インテグリンα５β１のインヒビターおよび組織顆粒化の制御のためのそれらの使用
本発明はユーザーが傷部以内およびその周辺の組織肉芽化のインヒビターを同定し、それにより傷付いた組織の治癒に伴う過剰の廃痕形成を制限することを可能にする。本発明の方法を用いて同定される肉芽化インヒビターのあるものは、創傷部位内およびその周辺の肉芽化を５倍まで阻害し、網膜障害で試験した場合、それに対応して廃痕組織形成を減少する。本発明の方法を用いて同定し得る肉芽化インヒビターには抗体、ペプチド、核酸（アプタマー）および非ペプチド低分子量分子が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学および生理学、特に傷の治癒を促進する方法に関する。提供される方法により、ユーザーは創傷部位中およびその周辺における組織の肉芽化を処置するための治療薬として有用なインヒビターを特定し、傷ついた組織の治癒に伴う過剰の傷跡形成を制限することができる。本発明の方法を用いて同定された肉芽化インヒビターは、創傷部位内およびその周辺の肉芽化を５倍程度阻害し、それに伴って網膜の障害に試験した場合、廃痕組織の形成が減少する。さらに、これらのインヒビターはＲＰＥ細胞中の病変部に関連するマクロファージの挙動を阻害する。本発明の方法を用いて同定し得る肉芽化インヒビターには抗体、ペプチド、拡散（アプタマー）および非ペプチド低分子量分子が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
正常な状態、および傷治癒条件における傷の修復および組織形成は医療における主な目標である。傷の治癒における特異的な問題は、創傷部位内およびその周辺の過剰肉芽形成の結果である体液集積で生じる廃痕形成と下部膜からの組織の剥離である。これらの問題は眼の傷害、および関節軟骨等の他の組織において特に深刻である。例えば、傷の治癒においてＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの再編成が主として行われることが示されているが、結合組織内のこの様な分子の集積は、リューマチ性関節炎およびアテローム性動脈硬化と関連している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、治療された傷における肉芽化ばかりでなく、傷ついた、または組織移植を受けた哺乳動物組織、特にヒト組織の修復を制御するのに有用な方法と組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は傷ついた組織領域における肉芽化の制御法を提供する。この方法において、本発明の方法は初期の傷に伴う組織の損傷を最小にすることを幇助する。従って、本発明は傷ついた、または病んだ組織に肉芽化インヒビターを適用することを含む、有害な肉芽化を減少させる方法を提供する。病んだ、または傷ついた組織は眼の一部または関節であるか、または滑液嚢と関連し得る。ある方法はケロイド形成、火傷または皮膚硬化症等の症状で生じる、傷ついた、または病んだ組織の処置に有用である。他の方法は組織の炎症を生じる疾患に関連する、傷ついた、または病んだ組織の処置を提供する。このタイプの疾患の例にはリュウマチ性関節炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉芽腫症、好酸球肉芽腫症、正中肉芽腫、デスモイド、類肉腫症、黄紋変性、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、子宮類線維腫、側頭筋動脈炎、およびＴａｋａｙａｓｕ動脈炎が含まれる。例えばＣｒｏｈｎ病、特発性肺線維症、およびアレルギー性肺線維症等の炎症で生じる繊維形成を含む疾患も、本明細書に記載の処置に応答する。上記の様な疾患を治療する医薬として有用な肉芽化インヒビターには抗体、低分子量有機分子、および核酸、タンパク質およびペプチドが含まれる。
【０００５】
本発明の他の実施態様は、α５β１インテグリン結合剤を組織に施すことを含む、傷付いた、または病んだ組織における肉芽化を減少する方法である。この様な方法の対象となる組織には眼、皮膚、骨、関節、血管、靭帯および腱が含まれる。直接塗布、静脈注射、全身注入、噴霧吸入、点眼、および経口摂取を含むいくつかの技術で、結合剤を傷付いた、または病んだ組織に施すことができる。
【０００６】
本発明の方法を用いて処置し得る組織の損傷には切り傷、火傷、打撲傷および刺傷等の物理的傷害、化学的外傷、放射線源への暴露等が含まれる。組織の損傷による感染症もまた、本発明により処置し得る。しかしながら、本発明は非感染症、特に好ましくは手術中等の滅菌環境中で生じる、または優先的な感染を伴わないと思われる傷の処置に特に適している。本発明の方法で処置し得る疾患には糖尿病性網膜炎、リューマチ性関節炎、骨関節炎、組織肉芽化による黄斑変性、側頭動脈炎、多発性筋肉痛リューマチ、巨細胞動脈炎、Ｔａｋａｙａｓｕ動脈炎、Ｋａｗａｓａｋｉ病、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉芽腫症および血管炎、特発性肺線維症、全身性硬化症／皮膚硬化症、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群／症、乾燥症候群、アレルギー性肺線維症、類肉腫症、子宮前線維組織、血管腫、リンパ管腫、ケロイド瘢痕生成、Ｇｏｏｄｐａｓｔｅｕｒ病、Ｃｒｏｈｎ病、Ｐａｓｇｅｔｓ症候群、プテリギア、好酸球肉芽症、細胞顆粒化を生じる自己免疫疾患、および罹患組織内に血管新生を誘発する多くの傷および疾患が含まれるが、それらに限定されない。
【０００７】
本発明のいくつかの態様では、核酸（アプタマー）糖タンパク質、低分子量有機分子、ムティエン等であるα５β１結合剤が使用される。結合剤は抗α５β１インテグリン抗体であることが最も好ましく、配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体であることが望ましい。
【０００８】
本発明にはまた、細胞性肉芽化のインヒビターの同定法も含まれる。これらの方法のいくつかには、第１の傷組織をインヒビター候補の存在下にインキュベーションする工程、第２の傷組織をインヒビター候補を加えずにインキュベーションする工程、および第１傷組織と比較して第２傷組織中に存在する細胞性肉芽化のレベルを測定する工程が含まれる。
【０００９】
細胞性肉芽化の他の同定法には別なスクリーニングが含まれる。別なスクリーニングにはα５β１インテグリンを結合剤候補とインキュベーションする工程、フィブロネクチンをα５β１インテグリンと結合剤候補のインキュベーションに添加する工程、およびα５β１インテグリンがフィブロネクチンと結合するかどうかを測定する工程が含まれる。α５β１インテグリンがフィブロネクチンと結合できない場合、結合剤候補はインヒビター候補であることを示している。一度インヒビター候補が同定されると、それらを細胞性肉芽化阻害能について試験する。これには第１傷組織をインヒビター候補の存在下にインキュベーションする工程、第２傷組織をインヒビター候補を加えずにインキュベーションする工程、および第１傷組織と比較して第２傷組織中に存在する細胞性肉芽化レベルを測定する工程が含まれる。
【００１０】
細胞性肉芽化インヒビターを同定する二つの方法のある態様では、第１および第２傷組織は眼組織である。ある態様では、測定工程には染色組織切片を検査する工程が含まれる。また別な態様には結合またはインヒビター候補がタンパク質、好ましくは抗α５β１インテグリン抗体、最も好ましくは配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体である場合が含まれる。
【００１１】
眼の傷害および疾患に関連する実施態様では、罹患した眼の中の創傷部位を上記のα５β１インテグリン結合剤と接触させる工程を含むＲＰＥ細胞の挙動の制御法が提供される。その結果、罹患した眼のＲＰＥ細胞がマクロファージ挙動を示すことを阻害する。または、ＲＲＥ細胞はより繊維芽細胞型の形態を取る様に思われる。阻害されるマクロファージ挙動のタイプには食細胞活性、およびサイトカイン、ケモカインおよび炎症反応媒介因子が含まれる。結合剤は抗α５β１抗体であることが好ましく、α５β１インテグリンに対し配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体と競合的に結合する抗体であることがより好ましく、配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体であることが最も好ましい。本発明のある態様では、傷付いたまたは病んだ組織への直接塗布、静脈内注射、全身注入、噴霧吸引、点眼、および経口摂取を含むいくつかの方法で、結合剤を傷付いたまたは病んだ組織に施すことができる。傷付いたまたは病んだ眼の傷害部位が感染で生じたものでないことが好ましい。
【００１２】
肉芽化インヒビターで調節される生理効果の評価法に、眼組織も用いられる。これらの方法には肉芽化を形成するに十分な障害を眼組織中に形成する工程、眼組織に一定量の肉芽化インヒビターを投与する工程、および薬品投与眼組織の障害中またはその周りの肉芽化をモニターする工程が含まれる。本実施態様のある態様では、眼組織は生きた霊長類の眼の一部である。本実施態様で使用される眼組織は網膜、角膜斑または角膜組織である。本発明のある態様では、眼組織中の障害の形成がレーザー光で行われる。ある態様では、レーザー光は約３００〜７００ミリワットであり、暴露時間は０．１秒以下である。形成した傷害は直径約５０〜１００μｍであることが好ましい。肉芽化インヒビターの投与は任意の方法、例えば直接適用、静脈内注射、全身注入、噴霧吸入、点眼、または経口摂取が可能である。肉芽化インヒビターは上記の任意の分子でよいが、好ましくは抗α５β１抗体、より好ましくは配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
１．定義
特に断らない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術の当業者が通常理解する意味を有する。以下の文献は、本発明で用いられる多くの用語の一般的な定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．、１９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ａｎｄ Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で用いる以下の用語は、特に断らない限りその本来の意味を有する。
【００１４】
「インテグリン」という用語は、多様な細胞中で発現し、細胞外マトリックス中で特定のリガンドに結合する細胞外受容体を指す。インテグリンが結合する特異的リガンドはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；ＲＧＤ）またはロイシン−アスパラギン酸−バリントリペプチドを含み、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テナスシンおよびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子が含まれる。ヘテロダイマーのインテグリン領域スーパーファミリーはαサブユニットとβサブユニットで構成される。例えばαＶ、α５等で指定される多くのαサブユニット、および例えばβ１、β２、β３、β５等で指定される多くのβサブユニットが同定され、α５β１、αＶβ３およびαＶβ５を含むこれらのサブユニットの様々な組み合わせが、インテグリンサブファミリーを代表する。インテグリンのスーパーファミリーを例えばαＶβ３およびαＶβ５を含むαＶ含有インテグリン、またはα５β１およびαＶβ１を含むＰｉ含有インテグリン等のファミリーに細分することができる。インテグリンはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、両生類、トリおよびヒトを含む哺乳動物を含む広い範囲の生物中で発現する。
【００１５】
α５β１インテグリンと結合する本明細書で開示するタンパク質、特に抗体、突然変異タンパク質、ムティン、核酸アプタマー、およびペプチドおよび非ペプチド低分子量有機分子は、本発明の「結合剤」および「肉芽化インヒビター」として作用する。「結合剤」という用語は、本明細書では受容体とそのリガンドとの特異的相互作用を妨害し得る試薬を意味するものとして使用される。α５β１とフィブロネクチンとの結合を妨害し、それにより会合を減少または阻害し得る抗α５β１インテグリン抗体は、α５β１結合剤の１例である。α５β１結合剤は、そのリガンドへ結合するα５β１インテグリンの競合的インヒビターまたは非競合的インヒビターとして作用し得る。
【００１６】
肉芽化インヒビターには、本明細書で説明する様に創傷部位へ施した場合、組織の肉芽化を減少させる結合剤が含まれる。
【００１７】
「結合剤候補」とは、本明細書で定義する様にα５β１インテグリンに特異的に結合し得る分子種を指す（すなわち結合剤であり得る分子種）。
【００１８】
「インヒビター候補」とは、α５β１インテグリンに特異的に結合し、傷組織に施した場合、細胞の肉芽化を阻害し得る分子種を指す。
【００１９】
「特異的に（または選択的に）結合する」という語句、または抗体相互作用を指す場合、「特異的に（または選択的に）〜と免疫反応性」という語句は、生理条件下でバックグラウンド分子会合の少なくとも２倍、より典型的には１０〜１００倍以上の２つの分子間の結合反応を指す。タンパク質である少なくとも１個の検出可能結合剤を使用する場合、当為的結合とはタンパク質および他の生体物質の異種集団中のそのタンパク質の存在を決定する因子である。従って、特定の免疫分析条件下では、特異性抗体が特定のタンパク質配列に結合し、その存在を同定する。
【００２０】
この様な条件下の抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性で選択された抗体が必要である。例えば、特定のタンパク質、多形突然変異体、対立遺伝子、オーソログ、および保存的に修飾された突然変異体、またはスプライス突然変異体、またはその一部を選択して、α５β１インテグリンと特異的に免疫反応性であるが他のタンパク質とは反応性でないポリクローン抗体を得ることができる。この選択を、他の分子と交差反応性である抗体を除外することで実行できる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々な免疫分析フォーマットを使用し得る。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫分析が日常的に使用される（特異的免疫反応性を測定するために使用できる免疫分析フォーマットと条件については、例えばＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）参照）。２つの分子が特異的に相互作用するかどうかを決定する方法が本明細書に記載され、結合親和性と特異性の決定法は公知である（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）；Ｆｒｉｅｆｅｌｄｅｒ、“Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、１９７６）参照）。
【００２１】
一般に結合剤と肉芽化インヒビターは、その天然リガンドに結合するα５β１インテグリンを「妨害」する。他のインテグリンリガンドのインテグリン結合能に関する結合剤の作用を参照して使用される場合、「妨害する」とはインテグリンとそのリガンド間の相互作用の親和性が、結合剤がない場合に生じる結合レベル以下に減少することを指す。受容体とそのリガンドとの会合がこの様な分子群間で生じる動的な関係にあり、任意の時点で受容体とリガンドのある部分が会合状態にあることを、当業者は理解し得ると考えられる。従って、受容体とそのリガンドとの特異的相互作用を妨害する試薬は、ある時点で生じるこの様な相互作用の相対的な数を減少させ、ある場合はこの様な会合の全てを完全に阻害し得る。α５β１インテグリン結合剤が受容体とそのリガンドとの会合を阻害する、または会合を特定の分析の検出限界以下に減少させるかどうかを判別することは困難である。従って、受容体とそのリガンドとの特異的結合を減少させる、または阻害すること包含して、「妨害」という用語は本明細書では広く用いられる。
【００２２】
さらに、α５β１インテグリン結合剤は様々な機構、例えばリガンド結合部位に結合し、その結果リガンド結合を妨害することにより；受容体のリガンド結合部位以外に結合するが、リガンドの受容体への結合を立体的に妨害することにより；受容体に結合し、リガンドの結合を妨害する受容体の立体配座その他の変化を生じさせることにより；または他の機構により、受容体とそのリガンドとの特異的結合を妨害することができる。同様に、結合剤はリガンドと結合して、または相互作用して受容体との特異的相互作用を妨害する。本明細書に開示した目的では、妨害を生じる機構の理解は必要でなく、作用の機構を提案していない。抗α５β１抗体またはその抗原結合フラグメント等のα５β１結合剤の特徴は、少なくとも約１０５ｍｏｌ−１、１０６ｍｏｌ−１以上、好ましくは１０７ｍｏｌ−１以上、より好ましくは１０８ｍｏｌ−１以上、最も好ましくは１０９ｍｏｌ−１以上のα５β１インテグリンに対する特異性結合活性（Ｋａ）を有することである。例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−７２、１９４９）により、当業者は抗体の結合親和性を容易に決定することができる。
【００２３】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、天然起源の抗体の他、例えば１本鎖抗体、キメラ２価ヒト化抗体、およびその抗体結合フラグメント（例えばＦａｂ‘、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）を包含する。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ １９９４−１９５５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）および例えばＫｕｂｙ、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ，、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）参照。この様な非天然起源抗体を固相ペプチド合成を用いて構築するか、組み換えで製造するか、例えばＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に記載され、本明細書に引用して援用する可変重鎖および可変軽鎖でなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして得ることができる。例えばキメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト１本鎖２価抗体は当業者に公知である（Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａ，１９８８；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２ｎｄ ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；それぞれを本明細書に引用して援用する）。
【００２４】
「抗体」という用語にはポリクローンおよびモノクローン抗体の双方が含まれる。この用語にはまた、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）およびヘテロ共役付加抗体（例えば双特異性抗体）遺伝子操作型も含まれる。この用語は組み換え１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）も指す。抗体という用語には２価または双特異性分子、２抗体、３抗体および４抗体も含まれる。２価および双特異性分子は例えばＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．、（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１５４７，Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａ，Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ：５３６８；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：７８１；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５；Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４０２６；およびＭｃＧａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：３０１に記載されている。
【００２５】
典型的には抗体は重鎖および軽鎖を有する。重鎖および軽鎖のそれぞれは不変領域および可変領域を有する（この領域は「ドメイン」としても知られている）。軽鎖および重鎖可変領域は３個の超可変領域で隔てられた４個の「骨格」領域を有し、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。骨格領域とＣＤＲの長さは定義されている。異なった重鎖または軽鎖の骨格領域の配列は一定の種内では相対的に保存されている。構成軽鎖および重鎖の組み合わせ骨格領域である抗体の骨格領域は、ＣＤＲを３次元空間に位置し配列する役割を果たす。
【００２６】
ＣＤＲは主として抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは典型的にはＮ−末端から開始して番号が付けられるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、特定のＣＤＲが位置する鎖で同定される。従って、ＶＨＣＤＲ３はそれが結合する抗体の重鎖の可変領域に位置し、一方、ＶＬＣＤＲはそれが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。
【００２７】
「ＶＨ」の例はＦｖ、ｓｃＦｖまたなＦａｂの重鎖を含む抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域である。「ＶＬ」の例はＦｖ、ｓｃＦｖまたなＦａｂの軽鎖を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域である。
【００２８】
「１本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という語句は、伝統的な２本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが結合して１本鎖を形成する抗体を指す。典型的には、リンカーペプチドが２本の鎖の間に挿入され、適切な折り畳みと活性結合部位の形成が可能になる。
【００２９】
「キメラ抗体」とは（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なった、または変化したクラス、エフェクター機能および／または種の不変領域、またはキメラ抗体に例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等の新しい性質を付与する全く異なった分子に結合する様に、不変領域またはその一部が変化した、または置換または交換された免疫グロブリン分子；または（ｂ）可変領域またはその一部が変化した、または異なったまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で置換または交換された免疫グロブリン分子である。
【００３０】
「ヒト化抗体」とは非ヒト免疫グロブリン由来の最少の配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体には受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が所望の特異性、親和性および容量を有するマウス、ラットまたはウサギ等の非ヒト種（供与者抗体）由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）が含まれる。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格領域が対応する非ヒト残基で置換されている。ヒト化抗体はまた、受容者抗体または導入ＣＤＲまたは骨格配列内に見出されない残基を有してもよい。一般にヒト化抗体は少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを有するが、可変領域内では骨格領域（ＦＲ）の全て、または実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの不変領域の一部を有することが最適である（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。ヒト抗体に対しげっ歯類ＣＤＲ配列（単数または複数）を置換することにより、ヒト化をＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って基本的にあらかじめ生成することができる。従って、この様なヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的に少なくとも無傷のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。
【００３１】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープをタンパク質の３次元折り畳みで並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の双方から形成することができる。隣接アミノ酸で生成したエピトープは典型的には変性溶剤に晒しても保持されるが、３次元折り畳みで形成したエピトープは変性溶剤で処理すると典型的に失われる。エピトープには独自の空間配置中に少なくとも３個、通常は少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸が含まれる。エピトープの空間配置の決定法には例えばＸ−線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば「分子生物学の方法におけるエピトープマッピングプロトコール」、第６６巻、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ Ｅｄ（１９９６）参照。エピトープマッピングの好ましい方法は表面プラズモン共鳴であり、本明細書に開示するＩＩＡＩと同じエピトープ境域を認識する好ましい肉芽化インヒビターを同定するために用いられている。
【００３２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では互換的に用いられている。この用語は、少なくとも１個のアミノ酸残基が対応する天然起源アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーの他、修飾された残基、および非天然由来のアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３３】
用語「アミノ酸」とは天然起源アミノ酸および合成アミノ酸の他、天然起源アミノ酸と同様に機能をするアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然起源アミノ酸は遺伝子コードでコードされるアミノ酸の他、以後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスフォセリンである。アミノ酸アナログとは天然起源アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば水素、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキシド、メチオニンメチルスルフォニウムを指す。この様なアナログは修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有してもよいが、天然起源アミノ酸と同じ基本化学構造を維持している。アミノ酸模倣体とはアミノ酸の一般的な化学構造とは異なった構造を有するが、天然起源アミノ酸と類似の機能を有する化合物を指す。
【００３４】
アミノ酸は本明細書では一般に知られた３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字記号で表される。同様にヌクレオチドも一般に受け入れられている１文字コードで表される。
【００３５】
「保存的に修飾された突然変異体」はアミノ酸および核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された突然変異体とは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は基本的に同一または関連する配列、例えば天然の隣接配列を指す。遺伝コードの縮退のため、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ，ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって指定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変えることなくあるコドンを対応する他のコドンに変えることができる。この様な核酸の突然変異は「沈黙突然変異」であり、保存的に修飾された変化の１種である。あるポリペプチドをコードする本明細書の核酸配列の全ては、その核酸の沈黙突然変異である。当業者はある状況では核酸中の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）を修飾して機能的に同一の分子を生成することができることを理解し得ると思われる。従って、あるポリペプチドをコードする核酸の沈黙突然変異は、発現生成物に関して記載された配列中で暗黙に認められるものであるが、実際のプローブ配列中ではそうではない。
【００３６】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列中の単一アミノ酸またはアミノ酸のわずかな割合を変化、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、その変化があるアミノ酸を化学的に類似のアミノ酸で置換する結果になる場合、「保存的に修飾された突然変異体」であることを当業者は理解し得ると思われる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は公知である。この様な保存的に修飾された突然変異体は本発明の多形突然変異体、種間同族体および対立遺伝子に付加されるものであり、それらを除外するものではない。典型的な相互の保存性置換は１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ（１９８４）参照）。
【００３７】
少なくとも２個のペプチドに関連する「同種」とは、以下に記載するデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定される、または手動整列および目視検査による、同一であるアミノ酸残基の指定されたパーセント（すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたる最大の対応性に対して比較し整列した場合、指定した領域にわたる約６０％の同一性、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性）を有する少なくとも２個の配列またはサブ配列を指す（例えばＮＣＢＩウエブサイトｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等を参照）。この定義には欠失および／または付加を有する配列の他、置換を有する配列、天然起源、例えば多形または対立遺伝子突然変異体、および人工突然変異体も含まれる。以下に述べる様に、好ましいアルゴリズムはギャップ等を考慮することができる。長さで少なくとも２５アミノ酸である領域にわたって同一性が存在することが好ましく、長さで５０〜１００アミノ酸である領域に渡って同一性が存在することがより好ましい。
【００３８】
配列の比較のため、典型的にはある配列が参照配列となり、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要あればサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを指定することが好ましいが、別なパラメーターを指定することもできる。次いでプログラムパラメーターに基づき、参照配列と比較して配列比較アルゴリズムが試験配列に対する配列同一パーセントを計算する。
【００３９】
本明細書で使用する「比較ウインドウ」には、２つの配列を最適に整列した後、ある配列が同じ数の隣接位置の参照配列と比較される、典型的には２０〜６００、通常は約５０〜約２００、さらに約１００〜約１５０でなる群より選ばれた隣接位置の数の一つに対する参照が含まれる。比較のための配列の整列法は公知である。比較のための配列の最適整列は例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８））の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＦＡＳＴＡ）、または手動整列および目視検査（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．、１９９５、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））により行うことができる。
【００４０】
配列同一度パーセントと配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例には、Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されたＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０が含まれる。本明細書に記載のパラメーターを有するＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明の核酸およびタンパク質に対する配列同一性パーセントを決定するために用いられる。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウエアはＮａｔｉｏｎｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムには最初に質問配列中の長さＷの短いワードを同定することによる高スコア配列対の同定が含まれ、データーベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、それを満足する。Ｔは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｈｕｌら、上記）。最初の近隣ワードヒットが、それらを含むより長いＨＳＰの検索を開始するためのシードとなる。累積整列スコアが増加する限り、ワードヒットが各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは例えばヌクレオチド配列、パラメーターＭ（一致残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびパラメータＮ（ミスマッチスコアに対する罰スコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列に対してスコアマトリックスが累積スコアを計算するために用いられる。累積整列スコアがその達成した最大値からある量Ｘだけ下降した場合；少なくとも１個の負スコア残基整列の累積のため、累積スコアがゼロ以下に下がった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合、各方向へのワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対する）はデフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および２つの鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス整列（Ｂ）５０（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および２つの鎖の比較を使用する。
