インフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤
【課題】 亜型や変異体の出現などのインフルエンザウイルス側の変化に影響されることなく、インフルエンザウイルス感染症の治療や発症抑制をすることができる、インフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を提供する。
【解決手段】 Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤であって、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とする。本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主細胞側の因子であるＦａｓリガンドの機能を具体的に抑制することにより、インフルエンザウイルスに感染したマウスのアポトーシスが抑制されて生存率が上昇することを見出し、本発明を完成した。
【解決手段】 Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤であって、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とする。本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主細胞側の因子であるＦａｓリガンドの機能を具体的に抑制することにより、インフルエンザウイルスに感染したマウスのアポトーシスが抑制されて生存率が上昇することを見出し、本発明を完成した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤に関し、より詳細には、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とするインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは細胞死の一種であり、細胞の縮小、クロマチンの凝集、核の断片化、細胞の断片化、周辺細胞やマクロファージによる断片化した細胞（アポトーシス小体）の貪食といった一連の形態変化に特徴付けられる。アポトーシスは、特定のシグナル伝達タンパク質やカスパーゼ類、エンドヌクレアーゼ類の秩序立った機能発現によって起こる、能動的な細胞死である。
【０００３】
アポトーシスは、個体の発生過程においてはさまざまな臓器や気管の形態形成や細胞数の調整に寄与し、成体においては癌細胞やウイルス感染細胞の除去など組織の恒常性の維持に寄与する重要なシステムであり、その過剰や低下は、ウイルス感染症や癌、自己免疫疾患などの様々な疾患に関与する。
【０００４】
アポトーシスが関与する疾患の一つとして、インフルエンザウイルス感染症を挙げることができる。インフルエンザウイルスを感染させた培養細胞では、アポトーシスが起こること（非特許文献１）やアポトーシス誘導因子であるＦａｓリガンドのｍＲＮＡ発現量が増大すること（非特許文献２、３）、インフルエンザウイルスを感染させた動物体内でアポトーシスが観察されること（非特許文献４）などから、インフルエンザウイルス感染症ではアポトーシスが促進されることが確認されている。インフルエンザウイルス感染症におけるアポトーシスが生体防御反応によるものか、ウイルス複製によるものかは未だ議論されているところであるが、いずれにしても過剰なアポトーシスは身体にダメージを与えることから、インフルエンザウイルス感染症の発症や症状悪化の原因となると考えられている。
【０００５】
従来、インフルエンザウイルス感染症に対する予防剤や治療剤として、弱毒化または不活化したインフルエンザウイルスを宿主に取り込ませて獲得させた免疫を利用するインフルエンザワクチンや、インフルエンザウイルス表面に存在する酵素ノイラミニダーゼの働きを阻害するオセルタミビル（商品名タミフル；ロシュ社）、ザナミビル（商品名リレンザ；グラクソ・スミスクライン社）の他、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を阻害するアマンタジン（商品名シンメトレル；ノバルティスファーマ社）が開発され、市販されている。また、国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレットには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに親和性の高いペプチドからなるインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド（特許文献１）が、特開２００７−５３３５９５号には、アポトーシス誘導機構であるＴｒａｉｌリガンド／Ｔｒａｉｌレセプター系を阻害するインフルエンザウイルス感染症の予防・治療剤（特許文献２）が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋｉｚａｗａ Ｙ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第７４巻、第２３４７−２３５５頁、１９９３年
【非特許文献２】Ｗａｄａ Ｎ．ら、Ｊ．Ｂ．Ｃ．、第２７０巻、１８００７−１８０１２頁、１９９５年
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．ら、第５巻、第４２６−４３１頁、１９９８年
【非特許文献４】Ｍｏｒｉ Ｉ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第７６巻、第２８６９−２８７３頁、１９９５年
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−５３３５９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、インフルエンザワクチン、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、特許文献１に開示されているインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、いずれもインフルエンザウイルス本体に由来するタンパク質を標的としているため、亜型への効果が期待できず、また、変異体の出現により耐性獲得が生じやすいという問題点を抱えている。例えば、現在日本で使用されている季節性インフルエンザに対するワクチンは、先行するオーストラリアでの流行株の情報に基づき、日本で流行すると予想された株に対して作製されるため、毎年不安定であるうえ、この予測が外れた場合や変異体が生じた場合には、対応が困難となっている。また、特許文献２に開示されているインフルエンザウイルス感染症の予防・治療剤は、培養細胞でインフルエンザウイルスの増殖を抑制することが示されているに過ぎず、動物個体でインフルエンザウイルスの増殖を抑制することも、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することが、個体の体重減少率や致死率の改善などのインフルエンザウイルス感染症における諸症状の予防や治療につながることも、具体的に示されていない。
【０００９】
さらに、非特許文献１〜非特許文献４には、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制してインフルエンザウイルス感染症の治療や発症抑制をすることができる、すなわちアンタゴニストとして用いることができるＦａｓリガンドと相互作用する物質についての記載や示唆はない。
【００１０】
本発明は、上述の問題点を解決するためになされたものであって、亜型や変異体の出現などのインフルエンザウイルス側の変化に影響されることなく、インフルエンザウイルス感染症の治療や発症抑制をすることができる、インフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主細胞側の因子であるＦａｓリガンドの機能を具体的に抑制することにより、インフルエンザウイルスに感染したマウスのアポトーシスが抑制されて生存率が上昇することを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１２】
（１）Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤であって、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とする前記剤。
【００１３】
（２）Ｆａｓリガンドと相互作用する物質が、Ｆａｓレセプターの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質Ｆａｓ−Ｆｃである、（１）に記載の剤。
【００１４】
（３）Ｆａｓレセプターの細胞外領域が、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってＦａｓリガンドと相互作用するポリペプチドである、（２）に記載の剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤によれば、亜型や変異体の出現などのインフルエンザウイルス側の変化に影響されることなく、さまざまなインフルエンザウイルス株によるインフルエンザウイルス感染症に対する治療や発症抑制をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＦａｓリガンドおよびヒトＦａｓレセプターのアミノ酸配列における各領域および各ドメインを示す模式図である。
【図２】１×１０３ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）、１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）および１×１０７ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｃ群）の、接種後の経過日数と生存率との関係を示すグラフである。
【図３】１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）の、接種後の経過日数と体重減少率との関係を示すグラフ（ａ）、１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）のＦａｓＬ（ｍＦａｓＬ）のｍＲＮＡ発現量と接種後の経過日数と体重減少率との関係を示すグラフ（ｂ）、１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）のＦａｓ（ｍＦａｓ）のｍＲＮＡ発現量と接種後の経過日数と体重減少率との関係を示すグラフ（ｃ）である。
