インフルエンザに対する新規ワクチン組成物
チオマーサルの非存在下、または低レベルのチオマーサルで安定化される血球凝集素抗原を含む不活化インフルエンザウイルス調製物が記載され、その血球凝集素はＳＲＤアッセイにより検出可能である。インフルエンザウイルス調製物は、血球凝集素を安定化させるのに十分な量のミセル修飾賦形剤、例えばα−トコフェロールまたはその誘導体を含んでもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年１０月１８日に出願された同時係属米国特許出願第１１／８７４，６４７号の一部係属出願であり、その出願は２００４年６月２２日に出願された特許出願第１０／４８０，９５２号、現米国特許第７，３１６，８１３号（これは２００２年５月２９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ０２／０５８３３の３７１である）であり、それらの内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれている。本出願はまた、２００１年５月３０日に出願された英国特許出願第０１１３０８３．０号および２００２年２月２１日に出願された英国特許出願第０２０４１１６．８号のより早い出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、新規インフルエンザウイルス抗原調製物、それらを調製するための方法、およびヒト被験体の予防または治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、全ウイルスワクチンというよりむしろ、破壊され、有機水銀防腐剤の非存在下で安定である、不活化インフルエンザワクチンに関する。更に、そのワクチンは標準検査に従って安定している赤血球凝集素を含有する。本発明は更に、小児の免疫化における水銀防腐剤を含まないインフルエンザ免疫原性組成物の使用に関する。水銀防腐剤を含まないインフルエンザ免疫原性組成物は、有機水銀防止剤を含有している組成物と比べて小児集団においてより高い免疫反応を誘発する。そのワクチンは、筋肉内、皮下、皮内、または粘膜、例えば鼻腔内などの、そのようなワクチンに適切な任意の経路によって投与できる。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザウイルスはヒトと家畜の両方に影響を及ぼす、世界中に存在する最も偏在的なウイルスの一つである。インフルエンザの経済的影響は大きい。インフルエンザウイルスは温帯地域においては最も冬に、また熱帯地域においては１年中、流行する。インフルエンザＡ型およびＢ型は、表面糖タンパク質の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を保有し、それらは、抗原連続変異としても知られている、点突然変異のプロセスにおいて年々進化している。インフルエンザウイルスのこの継続した変化により、それらは宿主免疫系を逃れることができ、この理由のために、季節性インフルエンザワクチン接種が毎年繰り返されなければならない。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、直径約１２５ｎｍの粒径を有するＲＮＡエンベロープウイルスである。それは基本的に、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープによって取り囲まれた、内部ヌクレオカプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は主にマトリクスタンパク質で、その外層の殆どは宿主由来の脂質物質から構成されている。表面糖タンパク質ノイラミニダーゼ（ＮＡ）および赤血球凝集素（ＨＡ）は、粒子の表面で長さ１０〜１２ｎｍのスパイクのように見える。インフルエンザのサブタイプの抗原特異性を確定するのは、これらの表面タンパク質、特に赤血球凝集素である。
【０００５】
現在利用可能なインフルエンザワクチンは不活化インフルエンザワクチンまたは生の弱毒化したインフルエンザワクチンのいずれかである。不活化インフルエンザワクチンは、３つの可能な形態の抗原調製物：不活化全ウイルス、精製されたウイルス粒子が脂質エンベロープを可溶化させるように洗浄剤もしくは他の試薬で破壊されたサブビリオン（いわゆる「スプリット」ワクチン）、または精製されたＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）から構成されている。これらの不活化ワクチンは筋肉注射（ｉ．ｍ．）や鼻腔内注射（ｉ．ｎ．）で投与される。生の弱毒化されたワクチンは市販されていない。
【０００６】
あらゆる種類のインフルエンザワクチンは大抵、三価ワクチンである。それらは通常、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのインフルエンザＢ型株に由来する抗原を含有する。標準的な０．５ｍｌの注射用量は、ほとんどの場合、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）により測定した場合、各株に由来する１５μｇの赤血球凝集素抗原成分を含んでいる（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ：ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｃｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１）３１７−３３０）。
【０００７】
各シーズンにインフルエンザワクチンに組み込まれるインフルエンザウイルス株は、国立保険機関およびワクチン製造業者と共同して、世界保健機構によって決められる。
【０００８】
典型的なインフルエンザの流行は、入院患者数や死亡者数の増加率から見られる通り、肺炎および下部呼吸器疾患の発生率の増加を引き起こしている。高齢者や慢性の基礎疾患のある人々は、合併症を引き起こす可能性が高く、年少乳児もまた重症疾患を患う場合がある。インフルエンザが小児に顕著な影響をもたらすという証拠が増えてきている。インフルエンザの最も高い発病率は小児で発生し、インフルエンザに関係した発病率はこの年齢層で最も高い。小児はまた、ウイルスからの最も高い発病率を被るのでインフルエンザの主な伝達者であると考えられており、最も高い鼻咽頭ウイルス力価を有し、より長い期間のウイルス排出を示す。従って、インフルエンザに対する小児のワクチン接種は、疾患と関連する深刻な発病率を防ぎ、また、「群効果」にも影響を及ぼすことができ、社会に対してインフルエンザの影響を減少させる。小児自身の健康、彼らの家庭内での接触、およびより広いコミュニティーに対するワクチン接種の直接的効果以外に、関係する大きな経済的要因も存在する。実際、インフルエンザに関連した発病率は、顕著な常習的欠席率および生産力の低下に関与している。従って、特にこれらの群は保護される必要がある。
【０００９】
毎年のインフルエンザ流行に関連する発病率および死亡率を抑制する現在の試みは、筋肉内に投与される不活化インフルエンザワクチンの使用に基づく。呼吸器系疾患およびインフルエンザ合併症を防ぐ際のこのようなワクチンの効果は、健康な成人で７５％から高齢者で５０％未満に及ぶ。
【００１０】
インフルエンザワクチンの効果を測定するための基準が国際的に適用されている。インフルエンザに対する効果的なワクチンについての欧州連合公的基準は、下記の表に示されている。欧州連合の条件を満たすためには、理論上は、ワクチンに含まれるインフルエンザの全ての株に対し、インフルエンザワクチンがその表の基準の１つのみを満たさなければならない。しかし実際のところは、その基準の少なくとも２つまたは３つ全てが全ての株、特に異なる経路を介して送達する新規ワクチンなどの新しいワクチンに満たされる必要がある。一部の状況下では、２つの基準が十分であり得る。例えば、３つの基準のうちの２つが全ての株により満たされなければならないのに対して、３番目の基準は全ての株でなく一部の株（例えば３つの株のうち２つ）により満たされるように適用されてもよい。必要条件は、成人集団（１８−６０歳）と高齢者集団（＞６０歳）とでは異なる。
【００１１】
＊セロコンバージョン率は、各ワクチン株についてのワクチン接種後に、血清血球凝集素阻害（ＨＩ）力価が少なくとも４倍増加したワクチン接種者の割合と定義される、
＊＊コンバージョン係数は、各ワクチン株についてのワクチン接種後に、血清ＨＩ幾何平均力価（ＧＭＴ）の倍の増加と定義される、
＊＊＊防御率は、（各ワクチン株についての）ワクチン接種後に、１：４０に等しいか、またはそれよりも高い血清ＨＩ力価を有するワクチン接種者の割合と定義され、通常、防御を示すものとして承認されている。
【００１２】
ＦＤＡは、わずかに異なる年齢カットオフポイントを使用しているが、それらの基準はＣＨＭＰ基準に基づいている。適切な指標は、１）ＨＩ抗体力価≧１：４０を達成している被験体の割合、および２）ワクチン接種後のＨＩ抗体力価において４倍増加と定義されたセロコンバージョン率を同様に含む。幾何平均力価（ＧＭＴ）はその結果に含まれなければならないが、そのデータは、推定値だけではなくセロコンバージョンの発生率の９５％信頼区間の下限も含まなければならず、４２日目のＨＩ力価≧１：４０の発生率は、目標値を上回らなければならない。従って、これらのデータおよびこれらの評価の推定値の９５％信頼区間（ＣＩ）が規定されるべきである。ＦＤＡドラフトガイダンスは、両方の目標を達成するよう求めている。これを表１Ｂにまとめる。
【００１３】
＊セロコンバージョン率は、ａ）基礎力価≧１：１０の被験体に関して、４倍もしくはそれ以上の増加、またはｂ）基礎力価＜１：１０の被験体に関して、≧１：４０の増加と定義される。これらの基準は、真値について９５％ＣＩの下限で満たされなければならない。
【００１４】
商業的に有用である新規インフルエンザワクチンに関して、これらの基準を満たすことが必要とされるだけではなく、実際には、現在利用可能な注射ワクチンと、少なくとも同程度有効である必要がある。また、求められる抗原の量および投与数の観点から、商業的に実現可能である必要がある。
【００１５】
現在市販されているインフルエンザワクチンは注射可能なスプリットまたはサブユニットワクチンのいずれかである。これらのワクチンは一般に有機溶媒または洗浄剤を用いてウイルス粒子を破壊し、種々の程度までウイルスタンパク質を分離または精製することによって調製される。スプリットワクチンは、可溶化濃度の有機溶媒または洗浄剤を用いて、感染性または不活化されたいずれかの全インフルエンザウイルスを断片化し、その後、可溶化剤および一部またはほとんどのウイルス脂質物質を除去することによって調製される。スプリットワクチンは一般に汚染しているマトリクスタンパク質および核タンパク質および一部の場合、脂質、ならびにエンベロープ膜タンパク質を含有する。スプリットワクチンは通常ほとんどまたは全てのウイルス構造タンパク質を含有するが、それらは全ウイルスで生じるものと必ずしも同じ割合ではない。市販のスプリットワクチンの例は、例えばＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）、またはＦＬＵＺＯＮＥ（商標）である。
【００１６】
他方でサブユニットワクチンは、必要に応じて、ワクチン接種の際に所望のウイルス中和抗体を誘発するのに関与する表面タンパク質である、ノイラミニダーゼと共に高度に精製されたウイルス表面タンパク質である、血球凝集素から実質的になる。サブユニットワクチンは全ビリオンワクチン以上のさらなる利点を有し得る。なぜならそれらは一般に特に若いワクチン接種者において反応原性が低いからである。サブユニットワクチンは、組換えにより製造され得るか、または破壊されたウイルス粒子から精製され得る。市販のサブユニットワクチンの例は、例えばＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、またはＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）である。特定の実施形態において、サブユニットワクチンは、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、またはＭ２、好適にはＨＡからなどの少なくとも１つの主要なエンベロープ成分から調製される。好適には、それらは、インフルエンザ構造タンパク質ＨＡ、ＮＡ、マトリクス１（Ｍ１）およびＭ２のうちの少なくとも２つの組み合わせ、好適には必要に応じてＭ１を含む、ＨＡおよびＮＡの両方の組み合わせなどの２つの抗原またはそれ以上の組み合わせを含む。好適には、インフルエンザ成分は組換えＤＮＡ技術によって製造される。すなわち、生の組換えベクター（ワクチニア）または組換えサブユニットタンパク質（バキュロウイルス／昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、酵母、植物または細菌）を含む、組換えＤＮＡ操作から得られる核酸から得られるか、またはそれらから発現される。好適な昆虫細胞はスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）昆虫細胞またはキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）から開発されたハイファイブ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）（Ｈｉ５）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、好適なバキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）またはいわゆるＢａｃｍｉｄ系である。
【００１７】
一実施形態において、インフルエンザウイルス調製物はビロソームの形態である。ビロソームは、ビロソームのリン脂質二重層膜に挿入された、真正の構造において機能的ウイルスエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡを保有する球状の単層ベシクルである。市販のビロソームワクチンの例は、例えばＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（商標）、またはＩＮＶＡＶＡＣ（商標）である。別の実施形態において、サブユニットインフルエンザ成分は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはカプソメア、好適には植物製または昆虫細胞製のＶＬＰの形態で発現される。ＶＬＰはそれらの天然形態で抗原を提示する。ＶＬＰサブユニット技術は、完全にインフルエンザタンパク質に基づき得るか、またはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他のウイルスに依存し得るので、ＭＬＶ ｇａｇタンパク質などの非インフルエンザ抗原を含み得る。好適なＶＬＰは、少なくとも１つ、好適には少なくとも２つのインフルエンザタンパク質を、必要に応じてＭ１およびＨＡ、ＨＡおよびＮＡ、ＨＡ、ＮＡおよびＭ１またはＨＡ、ＮＡおよびＭＬＶ ｇａｇなどの他のインフルエンザまたは非インフルエンザタンパク質と共に含む。それは植物細胞または昆虫細胞のいずれかにおいて生成され得る。ＶＬＰはまた、例えば２つの季節性株（例えばＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）から、または１つの季節性株および１つの流行性株（例えばＨ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１）から作製されるＶＬＰなどの１つより多いインフルエンザ株由来の抗原を保有し得る。
【００１８】
市販されている多くのワクチンは劣化を防止するために防腐剤を必要とする。頻繁に使用される防腐剤は、水銀を含有する化合物であるチオマーサルである。水銀を含有する化合物の作用について一部の社会的関心が示されている。神経系が発達するときの中等量の有機水銀化合物に対する低い作用を検出するための所定の監視システムは存在せず、高用量の有機水銀化合物を受けている小児の特別な研究は完了するのに数年かかる。特定の解説者は、チオマーサルを含有するワクチンの潜在的危険性が誇張して述べられなければならないと強く主張している（Ｏｆｆｉｔ；Ｐ．Ａ．ＪＡＭＡ Ｖｏｌ．２８３；Ｎｏ：１６）。それにも関わらず、製造プロセスにおいてチオマーサルの使用に代わるワクチンを調製するための代替の方法を見出すことは有益である。従って、チオマーサルを含まない、特に年間ベースで少なくとも特定の集団群に関して推奨されるインフルエンザワクチンなどのワクチンであるワクチンを開発する必要がある。
【００１９】
今まで、製造／精製プロセスの間および／または最終ワクチンにおいて市販の不活化インフルエンザワクチンのために防腐剤を利用することが標準的に実施されてきた。防腐剤は、微生物が種々の精製段階を通して増殖するのを防止するために必要とされる。卵から誘導されたインフルエンザワクチンに関して、チオマーサルは典型的に生の尿膜腔液に加えられ、ウイルスの処理の間にも２回目が加えられ得る。従って、プロセスの終わりにおいて残留チオマーサルが存在し、これはさらに最終ワクチンにおいて望ましい防腐剤濃度、例えば約１００μｇ／ｍｌの濃度に調節され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
インフルエンザワクチンにおける防腐剤としてのチオマーサルの使用の副作用は安定化作用である。市販のインフルエンザワクチンにおけるチオマーサルは、特にＢ型株インフルエンザのＨＡに限らないが、ワクチンのＨＡ成分を安定化する作用がある。特定のＡ型株血球凝集素、例えばＨ３もまた、安定化を必要とし得る。従って、インフルエンザワクチンからチオマーサルを除去すること、または最終ワクチンにおいてチオマーサルの濃度を少なくとも減少させることを考慮することが望まれ得るが、チオマーサルを含まないと、ＨＡが十分に安定でなくなることを克服しなければならないという課題が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
有機水銀化合物を含有しない代替の試薬を用いた不活化インフルエンザ調製物においてＨＡを安定化させることができることが本発明において発見された。ＨＡは安定したままであり、それは標準的な定量的方法、特にＳＲＤによって、安定化賦形剤を含まない同じ方法によって製造された安定化していない抗原調製物より高い程度で長時間にわたって検出可能である。ＳＲＤ法は本明細書上記のように実施される。重要なことには、ＨＡは、最終インフルエンザワクチンについて標準的に必要とされる１２ヶ月間まで安定したままである。
【００２２】
また、驚くべきことに、水銀防腐剤を含まないインフルエンザワクチンは、小児において顕著に改善された免疫反応を誘発することを見出した。チオマーサルを含有するインフルエンザワクチンと比較して、チオマーサルを含まないワクチンは、小児において、試験した全てに株について、より高い抗体力価（ＧＭＴ）を誘発し、特にＨ１Ｎ１インフルエンザ株について効果が特別顕著であった。さらに、成人におけるインフルエンザワクチンの免疫原性評価についての３つのＣＨＭＰ基準を、ＴＦ群において６〜３５ヶ月齢の小児および３６ヶ月〜６歳未満の小児の両方でのみ満たした。対照群において、ＳＣＲおよびＳＣＦ基準のみを両方の年齢群で満たした。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】標準的な血球凝集素アッセイ（ＨＩ）を用いて評価した、ワクチン接種によって誘発された抗体力価を示す。
【図２】種々の抗原用量で抗原刺激し、皮内経路によって３μｇの三価インフルエンザ抗原＋（プラス）または−（マイナス）チオマーサルでワクチン接種したブタにおいて誘発された抗インフルエンザ血球凝集素阻害力価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
第１の態様において、本発明は、チオマーサルの非存在下、または低レベルのチオマーサルで安定化される血球凝集素抗原を含み、その血球凝集素がＳＲＤアッセイにより検出可能である、不活化インフルエンザウイルス調製物を提供する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、ヒト、特に小児において免疫反応を上昇させる方法であって、小児に、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性の不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、小児を免疫化するのに使用するための水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物であって、前記組成物は、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、前記水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物を提供する。
【００２７】
第３の実施形態において、本発明は、インフルエンザに対して小児を免疫化するための水銀防止剤を含まない免疫原性組成物の製造において、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物の使用を提供する。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない小児用免疫原性組成物、特にワクチンを提供する。特に、前記組成物またはワクチンの用量体積は０．２〜０．４５ｍｌの間である。
【００２９】
低レベルのチオマーサルは、そのレベルにおいてインフルエンザＢ型由来のＨＡの安定性が低下するレベルであり、その結果、安定化賦形剤がＨＡを安定化させるのに必要とされる。低レベルのチオマーサルはほぼ５μｇ／ｍｌまたはそれ未満である。
【００３０】
一般に、安定化したＨＡとは、同様の方法であるが、安定化賦形剤を全く有さずに生成された非安定化抗原調製物より高い程度で、標準的な定量的方法、特にＳＲＤによって長時間にわたって検出可能なＨＡを指す。ＨＡの安定化は好ましくは、１年間にわたって実質的に一定なＨＡの活性を維持する。好ましくは、安定化により、ＨＡを含むワクチンは、６ヶ月の保存期間、より好ましくは１年間の後でも許容可能な予防を与えることができる。
【００３１】
好適には、安定化は、安定化賦形剤、好ましくミセル修飾賦形剤により実施される。ミセル修飾賦形剤は一般に、膜タンパク質ＨＡを可溶化するのに使用される、または適した洗浄剤により形成されるミセル内に組み込まれ得る賦形剤、例えば個々にまたは組み合わせた洗浄剤Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびデオキシコール酸塩である。
【００３２】
理論により束縛されることを望まずに、賦形剤の作用は、最終調製物における脂質、洗浄剤および／またはタンパク質との相互作用により、ＨＡを安定化させると考えられる。Ｔｗｅｅｎおよびデオキシコール酸塩と残留脂質および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００とのミセルなどの賦形剤とタンパク質および脂質との混合ミセルが形成され得る。表面タンパク質はそれらの複合体ミセルにより安定化を維持すると考えられる。好ましくは、タンパク質凝集は、負に帯電している洗浄剤を含有するミセルなどの適切な賦形剤を含有するミセルの電荷斥力により制限される。
【００３３】
適切なミセル修飾賦形剤としては、アルキル硫酸塩、またはアルキル−アリール−硫酸塩などの正に、負にまたは両性イオンに荷電した両親媒性分子、アルキルポリグリコシドまたはその誘導体などの非イオン性両親媒性分子、例えばプランタケア（Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ）（登録商標）（Ｈｅｎｋｅｌ ＫＧａＡから入手可能である）、またはアルキルアルコールポリアルキレンエーテルもしくはその誘導体、例えばラウレス（Ｌａｕｒｅｔｈ）−９が挙げられる。
【００３４】
好ましい賦形剤は、α−トコフェロール、またはα−トコフェロールコハク酸エステルなどのα−トコフェロールの誘導体である。本発明に使用するための他の好ましいトコフェロール誘導体としては、Ｄ−αトコフェロール、Ｄ−δトコフェロール、Ｄ−γトコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールが挙げられる。使用され得るトコフェロールの好ましい誘導体としては、酢酸エステル、コハク酸エステル、リン酸エステル、ホルメート（ｆｏｒｍｉａｔｅ）、プロピオネート、ブチレート、スルフェートおよびグルコネートが挙げられる。α−トコフェロールコハク酸エステルが特に好ましい。α−トコフェロールまたは誘導体は、血球凝集素を安定化させるのに十分な量で存在する。
【００３５】
他の適切な賦形剤は、当該技術分野において標準的な方法により識別され得、例えば、本明細書に記載されるような安定性分析のためのＳＲＤ法を用いて試験され得る。
【００３６】
好ましい態様において、本発明は、少なくとも１つの安定なインフルエンザＢ型株血球凝集素抗原を含むインフルエンザウイルス抗原調製物を提供する。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、安定な血球凝集素抗原を調製するための方法であって、安定化ミセル修飾賦形剤、好ましくはα−トコフェロールまたはα−トコフェロールコハク酸エステルなどのその誘導体の存在下で抗原を精製することを含む方法を提供する。
【００３８】
さらに本発明によって、本明細書に記載される抗原調製物を含むワクチンおよび被験体、特に小児においてインフルエンザ感染または疾患を予防する方法であって、被験体に本発明に係るワクチンを投与することを含む方法におけるそれらのワクチンの使用が提供される。
【００３９】
０．５ｍｌのワクチン用量が好適に使用される。小児科集団について、０．５ｍｌ未満のワクチン用量が使用される。好適な用量は、０．２〜０．４５ｍｌの間、または０．２〜０．３ｍｌの間、典型的には約０．２５ｍｌである。用量体積のわずかな適合は、元のバルクサンプルにおけるＨＡ濃度に応じて、または鼻腔内もしくは皮内経路によって与えられるより少ない用量での送達経路に応じて、または標的集団に応じて慣例的になされるだろう（例えば０〜３５ヶ月の間の幼児は０．２５ｍｌのワクチン用量を受けてもよく、３歳からの小児はより高いワクチン用量を受けてもよい）。
【００４０】
別の実施形態において、ワクチン接種をする標的集団は、全ての出生直後から小児までか、または２もしくは３ヶ月齢およびそれ以上、または６ヶ月齢およびそれ以上、特に６〜２３ヶ月齢の小児であり、比較的高いインフルエンザ関連入院率を経験する集団である。他の標的集団は、（ｉ）出生から６ヶ月齢のより若い小児、（ｉｉ）出生から７２ヶ月齢の小児、（ｉｉｉ）３ヶ月齢または６ヶ月齢から３６ヶ月齢未満のより若い小児、（ｉｖ）３６ヶ月齢から６歳未満の小児である。
【００４１】
ワクチンは、皮内、粘膜、例えば鼻腔内、経口、筋肉内または皮下などの任意の適切な送達経路によって投与され得る。他の送達経路は当該技術分野において周知である。
【００４２】
皮内送達が好ましい。皮内送達のための任意の適切なデバイス、例えば米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているものなどの短いニードルデバイスが使用されてもよい。皮内ワクチンはまた、国際公開第９９／３４８５０号および欧州特許第１０９２４４４号（本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているものなどの真皮内へのニードルの効果的な貫通長さを制限するデバイスおよびその機能的等価物により投与されてもよい。また、液体ジェット注射器を介して、または角質層に穴を開け、真皮に届くジェットを生じるニードルを介して真皮に液体ワクチンを送達するジェット注射デバイスも適切である。ジェット注射デバイスは、例えば米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、国際公開第９７／３７７０５号および国際公開第９７／１３５３７号に記載されている。また、皮膚の外層から真皮まで粉末形態でワクチンを加速させる圧縮ガスを使用する弾道粉末／粒子送達デバイスも適切である。加えて、古典的な皮内投与のマントー法（ｍａｎｔｏｕｘ ｍｅｔｈｏｄ）において従来のシリンジが使用されてもよい。しかしながら、従来のシリンジの使用は、高いスキルの技師を必要とするので、高いスキルの使用者を必要とせずに正確な送達を可能にするデバイスが好ましい。
【００４３】
従って、本発明は、被験体におけるインフルエンザ感染または疾患を予防する方法であって、被験体に、本発明に係るインフルエンザワクチンを皮内投与することを含む、方法を提供する。
【００４４】
本発明はまた、本発明に係るワクチンと組み合わせた皮内デバイス、特に例えば国際公開第９９／３４８５０号または欧州特許第１０９２４４４号に開示されるデバイスにも及ぶ。
【００４５】
また、インフルエンザワクチンの製造におけるミセル修飾賦形剤、好ましくは血球凝集素安定剤などのα−トコフェロールまたはその誘導体の使用も提供される。
【００４６】
本発明は特に、排他的ではないが、Ｂ型株インフルエンザ血球凝集素の安定化に適用する。
【００４７】
好ましくは、本発明の安定化されたＨＡは、６ヶ月間、より好ましくは１２ヶ月間、安定である。
【００４８】
好ましくは、α−トコフェロールは、エステル、より好ましくはコハク酸エステルまたは酢酸エステル、最も好ましくはコハク酸エステルの形態である。
【００４９】
α−トコフェロールまたは誘導体についての好ましい濃度は、１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの間である。
【００５０】
