけるｍＲＮＡの発現量の測定は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法等、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）で測定することができるが、ＲＴ−ＰＣＲ法で測定することが好ましい。
【００２７】
ＲＴ−ＰＣＲ法とは、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出し、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）する方法をいうが、ＰＣＲとしてはリアルタイムＰＣＲが好ましい。また、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列は既に公知であるため、ＰＣＲする場合は、該ＤＮＡ塩基配列に基づいてプライマーを適宜設定することができる。このプライマーとしては、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列を増幅するものが好ましい。
【００２８】
ＰＣＲについては、ＰＣＲ増幅産物の収率及び特異性が最適化された反応条件を選択可能であるが、重要な反応パラメータとしては、例えば、プライマーの長さ及び塩基配列、アニーリング及び伸長工程の温度並びに反応時間、Ｍｇイオン濃度又は塩濃度が挙げられる。
【００２９】
ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる方法としては、例えば、サザンブロット法、ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料を用いるＤＮＡマイクロアレイ法、又は、細胞からＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡをポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせるノーザンブロット法若しくはＲＮａｓｅプロテクションアッセイが挙げられるが、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ又はＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列に特異的な配列をポリヌクレオチドプローブとして設計する必要がある。ここで、該ＤＮＡ塩基配列に特異的な配列かどうかは、ＢＬＡＳＴ解析により確認することができる。
【００３０】
また、ｍＲＮＡの発現量の測定において標準化のために用いるハウスキーピング遺伝子としては、例えば、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ又はＧ３ＰＤＨと略される。）、β−アクチン又はβ２−マイクログロブリンあるいはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３１】
タンパク質の発現量の測定は、細胞をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで溶解後、抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又はウェスタンブロッティング等、公知の方法で測定することが出来る。
【００３２】
タンパク質の発現量の測定には特異的抗体が必要であるが、特異的抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも構わない。ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のＤＮＡ塩基配列は既に公知であるため、これらのタンパク質の特異的抗体は、これらのタンパク質を抗原として用い、公知の抗体又は抗血清の製造方法で製造することができる。以下に、これらの製造方法を例示する。
【００３３】
モノクローナル抗体産生細胞の製造においては、まず、抗原で免疫された温血動物を準備する。抗原で免疫された温血動物は、抗原となるタンパク質を、温血動物の抗体産生が可能な部位に投与することで得られる。抗原となるタンパク質は単独で投与してもよいし、担体又は希釈剤とともに投与しても構わない。また、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント等のアジュバントを同時に投与してもよい。
【００３４】
抗原となるタンパク質は、通常、２〜６週毎に１回ずつの頻度で、計２〜１０回程度投与する。抗原となるタンパク質を投与する温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ又はニワトリが挙げられるが、マウス又はラットが好ましい。
【００３５】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、すなわちモノクローナル抗体産生細胞は、抗原で免疫された温血動物、すなわち抗体価の認められた温血動物から、抗原となるタンパク質の最終投与より２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることによって製造することができる。なお、温血動物の抗血清中の抗体価の測定方法としては、例えば、標識化ペプチドと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識化ペプチドの活性を測定する方法が挙げられる。
【００３６】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、公知の方法（ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、ｐ．２５６−４９５）で融合させることができる。融合に用いる融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）又はセンダイウィルスなどが挙げられるが、ＰＥＧが好ましく、ＰＥＧ１０００又はＰＥＧ６０００がより好ましい。また、融合促進剤は１０〜８０％の濃度で添加されることが好ましい。
【００３７】
異種動物の骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１細胞、Ｐ３Ｕ１細胞、ＳＰ２／０細胞、ＡＰ−１細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１細胞が好ましい。融合に用いる抗体産生細胞の数と骨髄腫細胞の数の比率は、１：１〜２０：１が好ましい。インキュベート温度は、２０〜４０℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。また、インキュベート時間は、１〜１０分間が好ましい。
【００３８】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法としては、例えば、ペプチド抗原を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを加えて、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法、又は、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法が挙げられる。
【００３９】
モノクローナル抗体は、自体公知又はそれに準じる方法で選別できるが、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）を添加した動物細胞用培地が用いられる。動物細胞用培地としては、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが生育できれば特に限定はないが、例えば、牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１；日水製薬（株））が挙げられる。ＲＰＭＩ １６４０培地に含まれる牛胎児血清は、１〜２０％が好ましく、１０〜２０％がより好ましい。