【図４】１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロールＡ群）、１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロールＢ群）、１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型Ｂ群）の接種後の経過日数と生存率との関係を示すグラフである。
【図５】１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロール群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型群）の肺をＴＵＮＥＬ法により染色し、細気管支周辺を撮影した写真図である。図中、茶色で示される細胞は、アポトーシス陽性細胞を示す。
【図６】１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロール群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型群）の肺をＴＵＮＥＬ法により染色し、肺血管周辺を拡大して撮影した写真図である。図中、「Ｖ」で示される箇所は肺血管内腔を示し、茶色で示される細胞は、アポトーシス陽性細胞を示す。
【図７】インフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロール群）およびインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型群）の肺におけるウイルス量について、プラークアッセイにより求めたウイルス量の割合と接種経過日数との関係を示すグラフである。
【図８】インフルエンザウイルスを接種した後、融合タンパク質であるｍＦａｓ−Ｆｃを１００μｇ／個体投与したマウス（１００μｇ投与群）、ｍＦａｓ−Ｆｃを５０μｇ／個体投与したマウス（５０μｇ投与群）およびＰＢＳを投与したマウス（コントロール群）の生存率を示すグラフである。図中、横軸における●はｍＦａｓ−Ｆｃを１００μｇ／個体投与した日を示し、△はｍＦａｓ−Ｆｃを５０μｇ／個体投与した日を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤について詳細に説明する。本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤は、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制する。
【００１８】
一般にアポトーシスが起こる機構としては、個体発生のプログラムに組み込まれたものや物理化学的ストレスにより誘導される機構のほか、特定のレセプターにリガンドが結合し、一連の細胞内シグナル伝達経路が活性化されて起こる機構（系）が知られている。アポトーシスを誘導するレセプターおよびそのリガンドはそれぞれ、デスレセプター（ＤＲ）およびデスリガンド（ＤＬ）と呼ばれ、例えば、下記の６つの系を挙げることができる。
【００１９】
ＤＬ／ＤＲ
ＴＮＦ−α／ＴＮＦレセプター１（ＤＲ１）
Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター（ＤＲ２）
ＡＰＯ−３リガンド／ＡＰＯ−３（ＤＲ３）
Ｔｒａｉｌ（ＡＰＯ−２リガンド）／Ｔｒａｉｌレセプター１（ＤＲ４）
Ｔｒａｉｌ（ＡＰＯ−２リガンド）／Ｔｒａｉｌレセプター２（ＤＲ５）
ｕｎｋｎｏｗｎ（不明）／ＤＲ６
【００２０】
すなわち、本発明において、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスとは、ＦａｓレセプターにＦａｓリガンドが相互作用することにより誘導されるアポトーシスをいう。
【００２１】
本発明において、アポトーシスを抑制するとは、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤をインフルエンザウイルスに感染した個体へ投与した場合に、投与していない場合と比較して、その個体においてアポトーシスを起こす細胞の数が少数となること、またはその個体においてアポトーシスを起こす細胞が確認できなくなることをいう。なお、本発明において「アポトーシスを抑制する」は、「アポトーシスを阻害する」ないし「アポトーシスを阻止する」と交換可能に用いられる。
【００２２】
アポトーシスの検出は常法に従い行うことができ、その方法としては、例えば、位相差顕微鏡や電子顕微鏡によりアポトーシス小体の形成などの形態変化を観察する方法、電気泳動により断片化したＤＮＡを検出する方法、ＴＵＮＥＬ法（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ；Ｔｏｒｎｕｓｃｉｏｌｏ Ｄ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１９巻、第５号、第８００−８０５頁、１９９５年、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＤＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ （ＴＵＮＥＬ）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ」）、ＩＳＮＴ（ｉｎ ｓｉｔｕ ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）法、アネキシンＶにより細胞外に露出したフォスファチジルセリンを検出する方法、フローサイトメトリーにより細胞サイズの縮小を検出する方法、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ、ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ３、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、ｃｌｅａｖｅｄ Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１８、ｃｌｅａｖｅｄ ａｃｔｉｎなどのアポトーシスで特徴的に生じる分子を認識する抗体による免疫染色方法などを挙げることができる。
【００２３】
本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤は、Ｆａｓリガンドと相互作用してＦａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制する物質を有効成分とする。この物質は、Ｆａｓリガンドと相互作用することにより、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスの誘導を抑制する。すなわち、本発明において、「相互作用」とは、リガンドとそのリガンドに対するレセプター間において共有結合などにより結合を形成することや、分子間引力により結合を形成することなどをいい、このような相互作用としては、例えば、共有結合性相互作用、静電的結合性相互作用、イオン結合性相互作用、水素結合性相互作用、ファンデルワールス結合性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用などを挙げることができる。
【００２４】
また、本発明において、「ウイルス感染症の治療」とは、「ウイルス感染症を治癒させる（完治させる）」ことの他、例えば、「ウイルス感染症の重症化を抑制する」ことや、「ウイルス感染症の重篤化を抑制する」ことを含む趣旨である。
【００２５】
本発明におけるＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターは、ヒト、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳類や鳥類のＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターを挙げることができ、本発明に係る治療および／または発症抑制剤を投与する対象に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
ヒト、マウス、ラットの種間で、ＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターのドメインの基本構成およびドメイン内のアミノ酸配列はよく保存されている。例えば、ヒトＦａｓリガンドは、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）ファミリーに属する分子量約４０ｋＤａの２型膜貫通型タンパク質であり、７９アミノ酸の細胞内領域、２３アミノ酸の細胞膜貫通領域、１７９アミノ酸の細胞外領域からなる。細胞外領域にはＴＮＦと顕著な相同性を示す約１５０アミノ酸のＴＮＦ相同ドメインが存在する。ＴＮＦ相同ドメインは生体内においてタンパク質分解酵素により切り出され、可溶型Ｆａｓリガンドとして分泌されることがある。
【００２７】
ヒトＦａｓレセプターは、ＴＮＦ受容体ファミリーに属する分子量約４５ｋＤａの１型膜貫通型タンパク質であり、約１４４アミノ酸の細胞内領域、約２２アミノ酸の細胞膜貫通領域、約１４５アミノ酸の細胞外領域および２３アミノ酸のシグナルペプチド配列からなる。細胞内領域にはＴＮＦレセプター１と有意な相同性を示す約７０アミノ酸のデスドメインが存在する。デスドメインはアポトーシス誘導において重要であることが報告されている。細胞外領域にはＴＮＦ受容体ファミリーに特徴的なシステイン残基に富む配列が３回繰り返されるシステインリッチドメインが存在する。システインリッチドメインにＦａｓリガンドが相互作用すると考えられている。また、スプライシングバリアントとして細胞外領域からなる可溶型Ｆａｓレセプターが存在することが知られている。ヒトＦａｓリガンドおよびヒトＦａｓレセプターのアミノ酸配列における各領域および各ドメインを示す模式図を図１に示す。
【００２８】
Ｆａｓリガンドと相互作用する物質は、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスの誘導を抑制する物質である限り、特に限定されない。そのような物質としては、例えば、抗Ｆａｓリガンド抗体、可溶型Ｆａｓレセプター、Ｆａｓレセプター誘導体、Ｄｅｃｏｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３、Ｄｅｃｏｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３誘導体などを挙げることができるが、Ｆａｓレセプター誘導体が好ましい。Ｆａｓレセプター誘導体としては、例えば、Ｆａｓレセプターから細胞膜貫通領域を除いたアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆａｓレセプターからデスドメインを除いたアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆａｓレセプターの細胞外領域からなるポリペプチド、Ｆａｓレセプターのシステインリッチドメインからなるポリペプチド、それらのポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質などを挙げることができるが、Ｆａｓレセプターの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質（Ｆａｓ−Ｆｃ）が好ましい。