本発明に係るワクチンは一般に、典型的には２つのＡ型株と１つのＢ型株の三価組成物中にＡ型およびＢ型株ウイルス抗原を含有する。しかしながら、二価および一価ワクチンは除外されない。四価ワクチン、特に、（ｉ）２つのＡ型株（例えばＨ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１）および２つのＢ型株の異なる系統（例えばＢ／ＹａｍａｇａｔａおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、（ｉｉ）３つのＡ型株（例えばＨ３Ｎ２、２つのＨ１Ｎ１；またはＨ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１）および１つのＢ型株を含むワクチンもまた考慮される。一価ワクチンは、例えば可能な限り迅速に製造され、投与される多くのワクチンを得ることが重要である、世界的大流行の状況において有益であり得る。
【００５１】
免疫原性組成物中のＨＡ成分は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９からなる群より選択され得る。
【００５２】
一実施形態において、免疫原性組成物の各小児用量は、一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）によって測定した場合、インフルエンザ株につき１５μｇのＨＡを含有する（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１）３１７−３３０）。別の実施形態において、１用量当たり１５μｇ未満、好適には１０μｇ未満のＨＡの量と定義される、低用量の血球凝集素（ＨＡ）が使用される。特定の実施形態において、免疫原性組成物の小児用量は、約１０μｇ、例えば５〜１５μｇの間、好適には６〜１４μｇの間、例えば７〜１３μｇの間または８〜１２μｇの間または９〜１１μｇの間、または１０μｇのレベルにて１用量の血球凝集素（ＨＡ）／株を含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇ、例えば１〜９μｇの間、または２〜８μｇの間または好適には３〜７μｇの間または４および６μｇ、または５μｇのレベルにて１用量の血球凝集素（ＨＡ）／株を含む。好適な量は、１．９μｇ、２．５μｇ、３．８μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、または１０μｇのＨＡであるか、またはワクチン組成物が本明細書に定義される有効性基準を満たすように決定される１５μｇ未満の好適な量のＨＡである。有益には、規制基準を満たすことができる１μｇのＨＡ、またはそれ未満（例えば０．５μｇ）のＨＡのＨＡ用量が使用されてもよい。好適な量のＨＡは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４μｇ（ｗ／ｖ）／インフルエンザ株／ヒト用量のいずれかの免疫原性組成物である。前記低用量のＨＡは、有効性についての国際的、例えばＥＵまたはＦＤＡ基準を満たすワクチンを製剤化することが可能であるならば、実際に実用可能である限り低くてもよい。
【００５３】
本発明に使用するための非生インフルエンザ抗原調製物は、スプリットウイルス抗原調製物、サブユニット抗原（組換えにより発現されるかまたは全ウイルスから調製される）、例えばホルムアルデヒド、β−プロピオラクトンで化学的に不活化され得るか、または他の方法、例えばＵ．Ｖにより不活性化、または熱により不活性化され得る不活化全ウイルスからなる群より選択され得る。好ましくは、抗原調製物は、特にスプリットプロセス、その後の表面抗原の精製による、スプリットウイルス調製物、または全ウイルスから調製されるサブユニット抗原のいずれかである。スプリットウイルス調製物が最も好ましい。他の好ましい調製物はサブユニットウイルス調製物である。
【００５４】
好ましくは、インフルエンザウイルス調製物についてまたはインフルエンザウイルス調製物の各株についての血球凝集素抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイによって測定した場合、１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは３〜３００μｇ／ｍｌおよび最も好ましくは約３０μｇ／ｍｌである。
【００５５】
本発明に係るワクチンはさらに、アジュバントまたは免疫刺激剤、例えば限定されないが、任意の供給源からの無毒化されたリピドＡおよびリピドＡの非毒性誘導体、サポニンおよびＴＨ１型反応を刺激できる他の試薬を含んでもよい。
【００５６】
腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）は免疫系の有効な刺激剤であることが長い間知られているが、アジュバントにおけるその使用は、その毒性作用により削減されている。主要な炭水化物群の除去によって生成されるＬＰＳの非毒性誘導体、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および還元末端グルコサミン由来のリン酸塩は、Ｒｉｂｉら（１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐ４０７−４１９）により記載されており、以下の構造：
【化１】
【００５７】
を有する。
【００５８】
ＭＰＬのさらなる無毒化型は、３位の二糖骨格からのアシル鎖の除去から得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれる。それは、英国特許第２１２２２０４Ｂ号に教示されている方法により精製され、調製され得、その参照文献はまた、ジホスホリルリピドＡ、およびその３−Ｏ−脱アシル型の調製を開示している。
【００５９】
３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小粒径を有するエマルションの形態であり、その製造方法は、国際公開第９４／２１２９２号に開示されている。モノホスホリルリピドＡおよび界面活性剤を含む水性製剤は国際公開第９８４３６７０Ａ２号に記載されている。
【００６０】
本発明の組成物中に製剤化される細菌リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製され、処理され得るか、または代替としてそれらは合成され得る。例えば、精製されたモノホスホリルリピドＡはＲｉｂｉら１９８６（上記）に記載されており、サルモネラ種由来の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡは、英国特許第２２２０２１１号および米国特許第４９１２０９４号に記載されている。他の精製および合成リポ多糖も記載されている（Ｈｉｌｇｅｒｓら，１９８６，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９（４）：３９２−６；Ｈｉｌｇｅｒｓら，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６０（１）：１４１−６；および欧州特許第０５４９０７４Ｂ１号）。特に好ましい細菌リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００６１】
従って、本発明に使用され得るＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬの構造と同様であるそれらの免疫刺激剤である。本発明の別の態様において、ＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬの上記の構造に対するサブ部分であるアシル化単糖であり得る。
【００６２】
サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ Ｈ．（１９９６．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２ ｐｐ３６３−３８６）に教示されている。サポニンは、植物および海洋動物界において広く分布しているステロイドまたはトリテルペン配糖体である。サポニンは、振盪すると泡状になるコロイド水溶液を形成し、コレステロールを沈殿させることが示されている。サポニンが細胞膜付近にある場合、それらは、膜において細孔状構造を生じ、それにより膜を破裂させる。赤血球の溶血はこの現象の一例であり、全てではないが、特定のサポニンの性質である。
【００６３】
サポニンは全身投与のためのワクチン中のアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血作用は、当該技術分野において広範囲に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，上記）。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（南アメリカの木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮由来）、およびその画分は、米国特許第５，０５７，５４０号および「Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」，Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）：１−５５；および欧州特許第０３６２２７９Ｂ１号に記載されている。Ｑｕｉｌ Ａの画分を含む、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる微粒子構造は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．，欧州特許第０１０９９４２Ｂ１号、国際公開第９６／１１７１１号、国際公開第９６／３３７３９号）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は、有効な全身アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号および欧州特許第０３６２２７９Ｂ１号に開示されている。全身ワクチン接種研究に使用されている他のサポニンには、ジプソフィラ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）およびサポナリア（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）などの他の植物種由来のものが含まれる（Ｂｏｍｆｏｒｄら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１０（９）：５７２−５７７，１９９２）。
【００６４】
改善された系は、非毒性のリピドＡ誘導体とサポニン誘導体との組み合わせ、特に国際公開第９４／００１５３号に開示されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ、または国際公開第９６／３３７３９号に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされる少ない反応原性組成物を含む。
【００６５】
水中油型エマルション中のＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを含む特に有効なアジュバント製剤は国際公開第９５／１７２１０号に記載されており、好ましい製剤である。
【００６６】
従って、本発明の一実施形態において、無毒性のリピドＡまたはリピドＡの非毒性誘導体でアジュバント化された、より好ましくはモノホスホリルリピドＡまたはその誘導体でアジュバント化された本発明のインフルエンザ抗原調製物を含むワクチンが提供される。
【００６７】
好ましくは、ワクチンはサポニン、より好ましくはＱＳ２１をさらに含む。
【００６８】
好適には、免疫原性組成物はアジュバント化される。好ましくは、製剤は水中油型エマルションをさらに含む。好適には、水中油型エマルションはスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）を含む。好適には、水中油型エマルションは、トコフェロール、好ましくはα−トコフェロールなどのトコールをさらに含む。特定の実施形態において、水中油型エマルションは、スクアランまたはスクアレンなどの代謝可能な非毒性油、必要に応じてトコフェロール、特にαトコフェロールなどのトコール（および必要に応じてスクアレンとαトコフェロールの両方）および非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ８０（商標）またはポリソルベート８０などの乳化剤（または界面活性剤）を含む。特定の実施形態において、油エマルションはコレステロールなどのステロールをさらに含む。
【００６９】
従って、一実施形態において、本発明は、アジュバント化された免疫原性組成物の小児用量を提供し、前記アジュバントは、１〜１２ｍｇ／用量の間、好適には２〜８ｍｇ／用量の間、好適には３〜６ｍｇ／用量の間のレベルで代謝可能な油、好適にはスクアレンを含む水中油型エマルションアジュバントを含む。１１ｍｇ／用量未満の量のスクアレンが小児に適切である。さらに別の実施形態において、本発明は、アジュバント化された免疫原性組成物の用量を提供し、前記アジュバントは、１〜１３ｍｇ／用量の間、好適には２〜１０ｍｇ／用量の間、好適には４〜９ｍｇ／用量の間、好適には２〜５ｍｇ／用量の間のレベルでトコール、好適にはα−トコフェロールをさらに含む。好ましい小児用組成物は、（ｉ）５〜６ｍｇスクアレン、２〜３ｍｇ乳化剤、５〜７ｍｇトコール／ヒト用量を含むアジュバント、（ｉｉ）２〜３ｍｇスクアレン、１〜１．５ｍｇ乳化剤、および２．５〜３．５ｍｇトコール／ヒト用量を含むアジュバント、（ｉｉｉ）０．５〜１．５ｍｇスクアレン、０．２５〜０．７５ｍｇ乳化剤、および０．５〜１．５ｍｇトコール／用量を含むアジュバントのリストから選択されるアジュバントを含む。
【００７０】
本発明はまた、本発明の抗原調製物と、３Ｄ−ＭＰＬなどの薬学上許容可能な賦形剤とを一緒に混合することを含む、ワクチン製剤を製造するための方法を提供する。
【００７１】
本発明に係るワクチンは、特に非イオン性界面活性剤であり得る少なくとも１つの界面活性剤をさらに含んでもよい。好適な非イオン性界面活性剤は、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば市販のＴｒｉｔｏｎ（商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（商標）シリーズ）およびポリオキシエチレンエーテルまたは一般式（Ｉ）のエステル：
（Ｉ）ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
（式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである）、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される。
【００７２】
式（Ｉ）の範囲内の好ましい界面活性剤は、ｎが４〜２４、より好ましくは６〜１２、および最も好ましくは９であり、Ｒ成分がＣ１−５０、好ましくはＣ４−Ｃ２０アルキル、および最も好ましくはＣ１２アルキルである分子である。
【００７３】
オクチルフェノキシポリオオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルは、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｅｄｓ：Ａｔｔｗｏｏｄ ａｎｄ Ｆｌｏｒｅｎｃｅ（１９８３，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ）に記載されている。ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標））を含む、オクチルフェノキシポリオキシエタノール（オクトキシノール）もまた、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ Ｅｎｔｒｙ ６８５８（１１６２ページ，第１２版，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ；ＩＳＢＮ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））を含む、ポリオキシエチレンソルビタンエステルは、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ Ｅｎｔｒｙ ７７４２（１３０８ページ，第１２版，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ；ＩＳＢＮ ０９１１９１０−１２−３に記載されている。両方ともその文献に記載されている方法を用いて製造できるか、またはＳｉｇｍａ Ｉｎｃ．などの市販の供給源から購入できる。
【００７４】
特に好ましい非イオン性界面活性剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−４５、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０２、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５、ＴｒｉｔｏｎＸ−２０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、ＴｒｉｔｏｎＮ−５７、ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＮ−１２８、Ｂｒｅｉｊ３５、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）およびポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ステアレス９）が挙げられる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびラウレス９が特に好ましい。また、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））も特に好ましい。
【００７５】
一般式（Ｉ）のさらに好適なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。
【００７６】
ポリオキシエチレンラウリルエーテルに関する代替の用語または名称は、ＣＡＳレジストリに開示されている。ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルのＣＡＳレジストリ番号は、９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（第１２版：ｅｎｔｒｙ ７７１７，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ；ＩＳＢＮ ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ラウレス９は、エチレンオキシドとドデシルアルコールとを反応させることにより形成され、９個のエチレンオキシド単位の平均を有する。
【００７７】
記載した界面活性剤の異なる群からの２つ以上の非イオン性界面活性剤が、本明細書に記載したワクチン製剤中に存在してもよい。特に、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（商標）などのオクトキシノールとの組み合わせが好ましい。別の特に好ましい非イオン性界面活性剤の組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルもしくはオクトキシノールまたはその両方を含む。
【００７８】
上記に説明したものなどの非イオン性界面活性剤は、以下のような最終ワクチン組成物中の好ましい濃度を有する：Ｔｗｅｅｎ８０（商標）などのポリオキシエチレンソルビタンエステル：０．０１〜１％、最も好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標）またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤などのオクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール：０．００１〜０．１％、最も好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）、ラウレス９などの一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテル：０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、および最も好ましくは０．１〜１％または約０．５％（ｗ／ｖ）。
【００７９】
特定のワクチン製剤に関して、他のワクチン成分が製剤中に含まれてもよい。従って、本発明の製剤はまた、特に塩の形態で胆汁酸またはその誘導体を含んでもよい。それらは、コール酸の誘導体およびその塩、特にコール酸またはコール酸誘導体のナトリウム塩を含む。胆汁酸およびその誘導体の例としては、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸および上述の胆汁酸のグリセロ−、タウロ−、アミドプロピル−１−プロパンスルホニック−、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホニック誘導体などの誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドが挙げられる。特に好ましい例は、最終ワクチン用量中に存在し得るデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である。
【００８０】
本発明に係るワクチンが充填されたワクチン投与デバイスを含む医薬キットもまた本発明により提供される。そのような投与デバイスとしては、限定されないが、ニードルデバイス、液体ジェットデバイス、粉末デバイス、および噴霧デバイス（鼻腔内用途のため）が挙げられる。
【００８１】
本発明に係るインフルエンザウイルス抗原調製物は、従来の孵化卵法から誘導され得るか、またはそれらは、ウイルスを増殖させるか、または組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現する組織培養を用いる新世代法のいずれかから誘導され得る。ウイルスを増殖させるための好適な細胞基質としては、例えば、ＭＤＣＫなどのイヌ腎臓細胞、またはＭＤＣＫ、ＭＤＣＫ様細胞のクローン由来の細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含むＡＧＭＫ細胞などのサル腎臓細胞、適切なブタ細胞株、またはワクチン目的のためのインフルエンザウイルスの生成に適切な任意の他の哺乳動物細胞種類が挙げられる。好適な細胞基質としてはまた、ヒト細胞、例えばＭＲＣ−５細胞またはＰｅｒ．Ｃ６細胞株が挙げられ、ニワトリまたはアヒル細胞株（例えばニワトリまたはアヒル胚幹細胞由来のＥＢ１４（登録商標）、ＥＢ２４（登録商標）またはＥＢ６６（登録商標）などのＥＢｘ（登録商標）細胞株）などのトリ細胞および細胞株も挙げられる。ＥＢ６６（登録商標）が特に好ましい。他の好適な昆虫細胞はＳｆ９またはＨｉ５である。好適な細胞基質は、細胞株に限定されず、例えばニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞株も含まれる。
【００８２】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、任意の数の商業的に適用可能なプロセス、本明細書に参照として組み込まれる、独国特許第３００８３３号および独国特許第２１１４４４号に記載されている例えばスプリットインフルエンザプロセスにより生成され得る。従来のスプリットインフルエンザは、Ｔｗｅｅｎ（商標）（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットとしても知られている）と共にトリ−ｎ−ブチルホスフェート、またはジエチルエーテルなどの溶媒／洗浄剤処理を用いて生成されており、このプロセスは一部の製造施設において今も使用されている。他の現在利用されている分割（スプリット）剤としては、洗浄剤またはタンパク質分解酵素または胆汁塩、例えば本明細書に参照として組み込まれる独国特許第１５５８７５号に記載されているデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。分割剤として使用され得る洗浄剤としては、陽イオン洗浄剤、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、他のイオン性洗浄剤、例えばラウリル硫酸、タウロデオキシコール酸、またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００（例えばＬｉｎａら，２０００，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２８，９５−１０３に記載されるプロセスにおける）およびＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、または任意の２つ以上の界面活性剤の組み合わせを含む上記のものなどの非イオン性洗浄剤が挙げられる。
【００８３】
スプリットワクチンについての調製プロセスは、種々の組み合わせで超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離およびクロマトグラフィー（例えばイオン交換）工程などの複数の異なる濾過および／または他の分離工程、ならびに必要に応じて例えば分割（スプリット）前または後に実施され得る、熱、ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはＵ．Ｖ．でのインキュベーション工程を含む。分割（スプリット）プロセスは、バッチの連続または半連続プロセスとして実施され得る。
【００８４】
本発明に係る好ましいスプリットインフルエンザワクチン抗原調製物は、精製プロセスから残存している残存量のＴｗｅｅｎ８０および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むが、スプリット抗原の調製後に、それらは加えられてもよいか、またはそれらの濃度が調節されてもよい。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００の両方が存在する。ワクチン用量におけるこれらの非イオン性界面活性剤の最終濃度についての好ましい範囲は、以下の通りである：
Ｔｗｅｅｎ８０：０．０１〜１％、より好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：０．００１〜０．１（％ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）。
【００８５】
代替として、本発明に係るインフルエンザウイルス抗原調製物は、生インフルエンザウイルス以外の供与源由来であってもよく、例えば血球凝集素抗原が組換えにより生成されてもよい。
【００８６】
ここで本発明を以下の非限定的な実施例においてさらに記載する。
【実施例】
【００８７】
実施例１−防腐剤を含まないワクチン（チオマーサル減少ワクチン）のための安定剤としてのα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
一価スプリットワクチンを以下の手順に従って調製した。
【００８８】
ウイルス接種の調製
孵化卵の接種の日に、作業種ロットと、０．５ｍｇ／ｍｌにて硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌにてヒドロコルチゾン（ウイルス株依存性）を含有するリン酸緩衝生理食塩水とを混合することによって新たな接種材料を調製する。ウイルス接種材料を２〜８℃に維持する。
【００８９】
孵化卵の接種
９〜１１日齢の孵化卵をウイルス複製のために使用する。殻を除去する。その卵を０．２ｍｌのウイルス接種材料で接種する。接種した卵を４８〜９６時間、適切な温度（ウイルス株依存性）にてインキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、胚を冷却することにより殺傷し、卵を２〜８℃にて１２〜６０時間保存する。
【００９０】
収集
冷却した孵化卵からの尿膜腔液を収集する。通常、８〜１０ｍｌの粗尿膜腔液を１つの卵当たり回収する。
【００９１】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清浄化
収集した尿膜腔液を、適度な速度の遠心分離（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。
【００９２】
２．吸着工程
清浄化したウイルスプール中のＣａＨＰＯ４ゲルを得るために、０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２溶液を加えて、ウイルス株に依存して１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルのＣａＨＰＯ４の最終濃度にする。
【００９３】
最後の８時間の沈殿の後、上清を除去し、インフルエンザウイルスを含有する沈殿物を、使用するＣａＨＰＯ４の量に依存して０．２６ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を加えることにより再び可溶化する。
【００９４】
３．濾過
再懸濁した沈殿物を６μｍのフィルター膜で濾過する。