【００４１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的解析も行う（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の基準は最少和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指針を提供する。例えば、試験ペプチドの参照ペプチドに対する比較における最少和確率が約０．２以下、より好ましくは約０．０１以下、最も好ましくは約０．００１である場合、あるペプチドが参照配列に類似であると考えられる。ログ値は例えば５、１０、２０、３０、４０、４０、７０、９０、１１０、１５０、１７０等の大きな負の値である。
【００４２】
「ラベル」または「検出可能成分」はスペクトロスコピー、光化学、生化学、免疫化学、化学または他の物理的手段により検出可能な成分である。例えば、有用なラベルには蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（通常ＥＬＩＳＡで使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンまたは例えば放射線ラベルをペプチド中に取り込むことにより検出可能にした、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられる他の成分が含まれる。例えば放射性同位体は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉである。ある場合、特に抗α５β１インテグリン抗体を用いる場合は、放射性同位元素は以下に記載する様な毒性成分として用いられる。抗体の任意の位置にラベルを取り込んでもよい。抗体をラベルに結合する任意の公知の方法を用い得るが、それらにはＨｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ。３０：４０７（１９８２）が含まれる。放射線標識ペプチドまたは放射線標識抗体成分の寿命を、放射線標識ペプチドまたは抗体を安定化し、分解を防止する物質を添加することにより延長し得る。放射線標識ペプチドまたは抗体を安定化する任意の物質またはその組み合わせを、米国特許第５，９６１，９５５号に記載の物質を含め使用し得る。
【００４３】
例えば細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される用語「組み換え体」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然核酸またはタンパク質の変化により修飾されているか、または細胞がその様に修飾された細胞から誘導されたことを示す。従って、例えば組み換え細胞は細胞の天然（非組み換え）型内に見出されない遺伝子を発現するか、または他の場合は異常発現するか、わずかに発現するか、または全く発現しない天然遺伝子を発現する。本明細書の「組み換え核酸」という用語は、一般的に例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる核酸の操作により、天然に通常見いだされない形で最初にインビトロで形成される核酸を意味する。この様にして、異なった配列の作動可能な結合が行われる。従って、鎖状の単離核酸、または通常は結合しないＤＮＡ分子をライゲーションしてインビトロで生成する発現ベクターの双方は、本発明の目的のための組み換え体であると考えられる。組み換え核酸が一度作成され、宿主細胞または生物中に再導入されると、その核酸は非組み換え的に、すなわちインビトロ操作でなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製すると理解される。しかしながら、組み換えで一度製造されたこの様な核酸は非組み換え的に引き続き複製するが、本発明の目的に対しては組み換え体であると考えられる。同様に、「組み換えタンパク質」は組み換え技術を用いて上記の様な組み換え核酸の発現により製造されたタンパク質である。
【００４４】
「眼組織」とは脊椎動物の眼に見出される任意の組織型、または組織型の組み合わせを指す。眼組織の例には網膜、硝子体、角膜斑および角膜組織が含まれる。「病変眼」とは本発明の肉芽化インヒビターに反応する傷付いた組織を有する眼を指す。
【００４５】
「損傷または病変組織」または「傷付いた組織」とは、細胞性肉芽化を誘発するに十分な外傷を負った任意の組織を指す。「傷付いた部位」とは、細胞性肉芽化を生じる領域を指す。肉芽化を誘発するに十分な外傷は罹患組織の物理的、化学的または感染侵入の結果である。外傷は自己免疫反応等の異常な生理的な出来事、または例えばカビまたはバクテリア等の病原体の侵入で生じ得る。
【００４６】
「傷」とは組織への物理的、化学的または感染傷害で生成した組織損傷の局部領域を指す。本発明の文脈では、傷が傷害部位を生成し、肉芽化を引き起こす。
【００４７】
「感染」とは体部分または組織中への病原性微生物の侵入と増殖を指す。本発明の文脈では、組織の感染がそれに続く組織の障害を形成し、傷付いた組織となる。
【００４８】
「肉芽化」または「細胞性肉芽化」とは、小さな赤い突起が傷または傷付いた部位の生の表面上に形成し、一般的には治癒プロセスを促進する傷治癒プロセスの部分を指す。しかしながらある場合は、肉芽化が過剰で治癒した組織を不必要に損なったり、周辺組織に損傷を与えたりすることもある。「肉芽化減少」とは過剰の肉芽化を制御または減少し、弱くなった治癒組織、または過剰の肉芽化で生じる周辺組織への損傷を最少にするプロセスである。
【００４９】
有害な肉芽化とは、最初の傷の後に生じ、最初の創傷部位を越えてに組織を傷つける肉芽化を指す。有害な肉芽化は一般に創傷部位を生じる解剖学的環境の結果である。創傷部位が有害な肉芽化を受ける組織の例には、眼の角膜斑（硝子体空間）、結合組織（滑液空間）および肺胞膜（肺胞空間）等の内腔を接着する表面、またはその近くが含まれる。
【００５０】
「マクロファージ挙動」とは活性化マクロファージの挙動を真似る非マクロファージ細胞型の表現型挙動を指す。マクロファージ挙動の例にはバクテリア等の細胞性および異物屑を指向する食細胞活性、およびサイトカイン等の成長およびパラクリン因子の分泌が含まれる。
【００５１】
「ＲＰＥ細胞挙動」とは、網膜の下に細胞層を形成し、光受容体細胞の機能を支援する網膜色素上皮細胞の表現型活性を指す。栄養を提供し老廃物を除去するために、光受容体細胞はＲＰＥに依存する。ＲＰＥ細胞の挙動には罹患した眼に傷付いた組織を形成する障害に対するＲＰＥ細胞の反応が含まれる。傷害に反応して、ＲＰＥ細胞は形質変換してマクロファージ挙動を取る様に思われる。本発明の肉芽化インヒビターは、細胞がマクロファージ挙動の代わりに繊維芽細胞様の形態を取る様に導くことにより、傷に対するこのＲＰＥ細胞挙動を変化させる。
【００５２】
「染色組織切片」とは、組織薄片に存在する特徴を同定し易くする少なくとも１種の染料またはラベルを染み込ませた組織の薄い薄片を指す。組織染色キットは当業者に公知であり、例えばＳＡＮＹＯ Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ ｐｌｃ、Ｍｏｎａｒｃｈ Ｗａｙ、Ｂｅｌｔｏｎ Ｐａｒｋ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ ＬＥ１１ ５ＸＧ等が市販されている。
【００５３】
肉芽化インヒビター、結合剤、インヒビターおよび結合剤候補、およびこれらの化合物を含む組成物を傷付いた組織に様々な方法で施すことができる。本明細書で用いる「直接塗布」とは、化合物を創傷部位に直接接触させることを指す。「硝子体内注入」とは、化合物を眼の硝子体液中に注入し、化合物を創傷部位に拡散させるか、または罹患した対照の血管系を通って創傷部位に運送することを指す。「強膜注入」とは、肉芽化インヒビターを眼の強膜中に直接注入することを指す。「全身注入」とは、処置する創傷部位から離れた部位に注入することを指す。全身注入には静脈内、皮下および筋肉内注入が含まれる。「噴霧吸入」とは液状化合物を微小液滴中に分散し、次いで吸入することを指す。噴霧吸入は肺中の創傷部位の処置に特に有用であり、化合物を肺胞中に吸収し、血管系を通って離れた創傷部位に輸送する。「点眼」とは、液状化合物を罹患者の眼の外部表面に施すことを指す。
【００５４】
ＩＩ．始めに
本発明はユーザーが創傷部位内およびその周辺の組織肉芽化インヒビターを同定し、傷組織の治癒に伴う過剰の瘢痕形成を制限し得る方法を提供する。本発明の方法の有効性が図１２に示され、２５μｇまたは１００μｇの肉芽化インヒビターの硝子体内注入で処置された網膜損創傷部位における組織形成が、緩衝液で処置された対照者と比較してほぼ５倍減少したことを示す。本発明の好ましい肉芽化インヒビターは、α５β１インテグリンに対し競合的に結合する、配列番号１〜６でなる群から選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体を有する複数の抗体である。より好ましくは、肉芽化インヒビターは配列番号１〜６でなる群から選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域（図１および２参照）と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域（図１および２参照）とを有する抗体である。
【００５５】
本発明の肉芽化インヒビターを、本明細書に記載の様々な技術で局所的または全身に配送することができる。図１３は５ｍｇ／ｋｇ（図１３Ａ）、１５ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｂ）および５０ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｃ）の最初の静脈内投与後の異なった時点における、肉芽化インヒビターＭ２００（以前は「ＥＯＳ２００−４」と呼ばれる）の血清レベルを示す。簡単に言えば、個体に５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇで静脈注入し、血清を採取し、示された日に書く投与量レベルに対するＭ２００を調べた。
【００５６】
図１３Ｄ〜１３Ｆは、各週の静脈投与で治療投与量レベルを個体中で維持することが可能であることを示している。簡単に言えば、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇを個体に毎週、静脈注射し、血清を採取し、示された日に各投与量レベルに対してＭ２００を試験した。肉芽化インヒビターの治療レベルは、少なくとも１５および５０ｍｇ／ｋｇ投与で維持された。
【００５７】
図１４は肉芽化インヒビターＭ２００の単核細胞α５β１インテグリンへの結合を示し、インヒビターの機能が劣化せず、血清中で活性を保っていることが確認された。簡単に言えば、先に記載した様に個体に指示された量で一回投与した。示された日に採集した全血単核細胞についてＦＡＣＳ測定を行った。図に示す様に、α５β１インテグリンと県連する結合部位のＭ２００占有率は、各日の肉芽化インヒビターの血清レベルと相関する。これらの研究から、約６０μｌの血清肉芽化インヒビターが、血液単核細胞α５β１インテグリン結合部位を完全に飽和するに十分であることを決定することができる。
【００５８】
図１５は図１４の結果を確認する。図１５はＭ２００結合と逆数の関係にある単核細胞α５β１インテグリンを用いる競合ＦＡＣＳ分析であり、Ｍ２００が飽和するこれらのデーターポイントでは完全にブロックされている。
【００５９】
本発明の方法により同定された肉芽化インヒビターの多くが毛管膜および／または基底膜を透過し得るので、全身および直接投与に加えてこれらのインヒビターを局所投与してもよい。
【００６０】
ＩＩＩ．α５β１インテグリン結合部位および肉芽化インヒビター化合物、およびライブラリーの調製
本明細書に開示する様に、α５β１インテグリンに結合するタンパク質、特に抗体、突然変異タンパク質、核酸アプタマー、およびペプチドおよび非ペプチド低分子量有機分子は本発明の結合剤および肉芽化インヒビターとなる。結合剤を天然起源、合成または組み換え調製物、およびその組み合わせから単離し得る。
【００６１】
例えば、ペプチドを“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｓｉｓ”ｂｙ Ｇ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｖｏｌ．２，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｎｅｎｈｏｆｆｅｒ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｐ１００−１１８、（１９８０））に記載の様に固相技術を用いて製造してもよい。同様に、核酸をＢｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．＆Ｉｙｅｒ、Ｒ．Ｐ（１９９２）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８、２２２３−２３１１）、およびＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，、ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−８０５（１９８４）に記載の様に固相技術を用いて合成することができる。
【００６２】
様々なアミノ酸模倣体または非天然アミノ酸による本発明のペプチドの修飾が、ペプチドのインビボ安定性を増加させるのに特に有用である。安定性をいくつかの方法で分析することができる。例えば、ペプチダーゼ、およびヒト血漿および結成等の様々な生物媒体が安定性試験に使用されている。例えばＶｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）参照。本発明のペプチドの半減期は通常、２５％（ｖ／ｖ）ヒト血清分析を用いて測定される。そのプロトコールは一般に以下の通りである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、熱不活性化なし）の脂質を使用前に遠心で除去する。次いで血清をＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性試験に用いられる。所定の時間間隔で少量の反応液を取り出し、６％トリクロロ酢酸水溶液またはエタノール中に添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、沈殿した血清蛋白質をペレットにする。次いで安定性特異性条件を用いてペプチドの存在を逆相ＨＰＬＣで測定する。公知の他のペプチド修飾にはグリコシル化およびアセチル化が含まれる。
【００６３】
核酸の場合は、既存の配列を公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて修飾することができる。例えば、Ａｌｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、ＤＮＡ、２：１８３（１９８３）に記載の様に部位指向突然変異誘発技術を用いて塩基１個の変更を行うことができる。
【００６４】
または、ＰＣＲ技術または適当な宿主中の発現を用いて核酸を増幅することができる（注：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）。ペプチドおよびタンパク質を公知の組み換え技術を用いて、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓ＆Ｃｕｒｔｉｓ、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１：３４７−３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ、１９８３）に記載の様に適当な宿主細胞を組み換えＤＮＡコンストラクトで形質転換して発現してもよい。
【００６５】
本発明のペプチドおよび核酸は市場でも入手し得るか、または所望の分子の構想的および／または機能的性質が与えられれば商業的に生産し得る。
【００６６】
本発明はまた、ペプチドの構造を模倣する有機分子、またはビニローグペプトイドであるペプトイドペプチド模倣体を含む非ペプチド低分子量分子であるα５β１インテグリン結合剤を想定している。α５β１インテグリン結合剤として作用する非ペプチド低分子量分子および肉芽化インヒビターは、例えば一般構造（Ｓ）−２−フェニルスルフォニルアミノ−３−｛｛｛８−（２−ピリジニルアミノメチル）−｝−１−オキサ−２−アザスピロ−｛４，５｝−デク−２−エンイル｝カルボキシアミノ｝プロピオン酸；（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルフォニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノエチル）−１−オキサ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸（米国特許第５，７６０，０２９号参照）を有する複素環であり得る。本発明の方法に有用な別な非ペプチド低分子量有機分子であるα５β１結合剤を、例えば上記に開示された構造を有する複素環の化学修飾誘導体、または他の非ペプチド低分子量有機分子をスクリーニングすることにより同定することができる（以下を参照）。
【００６７】
本発明の好ましい実施態様には、α５β１抗体、好ましくはキメラ抗体、最も好ましくはヒト化抗体である肉芽化インヒビターが含まれる。この様な抗体の製造法はすぐ下に議論される。
【００６８】
Ａ．抗体肉芽化インヒビター
抗α５β１インテグリン抗体を含む抗インテグリン抗体を製造業者、たとえばＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から購入することができるか、実質的に精製された全長インテグリン等の免疫源を用いて育成することができる。このインテグリンはヒトインテグリン、マウスインテグリンまたは天然起源から調製された、または組み換えで製造された他の哺乳動物インテグリンまたは非哺乳動物インテグリンである。または、このインテグリンはＲＤＧ結合ドメイン部分を含むインテグリンのペプチド部分、例えば合成ペプチドである。ヒトα５β１等のインテグリンの非免疫源ペプチド部分を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の担体分子にハプテンを結合することで、またはペプチド部分を融合タンパク質として発現することで免疫原性にすることができる。様々な他の担体分子、およびハプテンを担体分子に結合する方法は公知であり、例えばＨａｒｋｏｗおよびＬａｎｅ（上記、１９８８）により記載されている。
【００６９】
本発明の方法を実施するために特に有用な抗体は、α５β１インテグリンに特異的に結合するヒト化抗体である。この様な抗体は、それらが他のインテグリン、例えばαＶβ３またはαＶβ５に結合するよりも少なくとも１桁大きい親和性でα５β１インテグリンに結合する場合、特に有用である。ヒト化抗体を含むキメラ抗体の生成法を以下に詳しく説明する。
【００７０】
１．組み換え抗体肉芽化インヒビターの製造
本発明の肉芽化インヒビターとして機能し得る組み換えキメラヒト化抗体を調製するために、非ヒト化抗体をコードする核酸を最初に単離しなければならない。典型的にはこれは動物、例えばマウスを調製されたα５β１インテグリン、またはそれから誘導された抗原性ペプチドで免疫処理することで行われる。典型的には１匹のマウスあたり約５０マイクログラムのタンパク質抗体で２回、マウスを腹腔内免疫処理する。この様なポリペプチドを発現する任意の宿主系に関する免疫組織学または免疫細胞学、および発現ポリペプチドを用いるＥＬＩＳＡにより、免疫処理したマウス由来の血清の抗体活性を試験することができる。免疫組織学では、本発明の活性抗体をビオチン結合抗マウス免疫グロブリン、次いでアビジン−ペルオキシダーゼおよび色素生成ペルオキシダーゼ基質を用いて同定することができる。この様な試薬の調合物は例えばＺｙｍａｐ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から購入することができる。その血清が検出可能な本発明に記載の活性抗体を含むマウスを３日後に殺し、融合およびハイブリドーマ製作のために脾臓を取り出す。当業者に公知の分析、例えばウエスターンブロット分析を用いて、この様なハイブリドーマの要請の上澄み液を同定することができる。
【００７１】
次いで例えばハイブリドーマｍＲＮＡまたは脾臓ｍＲＮＡを重鎖および軽鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用の鋳型として用いて、所望の抗体鎖をコードする核酸を単離することができる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７６（１９８９））。抗体および細胞内抗体の双方を製造するための核酸を、この技術を用いてマウスモノクローンハイブリドーマから誘導することができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｊ．Ｈ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：３１３７−３１４１（１９９５）；Ｂｉｏｃｃａ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．，、Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７：４２２−４２７（１９９３）；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ、Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１５４２−１５５１（１９９５））。これらのハイブリドーマは、抗体構築用の特性が良く分かった試薬の信頼できる供給源を提供し、それらのエピトープ反応性および親和性の特性が分かれば特に有用である。単離された細胞から核酸の単離はＣｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ． ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）（脾臓）；Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．，、上記；Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．，、上記；Ｍａｒｋｓ、Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．，、上記；Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８−７９８２（１９９１）（ヒト末梢血リンパ球）にさらに議論されている。ヒト化抗体には免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部が任意に含まれる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。
【００７２】
キメラおよびヒト化組み換え抗体の双方を製造するためにいくつかの方法が報告されている。タンパク質のジスルフィド結合を通じて結合した抗体ドメインの配列の制御を利用できる（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ ｅｔ ａｌ．，、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ、１４（１）：９５−９９（１９８１））。マウス抗体可変軽鎖および重鎖可変ドメイン、およびヒト抗体軽鎖および重鎖不変ドメインをコードするＤＮＡ配列間の遺伝子融合を構築するために、組み換えＤＮＡ技術を使用することもできる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１（２１）：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００７３】
マウスモノクローン抗体の抗原結合部分または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列を、分子的手段でヒト抗体重鎖および軽鎖の骨格をコードするＤＮＡ配列中へ移植してもよい（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３２１（６０６９）：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２（６１６２）：３２３−３２７（１９８８））。発現した組み換え生成物は「再形成」またはヒト化抗体と呼ばれ、ヒト抗体軽鎖および重鎖、およびマウスモノクローン抗体の抗原認識部分ＣＤＲを有する。
【００７４】
ヒト化抗体を製造する他の方法は米国特許第５，６９３，７６２号、５，６９３，７６１号、５，５８５，０８９号、５，６３９，６４１号、５，５６５，３３２号、５，７３３．７４３号、５，７５０，０７８号、５，５０２，１６７号、５，７０５，１５４号、５，７７０，４０３号、５，６９８，４１７号、５，６９３，４９３号、５，５５８，８６４号、４，９３５，４９６号、４，８１６，５６７号および５，５３０，１０１号に記載され、本明細書に引用して援用する。
【００７５】
１本鎖抗体を製造するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、α５β１インテグリンに対する１本鎖ヒト化抗体を製造するために用いることができる。
【００７６】
２．抗体肉芽化インヒビターの単離
親和性精製
血清の抗体プールのアフィニティー精製は、当業者により均一な試薬を提供する。アフィニティーカラムを作成するための抗体アフィニティーマトリックスを用いる抗体肉芽化インヒビターの濃縮法は公知であり、市販されている（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ、ｃ／ｏＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ、Ａｒｔｉｌｌｅｒｉｖｅｊ５、Ｂｌｄｇ．Ｐ２、ＤＫ−２３００、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｓ）。簡単に言えば、抗体アフィニティーマトリックスがアフィニティー支持体に付着している（例えばＣＮＢＲ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ参照）。抗体を含む混合物をアフィニティーマトリックス上に流し、抗体を付着させる。結合した抗体を当業者に公知の技術で遊離し、濃縮抗体プールを得る。次いで濃縮抗体プールをその後の免疫研究に使用するが、そのいくつかは例として本明細書に記載されている。本発明の抗体を単離するために用いられる抗体アフィニティーマトリックスは本発明の抗α５β１抗体を特異的に任意記する様に設計されていないが、本質的にモノクローンであるシステム中で抗体が組み換えタンパク質として発現しているので、このことが抗体の精製におけるアフィニティーマトリックスの有用性を制限しない。
【００７７】
ｐＨ感受性抗体精製
中性または塩基性ｐＨでアフィニティー精製した場合、本発明の抗体結合試薬のいくつかは沈殿する傾向を示す。この問題を解決するため、図１に示す抗体を含むｐＨ感受性抗体、およびマウス可変領域を含むか、マウス可変領域と８０％以上の並列同一性を有するキメラ抗体、または図１に含まれる抗体のＣＤＲ領域と８０％以上の配列同一性を有するキメラ抗体の精製法を考案した。このプロセスには抗体結合アフィニティーマトリックスを含むクロマトグラフィーカラム、例えばイオン交換カラムを用いる抗体に対するアフィニティークロマトグラフィーを行い、次いで約３．０〜５．５好ましくは約３．３〜５．５、最も好ましくは約３．５〜４．２または約４．２〜５．５のｐＨで抗体を溶出する工程が含まれる。この範囲内のより低いｐＨが小スケール精製により適しているが、約４．２以上のｐＨが大スケール精製により適していると考えられる。この範囲内の精製プロセス操作により、ほとんど凝集しないまたは凝集しない、最も好ましくは本質的に凝集しない製品が製造される。
【００７８】
アフィニティークロマトグラフィーは、抗体または他の生物活性高分子等の物質を単離または精製するための公知の手段である。一般にこれはカラム上に固定化された抗体に特異的に結合する少なくとも１種のリガンドを含むクロマトグラフィーカラムに、抗体を含む溶液を通して行われる。この様な基はリガンド−アフィニティー反応により抗体を溶液から抽出することができる。一度これが行われると、抗体を絡むから溶出して回収し得る。
【００７９】
精製プロセスには基質に結合した抗体アフィニティーマトリックスへの抗体の吸収が含まれる。様々な形の抗体アフィニティーマトリックスを使用し得る。唯一の要請は、抗体アフィニティーマトリックス分子が精製すべき抗体に結合する能力を有することである。例えば、天然起源から単離された抗体アフィニティーマトリックス、組み換えＤＮＡ技術で製造された抗体アフィニティーマトリックス、抗体アフィニティーマトリックスの修飾型、または問題の抗体への結合能を維持するこれらの材料のフラグメントを使用し得る。抗体アフィニティーマトリックスとして使用するための材料の例にはポリペプチド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、核酸アプタマー、糖タンパク質、リポタンパク質、複数のタンパク質の複合体、生体膜、ウイルス、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチンおよびＦｃ受容体が含まれる。
【００８０】
抗体アフィニティーマトリックスを一般的な相互作用（例えば非特異的イオン交換結合または疎水性／親水性相互作用により）、または特異的相互作用（例えば抗原−抗体相互作用）、またはリガンドと固相間の共有結合、または当業者に公知の任意の方法で固相または支持体に付着させる。または、中間化合物またはスペーサーを固相に付着させ、アフィニティーマトリックスをスペーサーに付着して抗体アフィニティーマトリックスを固相上に固定化することができる。スペーサー自体が遊離抗体アフィニティーマトリックスに対し特異的結合アフィニティーを有するリガンド（すなわち第２リガンド）であることも可能である。
【００８１】
例えば緩衝液を用いて抗体をカラムから溶離する通常の手順を用いて、抗体を基質結合抗体アフィニティーマトリックスから溶離してもよい。沈殿を最少にするため、ｐＨ感受性抗α５β１インテグリン抗体をｐＨ３．５で０．１Ｍグリシンを含む緩衝液で溶離することが好ましい。分解および／または変性を最少にするため、緩衝液の温度を１０℃以下に保つことが好ましく、４℃以下がより好ましい。同じ理由で、抗体が酸性ｐＨに晒される期間も最少にしなければならない。これは例えば所定量の塩基性溶液を溶出した抗体溶液に添加することで行われる。この塩基性溶液が緩衝液であることが好ましく、揮発性塩基性緩衝液であることがより好ましく、アンモニウム溶液が最も好ましい。
【００８２】
基質結合抗体アフィニティーマトリックスから抗体の溶出を、公知の方法でモニターし得る。例えば、カラム手順を用いる場合、分画をカラムから集め、タンパク質の存在を分画の吸光度を測定して決定できる。既知の特異性を精製する場合、カラムから集められた分画中の抗体の存在を例えば放射線免疫分析（ＲＩＡ）または酵素免疫分析（ＥＩＡ）等の免疫分析技術で測定し得る。
【００８３】
本発明のプロセスを、精製される抗体を実質的に劣化しない、または基質に結合した抗体アフィニティーマトリックスに悪影響を及ぼさない任意の便利な温度で行い得る。使用する温度が室温であることが好ましい。
【００８４】
必要あれば公知の様々な方法を用いて、抗体アフィニティーマトリックスカラムから溶出した抗体を回収し得る。
【００８５】
Ｂ．低分子量肉芽化インヒビター
コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学合成または生合成により、試薬等の多数の化学「建築ブロック」を組み合わせた種々の化合物の集積である。例えば、ポリペプチドライブラリー等の線形コンビナトリアル化学ライブラリーは、ある長さ（すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸数）に対しできる限り可能な方法で化学建築ブロック（アミノ酸）のセットを組み合わせて作成される。化学建築ブロックのこの様なコンビナトリアル混合物により、何百万の化合物を合成することができる。
【００８６】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製とスクリーニングは当業者に公知である。この様なコンビナトリアル化学ライブラリーにはペプチドライブラリー（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ ｅｔ ａｌ．，、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）、およびＨｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４−８８（１９９１）参照）が含まれるが、それに限定されない。化学多様性ライブラリーを作成するための他の化合物も使用できる。この様な化合物にはペプチド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド等のダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニローグポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Ｈｉｒｓｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子量化合物ライブラリーの類縁有機合成（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスフォネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、全て上記参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５，５３９，０８３参照）、抗体ライブラリー（例えばＶａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（例えばＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｅｎｃｅ，２７４；１５２０−１５２２（１９９６）ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ５，５９３，８５３参照），低分子量有機分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ １８、ｐ３３（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリドンおよびメタチアゾリドン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルフォリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照）が含まれるが、それに限定されない。
