インフリキシマブの有効性判定方法
【課題】関節リウマチの治療において、患者個人に沿った治療方法を提案するための、関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性判定方法の提供。
【解決手段】ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性の判定方法。
【解決手段】ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチのインフリキシマブ療法にインフリキシマブの有効性を判定する方法、及び当該方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗リウマチ薬であるインフリキシマブやエタネルセプトなどの生物学的製剤は、病態に関与する重要な分子であるＴＮＦ−αを標的とするため、疾患活動性を特異的に制御して、高い有効性を示すことが明らかとなっている（非特許文献１〜２）。特に活動性関節リウマチ患者における関節破壊の進行抑制、及び身体機能とＱＯＬの改善効果は、抗ＴＮＦ薬の特筆すべき特徴であり、従来の抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）では達成しえなかったものである（非特許文献３）。
【０００３】
インフリキシマブは、キメラ型の抗ＴＮＦ-αモノクローナル抗体製剤であり、２００３年に日本でも関節リウマチへの使用が承認され、画期的な疾患制御効果・強力な骨破壊抑制効果など既存の抗リウマチ薬では達成できない有用性が明らかとなっている。特に早期関節リウマチでの投与は滑膜炎制御、骨破壊抑制において重要であることが提唱されている（非特許文献４〜６）。このように生物学的製剤による早期介入の有用性がさかんに提唱され、今後寛解・治癒を目指した早期介入に拍車がかかることが予想される。
【０００４】
一方、生物学的製剤は費用が高く、そして、ある割合で重篤な有害事象が起きる可能性があるので、生物学的製剤の有効性と安全性の予測は患者と医師の双方にとって非常に有益である。しかし、患者ごとの有効性を事前に知ることは困難であった。
【０００５】
近年、関節リウマチ患者の重症度と関連する免疫系機能遺伝子多型の研究により、ＨＬＡ-ＤＲＢ1遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ1Ｂ（ＴＮＦＲ２）遺伝子、ＩＬ−１遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子などの遺伝子多型が研究されてきたが、日本人におけるインフリキシマブの有効性に関連する遺伝子多型は確立されていない。従って、関節リウマチの治療において、患者ごとのインフリキシマブの有効性を事前に把握し、患者ごとの治療計画を立てるような、精度の高いインフリキシマブ療法はこれまでに存在していない。
【非特許文献１】Kalden, J. R. (2002) J.Rheumatol.Suppl. (66) 27-37
【非特許文献２】Weaver, A. L. (2004) Mod. Rheumatol. (14) 101-112
【非特許文献３】Ostor, A. J. (2005) Clin.Med. (5) 222-226
【非特許文献４】非特許文献４：Maini, R. N., et al. (2004) Arthritis Rheum. (50) 1051-1065
【非特許文献５】Breedveld, F. C., et al. (2004) Ann.Rheum.Dis. (63) 149-155
【非特許文献６】St Clair, E. W., et al. (2004) Arthritis Rheum. (50) 3432-3443
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、関節リウマチの治療において、患者個人に沿った治療方法を提案するための、関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性を判定する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子及び／又はＩＲＦ５遺伝子の多型がリウマチ患者にインフリキシマブを投与した時の有効性と有意に関連し、これらの遺伝子多型を検出することにより、インフリキシマブ療法における患者ごとのインフリキシマブ投与の有効性を判定でき、より的確な投与方法や投与量の設定が可能になることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性の判定方法。
２）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性を判定するためのキット。
３）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドを含む上記２）のキット 。
４）前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４から選ばれる１以上の遺伝子多型の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー又は、当該遺伝子多型部位を含む領域に結合するプローブである上記３）のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の判断方法を臨床検査等に利用することにより、治療における投与開始時点において薬剤の有効性を患者ごとに決めることができる。この方法によれば、インフリキシマブの過剰な投与を防止し、患者の身体への負担や治療費の削減が可能となる。また、関節リウマチ患者を、患者ごとにより早く有効な薬剤での治療へ導くことが出来、関節リウマチの進展を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
インフリキシマブは、関節リウマチ治療薬として、非ステロイド性抗炎症剤及び抗リウマチ薬（メトトレキサート製剤を含む）等の既存治療で効果不十分な患者に適用される。現在、日本においては、添付文書及び厚生労働省のインフリキシマブ研究班のガイドラインにより、インフリキシマブ３mg/kgを生理食塩水に溶解し、緩徐に（２時間以上かけて）点滴静注すること、初回投与の後、２週後、６週後に追加投与を行い、以後８週間毎に投与を継続することが決められている。
【００１１】
本発明におけるインフリキシマブの有効性の判定は、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することにより行われる。
判定は、これらの遺伝子多型それぞれを単独で検出して行うことが可能であるが、複数を組み合わせて判定するのが判定精度を上げる点で好ましい。少なくとも、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７を含めることがより好ましい。
【００１２】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７は、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子（インターロイキン−１０レセプターＢ（interleukin-10 receptor B：IL10RB））のエクソン２に位置するＩＬ１０ＲＢの４７番目のアミノ酸をコードする塩基に関する多型であり、頻度が多い方のアレル（メジャーアレル）が「Ｇ」であり、メジャーアレル以外のアレル（マイナーアレル）が「Ａ」である。メジャーアレル（「Ｇ」）の時の４７番目のアミノ酸はグルタミン酸であるが、マイナーアレル（「Ａ」）の時のアミノ酸はリジンである。
従って、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７には、ホモ接合体Ａ／Ａ及びＧ／Ｇと、ヘテロ接合体Ａ／Ｇの３つの型が存在する。