【００２９】
本発明において、Ｆａｓレセプターの細胞外領域は、Ｆａｓリガンドと相互作用するのであれば、その全アミノ酸配列からなるポリペプチドでも、その一部のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよい。
【００３０】
ここで、本発明におけるポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合してなる化合物のことをいい、構成するアミノ酸数は特に限定されず、例えば、２アミノ酸からなるジペプチド、３アミノ酸からなるトリペプチド、４アミノ酸からなるテトラペプチド、５〜１９のアミノ酸からなるペプチド（オリゴペプチド）、２０以上のアミノ酸からなるペプチドやタンパク質が包含される。
【００３１】
また、本発明において、「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」というときの、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の個数は、Ｆａｓリガンドと相互作用する限り特に限定されないが、例えば１〜８５個、好ましくは１〜５１個、より好ましくは１〜３４個、さらに好ましくは１〜１７個、よりさらに好ましくは１〜９個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列に相当するのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００３２】
すなわち、配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＦａｓレセプターのＮ末端側１〜１６９番目のアミノ酸からなるポリペプチドと高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦａｓリガンドと相互作用するポリペプチドが含まれる。また、ここにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００３３】
本発明に係る配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドには、Ｆａｓリガンドと相互作用する機能を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含される。
【００３４】
本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。
【００３５】
本発明におけるＩｇＧは、ＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターを用いることができる動物と同様の動物のＩｇＧを挙げることができ、本発明に係る治療および／または発症抑制剤を投与する対象に応じて適宜選択することができる。なお、本実施例においては、好適なＩｇＧとしてヒトのＩｇＧを用いている。また、本発明においてＩｇＧのＦｃ領域には、ＩｇＧをパパインにより消化して得られるＣ末端側のフラグメントに相当するポリペプチドまたはその一部のみならず、ＩｇＧをペプシンにより消化して得られるＣ末端側のフラグメント（Ｆｃ’領域）またはその一部も包含される。
【００３６】
本発明に係るＦａｓ−Ｆｃには、Ｆａｓリガンドと相互作用することにより、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスの誘導を抑制する機能を損なわない限り、他のアミノ酸配列、糖鎖、標識物質などが修飾されていてもよい。
【００３７】
本発明において、Ｆａｓ−Ｆｃの作製は常法に従い行うことができ、例えば、Ｆａｓレセプターの細胞外領域に相当するｃＤＮＡとＩｇＧのＦｃ領域に相当するｃＤＮＡとを翻訳フレームが合うように適当な発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを導入した細胞を培養してＦａｓ−Ｆｃを分泌させ、培養上清からＦａｓ−Ｆｃを精製することにより行うことができる。発現ベクターやこれを導入する細胞は、Ｆａｓ−Ｆｃの必要量や精製方法などに応じて適宜選択して用いることができる。また、Ｆａｓ−Ｆｃの精製は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに対するＦｃタンパク質の親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより簡便に行うことができるが、その他、例えば、硫安塩析法、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択し、またはこれらを組み合わせることにより行うことができる。
【００３８】
本発明において、インフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤の治療効果や発症抑制効果は、常法に従い確認することができ、例えば、対象がインフルエンザウイルスに感染した培養細胞群であれば、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を投与した場合に、投与していない場合と比較して、その培養細胞群においてアポトーシスを起こす細胞の数が減少すること、またはその培養細胞群においてアポトーシスを起こす細胞が確認できなくなることを、対象がインフルエンザウイルスに感染した個体であれば、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を投与した場合に、投与していない場合と比較して、その個体の体重減少率や生存率が改善することを、特に、インフルエンザウイルスに感染したヒトであれば、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を投与した場合に、投与していない場合と比較して、そのヒトにおいて発熱や倦怠感、悪寒、体の痛み、鼻炎、咽頭炎などの諸症状が緩和することやそのヒトの生存率が改善することを、それぞれ確認することなどにより行うことができる。
【００３９】
なお、本発明において、「発症を抑制する」は、「発症を予防する」、「発症を防止する」、「発症を阻止する」、「発症を阻害する」と交換可能に用いられる場合があり、「相互作用する」は、「結合する」、「反応する」、「接続する」、「接着する」、「接触する」、「連結する」と交換可能に用いられる場合がある。
【００４０】
本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００４１】
以下、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４２】
＜実施例１＞インフルエンザウイルスを接種したマウスの生存率の確認
（１）ウイルス液の調製
北海道大学の高田礼人氏から供与されたインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて希釈することにより、それぞれ１×１０３ｐｆｕ／５０μＬ、１×１０５ｐｆｕ／５０μＬおよび１×１０７ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を調製した。
【００４３】
（２）マウスへのインフルエンザウイルスの接種
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ；ホクドー社）９個体を、北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター内Ｐ２動物感染実験室で１週間飼育することにより馴化させた。続いて、イソフルラン（大日本住友製薬社）を吸入させて麻酔をかけた後、３個体ずつ３群に分け、Ａ群、Ｂ群およびＣ群とした。Ａ群、Ｂ群およびＣ群に、それぞれ本実施例（１）の１×１０３ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液、１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液および１×１０７ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を、５０μＬ／１個体、経鼻的に投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した。
【００４４】
（３）インフルエンザウイルスを接種したマウスの生存率の確認
本実施例（２）の各群について、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として１２日目まで飼育して毎日生存個体数を確認し、各群における０日目の生存個体数に対する各日の生存個体数の割合を百分率で求め、生存率とした。その結果を図２に示す。
【００４５】
図２に示すように、Ａ群の生存率は、０日目から８日目までは１００％、９日目から１２日目までは６６．７％であり、Ｂ群の生存率は、０日目から５日目までは１００％、６日目は６６．７％、７日目は３３．３％、８日目以降は０％であり、Ｃ群の生存率は、０日目から５日目までは１００％、６日目から８日目までは６６．７％、９日目から１２日目までは３３．３％であった。
【００４６】
これらの結果から、マウスに１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種することにより致死することが確認され、１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウスを致死性のウイルス感染モデル（致死性感染モデルマウス）とした。
【００４７】
＜実施例２＞インフルエンザウイルス感染症の重症度とマウスＦａｓ（ｍＦａｓ）およびマウスＦａｓリガンド（ｍＦａｓＬ）のｍＲＮＡ発現量との相関の確認
（１）ウイルス液の調製
実施例１（１）に記載の方法により、１×１０２ｐｆｕ／５０μＬのＰＲ８ウイルスのウイルス液を調製した。
【００４８】
（２）マウスの体重量の測定および肺の採取