【００４０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養は、通常、５％炭酸ガス下で行われるが、その培養温度は、２０〜４０℃が好ましく、約３７℃がより好ましい。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養期間は、５日〜３週間が好ましく、１〜２週間がより好ましい。また、ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価と同様に測定できる。
【００４１】
モノクローナル抗体の分離精製方法としては、例えば、免疫グロブリンの分離精製方法が挙げられる。ここで、免疫グロブリンの分離精製方法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、ＤＥＡＥ等のイオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡ若しくはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取する特異的精製法が挙げられる。
【００４２】
ポリクローナル抗体は、例えば、免疫抗原となるタンパク質又は免疫抗原となるタンパク質とキャリアータンパク質との複合体を、上記のモノクローナル抗体産生細胞の製造と同様に温血動物に投与し、免疫された温血動物から抗体含有物を採取して製造することができる。
【００４３】
キャリアータンパク質との複合体を形成して免疫抗原となるタンパク質、すなわちハプテンの種類としては、ハプテンがキャリアータンパク質と結合することによりポリクローナル抗体が効率良く産生されるものであれば、特に限定はない。一方、キャリアータンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はヘモシアニンが挙げられる。
【００４４】
複合体形成におけるハプテンとキャリアータンパク質との重量比としては、ハプテン１に対し、キャリアータンパク質が０．１〜２０が好ましく、１〜５がより好ましい。また、ハプテンとキャリアータンパク質との結合に用いる縮合剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル又はチオール基若しくはジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬が挙げられる。
【００４５】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水等から採取することができるが、血液から採取することが好ましい。
【００４６】
ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と同様に分離精製することができる。
【００４７】
「発現量」とは、絶対量である必要はなく、相対量であってもよい。また、必ずしも数値的に表現される必要はなく、例えば、色素や蛍光標識等の可視的な標識を用い、目視により判定する場合も、発現量の測定に含まれる。
【００４８】
対照細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量は、被検細胞におけるそれらの発現量と同時に測定してもよいし、事前に測定しておいてもよい。事前の測定をしておく場合には、予め対照細胞における該ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の絶対量又はある標準物質に換算した相対量を求めておき、それを被検細胞における発現量と比較してもよいし、対照細胞における絶対量に相当する量の該ＤＮＡ又はタンパク質を対照として、被検細胞における発現量と同時に測定してもよい。
【００４９】
被検細胞及び対照細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量の比較は、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量が、対照細胞におけるそれと比較して何倍であるかを指標にすることもできる。
【００５０】
対照細胞がＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であるＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞又はＨｅｐ３Ｂ細胞の場合には、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量のうち、１以上が対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞であると予測することが好ましい。また、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、対照細胞における発現量と比較して４倍以上であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測することも好ましい。さらには、被検細胞におけるＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量が、対照細胞における発現量と比較して２倍以上であることを指標として、被検細胞がＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞であると予測することも好ましい。
【００５１】
上記の指標以外にも、対照細胞としてＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の細胞及びＩＦＮ非感受性又はＩＦＮ非応答性の細胞の両方を用い、被検細胞におけるＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子若しくはＡＮＫＲＤ１２遺伝子又はそれらのいずれかの翻訳産物の発現量がＩＦＮ感受性若しくはＩＦＮ応答性の細胞又はＩＦＮ非感受性若しくはＩＦＮ非応答性の細胞のどちらに近いかを指標とすることも可能である。
【００５２】
被検細胞の感受性又は応答性を予測するＩＦＮは、α型、β型、γ型、τ型、ω型、λ型、コンセンサス型又はハイブリット型のいずれでもよく、また由来も天然型、遺伝子組換え型又は化学合成型のいずれでもよいが、Ｉ型ＩＦＮが好ましく、α型ＩＦＮ又はβ型ＩＦＮすなわちＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βがより好ましく、ＩＦＮ−βがさらに好ましい。なお、ＩＦＮは高分子等により修飾されていてもよく、例えば、ＰＥＧと結合したＰＥＧ−ＩＦＮであってもよい。
【００５３】
患者にＩＦＮを投与する方法としては、例えば、製剤化したＩＦＮを投与する方法又はＩＦＮ遺伝子を直接患部に投与する方法が挙げられる。
【００５４】
また、本発明の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測するキットは、下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含むことを特徴としている。
（ｇ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 上記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
【００５５】
上記キットは、ＩＦＮ感受性又はＩＦＮ応答性の診断をするために必要な試薬や器材を含むものである。これらの試薬の中には、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液なども含まれる。さらに、反応条件を最適化したプロトコルなどを含んでいてもよい。また、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートや蛍光／発光強度の測定に必要な器材等の一式を含んでいるとさらに好ましい。
【００５６】