【００９５】
４．ショ糖密度勾配遠心法
インフルエンザウイルスを、１００μｇ／ｍｌチオマーサルを含有する線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心法により濃縮する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【００９６】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を４つの異なる画分により回収する（ショ糖は屈折計で測定する）。
【００９７】
画分１ ５５〜５２％ショ糖
画分２ 約５２〜３８％ショ糖
画分３ ３８〜２０％ショ糖＊
画分４ ２０〜０％ショ糖
＊ウイルス株依存性：画分３は１５％ショ糖まで減少し得る。
【００９８】
さらなるワクチン調製のために、画分２および３のみを使用する。
【００９９】
ショ糖含有量を約６％以下に低下させるために、画分３をリン酸緩衝液を用いて透析濾過により洗浄する。この希釈した画分に存在するインフルエンザウイルスをペレット状にし、可溶性の汚染物質を除去する。
【０１００】
ペレットを再懸濁し、完全に混合して、均一な懸濁液を得る。画分２および画分３の再懸濁したペレットをプールし、リン酸緩衝液を加えて、約４０リットルの体積を得る。この生成物は一価の全ウイルス濃縮物である。
【０１０１】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ）（ここで、デオキシコール酸ナトリウム勾配がさらに重ね合わせられる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は０．１％（ｗ／ｖ）まで分割（スプリット）中に存在し、トコフェロールコハク酸エステルを０．５ｍＭまでＢ型株ウイルスに加える。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１０２】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分によって回収する（ショ糖は屈折計で測定する）。画分２をさらなる処理のために使用する。画分制限についてのショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１０３】
６．濾過滅菌
スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１０４】
７．不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を、最大２５０μｇ／ｍｌまで全タンパク質含有量を減少させるために加える。Ｂ型株ウイルスについて、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈に適用して、全タンパク質含有量を２５０μｇ／ｍｌまで減少させる。ホルムアルデヒドを５０μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加えて、不活化を２０℃±２℃にて少なくとも７２時間行う。
【０１０５】
８．限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置において少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液、およびその後、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスについて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールコハク酸塩を含有するリン酸緩衝生理食塩水を洗浄に使用する。
【０１０６】
９．最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、必要な場合、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないようにその物質を、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈する。
【０１０７】
１０．保存
一価最終バルクを最大１８カ月間、２〜８℃にて保存する。
【０１０８】
安定性
【０１０９】
実施例２−チオマーサル減少ワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザワクチンの調製
３つの株、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価最終バルクを実施例１に記載した方法に従って生成した。
【０１１０】
プール
一価最終バルクの適切な量を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７それぞれについて３０μｇ／ｍｌ、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８について３９μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度でプールした。Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００をそれぞれ５８０μｇ／ｍｌおよび９０μｇ／ｍｌに調節した。最終体積をリン酸緩衝生理食塩水で３ｌに調節した。三価プールを０．８μｍ酢酸セルロース膜で最後に濾過して、三価最終バルクを得た。三価最終バルクを各々少なくとも０．５ｍＬにてシリンジに充填した。
【０１１１】
【０１１２】
実施例３−血球凝集素含有量を測定するために使用したＳＲＤ法
ガラスプレート（１２．４−１０．０ｃｍ）を、ＮＩＢＳＣによって推奨されている抗インフルエンザＨＡ血清の濃度を含有するアガロースゲルでコーティングする。ゲルをセットした後、７２サンプルウェル（３ｍｍφ）をアガロース中で穴を開ける。基準物質の１０μｌの適切な希釈物およびサンプルをウェルに負荷する。湿室内で室温（２０〜２５℃）にて２４時間、プレートをインキュベートする。その後、プレートをＮａＣｌ溶液で一晩浸し、蒸留水中で簡単に洗浄する。次いでゲルをプレスし、乾燥させる。完全に乾燥させて、プレートを１０分間クマシーブリリアントブルー溶液で染色し、明確に規定された染色領域が目に見えるまで、メタノールと酢酸との混合物中で２回脱染する。プレートを乾燥させた後、抗原ウェル周囲の染色領域の直径を直角で２方向において測定する。代替として、表面を測定する装置を使用してもよい。表面に対する抗原希釈物の用量反応曲線を構築し、結果を標準的な勾配比アッセイ法に従って計算する（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．（１９５２）．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｑｕｏｔｅｄ：Ｗｏｏｄ，ＪＭら（１９７７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．５，２３７−２４７）。
【０１１３】
実施例４−α−トコフェロール安定化インフルエンザワクチン（減少チオマーサル）の臨床検査
実施例２に記載したように得たシリンジを臨床検査に使用する：
Ｈ３Ｎ２：Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ ＲＥＳＶＩＲ−１７
Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１） ＩＶＲ−１１６
Ｂ：Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８。
【０１１４】
表３
【０１１５】
結果は、ワクチンが、防腐剤としてチオマーサルを含有するワクチンに対して等価の防御を与えることができることを示す。
【０１１６】
実施例５ａ−チオマーサルを含まないワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
一価スプリットワクチンを以下の手順に従って調製した。
【０１１７】
ウイルス接種材料の調製
孵化卵の接種の日に、新しい接種材料を、作業種ロットと、０．５ｍｇ／ｍｌにて硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌにてヒドロコルチゾンを含有するリン酸緩衝生理食塩水とを混合することによって調製する（ウイルス株依存性）。ウイルス接種材料を２〜８℃に維持する。
【０１１８】
孵化卵の接種
９〜１１日齢の孵化卵をウイルス複製のために使用する。殻を除去する。０．２ｍｌのウイルス接種材料を卵に接種する。６０，０００個の接種した卵を適切な温度（ウイルス株依存）で４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに胚を冷却により殺傷し、卵を２〜８℃にて１２〜６０時間保存する。
【０１１９】
収集
冷却した孵化卵からの尿膜腔液を収集する。通常、８〜１０ｍｌの粗尿膜腔液を１個の卵当たり回収する。
【０１２０】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
清浄化
収集した尿膜腔液を適度な速度の遠心分離（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。
【０１２１】
沈殿工程
飽和硫酸アンモニウム溶液を清浄化したウイルスプールに加えて、０．５ｍｏｌ／Ｌの最終硫酸アンモニウム濃度に到達させる。少なくとも１時間の沈殿の後、デプスフィルタ（典型的に０．５μｍ）での濾過により沈殿物を除去する。
【０１２２】
濾過
清浄化した粗全ウイルスバルクを、有効な滅菌膜（典型的に０．２μｍ）を用いて最後にフィルター膜で濾過する。
【０１２３】
限外濾過
濾過滅菌した粗一価全ウイルスバルクを、１０００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＢＩＯＭＡＸ（商標）膜を備えたカセットで少なくとも６倍濃縮する。濃縮した残余分をリン酸緩衝生理食塩水で少なくとも１．８回洗浄する。
【０１２４】
ショ糖密度勾配遠心法
インフルエンザウイルスを線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））において等密度遠心法により濃縮する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１２５】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を４つの異なる画分により回収する（ショ糖は屈折計で測定する）：
画分１ ５５〜５２％ショ糖
画分２ 約５２〜３８％ショ糖
画分３ ３８〜２０％ショ糖＊
画分４ ２０〜０％ショ糖
＊ウイルス株依存性：画分３は１５％ショ糖まで減少し得る。
【０１２６】
さらなるワクチン調製物のために、画分２のみを使用するか、またはさらに精製した画分３と共に画分２を使用する。
【０１２７】
ショ糖含有量を約６％以下に減少させるために、画分３を透析濾過によりリン酸緩衝液で洗浄する。必要に応じてこの工程は省略してもよい。この希釈した画分に存在するインフルエンザウイルスをペレット状にして、可溶性汚染物質を除去する。
【０１２８】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して、均一な懸濁液を得る。画分２および再懸濁した画分３のペレットをプールし、リン酸緩衝液を加えて、約４０リットルの体積を得る。この生成物は一価の全ウイルス濃縮物である。
【０１２９】
デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））（ここでデオキシコール酸ナトリウム勾配をさらに重ね合わせる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は、分割（スプリット）の間、０．１％（ｗ／ｖ）まで存在し、トコフェロールコハク酸エステルをＢ型株ウイルスについて０．５ｍＭまで加える。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１３０】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分（ショ糖は屈折計で測定する）によって回収し、画分２をさらなる処理のために使用する。画分制限についてショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１３１】
濾過滅菌
スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株について）０．５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝液を希釈のために使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１３２】
不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで全タンパク質含有量を最大４５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を加える。Ｂ型株について、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈に適用して、全タンパク質含有量を４５０μｇ／ｍｌまで減少させる。ホルムアルデヒドを１００μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化は少なくとも７２時間、２０℃±２℃にて行う。
【０１３３】
限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置で少なくとも２倍に濃縮する。その後、その物質を０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスについて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を洗浄に使用する。
【０１３４】
最終滅菌濾過
限外濾過後にその物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、必要な場合、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えない場合、その物質を、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、およびＢ型株について特に０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈する。
【０１３５】
保存
一価最終バルクを、最大１８ヶ月間、２〜８℃にて保存する。
【０１３６】
安定性
【０１３７】
実施例５ｂ−チオマーサルを含まないワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
実施例５ａに記載される方法の好ましい変更は以下の通りである：
全ウイルスを収集し、その後、沈殿工程を行う（硫酸アンモニウム沈殿）。この後、清浄化工程を行い、流体を適度な速度の遠心分離（範囲４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。このように沈殿および清浄化工程の順序は実施例５ａと比べて逆である。
【０１３８】
滅菌濾過、限外濾過および超遠心分離法（ショ糖密度勾配遠心法）の工程は実施例５ａに従う。しかしながら、超遠心分離法の工程から得られた画分の再処理工程は必要としない。
【０１３９】
プロセスの残りの工程は実施例５ａに記載される通りである。
【０１４０】
このように、この実施例において要約したプロセスは以下の通りである：
収集
沈殿（硫酸アンモニウム）
清浄化
濾過滅菌
限外濾過
超遠心分離法
分割（スプリット）（好ましくはデオキシコール酸ナトリウム）
濾過滅菌
不活化
限外濾過
最終濾過滅菌。
【０１４１】
実施例５ａの別の好ましい変更は、第１の濾過滅菌の前に前濾過工程を含む。これは滅菌フィルターでない膜を使用するが、汚染物質、例えば濾過滅菌の前のアルブミンの除去を可能にする。これにより、より良い収率が得られ得る。前濾過のための好適な膜は約０．８μｍ〜約１．８μｍ、例えば１．２μｍである。前濾過工程は実施例５ａまたは実施例５ｂのスキームにおいて使用され得る。
【０１４２】
実施例６−チオマーサルを含まないワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザワクチンの調製
３つの株、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価最終バルクを、実施例５に記載した方法に従って生成した。
【０１４３】
プール
適切な量の一価最終バルクを、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７それぞれについて３０μｇ／ｍｌ、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９７について３６μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度でプールした。Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００をそれぞれ５８０μｇ／ｍｌおよび９０μｇ／ｍｌに調節した。リン酸緩衝生理食塩水で最終体積を３ｌに調節した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜を用いて最後に濾過して、三価最終バルクを得た。三価最終バルクを各々少なくとも０．５ｍＬでシリンジに充填した。
【０１４４】
【０１４５】
実施例７−防腐剤を含まないワクチン（チオマーサル減少ワクチン）のための安定剤としてラウリル硫酸ナトリウムを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価全ウイルス濃縮物を実施例１に記載したように得た。
デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは、線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））（ここで、デオキシコール酸ナトリウム勾配がさらに重ね合わされる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は、分割（スプリット）の間、０．１％（ｗ／ｖ）まで存在する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１４６】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分（ショ糖は屈折計で測定する）によって回収する。画分２をさらに処理するために使用する。画分制限についてショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１４７】
濾過滅菌
画分２の１０ｍｌのサンプルをさらなる処理のために取った。スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝液を希釈のために使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１４８】
不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水を加える。ホルムアルデヒドを５０μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化を少なくとも７２時間、２０℃±２℃で行う。
【０１４９】
限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置において少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎおよび０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有する４容量のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【０１５０】
最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。濾過膜をリンスし、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないことが必要な場合、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水でその物質を希釈する。
【０１５１】
保存
一価最終バルクを２〜８℃で保存する。
【０１５２】
【０１５３】
実施例８−防腐剤を含まないワクチン（チオマーサル減少ワクチン）のための安定剤としてプランタケア（Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ）またはラウレス−９を用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価全ウイルス濃縮物を実施例１に記載したように得た。
断片化
一価全インフルエンザウイルス濃縮物を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を用いて１，０００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈する。プランタケア（登録商標）２０００ＵＰまたはラウレス−９を１％（ｗ／ｖ）の最終濃縮物に加える。その物質を３０分間わずかに混合する。次いでその物質をバケット内のショ糖クッション１５％（ｗ／ｗ）で覆う。ローターＳＷ２８をスイングするＢｅｃｋｍａｎにおける超遠心分離を２５，０００ｒｐｍにて２時間、２０℃で実施する。
【０１５４】
濾過滅菌
上清をさらなる処理のために取った。スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。
【０１５５】
不活化
必要な場合、全タンパク質含有量を最大５００μｇ／ｍｌまで減少させるために、リン酸緩衝生理食塩水を加える。ホルムアルデヒドを１００μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化を２０℃±２℃にて少なくとも６日間行う。
【０１５６】
限外濾過
不活化物質中でＴｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ１００をそれぞれ０．１５％および０．０２％に調節する。不活化スプリットウイルス物質を、３０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置で少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を４容量のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【０１５７】
最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないようにリン酸緩衝生理食塩水で物質を希釈する。
【０１５８】
保存
一価最終バルクを２〜８℃に保存する。
【０１５９】
【０１６０】
実施例９−ＩＤおよびＩＭ投与による高齢者におけるα−トコフェロール安定化インフルエンザワクチン（減少チオマーサル）の臨床検査
Ａ インフルエンザウイルス抗原調製物の調製
一価スプリットワクチンを以下の手順に従って調製した。
【０１６１】
ウイルス接種材料の調製
孵化卵の接種の日に、新しい接種材料を、作業種ロットと、０．５ｍｇ／ｍｌにて硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌにてヒドロコルチゾン（ウイルス株依存性）を含有するリン酸緩衝生理食塩水とを混合することによって調製する。ウイルス接種材料を２〜８℃に維持する。
【０１６２】
孵化卵の接種
９〜１１日齢の孵化卵をウイルス複製のために使用する。殻を除去する。０．２ｍｌのウイルス接種材料を卵に接種する。接種した卵を適切な温度（ウイルス株依存性）で４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、胚を冷却により殺傷し、卵を２〜８℃にて１２〜６０時間保存する。
【０１６３】
収集
冷却した孵化卵からの尿膜腔液を収集する。通常、８〜１０ｍｌの粗尿膜腔液を１個の卵当たり回収する。
【０１６４】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清浄化
収集した尿膜腔液を適度な速度の遠心分離（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。
【０１６５】
２．吸着工程
清浄化したウイルスプール中のＣａＨＰＯ４ゲルを得るために、０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２溶液を加えて、ウイルス株に依存して１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルのＣａＨＰＯ４の最終濃度にする。
【０１６６】
最後の８時間の沈殿の後、上清を除去し、インフルエンザウイルスを含有する沈殿物を、使用するＣａＨＰＯ４の量に依存して０．２６ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を加えることにより再び可溶化する。
【０１６７】
３．濾過
再懸濁した沈殿物を６μｍのフィルター膜で濾過する。
【０１６８】
４．ショ糖密度勾配遠心法
インフルエンザウイルスを、１００μｇ／ｍｌチオマーサルを含有する線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心法により濃縮する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１６９】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を４つの異なる画分により回収する（ショ糖は屈折計で測定する）：
画分１ ５５〜５２％ショ糖
画分２ 約５２〜３８％ショ糖
画分３ ３８〜２０％ショ糖＊
画分４ ２０〜０％スクロール
＊ウイルス株依存性：画分３は１５％ショ糖まで減少し得る。
【０１７０】
さらなるワクチン調製のために、画分２および３のみを使用する。
【０１７１】
ショ糖含有量を約６％以下に低下させるために、画分３をリン酸緩衝液を用いて透析濾過により洗浄する。この希釈した画分に存在するインフルエンザウイルスをペレット状にし、可溶性の汚染物質を除去する。
【０１７２】
ペレットを再懸濁し、完全に混合して、均一な懸濁液を得る。画分２および画分３の再懸濁したペレットをプールし、リン酸緩衝液を加えて、１２０，０００卵／バッチに適切な体積である、約４０リットルの体積を得る。この生成物は一価の全ウイルス濃縮物である。
【０１７３】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ）（ここで、デオキシコール酸ナトリウム勾配がさらに重ね合わせられる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は０．１％（ｗ／ｖ）まで分割（スプリット）中に存在し、コハク酸トコフェロールをＢ型株ウイルスについて０．５ｍＭまで加える。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１７４】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分によって回収する（ショ糖は屈折計で測定する）。画分２をさらなる処理のために使用する。画分制限についてのショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１７５】
６．濾過滅菌
スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１７６】
７．不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を、最大２５０μｇ／ｍｌまで全タンパク含有量を減少させるために加える。Ｂ型株ウイルスについて、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈に適用して、全タンパク質含有量を２５０μｇ／ｍｌまで減少させる。ホルムアルデヒドを５０μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化を２０℃±２℃にて少なくとも７２時間行う。
【０１７７】
８．限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置において少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液、およびその後、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスについて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を洗浄に使用する。
【０１７８】
９．最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、必要な場合、タンパク質濃度が１，０００μｇ／ｍｌを超えず、血球凝集素濃度が１８０μｇ／ｍｌを超えるように、その物質を０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈する。
【０１７９】
１０．保存
一価最終バルクを最大１８カ月間、２〜８℃にて保存する。
【０１８０】