実施例２に示すとおり、５４週間投与（３ｍｇ／ｋｇ×８回）のインフリキシマブ療法で、ＡＣＲ（American College of Rheumatology）コアセット（Felson, D.T. et al. American College of Rheumatology preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 38: 727-735, 1995）がＡＣＲ２０以上の改善群と、改善がみられなかった無効群を比較した結果、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が高い（インフリキシマブ感受性）、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が低い（インフリキシマブ非感受性）、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ感受性とインフリキシマブ非感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００１３】
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２は、ＩＲＦ５遺伝子（インターフェロン調節因子−５（interferon regulatory factor 5：IRF5））の５’−フランキング領域に位置する多型であり、メジャーアレルが「Ａ」であり、マイナーアレルが「Ｃ」である。
従って、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２には、ホモ接合体Ａ／Ａ及びＣ／Ｃと、ヘテロ接合体Ａ／Ｃの３つの型が存在する。
実施例３に示すとおり、５４週間投与（３ｍｇ／ｋｇ×８回）のインフリキシマブ療法で、ＡＣＲ５０以上の改善群と、ＡＣＲ２０以下の改善群を比較した結果、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ感受性でありかつ高い改善効果が得られる可能性が高く（インフリキシマブ高感受性）、それ以外の遺伝子型の場合には、インフリキシマブ感受性であっても高い改善効果を得る可能性は低い（インフリキシマブ低感受性）とインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００１４】
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４は、ＩＲＦ５遺伝子の５ｋｂ下流に位置する多型であり、メジャーアレルが「Ａ」であり、マイナーアレルが「Ｇ」である。
従って、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４には、ホモ接合体Ａ／Ａ及びＧ／Ｇと、ヘテロ接合体Ａ／Ｇの３つの型が存在する。
実施例４に示すとおり、５４週間投与（３ｍｇ／ｋｇ×８回）のインフリキシマブ療法で、ＡＣＲ５０以上の改善群と、ＡＣＲ２０以下の改善群を比較した結果、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ低感受性、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ高感受性、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ高感受性とインフリキシマブ低感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００１５】
従って、インフリキシマブ感受性の被験者には、投与回数の減少や投与量を低下することにより、副作用の軽減を図ることができ、一方、インフリキシマブ非感受性或いはインフリキシマブ低感受性の被験者には、インフリキシマブの投与量の増加や投与間隔の短縮あるいは代替薬物への変更を検討することが可能となる。
かように、上記の遺伝子多型の検出は、関節リウマチ患者にとって、治療方法・治療薬を選定する上で重要な情報となる。
【００１６】
上記多型を核酸レベルで検出する方法は、特に制限はなく、当業者にとって公知の方法の中から選択することができる。
例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＡＳＯ（allele-specific oligonucleotide）法、直接シークエンス法、ＲＦＬＰ法、インベーダー法、ＴＧＧＥ、ＤＧＧＥ法、ＭｕｔＹ酵素法、マイクロアレイ、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＰＴＴ）法、Ｓｎｉｐｐｅｒ法等が挙げられ、目的等に応じて選択することができる。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、アレル特異的なＴａｑｍａｎ プローブとＴａｑ ポリメラーゼを用い、遺伝子多型の検出と該遺伝子多型を含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。Ｔａｑｍａｎ プローブは、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャーで標識されている約２０塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的の遺伝子多型部位にハイブリダイズするよう設計されている。Ｔａｑポリメラーゼは、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する。これらのＴａｑｍａｎプローブ及びＴａｑポリメラーゼ存在下において、目的の遺伝子多型を含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該遺伝子多型領域を増幅すると、増幅と並行して、Ｔａｑｍａｎプローブが鋳型ＤＮＡの目的遺伝子多型部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑｍａｎ プローブに到達すると、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、Ｔａｑｍａｎプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、遺伝子多型の検出が可能となる。
【００１７】
核酸を複製又は増幅する公知の方法は、ＰＣＲ法を応用した方法が多いが、ＰＣＲ法によらない方法もある。例えば、Ｓｎｉｐｐｅｒ法、ＵＣＡＮ法やＬＡＭＰ法を利用した遺伝子多型タイピング方法が挙げられる。
【００１８】
本発明のインフリキシマブの有効性を判定するためのキットは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出するものであり、具体的には、当該遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドを含むものである
当該ポリヌクレオチドは、各遺伝子多型部位を含む領域を含むものであればよく、一般にオリゴヌクレオチドと言われる長さのものが包含されるが、好ましくは１０塩基長以上、より好ましくは１０〜５０塩基長のポリヌクレオチドがより好ましい。
当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また当該ポリヌクレオチドは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質で標識されていてもよい。
【００１９】
上記ポリヌクレオチドは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型のいずれかを含む領域を増幅するためのプライマー、上記遺伝子多型部位のいずれかを含む領域に結合するためのプローブとして使用される。