【００８７】
他のアプローチでは大きなライブラリーを作成するために組み換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ、４９：４０４−４０６（１９９０））を使用し、非常に大きいライブラリーを構築できる（１０６〜１０８化学種）。第２のアプローチは主として科学的方法を使用するが、その例はＧｅｙｓｅｎ法（Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２３：７０９−７１５（１９８６）；Ｇｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ．Ｍｅｔｈｏｄ、１０２：２５９−２７４（１９８７））およびＦｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７３（１９９１））である。Ｆｕｒｋａ ｅｔ ａｌ．，（１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ＃５、ＡｂｓｔｒａｃｔＦＲ：０１３（１９８８）；Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１））、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（米国特許第４，６３１，２１１号、１９８６年１２月出願）およびＲｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（米国特許第５，０１０，１７５号、１９９１年４月出願）は、作動剤または拮抗剤として試験し得るペプチド混合物の製造法を記載している。
【００８８】
コンビナトリアルライブラリー調製用の装置は市販されている（例えば３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、９０５０Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ参照）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー事態が市販されている（例えばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等）。
【００８９】
肉芽化インヒビターとして使用するに適した低分子量ペプチドはＨｏｒｔｏｎ、Ｍ．“Ａｒｇ−ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．”、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９９、Ｍａｒ−Ａｐｒ；７（２）１７８−８４；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、Ｒ．、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ、Ｅ．、Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ、Ｅ．“Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｓ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｍｉｃ ｏｆ ａｎ ＲＧＤ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．”、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５年９月、１３０（５）：１１８９−９６；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ、Ｅ．、Ｗａｎｇ、Ｂ．、Ｒｕｏｓｌｈａｔｉ、Ｅ．“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ５ ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆｒｏｍ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．”、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４年Ｆｅｂ；１２４（３）：３７３−８０；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，、米国特許第６，１７７，５４２号および関連特許に議論されている。
【００９０】
低分子量二重鎖ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡも本発明で検討されている。本発明のｓｉＲＮＡはα５β１インテグリンサブユニットの１つの配列と同一の配列を有する。α５β１を発現する細胞に適用した場合、そのサブユニットをコードする対応するｍＲＮＡ転写産物を分解させることにより、これらのｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡ配列を有するα５β１インテグリンサブユニットの翻訳を阻害する。
【００９１】
Ｃ．肉芽化インヒビターを単離するための一般法
肉芽化インヒビターの単離法は公知である。一般に核酸またはタンパク質の単離に適した任意の精製プロトコールを用いることができる。例えば、抗体肉芽化インヒビター単離の関係で上記の様なアフィニティー精製を、任意のα５β１インテグリン結合肉芽化インヒビターを単離するために、より一般的な意味で使用することができる。公知の様に、核酸肉芽化インヒビターをアガロースゲル電気泳動を用いて精製することもできる。カラムクロマトグラフィー技術、沈殿プロトコールおよびタンパク質および／または核酸を分離するための他の方法も使用できる（例えばＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，、上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，、上記；およびＬｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６５：１０３７３−１０３８２（１９９０）参照）。
【００９２】
ＩＶ．肉芽化インヒビター同定法
本発明は診断および治療肉芽化インヒビターの同定法を提供する。肉芽化インヒビター同定法の例には、制御された条件下で創傷部位に肉芽化または瘢痕組織の形成に対する効果の評価が含まれる。まず類似の創傷部位を２つの異なった対象の同じ生きた組織に形成する。創傷部位を、外科穿刺、切断、火傷、例えばレーザーによる火傷、または化学的刺激等の任意の適した方法を用いて形成することができる。スクリーニング分析に適した組織には眼、皮膚、骨、軟骨、血管、靭帯および腱が含まれる。
【００９３】
一度創傷部位が形成すると、ある創傷部位（試験創傷部位）が一定投与量の肉芽化インヒビター候補で処置される。第２創傷部位（対象部位）は対照溶液、好ましくは非刺激性緩衝液または他の担体で処置される。
【００９４】
肉芽化インヒビター候補が担体中で配送される場合、対照溶液は理想的には肉芽化インヒビター候補がない担体である。現在知られている肉芽化インヒビターの多くは毛細間膜を横断できるので、試験および対照創傷部位は異なった個体または離れた組織試料である必要がある。対照および試験創傷部位が同じ個体の左と右の眼にそれぞれ置かれている場合、試験部位に施された肉芽化インヒビターは個体の血管系を通って対照部位に達することができ、正しくない結果が得られる。好ましくは所定の投与計画に従い、肉芽化インヒビターが試験創傷部位に複数回投与される。投与計画は１日でもよいが、より好ましくは数週間である。
【００９５】
投与計画が終了すると、試験および対照創傷部位を調べて、存在する肉芽化または廃痕のレベルを測定する。これは例えば染色および顕微鏡検査に適した組織切片を作成する（肉芽化）か、または単純に顕微鏡で検査する（廃痕）ことで行われる。顕微鏡検査および組織切片作成法は公知である。肉芽化インヒビターとして使用するに適した肉芽化インヒビター候補は、対照部位と比較して試験部位から採取した組織切片中の有意に減少した肉芽化に注目して同定される。理想的には創傷部位における肉芽化または廃痕形成は、対照創傷部位中に存在するものより少なくとも７５％、より好ましくは５０％、最も好ましくは３０％以下の肉芽化である。必要な場合、各創傷部位に存在する肉芽化組織の面積を測定して肉芽化または廃痕形成のレベルを計算することができる。各創傷部位における２次元像を作成し、映像内に保たれる面積を計算する。この様な計算をデジタルコンピューターの助けを借りて行うことが好ましく、顕微鏡と連動したデジタルコンピューターが理想的である。廃痕で覆われた表面積を測定して廃痕組織を定量してもよい。
【００９６】
実施態様例では、２頭の霊長類の眼の角膜斑に対するレーザー処置で創傷部位を誘発する。例えば網膜または角膜組織との他の眼の組織を任意に用いてもよい。隣接する解剖学的特徴に対し、各眼の創傷部位は理想的には類似の場所に置く必要がある。各創傷部位のサイズは類似している必要があり、好ましくは約２５μｍ、より好ましくは約５０μｍであり、約１００μｍが有利であり、約２００μｍがより有利である。レーザーの設定は理想的には肉芽化を誘発する創傷部位を作成するに十分なだけの量である必要があり、好ましくは約２００ミリワット、より好ましくは約３００ミリワットであり、約４５０ミリワットが有利であり、約５００ミリワットが寄り有利であり、理想的には約３００ミリワット〜約７００ミリワットの間である。この様な創傷部位を誘発するための装置は市販され、例えばＩＲＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ（商標）ポータブルスリットランプアダプターを備えたＯｃｕＬｉｇｈｔ ＧＬ（５３２ｎｍ）レーザーホトコアギュレーターである。
【００９７】
次いで肉芽化インヒビター候補、例えば配列番号１〜６でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体候補の硝子体内注入を各眼で行う。
【００９８】
レーザー処置直後に最初の注入が行われる。強膜および平面部を通って、角膜縁の後方約４ｍｍの位置に注射器の針を通す。針を水晶体の後方で硝子体中位に向け、硝子体中にゆっくりと注入する。週毎に４週間、同じ量を投与する必要がある。適当な投与量は、試験される特定の肉芽化インヒビター候補の性質に依存すると思われる。例えば、硝子体の容積を２ｍｌとすると、眼あたりＦａｂフラグメントを約２５μｇ、好ましくは約５０μｇ、より好ましくは約１００μｇ、最も好ましくは約２００μｇの投与量で与える必要がある。他のインヒビター候補の投与量を決定するベースラインとして、これは１μＭの肉芽化インヒビターに相当する。このベースライン値を用い、当業者は他の肉芽化インヒビター候補に対する投与量レベルを決定することができる。
【００９９】
投与する場合、静脈注射、皮下注射または筋肉注射のいずれかで全身注入し得ることに注意する必要がある。肉芽化インヒビターまたは肉芽化インヒビター候補の全身注入では、投与量は約５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１５ｍｇ／ｋｇであり、約５０ｍｇ／ｋｇが有利であり、約１００ｍｇ／ｋｇがより有利であり、約２００ｍｇ／ｋｇが許容し得る。噴霧吸入、点眼または経口投与で行われる投与量は、全身注入を用いて達成される量に類似の肉芽化インヒビターまたは肉芽化インヒビター候補の血液レベルを生成するに十分な量である必要がある。これらのレベルを達成するために噴霧吸入、点眼、または経口摂取で配送される肉芽化インヒビターまたは肉芽化インヒビター候補の量は、通常の試験で決定できる。抗体肉芽化インヒビターＭ２００の全身注入では、インヒビターの治療レベルが１５ｍｇ／ｋｇ配送の１週間後に血液中で検出される（図１３Ｂ）。図１３Ｅおよび１３Ｆは、１週間間隔で１５および５０ｍｇ／ｋｇのＭ２００による繰り返し投与がＭ２００の血漿濃度を治療レベルに保つに十分であることを示している。この発見は図１４および１５で確認され、これらの図は全ての試験日で血漿マクロファージのα５β１インテグリン受容体のＭ２００による飽和（図１４）と、α５β１インテグリン抗体ＩＩＡ１のブロック結合（図１５）を示している。
【０１００】
肉芽化レベルの評価は、試験眼から採取した固定組織切片を染色して決定する。簡単に言えば、フォルマリン固定眼を瞳、視神経および角膜斑が同じ平面にあり、パラフィン中に埋没される様に水平に切り出す。全試料にわたって連続切片を作成し、一定間隔の薄片をヘムトキソリンおよびエオシンで通常通り染色する。傷を光学顕微鏡で同定し、測定し、傷、および視神経の位置を示す地図を作成する。組織学的に最も重症度の大きい傷害を示すスライド（幹部の中心領域と考えられる）上で、肉芽化組織領域をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ製のＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウエアを用いて測定する。
【０１０１】
上記の実施態様を用いてサルの眼を処置して得られた結果と、より詳しくは実施例４の結果は、対象と比較して眼への投与量あたり２５μｇおよび１００μｇの肉芽化インヒビターＦ２００（ＥＯＳ２００−Ｆとも呼ばれる）で処置した創傷部位で形成された廃痕の量が劇的に減少した（図１２Ａ参照）。
【０１０２】
本発明はまた、上記の定性的スクリーニング分析に基づく肉芽化インヒビターの定量分析を提供する。この肉芽化インヒビター評価法には最初に眼組織中に傷を形成し、上記の様に肉芽化インヒビターを眼組織に少なくとも１回投与する工程が含まれる。上記の技術を用いて、創傷部位における肉芽化または廃痕形成のレベルを定期的に、または処置の最後にモニターする。
【０１０３】
高処理能力技術
上記方法を任意のタイプの肉芽化インヒビターを同定するために使用できるが、それらは通常、既知の肉芽化インヒビターとのある関係により肉芽化インヒビターであると推定される肉芽化インヒビター候補（既知の肉芽化インヒビターと同じ化学ファミリーに属するか、またはそれとある構造または機能的特徴を共有する）のスクリーニングに最も適している。さらに、以下に議論する様に、新規肉芽化インヒビターをコンピューター、または分子モデリングとして知られるプロセスを用いて同定し得る。
【０１０４】
コンピューターモデリング
コンピューターモデリングにより、選ばれた分子の３次元原子構造の可視化と、その分子と相互作用すると思われる新しい化合物の合理的な設計が可能になる。３次元コンストラクトは典型的には選ばれた分子のＸ−線結晶解析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学には力場のデータが必要である。コンピューターグラフィックにより、新規化合物がどの様に標的化合物と結合するかの予測を可能にし、その化合物と標的化合物を完全な結合特異性へ実験的に操作することができる。いずれか一つ、または双方に小さな変化が生じた場合、分子−化合物相互作用がどうなるかの予測には、通常はユーザーに優しく、分子設計プログラムとユーザーの間のメニュー駆動インターフェースと組み合わせた分子動力学ソフトウエアと強力な計算能力を有するコンピューターが必要である。
【０１０５】
上記に一般的に記載された分子モデリングシステムの一例は、Ｐｏｌｙｇｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．製のＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムで構成される。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化と分子動力学機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは構築、グラフィックモデリングおよび分子構造の解析を行う。ＱＵＡＮＴＡにより相互作用構築、修飾、可視化および分子相互の挙動の解析が行われる。
【０１０６】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７、１５９−１６６（１９８８）；Ｒｉｐｋａ、Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、５４−５７（Ｊｕｎ．１６，１９８８）；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９、１１１−１２２（１９８９）；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＯＳＡＲ：“Ｏｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ１８９−１９３（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ、２３６：１２５−１４０および１４１−１６２（１９８９）等の数多くの文献にタンパク質と特異的に相互作用する薬品のコンピューターモデリングがレビューされ、核酸成分に対するモデル受容体に関してＡｓｋｅｗ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０８２−１０９０（１９８９）にレビューされている。Ａｓｋｅｗらは、水素結合と原子積層力の双方が同時に作用する新しい分子の形を構築した。ＡｓｋｅｗらはＵ−型（２軸）関係が任意の２個のカルボキシル基間に存在するＫｅｍｐの三塩基酸（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５１４０−５１４３（１９８１））を使用した。三塩基酸のイミド酸塩化物への変換により、アミドまたはエステル結合により実用的に使用し得る任意の芳香族表面に付加し得るアシル化剤が得られた。得られた構造は、イミド基中の原子面にほぼ平行である芳香族平面が特徴であり、水素結合と積層力が垂直方向から集中し、アデニン誘導体に相補的であるミクロ環境を提供する。
【０１０７】
力の場のデータの作成とＸ線結晶学情報がコンピューター技術より遅れているので、核酸と相互作用すると思われる化合物の設計におけるコンピューターモデリングの使用には限界があることが分かった。Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：９７２７（１９８９）に報告される様に、４種のＲＮＡの一部の３次元構造の可視化にＣＨＡＲＭｍが使用されている。核酸とのモデリング相互作用の方法については米国特許第６，４４６，０３２号およびその中の参考文献参照。
【０１０８】
化合物をスクリーニングしグラフ表示する他のコンピュータープログラムはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．、Ａｌｌｅｌｉｘ、Ｔｈｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔｒｉｏ、ＣａｎａｄａおよびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏから入手できる。これらは主として特定のタンパク質に特異的である薬品への応用のために設計されているが、ＲＮＡ領域が同定されればその領域に特異的である薬品の設計にも用いることができる。
【０１０９】
スクリーニング化合物ライブラリー
既存の肉芽化インヒビターまたは分子モデリング技術のいづれから同定されても、その治療上の有用性を増進するためには一般的には肉芽化インヒビターをさらに修飾しなければならない。典型的にはこれは肉芽化インヒビターに関連する化合物、またはコア構造の周りに基づいて無秩序に合成された化合物のライブラリーを作成して行われる。肉芽化インヒビター候補の大きな、および／または広範囲のライブラリーを効率的にスクリーニングするためには、上記の分析を用いてスクリーニングされる候補化合物の数を少なくとも減少するために、高処理能力スクリーニング法が必要である。高処理能力スクリーニング法には、多数の潜在的治療用化合物（潜在的モジュレーターまたはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化合物またはペプチドライブラリーを準備する工程が含まれる。この様な「コンビナトリアル化合物ライブラリー」または「候補ライブラリー」を以下に述べる様に少なくとも１回の分析でスクリーニングし、肉芽化を阻害し瘢痕形成を制限し得るライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。この様にして同定された化合物は通常の「リード化合物」となり得るか、またはそれ自体を潜在的または実際の治療薬として使用し得る。
【０１１０】
ライブラリーの候補化合物は任意の低分子量化合物であるか、上記のタンパク質、糖、核酸または脂質等の生物要素であり得る。典型的には、試験化合物は低分子量化合物分子およびペプチドである。以下に議論する分析は、分析工程を自動化し、化合物を任意の便利な起源から、典型的には平行して（例えば図１５に示すロボット分析におけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマットで）実行される分析に提供して、大きな化学ライブラリーをスクリーニングする様に設計されている。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔｉｃａ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等、化合物の供給者は多数あることは理解されると思われる。
【０１１１】
従って、本発明は肉芽化インヒビター候補の高処理能力スクリーニング法を提供する。これらの方法の最初の工程で、肉芽化インヒビターである高い確率を有するコンビナトリアルライブラリーメンバーの効率的で迅速な同定が行われる。これらの初期工程は、肉芽化インヒビターがα５β１インテグリン結合剤であるという観察を利用する。α５β１インテグリンに特異的に結合する、結合候補と呼ばれるライブラリ０メンバーの能力を決定する任意の方法が、この初期高処理能力スクリーニングに適している。例えば、競合的および非競合的ＥＬＩＳＡ型分析を使用できる。
【０１１２】
競合的ＥＬＩＳＡ分析には固相に結合したα５β１インテグリンが含まれる。結合剤にα５β１インテグリンを結合させるに十分な時間後、基質を洗浄し、次いでフィブロネクチン等の既知のα５β１インテグリンリガンドを競合させる。利用可能なα５β１インテグリン結合部位の数は、フィブロネクチンが固定化α５β１インテグリンを結合する能力に正比例していると思われる。利用できるα５β１インテグリン結合部位がほとんどない場合、それは結合部位が結合候補で占有されているためである。フィブロネクチンのα５β１インテグリンへの結合を妨害し得る結合候補は、肉芽化インヒビター候補であると思われる。Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載される様に、フィブロネクチンを標識することにより結合したフィブロネクチンを測定し得る。
【０１１３】
非競合的分析は競合的分析で説明した同じ手順に従うが、既知のα５β１インテグリンリガンドを添加しない。結合候補の固定化α５β１インテグリンへの結合を、未結合候補を洗い流し、結合した結合候補を支持体から溶出し、溶出物を例えばマススペクトロスコピー、タンパク質検出（ＢｒａｄｆｏｒｄまたはＬｏｗｒｙ分析、または２８０ｎｍ吸光度測定）等で分析して測定することができる。または、支持体表面の有機層の分光学的性質の変化をモニターして結合を同定し得る。表面の分光学的性質のモニター法には吸光度、反射率、二色性、屈折率、回折、表面プラズモン共鳴、楕円偏光法、共鳴ミラー技術、格子連動導波管技術および多極性共鳴分光学等が含まれ、その全ては当業者に公知であるが、それらに限られない。
【０１１４】
例えばα５β１に対するＫａが少なくとも１０５ｍｏｌ−１、１０６ｍｏｌ−１以上、好ましくは１０７ｍｏｌ−１以上、より好ましくは１０８ｍｏｌ−１以上、最も好ましくは１０９ｍｏｌ−１以上の許容し得る特異性でα５β１インテグリンに結合することが見出された結合候補は肉芽化インヒビター候補であり、細胞性肉芽化を阻害する能力、および廃痕組織形成を制限する能力を決定するため、上記の様にさらにスクリーニングされる。
【０１１５】
いくつかの公知のロボットシステムが液相化学分析のために開発されている。これらのシステムにはＴａｋｅｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｄ ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で開発された自動合成装置等の自動化ワークステーション、およびロボットアームを利用する多くのロボットシステム（ＺｙｍａｔｅＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、Ｍａｓｓ；Ｏｒｃａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれ、これらは化学者が行う手動合成操作を模倣している。上記装置のいずれも本発明での使用に適している。本明細書で議論した様に操作しえる様な、これらの装置の改造の性質と実行（必要あれば）は当業者に公知であると考えられる。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．；Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕ．；Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．；ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ．、ＲＵ；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ．；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ．等）。
【０１１６】
Ｖ．治療への使用
本発明の方法を用いて処置される個体は、顕著な細胞性肉芽化の結果としての副次的な組織損傷および／または過剰廃痕形成になり易い傷を有する任意の個体である。この様な個体は例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシまたはヤギ等の哺乳動物、トリ、または任意の他の動物、特に商業的に重要な動物または家畜である。
【０１１７】
最後に、本発明は肉芽化インヒビターであるα５β１インテグリン結合剤を個体に投与することによる、個体中の肉芽化を減少または阻害する方法を提供する。肉芽化を減少することにより、本発明の方法は創傷部位に形成する廃痕組織の量を制限し、膨潤および過剰マクロファージ挙動で生じた副次的組織損傷を減少する。
【０１１８】
本発明の方法は、組織肉芽化をもたらし得る傷害または疾患に罹り易い任意の組織に使用するに適している。この様な組織には眼、皮膚、骨、軟骨、血管、靭帯および腱が含まれるが、それらに限定されない。本発明で処置し得る疾患にはリューマチ性関節炎、側頭動脈炎、リューマチ性多発性筋肉痛、巨大細胞動脈炎、Ｔａｋａｙａｓｕ動脈炎、Ｋａｗａｓａｋｉ病、Ｗｒｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉腫症および血管炎、特発性肺線維症、全身性硬化症／皮膚強化症、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群／病、乾燥症候群、アレルギー性肺線維症、類肉腫症、子宮前線維組織、血管腫、リンパ管腫、ケロイド廃痕形成、Ｇｏｏｄｐａｓｔｅｕｒ病、Ｇｒｏｈｎｓ病、Ｐａｇｅｔｓ症候群、プテリギア、正中肉芽腫、デスモイド、黄紋変性、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、アレルギー性肺線維症および好酸性肉芽腫が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１９】
本明細書に記載の方法のある実施態様は、眼の傷害および疾患の治療特に適している。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が、肉芽化を誘発するに十分な眼の傷害に反応してマクロファージ挙動と呼ばれるマクロファージ様特性を取る能力を有することが観察されている。ＲＰＥ細胞のこのマクロファージ挙動は、創傷部位を取り囲む細胞の損傷を引き起こし、過剰の廃痕組織が形成されると共に、失明になり得る組織損傷を引き起こす。本発明の方法で同定される肉芽化インヒビターを用いて、ＲＰＥ細胞を繊維芽細胞様挙動を取る様に導くことができる。付随するマクロファージ挙動の減少は廃痕形成、肉芽化およびその結果の組織損傷の大部分を低減する。その結果、治癒組織は肉芽化インヒビターがない場合に治癒される組織よりはるかに機能性である（図１２）。
【０１２０】
従って、本発明は罹患眼の創傷部位をα５β１インテグリン結合剤、好ましくは肉芽化インヒビターと接触させる工程を有するＲＰＥ細胞の制御法であって、罹患した眼のＲＰＥ細胞がマクロファージ挙動を表すことを阻害する方法も提供する。
【０１２１】
治療用途では、肉芽化インヒビターは一般にインヒビターと薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の形である。薬学的に許容し得る担体は公知であり、生理緩衝食塩水または他の緩衝液等の溶液、または溶剤、またはグリコール、グリセロール、オリーブオイル等のオイル、または注射可能有機エステル等のビヒクルが含まれる。薬学的に許容し得る担体の選択は、部分的には例えばインヒビターが抗体であるか、ペプチドまたは非ペプチドであるか、低分子量有機分子であるか等のインヒビターの化学的性質に依存する。
【０１２２】
薬学的に許容し得る担体には、例えば肉芽化インヒビターを安定化するかその吸収を増加する生理学的に許容し得る化合物、または必要あれば他の賦形剤が含まれてもよい。生理学的に許容し得る化合物の例にはグルコース、スクロースまたはデキストリン等の炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオン等の抗酸化剤、キーレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤または賦形剤が含まれる。当業者は生理学的に許容し得る化合物を含む薬学的に許容し得る担体の選択は、例えば肉芽化インヒビターの投与経路、またはその特定の物理化学的特性に依存することを知っていると思われる。
【０１２３】
本発明の方法には他の薬剤、例えば抗生物質、殺かび剤および抗炎症剤を含むカクテル中に肉芽化インヒビターを適用することが含まれる。または、本方法は罹患した個体に肉芽化インヒビターと少なくとも１種の別な薬剤を順次投与し、治療法を最適化することも含まれる。この様な最適化された治療法では、肉芽化インヒビターを含む薬剤を任意の順番および任意の組み合わせで投与し得る。
【０１２４】
傷害または疾患で生じる細胞性肉芽化は、例えば糖尿病網膜症を患う個体の網膜中等の局所に生じるか、または例えばリューマチ性関節炎を患う個体で全身的に生じる。処置される組織および疾患または傷害の性質によって、当業者は肉芽化インヒビターの投与法および投与経路を選択すると考えられる。例えば、糖尿病性網膜塩を患う個体では、インヒビターを点眼剤として使用するに便利な医薬組成物に調合し、それを眼に直接投与する。対照的に、骨関節炎を患う患者では、インヒビターを静脈内、経口または薬剤を全身に配送する他の方法で投与可能な医薬組成物中で配送してもよい。従って、肉芽化インヒビターを様々な経路、例えば静脈内、経口、または処置すべき領域中に直接、例えば病状が関節を含む場合は滑液内に投与することができる。一回投与後に治療を継続させるため、本発明の肉芽化インヒビターは徐放製剤中に含まれてもよい。ある実施態様では、製剤はミクロ球体の形で調製される。ミクロ球体を、治療に必要ならば任意の別な薬剤と共に、生分解性放出制御材料による肉芽化インヒビターの均一マトリックスとして調製してもよい。ミクロ球体は浸透および／または注入に適したサイズで調整されることが好ましく、創傷部位へ全身的に、または直接注入される。
【０１２５】
製剤の直接塗布を受け入れ易い解剖学的位置の例には目の硝子体液が含まれ、関節内投与には膝、肘、腰、胸骨鎖骨、顎関節、手首、足根、腕、踝、および関節炎症状を起こす他の関節が含まれる。本発明で有用な製剤を投与できる滑液嚢の例には肩峰、二頭筋橈骨、肘橈骨、三角筋、膝蓋下、坐骨、および当業者に有害な肉芽化を形成することが知られている他の滑液嚢が含まれる。
【０１２６】
本発明の製剤は胸膜、腹膜、頭蓋骨、縦隔、心膜、滑液嚢または包、硬膜外、硬腔内、眼球内等を含むがそれに限定されない全身空間／空洞に投与するのに適している。
【０１２７】
徐放実施態様のいくつかには生分解性および／または徐々に溶解する高分子物質が含まれる。この様な高分子物質にはポリビニルピロリドン、低および中分子量ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチル澱粉、メタクリル酸カリウム−ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、澱粉、澱粉誘導体、微結晶性セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、およびセルロース誘導体、β−シクロデキストリン、ポリ（メチルビニルエーテル／マレイン酸無水物）、グルカン、シエロズルカン、マンナン、ザンタス、アルギン酸およびその誘導体、デキストリン誘導体、グリセリルモノステアリン酸、半合成グリセリド、グリセリルパルミトステアリン酸、グリセリルベヘン酸、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、タルク、安息香酸ナトリウム、硼酸、およびコロイドシリカが含まれる。
【０１２８】
本発明の徐放剤には澱粉等のアジュバント、プレゲル澱粉、マンニトール燐酸カルシウム、ラクトース、蔗糖、グルコース、ソルビトール、微結晶性セルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、澱粉溶液、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガカントガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、コロイドシリカ、ぐるセリルモノステアリン酸、水素化ヒマシ油、ワックス、およびモノ−、ビ−およびトリ置換グリセリドも含まれる。
【０１２９】
徐放剤はＷＯ９４／０６４１６に一般的に記載される様に調製されてもよい。
【０１３０】
間質性腫瘍では、α５β１インテグリン結合剤は抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。ＩｇＧ１はα５β１拮抗作用に加えて、例えば補体固定、ＡＤＣＣおよびＴ細胞動員等の別な有用な機構を動員し、これらの腫瘍の治療に有益であると思われる。
【０１３１】