例えば、上記（ｇ）のＰＣＲプライマーセットを含むキットの構成品としては、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出する試薬、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素や試薬、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子を増幅するプライマー、ハウスキーピング遺伝子を増幅するプライマー及びＰＣＲ関連試薬が挙げられる。ＰＣＲを実施するために必要な上記試薬やプライマーは、予めマイクロチューブに添加された状態であってもよく、ＰＣＲのアニーリング及び伸長工程の温度及び反応時間を最適化したプロトコルがキットに含まれていればより好ましい。
【００５７】
上記（ｈ）のポリヌクレオチドプローブ又は上記（ｉ）のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料を含むキットの構成品としては、細胞からＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を抽出する試薬、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素や試薬、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及び／又はＡＮＫＲＤ１２遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ、ハウスキーピング遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズ関連試薬が挙げられる。ポリヌクレオチドプローブは固相化試料に固定された状態で提供されてもよい。
【００５８】
上記（ｊ）の抗体を含むキットの構成品としては、細胞を溶解するＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及び／又はＡＮＫＲＤ１２タンパク質と特異的に結合する抗体及びその関連試薬が挙げられる。ＥＬＩＳＡやＲＩＡのより正確な実施のためには、検量線作成のための標準物質がキットに含まれていればより好ましい。
【００５９】
また本発明のマーカー遺伝子は、上記の被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する方法やキットで使用され、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性を予測する用途を提供することを特徴としている。
【００６０】
ＫＬＦ４遺伝子は、亜鉛フィンガードメインを有する転写因子をコードするＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０３０８１１）から入手することができる。
【００６１】
ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子は、熱ショックタンパク質の発現を制御する転写因子の１つであるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２に結合して相互作用をするＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０００１５３）から入手することができる。
【００６２】
ＡＮＫＲＤ１２遺伝子は、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｆａｃｔｏｒ ２（ＡＮＣＯ２と略される。）又はＫＩＡＡ０８７４とも呼ばれるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子であり、塩基配列及びアミノ酸配列の情報はＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションＮｏ．ＢＣ０５７２２５）から入手することができる。
【００６３】
なお、ＫＬＦ４遺伝子、ＨＳＦ２ＢＰ遺伝子及びＡＮＫＲＤ１２遺伝子のクローニング及び翻訳産物の調製は、常法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）に記載の分子生物学手法及びそれらを基にした改良法に従って行なうことができる。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）ＩＦＮ感受性肝癌細胞及びＩＦＮ非感受性肝癌細胞の同定：
ヒト肝癌由来株化細胞として、ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の６種の細胞を使用した。ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐＧ２細胞はヒューマンサイエンス振興財団から、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞は大日本製薬株式会社から購入した。ＨｕＨ−７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞は１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＭＥＭ培地を用いて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡを含むＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下の細胞培養器内で培養した。
【００６５】
細胞増殖抑制試験は、以下の手順で実施した。まず、サブコンフルエント状態の細胞をフラスコから剥離し、培養培地で細胞を一定密度となるよう調製した。検量線作成用９６穴プレートには、１００、３００、１０００、３０００、１００００、１５０００ｃｅｌｌｓ／穴となるように、また、評価用９６穴プレートには、細胞を３０００ｃｅｌｌｓ／穴となるように、細胞懸濁液を１００μＬ／穴でそれぞれ播種した。
【００６６】
播種した細胞を一晩培養後、評価用プレートの培養培地を除去し、コントロール用に培養培地１００μＬ／穴を、また、ＩＦＮ処置用に調製したＩＦＮ溶液を１００μＬ／穴で添加した。ＩＦＮ処置後は、評価用プレートを細胞培養器内に入れて培養した。ＩＦＮ溶液は、天然型ＩＦＮ−β製剤であるフエロン（登録商標；東レ株式会社）を培養培地にて濃度範囲１０−１０００００国際単位（以下、ＩＵ）／ｍＬの１０倍希釈系列にて調製した。
【００６７】
検量線作成用プレートに関しては、播種した細胞を一晩培養後、評価用プレートに関してはＩＦＮ処置した細胞をさらに３日間培養後、細胞増殖抑制試験を行った。各測定ポイントにおいて、プレートの培養培地を除去し、新しい培地を５０μＬ／穴で添加した。その後、ＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；プロメガ株式会社）をプレートの各ウェルに１０μＬ／穴ずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下の細胞培養器内で培養した。各細胞の評価用プレートは１時間後又は３時間後にプレートリーダーで吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。検量線から評価用プレートの各穴の細胞数を算出し、コントロールの細胞数を１００％とした時の、ＩＦＮ処理時の細胞増殖率を濃度別に求め、そのＩＣ３０値（３０％増殖阻害濃度）を算出した。
【００６８】
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞及びＨｕＨ−７細胞の増殖は、それぞれ１８．７ ＩＵ／ｍＬ及び２９１ ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β濃度によって３０％抑制されたが、ＨｅｐＧ２細胞のＩＣ３０値はＨｕＨ−７細胞の１０倍以上高い濃度である３９００ ＩＵ／ｍＬであった。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞においては１００００ ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−β濃度でもほとんどＩＦＮによる細胞増殖抑制作用は認められなかった。これらの結果、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞及びＨｕＨ−７細胞はＩＦＮ感受性肝癌細胞であり、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞はＩＦＮ非感受性肝癌細胞であることが確認された。