そのため上記ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型のいずれかを検出する検出用ポリヌクレオチドは、当該ゲノム遺伝子の一部と相補的な配列を含むものであるが、当該遺伝子とは無関係な任意の配列が含まれていてもよい。
【００２０】
上記ポリヌクレオチドをプライマーとする場合、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。増幅する領域の長さは、遺伝子多型タイピングに支障がない限り制限はない。一般には１５−１０００塩基長、より好ましくは５０−５００塩基長程度を増幅するが、検出方法に従って適宜増減できる。また、増幅される領域の一部には遺伝子多型部位が含まれるが、増幅される領域内における遺伝子多型部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置することができる。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーと遺伝子多型部位との位置関係は、検出方法にあわせて変更することができ、検出しようとする遺伝子多型を含むＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型の一部領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計することができる。ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型検出用プライマーの長さは、通常１５−５０塩基長、好ましくは１５−３０塩基長であるが、タイピング方法によってはこれより長くてもよい。
【００２１】
また上記ポリヌクレオチドをプローブとする場合は、プローブが遺伝子多型部位を認識するように設計する。プローブ設計において、遺伝子多型部位は、タイピング方法にあわせ、プローブ内のいずれかの場所で認識されればよく、タイピング方法によっては、プローブの末端で遺伝子多型部位が認識されてもよい。この場合、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、１５−２００塩基長であれば良く、より好ましくは１５−１００塩基長、さらに好ましくは１５−５０塩基長であるが、タイピング方法によってはこれより長くても短くてもよい。
【００２２】
各遺伝子多型を検出するための上記ポリヌクレオチドは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型の塩基配列をもとに、プライマー又はプローブの別及び適応する検出方法に合わせて、任意の方法によって合成することができる。すなわち、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型のゲノムＤＮＡ、及び公知遺伝子多型の位置情報に基づいて、公知手段により、当該塩基配列を有するポリヌクレオチドを合成することができる。更に、公知の手法に基づき、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、ポリヌクレオチドに任意の修飾を導入する方法や、合成されたポリヌクレオチドに、蛍光色素などを結合することも可能である。
【００２３】
本発明のインフリキシマブの有効性を判定するためのキットには、上記の各遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドの他に、遺伝子多型タイピングに際して通常用いられる試薬類（例えば、デオキシヌクレオチド３リン酸（dNTPs）やDNAポリメラーゼ、緩衝液等）や陽性コントロール等を含むことができる。
【００２４】
本発明のインフリキシマブの有効性判定方法において、各遺伝子の遺伝子多型を検出するために供する試料は、被験者から採取した生物学的試料をもとに、当業者に周知の方法で調製したDNA試料を用いることができる。
被験者から採取する生物学的試料に特に制限はなく、例えば、血液、毛髪、便、尿、唾液、細胞などを用いることができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１ 被験者及び方法
インフリキシマブ治療を受けた３３例の関節リウマチ患者（以下、ＲＡとする）について、採血を行い、末梢血を原料とし、Quick Gene kit（Fuji Film社）を使用して、染色体DNAを抽出した。
そして、同患者の３０週、５４週におけるＡＣＲ改善度（ＡＣＲコアセット）＜参考文献：Felson, D.T. et al. American College of Rheumatology preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 38: 727-735, 1995）＞と、ＨＬＡ-ＤＲＢ１遺伝子、ＩＲＦ５遺伝子、ＩＬ１０遺伝子、及びＩＬ１０ＲＢ遺伝子の多型との関連を解析した。解析は、χ2検定、フィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）又はアーミテージの傾向検定（Armitage's trend test）を用いて行った。
【００２６】
実施例２ ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７
（１）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７の増幅反応
抽出した染色体ＤＮＡ４０ｎｇを鋳型として、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｐｍｏｌ各プライマー及び１ｕｎｉｔ ＴａＫａＲａ ｒＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ製）を加え、２５μＬの反応液を調製した。ＰＣＲ反応装置はＧｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドシステムズ社製）を用い、９３℃、３分の前処理の後、熱変性９３℃、３０秒、アニーリング６０℃、３０秒及び伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７を含む遺伝子断片を増幅するプライマーを以下に示す。
Forward primer CACGTGGCCTTTGAAGACATGG（配列番号１）
Reverse primer GCCACGAGAATTTCCCAGACAG（配列番号２）
【００２７】
（２）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７の遺伝子型の検出
５μＬのＰＣＲ増幅産物とアルカリ変性用溶液（湧永製薬製）５μＬとを混合し、室温で５分間、放置した。ハイブリダイゼーション用溶液（ハイブリダイゼーション溶液、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン、Ａアリル検出用プローブ固相化Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ及びＧアリル検出用プローブ固相化Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ（湧永製薬製））２５μＬを加え、５５℃で３０分間、ハイブリダイゼーションを行った。７５μＬの洗浄液（湧永製薬製）を加え、３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、スナッピングにより上清を除いた。７５μＬの洗浄液（湧永製薬製）を加え、Ｌｕｍｉｎｅｘ−１００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ製）を用いて、各Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにおける蛍光値の測定を行った。各検出用プローブの蛍光値が５００以上である場合を陽性と判定し遺伝子型の決定をした。