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）３０個体について、各個体の体重量を測定した。またその３０個体のうち３個体から肺を採取した。
【００４９】
（３）マウスへのインフルエンザウイルスの接種
本実施例（２）の２７個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、麻酔後に１２個体と１５個体との２群に分け、１２個体をＡ群、１５個体をＢ群とし、Ａ群には本実施例（１）で調製した１×１０２ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を、Ｂ群には本実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種し、非致死性感染モデルマウス（Ａ群）および致死性感染モデルマウス（Ｂ群）とした。
【００５０】
（４）インフルエンザウイルスを接種したマウスの体重量の測定および肺の採取
本実施例（３）の各群について、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として６日目まで飼育して、１日目から６日目まで毎日各個体の体重量を測定した。また、１日目から６日目まで毎日、Ａ群においては２個体、Ｂ群においては３個体からそれぞれ肺を採取した。
【００５１】
（５）インフルエンザウイルスを接種したマウスの体重減少率の確認
本実施例（２）および（４）で測定した体重量および次式に基づいて体重減少率を求め、各群についてその平均値を算出した。なお、本実施例（２）で測定した体重量を０日目の体重量とした。その結果を図３のａに示す。
体重減少率＝｛（０日目の体重量）−（各日の体重量）／（０日目の体重量）｝×１００
【００５２】
図３のａに示すように、Ａ群の体重減少率は、０日目から５日目までは約０％であり、６日目は約１０％であった。一方、Ｂ群の体重減少率は、０日目および１日目は約０％であり、２日目は約１０％、３日目は約１５％、４日目は約２０％、５日目は約２５％であった。なお、６日目において、Ｂ群のすべての個体が致死した。
【００５３】
これらの結果から、致死性感染モデルマウスでは、インフルエンザウイルス接種後から致死するまで、経過日数に比例して体重減少率が増大することが確認された。すなわち、体重減少率がインフルエンザウイルス感染症の重症度の指標となることが示された。
【００５４】
（６）インフルエンザウイルスを接種したマウスのＦａｓ（ｍＦａｓ）およびＦａｓＬ（ｍＦａｓＬ）のｍＲＮＡ発現量の検討
本実施例（４）で採取した各個体の肺を、速やかにＲＮＡ抽出溶解液(ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で破砕した後、付属の使用書に従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
【００５５】
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、付属の使用書に従い、ＲｅｖａＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）を用いて逆転写反応を行うことにより各個体の肺のｃＤＮＡを得た。
【００５６】
このｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲ装置Ｍｘ３０００Ｐ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）および試薬ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑII（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ；タカラバイオ社）を用いて、付属の使用書に従ってリアルタイムＰＣＲ法を行うことにより、各個体の肺におけるマウスＦａｓリガンド（ｍＦａｓＬ）、マウスＦａｓ（ｍＦａｓ）およびマウスグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ｍＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは下記のとおりである。
【００５７】
ｍＦａｓＬの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー；５’−ＣＣＣＴＧＴＴＡＡＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴ−３’（配列番号２）
ｍＦａｓの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー；５’−ＴＣＧＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＣ−３’（配列番号４）
ｍＧＡＰＤＨの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号５）
アンチセンスプライマー；５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号６）
【００５８】
測定したｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量の値を、ｍＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量の値でそれぞれ除することにより補正した後、各日におけるｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量を、０日目のｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量を１として各日におけるｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量の相対値を算出し、この相対値の各群における平均値（Ｎ＝２〜３）を算出した。ｍＦａｓＬについての結果を図３のｂに、ｍＦａｓについての結果を図３のｃにそれぞれ示す。
【００５９】
図３のｂに示すように、Ａ群におけるｍＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量は、０日目から３日目までは約１であり、４日目は約２．５、５日目は約４．４、６日目は約５．５であった。これに対し、Ｂ群におけるｍＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量は、０日目および１日目は約１であり、２日目および３日目は約６、４日目は約５．５、５日目は約８であった。これらの結果から、致死性感染モデルマウスでは、インフルエンザウイルス接種後から致死するまで、経過日数に比例して肺中ＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量が増大することが確認された。すなわち、ウイルス感染症の重症度が高いほど肺中ＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量が大きいという相関関係が成立することが示された。
【００６０】
また、図３のｃに示すように、Ａ群およびＢ群におけるｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量は、０日目から６日目までのいずれも２未満であった。これらの結果から、非致死性感染モデルマウスと致死性感染モデルマウスのいずれにおいても、ウイルス接種後の経過日数に関わらず、ｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量が同程度であることが確認された。すなわち、ウイルス感染症の重症度と肺中ＦａｓのｍＲＮＡ発現量とは相関しないことが示された。
【００６１】
＜実施例３＞インフルエンザウイルスを接種したＦａｓＬ機能喪失型変異マウスの生存率の確認
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）１０個体およびＣｓ７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴのＦａｓＬ機能喪失型変異マウスであるＣ５７ＢＬ／６−ｇｌｄ／ｇｌｄ（ｇｌｄマウス；日本チャールス・リバー社）１０個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、麻酔後にコントロールＡ群、コントロールＢ群、変異型Ａ群および変異型Ｂ群の４群に分け、コントロールＡ群および変異型Ａ群には実施例２（１）で調製した１×１０２ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を、コントロールＢ群および変異型Ｂ群には実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した。コントロールＡ群、コントロールＢ群、変異型Ａ群および変異型Ｂ群の構成は下記のとおりである。
コントロール型Ａ群；Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ／ＷＴ ５個体、１×１０２ｐｆｕ／個体
コントロール型Ｂ群；Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ／ＷＴ ５個体、１×１０５ｐｆｕ／個体
変異型Ａ群 ；ｇｌｄマウス ５個体、１×１０２ｐｆｕ／個体
変異型Ｂ群 ；ｇｌｄマウス ５個体、１×１０５ｐｆｕ／個体
【００６２】
その後、実施例１（３）に記載の方法により、０日目から１９日目まで飼育して各群の生存率を求めた。その結果を図４に示す。
【００６３】
図４に示すように、コントロールＢ群の生存率は、６日目は６０％、７日目は４０％、８日目以降は０％であったのに対し、変異型Ｂ群の生存率は、６日目は８０％、７日目以降１９日目までは６０％であった。また、コントロールＡ群および変異型Ａ群の生存率は０日目から１９日目まで１００％であった。
【００６４】
これらの結果から、ＦａｓＬの機能を抑制することにより、致死性感染モデルマウスの生存率が上昇することが確認された。
【００６５】
＜実施例４＞インフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウスのアポトーシス誘導細胞の観察
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）６個体および６週齢の雄のｇｌｄマウス（日本チャールス・リバー社）６個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種し、それぞれコントロール群および変異型群とした。
【００６６】