Ｂ インフルエンザワクチンの調製
３つの株、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価最終バルクを、上記のパートＡに記載した方法に従って生成した。
【０１８１】
プール
適切な量の一価最終バルクを、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７それぞれについて６０μｇ／ｍｌ、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９について６８μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度でプールした。Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびトコフェロールコハク酸エステルをそれぞれ１，０００μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌおよび１６０μｇ／ｍｌに調節した。リン酸緩衝生理食塩水で最終体積を３ｌに調節した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜を用いて最後に濾過して、三価最終バルクを得た。三価最終バルクを各々少なくとも０．１６５ｍＬでシリンジに充填した。
【０１８２】
ワクチン投与
ワクチンを予め充填したシリンジに供給し、三角筋部に皮内投与した。皮内（ＩＤ）ニードルは欧州特許第１０９２４４４号に記載されており、適切な皮内注射を確実にするために皮膚浸透制限器を有する。注射部位における腫れ（丘疹）の形成は良質なＩＤ投与であると実証されているので、被験体と共に調査員が、ワクチン接種の３０分後に腫れの正確なサイズを測定した。
【０１８３】
１用量（１００μｌ）は以下の成分を含有した：
【０１８４】
Ｂ 上記のワクチンを標準的な三価スプリットインフルエンザワクチン：Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）と比較した。Ｆｌｕａｒｉｘワクチンを予め充填したシリンジに供給し、三角筋に筋肉注射により投与した。適切な筋肉内注射を確実にするために、少なくとも２．５ｃｍ／１インチの長さ（２３ゲージ）のニードルを使用した。
【０１８５】
１用量（０．５ｍｌ）は以下の成分を含有した：
【０１８６】
結果
ワクチン投与時における全コホートの平均年齢は７０．４±６．２歳の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）であり、女性／男性比は１．７：１であった。
【０１８７】
【０１８８】
１０／６５（１５．４％）のワクチン接種者により報告される、注射部位の痛みは、Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）のＩＭ投与後の最も一般的な症状であった。ＩＤ群において、痛みは３／６５（４．６％）のワクチン接種者により報告された。この相違は統計的に有意であった（ｐ＝０．０３８；フィッシャーの正確確率検定）。従って、チオマーサル減少製剤のＩＤ送達が好ましい。
【０１８９】
結論
高齢者集団においてチオマーサル減少インフルエンザワクチンのＩＤおよびＩＭ投与の両方は１００％の血清防御を与えることができる。
【０１９０】
幾何平均力価、血清防御率、セロコンバージョン率およびコンバージョン係数に関してワクチン接種に対する比較可能な反応がＩＭおよびＩＤでワクチン接種した個体において見出され、ＩＤ群は２．５倍低い抗原を受けた。２つの治療群においてワクチンに関連する応答型／非応答型の全身症状の全発生率の識別可能な相違はなかった。
【０１９１】
実施例１０−チオマーサル減少インフルエンザワクチンの皮内送達
（プールを独立して行い、ワクチンをシリンジに充填しなかったことを除いて）実施例９に記載したように調製したチオマーサル減少スプリットインフルエンザワクチンの免疫原性を、標準的なニードルを用いてモルモットにおいてＩＤ送達により評価した。
【０１９２】
５匹の動物の群を各々、２００μｌの全体積で５μｇの各ＨＡを含有する全不活化三価インフルエンザウイルスを用いて鼻腔内で抗原刺激した。抗原刺激の２８日後に、皮内または筋肉内経路のいずれかで動物をワクチン接種した。０．１ｍｌの０．１、０．３、または１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザを含有する皮内用量を、標準的なニードルを用いてモルモットの背中に投与した。１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザの筋肉内用量を、０．１ｍｌの体積でモルモットの後肢に投与した。群は以下の通りであった：
群１−０．１μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＤ、
群２−０．３μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＤ、
群３−１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＤ、
群４−１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＭ。
【０１９３】
ワクチン接種の１４日後、動物から採血し、ワクチン接種によって誘発された抗体力価を、標準的な血球凝集素アッセイ（ＨＩ）を用いて評価した。結果を図１に示す。全ての３つの株に対する強いＨＩ反応をワクチン接種によって誘発させた。明確な用量反応が示されなかったことにより、ＩＤ経路により投与した場合、非常に低い用量のチオマーサル減少抗原が依然として非常に有効なＨＩ抗体反応を誘発できることが示唆される。ＩＤまたはＩＭワクチン接種によって誘発されるＨＩ力価の間に有意な差はなかった。このように、モルモットにおいて得た結果により、チオマーサル減少三価スプリットインフルエンザ抗原は、ＩＭ経路と比較してＩＤ経路によって送達した場合、動物において同様のレベルのＨＩ抗体を誘発することが確認された。
【０１９４】
実施例１１−チオマーサル減少、アジュバント化インフルエンザワクチンの皮内送達
プロトコル
０日に、モルモットを２００μｌにおいて５μｇの三価全不活化インフルエンザウイルスにより鼻腔内で抗原刺激した。
【０１９５】
ワクチン接種−２８日−実施例９に記載したように調製した０．１μｇのＨＡ／株の三価スプリットインフルエンザを含有するワクチン（プールする工程により、各抗原について１．０μｇ／ｍｌの最終濃度を生じて、実施例９における６０μｇ／ｍｌと比べて１００μｌにおいて０．１μｇの用量を得たことを除く）。アジュバント化されたまたはアジュバント化されていない最終的な三価製剤を１００μｌでツベルクリンシリンジを用いて皮内投与した。
【０１９６】
出血−４２日
アジュバント化の効果を、ＨＩアッセイによる抗体反応（０、２８、４２日）を測定することによって評価した。
【０１９７】
全てのＩＤ実験は標準的なニードルを用いて実施した。
【０１９８】
結果
Ｇ１〜Ｇ５は各群あたり５匹の５群のモルモットを示す。
【０１９９】
Ｇ１ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ
Ｇ２ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇ
Ｇ３ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ１０μｇ
Ｇ４ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ５０μｇ＋ＱＳ２１ ５０μｇ
Ｇ５ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ１０μｇ＋ＱＳ２１ １０μｇ。
【０２００】
３Ｄ−ＭＰＬｉｎ＋ＱＳ２１の記載は、ジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有する、コレステロールを含む単層ベシクルを含む、アジュバント製剤を示し、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬは、脂質二重層と結合されているか、または脂質二重層内に包埋れている。このようなアジュバント製剤は欧州特許第０８２２８３１Ｂ号に記載されており、その開示は本明細書に参照として組み込まれる。
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
このように、アジュバント化されるかアジュバント化されないかに関わらず、チオマーサル減少三価スプリットインフルエンザ抗原は有効な免疫原であり、ＩＤまたはＩＭ経路によって投与した場合、強いＨＩ反応を誘発できる。これらの反応は、標準的なＦｌｕａｒｉｘ調製物によって誘発される反応と少なくとも同じほど有効であるように見える。
【０２０５】
実施例１２−ブタにおいて皮内送達したチオマーサルを含有するおよびチオマーサルを含まないワクチンの比較
ＩＤ経路によって投与したスプリットインフルエンザワクチン（プラスおよびマイナスチオマーサル）の免疫原性を評価するために、抗原刺激したブタモデルを使用した。大部分の集団は、インフルエンザによる少なくとも１回の感染を経験しているので、インフルエンザワクチンは、前から存在する免疫反応をブーストできなければならない。従って、ヒトの状況を最適に模倣するように動物を抗原刺激する。
【０２０６】
この実験において、４週齢のブタを鼻腔内経路によって抗原刺激した。６群の５匹の動物各々を以下のように抗原刺激した：
群１ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（５０μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激；
群２ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（５０μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激；
群３ ０日における三価全不活化ウイルス（５０μｇの各ＨＡ）での１回の抗原刺激；
群４ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（２５μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激；
群５ ０日における三価全不活化ウイルス（２５μｇの各ＨＡ）の１回の抗原刺激；
群６ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（１２．５μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激。
【０２０７】
最後の抗原刺激から２８日後に、ＩＤ経路によって、１００μｌにおける３μｇの各ＨＡ三価スプリット抗原（株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｐａｎａｍａ Ｈ３Ｎ２、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ）を動物にワクチン接種した。群１には、ワクチン抗原としてチオマーサル防腐剤を含有する標準的なＦｌｕａｒｉｘ（商標）を与えた。全ての他の群には、防腐剤を含まない抗原を与えた。
【０２０８】
この実験で得たＨＩの結果を図２に示す（種々の抗原用量で抗原刺激し、皮内経路によって３μｇの三価インフルエンザ抗原＋（プラス）または−（マイナス）チオマーサルでワクチン接種したブタにおいて誘発された抗インフルエンザ血球凝集素阻害力価）。
【０２０９】
比較的低いＨＩ力価がこの実験においてＢ型株に対して誘発され、Ａ／Ｈ３Ｎ２株に対するバックグラウンドは高い。抗原刺激用量が低い場合、ワクチン接種に対する反応に関して有益な効果が観察される。ほとんど全ての場合、抗原濃度または抗原刺激投与の回数の減少（５０μｇを用いる２回の抗原刺激から）はワクチン接種に対して増大した反応を生じた。５０μｇで２回抗原刺激した、ワクチン接種に対する群１および２の動物の反応はそれほど明確ではないが、防腐剤を含まない抗原（群２）は、これらの条件下でＦｌｕａｒｉｘ（商標）（群１）と少なくとも同じほど機能することが見られる。代わりに抗原刺激した動物（群３〜６）においてＩＤ経路によって投与した防腐剤を含まない三価インフルエンザ抗原でのワクチン接種に対する強い反応は明らかであり、この反応はさらにＢ型株においても見られるが、ＨＩ力価は低いままである。
【０２１０】
実施例１３−６ヶ月から６歳未満の小児における第ＩＩＩ相二重盲検、無作為化、比較研究
１３．１ 方法
１３．１．１． 研究設計
基礎慢性疾患を有するかまたは有さず、インフルエンザに対して以前にワクチン接種を受けていない６ヶ月〜６歳未満の小児をこの研究に含めた。
【０２１１】
２用量の試験ワクチン（実施例５に記載したものと同様の方法に従って調製したＴＦインフルエンザスプリットワクチン）または対照ワクチン（２．５μｇ未満のチオマーサル／０．５ｍｌ用量を含有する、チオマーサル減少Ｉｎｆｌｕｓｐｌｉｔ ＳＳＷ（登録商標）／Ｆｌｕａｒｉｘ（商標））（６から３５ヶ月齢の小児に対して０．２５ｍｌおよび３６ヶ月から６歳未満の小児に対して０．５ｍｌ）を０日および２８±２日に投与した。両方のワクチンは、各々のウイルス株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ＩＶＲ−１１６）［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（ＲＥＳＶＩＲ−１７）［Ｈ３Ｎ２］およびＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７（すなわち、２００３／２００４インフルエンザシーズンの間、北半休で推奨されている株）の１５μｇのＨＡを含有した。
【０２１２】
１３．１．２ 免疫原性
免疫化前（０日）、２回目のワクチン接種の２１日後（４９±２日）、２回目のワクチン接種の３ヶ月後（１１８日／４ヶ月）および２回目のワクチン接種の６ヶ月後（２０８日／７ヶ月）に血清サンプルを回収した。標準的な手順に従って、ＨＡ阻害（ＨＩ）検査によって血清を分析した。検査に使用した抗原はワクチン製剤に含まれているものと同じであった（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ＩＶＲ−１１６）［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（ＲＥＳＶＩＲ−１７）［Ｈ３Ｎ２］およびＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７）。各血清を１：１０の開始希釈にて試験した。幾何平均力価（ＧＭＴ）、ＳＰＲ（すなわち、ワクチン接種後、血清ＨＩ力価≧１：４０を有する被験体の割合）、ＳＣＲ（すなわち、ワクチン接種前のＨＩ力価＜１：１０およびワクチン接種後の力価≧１：４０またはワクチン接種前の力価≧１：１０およびワクチン接種後の力価の少なくとも４倍増加のいずれかを有する被験体の割合）、およびＳＣＦ（すなわち、０日と比較したワクチン接種後のＨＩ ＧＭＴの倍率増加）を計算した。小児におけるインフルエンザワクチンの免疫原性評価についての指針はまだ確立されていないので、１８〜６０歳の成人におけるインフルエンザワクチンの評価に関するＣＨＭＰ基準に従って血清学の結果を評価した：ＳＰＲ＞７０％、ＳＣＲ＞４０％およびＳＣＦ＞２．５を、ワクチン免疫原性のカットオフレベルとみなした。加えて、血清防御力（ＳＰＰ；すなわち２回目のワクチン接種後に≧１：４０の血清防御力価を示したワクチン接種前に血清防御されていない被験体［０日に力価＜１：４０］の割合）をさらなる誘導パラメーターとして計算した。
【０２１３】
１３．２ 結果
１３．２．１ 反応原性および安全性
両方のワクチンは有益な安全性プロファイルを示した。
【０２１４】
１３．２．２ 免疫原性
各年齢およびワクチン群についての免疫原性の結果を表９および表１０にまとめる。全ての３つのワクチン株についてのワクチン接種前のＧＭＴは２つのワクチン群において同じ範囲内であった。ＴＦ群において２回目のワクチン接種から２１日後、ＧＭＴは、６〜３５ヶ月齢の小児に関して７１．３から２８３．０の間、および３６ヶ月〜６歳未満の小児に関して１８０．３から７１２．７の間の範囲であった。対照群において、ＧＭＴは、６〜３５ヶ月齢の小児に関して３１．３〜１１１．２の範囲であり、３６ヶ月〜６歳未満の小児に関して１６５．１〜５２９．８の範囲であった。２用量の後、成人におけるインフルエンザワクチンの免疫原性評価に関するＣＨＭＰ基準は、ＴＦ群において６〜３５ヶ月齢の小児および３６ヶ月〜６歳未満の小児の両方について満たした（表９および表１０）。対照群において、両方の年齢群についてＳＣＲおよびＳＣＦ基準のみが満たされた。ＳＰＲは、年長児（３６ヶ月〜６歳未満）において全ての３つの株に関して７０％より高かったが、低年齢の小児（６〜３５ヶ月齢）において３つの株のいずれも６５．９％を超えなかった。
【０２１５】
より長い追跡期間（すなわちワクチン接種後４ヶ月および７ヶ月）において、低レベルであるが免疫反応は持続した。持続は両方のワクチンおよび年齢群に関して同程度であった。
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
１３．３ 結論
Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）の新規のチオマーサルを含まない製剤およびチオマーサル減少Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）（対照）の両方は免疫原性であり、良好な安全性プロファイルを示した。ＴＦワクチンは、６〜３５ヶ月齢の小児および３６〜６歳未満の小児の両方でかつ３つ全ての株に関して、成人について規定された３つ全てのＣＨＭＰ基準を満たすことが示された。免疫原性は、２用量の対照ワクチンを受けている小児と比べて、２用量のＴＦワクチンを受けている３歳より低年齢の小児において、より高くなることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年１０月１８日に出願された同時係属米国特許出願第１１／８７４，６４７号の一部係属出願であり、その出願は２００４年６月２２日に出願された特許出願第１０／４８０，９５２号、現米国特許第７，３１６，８１３号（これは２００２年５月２９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ０２／０５８３３の３７１である）であり、それらの内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれている。本出願はまた、２００１年５月３０日に出願された英国特許出願第０１１３０８３．０号および２００２年２月２１日に出願された英国特許出願第０２０４１１６．８号のより早い出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、新規インフルエンザウイルス抗原調製物、それらを調製するための方法、およびヒト被験体の予防または治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、全ウイルスワクチンというよりむしろ、破壊され、有機水銀防腐剤の非存在下で安定である、不活化インフルエンザワクチンに関する。更に、そのワクチンは標準検査に従って安定している赤血球凝集素を含有する。本発明は更に、小児の免疫化における水銀防腐剤を含まないインフルエンザ免疫原性組成物の使用に関する。水銀防腐剤を含まないインフルエンザ免疫原性組成物は、有機水銀防止剤を含有している組成物と比べて小児集団においてより高い免疫反応を誘発する。そのワクチンは、筋肉内、皮下、皮内、または粘膜、例えば鼻腔内などの、そのようなワクチンに適切な任意の経路によって投与できる。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザウイルスはヒトと家畜の両方に影響を及ぼす、世界中に存在する最も偏在的なウイルスの一つである。インフルエンザの経済的影響は大きい。インフルエンザウイルスは温帯地域においては最も冬に、また熱帯地域においては１年中、流行する。インフルエンザＡ型およびＢ型は、表面糖タンパク質の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を保有し、それらは、抗原連続変異としても知られている、点突然変異のプロセスにおいて年々進化している。インフルエンザウイルスのこの継続した変化により、それらは宿主免疫系を逃れることができ、この理由のために、季節性インフルエンザワクチン接種が毎年繰り返されなければならない。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、直径約１２５ｎｍの粒径を有するＲＮＡエンベロープウイルスである。それは基本的に、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープによって取り囲まれた、内部ヌクレオカプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は主にマトリクスタンパク質で、その外層の殆どは宿主由来の脂質物質から構成されている。表面糖タンパク質ノイラミニダーゼ（ＮＡ）および赤血球凝集素（ＨＡ）は、粒子の表面で長さ１０〜１２ｎｍのスパイクのように見える。インフルエンザのサブタイプの抗原特異性を確定するのは、これらの表面タンパク質、特に赤血球凝集素である。
【０００５】
現在利用可能なインフルエンザワクチンは不活化インフルエンザワクチンまたは生の弱毒化したインフルエンザワクチンのいずれかである。不活化インフルエンザワクチンは、３つの可能な形態の抗原調製物：不活化全ウイルス、精製されたウイルス粒子が脂質エンベロープを可溶化させるように洗浄剤もしくは他の試薬で破壊されたサブビリオン（いわゆる「スプリット」ワクチン）、または精製されたＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）から構成されている。これらの不活化ワクチンは筋肉注射（ｉ．ｍ．）や鼻腔内注射（ｉ．ｎ．）で投与される。生の弱毒化されたワクチンは市販されていない。
【０００６】
あらゆる種類のインフルエンザワクチンは大抵、三価ワクチンである。それらは通常、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのインフルエンザＢ型株に由来する抗原を含有する。標準的な０．５ｍｌの注射用量は、ほとんどの場合、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）により測定した場合、各株に由来する１５μｇの赤血球凝集素抗原成分を含んでいる（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ：ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｃｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１）３１７−３３０）。
【０００７】
各シーズンにインフルエンザワクチンに組み込まれるインフルエンザウイルス株は、国立保険機関およびワクチン製造業者と共同して、世界保健機構によって決められる。
【０００８】
典型的なインフルエンザの流行は、入院患者数や死亡者数の増加率から見られる通り、肺炎および下部呼吸器疾患の発生率の増加を引き起こしている。高齢者や慢性の基礎疾患のある人々は、合併症を引き起こす可能性が高く、年少乳児もまた重症疾患を患う場合がある。インフルエンザが小児に顕著な影響をもたらすという証拠が増えてきている。インフルエンザの最も高い発病率は小児で発生し、インフルエンザに関係した発病率はこの年齢層で最も高い。小児はまた、ウイルスからの最も高い発病率を被るのでインフルエンザの主な伝達者であると考えられており、最も高い鼻咽頭ウイルス力価を有し、より長い期間のウイルス排出を示す。従って、インフルエンザに対する小児のワクチン接種は、疾患と関連する深刻な発病率を防ぎ、また、「群効果」にも影響を及ぼすことができ、社会に対してインフルエンザの影響を減少させる。小児自身の健康、彼らの家庭内での接触、およびより広いコミュニティーに対するワクチン接種の直接的効果以外に、関係する大きな経済的要因も存在する。実際、インフルエンザに関連した発病率は、顕著な常習的欠席率および生産力の低下に関与している。従って、特にこれらの群は保護される必要がある。
【０００９】
毎年のインフルエンザ流行に関連する発病率および死亡率を抑制する現在の試みは、筋肉内に投与される不活化インフルエンザワクチンの使用に基づく。呼吸器系疾患およびインフルエンザ合併症を防ぐ際のこのようなワクチンの効果は、健康な成人で７５％から高齢者で５０％未満に及ぶ。
【００１０】
インフルエンザワクチンの効果を測定するための基準が国際的に適用されている。インフルエンザに対する効果的なワクチンについての欧州連合公的基準は、下記の表に示されている。欧州連合の条件を満たすためには、理論上は、ワクチンに含まれるインフルエンザの全ての株に対し、インフルエンザワクチンがその表の基準の１つのみを満たさなければならない。しかし実際のところは、その基準の少なくとも２つまたは３つ全てが全ての株、特に異なる経路を介して送達する新規ワクチンなどの新しいワクチンに満たされる必要がある。一部の状況下では、２つの基準が十分であり得る。例えば、３つの基準のうちの２つが全ての株により満たされなければならないのに対して、３番目の基準は全ての株でなく一部の株（例えば３つの株のうち２つ）により満たされるように適用されてもよい。必要条件は、成人集団（１８−６０歳）と高齢者集団（＞６０歳）とでは異なる。
【００１１】
＊セロコンバージョン率は、各ワクチン株についてのワクチン接種後に、血清血球凝集素阻害（ＨＩ）力価が少なくとも４倍増加したワクチン接種者の割合と定義される、
＊＊コンバージョン係数は、各ワクチン株についてのワクチン接種後に、血清ＨＩ幾何平均力価（ＧＭＴ）の倍の増加と定義される、
＊＊＊防御率は、（各ワクチン株についての）ワクチン接種後に、１：４０に等しいか、またはそれよりも高い血清ＨＩ力価を有するワクチン接種者の割合と定義され、通常、防御を示すものとして承認されている。
【００１２】
ＦＤＡは、わずかに異なる年齢カットオフポイントを使用しているが、それらの基準はＣＨＭＰ基準に基づいている。適切な指標は、１）ＨＩ抗体力価≧１：４０を達成している被験体の割合、および２）ワクチン接種後のＨＩ抗体力価において４倍増加と定義されたセロコンバージョン率を同様に含む。幾何平均力価（ＧＭＴ）はその結果に含まれなければならないが、そのデータは、推定値だけではなくセロコンバージョンの発生率の９５％信頼区間の下限も含まなければならず、４２日目のＨＩ力価≧１：４０の発生率は、目標値を上回らなければならない。従って、これらのデータおよびこれらの評価の推定値の９５％信頼区間（ＣＩ）が規定されるべきである。ＦＤＡドラフトガイダンスは、両方の目標を達成するよう求めている。これを表１Ｂにまとめる。
【００１３】
＊セロコンバージョン率は、ａ）基礎力価≧１：１０の被験体に関して、４倍もしくはそれ以上の増加、またはｂ）基礎力価＜１：１０の被験体に関して、≧１：４０の増加と定義される。これらの基準は、真値について９５％ＣＩの下限で満たされなければならない。
【００１４】
商業的に有用である新規インフルエンザワクチンに関して、これらの基準を満たすことが必要とされるだけではなく、実際には、現在利用可能な注射ワクチンと、少なくとも同程度有効である必要がある。また、求められる抗原の量および投与数の観点から、商業的に実現可能である必要がある。
【００１５】
現在市販されているインフルエンザワクチンは注射可能なスプリットまたはサブユニットワクチンのいずれかである。これらのワクチンは一般に有機溶媒または洗浄剤を用いてウイルス粒子を破壊し、種々の程度までウイルスタンパク質を分離または精製することによって調製される。スプリットワクチンは、可溶化濃度の有機溶媒または洗浄剤を用いて、感染性または不活化されたいずれかの全インフルエンザウイルスを断片化し、その後、可溶化剤および一部またはほとんどのウイルス脂質物質を除去することによって調製される。スプリットワクチンは一般に汚染しているマトリクスタンパク質および核タンパク質および一部の場合、脂質、ならびにエンベロープ膜タンパク質を含有する。スプリットワクチンは通常ほとんどまたは全てのウイルス構造タンパク質を含有するが、それらは全ウイルスで生じるものと必ずしも同じ割合ではない。市販のスプリットワクチンの例は、例えばＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）、またはＦＬＵＺＯＮＥ（商標）である。
【００１６】