個体に投与される肉芽化インヒビターの量は、部分的には疾患と組織損傷の程度に依存する。診断または治療過程で投与される有効量の決定法は公知であり、フェーズＩ、フェーズＩＩおよびフェーズＩＩＩ臨床試験が含まれる。一般に全身投与の場合は拮抗薬を約０．０１〜２００ｍｇ／体重ｋｇで投与し、創傷部位に直接投与する場合は約１μＭの濃度で投与する。肉芽化インヒビターの全量をボーラスまたは吸入のいずれかで、比較的短期間で対象に１回の投与で与えることができる。または、分割処置プロトコールを用いて投与できるが、その場合は複数の投与回数でより長期間にわたって投与する。当業者は組織傷害の領域（単数または複数）へ有効量を提供するに必要な特定の肉芽化インヒビターの濃度は、対象の年齢と一般的な健康状態の他、投与経路、投与される処置部位の数、およびインヒビターが抗体、ペプチドまたは非ペプチド低分子量分子のいづれであるかを含むインヒビターの性質を含む多くの因子に依存することを等業者は知っていると考えられる。これらの因子の観点から、治療の目的で肉芽化および廃痕形成を効率よく阻害するための有効量を得る様に、当業者は特定の投与量を調節すると考えられる。
【０１３２】
本発明の方法で同定された肉芽化インヒビター、またはインヒビターを含むその組成物を、少なくとも部分的に過剰肉芽化および廃痕形成が特徴である任意の病状を治療するために使用することができる。当業者はインヒビターを例えば経口または非経口を含む様々な経路で投与できることを知っていると考えられ、非経口経路には静脈内、筋肉内、眼球内、関節包内、滑液内、腹腔内、大槽内、または例えば皮膚パッチまたは経皮イオン浸透を用いる受動または促進吸収が含まれる。さらに、インヒビターを座薬または局所剤を経由して注射、注入できるが、後者は例えばインヒビターを含む軟膏または粉末の直接投与による受動投与であるか、噴霧化吸入配送のための鼻スプレーまたは吸入剤を使用する能動投与である。必要あれば医薬組成物をリポソーム、ミクロ球体または他のポリマーマトリックス中に取り込むこともできる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１巻（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．１９８４）；本明細書に引用して援用する）。例えば、リン脂質または他の脂質でなるリポソームは非毒性であり、生理学的に許容され、製造と投与が比較的簡単な代謝可能な担体である。
【０１３３】
本明細書に引用したすべての文献と特許出願は、各文献または特許が具体的かつ個別に引用して援用されるかの様に本明細書に引用して援用する。
【０１３４】
先行する発明を明確性と理解のための説明と例示の手段としてある程度詳細に説明したが、ある程度の変更と修正を付随するクレームの精神と範囲から逸脱せずに行い得ることは、本発明の教示に照らして当業者に自明のことと考えられる。
【０１３５】
上記の開示から理解し得る様に、本発明は多様な用途を有する。従って、以下の実施例は説明の目的で提示されたものであり、本発明の制約として構成されることを意図するものではない。本質的に類似の結果を得るために変更または修正し得る様々な重要でないパラメーターを、当業者は理解すると考えられる。
【実施例】
【０１３６】
実施例１：マウスＩＩＡ１抗α５β１インテグリン由来のＭ２００キメラ抗体の構築
本実施例はキメラ抗体Ｍ２００の構築を説明する。
【０１３７】
Ａ．ＩＩＡ１および２００−４ＶＨおよびＶＬドメインの出発ＤＮＡ配列
マウス抗ヒトα５β１インテグリン抗体の可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）、ＩＩＡ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）をＩＩＡ１ハイブリドーマからクローニングし、２００−４抗体の初期構築の一部として配列決定した。図３はＩＩＡ１ＶＨ（配列番号１３）およびＶＬ（配列番号１４）ドメインのｃＤＮＡ配列を示す。ＩＩＡ１由来の２００−４マウス／ヒトキメラＩｇＧ４抗体の構築中に、沈黙ＸｈｏＩ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ：配列番号２９）をＩＩＡ１ＶＨおよびＶＬ双方の骨格４領域中に導入した。発現コンストラクトＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラおよびＮＥＦ５ＩＩＡ１／Ｋキメラ中に見出される、これらの沈黙ＸｈｏＩ部位を含む２００−４ＶＨ（配列番号１５）およびＶＬ（配列番号１７）ＤＮＡ配列が図４に示される。これらの２００−４ＶＨおよびＶＬ配列を、以後の全ての組み換えＤＮＡ操作の出発点として使用した。
【０１３８】
Ｂ．Ｍ２００ミニエクソンの設計
発現プラスミドＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラおよびＮＥＦ５ＩＩＡ１／Ｋキメラ中の２００−４ＶＨおよびＶＬドメインを、イントロンの介在なしに沈黙ＸｈｏＩ部位を通って隣接不変ドメインに直接融合した。これらの可変ドメインをゲノムＤＮＡに基づいて所望の抗体発現ベクターと互換性にするために、可変コード領域の３’末端で機能性ドナースプライスを生成する「ミニエクソン」を設計することが必要であった。配列の比較により、ＩＩＡ１のＶＨおよびＶＬ領域はマウスＪＨ４およびＪＫ１セグメントをそれぞれ利用することが明らかになったので、ＶＨおよびＶＬドメイン中の最後のアミノ酸の後に天然マウスＪＨ４およびＪＫ１ドナースプライス部位を作成するためにミニエクソンを設計した。さらに、ＸｈｏＩ部位を除去し、最初のＩＩＡ１ハイブリドーマ中に見出された様な骨格４配列を修復した。制限部位をミニエクソンの両側面−すなわちＶＨミニエクソンに対し５’および３’ＸｂａｌＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ：配列番号３０）、およびＶＬミニエクソンに対し５’ＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧＴ：配列番号３１）−に置いた。
【０１３９】
組み換え抗体可変ドメインは時には望ましくない別なｍＲＮＡスプライス部位を含み、交互にスプライスされたｍＲＮＡ種を生じる。理論的にはこの様な部位はマウス可変ドメイン中に存在するが、キメラ不変領域由来の異種発現細胞および／または新しい受容体部位の状態でのみ活性になる。潜在性別スプライス部位を除去し、コードされたアミノ酸配列を変えないためにコドン縮退を利用することにより、子の様な望ましくない別なスプライシングを排除し得る。Ｍ２００ＶＨおよびＶＬミニエクソン中の任意の潜在性別スプライス部位を検出するため、最初の設計をＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｈｈｔｐ：／／ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）で作成したスプライス部位予測プログラムで解析した。２つの２００−Ｍミニエクソンでは正しいドナースプライス部位が同定されたが、潜在性別スプライス部位がＶＨミニエクソンのＣＤＲ３およびＶＬミニエクソンのＣＤＲ１中に検出された。これらのスプライス部位が使用される可能性を除くため、ミニエクソンの設計に単一沈黙塩基対の変更を行った。ＶＨの設計の場合は、グリシン１００（Ｋａｂａｔ番号）における沈黙ＧＧＴをＧＧＡへ変化させ、ＶＬの設計ではバリン２９における沈黙ＧＴＡをＧＴＣへ変化させた。双方の場合で、これらの沈黙配列変化により、Ｖ遺伝子における潜在性２次スプライスドナー信号が排除された。
【０１４０】
両側制限部位、マウスドナースプライス部位を含み、２００４−Ｘｈｏｌが除去され、潜在性別ドナースプライス部位が排除されたＭ２００ＶＨおよびＶＬミニエクソン（配列番号１９、２１）に対する最終設計が図５に示される。
【０１４１】
Ｃ．Ｍ２００ＶＨミニエクソンおよびプラスミドｐ２００−Ｍ−Ｈの構築
図５Ａに示すＭ２００ＶＨに対する設計されたミニエクソンを、２００−４発現プラスミドＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラを出発点として用いてＰＣＲ系突然変異誘発により構築した。簡単に言えば、２００−４ＶＨ領域を、２００−４ＶＨの３’末端にアに−リングし、Ｋｏｚａｋ配列およびＸｂａＩ部位を追加するプライマー＃１１０（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＴ−３’：配列番号３２）と、２００−４ＶＨの３’末端にアニーリングし、ＸｂａＩ部位を追加するプライマー＃１０４（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴ−３’：配列番号３３）を用いてＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラから増幅した。４６９ｂｐＰＣＲフラグメントをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ＤＮＡ配列決定で確認してプラスミドｐ２００Ｍ−ＶＨ−２．１を作成した。次いでこの中間プラスミドを第２のＰＣＲ突然変異誘発反応に使用し、ＣＤＲ３中の潜在的に異常なスプライス部位を除去し、マウスＪＨ４ドナースプライス部位をＶＨコード領域の３‘’末端に付加した。二つの相補性プライマー＃１１１（５’−ＴＧＧＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧＧ−３’：配列番号３４）および＃１１２（５’−ＣＣＣＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＡＴＴＣＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡ−３’：配列番号３５）を設計し、Ｍ２００ＶＨのＣＤＲ３中のグリシン１００（Ｋａｂａｔ番号）におけるＧＧＴからＧＧＡへのコドン変化を導いた。プライマー＃１１０および＃１１２をＰＣＲ反応に使用し、Ｍ２００ＶＨミニエクソンの５’末端から３９５ｂｐフラグメントを作成し、プライマー＃１１１および＃１１３（）による別なＰＣＲ反応によりＭ２００ＶＨミニエクソンの３’末端から１０１ｂｐフラグメントを作成した。２つのＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース上でゲル精製し、それらを合わせてプライマー＃１１０および＃１１３を用いる最終ＰＣＲ反応中で結合した。最終４５６ｂｐＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａｌＩで消化し、ＸｂａＩ消化およびエビアルカリホスファターゼ処理ベクターｐＨｕＨＣｇ４．Ｄ中にクローニングした。ＸｂａＩ部位間の２００−ＭＶＨミニエクソンに対する正しい配列を確認し、ＸｂａＩ−ＸｂａＩインサートの正しい配位を実証するため、最終プラスミドｐ２００−Ｍ−Ｈ（図６）のＤＮＡ配列を決定した。
【０１４２】
Ｄ．Ｍ２００ＶＬミニエクソンおよびプラスミドｐ２００−Ｍ−Ｌの構築
図５Ｂに示される様な設計されたミニエクソンＭ２００ＶＬは、出発点として２００−４発現プラスミドＮＥＦ５―ＩＩＡ１―Ｋを用いるＰＣＲ系突然変異誘発により構築された。信号配列の５’末端にアニーリングし、Ｋｏｚａｋ配列とＭｌｕＩ部位を追加するプライマー＃１０１（５’−ＴＴＴＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴ−３’：配列番号３７）と、２００４−ＶＬの３’間単にアニーリングし、ＸｂａＩ部位を追加するプライマー＃１０２（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’：配列番号３８）を用いてＶＬ領域をＮＦＥ５ＩＩＡ１−Ｋから増幅した。４３２ｂｐのＰＣＲフラグメントをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ＤＮＡ配列決定で確認し、プラスミドｐ２００Ｍ−ＶＬ−３．３を生成した。この中間プラスミドを第２のＰＣＲ突然変異誘発反応に使用し、ＣＤＲ１中の潜在性異常スプライス部位を除去し、ＶＬコード領域の３’末端にマウスＪＫ１ドナースプライス部位を付加した。２つの相補プライマー＃１１４（５’−ＴＧＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴＴＡＣＴＴＧ−３’：配列番号３９）および＃１１５（５’−ＣＡＡＧＴＡＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＡ−３’：配列番号４０）を設計し、ＶＬドメインのＣＤＲ１中のバリン２９（Ｋａｂａｔ番号）にＧＴＡからＧＴＣへの変化を導いた。プライマー＃１０１と＃１１５をＰＣＲ反応に使用し、ＶＬミニエクソンの５’末端から１８２ｂｐフラグメントを作成した。プライマー＃１１４と＃１１６（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’：配列番号４１）とを用いる別なＰＣＲ反応により、ＶＬミニエクソンの３’末端から２８０ｂｐフラグメントを生成した。ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース上でゲル精製し、それらを合わせ、プライマー＃１０１および＃１１６を用いて最終ＰＣＲ反応中で結合した。４３１ｂｐの最終ＰＣＲ生成物を精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化し、ＭｌｕＩ−およびＸｂａＩ消化軽鎖発現ベクターｐＨｕＣｋａｐｐａ．ｒｇｐｔ．ｄＥ中へクローニングした。最終プラスミドｐ２００−Ｍ−Ｌ（図７）のＤＮＡ配列決定を行い、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩ部位間のＶＬミニエクソンに対する正しい配列を確認した。
【０１４３】
Ｅ．最終発現プラスミドｐ２００−Ｍを作成するためのプラスミドｐ２００−Ｍ−Ｈとｐ２００−Ｍ−Ｌとの組み合わせ
１個のプラスミドからＭ２００を発現するため、ｐ２００−Ｍ−Ｈおよびｐ２００−Ｍ−ＬをＥｃｏＲＩで消化し、ｐ２００−Ｍ−Ｈ由来の全ＩｇＧ４重さ遺伝子を有するＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩｐ２００−Ｍ−Ｌ中にライゲートしプラスミドｐ２００−Ｍ（図８）を作成した。ｐ２００−Ｍの内毒素フリープラスミドの大スケール調製物を内毒素フリープラスミドＭａｘｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２．５リッターのＥ．ｃｏｌｉ培養から調製した。酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＦｓｐＩを用いる制限酵素マッピングによりプラスミドの構造を実証した。Ｍ２００ＶＨ、ＶＬ、ＣκおよびＣγ４に対する全コード領域をＤＮＡ配列決定で実証した。完全Ｍ２００重鎖（配列番号２３）およびＭ２００軽鎖（配列番号２４）に対するＤＮＡ配列を図９に示す。完全Ｍ２００重鎖（配列番号２５）およびＭ２００軽鎖（配列番号２６）に対する対応するアミノ酸配列を図１０に示す。
【０１４４】
実施例２：Ｍ２００からＦａｂフラグメントＦ２００の作成
本実施例はＦａｂフラグメントＦ２００の生成を説明する。
【０１４５】
Ｆａｂフラグメントを酵素消化によりＭ２００ＩｇＧ出発物質から作成する。出発ＩｇＧの緩衝液を２０ｍＭ燐酸ナトリウム、２０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン、ｐＨ７．０に交換した。可溶性パパイン酵素を加え、混合物を３７℃で４時間回転させた。消化後、混合物をプロテインＡカラムに通し、Ｆｃフラグメントを除くと共に未消化ＩｇＧを除去した。テトラチオネートナトリウムを１０ｍＭで加え、室温で３０分間インキュベーションした。最後にこの調製物の緩衝液を２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４に交換し、Ｆ２００溶液を得た。
【０１４６】
Ｆａｂフラグメントであるので、Ｆ２００軽鎖ＤＮＡとアミノ酸配列はＭ２００軽鎖と同じである。完全Ｆ２００重鎖（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）を図１１に示す。
【０１４７】
実施例３：全身投与後の肉芽化インヒビター血清レベルの維持
本実施例は、肉芽化インヒビター血清レベルが規則的な投与レジームで維持し得ることを示す。
【０１４８】
各対象の投与法は、頭静脈または伏在静脈中の静脈内注入による全身配送であった。各動物に対する投与容積は最新の体重測定に基づき、５０、１５または５ｍｇ／ｋｇであった。動物が霊長類椅子に拘束されている間に、シリンジ注入ポンプを用いて静脈内注入を行った。投与のために動物を麻酔しなかった。投与スケジュールはレーザー傷害の当日から初めて、週１回、４週間であった。
【０１４９】
【表１】
Ｍ２００の静脈内投与後のＣＤ１４＋上のα５β１部位の飽和度を測定した。ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１４を用いてＣＤ１４＋単核細胞が同定される２色分析を用い、ＰＥ結合マウス抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いて結合Ｍ２００を定量して、占有されたα５β１部位の測定を行った。平行して細胞をＰＥに結合したマウス抗体ＩＩＡ１とインキュベーションし、ＩＩＡ１結合を定量し、占有された（利用できる）α５β１部位の測定を行った。これらの２つの測定を用いて、Ｍ２００によるα５β１部位の飽和度を計算した。
【０１５０】
以下の様な平均ＧＭＦ（平均蛍光強度）を用い、結合Ｍ２００の正規化ＧＭＦ（ＧＭＦＮｏｒｍ）を決定して飽和度を計算を行った。
【０１５１】
ＧＭＦＮｏｒｍＭ２００＝（ＰＥ抗ヒトＩｇＧ４のＧＭＦ）／（対照同位体のＧＭＦ）
平均ＧＭＦ値を用いる結合ＩＩＡ１の正規化ＧＭＦ（ＧＭＦＮｏｒｍ）の計算は以下の通りである。
【０１５２】
ＧＭＦＮｏｒｍＩＩＡ１＝（ＰＥ−ＩＩＡ１のＧＭＦ）／（対照同位体のＧＭＦ）
Ｍ２００によるα５β１の占有率の計算は以下の通りである。
【０１５３】
Ｍ２００による占有％＝［（ＧＭＦＮｏｒｍＭ２００−１）×１００］／［（ＧＭＦＮｏｒｍＭ２００−１）＋（ＧＭＦＮｏｒｍＩＩＡ１−１）］
【０１５４】
結果
図３Ａ〜３Ｃに示す様に、肉芽化インヒビターＭ２００のレベルは時間と共に減少する。肉芽化インヒビターの治療レベルは５ｍｇ／ｋｇのＭ２００投与後１６８時間、１５ｍｇ／ｋｇ注入の２４０時間後、５０ｍｇ／ｋｇ投与の３３６時間以上後でも存在する。
【０１５５】
図３Ｄ〜３Ｆは、１５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＭ２００毎週投与により、有益な効果を与えるに必要な肉芽化インヒビターの最少レベルを維持するか、またはそれを超えることを示している。この結果は図２および３にまとめられるＭ２００およびＩＩＡ１結合の研究で確認される。
【０１５６】
図１４は血液単核細胞に対するＭ２００肉芽化インヒビターの結合を示す。各棒グラフは付随する説明で表される様な日毎のＦＡＣＳ分析で測定したＭ２００の占有率を示す。このチャートは、各投与量を与えた４日後に単核細胞α５β１インテグリン結合部位がＭ２００で飽和していることを示す。５ｍｇ／ｋｇの投与量では、単核細胞へのＭ２００結合レベルが急速に消滅し、２１日でのレベルは無視し得る程度であった。しかしながら、単核細胞α５β１インテグリン結合部位のＭ２００による飽和レベルは、１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの投与量の双方で実験期間中維持される。これらの結果は、図１５に示されるＩＩＡ１のＦＡＣＳ分析で確認される。部位がＭ２００で占有されていない場合のみ、ＩＩＡ１は単核細胞α５β１インテグリン結合部位へ結合する。図１５に示す様に、５ｍｇ／ｋｇの投与量でＩＩＡ１の単核細胞α５β１インテグリン結合部位への結合は約１４日以内にほぼ飽和レベルに増加する。このＩＩＡ１占有の増加は、単核細胞α５β１インテグリン結合部位へのＭ２００の結合の減少の後を追うものである。ＩＩＡ１結合とＭ２００結合の間の同じパターンが１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇでも観察される。
【０１５７】
実施例４：肉芽化インヒビターＦ２００による硝子体内処置後の肉芽化の減少
本実施例は肉芽化インヒビターＦ２００によるレーザー誘発眼障害処置の効果を示す。動物モデルにおけるレーザー誘発眼障害の研究を記載する背景文献には：Ｓ．Ｒｙａｎ、“Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｉｓｃｉｆｏｒｍ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｐｔｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、７７：７０７−７４５（１９７９）；Ｓ．Ｊ．Ｒｙａｎ、“Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｉｏｎ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ”、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１００：１８０４−１８０９（１９８２）；Ｍ．Ｊ．Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、“Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｄｅｘｔｒａｎｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，”、Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１１８：７８−７４（２０００）が含まれる。
【０１５８】
以下に記す様に、本発明の細胞性肉芽化インヒビターの硝子体内注入により、サルで誘発した斑紋傷における組織肉芽化がかなり減少する。
【０１５９】
まとめ
以下の表２に示す様に、合計４匹のサルを処置群とした。ＥＯＳ２００Ｆは担体緩衝液中で投与したマウス抗α５β１インテグリンＩｇＧおよびヒトＩｇＧ由来のＦａｂフラグメントである。第１日に各動物の両眼の斑紋にレーザー処置により斑紋肉芽化を誘発した。週に１回、４週間、全ての動物に表に示す様に薬剤を投与した。投与の最初の日を第１日と定義した。標準法を用いて臨床症候、体重および他のパラメーターにつき動物を評価した。全ての動物を第３２日に安楽死させた。
【０１６０】
【表２】
細胞性肉芽化の誘発
レーザー処理および薬剤投与の前に動物を終夜縛り付けた。レーザー処理および薬剤投与操作のため、動物をケタミンＨＣｌ（筋肉内、有効量）、続いて筋肉内ケタミンとジアゼパム（有効量）で麻酔した。
【０１６１】
レーザー処理により斑紋肉芽化を両眼の斑紋に誘発した。レーザー（ＩＲＩＳ Ｍｅｄｉａｌ（商標）ポータブルスリットランプアダプターを備えたＯｃｕＬｉｇｈｔＧＬ（５３２ｎｍ）レーザーフォトコアギュレーター）による標準グリッドパタンで傷を斑紋中に形成した。右眼のレーザースポットを左眼に反転して照射した。レーザーパラメーターの概要は以下の通りである：スポットサイズ５０〜１００μｍ；レーザー出力３００〜７００ミリワット；露光時間０．１秒。各動物に対するパラメーターをレーザー処置の当日に記録した。ＴＲＣ５０ＥＸ網膜カメラおよび／またはデジタルＣＣＤカメラを備えたＳＬ−４ＥＤスリットランプを使用して写真を撮影した。
【０１６２】
薬剤投与
免疫グロブリンまたは緩衝液対照品の硝子体内注入を各眼に行った。レーザー処理の直後に第１日の注入を行う。薬剤投与の前に散瞳薬（１％トロピカミド）を各眼に滴下した。眼を薄い抗菌剤溶液（５％ベタジン溶液またはその等価物）で漱ぎ、抗菌剤を０．９％滅菌食塩水（またはその等価物）で洗い流し、２滴の局所麻酔剤（プロパラカインまたはその等価物）を眼に滴下した。術中に瞼を開いたままにしておくため、瞼鏡を挿入し、球を引き抜いた。角膜の約４ｍｍ後方で強膜および平面部に注射器の針を通した。針をレンズの後方で中間硝子体に指し込んだ。薬品を硝子体中にゆっくり注入した。針を引き抜く前に注射器を取り巻く結膜を掴むため、鉗子を使用した。針を引き抜く間、および針を引き抜いた後の短時間、結膜を鉗子で保持した。次いで瞼鏡を取り除いた。薬剤投与後直ちに、眼を検眼鏡で調べて、眼に見える投与後の問題があるかどうかを検査した。
【０１６３】
薬剤投与の直後、および投与の１日後に、感染を防ぐため各眼に局所抗生物質（トブレックス（商標）またはその等価物）を分配した。麻酔から十分に回復してから、動物をケージに戻した。薬剤投与を上記の様に毎週行った。示されたグラム量投与レベルを各眼に与えた。使用した肉芽化インヒビターの濃度範囲は以下の通りである：各無損傷抗体を約１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０〜３００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約２５〜２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約７．５〜１５０μｇ／ｍｌの濃度で使用する。好ましいＦａｂ濃度は全抗体で挙げられた濃度と同じであり、好ましくは眼に対し２．５〜５０μｇ／ｍｌである。
【０１６４】
肉芽化阻害のモニタリング
後部チャンバーを調べるために関節検眼鏡を使用し、眼の前部セグメントを調べるために生物顕微鏡を使用した。標準法を用いて眼を評価した（Ｒｏｂｅｒｔ、Ｂ．ＨａｃｋｅｔｔおよびＴ．Ｏ．ＭｃＤｏｎａｌｄ、１９６６、Ｄｅｒｍａｔｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ．Ｂｙ Ｆ．Ｂ．Ｍａｒｘｕｌｌｉ ａｎｄ Ｈ．Ｉ．Ｍａｉｂａｃｈ、Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ）。
【０１６５】
眼の写真を撮影する（ＴＲＣ−５０ＥＸ網膜カメラおよび／またはデジタルＣＣＤカメラ付きＳＬ−４ＥＤスリットランプ）。この処置の前に動物をケタミンＨＣｌで軽く麻酔し、数滴の散瞳薬（典型的には１％トロピァカミド）を眼に滴下して検査し易くする。
【０１６６】
動物を安楽死させ、眼を取り出して切開した。瞳、視神経および斑紋が同一平面になる様にフォルマリン固定眼を水平に切開し、パラフィンに埋没した。全試料にわたり連続切片を作成し、一定間隔のスライドをヘムトキソリンおよびエオシンにより定法で染色した。傷を光学顕微鏡で同定し、測定して傷、斑紋および視神経の位置を示すマップを作成した。組織学的に最も重症度の高い傷害（傷の中心領域と考えられる）を示すスライド上で、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ製のＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウエアを用いて肉芽化組織の領域を測定した。
【０１６７】
これらのグループの解析は、傷における組織肉芽化を明瞭に検出した。図１２に示す様に、未処置対照動物（グループ１および２）中に見出された肉芽化のレベルと比較して、処置動物の眼における肉芽化（グループ８および９）が有意に減少している。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１はマウス抗α５β１インテグリン抗体（ＩＩＡ１）の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）、およびマウスオリジナル由来の５個のヒト化抗体（１．０〜５．０）のアミノ酸配列（配列番号１〜１２）を示す。
【図２】図２はマウスオリジナル（ＩＩＡ１）に対する５個のヒト化抗体中の配列置換を強調するアミノ酸配列（配列番号１〜１２）の並びを示す。
【図３】図３は（Ａ）ＩＩＡ１ＶＨ核酸配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１）；（Ｂ）ＩＩＡ１ＶＬ核酸配列（配列番号１４）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図４】図４は（Ａ）抗体Ｍ２００−４ＶＨ核酸配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）、（Ｂ）抗体Ｍ２００−４ＶＬ核酸配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図５】図５は（Ａ）抗体Ｍ２００ＶＨ核酸配列（配列番号１９）およびアミノ酸配列（配列番号２０）、（Ｂ）抗体Ｍ２００ＶＬ核酸配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。
【図６】図６はＭ２００重鎖発現のためのｐ２００−Ｍ−Ｈプラスミドコンストラクトを示す。
【図７】図７はＭ２００軽鎖発現のためのｐ２００−Ｍ−Ｌプラスミドコンストラクトを示す。
【図８】図８はＭ２００重鎖および軽鎖発現のための単一プラスミドｐ２００−Ｍを示す。
【図９】図９は完全Ｍ２００重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列（配列番号２３、２４）を示す。
【図１０】図１０は完全Ｍ２００重鎖および軽鎖アミノ酸配列（配列番号２５、２６）を示す。
【図１１】図１１は完全Ｆ２００重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号２７、２８）を示す。
【図１２】図１２は肉芽化インヒビターＦ２００（ＥＯＳ２００−Ｆとも呼ばれる）の不在に対する肉芽化インヒビターの存在における瘢痕形成の減少を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは５、１５または５０ｍｇ／ｋｇ体重それぞれの１回の静脈内注射後の指示された期間中の肉芽化インヒビターＭ２００（ＥＯＳ２００−４とも呼ばれる）の血清レベルを示す。図１３Ｄ〜１３Ｆは毎週５、１５または５０ｍｇ／ｋｇ体重それぞれのスケジュール中の指示された期間中の肉芽化インヒビターＭ２００の血清レベルを示す。
【図１４】図１４は図１３Ａ〜１３Ｃに記載の個体から採集した全血のＦＡＣＳ測定の結果のまとめであり、肉芽化インヒビターＭ２００（ビヒクル＝０ｍｇ・ｋｇ）による血液単核細胞α５β１インテグリン結合部位の占有率を示す。
【図１５】図１５は図１３Ａ〜１３Ｃに記載の個体から採集した全血のＦＡＣＳ測定の結果のまとめであり、血液単核細胞α５β１インテグリン結合部位の利用可能率を示す。データは図４に示すデータで補正され、肉芽化インヒビターＭ２００（ビヒクル＝０ｍｇ／ｋｇ）を投与した個体から採集した単核細胞α５β１インテグリン結合部位へ抗α５β１抗体が結合できないことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学および生理学、特に傷の治癒を促進する方法に関する。提供される方法により、ユーザーは創傷部位中およびその周辺における組織の肉芽化を処置するための治療薬として有用なインヒビターを特定し、傷ついた組織の治癒に伴う過剰の傷跡形成を制限することができる。本発明の方法を用いて同定された肉芽化インヒビターは、創傷部位内およびその周辺の肉芽化を５倍程度阻害し、それに伴って網膜の障害に試験した場合、廃痕組織の形成が減少する。さらに、これらのインヒビターはＲＰＥ細胞中の病変部に関連するマクロファージの挙動を阻害する。本発明の方法を用いて同定し得る肉芽化インヒビターには抗体、ペプチド、拡散（アプタマー）および非ペプチド低分子量分子が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
正常な状態、および傷治癒条件における傷の修復および組織形成は医療における主な目標である。傷の治癒における特異的な問題は、創傷部位内およびその周辺の過剰肉芽形成の結果である体液集積で生じる廃痕形成と下部膜からの組織の剥離である。これらの問題は眼の傷害、および関節軟骨等の他の組織において特に深刻である。例えば、傷の治癒においてＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの再編成が主として行われることが示されているが、結合組織内のこの様な分子の集積は、リューマチ性関節炎およびアテローム性動脈硬化と関連している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、治療された傷における肉芽化ばかりでなく、傷ついた、または組織移植を受けた哺乳動物組織、特にヒト組織の修復を制御するのに有用な方法と組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は傷ついた組織領域における肉芽化の制御法を提供する。この方法において、本発明の方法は初期の傷に伴う組織の損傷を最小にすることを幇助する。従って、本発明は傷ついた、または病んだ組織に肉芽化インヒビターを適用することを含む、有害な肉芽化を減少させる方法を提供する。病んだ、または傷ついた組織は眼の一部または関節であるか、または滑液嚢と関連し得る。ある方法はケロイド形成、火傷または皮膚硬化症等の症状で生じる、傷ついた、または病んだ組織の処置に有用である。他の方法は組織の炎症を生じる疾患に関連する、傷ついた、または病んだ組織の処置を提供する。このタイプの疾患の例にはリュウマチ性関節炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉芽腫症、好酸球肉芽腫症、正中肉芽腫、デスモイド、類肉腫症、黄紋変性、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、子宮類線維腫、側頭筋動脈炎、およびＴａｋａｙａｓｕ動脈炎が含まれる。例えばＣｒｏｈｎ病、特発性肺線維症、およびアレルギー性肺線維症等の炎症で生じる繊維形成を含む疾患も、本明細書に記載の処置に応答する。上記の様な疾患を治療する医薬として有用な肉芽化インヒビターには抗体、低分子量有機分子、および核酸、タンパク質およびペプチドが含まれる。
【０００５】
本発明の他の実施態様は、α５β１インテグリン結合剤を組織に施すことを含む、傷付いた、または病んだ組織における肉芽化を減少する方法である。この様な方法の対象となる組織には眼、皮膚、骨、関節、血管、靭帯および腱が含まれる。直接塗布、静脈注射、全身注入、噴霧吸入、点眼、および経口摂取を含むいくつかの技術で、結合剤を傷付いた、または病んだ組織に施すことができる。
【０００６】
本発明の方法を用いて処置し得る組織の損傷には切り傷、火傷、打撲傷および刺傷等の物理的傷害、化学的外傷、放射線源への暴露等が含まれる。組織の損傷による感染症もまた、本発明により処置し得る。しかしながら、本発明は非感染症、特に好ましくは手術中等の滅菌環境中で生じる、または優先的な感染を伴わないと思われる傷の処置に特に適している。本発明の方法で処置し得る疾患には糖尿病性網膜炎、リューマチ性関節炎、骨関節炎、組織肉芽化による黄斑変性、側頭動脈炎、多発性筋肉痛リューマチ、巨細胞動脈炎、Ｔａｋａｙａｓｕ動脈炎、Ｋａｗａｓａｋｉ病、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉芽腫症および血管炎、特発性肺線維症、全身性硬化症／皮膚硬化症、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群／症、乾燥症候群、アレルギー性肺線維症、類肉腫症、子宮前線維組織、血管腫、リンパ管腫、ケロイド瘢痕生成、Ｇｏｏｄｐａｓｔｅｕｒ病、Ｃｒｏｈｎ病、Ｐａｓｇｅｔｓ症候群、プテリギア、好酸球肉芽症、細胞顆粒化を生じる自己免疫疾患、および罹患組織内に血管新生を誘発する多くの傷および疾患が含まれるが、それらに限定されない。
【０００７】
本発明のいくつかの態様では、核酸（アプタマー）糖タンパク質、低分子量有機分子、ムティエン等であるα５β１結合剤が使用される。結合剤は抗α５β１インテグリン抗体であることが最も好ましく、配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体であることが望ましい。