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７を検出するためのプローブを以下に示す。
Ａアレル検出用 CTTTTGCCAAAGGGAACC（配列番号３）
Ｇアレル検出用 CTTTTGCCGAAGGGAACC（配列番号４）
【００２８】
（３）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７とインフリキシマブの有効性
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７の遺伝子型頻度をＡＣＲ２０以上の達成群と改善が見られなかった無効群とで比較を行ったところ、無効群においてＡ／Ａ遺伝子型の有意な増加が認められた。５４週における遺伝子型と改善度の結果は、表１に示される通りであった。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１に示されるように、インフリキシマブ治療を受けＡＣＲ２０以上の改善が見られなかった患者群においてはＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７のＡ／Ａ遺伝子型の頻度が高くなっているのに対し、改善群にはＡ／Ａ遺伝子型が存在しなかったことから、本遺伝子型がインフリキシマブ有効性に有意に関連していることが明らかとなった。
これより、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が高い（インフリキシマブ感受性）、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が低い（インフリキシマブ非感受性）、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ感受性とインフリキシマブ非感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００３１】
実施例３ ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２
（１）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２の遺伝子型の検出
アプライドバイオシステムズ社製のＴａｑＭａｎ試薬を用いて遺伝子型の決定を行った。
【００３２】
（２）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２とインフリキシマブの有効性
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２の遺伝子型頻度をＡＣＲ５０以上を達成した有効群とＡＣＲ２０あるいはそれ未満の無効群とで比較を行ったところ、遺伝子型頻度に有意差が認められた。５４週における遺伝子型と改善度の結果は、表２に示される通りであった。
【００３３】
【表２】
【００３４】
インフリキシマブ治療を受けＡＣＲ２０及びＡＣＲ５０を達成した患者群においては、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２のＡ／Ａ遺伝子型が増加していた。
これにより、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ感受性でありかつ高い改善効果が得られる可能性が高く（インフリキシマブ高感受性）、それ以外の遺伝子型の場合にはインフリキシマブ感受性であっても高い改善効果を得る可能性は低い（インフリキシマブ低感受性）とインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００３５】
実施例４ ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４
（１）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の増幅反応
抽出した染色体ＤＮＡ２０ｎｇを鋳型として、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｐｍｏｌ各プライマー及び０．２５ｕｎｉｔ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ）を加え、１０μＬの反応液を調製した。ＰＣＲ反応装置はＧｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドシステムズ社製）を用い、９６℃、１０分の前処理の後、熱変性９６℃、３０秒、アニーリング６０℃、３０秒及び伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４を含む遺伝子断片を増幅するプライマーを以下に示す。
Forward primer GCTGCAATTGGAAGAAGAGGG（配列番号５）
Reverse primer TGATGTGGATTGGAAGTGGA（配列番号６）
【００３６】
（２）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の遺伝子型の検出
増幅産物をテンプレートとしたダイレクトシークエンシング法によって塩基配列の確認を行い、遺伝子型を決定した。
【００３７】
（３）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４とインフリキシマブの有効性
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の遺伝子型頻度をＡＣＲ５０以上を達成した有効群とＡＣＲ２０あるいはそれ未満の無効群とで比較したところ、遺伝子型頻度に有意差が認められた。５４週における遺伝子型と改善度の結果は、表３に示される通りであった。
【００３８】
【表３】
【００３９】
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４のＡ／Ａ遺伝子型は、ＡＣＲ２０及びそれ未満のインフリキシマブ抵抗群に増加していた。
これより、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ低感受性、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ高感受性、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ高感受性とインフリキシマブ低感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の判定方法を用いることにより、治療における投与開始時点での有効性を患者ごとに決めることができる。この方法により、インフリキシマブの過剰な投与を防止し、患者の身体への負担や治療費の削減が可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチのインフリキシマブ療法にインフリキシマブの有効性を判定する方法、及び当該方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗リウマチ薬であるインフリキシマブやエタネルセプトなどの生物学的製剤は、病態に関与する重要な分子であるＴＮＦ−αを標的とするため、疾患活動性を特異的に制御して、高い有効性を示すことが明らかとなっている（非特許文献１〜２）。特に活動性関節リウマチ患者における関節破壊の進行抑制、及び身体機能とＱＯＬの改善効果は、抗ＴＮＦ薬の特筆すべき特徴であり、従来の抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）では達成しえなかったものである（非特許文献３）。
【０００３】