次に、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として４日目まで飼育し、２日目、３日目および４日目に、各群につき２個体から肺を採取した。採取した肺は、速やかに１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬し、４℃で２週間静置することにより固定を行った。その後、常法に従って肺のパラフィン切片を作製し、札幌総合病理研究所社に委託してＴＵＮＥＬ法（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）により染色した。染色したパラフィン切片について、ＥＣＬＩＰＳＥ８０ｉ（Ｎｉｋｏｎ社）を用いて観察を行った。細気管支周辺および肺血管周辺を撮影して作成した写真図を図５に、拡大撮影して作成した写真図を図６に、それぞれ示す。
【００６７】
図５に示すように、コントロール群では、２日目には陽性シグナルが検出されず、３日目に気管支へ浸潤する好中球および肺上皮細胞において陽性シグナルが検出され、４日目に、肺胞間質の顕著な肥厚部分において陽性シグナルが検出された。これに対し、変異型群では、２日目には陽性シグナルが検出されず、３日目に気管支へ浸潤する好中球において陽性シグナルが検出されたが、肺上皮細胞では陽性シグナルが検出されなかった。また、４日目には、肺胞間質の肥厚部分においてＴＵＮＥＬ染色陽性シグナルが検出されたが、その肥厚の程度は軽微であった。
【００６８】
また、図６に示すように、コントロール群では、３日目には陽性シグナルが検出されず、４日目に肺血管に浸潤する細胞に強い陽性シグナルが検出された。これに対し、変異型群では、３日目には陽性シグナルが検出されず、４日目には肺血管に浸潤する細胞が認められるものの、これらの細胞における陽性シグナルは検出されなかった。
【００６９】
これらの結果から、ＦａｓＬの機能を抑制することにより、インフルエンザウイルスの感染に伴う肺組織におけるアポトーシスを抑制できることが示された。
【００７０】
＜実施例５＞インフルエンザウイルスを接種したＦａｓＬ機能喪失型変異マウスの肺におけるウイルス量の確認
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）６個体および６週齢の雄のｇｌｄマウス（日本チャールス・リバー社）６個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種し、それぞれコントロール群および変異型群とした。
【００７１】
次に、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として５日目まで飼育し、３日目、４日目および５日目に、各群につき２個体から肺を採取した。採取した肺は、重量を測定した後、ビーズ式細胞破砕装置ＭＳ−１００Ｒ（トミー精工社）を用いて下記の条件により破砕して破砕液を得た。
【００７２】
１ｍｍジルコニアビーズ
５ｍｍステンレスビーズ
２ｍＬサンプルチューブ
３５００ｒｐｍ、３０秒間を１セットとして２セット
【００７３】
得られた破砕液を、１２穴プレートで単層培養したＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）に添加して、３７℃で１時間培養した。続いて、培養上清を除去し、Ｂａｃｔ−ａｇａｒ１％（ｗ／ｖ）およびトリプシン５μｇ／ｍＬを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加して、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養し、出現したプラークを数え、肺組織重量に対するウイルス量の割合（ｐｆｕ／ｇ）を求めた。その結果を図７に示す。
【００７４】
図７に示すように、３日目、４日目および５日目のいずれにおいても、コントロール群と変異型群とではウイルス量の割合がほぼ同じであった。これらの結果から、ＦａｓＬの機能を抑制した場合とＦａｓＬの機能を抑制しない場合とでは、肺の中のインフルエンザウイルスのウイルス増幅量はほとんど変わらないことが確認された。
【００７５】
＜実施例６＞インフルエンザウイルスを接種した後にＦａｓの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質を投与したマウスの生存率の確認
（１）Ｆａｓの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質の調製
［１−１］ベクターの調製
ｍＦａｓの細胞外領域であるアミノ酸配列１番目〜１６９番目（配列番号８）に相当する塩基配列（アクセッション番号ＮＭ００７９８７；配列番号７）とヒトＩｇＧのＦｃ領域（配列番号１０）に相当する塩基配列（アクセッション番号Ｚ１７３７０；配列番号９）とを、翻訳フレームが合うように繋げて得られる融合タンパク質（ｍＦａｓ−Ｆｃ；配列番号１２）に相当する塩基配列（配列番号１１）を有するＤＮＡ断片を調製した。具体的には、ｍＦａｓの細胞外領域であるアミノ酸１番目〜１６９番目に相当する塩基配列（配列番号７）とヒトＩｇＧのＦｃ領域に相当する塩基配列とを、ＢａｍＨIサイトを付加したプライマーを用いて、それぞれマウス末梢リンパ細胞およびヒト末梢リンパ細胞ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ法にて増幅し、翻訳フレームが合うように連結させることにより調製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎIおよびＸｂａIで消化した後、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＫｐｎI／ＸｂａIサイトに挿入し、ｐｃＤＮＡ３−ｍＦａｓ−Ｆｃを得た。
【００７６】
［１−２］ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのベクターの導入
本実施例（１）［１−１］のｐｃＤＮＡ３．１−ｍＦａｓ−Ｆｃおよびピューロマイシン耐性遺伝子が挿入されたベクターｐＧＬ４．１（Ｐｒｏｍｅｇａ社)を１：１の重量比の割合で含むベクター液を調製した。このベクター液に含まれるベクターを、遺伝子病制御研究所の上出利光氏より供与されたヒト胎児腎線維芽細胞由来株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて導入した。
【００７７】
その後、胎児牛血清（ＦＢＳ；Ｃａｎｓｅｒａ社）を１０％（ｖ／ｖ）含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地；シグマ社）で、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養した。次に、培地にピューロマイシン（ＣＡＹＬＡ社）を３μｇ／ｍＬとなるよう添加してさらに約２週間培養し、耐性細胞を得た。続いて、得られた耐性細胞について、ｍＦａｓ−Ｆｃ／ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とした。
【００７８】
［１−３］ｍＦａｓ−Ｆｃの精製
本実施例（１）［１−２］のｍＦａｓ−Ｆｃ／ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎでコートした培養面積１５０ｃｍ２の細胞培養フラスコ（北海道和光純薬社）にて、本実施例（１）［１−２］に記載の条件下でサブコンフルエントの状態まで約２４時間培養した。
【００７９】
続いて、培養液を除去してＰＢＳで洗浄を４回行った後、ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２％（ｖ／ｖ）含むＣＤ２９３Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０ｍＬを添加して３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２週間培養した。
【００８０】
その後、培養上清を回収し、３５００×ｇ、４℃の条件下で１５分間遠心分離を行って上清を得た。得られた上清を、０．４５ｕｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ；ミリポア社）を用いて濾過し、濾過液を得た。
【００８１】
次に、４℃の環境下でｐｒｏｔｅｉｎ Ａ結合アガロースゲル１ｍＬを充填したアフィニティーカラム（ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ；ＧＥヘルスケア社）に濾過液を通した後、５ｍＬのＰＢＳを用いて洗浄した。続いて、０．１ｍｏｌ／Ｌのｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）５ｍＬを添加して、０．５ｍＬずつ、計１０フラクションの溶出液を回収した。各溶出液には速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）１５μＬを加えて中和した。
【００８２】
続いて、各溶出液について波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を求め、タンパク質濃度が２００ｕｇ／ｍＬ以上である溶出液を選択し、計約１ｍｇのｍＦａｓ−Ｆｃを得た。これら選択した溶出液は、−８０℃で保存した。
【００８３】
［１−４］ｍＦａｓ−Ｆｃの大量調製
本実施例（１）［１−３］の操作を繰り返して、１５ｍｇのｍＦａｓ−Ｆｃを含む溶出液を得た。ＰＢＳを透析液として、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ １０ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、４℃で二晩透析し、ｍＦａｓ−Ｆｃ溶液３０ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。得られたｍＦａｓ−Ｆｃ溶液は−８０℃で保存した。
【００８４】
（２）インフルエンザウイルスを接種した後、ｍＦａｓ−Ｆｃを投与したマウスの生存率の確認
［２−１］マウスへのインフルエンザウイルスの接種
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）１５個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、麻酔後に５個体ずつ３群に分け、１００μｇ投与群、５０μｇ投与群およびコントロール群として、実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した。
【００８５】
［２−２］ｍＦａｓ−Ｆｃの投与