他方でサブユニットワクチンは、必要に応じて、ワクチン接種の際に所望のウイルス中和抗体を誘発するのに関与する表面タンパク質である、ノイラミニダーゼと共に高度に精製されたウイルス表面タンパク質である、血球凝集素から実質的になる。サブユニットワクチンは全ビリオンワクチン以上のさらなる利点を有し得る。なぜならそれらは一般に特に若いワクチン接種者において反応原性が低いからである。サブユニットワクチンは、組換えにより製造され得るか、または破壊されたウイルス粒子から精製され得る。市販のサブユニットワクチンの例は、例えばＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、またはＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）である。特定の実施形態において、サブユニットワクチンは、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、またはＭ２、好適にはＨＡからなどの少なくとも１つの主要なエンベロープ成分から調製される。好適には、それらは、インフルエンザ構造タンパク質ＨＡ、ＮＡ、マトリクス１（Ｍ１）およびＭ２のうちの少なくとも２つの組み合わせ、好適には必要に応じてＭ１を含む、ＨＡおよびＮＡの両方の組み合わせなどの２つの抗原またはそれ以上の組み合わせを含む。好適には、インフルエンザ成分は組換えＤＮＡ技術によって製造される。すなわち、生の組換えベクター（ワクチニア）または組換えサブユニットタンパク質（バキュロウイルス／昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、酵母、植物または細菌）を含む、組換えＤＮＡ操作から得られる核酸から得られるか、またはそれらから発現される。好適な昆虫細胞はスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）昆虫細胞またはキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）から開発されたハイファイブ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）（Ｈｉ５）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、好適なバキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）またはいわゆるＢａｃｍｉｄ系である。
【００１７】
一実施形態において、インフルエンザウイルス調製物はビロソームの形態である。ビロソームは、ビロソームのリン脂質二重層膜に挿入された、真正の構造において機能的ウイルスエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡを保有する球状の単層ベシクルである。市販のビロソームワクチンの例は、例えばＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（商標）、またはＩＮＶＡＶＡＣ（商標）である。別の実施形態において、サブユニットインフルエンザ成分は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはカプソメア、好適には植物製または昆虫細胞製のＶＬＰの形態で発現される。ＶＬＰはそれらの天然形態で抗原を提示する。ＶＬＰサブユニット技術は、完全にインフルエンザタンパク質に基づき得るか、またはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他のウイルスに依存し得るので、ＭＬＶ ｇａｇタンパク質などの非インフルエンザ抗原を含み得る。好適なＶＬＰは、少なくとも１つ、好適には少なくとも２つのインフルエンザタンパク質を、必要に応じてＭ１およびＨＡ、ＨＡおよびＮＡ、ＨＡ、ＮＡおよびＭ１またはＨＡ、ＮＡおよびＭＬＶ ｇａｇなどの他のインフルエンザまたは非インフルエンザタンパク質と共に含む。それは植物細胞または昆虫細胞のいずれかにおいて生成され得る。ＶＬＰはまた、例えば２つの季節性株（例えばＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）から、または１つの季節性株および１つの流行性株（例えばＨ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１）から作製されるＶＬＰなどの１つより多いインフルエンザ株由来の抗原を保有し得る。
【００１８】
市販されている多くのワクチンは劣化を防止するために防腐剤を必要とする。頻繁に使用される防腐剤は、水銀を含有する化合物であるチオマーサルである。水銀を含有する化合物の作用について一部の社会的関心が示されている。神経系が発達するときの中等量の有機水銀化合物に対する低い作用を検出するための所定の監視システムは存在せず、高用量の有機水銀化合物を受けている小児の特別な研究は完了するのに数年かかる。特定の解説者は、チオマーサルを含有するワクチンの潜在的危険性が誇張して述べられなければならないと強く主張している（Ｏｆｆｉｔ；Ｐ．Ａ．ＪＡＭＡ Ｖｏｌ．２８３；Ｎｏ：１６）。それにも関わらず、製造プロセスにおいてチオマーサルの使用に代わるワクチンを調製するための代替の方法を見出すことは有益である。従って、チオマーサルを含まない、特に年間ベースで少なくとも特定の集団群に関して推奨されるインフルエンザワクチンなどのワクチンであるワクチンを開発する必要がある。
【００１９】
今まで、製造／精製プロセスの間および／または最終ワクチンにおいて市販の不活化インフルエンザワクチンのために防腐剤を利用することが標準的に実施されてきた。防腐剤は、微生物が種々の精製段階を通して増殖するのを防止するために必要とされる。卵から誘導されたインフルエンザワクチンに関して、チオマーサルは典型的に生の尿膜腔液に加えられ、ウイルスの処理の間にも２回目が加えられ得る。従って、プロセスの終わりにおいて残留チオマーサルが存在し、これはさらに最終ワクチンにおいて望ましい防腐剤濃度、例えば約１００μｇ／ｍｌの濃度に調節され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
インフルエンザワクチンにおける防腐剤としてのチオマーサルの使用の副作用は安定化作用である。市販のインフルエンザワクチンにおけるチオマーサルは、特にＢ型株インフルエンザのＨＡに限らないが、ワクチンのＨＡ成分を安定化する作用がある。特定のＡ型株血球凝集素、例えばＨ３もまた、安定化を必要とし得る。従って、インフルエンザワクチンからチオマーサルを除去すること、または最終ワクチンにおいてチオマーサルの濃度を少なくとも減少させることを考慮することが望まれ得るが、チオマーサルを含まないと、ＨＡが十分に安定でなくなることを克服しなければならないという課題が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
有機水銀化合物を含有しない代替の試薬を用いた不活化インフルエンザ調製物においてＨＡを安定化させることができることが本発明において発見された。ＨＡは安定したままであり、それは標準的な定量的方法、特にＳＲＤによって、安定化賦形剤を含まない同じ方法によって製造された安定化していない抗原調製物より高い程度で長時間にわたって検出可能である。ＳＲＤ法は本明細書上記のように実施される。重要なことには、ＨＡは、最終インフルエンザワクチンについて標準的に必要とされる１２ヶ月間まで安定したままである。
【００２２】
また、驚くべきことに、水銀防腐剤を含まないインフルエンザワクチンは、小児において顕著に改善された免疫反応を誘発することを見出した。チオマーサルを含有するインフルエンザワクチンと比較して、チオマーサルを含まないワクチンは、小児において、試験した全てに株について、より高い抗体力価（ＧＭＴ）を誘発し、特にＨ１Ｎ１インフルエンザ株について効果が特別顕著であった。さらに、成人におけるインフルエンザワクチンの免疫原性評価についての３つのＣＨＭＰ基準を、ＴＦ群において６〜３５ヶ月齢の小児および３６ヶ月〜６歳未満の小児の両方でのみ満たした。対照群において、ＳＣＲおよびＳＣＦ基準のみを両方の年齢群で満たした。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】標準的な血球凝集素アッセイ（ＨＩ）を用いて評価した、ワクチン接種によって誘発された抗体力価を示す。
【図２】種々の抗原用量で抗原刺激し、皮内経路によって３μｇの三価インフルエンザ抗原＋（プラス）または−（マイナス）チオマーサルでワクチン接種したブタにおいて誘発された抗インフルエンザ血球凝集素阻害力価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
第１の態様において、本発明は、チオマーサルの非存在下、または低レベルのチオマーサルで安定化される血球凝集素抗原を含み、その血球凝集素がＳＲＤアッセイにより検出可能である、不活化インフルエンザウイルス調製物を提供する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、ヒト、特に小児において免疫反応を上昇させる方法であって、小児に、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性の不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、小児を免疫化するのに使用するための水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物であって、前記組成物は、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、前記水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物を提供する。
【００２７】
第３の実施形態において、本発明は、インフルエンザに対して小児を免疫化するための水銀防止剤を含まない免疫原性組成物の製造において、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物の使用を提供する。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない小児用免疫原性組成物、特にワクチンを提供する。特に、前記組成物またはワクチンの用量体積は０．２〜０．４５ｍｌの間である。
【００２９】
低レベルのチオマーサルは、そのレベルにおいてインフルエンザＢ型由来のＨＡの安定性が低下するレベルであり、その結果、安定化賦形剤がＨＡを安定化させるのに必要とされる。低レベルのチオマーサルはほぼ５μｇ／ｍｌまたはそれ未満である。
【００３０】
一般に、安定化したＨＡとは、同様の方法であるが、安定化賦形剤を全く有さずに生成された非安定化抗原調製物より高い程度で、標準的な定量的方法、特にＳＲＤによって長時間にわたって検出可能なＨＡを指す。ＨＡの安定化は好ましくは、１年間にわたって実質的に一定なＨＡの活性を維持する。好ましくは、安定化により、ＨＡを含むワクチンは、６ヶ月の保存期間、より好ましくは１年間の後でも許容可能な予防を与えることができる。
【００３１】
好適には、安定化は、安定化賦形剤、好ましくミセル修飾賦形剤により実施される。ミセル修飾賦形剤は一般に、膜タンパク質ＨＡを可溶化するのに使用される、または適した洗浄剤により形成されるミセル内に組み込まれ得る賦形剤、例えば個々にまたは組み合わせた洗浄剤Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびデオキシコール酸塩である。
【００３２】
理論により束縛されることを望まずに、賦形剤の作用は、最終調製物における脂質、洗浄剤および／またはタンパク質との相互作用により、ＨＡを安定化させると考えられる。Ｔｗｅｅｎおよびデオキシコール酸塩と残留脂質および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００とのミセルなどの賦形剤とタンパク質および脂質との混合ミセルが形成され得る。表面タンパク質はそれらの複合体ミセルにより安定化を維持すると考えられる。好ましくは、タンパク質凝集は、負に帯電している洗浄剤を含有するミセルなどの適切な賦形剤を含有するミセルの電荷斥力により制限される。
【００３３】
適切なミセル修飾賦形剤としては、アルキル硫酸塩、またはアルキル−アリール−硫酸塩などの正に、負にまたは両性イオンに荷電した両親媒性分子、アルキルポリグリコシドまたはその誘導体などの非イオン性両親媒性分子、例えばプランタケア（Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ）（登録商標）（Ｈｅｎｋｅｌ ＫＧａＡから入手可能である）、またはアルキルアルコールポリアルキレンエーテルもしくはその誘導体、例えばラウレス（Ｌａｕｒｅｔｈ）−９が挙げられる。
【００３４】
好ましい賦形剤は、α−トコフェロール、またはα−トコフェロールコハク酸エステルなどのα−トコフェロールの誘導体である。本発明に使用するための他の好ましいトコフェロール誘導体としては、Ｄ−αトコフェロール、Ｄ−δトコフェロール、Ｄ−γトコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールが挙げられる。使用され得るトコフェロールの好ましい誘導体としては、酢酸エステル、コハク酸エステル、リン酸エステル、ホルメート（ｆｏｒｍｉａｔｅ）、プロピオネート、ブチレート、スルフェートおよびグルコネートが挙げられる。α−トコフェロールコハク酸エステルが特に好ましい。α−トコフェロールまたは誘導体は、血球凝集素を安定化させるのに十分な量で存在する。
【００３５】
他の適切な賦形剤は、当該技術分野において標準的な方法により識別され得、例えば、本明細書に記載されるような安定性分析のためのＳＲＤ法を用いて試験され得る。
【００３６】
好ましい態様において、本発明は、少なくとも１つの安定なインフルエンザＢ型株血球凝集素抗原を含むインフルエンザウイルス抗原調製物を提供する。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、安定な血球凝集素抗原を調製するための方法であって、安定化ミセル修飾賦形剤、好ましくはα−トコフェロールまたはα−トコフェロールコハク酸エステルなどのその誘導体の存在下で抗原を精製することを含む方法を提供する。
【００３８】
さらに本発明によって、本明細書に記載される抗原調製物を含むワクチンおよび被験体、特に小児においてインフルエンザ感染または疾患を予防する方法であって、被験体に本発明に係るワクチンを投与することを含む方法におけるそれらのワクチンの使用が提供される。
【００３９】
０．５ｍｌのワクチン用量が好適に使用される。小児科集団について、０．５ｍｌ未満のワクチン用量が使用される。好適な用量は、０．２〜０．４５ｍｌの間、または０．２〜０．３ｍｌの間、典型的には約０．２５ｍｌである。用量体積のわずかな適合は、元のバルクサンプルにおけるＨＡ濃度に応じて、または鼻腔内もしくは皮内経路によって与えられるより少ない用量での送達経路に応じて、または標的集団に応じて慣例的になされるだろう（例えば０〜３５ヶ月の間の幼児は０．２５ｍｌのワクチン用量を受けてもよく、３歳からの小児はより高いワクチン用量を受けてもよい）。
【００４０】
別の実施形態において、ワクチン接種をする標的集団は、全ての出生直後から小児までか、または２もしくは３ヶ月齢およびそれ以上、または６ヶ月齢およびそれ以上、特に６〜２３ヶ月齢の小児であり、比較的高いインフルエンザ関連入院率を経験する集団である。他の標的集団は、（ｉ）出生から６ヶ月齢のより若い小児、（ｉｉ）出生から７２ヶ月齢の小児、（ｉｉｉ）３ヶ月齢または６ヶ月齢から３６ヶ月齢未満のより若い小児、（ｉｖ）３６ヶ月齢から６歳未満の小児である。
【００４１】
ワクチンは、皮内、粘膜、例えば鼻腔内、経口、筋肉内または皮下などの任意の適切な送達経路によって投与され得る。他の送達経路は当該技術分野において周知である。
【００４２】
皮内送達が好ましい。皮内送達のための任意の適切なデバイス、例えば米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているものなどの短いニードルデバイスが使用されてもよい。皮内ワクチンはまた、国際公開第９９／３４８５０号および欧州特許第１０９２４４４号（本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているものなどの真皮内へのニードルの効果的な貫通長さを制限するデバイスおよびその機能的等価物により投与されてもよい。また、液体ジェット注射器を介して、または角質層に穴を開け、真皮に届くジェットを生じるニードルを介して真皮に液体ワクチンを送達するジェット注射デバイスも適切である。ジェット注射デバイスは、例えば米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、国際公開第９７／３７７０５号および国際公開第９７／１３５３７号に記載されている。また、皮膚の外層から真皮まで粉末形態でワクチンを加速させる圧縮ガスを使用する弾道粉末／粒子送達デバイスも適切である。加えて、古典的な皮内投与のマントー法（ｍａｎｔｏｕｘ ｍｅｔｈｏｄ）において従来のシリンジが使用されてもよい。しかしながら、従来のシリンジの使用は、高いスキルの技師を必要とするので、高いスキルの使用者を必要とせずに正確な送達を可能にするデバイスが好ましい。
【００４３】
従って、本発明は、被験体におけるインフルエンザ感染または疾患を予防する方法であって、被験体に、本発明に係るインフルエンザワクチンを皮内投与することを含む、方法を提供する。
【００４４】
本発明はまた、本発明に係るワクチンと組み合わせた皮内デバイス、特に例えば国際公開第９９／３４８５０号または欧州特許第１０９２４４４号に開示されるデバイスにも及ぶ。
【００４５】
また、インフルエンザワクチンの製造におけるミセル修飾賦形剤、好ましくは血球凝集素安定剤などのα−トコフェロールまたはその誘導体の使用も提供される。
【００４６】
本発明は特に、排他的ではないが、Ｂ型株インフルエンザ血球凝集素の安定化に適用する。
【００４７】
好ましくは、本発明の安定化されたＨＡは、６ヶ月間、より好ましくは１２ヶ月間、安定である。
【００４８】
好ましくは、α−トコフェロールは、エステル、より好ましくはコハク酸エステルまたは酢酸エステル、最も好ましくはコハク酸エステルの形態である。
【００４９】
α−トコフェロールまたは誘導体についての好ましい濃度は、１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの間である。
【００５０】
本発明に係るワクチンは一般に、典型的には２つのＡ型株と１つのＢ型株の三価組成物中にＡ型およびＢ型株ウイルス抗原を含有する。しかしながら、二価および一価ワクチンは除外されない。四価ワクチン、特に、（ｉ）２つのＡ型株（例えばＨ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１）および２つのＢ型株の異なる系統（例えばＢ／ＹａｍａｇａｔａおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、（ｉｉ）３つのＡ型株（例えばＨ３Ｎ２、２つのＨ１Ｎ１；またはＨ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１）および１つのＢ型株を含むワクチンもまた考慮される。一価ワクチンは、例えば可能な限り迅速に製造され、投与される多くのワクチンを得ることが重要である、世界的大流行の状況において有益であり得る。
【００５１】
免疫原性組成物中のＨＡ成分は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９からなる群より選択され得る。
【００５２】
一実施形態において、免疫原性組成物の各小児用量は、一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）によって測定した場合、インフルエンザ株につき１５μｇのＨＡを含有する（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７）２３７−２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１）３１７−３３０）。別の実施形態において、１用量当たり１５μｇ未満、好適には１０μｇ未満のＨＡの量と定義される、低用量の血球凝集素（ＨＡ）が使用される。特定の実施形態において、免疫原性組成物の小児用量は、約１０μｇ、例えば５〜１５μｇの間、好適には６〜１４μｇの間、例えば７〜１３μｇの間または８〜１２μｇの間または９〜１１μｇの間、または１０μｇのレベルにて１用量の血球凝集素（ＨＡ）／株を含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、約５μｇ、例えば１〜９μｇの間、または２〜８μｇの間または好適には３〜７μｇの間または４および６μｇ、または５μｇのレベルにて１用量の血球凝集素（ＨＡ）／株を含む。好適な量は、１．９μｇ、２．５μｇ、３．８μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、または１０μｇのＨＡであるか、またはワクチン組成物が本明細書に定義される有効性基準を満たすように決定される１５μｇ未満の好適な量のＨＡである。有益には、規制基準を満たすことができる１μｇのＨＡ、またはそれ未満（例えば０．５μｇ）のＨＡのＨＡ用量が使用されてもよい。好適な量のＨＡは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４μｇ（ｗ／ｖ）／インフルエンザ株／ヒト用量のいずれかの免疫原性組成物である。前記低用量のＨＡは、有効性についての国際的、例えばＥＵまたはＦＤＡ基準を満たすワクチンを製剤化することが可能であるならば、実際に実用可能である限り低くてもよい。
【００５３】
本発明に使用するための非生インフルエンザ抗原調製物は、スプリットウイルス抗原調製物、サブユニット抗原（組換えにより発現されるかまたは全ウイルスから調製される）、例えばホルムアルデヒド、β−プロピオラクトンで化学的に不活化され得るか、または他の方法、例えばＵ．Ｖにより不活性化、または熱により不活性化され得る不活化全ウイルスからなる群より選択され得る。好ましくは、抗原調製物は、特にスプリットプロセス、その後の表面抗原の精製による、スプリットウイルス調製物、または全ウイルスから調製されるサブユニット抗原のいずれかである。スプリットウイルス調製物が最も好ましい。他の好ましい調製物はサブユニットウイルス調製物である。
【００５４】
好ましくは、インフルエンザウイルス調製物についてまたはインフルエンザウイルス調製物の各株についての血球凝集素抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイによって測定した場合、１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは３〜３００μｇ／ｍｌおよび最も好ましくは約３０μｇ／ｍｌである。
【００５５】
本発明に係るワクチンはさらに、アジュバントまたは免疫刺激剤、例えば限定されないが、任意の供給源からの無毒化されたリピドＡおよびリピドＡの非毒性誘導体、サポニンおよびＴＨ１型反応を刺激できる他の試薬を含んでもよい。
【００５６】
腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）は免疫系の有効な刺激剤であることが長い間知られているが、アジュバントにおけるその使用は、その毒性作用により削減されている。主要な炭水化物群の除去によって生成されるＬＰＳの非毒性誘導体、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および還元末端グルコサミン由来のリン酸塩は、Ｒｉｂｉら（１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐ４０７−４１９）により記載されており、以下の構造：
【化１】
【００５７】
を有する。
【００５８】
ＭＰＬのさらなる無毒化型は、３位の二糖骨格からのアシル鎖の除去から得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれる。それは、英国特許第２１２２２０４Ｂ号に教示されている方法により精製され、調製され得、その参照文献はまた、ジホスホリルリピドＡ、およびその３−Ｏ−脱アシル型の調製を開示している。
【００５９】
３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小粒径を有するエマルションの形態であり、その製造方法は、国際公開第９４／２１２９２号に開示されている。モノホスホリルリピドＡおよび界面活性剤を含む水性製剤は国際公開第９８４３６７０Ａ２号に記載されている。
【００６０】
本発明の組成物中に製剤化される細菌リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製され、処理され得るか、または代替としてそれらは合成され得る。例えば、精製されたモノホスホリルリピドＡはＲｉｂｉら１９８６（上記）に記載されており、サルモネラ種由来の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡは、英国特許第２２２０２１１号および米国特許第４９１２０９４号に記載されている。他の精製および合成リポ多糖も記載されている（Ｈｉｌｇｅｒｓら，１９８６，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９（４）：３９２−６；Ｈｉｌｇｅｒｓら，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６０（１）：１４１−６；および欧州特許第０５４９０７４Ｂ１号）。特に好ましい細菌リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００６１】
従って、本発明に使用され得るＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬの構造と同様であるそれらの免疫刺激剤である。本発明の別の態様において、ＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬの上記の構造に対するサブ部分であるアシル化単糖であり得る。
【００６２】
サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ Ｈ．（１９９６．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌ ２ ｐｐ３６３−３８６）に教示されている。サポニンは、植物および海洋動物界において広く分布しているステロイドまたはトリテルペン配糖体である。サポニンは、振盪すると泡状になるコロイド水溶液を形成し、コレステロールを沈殿させることが示されている。サポニンが細胞膜付近にある場合、それらは、膜において細孔状構造を生じ、それにより膜を破裂させる。赤血球の溶血はこの現象の一例であり、全てではないが、特定のサポニンの性質である。
【００６３】
サポニンは全身投与のためのワクチン中のアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血作用は、当該技術分野において広範囲に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，上記）。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（南アメリカの木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮由来）、およびその画分は、米国特許第５，０５７，５４０号および「Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」，Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ，１９９６，１２（１−２）：１−５５；および欧州特許第０３６２２７９Ｂ１号に記載されている。Ｑｕｉｌ Ａの画分を含む、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる微粒子構造は、溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．，欧州特許第０１０９９４２Ｂ１号、国際公開第９６／１１７１１号、国際公開第９６／３３７３９号）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）は、有効な全身アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号および欧州特許第０３６２２７９Ｂ１号に開示されている。全身ワクチン接種研究に使用されている他のサポニンには、ジプソフィラ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）およびサポナリア（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）などの他の植物種由来のものが含まれる（Ｂｏｍｆｏｒｄら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１０（９）：５７２−５７７，１９９２）。
【００６４】
改善された系は、非毒性のリピドＡ誘導体とサポニン誘導体との組み合わせ、特に国際公開第９４／００１５３号に開示されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ、または国際公開第９６／３３７３９号に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされる少ない反応原性組成物を含む。
【００６５】
水中油型エマルション中のＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを含む特に有効なアジュバント製剤は国際公開第９５／１７２１０号に記載されており、好ましい製剤である。
【００６６】
従って、本発明の一実施形態において、無毒性のリピドＡまたはリピドＡの非毒性誘導体でアジュバント化された、より好ましくはモノホスホリルリピドＡまたはその誘導体でアジュバント化された本発明のインフルエンザ抗原調製物を含むワクチンが提供される。
【００６７】
好ましくは、ワクチンはサポニン、より好ましくはＱＳ２１をさらに含む。
【００６８】