【０００８】
本発明にはまた、細胞性肉芽化のインヒビターの同定法も含まれる。これらの方法のいくつかには、第１の傷組織をインヒビター候補の存在下にインキュベーションする工程、第２の傷組織をインヒビター候補を加えずにインキュベーションする工程、および第１傷組織と比較して第２傷組織中に存在する細胞性肉芽化のレベルを測定する工程が含まれる。
【０００９】
細胞性肉芽化の他の同定法には別なスクリーニングが含まれる。別なスクリーニングにはα５β１インテグリンを結合剤候補とインキュベーションする工程、フィブロネクチンをα５β１インテグリンと結合剤候補のインキュベーションに添加する工程、およびα５β１インテグリンがフィブロネクチンと結合するかどうかを測定する工程が含まれる。α５β１インテグリンがフィブロネクチンと結合できない場合、結合剤候補はインヒビター候補であることを示している。一度インヒビター候補が同定されると、それらを細胞性肉芽化阻害能について試験する。これには第１傷組織をインヒビター候補の存在下にインキュベーションする工程、第２傷組織をインヒビター候補を加えずにインキュベーションする工程、および第１傷組織と比較して第２傷組織中に存在する細胞性肉芽化レベルを測定する工程が含まれる。
【００１０】
細胞性肉芽化インヒビターを同定する二つの方法のある態様では、第１および第２傷組織は眼組織である。ある態様では、測定工程には染色組織切片を検査する工程が含まれる。また別な態様には結合またはインヒビター候補がタンパク質、好ましくは抗α５β１インテグリン抗体、最も好ましくは配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体である場合が含まれる。
【００１１】
眼の傷害および疾患に関連する実施態様では、罹患した眼の中の創傷部位を上記のα５β１インテグリン結合剤と接触させる工程を含むＲＰＥ細胞の挙動の制御法が提供される。その結果、罹患した眼のＲＰＥ細胞がマクロファージ挙動を示すことを阻害する。または、ＲＲＥ細胞はより繊維芽細胞型の形態を取る様に思われる。阻害されるマクロファージ挙動のタイプには食細胞活性、およびサイトカイン、ケモカインおよび炎症反応媒介因子が含まれる。結合剤は抗α５β１抗体であることが好ましく、α５β１インテグリンに対し配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体と競合的に結合する抗体であることがより好ましく、配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体であることが最も好ましい。本発明のある態様では、傷付いたまたは病んだ組織への直接塗布、静脈内注射、全身注入、噴霧吸引、点眼、および経口摂取を含むいくつかの方法で、結合剤を傷付いたまたは病んだ組織に施すことができる。傷付いたまたは病んだ眼の傷害部位が感染で生じたものでないことが好ましい。
【００１２】
肉芽化インヒビターで調節される生理効果の評価法に、眼組織も用いられる。これらの方法には肉芽化を形成するに十分な障害を眼組織中に形成する工程、眼組織に一定量の肉芽化インヒビターを投与する工程、および薬品投与眼組織の障害中またはその周りの肉芽化をモニターする工程が含まれる。本実施態様のある態様では、眼組織は生きた霊長類の眼の一部である。本実施態様で使用される眼組織は網膜、角膜斑または角膜組織である。本発明のある態様では、眼組織中の障害の形成がレーザー光で行われる。ある態様では、レーザー光は約３００〜７００ミリワットであり、暴露時間は０．１秒以下である。形成した傷害は直径約５０〜１００μｍであることが好ましい。肉芽化インヒビターの投与は任意の方法、例えば直接適用、静脈内注射、全身注入、噴霧吸入、点眼、または経口摂取が可能である。肉芽化インヒビターは上記の任意の分子でよいが、好ましくは抗α５β１抗体、より好ましくは配列番号１〜６でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
１．定義
特に断らない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術の当業者が通常理解する意味を有する。以下の文献は、本発明で用いられる多くの用語の一般的な定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．、１９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ａｎｄ Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で用いる以下の用語は、特に断らない限りその本来の意味を有する。
【００１４】
「インテグリン」という用語は、多様な細胞中で発現し、細胞外マトリックス中で特定のリガンドに結合する細胞外受容体を指す。インテグリンが結合する特異的リガンドはアルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；ＲＧＤ）またはロイシン−アスパラギン酸−バリントリペプチドを含み、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テナスシンおよびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子が含まれる。ヘテロダイマーのインテグリン領域スーパーファミリーはαサブユニットとβサブユニットで構成される。例えばαＶ、α５等で指定される多くのαサブユニット、および例えばβ１、β２、β３、β５等で指定される多くのβサブユニットが同定され、α５β１、αＶβ３およびαＶβ５を含むこれらのサブユニットの様々な組み合わせが、インテグリンサブファミリーを代表する。インテグリンのスーパーファミリーを例えばαＶβ３およびαＶβ５を含むαＶ含有インテグリン、またはα５β１およびαＶβ１を含むＰｉ含有インテグリン等のファミリーに細分することができる。インテグリンはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、両生類、トリおよびヒトを含む哺乳動物を含む広い範囲の生物中で発現する。
【００１５】
α５β１インテグリンと結合する本明細書で開示するタンパク質、特に抗体、突然変異タンパク質、ムティン、核酸アプタマー、およびペプチドおよび非ペプチド低分子量有機分子は、本発明の「結合剤」および「肉芽化インヒビター」として作用する。「結合剤」という用語は、本明細書では受容体とそのリガンドとの特異的相互作用を妨害し得る試薬を意味するものとして使用される。α５β１とフィブロネクチンとの結合を妨害し、それにより会合を減少または阻害し得る抗α５β１インテグリン抗体は、α５β１結合剤の１例である。α５β１結合剤は、そのリガンドへ結合するα５β１インテグリンの競合的インヒビターまたは非競合的インヒビターとして作用し得る。
【００１６】
肉芽化インヒビターには、本明細書で説明する様に創傷部位へ施した場合、組織の肉芽化を減少させる結合剤が含まれる。
【００１７】
「結合剤候補」とは、本明細書で定義する様にα５β１インテグリンに特異的に結合し得る分子種を指す（すなわち結合剤であり得る分子種）。
【００１８】
「インヒビター候補」とは、α５β１インテグリンに特異的に結合し、傷組織に施した場合、細胞の肉芽化を阻害し得る分子種を指す。
【００１９】
「特異的に（または選択的に）結合する」という語句、または抗体相互作用を指す場合、「特異的に（または選択的に）〜と免疫反応性」という語句は、生理条件下でバックグラウンド分子会合の少なくとも２倍、より典型的には１０〜１００倍以上の２つの分子間の結合反応を指す。タンパク質である少なくとも１個の検出可能結合剤を使用する場合、当為的結合とはタンパク質および他の生体物質の異種集団中のそのタンパク質の存在を決定する因子である。従って、特定の免疫分析条件下では、特異性抗体が特定のタンパク質配列に結合し、その存在を同定する。
【００２０】
この様な条件下の抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性で選択された抗体が必要である。例えば、特定のタンパク質、多形突然変異体、対立遺伝子、オーソログ、および保存的に修飾された突然変異体、またはスプライス突然変異体、またはその一部を選択して、α５β１インテグリンと特異的に免疫反応性であるが他のタンパク質とは反応性でないポリクローン抗体を得ることができる。この選択を、他の分子と交差反応性である抗体を除外することで実行できる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々な免疫分析フォーマットを使用し得る。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫分析が日常的に使用される（特異的免疫反応性を測定するために使用できる免疫分析フォーマットと条件については、例えばＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）参照）。２つの分子が特異的に相互作用するかどうかを決定する方法が本明細書に記載され、結合親和性と特異性の決定法は公知である（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）；Ｆｒｉｅｆｅｌｄｅｒ、“Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、１９７６）参照）。
【００２１】
一般に結合剤と肉芽化インヒビターは、その天然リガンドに結合するα５β１インテグリンを「妨害」する。他のインテグリンリガンドのインテグリン結合能に関する結合剤の作用を参照して使用される場合、「妨害する」とはインテグリンとそのリガンド間の相互作用の親和性が、結合剤がない場合に生じる結合レベル以下に減少することを指す。受容体とそのリガンドとの会合がこの様な分子群間で生じる動的な関係にあり、任意の時点で受容体とリガンドのある部分が会合状態にあることを、当業者は理解し得ると考えられる。従って、受容体とそのリガンドとの特異的相互作用を妨害する試薬は、ある時点で生じるこの様な相互作用の相対的な数を減少させ、ある場合はこの様な会合の全てを完全に阻害し得る。α５β１インテグリン結合剤が受容体とそのリガンドとの会合を阻害する、または会合を特定の分析の検出限界以下に減少させるかどうかを判別することは困難である。従って、受容体とそのリガンドとの特異的結合を減少させる、または阻害すること包含して、「妨害」という用語は本明細書では広く用いられる。
【００２２】
さらに、α５β１インテグリン結合剤は様々な機構、例えばリガンド結合部位に結合し、その結果リガンド結合を妨害することにより；受容体のリガンド結合部位以外に結合するが、リガンドの受容体への結合を立体的に妨害することにより；受容体に結合し、リガンドの結合を妨害する受容体の立体配座その他の変化を生じさせることにより；または他の機構により、受容体とそのリガンドとの特異的結合を妨害することができる。同様に、結合剤はリガンドと結合して、または相互作用して受容体との特異的相互作用を妨害する。本明細書に開示した目的では、妨害を生じる機構の理解は必要でなく、作用の機構を提案していない。抗α５β１抗体またはその抗原結合フラグメント等のα５β１結合剤の特徴は、少なくとも約１０５ｍｏｌ−１、１０６ｍｏｌ−１以上、好ましくは１０７ｍｏｌ−１以上、より好ましくは１０８ｍｏｌ−１以上、最も好ましくは１０９ｍｏｌ−１以上のα５β１インテグリンに対する特異性結合活性（Ｋａ）を有することである。例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−７２、１９４９）により、当業者は抗体の結合親和性を容易に決定することができる。
【００２３】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、天然起源の抗体の他、例えば１本鎖抗体、キメラ２価ヒト化抗体、およびその抗体結合フラグメント（例えばＦａｂ‘、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）を包含する。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ １９９４−１９５５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）および例えばＫｕｂｙ、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ，、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）参照。この様な非天然起源抗体を固相ペプチド合成を用いて構築するか、組み換えで製造するか、例えばＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に記載され、本明細書に引用して援用する可変重鎖および可変軽鎖でなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして得ることができる。例えばキメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト１本鎖２価抗体は当業者に公知である（Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａ，１９８８；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２ｎｄ ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）；それぞれを本明細書に引用して援用する）。
【００２４】
「抗体」という用語にはポリクローンおよびモノクローン抗体の双方が含まれる。この用語にはまた、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）およびヘテロ共役付加抗体（例えば双特異性抗体）遺伝子操作型も含まれる。この用語は組み換え１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）も指す。抗体という用語には２価または双特異性分子、２抗体、３抗体および４抗体も含まれる。２価および双特異性分子は例えばＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．、（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１５４７，Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａ，Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ：５３６８；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：７８１；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５；Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４０２６；およびＭｃＧａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：３０１に記載されている。
【００２５】
典型的には抗体は重鎖および軽鎖を有する。重鎖および軽鎖のそれぞれは不変領域および可変領域を有する（この領域は「ドメイン」としても知られている）。軽鎖および重鎖可変領域は３個の超可変領域で隔てられた４個の「骨格」領域を有し、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。骨格領域とＣＤＲの長さは定義されている。異なった重鎖または軽鎖の骨格領域の配列は一定の種内では相対的に保存されている。構成軽鎖および重鎖の組み合わせ骨格領域である抗体の骨格領域は、ＣＤＲを３次元空間に位置し配列する役割を果たす。
【００２６】
ＣＤＲは主として抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは典型的にはＮ−末端から開始して番号が付けられるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、特定のＣＤＲが位置する鎖で同定される。従って、ＶＨＣＤＲ３はそれが結合する抗体の重鎖の可変領域に位置し、一方、ＶＬＣＤＲはそれが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。
【００２７】
「ＶＨ」の例はＦｖ、ｓｃＦｖまたなＦａｂの重鎖を含む抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域である。「ＶＬ」の例はＦｖ、ｓｃＦｖまたなＦａｂの軽鎖を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域である。
【００２８】
「１本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という語句は、伝統的な２本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが結合して１本鎖を形成する抗体を指す。典型的には、リンカーペプチドが２本の鎖の間に挿入され、適切な折り畳みと活性結合部位の形成が可能になる。
【００２９】
「キメラ抗体」とは（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なった、または変化したクラス、エフェクター機能および／または種の不変領域、またはキメラ抗体に例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等の新しい性質を付与する全く異なった分子に結合する様に、不変領域またはその一部が変化した、または置換または交換された免疫グロブリン分子；または（ｂ）可変領域またはその一部が変化した、または異なったまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で置換または交換された免疫グロブリン分子である。
【００３０】
「ヒト化抗体」とは非ヒト免疫グロブリン由来の最少の配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体には受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が所望の特異性、親和性および容量を有するマウス、ラットまたはウサギ等の非ヒト種（供与者抗体）由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）が含まれる。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格領域が対応する非ヒト残基で置換されている。ヒト化抗体はまた、受容者抗体または導入ＣＤＲまたは骨格配列内に見出されない残基を有してもよい。一般にヒト化抗体は少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを有するが、可変領域内では骨格領域（ＦＲ）の全て、または実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの不変領域の一部を有することが最適である（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。ヒト抗体に対しげっ歯類ＣＤＲ配列（単数または複数）を置換することにより、ヒト化をＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って基本的にあらかじめ生成することができる。従って、この様なヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的に少なくとも無傷のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。
【００３１】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープをタンパク質の３次元折り畳みで並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の双方から形成することができる。隣接アミノ酸で生成したエピトープは典型的には変性溶剤に晒しても保持されるが、３次元折り畳みで形成したエピトープは変性溶剤で処理すると典型的に失われる。エピトープには独自の空間配置中に少なくとも３個、通常は少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸が含まれる。エピトープの空間配置の決定法には例えばＸ−線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば「分子生物学の方法におけるエピトープマッピングプロトコール」、第６６巻、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ Ｅｄ（１９９６）参照。エピトープマッピングの好ましい方法は表面プラズモン共鳴であり、本明細書に開示するＩＩＡＩと同じエピトープ境域を認識する好ましい肉芽化インヒビターを同定するために用いられている。
【００３２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では互換的に用いられている。この用語は、少なくとも１個のアミノ酸残基が対応する天然起源アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーの他、修飾された残基、および非天然由来のアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３３】
用語「アミノ酸」とは天然起源アミノ酸および合成アミノ酸の他、天然起源アミノ酸と同様に機能をするアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然起源アミノ酸は遺伝子コードでコードされるアミノ酸の他、以後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスフォセリンである。アミノ酸アナログとは天然起源アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば水素、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキシド、メチオニンメチルスルフォニウムを指す。この様なアナログは修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有してもよいが、天然起源アミノ酸と同じ基本化学構造を維持している。アミノ酸模倣体とはアミノ酸の一般的な化学構造とは異なった構造を有するが、天然起源アミノ酸と類似の機能を有する化合物を指す。
【００３４】
アミノ酸は本明細書では一般に知られた３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字記号で表される。同様にヌクレオチドも一般に受け入れられている１文字コードで表される。
【００３５】
「保存的に修飾された突然変異体」はアミノ酸および核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された突然変異体とは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は基本的に同一または関連する配列、例えば天然の隣接配列を指す。遺伝コードの縮退のため、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ，ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって指定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変えることなくあるコドンを対応する他のコドンに変えることができる。この様な核酸の突然変異は「沈黙突然変異」であり、保存的に修飾された変化の１種である。あるポリペプチドをコードする本明細書の核酸配列の全ては、その核酸の沈黙突然変異である。当業者はある状況では核酸中の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）を修飾して機能的に同一の分子を生成することができることを理解し得ると思われる。従って、あるポリペプチドをコードする核酸の沈黙突然変異は、発現生成物に関して記載された配列中で暗黙に認められるものであるが、実際のプローブ配列中ではそうではない。
【００３６】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列中の単一アミノ酸またはアミノ酸のわずかな割合を変化、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、その変化があるアミノ酸を化学的に類似のアミノ酸で置換する結果になる場合、「保存的に修飾された突然変異体」であることを当業者は理解し得ると思われる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は公知である。この様な保存的に修飾された突然変異体は本発明の多形突然変異体、種間同族体および対立遺伝子に付加されるものであり、それらを除外するものではない。典型的な相互の保存性置換は１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ（１９８４）参照）。
【００３７】
少なくとも２個のペプチドに関連する「同種」とは、以下に記載するデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定される、または手動整列および目視検査による、同一であるアミノ酸残基の指定されたパーセント（すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたる最大の対応性に対して比較し整列した場合、指定した領域にわたる約６０％の同一性、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性）を有する少なくとも２個の配列またはサブ配列を指す（例えばＮＣＢＩウエブサイトｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等を参照）。この定義には欠失および／または付加を有する配列の他、置換を有する配列、天然起源、例えば多形または対立遺伝子突然変異体、および人工突然変異体も含まれる。以下に述べる様に、好ましいアルゴリズムはギャップ等を考慮することができる。長さで少なくとも２５アミノ酸である領域にわたって同一性が存在することが好ましく、長さで５０〜１００アミノ酸である領域に渡って同一性が存在することがより好ましい。
【００３８】
配列の比較のため、典型的にはある配列が参照配列となり、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要あればサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを指定することが好ましいが、別なパラメーターを指定することもできる。次いでプログラムパラメーターに基づき、参照配列と比較して配列比較アルゴリズムが試験配列に対する配列同一パーセントを計算する。
【００３９】
本明細書で使用する「比較ウインドウ」には、２つの配列を最適に整列した後、ある配列が同じ数の隣接位置の参照配列と比較される、典型的には２０〜６００、通常は約５０〜約２００、さらに約１００〜約１５０でなる群より選ばれた隣接位置の数の一つに対する参照が含まれる。比較のための配列の整列法は公知である。比較のための配列の最適整列は例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８））の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＦＡＳＴＡ）、または手動整列および目視検査（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．、１９９５、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））により行うことができる。
【００４０】
配列同一度パーセントと配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例には、Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されたＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０が含まれる。本明細書に記載のパラメーターを有するＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明の核酸およびタンパク質に対する配列同一性パーセントを決定するために用いられる。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウエアはＮａｔｉｏｎｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムには最初に質問配列中の長さＷの短いワードを同定することによる高スコア配列対の同定が含まれ、データーベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、それを満足する。Ｔは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｈｕｌら、上記）。最初の近隣ワードヒットが、それらを含むより長いＨＳＰの検索を開始するためのシードとなる。累積整列スコアが増加する限り、ワードヒットが各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは例えばヌクレオチド配列、パラメーターＭ（一致残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびパラメータＮ（ミスマッチスコアに対する罰スコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列に対してスコアマトリックスが累積スコアを計算するために用いられる。累積整列スコアがその達成した最大値からある量Ｘだけ下降した場合；少なくとも１個の負スコア残基整列の累積のため、累積スコアがゼロ以下に下がった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合、各方向へのワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対する）はデフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および２つの鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス整列（Ｂ）５０（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および２つの鎖の比較を使用する。
【００４１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的解析も行う（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の基準は最少和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指針を提供する。例えば、試験ペプチドの参照ペプチドに対する比較における最少和確率が約０．２以下、より好ましくは約０．０１以下、最も好ましくは約０．００１である場合、あるペプチドが参照配列に類似であると考えられる。ログ値は例えば５、１０、２０、３０、４０、４０、７０、９０、１１０、１５０、１７０等の大きな負の値である。
【００４２】
「ラベル」または「検出可能成分」はスペクトロスコピー、光化学、生化学、免疫化学、化学または他の物理的手段により検出可能な成分である。例えば、有用なラベルには蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（通常ＥＬＩＳＡで使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンまたは例えば放射線ラベルをペプチド中に取り込むことにより検出可能にした、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられる他の成分が含まれる。例えば放射性同位体は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉである。ある場合、特に抗α５β１インテグリン抗体を用いる場合は、放射性同位元素は以下に記載する様な毒性成分として用いられる。抗体の任意の位置にラベルを取り込んでもよい。抗体をラベルに結合する任意の公知の方法を用い得るが、それらにはＨｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ。３０：４０７（１９８２）が含まれる。放射線標識ペプチドまたは放射線標識抗体成分の寿命を、放射線標識ペプチドまたは抗体を安定化し、分解を防止する物質を添加することにより延長し得る。放射線標識ペプチドまたは抗体を安定化する任意の物質またはその組み合わせを、米国特許第５，９６１，９５５号に記載の物質を含め使用し得る。
【００４３】
例えば細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される用語「組み換え体」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然核酸またはタンパク質の変化により修飾されているか、または細胞がその様に修飾された細胞から誘導されたことを示す。従って、例えば組み換え細胞は細胞の天然（非組み換え）型内に見出されない遺伝子を発現するか、または他の場合は異常発現するか、わずかに発現するか、または全く発現しない天然遺伝子を発現する。本明細書の「組み換え核酸」という用語は、一般的に例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる核酸の操作により、天然に通常見いだされない形で最初にインビトロで形成される核酸を意味する。この様にして、異なった配列の作動可能な結合が行われる。従って、鎖状の単離核酸、または通常は結合しないＤＮＡ分子をライゲーションしてインビトロで生成する発現ベクターの双方は、本発明の目的のための組み換え体であると考えられる。組み換え核酸が一度作成され、宿主細胞または生物中に再導入されると、その核酸は非組み換え的に、すなわちインビトロ操作でなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製すると理解される。しかしながら、組み換えで一度製造されたこの様な核酸は非組み換え的に引き続き複製するが、本発明の目的に対しては組み換え体であると考えられる。同様に、「組み換えタンパク質」は組み換え技術を用いて上記の様な組み換え核酸の発現により製造されたタンパク質である。
【００４４】
「眼組織」とは脊椎動物の眼に見出される任意の組織型、または組織型の組み合わせを指す。眼組織の例には網膜、硝子体、角膜斑および角膜組織が含まれる。「病変眼」とは本発明の肉芽化インヒビターに反応する傷付いた組織を有する眼を指す。
【００４５】
「損傷または病変組織」または「傷付いた組織」とは、細胞性肉芽化を誘発するに十分な外傷を負った任意の組織を指す。「傷付いた部位」とは、細胞性肉芽化を生じる領域を指す。肉芽化を誘発するに十分な外傷は罹患組織の物理的、化学的または感染侵入の結果である。外傷は自己免疫反応等の異常な生理的な出来事、または例えばカビまたはバクテリア等の病原体の侵入で生じ得る。
【００４６】