本実施例（１）［１−４］のｍＦａｓ−Ｆｃ溶液を、ＰＢＳを用いて希釈することにより、５００μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液および２５０μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液を調製した。本実施例（２）［２−１］の各群について、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として１９日目まで飼育した。この際、０日目から４日目まで、１００μｇ投与群には５００μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液０．２ｍＬ（１００μｇ相当）／１個体を腹腔内に１回／日（計５回）投与し、５０μｇ投与群には２５０μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液０．２ｍＬ（５０μｇ相当）／１個体を腹腔内に１回／隔日（計３回）投与し、コントロール群にはＰＢＳ０．２ｍＬ／１個体を腹腔内に１回／日（計５回）投与した。
【００８６】
［２−３］インフルエンザウイルスを接種した後、ｍＦａｓ−Ｆｃを投与したマウスの生存率の確認
本実施例（２）［２−２］の各群について、実施例１（３）に記載の方法により生存率を求めた。その結果を図８に示す。
【００８７】
図８に示すように、１００μｇ投与群の生存率は、ｍＦａｓ−Ｆｃの投与以降、５日目および６日目は６０％、７日目から１９日目までは４０％であった。５０μｇ投与群の生存率は、ｍＦａｓ−Ｆｃの投与以降、５日目は８０％、６日目から１９日目までは２０％であった。これに対し、コントロール群の生存率は、ＰＢＳの投与以降、５日目は４０％、６日目は２０％、７日目以降は０％であった。
【００８８】
これらの結果から、ｍＦａｓ−Ｆｃを投与することにより、致死性感染モデルマウスの生存率の上昇が確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤に関し、より詳細には、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とするインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは細胞死の一種であり、細胞の縮小、クロマチンの凝集、核の断片化、細胞の断片化、周辺細胞やマクロファージによる断片化した細胞（アポトーシス小体）の貪食といった一連の形態変化に特徴付けられる。アポトーシスは、特定のシグナル伝達タンパク質やカスパーゼ類、エンドヌクレアーゼ類の秩序立った機能発現によって起こる、能動的な細胞死である。
【０００３】
アポトーシスは、個体の発生過程においてはさまざまな臓器や気管の形態形成や細胞数の調整に寄与し、成体においては癌細胞やウイルス感染細胞の除去など組織の恒常性の維持に寄与する重要なシステムであり、その過剰や低下は、ウイルス感染症や癌、自己免疫疾患などの様々な疾患に関与する。
【０００４】
アポトーシスが関与する疾患の一つとして、インフルエンザウイルス感染症を挙げることができる。インフルエンザウイルスを感染させた培養細胞では、アポトーシスが起こること（非特許文献１）やアポトーシス誘導因子であるＦａｓリガンドのｍＲＮＡ発現量が増大すること（非特許文献２、３）、インフルエンザウイルスを感染させた動物体内でアポトーシスが観察されること（非特許文献４）などから、インフルエンザウイルス感染症ではアポトーシスが促進されることが確認されている。インフルエンザウイルス感染症におけるアポトーシスが生体防御反応によるものか、ウイルス複製によるものかは未だ議論されているところであるが、いずれにしても過剰なアポトーシスは身体にダメージを与えることから、インフルエンザウイルス感染症の発症や症状悪化の原因となると考えられている。
【０００５】
従来、インフルエンザウイルス感染症に対する予防剤や治療剤として、弱毒化または不活化したインフルエンザウイルスを宿主に取り込ませて獲得させた免疫を利用するインフルエンザワクチンや、インフルエンザウイルス表面に存在する酵素ノイラミニダーゼの働きを阻害するオセルタミビル（商品名タミフル；ロシュ社）、ザナミビル（商品名リレンザ；グラクソ・スミスクライン社）の他、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を阻害するアマンタジン（商品名シンメトレル；ノバルティスファーマ社）が開発され、市販されている。また、国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレットには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに親和性の高いペプチドからなるインフルエンザウイルス感染阻害ペプチド（特許文献１）が、特開２００７−５３３５９５号には、アポトーシス誘導機構であるＴｒａｉｌリガンド／Ｔｒａｉｌレセプター系を阻害するインフルエンザウイルス感染症の予防・治療剤（特許文献２）が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋｉｚａｗａ Ｙ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第７４巻、第２３４７−２３５５頁、１９９３年
【非特許文献２】Ｗａｄａ Ｎ．ら、Ｊ．Ｂ．Ｃ．、第２７０巻、１８００７−１８０１２頁、１９９５年
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．ら、第５巻、第４２６−４３１頁、１９９８年
【非特許文献４】Ｍｏｒｉ Ｉ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第７６巻、第２８６９−２８７３頁、１９９５年
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−５３３５９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、インフルエンザワクチン、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、特許文献１に開示されているインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、いずれもインフルエンザウイルス本体に由来するタンパク質を標的としているため、亜型への効果が期待できず、また、変異体の出現により耐性獲得が生じやすいという問題点を抱えている。例えば、現在日本で使用されている季節性インフルエンザに対するワクチンは、先行するオーストラリアでの流行株の情報に基づき、日本で流行すると予想された株に対して作製されるため、毎年不安定であるうえ、この予測が外れた場合や変異体が生じた場合には、対応が困難となっている。また、特許文献２に開示されているインフルエンザウイルス感染症の予防・治療剤は、培養細胞でインフルエンザウイルスの増殖を抑制することが示されているに過ぎず、動物個体でインフルエンザウイルスの増殖を抑制することも、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することが、個体の体重減少率や致死率の改善などのインフルエンザウイルス感染症における諸症状の予防や治療につながることも、具体的に示されていない。
【０００９】
さらに、非特許文献１〜非特許文献４には、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制してインフルエンザウイルス感染症の治療や発症抑制をすることができる、すなわちアンタゴニストとして用いることができるＦａｓリガンドと相互作用する物質についての記載や示唆はない。
【００１０】
本発明は、上述の問題点を解決するためになされたものであって、亜型や変異体の出現などのインフルエンザウイルス側の変化に影響されることなく、インフルエンザウイルス感染症の治療や発症抑制をすることができる、インフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主細胞側の因子であるＦａｓリガンドの機能を具体的に抑制することにより、インフルエンザウイルスに感染したマウスのアポトーシスが抑制されて生存率が上昇することを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１２】
（１）Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤であって、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とする前記剤。
【００１３】
（２）Ｆａｓリガンドと相互作用する物質が、Ｆａｓレセプターの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質Ｆａｓ−Ｆｃである、（１）に記載の剤。
【００１４】
（３）Ｆａｓレセプターの細胞外領域が、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってＦａｓリガンドと相互作用するポリペプチドである、（２）に記載の剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤によれば、亜型や変異体の出現などのインフルエンザウイルス側の変化に影響されることなく、さまざまなインフルエンザウイルス株によるインフルエンザウイルス感染症に対する治療や発症抑制をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＦａｓリガンドおよびヒトＦａｓレセプターのアミノ酸配列における各領域および各ドメインを示す模式図である。
【図２】１×１０３ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）、１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）および１×１０７ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｃ群）の、接種後の経過日数と生存率との関係を示すグラフである。
【図３】１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）の、接種後の経過日数と体重減少率との関係を示すグラフ（ａ）、１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）のＦａｓＬ（ｍＦａｓＬ）のｍＲＮＡ発現量と接種後の経過日数と体重減少率との関係を示すグラフ（ｂ）、１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウス（Ｂ群）のＦａｓ（ｍＦａｓ）のｍＲＮＡ発現量と接種後の経過日数と体重減少率との関係を示すグラフ（ｃ）である。