インフリキシマブは、キメラ型の抗ＴＮＦ-αモノクローナル抗体製剤であり、２００３年に日本でも関節リウマチへの使用が承認され、画期的な疾患制御効果・強力な骨破壊抑制効果など既存の抗リウマチ薬では達成できない有用性が明らかとなっている。特に早期関節リウマチでの投与は滑膜炎制御、骨破壊抑制において重要であることが提唱されている（非特許文献４〜６）。このように生物学的製剤による早期介入の有用性がさかんに提唱され、今後寛解・治癒を目指した早期介入に拍車がかかることが予想される。
【０００４】
一方、生物学的製剤は費用が高く、そして、ある割合で重篤な有害事象が起きる可能性があるので、生物学的製剤の有効性と安全性の予測は患者と医師の双方にとって非常に有益である。しかし、患者ごとの有効性を事前に知ることは困難であった。
【０００５】
近年、関節リウマチ患者の重症度と関連する免疫系機能遺伝子多型の研究により、ＨＬＡ-ＤＲＢ1遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ1Ｂ（ＴＮＦＲ２）遺伝子、ＩＬ−１遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子などの遺伝子多型が研究されてきたが、日本人におけるインフリキシマブの有効性に関連する遺伝子多型は確立されていない。従って、関節リウマチの治療において、患者ごとのインフリキシマブの有効性を事前に把握し、患者ごとの治療計画を立てるような、精度の高いインフリキシマブ療法はこれまでに存在していない。
【非特許文献１】Kalden, J. R. (2002) J.Rheumatol.Suppl. (66) 27-37
【非特許文献２】Weaver, A. L. (2004) Mod. Rheumatol. (14) 101-112
【非特許文献３】Ostor, A. J. (2005) Clin.Med. (5) 222-226
【非特許文献４】非特許文献４：Maini, R. N., et al. (2004) Arthritis Rheum. (50) 1051-1065
【非特許文献５】Breedveld, F. C., et al. (2004) Ann.Rheum.Dis. (63) 149-155
【非特許文献６】St Clair, E. W., et al. (2004) Arthritis Rheum. (50) 3432-3443
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、関節リウマチの治療において、患者個人に沿った治療方法を提案するための、関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性を判定する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子及び／又はＩＲＦ５遺伝子の多型がリウマチ患者にインフリキシマブを投与した時の有効性と有意に関連し、これらの遺伝子多型を検出することにより、インフリキシマブ療法における患者ごとのインフリキシマブ投与の有効性を判定でき、より的確な投与方法や投与量の設定が可能になることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性の判定方法。
２）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性を判定するためのキット。
３）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドを含む上記２）のキット 。
４）前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４から選ばれる１以上の遺伝子多型の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー又は、当該遺伝子多型部位を含む領域に結合するプローブである上記３）のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の判断方法を臨床検査等に利用することにより、治療における投与開始時点において薬剤の有効性を患者ごとに決めることができる。この方法によれば、インフリキシマブの過剰な投与を防止し、患者の身体への負担や治療費の削減が可能となる。また、関節リウマチ患者を、患者ごとにより早く有効な薬剤での治療へ導くことが出来、関節リウマチの進展を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
インフリキシマブは、関節リウマチ治療薬として、非ステロイド性抗炎症剤及び抗リウマチ薬（メトトレキサート製剤を含む）等の既存治療で効果不十分な患者に適用される。現在、日本においては、添付文書及び厚生労働省のインフリキシマブ研究班のガイドラインにより、インフリキシマブ３mg/kgを生理食塩水に溶解し、緩徐に（２時間以上かけて）点滴静注すること、初回投与の後、２週後、６週後に追加投与を行い、以後８週間毎に投与を継続することが決められている。
【００１１】
本発明におけるインフリキシマブの有効性の判定は、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することにより行われる。
判定は、これらの遺伝子多型それぞれを単独で検出して行うことが可能であるが、複数を組み合わせて判定するのが判定精度を上げる点で好ましい。少なくとも、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７を含めることがより好ましい。
【００１２】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７は、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子（インターロイキン−１０レセプターＢ（interleukin-10 receptor B：IL10RB））のエクソン２に位置するＩＬ１０ＲＢの４７番目のアミノ酸をコードする塩基に関する多型であり、頻度が多い方のアレル（メジャーアレル）が「Ｇ」であり、メジャーアレル以外のアレル（マイナーアレル）が「Ａ」である。メジャーアレル（「Ｇ」）の時の４７番目のアミノ酸はグルタミン酸であるが、マイナーアレル（「Ａ」）の時のアミノ酸はリジンである。
従って、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７には、ホモ接合体Ａ／Ａ及びＧ／Ｇと、ヘテロ接合体Ａ／Ｇの３つの型が存在する。
実施例２に示すとおり、５４週間投与（３ｍｇ／ｋｇ×８回）のインフリキシマブ療法で、ＡＣＲ（American College of Rheumatology）コアセット（Felson, D.T. et al. American College of Rheumatology preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 38: 727-735, 1995）がＡＣＲ２０以上の改善群と、改善がみられなかった無効群を比較した結果、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が高い（インフリキシマブ感受性）、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が低い（インフリキシマブ非感受性）、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ感受性とインフリキシマブ非感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００１３】
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２は、ＩＲＦ５遺伝子（インターフェロン調節因子−５（interferon regulatory factor 5：IRF5））の５’−フランキング領域に位置する多型であり、メジャーアレルが「Ａ」であり、マイナーアレルが「Ｃ」である。