「傷」とは組織への物理的、化学的または感染傷害で生成した組織損傷の局部領域を指す。本発明の文脈では、傷が傷害部位を生成し、肉芽化を引き起こす。
【００４７】
「感染」とは体部分または組織中への病原性微生物の侵入と増殖を指す。本発明の文脈では、組織の感染がそれに続く組織の障害を形成し、傷付いた組織となる。
【００４８】
「肉芽化」または「細胞性肉芽化」とは、小さな赤い突起が傷または傷付いた部位の生の表面上に形成し、一般的には治癒プロセスを促進する傷治癒プロセスの部分を指す。しかしながらある場合は、肉芽化が過剰で治癒した組織を不必要に損なったり、周辺組織に損傷を与えたりすることもある。「肉芽化減少」とは過剰の肉芽化を制御または減少し、弱くなった治癒組織、または過剰の肉芽化で生じる周辺組織への損傷を最少にするプロセスである。
【００４９】
有害な肉芽化とは、最初の傷の後に生じ、最初の創傷部位を越えてに組織を傷つける肉芽化を指す。有害な肉芽化は一般に創傷部位を生じる解剖学的環境の結果である。創傷部位が有害な肉芽化を受ける組織の例には、眼の角膜斑（硝子体空間）、結合組織（滑液空間）および肺胞膜（肺胞空間）等の内腔を接着する表面、またはその近くが含まれる。
【００５０】
「マクロファージ挙動」とは活性化マクロファージの挙動を真似る非マクロファージ細胞型の表現型挙動を指す。マクロファージ挙動の例にはバクテリア等の細胞性および異物屑を指向する食細胞活性、およびサイトカイン等の成長およびパラクリン因子の分泌が含まれる。
【００５１】
「ＲＰＥ細胞挙動」とは、網膜の下に細胞層を形成し、光受容体細胞の機能を支援する網膜色素上皮細胞の表現型活性を指す。栄養を提供し老廃物を除去するために、光受容体細胞はＲＰＥに依存する。ＲＰＥ細胞の挙動には罹患した眼に傷付いた組織を形成する障害に対するＲＰＥ細胞の反応が含まれる。傷害に反応して、ＲＰＥ細胞は形質変換してマクロファージ挙動を取る様に思われる。本発明の肉芽化インヒビターは、細胞がマクロファージ挙動の代わりに繊維芽細胞様の形態を取る様に導くことにより、傷に対するこのＲＰＥ細胞挙動を変化させる。
【００５２】
「染色組織切片」とは、組織薄片に存在する特徴を同定し易くする少なくとも１種の染料またはラベルを染み込ませた組織の薄い薄片を指す。組織染色キットは当業者に公知であり、例えばＳＡＮＹＯ Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ ｐｌｃ、Ｍｏｎａｒｃｈ Ｗａｙ、Ｂｅｌｔｏｎ Ｐａｒｋ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ ＬＥ１１ ５ＸＧ等が市販されている。
【００５３】
肉芽化インヒビター、結合剤、インヒビターおよび結合剤候補、およびこれらの化合物を含む組成物を傷付いた組織に様々な方法で施すことができる。本明細書で用いる「直接塗布」とは、化合物を創傷部位に直接接触させることを指す。「硝子体内注入」とは、化合物を眼の硝子体液中に注入し、化合物を創傷部位に拡散させるか、または罹患した対照の血管系を通って創傷部位に運送することを指す。「強膜注入」とは、肉芽化インヒビターを眼の強膜中に直接注入することを指す。「全身注入」とは、処置する創傷部位から離れた部位に注入することを指す。全身注入には静脈内、皮下および筋肉内注入が含まれる。「噴霧吸入」とは液状化合物を微小液滴中に分散し、次いで吸入することを指す。噴霧吸入は肺中の創傷部位の処置に特に有用であり、化合物を肺胞中に吸収し、血管系を通って離れた創傷部位に輸送する。「点眼」とは、液状化合物を罹患者の眼の外部表面に施すことを指す。
【００５４】
ＩＩ．始めに
本発明はユーザーが創傷部位内およびその周辺の組織肉芽化インヒビターを同定し、傷組織の治癒に伴う過剰の瘢痕形成を制限し得る方法を提供する。本発明の方法の有効性が図１２に示され、２５μｇまたは１００μｇの肉芽化インヒビターの硝子体内注入で処置された網膜損創傷部位における組織形成が、緩衝液で処置された対照者と比較してほぼ５倍減少したことを示す。本発明の好ましい肉芽化インヒビターは、α５β１インテグリンに対し競合的に結合する、配列番号１〜６でなる群から選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体を有する複数の抗体である。より好ましくは、肉芽化インヒビターは配列番号１〜６でなる群から選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域（図１および２参照）と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域（図１および２参照）とを有する抗体である。
【００５５】
本発明の肉芽化インヒビターを、本明細書に記載の様々な技術で局所的または全身に配送することができる。図１３は５ｍｇ／ｋｇ（図１３Ａ）、１５ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｂ）および５０ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｃ）の最初の静脈内投与後の異なった時点における、肉芽化インヒビターＭ２００（以前は「ＥＯＳ２００−４」と呼ばれる）の血清レベルを示す。簡単に言えば、個体に５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇで静脈注入し、血清を採取し、示された日に書く投与量レベルに対するＭ２００を調べた。
【００５６】
図１３Ｄ〜１３Ｆは、各週の静脈投与で治療投与量レベルを個体中で維持することが可能であることを示している。簡単に言えば、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇを個体に毎週、静脈注射し、血清を採取し、示された日に各投与量レベルに対してＭ２００を試験した。肉芽化インヒビターの治療レベルは、少なくとも１５および５０ｍｇ／ｋｇ投与で維持された。
【００５７】
図１４は肉芽化インヒビターＭ２００の単核細胞α５β１インテグリンへの結合を示し、インヒビターの機能が劣化せず、血清中で活性を保っていることが確認された。簡単に言えば、先に記載した様に個体に指示された量で一回投与した。示された日に採集した全血単核細胞についてＦＡＣＳ測定を行った。図に示す様に、α５β１インテグリンと県連する結合部位のＭ２００占有率は、各日の肉芽化インヒビターの血清レベルと相関する。これらの研究から、約６０μｌの血清肉芽化インヒビターが、血液単核細胞α５β１インテグリン結合部位を完全に飽和するに十分であることを決定することができる。
【００５８】
図１５は図１４の結果を確認する。図１５はＭ２００結合と逆数の関係にある単核細胞α５β１インテグリンを用いる競合ＦＡＣＳ分析であり、Ｍ２００が飽和するこれらのデーターポイントでは完全にブロックされている。
【００５９】
本発明の方法により同定された肉芽化インヒビターの多くが毛管膜および／または基底膜を透過し得るので、全身および直接投与に加えてこれらのインヒビターを局所投与してもよい。
【００６０】
ＩＩＩ．α５β１インテグリン結合部位および肉芽化インヒビター化合物、およびライブラリーの調製
本明細書に開示する様に、α５β１インテグリンに結合するタンパク質、特に抗体、突然変異タンパク質、核酸アプタマー、およびペプチドおよび非ペプチド低分子量有機分子は本発明の結合剤および肉芽化インヒビターとなる。結合剤を天然起源、合成または組み換え調製物、およびその組み合わせから単離し得る。
【００６１】
例えば、ペプチドを“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｓｉｓ”ｂｙ Ｇ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｖｏｌ．２，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｎｅｎｈｏｆｆｅｒ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｐ１００−１１８、（１９８０））に記載の様に固相技術を用いて製造してもよい。同様に、核酸をＢｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．＆Ｉｙｅｒ、Ｒ．Ｐ（１９９２）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８、２２２３−２３１１）、およびＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，、ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−８０５（１９８４）に記載の様に固相技術を用いて合成することができる。
【００６２】
様々なアミノ酸模倣体または非天然アミノ酸による本発明のペプチドの修飾が、ペプチドのインビボ安定性を増加させるのに特に有用である。安定性をいくつかの方法で分析することができる。例えば、ペプチダーゼ、およびヒト血漿および結成等の様々な生物媒体が安定性試験に使用されている。例えばＶｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）参照。本発明のペプチドの半減期は通常、２５％（ｖ／ｖ）ヒト血清分析を用いて測定される。そのプロトコールは一般に以下の通りである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、熱不活性化なし）の脂質を使用前に遠心で除去する。次いで血清をＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性試験に用いられる。所定の時間間隔で少量の反応液を取り出し、６％トリクロロ酢酸水溶液またはエタノール中に添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、沈殿した血清蛋白質をペレットにする。次いで安定性特異性条件を用いてペプチドの存在を逆相ＨＰＬＣで測定する。公知の他のペプチド修飾にはグリコシル化およびアセチル化が含まれる。
【００６３】
核酸の場合は、既存の配列を公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて修飾することができる。例えば、Ａｌｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、ＤＮＡ、２：１８３（１９８３）に記載の様に部位指向突然変異誘発技術を用いて塩基１個の変更を行うことができる。
【００６４】
または、ＰＣＲ技術または適当な宿主中の発現を用いて核酸を増幅することができる（注：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）。ペプチドおよびタンパク質を公知の組み換え技術を用いて、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓ＆Ｃｕｒｔｉｓ、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１：３４７−３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ、１９８３）に記載の様に適当な宿主細胞を組み換えＤＮＡコンストラクトで形質転換して発現してもよい。
【００６５】
本発明のペプチドおよび核酸は市場でも入手し得るか、または所望の分子の構想的および／または機能的性質が与えられれば商業的に生産し得る。
【００６６】
本発明はまた、ペプチドの構造を模倣する有機分子、またはビニローグペプトイドであるペプトイドペプチド模倣体を含む非ペプチド低分子量分子であるα５β１インテグリン結合剤を想定している。α５β１インテグリン結合剤として作用する非ペプチド低分子量分子および肉芽化インヒビターは、例えば一般構造（Ｓ）−２−フェニルスルフォニルアミノ−３−｛｛｛８−（２−ピリジニルアミノメチル）−｝−１−オキサ−２−アザスピロ−｛４，５｝−デク−２−エンイル｝カルボキシアミノ｝プロピオン酸；（Ｓ）−２−｛（２，４，６−トリメチルフェニル）スルフォニル｝アミノ−３−｛７−ベンジルオキシカルボニル−８−（２−ピリジニルアミノエチル）−１−オキサ−２，７−ジアザスピロ−｛４，４｝−ノン−２−エン−３−イル｝カルボニルアミノ｝プロピオン酸（米国特許第５，７６０，０２９号参照）を有する複素環であり得る。本発明の方法に有用な別な非ペプチド低分子量有機分子であるα５β１結合剤を、例えば上記に開示された構造を有する複素環の化学修飾誘導体、または他の非ペプチド低分子量有機分子をスクリーニングすることにより同定することができる（以下を参照）。
【００６７】
本発明の好ましい実施態様には、α５β１抗体、好ましくはキメラ抗体、最も好ましくはヒト化抗体である肉芽化インヒビターが含まれる。この様な抗体の製造法はすぐ下に議論される。
【００６８】
Ａ．抗体肉芽化インヒビター
抗α５β１インテグリン抗体を含む抗インテグリン抗体を製造業者、たとえばＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から購入することができるか、実質的に精製された全長インテグリン等の免疫源を用いて育成することができる。このインテグリンはヒトインテグリン、マウスインテグリンまたは天然起源から調製された、または組み換えで製造された他の哺乳動物インテグリンまたは非哺乳動物インテグリンである。または、このインテグリンはＲＤＧ結合ドメイン部分を含むインテグリンのペプチド部分、例えば合成ペプチドである。ヒトα５β１等のインテグリンの非免疫源ペプチド部分を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の担体分子にハプテンを結合することで、またはペプチド部分を融合タンパク質として発現することで免疫原性にすることができる。様々な他の担体分子、およびハプテンを担体分子に結合する方法は公知であり、例えばＨａｒｋｏｗおよびＬａｎｅ（上記、１９８８）により記載されている。
【００６９】
本発明の方法を実施するために特に有用な抗体は、α５β１インテグリンに特異的に結合するヒト化抗体である。この様な抗体は、それらが他のインテグリン、例えばαＶβ３またはαＶβ５に結合するよりも少なくとも１桁大きい親和性でα５β１インテグリンに結合する場合、特に有用である。ヒト化抗体を含むキメラ抗体の生成法を以下に詳しく説明する。
【００７０】
１．組み換え抗体肉芽化インヒビターの製造
本発明の肉芽化インヒビターとして機能し得る組み換えキメラヒト化抗体を調製するために、非ヒト化抗体をコードする核酸を最初に単離しなければならない。典型的にはこれは動物、例えばマウスを調製されたα５β１インテグリン、またはそれから誘導された抗原性ペプチドで免疫処理することで行われる。典型的には１匹のマウスあたり約５０マイクログラムのタンパク質抗体で２回、マウスを腹腔内免疫処理する。この様なポリペプチドを発現する任意の宿主系に関する免疫組織学または免疫細胞学、および発現ポリペプチドを用いるＥＬＩＳＡにより、免疫処理したマウス由来の血清の抗体活性を試験することができる。免疫組織学では、本発明の活性抗体をビオチン結合抗マウス免疫グロブリン、次いでアビジン−ペルオキシダーゼおよび色素生成ペルオキシダーゼ基質を用いて同定することができる。この様な試薬の調合物は例えばＺｙｍａｐ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から購入することができる。その血清が検出可能な本発明に記載の活性抗体を含むマウスを３日後に殺し、融合およびハイブリドーマ製作のために脾臓を取り出す。当業者に公知の分析、例えばウエスターンブロット分析を用いて、この様なハイブリドーマの要請の上澄み液を同定することができる。
【００７１】
次いで例えばハイブリドーマｍＲＮＡまたは脾臓ｍＲＮＡを重鎖および軽鎖遺伝子のＰＣＲ増幅用の鋳型として用いて、所望の抗体鎖をコードする核酸を単離することができる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７６（１９８９））。抗体および細胞内抗体の双方を製造するための核酸を、この技術を用いてマウスモノクローンハイブリドーマから誘導することができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｊ．Ｈ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：３１３７−３１４１（１９９５）；Ｂｉｏｃｃａ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．，、Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７：４２２−４２７（１９９３）；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ、Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１５４２−１５５１（１９９５））。これらのハイブリドーマは、抗体構築用の特性が良く分かった試薬の信頼できる供給源を提供し、それらのエピトープ反応性および親和性の特性が分かれば特に有用である。単離された細胞から核酸の単離はＣｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ． ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）（脾臓）；Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ、Ｓ． ｅｔ ａｌ．，、上記；Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．，、上記；Ｍａｒｋｓ、Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．，、上記；Ｂａｒｂａｓ、Ｃ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８−７９８２（１９９１）（ヒト末梢血リンパ球）にさらに議論されている。ヒト化抗体には免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部が任意に含まれる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。
【００７２】
キメラおよびヒト化組み換え抗体の双方を製造するためにいくつかの方法が報告されている。タンパク質のジスルフィド結合を通じて結合した抗体ドメインの配列の制御を利用できる（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ ｅｔ ａｌ．，、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ、１４（１）：９５−９９（１９８１））。マウス抗体可変軽鎖および重鎖可変ドメイン、およびヒト抗体軽鎖および重鎖不変ドメインをコードするＤＮＡ配列間の遺伝子融合を構築するために、組み換えＤＮＡ技術を使用することもできる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１（２１）：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００７３】
マウスモノクローン抗体の抗原結合部分または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列を、分子的手段でヒト抗体重鎖および軽鎖の骨格をコードするＤＮＡ配列中へ移植してもよい（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３２１（６０６９）：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２（６１６２）：３２３−３２７（１９８８））。発現した組み換え生成物は「再形成」またはヒト化抗体と呼ばれ、ヒト抗体軽鎖および重鎖、およびマウスモノクローン抗体の抗原認識部分ＣＤＲを有する。
【００７４】
ヒト化抗体を製造する他の方法は米国特許第５，６９３，７６２号、５，６９３，７６１号、５，５８５，０８９号、５，６３９，６４１号、５，５６５，３３２号、５，７３３．７４３号、５，７５０，０７８号、５，５０２，１６７号、５，７０５，１５４号、５，７７０，４０３号、５，６９８，４１７号、５，６９３，４９３号、５，５５８，８６４号、４，９３５，４９６号、４，８１６，５６７号および５，５３０，１０１号に記載され、本明細書に引用して援用する。
【００７５】
１本鎖抗体を製造するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、α５β１インテグリンに対する１本鎖ヒト化抗体を製造するために用いることができる。
【００７６】
２．抗体肉芽化インヒビターの単離
親和性精製
血清の抗体プールのアフィニティー精製は、当業者により均一な試薬を提供する。アフィニティーカラムを作成するための抗体アフィニティーマトリックスを用いる抗体肉芽化インヒビターの濃縮法は公知であり、市販されている（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ、ｃ／ｏＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ、Ａｒｔｉｌｌｅｒｉｖｅｊ５、Ｂｌｄｇ．Ｐ２、ＤＫ−２３００、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｓ）。簡単に言えば、抗体アフィニティーマトリックスがアフィニティー支持体に付着している（例えばＣＮＢＲ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ参照）。抗体を含む混合物をアフィニティーマトリックス上に流し、抗体を付着させる。結合した抗体を当業者に公知の技術で遊離し、濃縮抗体プールを得る。次いで濃縮抗体プールをその後の免疫研究に使用するが、そのいくつかは例として本明細書に記載されている。本発明の抗体を単離するために用いられる抗体アフィニティーマトリックスは本発明の抗α５β１抗体を特異的に任意記する様に設計されていないが、本質的にモノクローンであるシステム中で抗体が組み換えタンパク質として発現しているので、このことが抗体の精製におけるアフィニティーマトリックスの有用性を制限しない。
【００７７】
ｐＨ感受性抗体精製
中性または塩基性ｐＨでアフィニティー精製した場合、本発明の抗体結合試薬のいくつかは沈殿する傾向を示す。この問題を解決するため、図１に示す抗体を含むｐＨ感受性抗体、およびマウス可変領域を含むか、マウス可変領域と８０％以上の並列同一性を有するキメラ抗体、または図１に含まれる抗体のＣＤＲ領域と８０％以上の配列同一性を有するキメラ抗体の精製法を考案した。このプロセスには抗体結合アフィニティーマトリックスを含むクロマトグラフィーカラム、例えばイオン交換カラムを用いる抗体に対するアフィニティークロマトグラフィーを行い、次いで約３．０〜５．５好ましくは約３．３〜５．５、最も好ましくは約３．５〜４．２または約４．２〜５．５のｐＨで抗体を溶出する工程が含まれる。この範囲内のより低いｐＨが小スケール精製により適しているが、約４．２以上のｐＨが大スケール精製により適していると考えられる。この範囲内の精製プロセス操作により、ほとんど凝集しないまたは凝集しない、最も好ましくは本質的に凝集しない製品が製造される。
【００７８】
アフィニティークロマトグラフィーは、抗体または他の生物活性高分子等の物質を単離または精製するための公知の手段である。一般にこれはカラム上に固定化された抗体に特異的に結合する少なくとも１種のリガンドを含むクロマトグラフィーカラムに、抗体を含む溶液を通して行われる。この様な基はリガンド−アフィニティー反応により抗体を溶液から抽出することができる。一度これが行われると、抗体を絡むから溶出して回収し得る。
【００７９】
精製プロセスには基質に結合した抗体アフィニティーマトリックスへの抗体の吸収が含まれる。様々な形の抗体アフィニティーマトリックスを使用し得る。唯一の要請は、抗体アフィニティーマトリックス分子が精製すべき抗体に結合する能力を有することである。例えば、天然起源から単離された抗体アフィニティーマトリックス、組み換えＤＮＡ技術で製造された抗体アフィニティーマトリックス、抗体アフィニティーマトリックスの修飾型、または問題の抗体への結合能を維持するこれらの材料のフラグメントを使用し得る。抗体アフィニティーマトリックスとして使用するための材料の例にはポリペプチド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、核酸アプタマー、糖タンパク質、リポタンパク質、複数のタンパク質の複合体、生体膜、ウイルス、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチンおよびＦｃ受容体が含まれる。
【００８０】
抗体アフィニティーマトリックスを一般的な相互作用（例えば非特異的イオン交換結合または疎水性／親水性相互作用により）、または特異的相互作用（例えば抗原−抗体相互作用）、またはリガンドと固相間の共有結合、または当業者に公知の任意の方法で固相または支持体に付着させる。または、中間化合物またはスペーサーを固相に付着させ、アフィニティーマトリックスをスペーサーに付着して抗体アフィニティーマトリックスを固相上に固定化することができる。スペーサー自体が遊離抗体アフィニティーマトリックスに対し特異的結合アフィニティーを有するリガンド（すなわち第２リガンド）であることも可能である。
【００８１】
例えば緩衝液を用いて抗体をカラムから溶離する通常の手順を用いて、抗体を基質結合抗体アフィニティーマトリックスから溶離してもよい。沈殿を最少にするため、ｐＨ感受性抗α５β１インテグリン抗体をｐＨ３．５で０．１Ｍグリシンを含む緩衝液で溶離することが好ましい。分解および／または変性を最少にするため、緩衝液の温度を１０℃以下に保つことが好ましく、４℃以下がより好ましい。同じ理由で、抗体が酸性ｐＨに晒される期間も最少にしなければならない。これは例えば所定量の塩基性溶液を溶出した抗体溶液に添加することで行われる。この塩基性溶液が緩衝液であることが好ましく、揮発性塩基性緩衝液であることがより好ましく、アンモニウム溶液が最も好ましい。
【００８２】
基質結合抗体アフィニティーマトリックスから抗体の溶出を、公知の方法でモニターし得る。例えば、カラム手順を用いる場合、分画をカラムから集め、タンパク質の存在を分画の吸光度を測定して決定できる。既知の特異性を精製する場合、カラムから集められた分画中の抗体の存在を例えば放射線免疫分析（ＲＩＡ）または酵素免疫分析（ＥＩＡ）等の免疫分析技術で測定し得る。
【００８３】
本発明のプロセスを、精製される抗体を実質的に劣化しない、または基質に結合した抗体アフィニティーマトリックスに悪影響を及ぼさない任意の便利な温度で行い得る。使用する温度が室温であることが好ましい。
【００８４】
必要あれば公知の様々な方法を用いて、抗体アフィニティーマトリックスカラムから溶出した抗体を回収し得る。
【００８５】
Ｂ．低分子量肉芽化インヒビター
コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学合成または生合成により、試薬等の多数の化学「建築ブロック」を組み合わせた種々の化合物の集積である。例えば、ポリペプチドライブラリー等の線形コンビナトリアル化学ライブラリーは、ある長さ（すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸数）に対しできる限り可能な方法で化学建築ブロック（アミノ酸）のセットを組み合わせて作成される。化学建築ブロックのこの様なコンビナトリアル混合物により、何百万の化合物を合成することができる。
【００８６】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製とスクリーニングは当業者に公知である。この様なコンビナトリアル化学ライブラリーにはペプチドライブラリー（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ ｅｔ ａｌ．，、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）、およびＨｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４−８８（１９９１）参照）が含まれるが、それに限定されない。化学多様性ライブラリーを作成するための他の化合物も使用できる。この様な化合物にはペプチド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド等のダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニローグポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Ｈｉｒｓｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子量化合物ライブラリーの類縁有機合成（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスフォネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、全て上記参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５，５３９，０８３参照）、抗体ライブラリー（例えばＶａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（例えばＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｅｎｃｅ，２７４；１５２０−１５２２（１９９６）ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ５，５９３，８５３参照），低分子量有機分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ １８、ｐ３３（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリドンおよびメタチアゾリドン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルフォリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照）が含まれるが、それに限定されない。
【００８７】
他のアプローチでは大きなライブラリーを作成するために組み換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｓｃｉｅｎｃｅ、４９：４０４−４０６（１９９０））を使用し、非常に大きいライブラリーを構築できる（１０６〜１０８化学種）。第２のアプローチは主として科学的方法を使用するが、その例はＧｅｙｓｅｎ法（Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２３：７０９−７１５（１９８６）；Ｇｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ．Ｍｅｔｈｏｄ、１０２：２５９−２７４（１９８７））およびＦｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７３（１９９１））である。Ｆｕｒｋａ ｅｔ ａｌ．，（１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ＃５、ＡｂｓｔｒａｃｔＦＲ：０１３（１９８８）；Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１））、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（米国特許第４，６３１，２１１号、１９８６年１２月出願）およびＲｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（米国特許第５，０１０，１７５号、１９９１年４月出願）は、作動剤または拮抗剤として試験し得るペプチド混合物の製造法を記載している。
【００８８】
コンビナトリアルライブラリー調製用の装置は市販されている（例えば３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、９０５０Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ参照）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー事態が市販されている（例えばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等）。
【００８９】
肉芽化インヒビターとして使用するに適した低分子量ペプチドはＨｏｒｔｏｎ、Ｍ．“Ａｒｇ−ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．”、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９９、Ｍａｒ−Ａｐｒ；７（２）１７８−８４；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、Ｒ．、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ、Ｅ．、Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ、Ｅ．“Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｓ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｍｉｃ ｏｆ ａｎ ＲＧＤ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．”、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５年９月、１３０（５）：１１８９−９６；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ、Ｅ．、Ｗａｎｇ、Ｂ．、Ｒｕｏｓｌｈａｔｉ、Ｅ．“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ５ ｂｅｔａ １ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｆｒｏｍ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．”、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４年Ｆｅｂ；１２４（３）：３７３−８０；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，、米国特許第６，１７７，５４２号および関連特許に議論されている。
【００９０】
低分子量二重鎖ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡも本発明で検討されている。本発明のｓｉＲＮＡはα５β１インテグリンサブユニットの１つの配列と同一の配列を有する。α５β１を発現する細胞に適用した場合、そのサブユニットをコードする対応するｍＲＮＡ転写産物を分解させることにより、これらのｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡ配列を有するα５β１インテグリンサブユニットの翻訳を阻害する。
【００９１】
Ｃ．肉芽化インヒビターを単離するための一般法