【図４】１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロールＡ群）、１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロールＢ群）、１×１０２ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型Ａ群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型Ｂ群）の接種後の経過日数と生存率との関係を示すグラフである。
【図５】１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロール群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型群）の肺をＴＵＮＥＬ法により染色し、細気管支周辺を撮影した写真図である。図中、茶色で示される細胞は、アポトーシス陽性細胞を示す。
【図６】１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロール群）および１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型群）の肺をＴＵＮＥＬ法により染色し、肺血管周辺を拡大して撮影した写真図である。図中、「Ｖ」で示される箇所は肺血管内腔を示し、茶色で示される細胞は、アポトーシス陽性細胞を示す。
【図７】インフルエンザウイルスを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロール群）およびインフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウス（変異型群）の肺におけるウイルス量について、プラークアッセイにより求めたウイルス量の割合と接種経過日数との関係を示すグラフである。
【図８】インフルエンザウイルスを接種した後、融合タンパク質であるｍＦａｓ−Ｆｃを１００μｇ／個体投与したマウス（１００μｇ投与群）、ｍＦａｓ−Ｆｃを５０μｇ／個体投与したマウス（５０μｇ投与群）およびＰＢＳを投与したマウス（コントロール群）の生存率を示すグラフである。図中、横軸における●はｍＦａｓ−Ｆｃを１００μｇ／個体投与した日を示し、△はｍＦａｓ−Ｆｃを５０μｇ／個体投与した日を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤について詳細に説明する。本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤は、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制する。
【００１８】
一般にアポトーシスが起こる機構としては、個体発生のプログラムに組み込まれたものや物理化学的ストレスにより誘導される機構のほか、特定のレセプターにリガンドが結合し、一連の細胞内シグナル伝達経路が活性化されて起こる機構（系）が知られている。アポトーシスを誘導するレセプターおよびそのリガンドはそれぞれ、デスレセプター（ＤＲ）およびデスリガンド（ＤＬ）と呼ばれ、例えば、下記の６つの系を挙げることができる。
【００１９】
ＤＬ／ＤＲ
ＴＮＦ−α／ＴＮＦレセプター１（ＤＲ１）
Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター（ＤＲ２）
ＡＰＯ−３リガンド／ＡＰＯ−３（ＤＲ３）
Ｔｒａｉｌ（ＡＰＯ−２リガンド）／Ｔｒａｉｌレセプター１（ＤＲ４）
Ｔｒａｉｌ（ＡＰＯ−２リガンド）／Ｔｒａｉｌレセプター２（ＤＲ５）
ｕｎｋｎｏｗｎ（不明）／ＤＲ６
【００２０】
すなわち、本発明において、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスとは、ＦａｓレセプターにＦａｓリガンドが相互作用することにより誘導されるアポトーシスをいう。
【００２１】
本発明において、アポトーシスを抑制するとは、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤をインフルエンザウイルスに感染した個体へ投与した場合に、投与していない場合と比較して、その個体においてアポトーシスを起こす細胞の数が少数となること、またはその個体においてアポトーシスを起こす細胞が確認できなくなることをいう。なお、本発明において「アポトーシスを抑制する」は、「アポトーシスを阻害する」ないし「アポトーシスを阻止する」と交換可能に用いられる。
【００２２】
アポトーシスの検出は常法に従い行うことができ、その方法としては、例えば、位相差顕微鏡や電子顕微鏡によりアポトーシス小体の形成などの形態変化を観察する方法、電気泳動により断片化したＤＮＡを検出する方法、ＴＵＮＥＬ法（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ；Ｔｏｒｎｕｓｃｉｏｌｏ Ｄ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１９巻、第５号、第８００−８０５頁、１９９５年、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＤＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ （ＴＵＮＥＬ）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ」）、ＩＳＮＴ（ｉｎ ｓｉｔｕ ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）法、アネキシンＶにより細胞外に露出したフォスファチジルセリンを検出する方法、フローサイトメトリーにより細胞サイズの縮小を検出する方法、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ、ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ３、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、ｃｌｅａｖｅｄ Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１８、ｃｌｅａｖｅｄ ａｃｔｉｎなどのアポトーシスで特徴的に生じる分子を認識する抗体による免疫染色方法などを挙げることができる。
【００２３】
本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤は、Ｆａｓリガンドと相互作用してＦａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制する物質を有効成分とする。この物質は、Ｆａｓリガンドと相互作用することにより、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスの誘導を抑制する。すなわち、本発明において、「相互作用」とは、リガンドとそのリガンドに対するレセプター間において共有結合などにより結合を形成することや、分子間引力により結合を形成することなどをいい、このような相互作用としては、例えば、共有結合性相互作用、静電的結合性相互作用、イオン結合性相互作用、水素結合性相互作用、ファンデルワールス結合性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用などを挙げることができる。
【００２４】
また、本発明において、「ウイルス感染症の治療」とは、「ウイルス感染症を治癒させる（完治させる）」ことの他、例えば、「ウイルス感染症の重症化を抑制する」ことや、「ウイルス感染症の重篤化を抑制する」ことを含む趣旨である。
【００２５】
本発明におけるＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターは、ヒト、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳類や鳥類のＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターを挙げることができ、本発明に係る治療および／または発症抑制剤を投与する対象に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
ヒト、マウス、ラットの種間で、ＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターのドメインの基本構成およびドメイン内のアミノ酸配列はよく保存されている。例えば、ヒトＦａｓリガンドは、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）ファミリーに属する分子量約４０ｋＤａの２型膜貫通型タンパク質であり、７９アミノ酸の細胞内領域、２３アミノ酸の細胞膜貫通領域、１７９アミノ酸の細胞外領域からなる。細胞外領域にはＴＮＦと顕著な相同性を示す約１５０アミノ酸のＴＮＦ相同ドメインが存在する。ＴＮＦ相同ドメインは生体内においてタンパク質分解酵素により切り出され、可溶型Ｆａｓリガンドとして分泌されることがある。
【００２７】
ヒトＦａｓレセプターは、ＴＮＦ受容体ファミリーに属する分子量約４５ｋＤａの１型膜貫通型タンパク質であり、約１４４アミノ酸の細胞内領域、約２２アミノ酸の細胞膜貫通領域、約１４５アミノ酸の細胞外領域および２３アミノ酸のシグナルペプチド配列からなる。細胞内領域にはＴＮＦレセプター１と有意な相同性を示す約７０アミノ酸のデスドメインが存在する。デスドメインはアポトーシス誘導において重要であることが報告されている。細胞外領域にはＴＮＦ受容体ファミリーに特徴的なシステイン残基に富む配列が３回繰り返されるシステインリッチドメインが存在する。システインリッチドメインにＦａｓリガンドが相互作用すると考えられている。また、スプライシングバリアントとして細胞外領域からなる可溶型Ｆａｓレセプターが存在することが知られている。ヒトＦａｓリガンドおよびヒトＦａｓレセプターのアミノ酸配列における各領域および各ドメインを示す模式図を図１に示す。
【００２８】