従って、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２には、ホモ接合体Ａ／Ａ及びＣ／Ｃと、ヘテロ接合体Ａ／Ｃの３つの型が存在する。
実施例３に示すとおり、５４週間投与（３ｍｇ／ｋｇ×８回）のインフリキシマブ療法で、ＡＣＲ５０以上の改善群と、ＡＣＲ２０以下の改善群を比較した結果、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ感受性でありかつ高い改善効果が得られる可能性が高く（インフリキシマブ高感受性）、それ以外の遺伝子型の場合には、インフリキシマブ感受性であっても高い改善効果を得る可能性は低い（インフリキシマブ低感受性）とインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００１４】
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４は、ＩＲＦ５遺伝子の５ｋｂ下流に位置する多型であり、メジャーアレルが「Ａ」であり、マイナーアレルが「Ｇ」である。
従って、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４には、ホモ接合体Ａ／Ａ及びＧ／Ｇと、ヘテロ接合体Ａ／Ｇの３つの型が存在する。
実施例４に示すとおり、５４週間投与（３ｍｇ／ｋｇ×８回）のインフリキシマブ療法で、ＡＣＲ５０以上の改善群と、ＡＣＲ２０以下の改善群を比較した結果、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ低感受性、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ高感受性、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ高感受性とインフリキシマブ低感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００１５】
従って、インフリキシマブ感受性の被験者には、投与回数の減少や投与量を低下することにより、副作用の軽減を図ることができ、一方、インフリキシマブ非感受性或いはインフリキシマブ低感受性の被験者には、インフリキシマブの投与量の増加や投与間隔の短縮あるいは代替薬物への変更を検討することが可能となる。
かように、上記の遺伝子多型の検出は、関節リウマチ患者にとって、治療方法・治療薬を選定する上で重要な情報となる。
【００１６】
上記多型を核酸レベルで検出する方法は、特に制限はなく、当業者にとって公知の方法の中から選択することができる。
例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＡＳＯ（allele-specific oligonucleotide）法、直接シークエンス法、ＲＦＬＰ法、インベーダー法、ＴＧＧＥ、ＤＧＧＥ法、ＭｕｔＹ酵素法、マイクロアレイ、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＰＴＴ）法、Ｓｎｉｐｐｅｒ法等が挙げられ、目的等に応じて選択することができる。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、アレル特異的なＴａｑｍａｎ プローブとＴａｑ ポリメラーゼを用い、遺伝子多型の検出と該遺伝子多型を含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。Ｔａｑｍａｎ プローブは、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャーで標識されている約２０塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的の遺伝子多型部位にハイブリダイズするよう設計されている。Ｔａｑポリメラーゼは、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する。これらのＴａｑｍａｎプローブ及びＴａｑポリメラーゼ存在下において、目的の遺伝子多型を含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該遺伝子多型領域を増幅すると、増幅と並行して、Ｔａｑｍａｎプローブが鋳型ＤＮＡの目的遺伝子多型部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑｍａｎ プローブに到達すると、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、Ｔａｑｍａｎプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、遺伝子多型の検出が可能となる。
【００１７】
核酸を複製又は増幅する公知の方法は、ＰＣＲ法を応用した方法が多いが、ＰＣＲ法によらない方法もある。例えば、Ｓｎｉｐｐｅｒ法、ＵＣＡＮ法やＬＡＭＰ法を利用した遺伝子多型タイピング方法が挙げられる。
【００１８】
本発明のインフリキシマブの有効性を判定するためのキットは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出するものであり、具体的には、当該遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドを含むものである
当該ポリヌクレオチドは、各遺伝子多型部位を含む領域を含むものであればよく、一般にオリゴヌクレオチドと言われる長さのものが包含されるが、好ましくは１０塩基長以上、より好ましくは１０〜５０塩基長のポリヌクレオチドがより好ましい。
当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また当該ポリヌクレオチドは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質で標識されていてもよい。
【００１９】
上記ポリヌクレオチドは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型のいずれかを含む領域を増幅するためのプライマー、上記遺伝子多型部位のいずれかを含む領域に結合するためのプローブとして使用される。
そのため上記ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型のいずれかを検出する検出用ポリヌクレオチドは、当該ゲノム遺伝子の一部と相補的な配列を含むものであるが、当該遺伝子とは無関係な任意の配列が含まれていてもよい。
【００２０】
上記ポリヌクレオチドをプライマーとする場合、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。増幅する領域の長さは、遺伝子多型タイピングに支障がない限り制限はない。一般には１５−１０００塩基長、より好ましくは５０−５００塩基長程度を増幅するが、検出方法に従って適宜増減できる。また、増幅される領域の一部には遺伝子多型部位が含まれるが、増幅される領域内における遺伝子多型部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置することができる。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーと遺伝子多型部位との位置関係は、検出方法にあわせて変更することができ、検出しようとする遺伝子多型を含むＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型の一部領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計することができる。ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型検出用プライマーの長さは、通常１５−５０塩基長、好ましくは１５−３０塩基長であるが、タイピング方法によってはこれより長くてもよい。