肉芽化インヒビターの単離法は公知である。一般に核酸またはタンパク質の単離に適した任意の精製プロトコールを用いることができる。例えば、抗体肉芽化インヒビター単離の関係で上記の様なアフィニティー精製を、任意のα５β１インテグリン結合肉芽化インヒビターを単離するために、より一般的な意味で使用することができる。公知の様に、核酸肉芽化インヒビターをアガロースゲル電気泳動を用いて精製することもできる。カラムクロマトグラフィー技術、沈殿プロトコールおよびタンパク質および／または核酸を分離するための他の方法も使用できる（例えばＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，、上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，、上記；およびＬｅｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６５：１０３７３−１０３８２（１９９０）参照）。
【００９２】
ＩＶ．肉芽化インヒビター同定法
本発明は診断および治療肉芽化インヒビターの同定法を提供する。肉芽化インヒビター同定法の例には、制御された条件下で創傷部位に肉芽化または瘢痕組織の形成に対する効果の評価が含まれる。まず類似の創傷部位を２つの異なった対象の同じ生きた組織に形成する。創傷部位を、外科穿刺、切断、火傷、例えばレーザーによる火傷、または化学的刺激等の任意の適した方法を用いて形成することができる。スクリーニング分析に適した組織には眼、皮膚、骨、軟骨、血管、靭帯および腱が含まれる。
【００９３】
一度創傷部位が形成すると、ある創傷部位（試験創傷部位）が一定投与量の肉芽化インヒビター候補で処置される。第２創傷部位（対象部位）は対照溶液、好ましくは非刺激性緩衝液または他の担体で処置される。
【００９４】
肉芽化インヒビター候補が担体中で配送される場合、対照溶液は理想的には肉芽化インヒビター候補がない担体である。現在知られている肉芽化インヒビターの多くは毛細間膜を横断できるので、試験および対照創傷部位は異なった個体または離れた組織試料である必要がある。対照および試験創傷部位が同じ個体の左と右の眼にそれぞれ置かれている場合、試験部位に施された肉芽化インヒビターは個体の血管系を通って対照部位に達することができ、正しくない結果が得られる。好ましくは所定の投与計画に従い、肉芽化インヒビターが試験創傷部位に複数回投与される。投与計画は１日でもよいが、より好ましくは数週間である。
【００９５】
投与計画が終了すると、試験および対照創傷部位を調べて、存在する肉芽化または廃痕のレベルを測定する。これは例えば染色および顕微鏡検査に適した組織切片を作成する（肉芽化）か、または単純に顕微鏡で検査する（廃痕）ことで行われる。顕微鏡検査および組織切片作成法は公知である。肉芽化インヒビターとして使用するに適した肉芽化インヒビター候補は、対照部位と比較して試験部位から採取した組織切片中の有意に減少した肉芽化に注目して同定される。理想的には創傷部位における肉芽化または廃痕形成は、対照創傷部位中に存在するものより少なくとも７５％、より好ましくは５０％、最も好ましくは３０％以下の肉芽化である。必要な場合、各創傷部位に存在する肉芽化組織の面積を測定して肉芽化または廃痕形成のレベルを計算することができる。各創傷部位における２次元像を作成し、映像内に保たれる面積を計算する。この様な計算をデジタルコンピューターの助けを借りて行うことが好ましく、顕微鏡と連動したデジタルコンピューターが理想的である。廃痕で覆われた表面積を測定して廃痕組織を定量してもよい。
【００９６】
実施態様例では、２頭の霊長類の眼の角膜斑に対するレーザー処置で創傷部位を誘発する。例えば網膜または角膜組織との他の眼の組織を任意に用いてもよい。隣接する解剖学的特徴に対し、各眼の創傷部位は理想的には類似の場所に置く必要がある。各創傷部位のサイズは類似している必要があり、好ましくは約２５μｍ、より好ましくは約５０μｍであり、約１００μｍが有利であり、約２００μｍがより有利である。レーザーの設定は理想的には肉芽化を誘発する創傷部位を作成するに十分なだけの量である必要があり、好ましくは約２００ミリワット、より好ましくは約３００ミリワットであり、約４５０ミリワットが有利であり、約５００ミリワットが寄り有利であり、理想的には約３００ミリワット〜約７００ミリワットの間である。この様な創傷部位を誘発するための装置は市販され、例えばＩＲＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ（商標）ポータブルスリットランプアダプターを備えたＯｃｕＬｉｇｈｔ ＧＬ（５３２ｎｍ）レーザーホトコアギュレーターである。
【００９７】
次いで肉芽化インヒビター候補、例えば配列番号１〜６でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２でなる群より選ばれたアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを有する抗体候補の硝子体内注入を各眼で行う。
【００９８】
レーザー処置直後に最初の注入が行われる。強膜および平面部を通って、角膜縁の後方約４ｍｍの位置に注射器の針を通す。針を水晶体の後方で硝子体中位に向け、硝子体中にゆっくりと注入する。週毎に４週間、同じ量を投与する必要がある。適当な投与量は、試験される特定の肉芽化インヒビター候補の性質に依存すると思われる。例えば、硝子体の容積を２ｍｌとすると、眼あたりＦａｂフラグメントを約２５μｇ、好ましくは約５０μｇ、より好ましくは約１００μｇ、最も好ましくは約２００μｇの投与量で与える必要がある。他のインヒビター候補の投与量を決定するベースラインとして、これは１μＭの肉芽化インヒビターに相当する。このベースライン値を用い、当業者は他の肉芽化インヒビター候補に対する投与量レベルを決定することができる。
【００９９】
投与する場合、静脈注射、皮下注射または筋肉注射のいずれかで全身注入し得ることに注意する必要がある。肉芽化インヒビターまたは肉芽化インヒビター候補の全身注入では、投与量は約５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１５ｍｇ／ｋｇであり、約５０ｍｇ／ｋｇが有利であり、約１００ｍｇ／ｋｇがより有利であり、約２００ｍｇ／ｋｇが許容し得る。噴霧吸入、点眼または経口投与で行われる投与量は、全身注入を用いて達成される量に類似の肉芽化インヒビターまたは肉芽化インヒビター候補の血液レベルを生成するに十分な量である必要がある。これらのレベルを達成するために噴霧吸入、点眼、または経口摂取で配送される肉芽化インヒビターまたは肉芽化インヒビター候補の量は、通常の試験で決定できる。抗体肉芽化インヒビターＭ２００の全身注入では、インヒビターの治療レベルが１５ｍｇ／ｋｇ配送の１週間後に血液中で検出される（図１３Ｂ）。図１３Ｅおよび１３Ｆは、１週間間隔で１５および５０ｍｇ／ｋｇのＭ２００による繰り返し投与がＭ２００の血漿濃度を治療レベルに保つに十分であることを示している。この発見は図１４および１５で確認され、これらの図は全ての試験日で血漿マクロファージのα５β１インテグリン受容体のＭ２００による飽和（図１４）と、α５β１インテグリン抗体ＩＩＡ１のブロック結合（図１５）を示している。
【０１００】
肉芽化レベルの評価は、試験眼から採取した固定組織切片を染色して決定する。簡単に言えば、フォルマリン固定眼を瞳、視神経および角膜斑が同じ平面にあり、パラフィン中に埋没される様に水平に切り出す。全試料にわたって連続切片を作成し、一定間隔の薄片をヘムトキソリンおよびエオシンで通常通り染色する。傷を光学顕微鏡で同定し、測定し、傷、および視神経の位置を示す地図を作成する。組織学的に最も重症度の大きい傷害を示すスライド（幹部の中心領域と考えられる）上で、肉芽化組織領域をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ製のＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウエアを用いて測定する。
【０１０１】
上記の実施態様を用いてサルの眼を処置して得られた結果と、より詳しくは実施例４の結果は、対象と比較して眼への投与量あたり２５μｇおよび１００μｇの肉芽化インヒビターＦ２００（ＥＯＳ２００−Ｆとも呼ばれる）で処置した創傷部位で形成された廃痕の量が劇的に減少した（図１２Ａ参照）。
【０１０２】
本発明はまた、上記の定性的スクリーニング分析に基づく肉芽化インヒビターの定量分析を提供する。この肉芽化インヒビター評価法には最初に眼組織中に傷を形成し、上記の様に肉芽化インヒビターを眼組織に少なくとも１回投与する工程が含まれる。上記の技術を用いて、創傷部位における肉芽化または廃痕形成のレベルを定期的に、または処置の最後にモニターする。
【０１０３】
高処理能力技術
上記方法を任意のタイプの肉芽化インヒビターを同定するために使用できるが、それらは通常、既知の肉芽化インヒビターとのある関係により肉芽化インヒビターであると推定される肉芽化インヒビター候補（既知の肉芽化インヒビターと同じ化学ファミリーに属するか、またはそれとある構造または機能的特徴を共有する）のスクリーニングに最も適している。さらに、以下に議論する様に、新規肉芽化インヒビターをコンピューター、または分子モデリングとして知られるプロセスを用いて同定し得る。
【０１０４】
コンピューターモデリング
コンピューターモデリングにより、選ばれた分子の３次元原子構造の可視化と、その分子と相互作用すると思われる新しい化合物の合理的な設計が可能になる。３次元コンストラクトは典型的には選ばれた分子のＸ−線結晶解析またはＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学には力場のデータが必要である。コンピューターグラフィックにより、新規化合物がどの様に標的化合物と結合するかの予測を可能にし、その化合物と標的化合物を完全な結合特異性へ実験的に操作することができる。いずれか一つ、または双方に小さな変化が生じた場合、分子−化合物相互作用がどうなるかの予測には、通常はユーザーに優しく、分子設計プログラムとユーザーの間のメニュー駆動インターフェースと組み合わせた分子動力学ソフトウエアと強力な計算能力を有するコンピューターが必要である。
【０１０５】
上記に一般的に記載された分子モデリングシステムの一例は、Ｐｏｌｙｇｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．製のＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラムで構成される。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化と分子動力学機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは構築、グラフィックモデリングおよび分子構造の解析を行う。ＱＵＡＮＴＡにより相互作用構築、修飾、可視化および分子相互の挙動の解析が行われる。
【０１０６】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７、１５９−１６６（１９８８）；Ｒｉｐｋａ、Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、５４−５７（Ｊｕｎ．１６，１９８８）；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９、１１１−１２２（１９８９）；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＯＳＡＲ：“Ｏｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ１８９−１９３（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ、２３６：１２５−１４０および１４１−１６２（１９８９）等の数多くの文献にタンパク質と特異的に相互作用する薬品のコンピューターモデリングがレビューされ、核酸成分に対するモデル受容体に関してＡｓｋｅｗ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０８２−１０９０（１９８９）にレビューされている。Ａｓｋｅｗらは、水素結合と原子積層力の双方が同時に作用する新しい分子の形を構築した。ＡｓｋｅｗらはＵ−型（２軸）関係が任意の２個のカルボキシル基間に存在するＫｅｍｐの三塩基酸（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５１４０−５１４３（１９８１））を使用した。三塩基酸のイミド酸塩化物への変換により、アミドまたはエステル結合により実用的に使用し得る任意の芳香族表面に付加し得るアシル化剤が得られた。得られた構造は、イミド基中の原子面にほぼ平行である芳香族平面が特徴であり、水素結合と積層力が垂直方向から集中し、アデニン誘導体に相補的であるミクロ環境を提供する。
【０１０７】
力の場のデータの作成とＸ線結晶学情報がコンピューター技術より遅れているので、核酸と相互作用すると思われる化合物の設計におけるコンピューターモデリングの使用には限界があることが分かった。Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：９７２７（１９８９）に報告される様に、４種のＲＮＡの一部の３次元構造の可視化にＣＨＡＲＭｍが使用されている。核酸とのモデリング相互作用の方法については米国特許第６，４４６，０３２号およびその中の参考文献参照。
【０１０８】
化合物をスクリーニングしグラフ表示する他のコンピュータープログラムはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．、Ａｌｌｅｌｉｘ、Ｔｈｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔｒｉｏ、ＣａｎａｄａおよびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏから入手できる。これらは主として特定のタンパク質に特異的である薬品への応用のために設計されているが、ＲＮＡ領域が同定されればその領域に特異的である薬品の設計にも用いることができる。
【０１０９】
スクリーニング化合物ライブラリー
既存の肉芽化インヒビターまたは分子モデリング技術のいづれから同定されても、その治療上の有用性を増進するためには一般的には肉芽化インヒビターをさらに修飾しなければならない。典型的にはこれは肉芽化インヒビターに関連する化合物、またはコア構造の周りに基づいて無秩序に合成された化合物のライブラリーを作成して行われる。肉芽化インヒビター候補の大きな、および／または広範囲のライブラリーを効率的にスクリーニングするためには、上記の分析を用いてスクリーニングされる候補化合物の数を少なくとも減少するために、高処理能力スクリーニング法が必要である。高処理能力スクリーニング法には、多数の潜在的治療用化合物（潜在的モジュレーターまたはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化合物またはペプチドライブラリーを準備する工程が含まれる。この様な「コンビナトリアル化合物ライブラリー」または「候補ライブラリー」を以下に述べる様に少なくとも１回の分析でスクリーニングし、肉芽化を阻害し瘢痕形成を制限し得るライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。この様にして同定された化合物は通常の「リード化合物」となり得るか、またはそれ自体を潜在的または実際の治療薬として使用し得る。
【０１１０】
ライブラリーの候補化合物は任意の低分子量化合物であるか、上記のタンパク質、糖、核酸または脂質等の生物要素であり得る。典型的には、試験化合物は低分子量化合物分子およびペプチドである。以下に議論する分析は、分析工程を自動化し、化合物を任意の便利な起源から、典型的には平行して（例えば図１５に示すロボット分析におけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマットで）実行される分析に提供して、大きな化学ライブラリーをスクリーニングする様に設計されている。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔｉｃａ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等、化合物の供給者は多数あることは理解されると思われる。
【０１１１】
従って、本発明は肉芽化インヒビター候補の高処理能力スクリーニング法を提供する。これらの方法の最初の工程で、肉芽化インヒビターである高い確率を有するコンビナトリアルライブラリーメンバーの効率的で迅速な同定が行われる。これらの初期工程は、肉芽化インヒビターがα５β１インテグリン結合剤であるという観察を利用する。α５β１インテグリンに特異的に結合する、結合候補と呼ばれるライブラリ０メンバーの能力を決定する任意の方法が、この初期高処理能力スクリーニングに適している。例えば、競合的および非競合的ＥＬＩＳＡ型分析を使用できる。
【０１１２】
競合的ＥＬＩＳＡ分析には固相に結合したα５β１インテグリンが含まれる。結合剤にα５β１インテグリンを結合させるに十分な時間後、基質を洗浄し、次いでフィブロネクチン等の既知のα５β１インテグリンリガンドを競合させる。利用可能なα５β１インテグリン結合部位の数は、フィブロネクチンが固定化α５β１インテグリンを結合する能力に正比例していると思われる。利用できるα５β１インテグリン結合部位がほとんどない場合、それは結合部位が結合候補で占有されているためである。フィブロネクチンのα５β１インテグリンへの結合を妨害し得る結合候補は、肉芽化インヒビター候補であると思われる。Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載される様に、フィブロネクチンを標識することにより結合したフィブロネクチンを測定し得る。
【０１１３】
非競合的分析は競合的分析で説明した同じ手順に従うが、既知のα５β１インテグリンリガンドを添加しない。結合候補の固定化α５β１インテグリンへの結合を、未結合候補を洗い流し、結合した結合候補を支持体から溶出し、溶出物を例えばマススペクトロスコピー、タンパク質検出（ＢｒａｄｆｏｒｄまたはＬｏｗｒｙ分析、または２８０ｎｍ吸光度測定）等で分析して測定することができる。または、支持体表面の有機層の分光学的性質の変化をモニターして結合を同定し得る。表面の分光学的性質のモニター法には吸光度、反射率、二色性、屈折率、回折、表面プラズモン共鳴、楕円偏光法、共鳴ミラー技術、格子連動導波管技術および多極性共鳴分光学等が含まれ、その全ては当業者に公知であるが、それらに限られない。
【０１１４】
例えばα５β１に対するＫａが少なくとも１０５ｍｏｌ−１、１０６ｍｏｌ−１以上、好ましくは１０７ｍｏｌ−１以上、より好ましくは１０８ｍｏｌ−１以上、最も好ましくは１０９ｍｏｌ−１以上の許容し得る特異性でα５β１インテグリンに結合することが見出された結合候補は肉芽化インヒビター候補であり、細胞性肉芽化を阻害する能力、および廃痕組織形成を制限する能力を決定するため、上記の様にさらにスクリーニングされる。
【０１１５】
いくつかの公知のロボットシステムが液相化学分析のために開発されている。これらのシステムにはＴａｋｅｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｄ ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で開発された自動合成装置等の自動化ワークステーション、およびロボットアームを利用する多くのロボットシステム（ＺｙｍａｔｅＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、Ｍａｓｓ；Ｏｒｃａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれ、これらは化学者が行う手動合成操作を模倣している。上記装置のいずれも本発明での使用に適している。本明細書で議論した様に操作しえる様な、これらの装置の改造の性質と実行（必要あれば）は当業者に公知であると考えられる。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．；Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕ．；Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．；ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ．、ＲＵ；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ．；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ．等）。
【０１１６】
Ｖ．治療への使用
本発明の方法を用いて処置される個体は、顕著な細胞性肉芽化の結果としての副次的な組織損傷および／または過剰廃痕形成になり易い傷を有する任意の個体である。この様な個体は例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシまたはヤギ等の哺乳動物、トリ、または任意の他の動物、特に商業的に重要な動物または家畜である。
【０１１７】
最後に、本発明は肉芽化インヒビターであるα５β１インテグリン結合剤を個体に投与することによる、個体中の肉芽化を減少または阻害する方法を提供する。肉芽化を減少することにより、本発明の方法は創傷部位に形成する廃痕組織の量を制限し、膨潤および過剰マクロファージ挙動で生じた副次的組織損傷を減少する。
【０１１８】
本発明の方法は、組織肉芽化をもたらし得る傷害または疾患に罹り易い任意の組織に使用するに適している。この様な組織には眼、皮膚、骨、軟骨、血管、靭帯および腱が含まれるが、それらに限定されない。本発明で処置し得る疾患にはリューマチ性関節炎、側頭動脈炎、リューマチ性多発性筋肉痛、巨大細胞動脈炎、Ｔａｋａｙａｓｕ動脈炎、Ｋａｗａｓａｋｉ病、Ｗｒｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉腫症および血管炎、特発性肺線維症、全身性硬化症／皮膚強化症、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群／病、乾燥症候群、アレルギー性肺線維症、類肉腫症、子宮前線維組織、血管腫、リンパ管腫、ケロイド廃痕形成、Ｇｏｏｄｐａｓｔｅｕｒ病、Ｇｒｏｈｎｓ病、Ｐａｇｅｔｓ症候群、プテリギア、正中肉芽腫、デスモイド、黄紋変性、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、アレルギー性肺線維症および好酸性肉芽腫が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１９】
本明細書に記載の方法のある実施態様は、眼の傷害および疾患の治療特に適している。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が、肉芽化を誘発するに十分な眼の傷害に反応してマクロファージ挙動と呼ばれるマクロファージ様特性を取る能力を有することが観察されている。ＲＰＥ細胞のこのマクロファージ挙動は、創傷部位を取り囲む細胞の損傷を引き起こし、過剰の廃痕組織が形成されると共に、失明になり得る組織損傷を引き起こす。本発明の方法で同定される肉芽化インヒビターを用いて、ＲＰＥ細胞を繊維芽細胞様挙動を取る様に導くことができる。付随するマクロファージ挙動の減少は廃痕形成、肉芽化およびその結果の組織損傷の大部分を低減する。その結果、治癒組織は肉芽化インヒビターがない場合に治癒される組織よりはるかに機能性である（図１２）。
【０１２０】
従って、本発明は罹患眼の創傷部位をα５β１インテグリン結合剤、好ましくは肉芽化インヒビターと接触させる工程を有するＲＰＥ細胞の制御法であって、罹患した眼のＲＰＥ細胞がマクロファージ挙動を表すことを阻害する方法も提供する。
【０１２１】
治療用途では、肉芽化インヒビターは一般にインヒビターと薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の形である。薬学的に許容し得る担体は公知であり、生理緩衝食塩水または他の緩衝液等の溶液、または溶剤、またはグリコール、グリセロール、オリーブオイル等のオイル、または注射可能有機エステル等のビヒクルが含まれる。薬学的に許容し得る担体の選択は、部分的には例えばインヒビターが抗体であるか、ペプチドまたは非ペプチドであるか、低分子量有機分子であるか等のインヒビターの化学的性質に依存する。
【０１２２】
薬学的に許容し得る担体には、例えば肉芽化インヒビターを安定化するかその吸収を増加する生理学的に許容し得る化合物、または必要あれば他の賦形剤が含まれてもよい。生理学的に許容し得る化合物の例にはグルコース、スクロースまたはデキストリン等の炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオン等の抗酸化剤、キーレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤または賦形剤が含まれる。当業者は生理学的に許容し得る化合物を含む薬学的に許容し得る担体の選択は、例えば肉芽化インヒビターの投与経路、またはその特定の物理化学的特性に依存することを知っていると思われる。
【０１２３】
本発明の方法には他の薬剤、例えば抗生物質、殺かび剤および抗炎症剤を含むカクテル中に肉芽化インヒビターを適用することが含まれる。または、本方法は罹患した個体に肉芽化インヒビターと少なくとも１種の別な薬剤を順次投与し、治療法を最適化することも含まれる。この様な最適化された治療法では、肉芽化インヒビターを含む薬剤を任意の順番および任意の組み合わせで投与し得る。
【０１２４】
傷害または疾患で生じる細胞性肉芽化は、例えば糖尿病網膜症を患う個体の網膜中等の局所に生じるか、または例えばリューマチ性関節炎を患う個体で全身的に生じる。処置される組織および疾患または傷害の性質によって、当業者は肉芽化インヒビターの投与法および投与経路を選択すると考えられる。例えば、糖尿病性網膜塩を患う個体では、インヒビターを点眼剤として使用するに便利な医薬組成物に調合し、それを眼に直接投与する。対照的に、骨関節炎を患う患者では、インヒビターを静脈内、経口または薬剤を全身に配送する他の方法で投与可能な医薬組成物中で配送してもよい。従って、肉芽化インヒビターを様々な経路、例えば静脈内、経口、または処置すべき領域中に直接、例えば病状が関節を含む場合は滑液内に投与することができる。一回投与後に治療を継続させるため、本発明の肉芽化インヒビターは徐放製剤中に含まれてもよい。ある実施態様では、製剤はミクロ球体の形で調製される。ミクロ球体を、治療に必要ならば任意の別な薬剤と共に、生分解性放出制御材料による肉芽化インヒビターの均一マトリックスとして調製してもよい。ミクロ球体は浸透および／または注入に適したサイズで調整されることが好ましく、創傷部位へ全身的に、または直接注入される。
【０１２５】
製剤の直接塗布を受け入れ易い解剖学的位置の例には目の硝子体液が含まれ、関節内投与には膝、肘、腰、胸骨鎖骨、顎関節、手首、足根、腕、踝、および関節炎症状を起こす他の関節が含まれる。本発明で有用な製剤を投与できる滑液嚢の例には肩峰、二頭筋橈骨、肘橈骨、三角筋、膝蓋下、坐骨、および当業者に有害な肉芽化を形成することが知られている他の滑液嚢が含まれる。
【０１２６】
本発明の製剤は胸膜、腹膜、頭蓋骨、縦隔、心膜、滑液嚢または包、硬膜外、硬腔内、眼球内等を含むがそれに限定されない全身空間／空洞に投与するのに適している。
【０１２７】
徐放実施態様のいくつかには生分解性および／または徐々に溶解する高分子物質が含まれる。この様な高分子物質にはポリビニルピロリドン、低および中分子量ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチル澱粉、メタクリル酸カリウム−ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、澱粉、澱粉誘導体、微結晶性セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、およびセルロース誘導体、β−シクロデキストリン、ポリ（メチルビニルエーテル／マレイン酸無水物）、グルカン、シエロズルカン、マンナン、ザンタス、アルギン酸およびその誘導体、デキストリン誘導体、グリセリルモノステアリン酸、半合成グリセリド、グリセリルパルミトステアリン酸、グリセリルベヘン酸、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、タルク、安息香酸ナトリウム、硼酸、およびコロイドシリカが含まれる。
【０１２８】
本発明の徐放剤には澱粉等のアジュバント、プレゲル澱粉、マンニトール燐酸カルシウム、ラクトース、蔗糖、グルコース、ソルビトール、微結晶性セルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、澱粉溶液、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガカントガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、コロイドシリカ、ぐるセリルモノステアリン酸、水素化ヒマシ油、ワックス、およびモノ−、ビ−およびトリ置換グリセリドも含まれる。
【０１２９】
徐放剤はＷＯ９４／０６４１６に一般的に記載される様に調製されてもよい。
【０１３０】
間質性腫瘍では、α５β１インテグリン結合剤は抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体である。ＩｇＧ１はα５β１拮抗作用に加えて、例えば補体固定、ＡＤＣＣおよびＴ細胞動員等の別な有用な機構を動員し、これらの腫瘍の治療に有益であると思われる。
【０１３１】
個体に投与される肉芽化インヒビターの量は、部分的には疾患と組織損傷の程度に依存する。診断または治療過程で投与される有効量の決定法は公知であり、フェーズＩ、フェーズＩＩおよびフェーズＩＩＩ臨床試験が含まれる。一般に全身投与の場合は拮抗薬を約０．０１〜２００ｍｇ／体重ｋｇで投与し、創傷部位に直接投与する場合は約１μＭの濃度で投与する。肉芽化インヒビターの全量をボーラスまたは吸入のいずれかで、比較的短期間で対象に１回の投与で与えることができる。または、分割処置プロトコールを用いて投与できるが、その場合は複数の投与回数でより長期間にわたって投与する。当業者は組織傷害の領域（単数または複数）へ有効量を提供するに必要な特定の肉芽化インヒビターの濃度は、対象の年齢と一般的な健康状態の他、投与経路、投与される処置部位の数、およびインヒビターが抗体、ペプチドまたは非ペプチド低分子量分子のいづれであるかを含むインヒビターの性質を含む多くの因子に依存することを等業者は知っていると考えられる。これらの因子の観点から、治療の目的で肉芽化および廃痕形成を効率よく阻害するための有効量を得る様に、当業者は特定の投与量を調節すると考えられる。
【０１３２】
本発明の方法で同定された肉芽化インヒビター、またはインヒビターを含むその組成物を、少なくとも部分的に過剰肉芽化および廃痕形成が特徴である任意の病状を治療するために使用することができる。当業者はインヒビターを例えば経口または非経口を含む様々な経路で投与できることを知っていると考えられ、非経口経路には静脈内、筋肉内、眼球内、関節包内、滑液内、腹腔内、大槽内、または例えば皮膚パッチまたは経皮イオン浸透を用いる受動または促進吸収が含まれる。さらに、インヒビターを座薬または局所剤を経由して注射、注入できるが、後者は例えばインヒビターを含む軟膏または粉末の直接投与による受動投与であるか、噴霧化吸入配送のための鼻スプレーまたは吸入剤を使用する能動投与である。必要あれば医薬組成物をリポソーム、ミクロ球体または他のポリマーマトリックス中に取り込むこともできる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１巻（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．１９８４）；本明細書に引用して援用する）。例えば、リン脂質または他の脂質でなるリポソームは非毒性であり、生理学的に許容され、製造と投与が比較的簡単な代謝可能な担体である。
【０１３３】
本明細書に引用したすべての文献と特許出願は、各文献または特許が具体的かつ個別に引用して援用されるかの様に本明細書に引用して援用する。
【０１３４】
先行する発明を明確性と理解のための説明と例示の手段としてある程度詳細に説明したが、ある程度の変更と修正を付随するクレームの精神と範囲から逸脱せずに行い得ることは、本発明の教示に照らして当業者に自明のことと考えられる。
【０１３５】
上記の開示から理解し得る様に、本発明は多様な用途を有する。従って、以下の実施例は説明の目的で提示されたものであり、本発明の制約として構成されることを意図するものではない。本質的に類似の結果を得るために変更または修正し得る様々な重要でないパラメーターを、当業者は理解すると考えられる。
【実施例】
【０１３６】
実施例１：マウスＩＩＡ１抗α５β１インテグリン由来のＭ２００キメラ抗体の構築
本実施例はキメラ抗体Ｍ２００の構築を説明する。
【０１３７】
Ａ．ＩＩＡ１および２００−４ＶＨおよびＶＬドメインの出発ＤＮＡ配列
マウス抗ヒトα５β１インテグリン抗体の可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）、ＩＩＡ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）をＩＩＡ１ハイブリドーマからクローニングし、２００−４抗体の初期構築の一部として配列決定した。図３はＩＩＡ１ＶＨ（配列番号１３）およびＶＬ（配列番号１４）ドメインのｃＤＮＡ配列を示す。ＩＩＡ１由来の２００−４マウス／ヒトキメラＩｇＧ４抗体の構築中に、沈黙ＸｈｏＩ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ：配列番号２９）をＩＩＡ１ＶＨおよびＶＬ双方の骨格４領域中に導入した。発現コンストラクトＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラおよびＮＥＦ５ＩＩＡ１／Ｋキメラ中に見出される、これらの沈黙ＸｈｏＩ部位を含む２００−４ＶＨ（配列番号１５）およびＶＬ（配列番号１７）ＤＮＡ配列が図４に示される。これらの２００−４ＶＨおよびＶＬ配列を、以後の全ての組み換えＤＮＡ操作の出発点として使用した。
【０１３８】
Ｂ．Ｍ２００ミニエクソンの設計
発現プラスミドＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラおよびＮＥＦ５ＩＩＡ１／Ｋキメラ中の２００−４ＶＨおよびＶＬドメインを、イントロンの介在なしに沈黙ＸｈｏＩ部位を通って隣接不変ドメインに直接融合した。これらの可変ドメインをゲノムＤＮＡに基づいて所望の抗体発現ベクターと互換性にするために、可変コード領域の３’末端で機能性ドナースプライスを生成する「ミニエクソン」を設計することが必要であった。配列の比較により、ＩＩＡ１のＶＨおよびＶＬ領域はマウスＪＨ４およびＪＫ１セグメントをそれぞれ利用することが明らかになったので、ＶＨおよびＶＬドメイン中の最後のアミノ酸の後に天然マウスＪＨ４およびＪＫ１ドナースプライス部位を作成するためにミニエクソンを設計した。さらに、ＸｈｏＩ部位を除去し、最初のＩＩＡ１ハイブリドーマ中に見出された様な骨格４配列を修復した。制限部位をミニエクソンの両側面−すなわちＶＨミニエクソンに対し５’および３’ＸｂａｌＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ：配列番号３０）、およびＶＬミニエクソンに対し５’ＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧＴ：配列番号３１）−に置いた。