【００６９】
（実施例２）ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４、ＨＳＢＰ２及びＡＮＫＲＤ１２の発現量の解析：
通常の培養条件（ＩＦＮ無刺激）で培養した肝癌細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。細胞（２５ｃｍ２フラスコ）にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン） １．０ｍＬを加え、さらにクロロホルム０．２ｍＬを加え混合、室温で３分間静置したのち、１２０００×ｇ、１５分間遠心した。得られた水相に０．５ｍＬのイソプロパノールを加えて混合、室温で１０分間静置したのち、さらに１２０００×ｇ、１５分間遠心した。上清を除き、沈渣を７０％エタノールで洗浄後、ＤＥＰＣ処理水に溶解し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液を得た。そのＲＮＡ溶液について、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定してｔｏｔａｌ ＲＮＡ量を算出した。続いて、得られたＲＮＡから、常法に従って、ｃＤＮＡ合成を行った。すなわち５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡを、１μＬのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー：Ｒａｎｄｏｍプライマー（５：１）ＤＥＰＣ処理水溶液と混和し、７０℃で５分間加温後、氷上で１０分間冷却した。その後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を用いて逆転写を行った。逆転写反応条件は、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間反応後４℃保持とした。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて各遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法にて定量した。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲ法による測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５；ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた。ＰＣＲ増幅産物の検出には二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する色素であるＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いた（インターカレーター法）。測定にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用い、常法に従って実施した。なお、上記のＰＣＲにおいて、遺伝子の増幅のために用いたプライマーセットは、表１に示す通りである。また、上記ＰＣＲの温度サイクル条件は、９５℃で１０秒、６２℃で１０秒、７２℃で１０秒を１サイクルとし、４０サイクルを実施した。なお、ＰＣＲプログラムはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５を用い設定した。目的遺伝子のｍＲＮＡ発現量解析は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＤＰＨ）の発現量により標準化し、相対定量した。標準化した発現量比（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は下記式で表される。下記式中の、ＣｔとはＣｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを表す。
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ＝２（Ｃｔ（ＧＡＤＰＨ）−Ｃｔ（Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）
【００７１】
【表１】
【００７２】
（実施例３）ヒト肝癌細胞におけるＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２の発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果の相関及び比較：
実施例２の方法で測定したヒト肝癌細胞のＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ又はＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量及び実施例１で測定した肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）との相関を検討した。その結果、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２のｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる増殖抑制効果の相関は、図１〜３に示すように、決定係数（Ｒ２乗値）でそれぞれ０．９１、０．９３及び０．７６であった。なお、図１〜３の縦軸は、ＨｅｐＧ２細胞の該ｍＲＮＡ発現量を１としたときの相対値を表し、横軸はＩＦＮの肝癌細胞増殖抑制効果のＩＣ３０値（ＩＵ／ｍＬ）を表す。
【００７３】
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞をＩＦＮ非感受性細胞群として、ＩＦＮ非感受性細胞群とＩＦＮ感受性細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の各遺伝子の発現量の比較を行ったところ、ＩＦＮ感受性細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞のＫＬＦ４発現量は３．９〜２９．７倍、ＨＳＦ２ＢＰ発現量は２．２〜９．６倍、ＡＮＫＲＤ１２発現量は２．２〜８．２倍であった。さらに、ＩＦＮ非感受性細胞群をＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びＨｅｐＧ２細胞として、この細胞間で各遺伝子の発現量の比較を行ったところ、最低発現比の平均値は、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２の遺伝子でそれぞれ０．５６倍、０．５８倍及び０．５８倍であった。
【００７４】
（実施例４）ヒト肝癌細胞におけるその他の遺伝子の発現量とＩＦＮによる肝癌細胞増殖抑制効果の相関：
実施例２の方法でリアルタイムＰＣＲにおいて、プライマーセットを変えて、ＫＬＦ４、ＨＳＦ２ＢＰ及びＡＮＫＲＤ１２以外の目的遺伝子２０種類の遺伝子（ＨＡＳ２、ＳＤＣ、ＴＧＦＢＲ３などを含む）の発現量をＧＡＤＰＨの発現量で標準化し相対定量した。測定したヒト肝癌細胞における２０種類の遺伝子の発現量及び、実施例１で測定した肝癌細胞増殖抑制効果（ＩＣ３０値）との相関を検討した結果、いずれもｍＲＮＡ発現量とＩＦＮによる増殖抑制効果の相関は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、医薬医療分野において、患者又は被検細胞のＩＦＮに対する感受性又は応答性の予測に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検細胞のインターフェロンに対する感受性又は応答性を予測する方法であって、
ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と前記被検細胞とにおける、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、
前記被検細胞における前記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、前記対照細胞における前記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、前記被検細胞はインターフェロン非感受性又はインターフェロン非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、前記被検細胞はインターフェロン感受性又はインターフェロン応答性の細胞であると予測する予測ステップと、
を備える、方法。
（ａ） 前記被検細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 前記被検細胞におけるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 前記被検細胞におけるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 前記被検細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 前記被検細胞におけるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 前記被検細胞におけるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
【請求項２】
前記被検細胞は、ヒト由来の癌細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞は、肝癌細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記インターフェロンは、Ｉ型インターフェロンである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記Ｉ型インターフェロンは、インターフェロン−β又はインターフェロン−αである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含む、被検細胞のインターフェロンに対する感受性又は応答性を予測するキット。
（ｇ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 前記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
【請求項７】
Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のインターフェロンに対する感受性又は応答性を予測するマーカー遺伝子。
【請求項１】
被検細胞のインターフェロンに対する感受性又は応答性を予測する方法であって、
ＨｅｐＧ２細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞、ＨＬＥ細胞及びＨｅｐ３Ｂ細胞からなる群から選択されるいずれかの対照細胞と前記被検細胞とにおける、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量を測定する測定ステップと、
前記被検細胞における前記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量と、前記対照細胞における前記マーカー遺伝子又はその翻訳産物の発現量とをそれぞれ比較する比較ステップと、
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである場合に、前記被検細胞はインターフェロン非感受性又はインターフェロン非応答性の細胞であると予測し、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかである場合に、前記被検細胞はインターフェロン感受性又はインターフェロン応答性の細胞であると予測する予測ステップと、
を備える、方法。
（ａ） 前記被検細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｂ） 前記被検細胞におけるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｃ） 前記被検細胞におけるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して０．５倍以下である場合
（ｄ） 前記被検細胞におけるＫｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して４倍以上である場合
（ｅ） 前記被検細胞におけるＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
（ｆ） 前記被検細胞におけるＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子又はその翻訳産物の発現量が、前記対照細胞における発現量と比較して２倍以上である場合
【請求項２】
前記被検細胞は、ヒト由来の癌細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞は、肝癌細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記インターフェロンは、Ｉ型インターフェロンである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記Ｉ型インターフェロンは、インターフェロン−β又はインターフェロン−αである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
下記の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかを含む、被検細胞のインターフェロンに対する感受性又は応答性を予測するキット。
（ｇ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子をＰＣＲで増幅するためのＰＣＲプライマーセット
（ｈ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ
（ｉ） 前記ポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
（ｊ） Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及び／又はＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体
【請求項７】
Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４遺伝子、Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子及びＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍｅｉｎ １２遺伝子からなる群から選択され、被検細胞のインターフェロンに対する感受性又は応答性を予測するマーカー遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２１１９７０（Ｐ２０１１−２１１９７０Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８３７２４（Ｐ２０１０−８３７２４）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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