【００２１】
また上記ポリヌクレオチドをプローブとする場合は、プローブが遺伝子多型部位を認識するように設計する。プローブ設計において、遺伝子多型部位は、タイピング方法にあわせ、プローブ内のいずれかの場所で認識されればよく、タイピング方法によっては、プローブの末端で遺伝子多型部位が認識されてもよい。この場合、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、１５−２００塩基長であれば良く、より好ましくは１５−１００塩基長、さらに好ましくは１５−５０塩基長であるが、タイピング方法によってはこれより長くても短くてもよい。
【００２２】
各遺伝子多型を検出するための上記ポリヌクレオチドは、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型の塩基配列をもとに、プライマー又はプローブの別及び適応する検出方法に合わせて、任意の方法によって合成することができる。すなわち、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の各遺伝子多型のゲノムＤＮＡ、及び公知遺伝子多型の位置情報に基づいて、公知手段により、当該塩基配列を有するポリヌクレオチドを合成することができる。更に、公知の手法に基づき、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、ポリヌクレオチドに任意の修飾を導入する方法や、合成されたポリヌクレオチドに、蛍光色素などを結合することも可能である。
【００２３】
本発明のインフリキシマブの有効性を判定するためのキットには、上記の各遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドの他に、遺伝子多型タイピングに際して通常用いられる試薬類（例えば、デオキシヌクレオチド３リン酸（dNTPs）やDNAポリメラーゼ、緩衝液等）や陽性コントロール等を含むことができる。
【００２４】
本発明のインフリキシマブの有効性判定方法において、各遺伝子の遺伝子多型を検出するために供する試料は、被験者から採取した生物学的試料をもとに、当業者に周知の方法で調製したDNA試料を用いることができる。
被験者から採取する生物学的試料に特に制限はなく、例えば、血液、毛髪、便、尿、唾液、細胞などを用いることができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１ 被験者及び方法
インフリキシマブ治療を受けた３３例の関節リウマチ患者（以下、ＲＡとする）について、採血を行い、末梢血を原料とし、Quick Gene kit（Fuji Film社）を使用して、染色体DNAを抽出した。
そして、同患者の３０週、５４週におけるＡＣＲ改善度（ＡＣＲコアセット）＜参考文献：Felson, D.T. et al. American College of Rheumatology preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 38: 727-735, 1995）＞と、ＨＬＡ-ＤＲＢ１遺伝子、ＩＲＦ５遺伝子、ＩＬ１０遺伝子、及びＩＬ１０ＲＢ遺伝子の多型との関連を解析した。解析は、χ2検定、フィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）又はアーミテージの傾向検定（Armitage's trend test）を用いて行った。
【００２６】
実施例２ ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７
（１）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７の増幅反応
抽出した染色体ＤＮＡ４０ｎｇを鋳型として、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｐｍｏｌ各プライマー及び１ｕｎｉｔ ＴａＫａＲａ ｒＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ製）を加え、２５μＬの反応液を調製した。ＰＣＲ反応装置はＧｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドシステムズ社製）を用い、９３℃、３分の前処理の後、熱変性９３℃、３０秒、アニーリング６０℃、３０秒及び伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７を含む遺伝子断片を増幅するプライマーを以下に示す。
Forward primer CACGTGGCCTTTGAAGACATGG（配列番号１）
Reverse primer GCCACGAGAATTTCCCAGACAG（配列番号２）
【００２７】
（２）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７の遺伝子型の検出
５μＬのＰＣＲ増幅産物とアルカリ変性用溶液（湧永製薬製）５μＬとを混合し、室温で５分間、放置した。ハイブリダイゼーション用溶液（ハイブリダイゼーション溶液、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン、Ａアリル検出用プローブ固相化Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ及びＧアリル検出用プローブ固相化Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ（湧永製薬製））２５μＬを加え、５５℃で３０分間、ハイブリダイゼーションを行った。７５μＬの洗浄液（湧永製薬製）を加え、３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、スナッピングにより上清を除いた。７５μＬの洗浄液（湧永製薬製）を加え、Ｌｕｍｉｎｅｘ−１００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ製）を用いて、各Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにおける蛍光値の測定を行った。各検出用プローブの蛍光値が５００以上である場合を陽性と判定し遺伝子型の決定をした。
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７を検出するためのプローブを以下に示す。
Ａアレル検出用 CTTTTGCCAAAGGGAACC（配列番号３）
Ｇアレル検出用 CTTTTGCCGAAGGGAACC（配列番号４）
【００２８】
（３）ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７とインフリキシマブの有効性
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７の遺伝子型頻度をＡＣＲ２０以上の達成群と改善が見られなかった無効群とで比較を行ったところ、無効群においてＡ／Ａ遺伝子型の有意な増加が認められた。５４週における遺伝子型と改善度の結果は、表１に示される通りであった。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１に示されるように、インフリキシマブ治療を受けＡＣＲ２０以上の改善が見られなかった患者群においてはＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７のＡ／Ａ遺伝子型の頻度が高くなっているのに対し、改善群にはＡ／Ａ遺伝子型が存在しなかったことから、本遺伝子型がインフリキシマブ有効性に有意に関連していることが明らかとなった。