【０１３９】
組み換え抗体可変ドメインは時には望ましくない別なｍＲＮＡスプライス部位を含み、交互にスプライスされたｍＲＮＡ種を生じる。理論的にはこの様な部位はマウス可変ドメイン中に存在するが、キメラ不変領域由来の異種発現細胞および／または新しい受容体部位の状態でのみ活性になる。潜在性別スプライス部位を除去し、コードされたアミノ酸配列を変えないためにコドン縮退を利用することにより、子の様な望ましくない別なスプライシングを排除し得る。Ｍ２００ＶＨおよびＶＬミニエクソン中の任意の潜在性別スプライス部位を検出するため、最初の設計をＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｈｈｔｐ：／／ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）で作成したスプライス部位予測プログラムで解析した。２つの２００−Ｍミニエクソンでは正しいドナースプライス部位が同定されたが、潜在性別スプライス部位がＶＨミニエクソンのＣＤＲ３およびＶＬミニエクソンのＣＤＲ１中に検出された。これらのスプライス部位が使用される可能性を除くため、ミニエクソンの設計に単一沈黙塩基対の変更を行った。ＶＨの設計の場合は、グリシン１００（Ｋａｂａｔ番号）における沈黙ＧＧＴをＧＧＡへ変化させ、ＶＬの設計ではバリン２９における沈黙ＧＴＡをＧＴＣへ変化させた。双方の場合で、これらの沈黙配列変化により、Ｖ遺伝子における潜在性２次スプライスドナー信号が排除された。
【０１４０】
両側制限部位、マウスドナースプライス部位を含み、２００４−Ｘｈｏｌが除去され、潜在性別ドナースプライス部位が排除されたＭ２００ＶＨおよびＶＬミニエクソン（配列番号１９、２１）に対する最終設計が図５に示される。
【０１４１】
Ｃ．Ｍ２００ＶＨミニエクソンおよびプラスミドｐ２００−Ｍ−Ｈの構築
図５Ａに示すＭ２００ＶＨに対する設計されたミニエクソンを、２００−４発現プラスミドＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラを出発点として用いてＰＣＲ系突然変異誘発により構築した。簡単に言えば、２００−４ＶＨ領域を、２００−４ＶＨの３’末端にアに−リングし、Ｋｏｚａｋ配列およびＸｂａＩ部位を追加するプライマー＃１１０（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＴ−３’：配列番号３２）と、２００−４ＶＨの３’末端にアニーリングし、ＸｂａＩ部位を追加するプライマー＃１０４（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴ−３’：配列番号３３）を用いてＤＥＦ３８ＩＩＡ１／ヒトＧ４キメラから増幅した。４６９ｂｐＰＣＲフラグメントをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ＤＮＡ配列決定で確認してプラスミドｐ２００Ｍ−ＶＨ−２．１を作成した。次いでこの中間プラスミドを第２のＰＣＲ突然変異誘発反応に使用し、ＣＤＲ３中の潜在的に異常なスプライス部位を除去し、マウスＪＨ４ドナースプライス部位をＶＨコード領域の３‘’末端に付加した。二つの相補性プライマー＃１１１（５’−ＴＧＧＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧＧ−３’：配列番号３４）および＃１１２（５’−ＣＣＣＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＡＴＴＣＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＴＣＣＡ−３’：配列番号３５）を設計し、Ｍ２００ＶＨのＣＤＲ３中のグリシン１００（Ｋａｂａｔ番号）におけるＧＧＴからＧＧＡへのコドン変化を導いた。プライマー＃１１０および＃１１２をＰＣＲ反応に使用し、Ｍ２００ＶＨミニエクソンの５’末端から３９５ｂｐフラグメントを作成し、プライマー＃１１１および＃１１３（）による別なＰＣＲ反応によりＭ２００ＶＨミニエクソンの３’末端から１０１ｂｐフラグメントを作成した。２つのＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース上でゲル精製し、それらを合わせてプライマー＃１１０および＃１１３を用いる最終ＰＣＲ反応中で結合した。最終４５６ｂｐＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａｌＩで消化し、ＸｂａＩ消化およびエビアルカリホスファターゼ処理ベクターｐＨｕＨＣｇ４．Ｄ中にクローニングした。ＸｂａＩ部位間の２００−ＭＶＨミニエクソンに対する正しい配列を確認し、ＸｂａＩ−ＸｂａＩインサートの正しい配位を実証するため、最終プラスミドｐ２００−Ｍ−Ｈ（図６）のＤＮＡ配列を決定した。
【０１４２】
Ｄ．Ｍ２００ＶＬミニエクソンおよびプラスミドｐ２００−Ｍ−Ｌの構築
図５Ｂに示される様な設計されたミニエクソンＭ２００ＶＬは、出発点として２００−４発現プラスミドＮＥＦ５―ＩＩＡ１―Ｋを用いるＰＣＲ系突然変異誘発により構築された。信号配列の５’末端にアニーリングし、Ｋｏｚａｋ配列とＭｌｕＩ部位を追加するプライマー＃１０１（５’−ＴＴＴＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴ−３’：配列番号３７）と、２００４−ＶＬの３’間単にアニーリングし、ＸｂａＩ部位を追加するプライマー＃１０２（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’：配列番号３８）を用いてＶＬ領域をＮＦＥ５ＩＩＡ１−Ｋから増幅した。４３２ｂｐのＰＣＲフラグメントをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ＤＮＡ配列決定で確認し、プラスミドｐ２００Ｍ−ＶＬ−３．３を生成した。この中間プラスミドを第２のＰＣＲ突然変異誘発反応に使用し、ＣＤＲ１中の潜在性異常スプライス部位を除去し、ＶＬコード領域の３’末端にマウスＪＫ１ドナースプライス部位を付加した。２つの相補プライマー＃１１４（５’−ＴＧＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴＴＡＣＴＴＧ−３’：配列番号３９）および＃１１５（５’−ＣＡＡＧＴＡＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣＡ−３’：配列番号４０）を設計し、ＶＬドメインのＣＤＲ１中のバリン２９（Ｋａｂａｔ番号）にＧＴＡからＧＴＣへの変化を導いた。プライマー＃１０１と＃１１５をＰＣＲ反応に使用し、ＶＬミニエクソンの５’末端から１８２ｂｐフラグメントを作成した。プライマー＃１１４と＃１１６（５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’：配列番号４１）とを用いる別なＰＣＲ反応により、ＶＬミニエクソンの３’末端から２８０ｂｐフラグメントを生成した。ＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロース上でゲル精製し、それらを合わせ、プライマー＃１０１および＃１１６を用いて最終ＰＣＲ反応中で結合した。４３１ｂｐの最終ＰＣＲ生成物を精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化し、ＭｌｕＩ−およびＸｂａＩ消化軽鎖発現ベクターｐＨｕＣｋａｐｐａ．ｒｇｐｔ．ｄＥ中へクローニングした。最終プラスミドｐ２００−Ｍ−Ｌ（図７）のＤＮＡ配列決定を行い、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩ部位間のＶＬミニエクソンに対する正しい配列を確認した。
【０１４３】
Ｅ．最終発現プラスミドｐ２００−Ｍを作成するためのプラスミドｐ２００−Ｍ−Ｈとｐ２００−Ｍ−Ｌとの組み合わせ
１個のプラスミドからＭ２００を発現するため、ｐ２００−Ｍ−Ｈおよびｐ２００−Ｍ−ＬをＥｃｏＲＩで消化し、ｐ２００−Ｍ−Ｈ由来の全ＩｇＧ４重さ遺伝子を有するＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩｐ２００−Ｍ−Ｌ中にライゲートしプラスミドｐ２００−Ｍ（図８）を作成した。ｐ２００−Ｍの内毒素フリープラスミドの大スケール調製物を内毒素フリープラスミドＭａｘｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２．５リッターのＥ．ｃｏｌｉ培養から調製した。酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＦｓｐＩを用いる制限酵素マッピングによりプラスミドの構造を実証した。Ｍ２００ＶＨ、ＶＬ、ＣκおよびＣγ４に対する全コード領域をＤＮＡ配列決定で実証した。完全Ｍ２００重鎖（配列番号２３）およびＭ２００軽鎖（配列番号２４）に対するＤＮＡ配列を図９に示す。完全Ｍ２００重鎖（配列番号２５）およびＭ２００軽鎖（配列番号２６）に対する対応するアミノ酸配列を図１０に示す。
【０１４４】
実施例２：Ｍ２００からＦａｂフラグメントＦ２００の作成
本実施例はＦａｂフラグメントＦ２００の生成を説明する。
【０１４５】
Ｆａｂフラグメントを酵素消化によりＭ２００ＩｇＧ出発物質から作成する。出発ＩｇＧの緩衝液を２０ｍＭ燐酸ナトリウム、２０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン、ｐＨ７．０に交換した。可溶性パパイン酵素を加え、混合物を３７℃で４時間回転させた。消化後、混合物をプロテインＡカラムに通し、Ｆｃフラグメントを除くと共に未消化ＩｇＧを除去した。テトラチオネートナトリウムを１０ｍＭで加え、室温で３０分間インキュベーションした。最後にこの調製物の緩衝液を２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４に交換し、Ｆ２００溶液を得た。
【０１４６】
Ｆａｂフラグメントであるので、Ｆ２００軽鎖ＤＮＡとアミノ酸配列はＭ２００軽鎖と同じである。完全Ｆ２００重鎖（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）を図１１に示す。
【０１４７】
実施例３：全身投与後の肉芽化インヒビター血清レベルの維持
本実施例は、肉芽化インヒビター血清レベルが規則的な投与レジームで維持し得ることを示す。
【０１４８】
各対象の投与法は、頭静脈または伏在静脈中の静脈内注入による全身配送であった。各動物に対する投与容積は最新の体重測定に基づき、５０、１５または５ｍｇ／ｋｇであった。動物が霊長類椅子に拘束されている間に、シリンジ注入ポンプを用いて静脈内注入を行った。投与のために動物を麻酔しなかった。投与スケジュールはレーザー傷害の当日から初めて、週１回、４週間であった。
【０１４９】
【表１】
Ｍ２００の静脈内投与後のＣＤ１４＋上のα５β１部位の飽和度を測定した。ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１４を用いてＣＤ１４＋単核細胞が同定される２色分析を用い、ＰＥ結合マウス抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いて結合Ｍ２００を定量して、占有されたα５β１部位の測定を行った。平行して細胞をＰＥに結合したマウス抗体ＩＩＡ１とインキュベーションし、ＩＩＡ１結合を定量し、占有された（利用できる）α５β１部位の測定を行った。これらの２つの測定を用いて、Ｍ２００によるα５β１部位の飽和度を計算した。
【０１５０】
以下の様な平均ＧＭＦ（平均蛍光強度）を用い、結合Ｍ２００の正規化ＧＭＦ（ＧＭＦＮｏｒｍ）を決定して飽和度を計算を行った。
【０１５１】
ＧＭＦＮｏｒｍＭ２００＝（ＰＥ抗ヒトＩｇＧ４のＧＭＦ）／（対照同位体のＧＭＦ）
平均ＧＭＦ値を用いる結合ＩＩＡ１の正規化ＧＭＦ（ＧＭＦＮｏｒｍ）の計算は以下の通りである。
【０１５２】
ＧＭＦＮｏｒｍＩＩＡ１＝（ＰＥ−ＩＩＡ１のＧＭＦ）／（対照同位体のＧＭＦ）
Ｍ２００によるα５β１の占有率の計算は以下の通りである。
【０１５３】
Ｍ２００による占有％＝［（ＧＭＦＮｏｒｍＭ２００−１）×１００］／［（ＧＭＦＮｏｒｍＭ２００−１）＋（ＧＭＦＮｏｒｍＩＩＡ１−１）］
【０１５４】
結果
図３Ａ〜３Ｃに示す様に、肉芽化インヒビターＭ２００のレベルは時間と共に減少する。肉芽化インヒビターの治療レベルは５ｍｇ／ｋｇのＭ２００投与後１６８時間、１５ｍｇ／ｋｇ注入の２４０時間後、５０ｍｇ／ｋｇ投与の３３６時間以上後でも存在する。
【０１５５】
図３Ｄ〜３Ｆは、１５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのＭ２００毎週投与により、有益な効果を与えるに必要な肉芽化インヒビターの最少レベルを維持するか、またはそれを超えることを示している。この結果は図２および３にまとめられるＭ２００およびＩＩＡ１結合の研究で確認される。
【０１５６】
図１４は血液単核細胞に対するＭ２００肉芽化インヒビターの結合を示す。各棒グラフは付随する説明で表される様な日毎のＦＡＣＳ分析で測定したＭ２００の占有率を示す。このチャートは、各投与量を与えた４日後に単核細胞α５β１インテグリン結合部位がＭ２００で飽和していることを示す。５ｍｇ／ｋｇの投与量では、単核細胞へのＭ２００結合レベルが急速に消滅し、２１日でのレベルは無視し得る程度であった。しかしながら、単核細胞α５β１インテグリン結合部位のＭ２００による飽和レベルは、１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの投与量の双方で実験期間中維持される。これらの結果は、図１５に示されるＩＩＡ１のＦＡＣＳ分析で確認される。部位がＭ２００で占有されていない場合のみ、ＩＩＡ１は単核細胞α５β１インテグリン結合部位へ結合する。図１５に示す様に、５ｍｇ／ｋｇの投与量でＩＩＡ１の単核細胞α５β１インテグリン結合部位への結合は約１４日以内にほぼ飽和レベルに増加する。このＩＩＡ１占有の増加は、単核細胞α５β１インテグリン結合部位へのＭ２００の結合の減少の後を追うものである。ＩＩＡ１結合とＭ２００結合の間の同じパターンが１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇでも観察される。
【０１５７】
実施例４：肉芽化インヒビターＦ２００による硝子体内処置後の肉芽化の減少
本実施例は肉芽化インヒビターＦ２００によるレーザー誘発眼障害処置の効果を示す。動物モデルにおけるレーザー誘発眼障害の研究を記載する背景文献には：Ｓ．Ｒｙａｎ、“Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｉｓｃｉｆｏｒｍ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｐｔｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、７７：７０７−７４５（１９７９）；Ｓ．Ｊ．Ｒｙａｎ、“Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｉｏｎ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ”、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１００：１８０４−１８０９（１９８２）；Ｍ．Ｊ．Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、“Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｄｅｘｔｒａｎｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，”、Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１１８：７８−７４（２０００）が含まれる。
【０１５８】
以下に記す様に、本発明の細胞性肉芽化インヒビターの硝子体内注入により、サルで誘発した斑紋傷における組織肉芽化がかなり減少する。
【０１５９】
まとめ
以下の表２に示す様に、合計４匹のサルを処置群とした。ＥＯＳ２００Ｆは担体緩衝液中で投与したマウス抗α５β１インテグリンＩｇＧおよびヒトＩｇＧ由来のＦａｂフラグメントである。第１日に各動物の両眼の斑紋にレーザー処置により斑紋肉芽化を誘発した。週に１回、４週間、全ての動物に表に示す様に薬剤を投与した。投与の最初の日を第１日と定義した。標準法を用いて臨床症候、体重および他のパラメーターにつき動物を評価した。全ての動物を第３２日に安楽死させた。
【０１６０】
【表２】
細胞性肉芽化の誘発
レーザー処理および薬剤投与の前に動物を終夜縛り付けた。レーザー処理および薬剤投与操作のため、動物をケタミンＨＣｌ（筋肉内、有効量）、続いて筋肉内ケタミンとジアゼパム（有効量）で麻酔した。
【０１６１】
レーザー処理により斑紋肉芽化を両眼の斑紋に誘発した。レーザー（ＩＲＩＳ Ｍｅｄｉａｌ（商標）ポータブルスリットランプアダプターを備えたＯｃｕＬｉｇｈｔＧＬ（５３２ｎｍ）レーザーフォトコアギュレーター）による標準グリッドパタンで傷を斑紋中に形成した。右眼のレーザースポットを左眼に反転して照射した。レーザーパラメーターの概要は以下の通りである：スポットサイズ５０〜１００μｍ；レーザー出力３００〜７００ミリワット；露光時間０．１秒。各動物に対するパラメーターをレーザー処置の当日に記録した。ＴＲＣ５０ＥＸ網膜カメラおよび／またはデジタルＣＣＤカメラを備えたＳＬ−４ＥＤスリットランプを使用して写真を撮影した。
【０１６２】
薬剤投与
免疫グロブリンまたは緩衝液対照品の硝子体内注入を各眼に行った。レーザー処理の直後に第１日の注入を行う。薬剤投与の前に散瞳薬（１％トロピカミド）を各眼に滴下した。眼を薄い抗菌剤溶液（５％ベタジン溶液またはその等価物）で漱ぎ、抗菌剤を０．９％滅菌食塩水（またはその等価物）で洗い流し、２滴の局所麻酔剤（プロパラカインまたはその等価物）を眼に滴下した。術中に瞼を開いたままにしておくため、瞼鏡を挿入し、球を引き抜いた。角膜の約４ｍｍ後方で強膜および平面部に注射器の針を通した。針をレンズの後方で中間硝子体に指し込んだ。薬品を硝子体中にゆっくり注入した。針を引き抜く前に注射器を取り巻く結膜を掴むため、鉗子を使用した。針を引き抜く間、および針を引き抜いた後の短時間、結膜を鉗子で保持した。次いで瞼鏡を取り除いた。薬剤投与後直ちに、眼を検眼鏡で調べて、眼に見える投与後の問題があるかどうかを検査した。
【０１６３】
薬剤投与の直後、および投与の１日後に、感染を防ぐため各眼に局所抗生物質（トブレックス（商標）またはその等価物）を分配した。麻酔から十分に回復してから、動物をケージに戻した。薬剤投与を上記の様に毎週行った。示されたグラム量投与レベルを各眼に与えた。使用した肉芽化インヒビターの濃度範囲は以下の通りである：各無損傷抗体を約１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０〜３００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約２５〜２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約７．５〜１５０μｇ／ｍｌの濃度で使用する。好ましいＦａｂ濃度は全抗体で挙げられた濃度と同じであり、好ましくは眼に対し２．５〜５０μｇ／ｍｌである。
【０１６４】
肉芽化阻害のモニタリング
後部チャンバーを調べるために関節検眼鏡を使用し、眼の前部セグメントを調べるために生物顕微鏡を使用した。標準法を用いて眼を評価した（Ｒｏｂｅｒｔ、Ｂ．ＨａｃｋｅｔｔおよびＴ．Ｏ．ＭｃＤｏｎａｌｄ、１９６６、Ｄｅｒｍａｔｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ．Ｂｙ Ｆ．Ｂ．Ｍａｒｘｕｌｌｉ ａｎｄ Ｈ．Ｉ．Ｍａｉｂａｃｈ、Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ）。
【０１６５】
眼の写真を撮影する（ＴＲＣ−５０ＥＸ網膜カメラおよび／またはデジタルＣＣＤカメラ付きＳＬ−４ＥＤスリットランプ）。この処置の前に動物をケタミンＨＣｌで軽く麻酔し、数滴の散瞳薬（典型的には１％トロピァカミド）を眼に滴下して検査し易くする。
【０１６６】
動物を安楽死させ、眼を取り出して切開した。瞳、視神経および斑紋が同一平面になる様にフォルマリン固定眼を水平に切開し、パラフィンに埋没した。全試料にわたり連続切片を作成し、一定間隔のスライドをヘムトキソリンおよびエオシンにより定法で染色した。傷を光学顕微鏡で同定し、測定して傷、斑紋および視神経の位置を示すマップを作成した。組織学的に最も重症度の高い傷害（傷の中心領域と考えられる）を示すスライド上で、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ製のＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウエアを用いて肉芽化組織の領域を測定した。
【０１６７】
これらのグループの解析は、傷における組織肉芽化を明瞭に検出した。図１２に示す様に、未処置対照動物（グループ１および２）中に見出された肉芽化のレベルと比較して、処置動物の眼における肉芽化（グループ８および９）が有意に減少している。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１はマウス抗α５β１インテグリン抗体（ＩＩＡ１）の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）、およびマウスオリジナル由来の５個のヒト化抗体（１．０〜５．０）のアミノ酸配列（配列番号１〜１２）を示す。
【図２】図２はマウスオリジナル（ＩＩＡ１）に対する５個のヒト化抗体中の配列置換を強調するアミノ酸配列（配列番号１〜１２）の並びを示す。
【図３】図３は（Ａ）ＩＩＡ１ＶＨ核酸配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１）；（Ｂ）ＩＩＡ１ＶＬ核酸配列（配列番号１４）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図４】図４は（Ａ）抗体Ｍ２００−４ＶＨ核酸配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）、（Ｂ）抗体Ｍ２００−４ＶＬ核酸配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図５】図５は（Ａ）抗体Ｍ２００ＶＨ核酸配列（配列番号１９）およびアミノ酸配列（配列番号２０）、（Ｂ）抗体Ｍ２００ＶＬ核酸配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。
【図６】図６はＭ２００重鎖発現のためのｐ２００−Ｍ−Ｈプラスミドコンストラクトを示す。
【図７】図７はＭ２００軽鎖発現のためのｐ２００−Ｍ−Ｌプラスミドコンストラクトを示す。
【図８】図８はＭ２００重鎖および軽鎖発現のための単一プラスミドｐ２００−Ｍを示す。
【図９】図９は完全Ｍ２００重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列（配列番号２３、２４）を示す。
【図１０】図１０は完全Ｍ２００重鎖および軽鎖アミノ酸配列（配列番号２５、２６）を示す。
【図１１】図１１は完全Ｆ２００重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号２７、２８）を示す。
【図１２】図１２は肉芽化インヒビターＦ２００（ＥＯＳ２００−Ｆとも呼ばれる）の不在に対する肉芽化インヒビターの存在における瘢痕形成の減少を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは５、１５または５０ｍｇ／ｋｇ体重それぞれの１回の静脈内注射後の指示された期間中の肉芽化インヒビターＭ２００（ＥＯＳ２００−４とも呼ばれる）の血清レベルを示す。図１３Ｄ〜１３Ｆは毎週５、１５または５０ｍｇ／ｋｇ体重それぞれのスケジュール中の指示された期間中の肉芽化インヒビターＭ２００の血清レベルを示す。
【図１４】図１４は図１３Ａ〜１３Ｃに記載の個体から採集した全血のＦＡＣＳ測定の結果のまとめであり、肉芽化インヒビターＭ２００（ビヒクル＝０ｍｇ・ｋｇ）による血液単核細胞α５β１インテグリン結合部位の占有率を示す。
【図１５】図１５は図１３Ａ〜１３Ｃに記載の個体から採集した全血のＦＡＣＳ測定の結果のまとめであり、血液単核細胞α５β１インテグリン結合部位の利用可能率を示す。データは図４に示すデータで補正され、肉芽化インヒビターＭ２００（ビヒクル＝０ｍｇ／ｋｇ）を投与した個体から採集した単核細胞α５β１インテグリン結合部位へ抗α５β１抗体が結合できないことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
罹患した眼の創傷部位をα５β１インテグリン結合剤と接触させる工程を包含するマクロファージ挙動の制御法であって、罹患した眼のＲＰＥ細胞がマクロファージ挙動を示すことを阻害する、方法。
【請求項２】
結合剤が抗α５β１インテグリン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が配列番号１〜６からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
マクロファージ挙動が食細胞活性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
マクロファージ挙動がサイトカイン、ケモカインまたは炎症反応のメディエーターの分泌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
創傷部位が感染によって作られない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
接触工程が直接適用、硝子体内注入、全身注入、噴霧吸引、点眼および経口摂取からなる群より選ばれる技術を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
α５β１インテグリン結合剤を傷害または罹患組織に適用し、それにより肉芽化を減少させる工程を包含する、傷害または罹患組織中の有害な肉芽化を減少させる方法。
【請求項９】
α５β１インテグリン結合剤が配列番号１〜６からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを含む抗α５β１抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組織が眼、皮膚、骨、軟骨、血管、靭帯または腱からなる群より選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
罹患組織が眼、関節の一部、または包に関連する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
傷害または罹患組織がケロイド形成、火傷および強皮症からなる群より選ばれる症状によって作られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
傷害または罹患組織が組織炎症を生じる疾患に関連している、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
疾患がリュウマチ性関節炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉芽腫症、好酸球肉芽腫症、正中肉芽腫症、デスモイド、類肉腫症、黄紋変性、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、子宮類線維腫症、側頭筋動脈炎、およびＴａｋａｙａｓｕ動脈炎からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患がＣｒｏｈｎ病、特発性肺線維症およびアレルギー性肺線維症からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
適用する工程が直接適用、硝子体内注入、全身注入、噴霧吸入、点眼または経口摂取を含む技術により結合剤を組織に接触させる工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）肉芽化を生じるに十分な傷を眼組織中に作る工程と；
（ｂ）眼組織にα５β１インテグリン結合剤の１回分以上の投与量を適用する工程と；
（ｃ）適用した眼組織の傷中の肉芽化、またはその周囲の肉芽化をモニタリングする工程と、を包含するＲＰＥ細胞中でマクロファージ挙動をのインヒビターを同定する方法であって：
繊維芽細胞様細胞挙動の増加がＲＰＥ細胞中のマクロファージ挙動のインヒビターを示す、方法。
【請求項１８】
眼組織が生きた霊長類の眼の一部である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
モニタリング工程が染色組織切片を検査する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
眼組織が網膜、斑紋および角膜からなる群より選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
結合剤の適用が直接適用、硝子体内注入、全身注入、噴霧吸引、点眼および経口摂取からなる群より選ばれる技術を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
罹患した眼の創傷部位をα５β１インテグリン結合剤と接触させる工程を包含するマクロファージ挙動の制御法であって、罹患した眼のＲＰＥ細胞がマクロファージ挙動を示すことを阻害する、方法。
【請求項２】
結合剤が抗α５β１インテグリン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が配列番号１〜６からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
マクロファージ挙動が食細胞活性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
マクロファージ挙動がサイトカイン、ケモカインまたは炎症反応のメディエーターの分泌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
創傷部位が感染によって作られない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
接触工程が直接適用、硝子体内注入、全身注入、噴霧吸引、点眼および経口摂取からなる群より選ばれる技術を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
α５β１インテグリン結合剤を傷害または罹患組織に適用し、それにより肉芽化を減少させる工程を包含する、傷害または罹患組織中の有害な肉芽化を減少させる方法。
【請求項９】
α５β１インテグリン結合剤が配列番号１〜６からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変重鎖領域と、配列番号７〜１２からなる群より選ばれるアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域とを含む抗α５β１抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組織が眼、皮膚、骨、軟骨、血管、靭帯または腱からなる群より選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
罹患組織が眼、関節の一部、または包に関連する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
傷害または罹患組織がケロイド形成、火傷および強皮症からなる群より選ばれる症状によって作られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
傷害または罹患組織が組織炎症を生じる疾患に関連している、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
疾患がリュウマチ性関節炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓアレルギー性肉芽腫症、好酸球肉芽腫症、正中肉芽腫症、デスモイド、類肉腫症、黄紋変性、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、子宮類線維腫症、側頭筋動脈炎、およびＴａｋａｙａｓｕ動脈炎からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患がＣｒｏｈｎ病、特発性肺線維症およびアレルギー性肺線維症からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
適用する工程が直接適用、硝子体内注入、全身注入、噴霧吸入、点眼または経口摂取を含む技術により結合剤を組織に接触させる工程を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）肉芽化を生じるに十分な傷を眼組織中に作る工程と；
（ｂ）眼組織にα５β１インテグリン結合剤の１回分以上の投与量を適用する工程と；
（ｃ）適用した眼組織の傷中の肉芽化、またはその周囲の肉芽化をモニタリングする工程と、を包含するＲＰＥ細胞中でマクロファージ挙動をのインヒビターを同定する方法であって：
繊維芽細胞様細胞挙動の増加がＲＰＥ細胞中のマクロファージ挙動のインヒビターを示す、方法。
【請求項１８】
眼組織が生きた霊長類の眼の一部である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
モニタリング工程が染色組織切片を検査する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
眼組織が網膜、斑紋および角膜からなる群より選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
結合剤の適用が直接適用、硝子体内注入、全身注入、噴霧吸引、点眼および経口摂取からなる群より選ばれる技術を含む、請求項１７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００７−５２４６０５（Ｐ２００７−５２４６０５Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９７０２（Ｐ２００６−５０９７０２）
【出願日】平成１６年４月２日（２００４．４．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０４２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８９９８８
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５００５３３４２２）ピーディーエル バイオファーマ，インコーポレイティド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２日（２００４．４．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０４２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８９９８８
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５００５３３４２２）ピーディーエル バイオファーマ，インコーポレイティド (18)
【Ｆターム（参考）】
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