好適には、免疫原性組成物はアジュバント化される。好ましくは、製剤は水中油型エマルションをさらに含む。好適には、水中油型エマルションはスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）を含む。好適には、水中油型エマルションは、トコフェロール、好ましくはα−トコフェロールなどのトコールをさらに含む。特定の実施形態において、水中油型エマルションは、スクアランまたはスクアレンなどの代謝可能な非毒性油、必要に応じてトコフェロール、特にαトコフェロールなどのトコール（および必要に応じてスクアレンとαトコフェロールの両方）および非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ８０（商標）またはポリソルベート８０などの乳化剤（または界面活性剤）を含む。特定の実施形態において、油エマルションはコレステロールなどのステロールをさらに含む。
【００６９】
従って、一実施形態において、本発明は、アジュバント化された免疫原性組成物の小児用量を提供し、前記アジュバントは、１〜１２ｍｇ／用量の間、好適には２〜８ｍｇ／用量の間、好適には３〜６ｍｇ／用量の間のレベルで代謝可能な油、好適にはスクアレンを含む水中油型エマルションアジュバントを含む。１１ｍｇ／用量未満の量のスクアレンが小児に適切である。さらに別の実施形態において、本発明は、アジュバント化された免疫原性組成物の用量を提供し、前記アジュバントは、１〜１３ｍｇ／用量の間、好適には２〜１０ｍｇ／用量の間、好適には４〜９ｍｇ／用量の間、好適には２〜５ｍｇ／用量の間のレベルでトコール、好適にはα−トコフェロールをさらに含む。好ましい小児用組成物は、（ｉ）５〜６ｍｇスクアレン、２〜３ｍｇ乳化剤、５〜７ｍｇトコール／ヒト用量を含むアジュバント、（ｉｉ）２〜３ｍｇスクアレン、１〜１．５ｍｇ乳化剤、および２．５〜３．５ｍｇトコール／ヒト用量を含むアジュバント、（ｉｉｉ）０．５〜１．５ｍｇスクアレン、０．２５〜０．７５ｍｇ乳化剤、および０．５〜１．５ｍｇトコール／用量を含むアジュバントのリストから選択されるアジュバントを含む。
【００７０】
本発明はまた、本発明の抗原調製物と、３Ｄ−ＭＰＬなどの薬学上許容可能な賦形剤とを一緒に混合することを含む、ワクチン製剤を製造するための方法を提供する。
【００７１】
本発明に係るワクチンは、特に非イオン性界面活性剤であり得る少なくとも１つの界面活性剤をさらに含んでもよい。好適な非イオン性界面活性剤は、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば市販のＴｒｉｔｏｎ（商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（商標）シリーズ）およびポリオキシエチレンエーテルまたは一般式（Ｉ）のエステル：
（Ｉ）ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
（式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである）、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される。
【００７２】
式（Ｉ）の範囲内の好ましい界面活性剤は、ｎが４〜２４、より好ましくは６〜１２、および最も好ましくは９であり、Ｒ成分がＣ１−５０、好ましくはＣ４−Ｃ２０アルキル、および最も好ましくはＣ１２アルキルである分子である。
【００７３】
オクチルフェノキシポリオオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルは、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｅｄｓ：Ａｔｔｗｏｏｄ ａｎｄ Ｆｌｏｒｅｎｃｅ（１９８３，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ）に記載されている。ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標））を含む、オクチルフェノキシポリオキシエタノール（オクトキシノール）もまた、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ Ｅｎｔｒｙ ６８５８（１１６２ページ，第１２版，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ；ＩＳＢＮ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標））を含む、ポリオキシエチレンソルビタンエステルは、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ Ｅｎｔｒｙ ７７４２（１３０８ページ，第１２版，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ；ＩＳＢＮ ０９１１９１０−１２−３に記載されている。両方ともその文献に記載されている方法を用いて製造できるか、またはＳｉｇｍａ Ｉｎｃ．などの市販の供給源から購入できる。
【００７４】
特に好ましい非イオン性界面活性剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−４５、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０２、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５、ＴｒｉｔｏｎＸ−２０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、ＴｒｉｔｏｎＮ−５７、ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＮ−１２８、Ｂｒｅｉｊ３５、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）およびポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ステアレス９）が挙げられる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびラウレス９が特に好ましい。また、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））も特に好ましい。
【００７５】
一般式（Ｉ）のさらに好適なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。
【００７６】
ポリオキシエチレンラウリルエーテルに関する代替の用語または名称は、ＣＡＳレジストリに開示されている。ポリオキシエチレン−９ラウリルエーテルのＣＡＳレジストリ番号は、９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（第１２版：ｅｎｔｒｙ ７７１７，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ；ＩＳＢＮ ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ラウレス９は、エチレンオキシドとドデシルアルコールとを反応させることにより形成され、９個のエチレンオキシド単位の平均を有する。
【００７７】
記載した界面活性剤の異なる群からの２つ以上の非イオン性界面活性剤が、本明細書に記載したワクチン製剤中に存在してもよい。特に、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（商標）などのオクトキシノールとの組み合わせが好ましい。別の特に好ましい非イオン性界面活性剤の組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルもしくはオクトキシノールまたはその両方を含む。
【００７８】
上記に説明したものなどの非イオン性界面活性剤は、以下のような最終ワクチン組成物中の好ましい濃度を有する：Ｔｗｅｅｎ８０（商標）などのポリオキシエチレンソルビタンエステル：０．０１〜１％、最も好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標）またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤などのオクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール：０．００１〜０．１％、最も好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）、ラウレス９などの一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテル：０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、および最も好ましくは０．１〜１％または約０．５％（ｗ／ｖ）。
【００７９】
特定のワクチン製剤に関して、他のワクチン成分が製剤中に含まれてもよい。従って、本発明の製剤はまた、特に塩の形態で胆汁酸またはその誘導体を含んでもよい。それらは、コール酸の誘導体およびその塩、特にコール酸またはコール酸誘導体のナトリウム塩を含む。胆汁酸およびその誘導体の例としては、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸および上述の胆汁酸のグリセロ−、タウロ−、アミドプロピル−１−プロパンスルホニック−、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホニック誘導体などの誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドが挙げられる。特に好ましい例は、最終ワクチン用量中に存在し得るデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である。
【００８０】
本発明に係るワクチンが充填されたワクチン投与デバイスを含む医薬キットもまた本発明により提供される。そのような投与デバイスとしては、限定されないが、ニードルデバイス、液体ジェットデバイス、粉末デバイス、および噴霧デバイス（鼻腔内用途のため）が挙げられる。
【００８１】
本発明に係るインフルエンザウイルス抗原調製物は、従来の孵化卵法から誘導され得るか、またはそれらは、ウイルスを増殖させるか、または組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現する組織培養を用いる新世代法のいずれかから誘導され得る。ウイルスを増殖させるための好適な細胞基質としては、例えば、ＭＤＣＫなどのイヌ腎臓細胞、またはＭＤＣＫ、ＭＤＣＫ様細胞のクローン由来の細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含むＡＧＭＫ細胞などのサル腎臓細胞、適切なブタ細胞株、またはワクチン目的のためのインフルエンザウイルスの生成に適切な任意の他の哺乳動物細胞種類が挙げられる。好適な細胞基質としてはまた、ヒト細胞、例えばＭＲＣ−５細胞またはＰｅｒ．Ｃ６細胞株が挙げられ、ニワトリまたはアヒル細胞株（例えばニワトリまたはアヒル胚幹細胞由来のＥＢ１４（登録商標）、ＥＢ２４（登録商標）またはＥＢ６６（登録商標）などのＥＢｘ（登録商標）細胞株）などのトリ細胞および細胞株も挙げられる。ＥＢ６６（登録商標）が特に好ましい。他の好適な昆虫細胞はＳｆ９またはＨｉ５である。好適な細胞基質は、細胞株に限定されず、例えばニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞株も含まれる。
【００８２】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、任意の数の商業的に適用可能なプロセス、本明細書に参照として組み込まれる、独国特許第３００８３３号および独国特許第２１１４４４号に記載されている例えばスプリットインフルエンザプロセスにより生成され得る。従来のスプリットインフルエンザは、Ｔｗｅｅｎ（商標）（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットとしても知られている）と共にトリ−ｎ−ブチルホスフェート、またはジエチルエーテルなどの溶媒／洗浄剤処理を用いて生成されており、このプロセスは一部の製造施設において今も使用されている。他の現在利用されている分割（スプリット）剤としては、洗浄剤またはタンパク質分解酵素または胆汁塩、例えば本明細書に参照として組み込まれる独国特許第１５５８７５号に記載されているデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。分割剤として使用され得る洗浄剤としては、陽イオン洗浄剤、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、他のイオン性洗浄剤、例えばラウリル硫酸、タウロデオキシコール酸、またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００（例えばＬｉｎａら，２０００，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２８，９５−１０３に記載されるプロセスにおける）およびＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、または任意の２つ以上の界面活性剤の組み合わせを含む上記のものなどの非イオン性洗浄剤が挙げられる。
【００８３】
スプリットワクチンについての調製プロセスは、種々の組み合わせで超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離およびクロマトグラフィー（例えばイオン交換）工程などの複数の異なる濾過および／または他の分離工程、ならびに必要に応じて例えば分割（スプリット）前または後に実施され得る、熱、ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはＵ．Ｖ．でのインキュベーション工程を含む。分割（スプリット）プロセスは、バッチの連続または半連続プロセスとして実施され得る。
【００８４】
本発明に係る好ましいスプリットインフルエンザワクチン抗原調製物は、精製プロセスから残存している残存量のＴｗｅｅｎ８０および／またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むが、スプリット抗原の調製後に、それらは加えられてもよいか、またはそれらの濃度が調節されてもよい。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００の両方が存在する。ワクチン用量におけるこれらの非イオン性界面活性剤の最終濃度についての好ましい範囲は、以下の通りである：
Ｔｗｅｅｎ８０：０．０１〜１％、より好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：０．００１〜０．１（％ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）。
【００８５】
代替として、本発明に係るインフルエンザウイルス抗原調製物は、生インフルエンザウイルス以外の供与源由来であってもよく、例えば血球凝集素抗原が組換えにより生成されてもよい。
【００８６】
ここで本発明を以下の非限定的な実施例においてさらに記載する。
【実施例】
【００８７】
実施例１−防腐剤を含まないワクチン（チオマーサル減少ワクチン）のための安定剤としてのα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
一価スプリットワクチンを以下の手順に従って調製した。
【００８８】
ウイルス接種の調製
孵化卵の接種の日に、作業種ロットと、０．５ｍｇ／ｍｌにて硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌにてヒドロコルチゾン（ウイルス株依存性）を含有するリン酸緩衝生理食塩水とを混合することによって新たな接種材料を調製する。ウイルス接種材料を２〜８℃に維持する。
【００８９】
孵化卵の接種
９〜１１日齢の孵化卵をウイルス複製のために使用する。殻を除去する。その卵を０．２ｍｌのウイルス接種材料で接種する。接種した卵を４８〜９６時間、適切な温度（ウイルス株依存性）にてインキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、胚を冷却することにより殺傷し、卵を２〜８℃にて１２〜６０時間保存する。
【００９０】
収集
冷却した孵化卵からの尿膜腔液を収集する。通常、８〜１０ｍｌの粗尿膜腔液を１つの卵当たり回収する。
【００９１】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清浄化
収集した尿膜腔液を、適度な速度の遠心分離（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。
【００９２】
２．吸着工程
清浄化したウイルスプール中のＣａＨＰＯ４ゲルを得るために、０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２溶液を加えて、ウイルス株に依存して１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルのＣａＨＰＯ４の最終濃度にする。
【００９３】
最後の８時間の沈殿の後、上清を除去し、インフルエンザウイルスを含有する沈殿物を、使用するＣａＨＰＯ４の量に依存して０．２６ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を加えることにより再び可溶化する。
【００９４】
３．濾過
再懸濁した沈殿物を６μｍのフィルター膜で濾過する。
【００９５】
４．ショ糖密度勾配遠心法
インフルエンザウイルスを、１００μｇ／ｍｌチオマーサルを含有する線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心法により濃縮する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【００９６】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を４つの異なる画分により回収する（ショ糖は屈折計で測定する）。
【００９７】
画分１ ５５〜５２％ショ糖
画分２ 約５２〜３８％ショ糖
画分３ ３８〜２０％ショ糖＊
画分４ ２０〜０％ショ糖
＊ウイルス株依存性：画分３は１５％ショ糖まで減少し得る。
【００９８】
さらなるワクチン調製のために、画分２および３のみを使用する。
【００９９】
ショ糖含有量を約６％以下に低下させるために、画分３をリン酸緩衝液を用いて透析濾過により洗浄する。この希釈した画分に存在するインフルエンザウイルスをペレット状にし、可溶性の汚染物質を除去する。
【０１００】
ペレットを再懸濁し、完全に混合して、均一な懸濁液を得る。画分２および画分３の再懸濁したペレットをプールし、リン酸緩衝液を加えて、約４０リットルの体積を得る。この生成物は一価の全ウイルス濃縮物である。
【０１０１】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ）（ここで、デオキシコール酸ナトリウム勾配がさらに重ね合わせられる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は０．１％（ｗ／ｖ）まで分割（スプリット）中に存在し、トコフェロールコハク酸エステルを０．５ｍＭまでＢ型株ウイルスに加える。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１０２】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分によって回収する（ショ糖は屈折計で測定する）。画分２をさらなる処理のために使用する。画分制限についてのショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１０３】
６．濾過滅菌
スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１０４】
７．不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を、最大２５０μｇ／ｍｌまで全タンパク質含有量を減少させるために加える。Ｂ型株ウイルスについて、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈に適用して、全タンパク質含有量を２５０μｇ／ｍｌまで減少させる。ホルムアルデヒドを５０μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加えて、不活化を２０℃±２℃にて少なくとも７２時間行う。
【０１０５】
８．限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置において少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液、およびその後、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスについて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールコハク酸塩を含有するリン酸緩衝生理食塩水を洗浄に使用する。
【０１０６】
９．最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、必要な場合、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないようにその物質を、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈する。
【０１０７】
１０．保存
一価最終バルクを最大１８カ月間、２〜８℃にて保存する。
【０１０８】
安定性
【０１０９】
実施例２−チオマーサル減少ワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザワクチンの調製
３つの株、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価最終バルクを実施例１に記載した方法に従って生成した。
【０１１０】
プール
一価最終バルクの適切な量を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７それぞれについて３０μｇ／ｍｌ、およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８について３９μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度でプールした。Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００をそれぞれ５８０μｇ／ｍｌおよび９０μｇ／ｍｌに調節した。最終体積をリン酸緩衝生理食塩水で３ｌに調節した。三価プールを０．８μｍ酢酸セルロース膜で最後に濾過して、三価最終バルクを得た。三価最終バルクを各々少なくとも０．５ｍＬにてシリンジに充填した。
【０１１１】
【０１１２】
実施例３−血球凝集素含有量を測定するために使用したＳＲＤ法
ガラスプレート（１２．４−１０．０ｃｍ）を、ＮＩＢＳＣによって推奨されている抗インフルエンザＨＡ血清の濃度を含有するアガロースゲルでコーティングする。ゲルをセットした後、７２サンプルウェル（３ｍｍφ）をアガロース中で穴を開ける。基準物質の１０μｌの適切な希釈物およびサンプルをウェルに負荷する。湿室内で室温（２０〜２５℃）にて２４時間、プレートをインキュベートする。その後、プレートをＮａＣｌ溶液で一晩浸し、蒸留水中で簡単に洗浄する。次いでゲルをプレスし、乾燥させる。完全に乾燥させて、プレートを１０分間クマシーブリリアントブルー溶液で染色し、明確に規定された染色領域が目に見えるまで、メタノールと酢酸との混合物中で２回脱染する。プレートを乾燥させた後、抗原ウェル周囲の染色領域の直径を直角で２方向において測定する。代替として、表面を測定する装置を使用してもよい。表面に対する抗原希釈物の用量反応曲線を構築し、結果を標準的な勾配比アッセイ法に従って計算する（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．（１９５２）．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｑｕｏｔｅｄ：Ｗｏｏｄ，ＪＭら（１９７７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．５，２３７−２４７）。
【０１１３】
実施例４−α−トコフェロール安定化インフルエンザワクチン（減少チオマーサル）の臨床検査
実施例２に記載したように得たシリンジを臨床検査に使用する：
Ｈ３Ｎ２：Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ ＲＥＳＶＩＲ−１７
Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１） ＩＶＲ−１１６
Ｂ：Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８。
【０１１４】
表３
【０１１５】
結果は、ワクチンが、防腐剤としてチオマーサルを含有するワクチンに対して等価の防御を与えることができることを示す。
【０１１６】
実施例５ａ−チオマーサルを含まないワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
一価スプリットワクチンを以下の手順に従って調製した。
【０１１７】
ウイルス接種材料の調製
孵化卵の接種の日に、新しい接種材料を、作業種ロットと、０．５ｍｇ／ｍｌにて硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌにてヒドロコルチゾンを含有するリン酸緩衝生理食塩水とを混合することによって調製する（ウイルス株依存性）。ウイルス接種材料を２〜８℃に維持する。
【０１１８】
孵化卵の接種
９〜１１日齢の孵化卵をウイルス複製のために使用する。殻を除去する。０．２ｍｌのウイルス接種材料を卵に接種する。６０，０００個の接種した卵を適切な温度（ウイルス株依存）で４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに胚を冷却により殺傷し、卵を２〜８℃にて１２〜６０時間保存する。
【０１１９】
収集
冷却した孵化卵からの尿膜腔液を収集する。通常、８〜１０ｍｌの粗尿膜腔液を１個の卵当たり回収する。
【０１２０】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
清浄化
収集した尿膜腔液を適度な速度の遠心分離（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。
【０１２１】
沈殿工程
飽和硫酸アンモニウム溶液を清浄化したウイルスプールに加えて、０．５ｍｏｌ／Ｌの最終硫酸アンモニウム濃度に到達させる。少なくとも１時間の沈殿の後、デプスフィルタ（典型的に０．５μｍ）での濾過により沈殿物を除去する。
【０１２２】
濾過
清浄化した粗全ウイルスバルクを、有効な滅菌膜（典型的に０．２μｍ）を用いて最後にフィルター膜で濾過する。
【０１２３】
限外濾過
濾過滅菌した粗一価全ウイルスバルクを、１０００ｋＤａ ＭＷＣＯ ＢＩＯＭＡＸ（商標）膜を備えたカセットで少なくとも６倍濃縮する。濃縮した残余分をリン酸緩衝生理食塩水で少なくとも１．８回洗浄する。
【０１２４】
ショ糖密度勾配遠心法
インフルエンザウイルスを線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））において等密度遠心法により濃縮する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１２５】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を４つの異なる画分により回収する（ショ糖は屈折計で測定する）：
画分１ ５５〜５２％ショ糖
画分２ 約５２〜３８％ショ糖
画分３ ３８〜２０％ショ糖＊
画分４ ２０〜０％ショ糖
＊ウイルス株依存性：画分３は１５％ショ糖まで減少し得る。
【０１２６】
さらなるワクチン調製物のために、画分２のみを使用するか、またはさらに精製した画分３と共に画分２を使用する。
【０１２７】
ショ糖含有量を約６％以下に減少させるために、画分３を透析濾過によりリン酸緩衝液で洗浄する。必要に応じてこの工程は省略してもよい。この希釈した画分に存在するインフルエンザウイルスをペレット状にして、可溶性汚染物質を除去する。
【０１２８】
ペレットを再懸濁し、十分に混合して、均一な懸濁液を得る。画分２および再懸濁した画分３のペレットをプールし、リン酸緩衝液を加えて、約４０リットルの体積を得る。この生成物は一価の全ウイルス濃縮物である。
【０１２９】
デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））（ここでデオキシコール酸ナトリウム勾配をさらに重ね合わせる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は、分割（スプリット）の間、０．１％（ｗ／ｖ）まで存在し、トコフェロールコハク酸エステルをＢ型株ウイルスについて０．５ｍＭまで加える。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１３０】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分（ショ糖は屈折計で測定する）によって回収し、画分２をさらなる処理のために使用する。画分制限についてショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１３１】