これより、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が高い（インフリキシマブ感受性）、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブの有効性が低い（インフリキシマブ非感受性）、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ感受性とインフリキシマブ非感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００３１】
実施例３ ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２
（１）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２の遺伝子型の検出
アプライドバイオシステムズ社製のＴａｑＭａｎ試薬を用いて遺伝子型の決定を行った。
【００３２】
（２）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２とインフリキシマブの有効性
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２の遺伝子型頻度をＡＣＲ５０以上を達成した有効群とＡＣＲ２０あるいはそれ未満の無効群とで比較を行ったところ、遺伝子型頻度に有意差が認められた。５４週における遺伝子型と改善度の結果は、表２に示される通りであった。
【００３３】
【表２】
【００３４】
インフリキシマブ治療を受けＡＣＲ２０及びＡＣＲ５０を達成した患者群においては、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２のＡ／Ａ遺伝子型が増加していた。
これにより、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ感受性でありかつ高い改善効果が得られる可能性が高く（インフリキシマブ高感受性）、それ以外の遺伝子型の場合にはインフリキシマブ感受性であっても高い改善効果を得る可能性は低い（インフリキシマブ低感受性）とインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【００３５】
実施例４ ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４
（１）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の増幅反応
抽出した染色体ＤＮＡ２０ｎｇを鋳型として、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｐｍｏｌ各プライマー及び０．２５ｕｎｉｔ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステムズ）を加え、１０μＬの反応液を調製した。ＰＣＲ反応装置はＧｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドシステムズ社製）を用い、９６℃、１０分の前処理の後、熱変性９６℃、３０秒、アニーリング６０℃、３０秒及び伸長反応７２℃、３０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４を含む遺伝子断片を増幅するプライマーを以下に示す。
Forward primer GCTGCAATTGGAAGAAGAGGG（配列番号５）
Reverse primer TGATGTGGATTGGAAGTGGA（配列番号６）
【００３６】
（２）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の遺伝子型の検出
増幅産物をテンプレートとしたダイレクトシークエンシング法によって塩基配列の確認を行い、遺伝子型を決定した。
【００３７】
（３）ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４とインフリキシマブの有効性
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４の遺伝子型頻度をＡＣＲ５０以上を達成した有効群とＡＣＲ２０あるいはそれ未満の無効群とで比較したところ、遺伝子型頻度に有意差が認められた。５４週における遺伝子型と改善度の結果は、表３に示される通りであった。
【００３８】
【表３】
【００３９】
ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４のＡ／Ａ遺伝子型は、ＡＣＲ２０及びそれ未満のインフリキシマブ抵抗群に増加していた。
これより、Ａ／Ａ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ低感受性、Ｇ／Ｇ遺伝子型の場合にはインフリキシマブ高感受性、Ａ／Ｇ遺伝子型の場合にはその患者のインフリキシマブ高感受性とインフリキシマブ低感受性である確率が中間であるとインフリキシマブ療法の可能性を予測できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の判定方法を用いることにより、治療における投与開始時点での有効性を患者ごとに決めることができる。この方法により、インフリキシマブの過剰な投与を防止し、患者の身体への負担や治療費の削減が可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性の判定方法。
【請求項２】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性を判定するためのキット。
【請求項３】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドを含む請求項２記載のキット 。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４から選ばれる１以上の遺伝子多型の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー又は当該多型部位を含む領域に結合するプローブである請求項３記載のキット。
【請求項１】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性の判定方法。
【請求項２】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする関節リウマチ患者におけるインフリキシマブの有効性を判定するためのキット。
【請求項３】
ＩＬ１０ＲＢ遺伝子のｒｓ２８３４１６７多型、ＩＲＦ５遺伝子のｒｓ７２９３０２多型、及びＩＲＦ５遺伝子のｒｓ２２８０７１４多型から選ばれる1以上の遺伝子多型を検出するためのポリヌクレオチドを含む請求項２記載のキット 。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、ＩＬ１０ＲＢ遺伝子多型ｒｓ２８３４１６７、ＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ７２９３０２、及びＩＲＦ５遺伝子多型ｒｓ２２８０７１４から選ばれる１以上の遺伝子多型の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー又は当該多型部位を含む領域に結合するプローブである請求項３記載のキット。
【公開番号】特開２００９−２２５７１３（Ｐ２００９−２２５７１３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７４２８８（Ｐ２００８−７４２８８）
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（０００２５０１００）湧永製薬株式会社 (51)
【Ｆターム（参考）】
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