濾過滅菌
スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株について）０．５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝液を希釈のために使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１３２】
不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで全タンパク質含有量を最大４５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を加える。Ｂ型株について、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈に適用して、全タンパク質含有量を４５０μｇ／ｍｌまで減少させる。ホルムアルデヒドを１００μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化は少なくとも７２時間、２０℃±２℃にて行う。
【０１３３】
限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置で少なくとも２倍に濃縮する。その後、その物質を０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液、続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスについて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を洗浄に使用する。
【０１３４】
最終滅菌濾過
限外濾過後にその物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、必要な場合、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えない場合、その物質を、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、およびＢ型株について特に０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈する。
【０１３５】
保存
一価最終バルクを、最大１８ヶ月間、２〜８℃にて保存する。
【０１３６】
安定性
【０１３７】
実施例５ｂ−チオマーサルを含まないワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
実施例５ａに記載される方法の好ましい変更は以下の通りである：
全ウイルスを収集し、その後、沈殿工程を行う（硫酸アンモニウム沈殿）。この後、清浄化工程を行い、流体を適度な速度の遠心分離（範囲４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。このように沈殿および清浄化工程の順序は実施例５ａと比べて逆である。
【０１３８】
滅菌濾過、限外濾過および超遠心分離法（ショ糖密度勾配遠心法）の工程は実施例５ａに従う。しかしながら、超遠心分離法の工程から得られた画分の再処理工程は必要としない。
【０１３９】
プロセスの残りの工程は実施例５ａに記載される通りである。
【０１４０】
このように、この実施例において要約したプロセスは以下の通りである：
収集
沈殿（硫酸アンモニウム）
清浄化
濾過滅菌
限外濾過
超遠心分離法
分割（スプリット）（好ましくはデオキシコール酸ナトリウム）
濾過滅菌
不活化
限外濾過
最終濾過滅菌。
【０１４１】
実施例５ａの別の好ましい変更は、第１の濾過滅菌の前に前濾過工程を含む。これは滅菌フィルターでない膜を使用するが、汚染物質、例えば濾過滅菌の前のアルブミンの除去を可能にする。これにより、より良い収率が得られ得る。前濾過のための好適な膜は約０．８μｍ〜約１．８μｍ、例えば１．２μｍである。前濾過工程は実施例５ａまたは実施例５ｂのスキームにおいて使用され得る。
【０１４２】
実施例６−チオマーサルを含まないワクチンのための安定剤としてα−トコフェロールコハク酸エステルを用いるインフルエンザワクチンの調製
３つの株、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価最終バルクを、実施例５に記載した方法に従って生成した。
【０１４３】
プール
適切な量の一価最終バルクを、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７それぞれについて３０μｇ／ｍｌ、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９７について３６μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度でプールした。Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００をそれぞれ５８０μｇ／ｍｌおよび９０μｇ／ｍｌに調節した。リン酸緩衝生理食塩水で最終体積を３ｌに調節した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜を用いて最後に濾過して、三価最終バルクを得た。三価最終バルクを各々少なくとも０．５ｍＬでシリンジに充填した。
【０１４４】
【０１４５】
実施例７−防腐剤を含まないワクチン（チオマーサル減少ワクチン）のための安定剤としてラウリル硫酸ナトリウムを用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価全ウイルス濃縮物を実施例１に記載したように得た。
デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは、線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））（ここで、デオキシコール酸ナトリウム勾配がさらに重ね合わされる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は、分割（スプリット）の間、０．１％（ｗ／ｖ）まで存在する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１４６】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分（ショ糖は屈折計で測定する）によって回収する。画分２をさらに処理するために使用する。画分制限についてショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１４７】
濾過滅菌
画分２の１０ｍｌのサンプルをさらなる処理のために取った。スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝液を希釈のために使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１４８】
不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで全タンパク質含有量を最大２５０μｇ／ｍｌまで減少させるために、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水を加える。ホルムアルデヒドを５０μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化を少なくとも７２時間、２０℃±２℃で行う。
【０１４９】
限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置において少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎおよび０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有する４容量のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【０１５０】
最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。濾過膜をリンスし、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないことが必要な場合、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．５ｍＭラウリル硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水でその物質を希釈する。
【０１５１】
保存
一価最終バルクを２〜８℃で保存する。
【０１５２】
【０１５３】
実施例８−防腐剤を含まないワクチン（チオマーサル減少ワクチン）のための安定剤としてプランタケア（Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ）またはラウレス−９を用いるインフルエンザウイルス抗原調製物の調製
Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８の一価全ウイルス濃縮物を実施例１に記載したように得た。
断片化
一価全インフルエンザウイルス濃縮物を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を用いて１，０００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈する。プランタケア（登録商標）２０００ＵＰまたはラウレス−９を１％（ｗ／ｖ）の最終濃縮物に加える。その物質を３０分間わずかに混合する。次いでその物質をバケット内のショ糖クッション１５％（ｗ／ｗ）で覆う。ローターＳＷ２８をスイングするＢｅｃｋｍａｎにおける超遠心分離を２５，０００ｒｐｍにて２時間、２０℃で実施する。
【０１５４】
濾過滅菌
上清をさらなる処理のために取った。スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。
【０１５５】
不活化
必要な場合、全タンパク質含有量を最大５００μｇ／ｍｌまで減少させるために、リン酸緩衝生理食塩水を加える。ホルムアルデヒドを１００μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化を２０℃±２℃にて少なくとも６日間行う。
【０１５６】
限外濾過
不活化物質中でＴｗｅｅｎ８０およびＴｒｉｔｏｎＸ１００をそれぞれ０．１５％および０．０２％に調節する。不活化スプリットウイルス物質を、３０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置で少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を４容量のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。
【０１５７】
最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、タンパク質濃度が５００μｇ／ｍｌを超えないようにリン酸緩衝生理食塩水で物質を希釈する。
【０１５８】
保存
一価最終バルクを２〜８℃に保存する。
【０１５９】
【０１６０】
実施例９−ＩＤおよびＩＭ投与による高齢者におけるα−トコフェロール安定化インフルエンザワクチン（減少チオマーサル）の臨床検査
Ａ インフルエンザウイルス抗原調製物の調製
一価スプリットワクチンを以下の手順に従って調製した。
【０１６１】
ウイルス接種材料の調製
孵化卵の接種の日に、新しい接種材料を、作業種ロットと、０．５ｍｇ／ｍｌにて硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌにてヒドロコルチゾン（ウイルス株依存性）を含有するリン酸緩衝生理食塩水とを混合することによって調製する。ウイルス接種材料を２〜８℃に維持する。
【０１６２】
孵化卵の接種
９〜１１日齢の孵化卵をウイルス複製のために使用する。殻を除去する。０．２ｍｌのウイルス接種材料を卵に接種する。接種した卵を適切な温度（ウイルス株依存性）で４８〜９６時間インキュベートする。インキュベーション時間の終わりに、胚を冷却により殺傷し、卵を２〜８℃にて１２〜６０時間保存する。
【０１６３】
収集
冷却した孵化卵からの尿膜腔液を収集する。通常、８〜１０ｍｌの粗尿膜腔液を１個の卵当たり回収する。
【０１６４】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清浄化
収集した尿膜腔液を適度な速度の遠心分離（範囲：４０００〜１４０００ｇ）により清浄化する。
【０１６５】
２．吸着工程
清浄化したウイルスプール中のＣａＨＰＯ４ゲルを得るために、０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４および０．５ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２溶液を加えて、ウイルス株に依存して１．５ｇ〜３．５ｇＣａＨＰＯ４／リットルのＣａＨＰＯ４の最終濃度にする。
【０１６６】
最後の８時間の沈殿の後、上清を除去し、インフルエンザウイルスを含有する沈殿物を、使用するＣａＨＰＯ４の量に依存して０．２６ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を加えることにより再び可溶化する。
【０１６７】
３．濾過
再懸濁した沈殿物を６μｍのフィルター膜で濾過する。
【０１６８】
４．ショ糖密度勾配遠心法
インフルエンザウイルスを、１００μｇ／ｍｌチオマーサルを含有する線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ））で等密度遠心法により濃縮する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１６９】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を４つの異なる画分により回収する（ショ糖は屈折計で測定する）：
画分１ ５５〜５２％ショ糖
画分２ 約５２〜３８％ショ糖
画分３ ３８〜２０％ショ糖＊
画分４ ２０〜０％スクロール
＊ウイルス株依存性：画分３は１５％ショ糖まで減少し得る。
【０１７０】
さらなるワクチン調製のために、画分２および３のみを使用する。
【０１７１】
ショ糖含有量を約６％以下に低下させるために、画分３をリン酸緩衝液を用いて透析濾過により洗浄する。この希釈した画分に存在するインフルエンザウイルスをペレット状にし、可溶性の汚染物質を除去する。
【０１７２】
ペレットを再懸濁し、完全に混合して、均一な懸濁液を得る。画分２および画分３の再懸濁したペレットをプールし、リン酸緩衝液を加えて、１２０，０００卵／バッチに適切な体積である、約４０リットルの体積を得る。この生成物は一価の全ウイルス濃縮物である。
【０１７３】
５．デオキシコール酸ナトリウムを用いるショ糖密度勾配遠心法
一価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−ＭａｒｋＩＩ超遠心分離器に適用する。Ｋ３ローターは線形ショ糖密度勾配（０．５５％（ｗ／ｖ）（ここで、デオキシコール酸ナトリウム勾配がさらに重ね合わせられる）を含有する。Ｔｗｅｅｎ８０は０．１％（ｗ／ｖ）まで分割（スプリット）中に存在し、コハク酸トコフェロールをＢ型株ウイルスについて０．５ｍＭまで加える。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株依存性である。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１７４】
遠心分離の終わりに、ローターの内容物を３つの異なる画分によって回収する（ショ糖は屈折計で測定する）。画分２をさらなる処理のために使用する。画分制限についてのショ糖含有量（４７〜１８％）は株に応じて変化し、測定後に固定する。
【０１７５】
６．濾過滅菌
スプリットウイルス画分を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝液を希釈に使用する。濾過した画分２の最終体積は元の画分体積の５倍である。
【０１７６】
７．不活化
濾過した一価物質を多くても８４時間、２２±２℃にてインキュベートする（ウイルス株に依存し、このインキュベーションは短縮できる）。次いで、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液を、最大２５０μｇ／ｍｌまで全タンパク含有量を減少させるために加える。Ｂ型株ウイルスについて、０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．２５ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈に適用して、全タンパク質含有量を２５０μｇ／ｍｌまで減少させる。ホルムアルデヒドを５０μｇ／ｍｌの最終濃縮物に加え、不活化を２０℃±２℃にて少なくとも７２時間行う。
【０１７７】
８．限外濾過
不活化スプリットウイルス物質を、２０ｋＤａ ＭＷＣＯを有する酢酸セルロース膜を備えた、限外濾過装置において少なくとも２倍に濃縮する。続いて、その物質を０．０２５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するリン酸緩衝液、およびその後、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。Ｂ型株ウイルスについて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水を洗浄に使用する。
【０１７８】
９．最終濾過滅菌
限外濾過後の物質を、０．２μｍ膜を用いて最後にフィルター膜で濾過する。フィルター膜をリンスし、必要な場合、タンパク質濃度が１，０００μｇ／ｍｌを超えず、血球凝集素濃度が１８０μｇ／ｍｌを超えるように、その物質を０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および（Ｂ型株ウイルスについて）０．１ｍＭトコフェロールコハク酸エステルを含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈する。
【０１７９】
１０．保存
一価最終バルクを最大１８カ月間、２〜８℃にて保存する。
【０１８０】
Ｂ インフルエンザワクチンの調製
３つの株、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９の一価最終バルクを、上記のパートＡに記載した方法に従って生成した。
【０１８１】
プール
適切な量の一価最終バルクを、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ＩＶＲ−１１６、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）Ｒｅｓｖｉｒ−１７それぞれについて６０μｇ／ｍｌ、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９について６８μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度でプールした。Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびトコフェロールコハク酸エステルをそれぞれ１，０００μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌおよび１６０μｇ／ｍｌに調節した。リン酸緩衝生理食塩水で最終体積を３ｌに調節した。三価プールを、０．８μｍ酢酸セルロース膜を用いて最後に濾過して、三価最終バルクを得た。三価最終バルクを各々少なくとも０．１６５ｍＬでシリンジに充填した。
【０１８２】
ワクチン投与
ワクチンを予め充填したシリンジに供給し、三角筋部に皮内投与した。皮内（ＩＤ）ニードルは欧州特許第１０９２４４４号に記載されており、適切な皮内注射を確実にするために皮膚浸透制限器を有する。注射部位における腫れ（丘疹）の形成は良質なＩＤ投与であると実証されているので、被験体と共に調査員が、ワクチン接種の３０分後に腫れの正確なサイズを測定した。
【０１８３】
１用量（１００μｌ）は以下の成分を含有した：
【０１８４】
Ｂ 上記のワクチンを標準的な三価スプリットインフルエンザワクチン：Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）と比較した。Ｆｌｕａｒｉｘワクチンを予め充填したシリンジに供給し、三角筋に筋肉注射により投与した。適切な筋肉内注射を確実にするために、少なくとも２．５ｃｍ／１インチの長さ（２３ゲージ）のニードルを使用した。
【０１８５】
１用量（０．５ｍｌ）は以下の成分を含有した：
【０１８６】
結果
ワクチン投与時における全コホートの平均年齢は７０．４±６．２歳の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）であり、女性／男性比は１．７：１であった。
【０１８７】
【０１８８】
１０／６５（１５．４％）のワクチン接種者により報告される、注射部位の痛みは、Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）のＩＭ投与後の最も一般的な症状であった。ＩＤ群において、痛みは３／６５（４．６％）のワクチン接種者により報告された。この相違は統計的に有意であった（ｐ＝０．０３８；フィッシャーの正確確率検定）。従って、チオマーサル減少製剤のＩＤ送達が好ましい。
【０１８９】
結論
高齢者集団においてチオマーサル減少インフルエンザワクチンのＩＤおよびＩＭ投与の両方は１００％の血清防御を与えることができる。
【０１９０】
幾何平均力価、血清防御率、セロコンバージョン率およびコンバージョン係数に関してワクチン接種に対する比較可能な反応がＩＭおよびＩＤでワクチン接種した個体において見出され、ＩＤ群は２．５倍低い抗原を受けた。２つの治療群においてワクチンに関連する応答型／非応答型の全身症状の全発生率の識別可能な相違はなかった。
【０１９１】
実施例１０−チオマーサル減少インフルエンザワクチンの皮内送達
（プールを独立して行い、ワクチンをシリンジに充填しなかったことを除いて）実施例９に記載したように調製したチオマーサル減少スプリットインフルエンザワクチンの免疫原性を、標準的なニードルを用いてモルモットにおいてＩＤ送達により評価した。
【０１９２】
５匹の動物の群を各々、２００μｌの全体積で５μｇの各ＨＡを含有する全不活化三価インフルエンザウイルスを用いて鼻腔内で抗原刺激した。抗原刺激の２８日後に、皮内または筋肉内経路のいずれかで動物をワクチン接種した。０．１ｍｌの０．１、０．３、または１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザを含有する皮内用量を、標準的なニードルを用いてモルモットの背中に投与した。１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザの筋肉内用量を、０．１ｍｌの体積でモルモットの後肢に投与した。群は以下の通りであった：
群１−０．１μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＤ、
群２−０．３μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＤ、
群３−１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＤ、
群４−１．０μｇの三価チオマーサル減少スプリットインフルエンザＩＭ。
【０１９３】
ワクチン接種の１４日後、動物から採血し、ワクチン接種によって誘発された抗体力価を、標準的な血球凝集素アッセイ（ＨＩ）を用いて評価した。結果を図１に示す。全ての３つの株に対する強いＨＩ反応をワクチン接種によって誘発させた。明確な用量反応が示されなかったことにより、ＩＤ経路により投与した場合、非常に低い用量のチオマーサル減少抗原が依然として非常に有効なＨＩ抗体反応を誘発できることが示唆される。ＩＤまたはＩＭワクチン接種によって誘発されるＨＩ力価の間に有意な差はなかった。このように、モルモットにおいて得た結果により、チオマーサル減少三価スプリットインフルエンザ抗原は、ＩＭ経路と比較してＩＤ経路によって送達した場合、動物において同様のレベルのＨＩ抗体を誘発することが確認された。
【０１９４】
実施例１１−チオマーサル減少、アジュバント化インフルエンザワクチンの皮内送達
プロトコル
０日に、モルモットを２００μｌにおいて５μｇの三価全不活化インフルエンザウイルスにより鼻腔内で抗原刺激した。
【０１９５】
ワクチン接種−２８日−実施例９に記載したように調製した０．１μｇのＨＡ／株の三価スプリットインフルエンザを含有するワクチン（プールする工程により、各抗原について１．０μｇ／ｍｌの最終濃度を生じて、実施例９における６０μｇ／ｍｌと比べて１００μｌにおいて０．１μｇの用量を得たことを除く）。アジュバント化されたまたはアジュバント化されていない最終的な三価製剤を１００μｌでツベルクリンシリンジを用いて皮内投与した。
【０１９６】
出血−４２日
アジュバント化の効果を、ＨＩアッセイによる抗体反応（０、２８、４２日）を測定することによって評価した。
【０１９７】
全てのＩＤ実験は標準的なニードルを用いて実施した。
【０１９８】
結果
Ｇ１〜Ｇ５は各群あたり５匹の５群のモルモットを示す。
【０１９９】
Ｇ１ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ
Ｇ２ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇ
Ｇ３ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬ１０μｇ
Ｇ４ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ５０μｇ＋ＱＳ２１ ５０μｇ
Ｇ５ スプリット三価チオマーサル減少０．１μｇ＋３Ｄ−ＭＰＬｉｎ１０μｇ＋ＱＳ２１ １０μｇ。
【０２００】
３Ｄ−ＭＰＬｉｎ＋ＱＳ２１の記載は、ジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有する、コレステロールを含む単層ベシクルを含む、アジュバント製剤を示し、ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬは、脂質二重層と結合されているか、または脂質二重層内に包埋れている。このようなアジュバント製剤は欧州特許第０８２２８３１Ｂ号に記載されており、その開示は本明細書に参照として組み込まれる。
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
このように、アジュバント化されるかアジュバント化されないかに関わらず、チオマーサル減少三価スプリットインフルエンザ抗原は有効な免疫原であり、ＩＤまたはＩＭ経路によって投与した場合、強いＨＩ反応を誘発できる。これらの反応は、標準的なＦｌｕａｒｉｘ調製物によって誘発される反応と少なくとも同じほど有効であるように見える。
【０２０５】
実施例１２−ブタにおいて皮内送達したチオマーサルを含有するおよびチオマーサルを含まないワクチンの比較
ＩＤ経路によって投与したスプリットインフルエンザワクチン（プラスおよびマイナスチオマーサル）の免疫原性を評価するために、抗原刺激したブタモデルを使用した。大部分の集団は、インフルエンザによる少なくとも１回の感染を経験しているので、インフルエンザワクチンは、前から存在する免疫反応をブーストできなければならない。従って、ヒトの状況を最適に模倣するように動物を抗原刺激する。
【０２０６】
この実験において、４週齢のブタを鼻腔内経路によって抗原刺激した。６群の５匹の動物各々を以下のように抗原刺激した：
群１ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（５０μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激；
群２ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（５０μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激；
群３ ０日における三価全不活化ウイルス（５０μｇの各ＨＡ）での１回の抗原刺激；
群４ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（２５μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激；
群５ ０日における三価全不活化ウイルス（２５μｇの各ＨＡ）の１回の抗原刺激；
群６ ０および１４日における三価全不活化ウイルス（１２．５μｇの各ＨＡ）の２回の抗原刺激。
【０２０７】
最後の抗原刺激から２８日後に、ＩＤ経路によって、１００μｌにおける３μｇの各ＨＡ三価スプリット抗原（株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｐａｎａｍａ Ｈ３Ｎ２、およびＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ）を動物にワクチン接種した。群１には、ワクチン抗原としてチオマーサル防腐剤を含有する標準的なＦｌｕａｒｉｘ（商標）を与えた。全ての他の群には、防腐剤を含まない抗原を与えた。
【０２０８】
この実験で得たＨＩの結果を図２に示す（種々の抗原用量で抗原刺激し、皮内経路によって３μｇの三価インフルエンザ抗原＋（プラス）または−（マイナス）チオマーサルでワクチン接種したブタにおいて誘発された抗インフルエンザ血球凝集素阻害力価）。
【０２０９】
比較的低いＨＩ力価がこの実験においてＢ型株に対して誘発され、Ａ／Ｈ３Ｎ２株に対するバックグラウンドは高い。抗原刺激用量が低い場合、ワクチン接種に対する反応に関して有益な効果が観察される。ほとんど全ての場合、抗原濃度または抗原刺激投与の回数の減少（５０μｇを用いる２回の抗原刺激から）はワクチン接種に対して増大した反応を生じた。５０μｇで２回抗原刺激した、ワクチン接種に対する群１および２の動物の反応はそれほど明確ではないが、防腐剤を含まない抗原（群２）は、これらの条件下でＦｌｕａｒｉｘ（商標）（群１）と少なくとも同じほど機能することが見られる。代わりに抗原刺激した動物（群３〜６）においてＩＤ経路によって投与した防腐剤を含まない三価インフルエンザ抗原でのワクチン接種に対する強い反応は明らかであり、この反応はさらにＢ型株においても見られるが、ＨＩ力価は低いままである。
【０２１０】
実施例１３−６ヶ月から６歳未満の小児における第ＩＩＩ相二重盲検、無作為化、比較研究
１３．１ 方法
１３．１．１． 研究設計
基礎慢性疾患を有するかまたは有さず、インフルエンザに対して以前にワクチン接種を受けていない６ヶ月〜６歳未満の小児をこの研究に含めた。
【０２１１】
２用量の試験ワクチン（実施例５に記載したものと同様の方法に従って調製したＴＦインフルエンザスプリットワクチン）または対照ワクチン（２．５μｇ未満のチオマーサル／０．５ｍｌ用量を含有する、チオマーサル減少Ｉｎｆｌｕｓｐｌｉｔ ＳＳＷ（登録商標）／Ｆｌｕａｒｉｘ（商標））（６から３５ヶ月齢の小児に対して０．２５ｍｌおよび３６ヶ月から６歳未満の小児に対して０．５ｍｌ）を０日および２８±２日に投与した。両方のワクチンは、各々のウイルス株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ＩＶＲ−１１６）［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（ＲＥＳＶＩＲ−１７）［Ｈ３Ｎ２］およびＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７（すなわち、２００３／２００４インフルエンザシーズンの間、北半休で推奨されている株）の１５μｇのＨＡを含有した。
【０２１２】
１３．１．２ 免疫原性
免疫化前（０日）、２回目のワクチン接種の２１日後（４９±２日）、２回目のワクチン接種の３ヶ月後（１１８日／４ヶ月）および２回目のワクチン接種の６ヶ月後（２０８日／７ヶ月）に血清サンプルを回収した。標準的な手順に従って、ＨＡ阻害（ＨＩ）検査によって血清を分析した。検査に使用した抗原はワクチン製剤に含まれているものと同じであった（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ＩＶＲ−１１６）［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（ＲＥＳＶＩＲ−１７）［Ｈ３Ｎ２］およびＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７）。各血清を１：１０の開始希釈にて試験した。幾何平均力価（ＧＭＴ）、ＳＰＲ（すなわち、ワクチン接種後、血清ＨＩ力価≧１：４０を有する被験体の割合）、ＳＣＲ（すなわち、ワクチン接種前のＨＩ力価＜１：１０およびワクチン接種後の力価≧１：４０またはワクチン接種前の力価≧１：１０およびワクチン接種後の力価の少なくとも４倍増加のいずれかを有する被験体の割合）、およびＳＣＦ（すなわち、０日と比較したワクチン接種後のＨＩ ＧＭＴの倍率増加）を計算した。小児におけるインフルエンザワクチンの免疫原性評価についての指針はまだ確立されていないので、１８〜６０歳の成人におけるインフルエンザワクチンの評価に関するＣＨＭＰ基準に従って血清学の結果を評価した：ＳＰＲ＞７０％、ＳＣＲ＞４０％およびＳＣＦ＞２．５を、ワクチン免疫原性のカットオフレベルとみなした。加えて、血清防御力（ＳＰＰ；すなわち２回目のワクチン接種後に≧１：４０の血清防御力価を示したワクチン接種前に血清防御されていない被験体［０日に力価＜１：４０］の割合）をさらなる誘導パラメーターとして計算した。
【０２１３】
１３．２ 結果
１３．２．１ 反応原性および安全性
両方のワクチンは有益な安全性プロファイルを示した。
【０２１４】
１３．２．２ 免疫原性
各年齢およびワクチン群についての免疫原性の結果を表９および表１０にまとめる。全ての３つのワクチン株についてのワクチン接種前のＧＭＴは２つのワクチン群において同じ範囲内であった。ＴＦ群において２回目のワクチン接種から２１日後、ＧＭＴは、６〜３５ヶ月齢の小児に関して７１．３から２８３．０の間、および３６ヶ月〜６歳未満の小児に関して１８０．３から７１２．７の間の範囲であった。対照群において、ＧＭＴは、６〜３５ヶ月齢の小児に関して３１．３〜１１１．２の範囲であり、３６ヶ月〜６歳未満の小児に関して１６５．１〜５２９．８の範囲であった。２用量の後、成人におけるインフルエンザワクチンの免疫原性評価に関するＣＨＭＰ基準は、ＴＦ群において６〜３５ヶ月齢の小児および３６ヶ月〜６歳未満の小児の両方について満たした（表９および表１０）。対照群において、両方の年齢群についてＳＣＲおよびＳＣＦ基準のみが満たされた。ＳＰＲは、年長児（３６ヶ月〜６歳未満）において全ての３つの株に関して７０％より高かったが、低年齢の小児（６〜３５ヶ月齢）において３つの株のいずれも６５．９％を超えなかった。
【０２１５】
より長い追跡期間（すなわちワクチン接種後４ヶ月および７ヶ月）において、低レベルであるが免疫反応は持続した。持続は両方のワクチンおよび年齢群に関して同程度であった。
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
１３．３ 結論
Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）の新規のチオマーサルを含まない製剤およびチオマーサル減少Ｆｌｕａｒｉｘ（商標）（対照）の両方は免疫原性であり、良好な安全性プロファイルを示した。ＴＦワクチンは、６〜３５ヶ月齢の小児および３６〜６歳未満の小児の両方でかつ３つ全ての株に関して、成人について規定された３つ全てのＣＨＭＰ基準を満たすことが示された。免疫原性は、２用量の対照ワクチンを受けている小児と比べて、２用量のＴＦワクチンを受けている３歳より低年齢の小児において、より高くなることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体において免疫反応を上昇させる方法であって、前記ヒト被験体に、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ヒト被験体は、小児である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＲＤアッセイによって検出可能な量のＨＡの存在により決定されるように、前記α−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つは、前記調製物のＨＡが、前記調製物が生成された後少なくとも６ヶ月間、安定なままであるような量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記調製物は、α−トコフェロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記調製物は、α−トコフェロールコハク酸エステルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１０から５００μｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、スプリットウイルス抗原調製物、サブユニット抗原、および化学的にまたは他の方法で不活化された全ウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記不活化インフルエンザウイルス調製物は、スプリットまたはサブユニットウイルス抗原調製物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記不活化インフルエンザウイルス調製物は、Ａ型株およびＢ型株の両方のＨＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記調製物は、２つのＡ型株および１つのＢ型株のＨＡを含む、三価インフルエンザウイルス調製物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記調製物は、２つのＡ型株および２つのＢ型株のＨＡを含む、四価インフルエンザウイルス調製物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、約１５μｇ／ｍｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１５μｇ／ｍｌ未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の量は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、６〜９μｇ／用量の間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジュバントは、水中油型エマルションを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アジュバントは、スクアレンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アジュバントは、トコフェロールなどのトコールを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
小児は、９歳以下または６歳以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記小児は、６ヶ月から６歳未満の間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記小児は、６ヶ月から３６ヶ月未満の間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記小児は、３６ヶ月から６歳未満の間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫原性組成物は、約０．５ｍｌまたは約０．２５ｍｌの用量体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫原性組成物は、０．２から０．４５ｍｌの間の用量体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫原性組成物の送達は、皮内、鼻腔内、筋肉内、経口または皮下経路による、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない小児用ワクチンであって、用量体積が０．２〜０．４５ｍｌの間である、前記水銀防腐剤を含まない小児用ワクチン。
【請求項２９】
小児を免疫化するのに使用するための水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物であって、前記組成物は、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、前記水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３０】
ＳＲＤアッセイによって検出可能な量のＨＡの存在により決定されるように、前記α−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つは、前記調製物のＨＡが、前記調製物が生成された後少なくとも６ヶ月間、安定なままであるような量で存在する、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３１】
前記調製物は、α−トコフェロールコハク酸エステルを含む、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３２】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項３１に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３３】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１０〜５００μｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項３２に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３４】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、スプリットウイルス抗原調製物、サブユニット抗原、および化学的にまたは他の方法で不活化された全ウイルスからなる群より選択される、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３５】
不活化インフルエンザウイルス調製物は、スプリットまたはサブユニットウイルス抗原調製物である、請求項３４に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３６】
不活化インフルエンザウイルス調製物は、Ａ型株およびＢ型株の両方のＨＡを含む、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３７】
前記調製物は、２つのＡ型株および１つのＢ型株のＨＡを含む三価インフルエンザウイルス調製物である、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記調製物は、２つのＡ型株および２つのＢ型株のＨＡを含む四価インフルエンザウイルス調製物である、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３９】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１〜１００μｇ／ｍｌである、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４０】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、約１５μｇ／ｍｌである、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４１】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１５μｇ／ｍｌ未満である、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４２】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の量は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、６〜９μｇ／用量の間である、請求項４１に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記アジュバントは、水中油型エマルションを含む、請求項４３に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記アジュバントは、スクアレンを含む、請求項４４に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記アジュバントは、トコフェロールなどのトコールを含む、請求項４３に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４７】
前記小児は、９歳以下または６歳以下である、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４８】
前記小児は、６ヶ月から６歳未満の間である、請求項４７に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４９】
前記小児は、６ヶ月から３６ヶ月未満の間である、請求項４７に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記小児は、３６ヶ月から６歳未満の間である、請求項４７に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項５１】
前記免疫原性組成物は、約０．５ｍｌまたは約０．２５ｍｌの用量体積を有する、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項５２】
前記免疫原性組成物は、０．２から０．４５ｍｌの間の用量体積を有する、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項１】
ヒト被験体において免疫反応を上昇させる方法であって、前記ヒト被験体に、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ヒト被験体は、小児である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＲＤアッセイによって検出可能な量のＨＡの存在により決定されるように、前記α−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つは、前記調製物のＨＡが、前記調製物が生成された後少なくとも６ヶ月間、安定なままであるような量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記調製物は、α−トコフェロールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記調製物は、α−トコフェロールコハク酸エステルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１０から５００μｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、スプリットウイルス抗原調製物、サブユニット抗原、および化学的にまたは他の方法で不活化された全ウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記不活化インフルエンザウイルス調製物は、スプリットまたはサブユニットウイルス抗原調製物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記不活化インフルエンザウイルス調製物は、Ａ型株およびＢ型株の両方のＨＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記調製物は、２つのＡ型株および１つのＢ型株のＨＡを含む、三価インフルエンザウイルス調製物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記調製物は、２つのＡ型株および２つのＢ型株のＨＡを含む、四価インフルエンザウイルス調製物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、約１５μｇ／ｍｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１５μｇ／ｍｌ未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の量は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、６〜９μｇ／用量の間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジュバントは、水中油型エマルションを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アジュバントは、スクアレンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アジュバントは、トコフェロールなどのトコールを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
小児は、９歳以下または６歳以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記小児は、６ヶ月から６歳未満の間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記小児は、６ヶ月から３６ヶ月未満の間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記小児は、３６ヶ月から６歳未満の間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫原性組成物は、約０．５ｍｌまたは約０．２５ｍｌの用量体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫原性組成物は、０．２から０．４５ｍｌの間の用量体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫原性組成物の送達は、皮内、鼻腔内、筋肉内、経口または皮下経路による、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、水銀防腐剤を含まない小児用ワクチンであって、用量体積が０．２〜０．４５ｍｌの間である、前記水銀防腐剤を含まない小児用ワクチン。
【請求項２９】
小児を免疫化するのに使用するための水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物であって、前記組成物は、血球凝集素（ＨＡ）と、前記ＨＡを安定化させるのに十分な量のα−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つとを含む水性不活化インフルエンザウイルス調製物を含む、前記水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３０】
ＳＲＤアッセイによって検出可能な量のＨＡの存在により決定されるように、前記α−トコフェロールまたはその誘導体のうちの少なくとも１つは、前記調製物のＨＡが、前記調製物が生成された後少なくとも６ヶ月間、安定なままであるような量で存在する、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３１】
前記調製物は、α−トコフェロールコハク酸エステルを含む、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３２】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項３１に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３３】
前記α−トコフェロールコハク酸エステルは、１０〜５００μｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項３２に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３４】
インフルエンザウイルス抗原調製物は、スプリットウイルス抗原調製物、サブユニット抗原、および化学的にまたは他の方法で不活化された全ウイルスからなる群より選択される、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３５】
不活化インフルエンザウイルス調製物は、スプリットまたはサブユニットウイルス抗原調製物である、請求項３４に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３６】
不活化インフルエンザウイルス調製物は、Ａ型株およびＢ型株の両方のＨＡを含む、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３７】
前記調製物は、２つのＡ型株および１つのＢ型株のＨＡを含む三価インフルエンザウイルス調製物である、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記調製物は、２つのＡ型株および２つのＢ型株のＨＡを含む四価インフルエンザウイルス調製物である、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項３９】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１〜１００μｇ／ｍｌである、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４０】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、約１５μｇ／ｍｌである、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４１】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の濃度は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、１５μｇ／ｍｌ未満である、請求項３６に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４２】
インフルエンザの各株についてのＨＡ抗原の量は、ＳＲＤアッセイにより測定すると、６〜９μｇ／用量の間である、請求項４１に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記アジュバントは、水中油型エマルションを含む、請求項４３に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記アジュバントは、スクアレンを含む、請求項４４に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記アジュバントは、トコフェロールなどのトコールを含む、請求項４３に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４７】
前記小児は、９歳以下または６歳以下である、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４８】
前記小児は、６ヶ月から６歳未満の間である、請求項４７に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項４９】
前記小児は、６ヶ月から３６ヶ月未満の間である、請求項４７に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記小児は、３６ヶ月から６歳未満の間である、請求項４７に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項５１】
前記免疫原性組成物は、約０．５ｍｌまたは約０．２５ｍｌの用量体積を有する、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【請求項５２】
前記免疫原性組成物は、０．２から０．４５ｍｌの間の用量体積を有する、請求項２９に記載の水銀防腐剤を含まない免疫原性組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５０６６３２（Ｐ２０１３−５０６６３２Ａ）
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３１３５７（Ｐ２０１２−５３１３５７）
【出願日】平成２２年９月２８日（２０１０．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６４３５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３９１８０
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５１２０８０８４８）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ，ニーデルラースウンク デア スミスクライン ビーチャム ファーマ ゲーエムベーハー ウント コムパニー カーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２８日（２０１０．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６４３５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３９１８０
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５１２０８０８４８）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ，ニーデルラースウンク デア スミスクライン ビーチャム ファーマ ゲーエムベーハー ウント コムパニー カーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
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