Ｆａｓリガンドと相互作用する物質は、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスの誘導を抑制する物質である限り、特に限定されない。そのような物質としては、例えば、抗Ｆａｓリガンド抗体、可溶型Ｆａｓレセプター、Ｆａｓレセプター誘導体、Ｄｅｃｏｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３、Ｄｅｃｏｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３誘導体などを挙げることができるが、Ｆａｓレセプター誘導体が好ましい。Ｆａｓレセプター誘導体としては、例えば、Ｆａｓレセプターから細胞膜貫通領域を除いたアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆａｓレセプターからデスドメインを除いたアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆａｓレセプターの細胞外領域からなるポリペプチド、Ｆａｓレセプターのシステインリッチドメインからなるポリペプチド、それらのポリペプチドとＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質などを挙げることができるが、Ｆａｓレセプターの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質（Ｆａｓ−Ｆｃ）が好ましい。
【００２９】
本発明において、Ｆａｓレセプターの細胞外領域は、Ｆａｓリガンドと相互作用するのであれば、その全アミノ酸配列からなるポリペプチドでも、その一部のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよい。
【００３０】
ここで、本発明におけるポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合してなる化合物のことをいい、構成するアミノ酸数は特に限定されず、例えば、２アミノ酸からなるジペプチド、３アミノ酸からなるトリペプチド、４アミノ酸からなるテトラペプチド、５〜１９のアミノ酸からなるペプチド（オリゴペプチド）、２０以上のアミノ酸からなるペプチドやタンパク質が包含される。
【００３１】
また、本発明において、「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」というときの、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の個数は、Ｆａｓリガンドと相互作用する限り特に限定されないが、例えば１〜８５個、好ましくは１〜５１個、より好ましくは１〜３４個、さらに好ましくは１〜１７個、よりさらに好ましくは１〜９個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列に相当するのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００３２】
すなわち、配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＦａｓレセプターのＮ末端側１〜１６９番目のアミノ酸からなるポリペプチドと高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＦａｓリガンドと相互作用するポリペプチドが含まれる。また、ここにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００３３】
本発明に係る配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドには、Ｆａｓリガンドと相互作用する機能を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含される。
【００３４】
本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。
【００３５】
本発明におけるＩｇＧは、ＦａｓリガンドおよびＦａｓレセプターを用いることができる動物と同様の動物のＩｇＧを挙げることができ、本発明に係る治療および／または発症抑制剤を投与する対象に応じて適宜選択することができる。なお、本実施例においては、好適なＩｇＧとしてヒトのＩｇＧを用いている。また、本発明においてＩｇＧのＦｃ領域には、ＩｇＧをパパインにより消化して得られるＣ末端側のフラグメントに相当するポリペプチドまたはその一部のみならず、ＩｇＧをペプシンにより消化して得られるＣ末端側のフラグメント（Ｆｃ’領域）またはその一部も包含される。
【００３６】
本発明に係るＦａｓ−Ｆｃには、Ｆａｓリガンドと相互作用することにより、Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスの誘導を抑制する機能を損なわない限り、他のアミノ酸配列、糖鎖、標識物質などが修飾されていてもよい。
【００３７】
本発明において、Ｆａｓ−Ｆｃの作製は常法に従い行うことができ、例えば、Ｆａｓレセプターの細胞外領域に相当するｃＤＮＡとＩｇＧのＦｃ領域に相当するｃＤＮＡとを翻訳フレームが合うように適当な発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを導入した細胞を培養してＦａｓ−Ｆｃを分泌させ、培養上清からＦａｓ−Ｆｃを精製することにより行うことができる。発現ベクターやこれを導入する細胞は、Ｆａｓ−Ｆｃの必要量や精製方法などに応じて適宜選択して用いることができる。また、Ｆａｓ−Ｆｃの精製は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａに対するＦｃタンパク質の親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより簡便に行うことができるが、その他、例えば、硫安塩析法、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択し、またはこれらを組み合わせることにより行うことができる。
【００３８】
本発明において、インフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤の治療効果や発症抑制効果は、常法に従い確認することができ、例えば、対象がインフルエンザウイルスに感染した培養細胞群であれば、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を投与した場合に、投与していない場合と比較して、その培養細胞群においてアポトーシスを起こす細胞の数が減少すること、またはその培養細胞群においてアポトーシスを起こす細胞が確認できなくなることを、対象がインフルエンザウイルスに感染した個体であれば、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を投与した場合に、投与していない場合と比較して、その個体の体重減少率や生存率が改善することを、特に、インフルエンザウイルスに感染したヒトであれば、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤を投与した場合に、投与していない場合と比較して、そのヒトにおいて発熱や倦怠感、悪寒、体の痛み、鼻炎、咽頭炎などの諸症状が緩和することやそのヒトの生存率が改善することを、それぞれ確認することなどにより行うことができる。
【００３９】
なお、本発明において、「発症を抑制する」は、「発症を予防する」、「発症を防止する」、「発症を阻止する」、「発症を阻害する」と交換可能に用いられる場合があり、「相互作用する」は、「結合する」、「反応する」、「接続する」、「接着する」、「接触する」、「連結する」と交換可能に用いられる場合がある。
【００４０】
本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００４１】
以下、本発明に係るインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４２】
＜実施例１＞インフルエンザウイルスを接種したマウスの生存率の確認
（１）ウイルス液の調製
北海道大学の高田礼人氏から供与されたインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて希釈することにより、それぞれ１×１０３ｐｆｕ／５０μＬ、１×１０５ｐｆｕ／５０μＬおよび１×１０７ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を調製した。
【００４３】
（２）マウスへのインフルエンザウイルスの接種
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ；ホクドー社）９個体を、北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター内Ｐ２動物感染実験室で１週間飼育することにより馴化させた。続いて、イソフルラン（大日本住友製薬社）を吸入させて麻酔をかけた後、３個体ずつ３群に分け、Ａ群、Ｂ群およびＣ群とした。Ａ群、Ｂ群およびＣ群に、それぞれ本実施例（１）の１×１０３ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液、１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液および１×１０７ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を、５０μＬ／１個体、経鼻的に投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した。
【００４４】
（３）インフルエンザウイルスを接種したマウスの生存率の確認
本実施例（２）の各群について、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として１２日目まで飼育して毎日生存個体数を確認し、各群における０日目の生存個体数に対する各日の生存個体数の割合を百分率で求め、生存率とした。その結果を図２に示す。
【００４５】
図２に示すように、Ａ群の生存率は、０日目から８日目までは１００％、９日目から１２日目までは６６．７％であり、Ｂ群の生存率は、０日目から５日目までは１００％、６日目は６６．７％、７日目は３３．３％、８日目以降は０％であり、Ｃ群の生存率は、０日目から５日目までは１００％、６日目から８日目までは６６．７％、９日目から１２日目までは３３．３％であった。
【００４６】
これらの結果から、マウスに１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種することにより致死することが確認され、１×１０５ｐｆｕのインフルエンザウイルスを接種したマウスを致死性のウイルス感染モデル（致死性感染モデルマウス）とした。
【００４７】
＜実施例２＞インフルエンザウイルス感染症の重症度とマウスＦａｓ（ｍＦａｓ）およびマウスＦａｓリガンド（ｍＦａｓＬ）のｍＲＮＡ発現量との相関の確認
（１）ウイルス液の調製
実施例１（１）に記載の方法により、１×１０２ｐｆｕ／５０μＬのＰＲ８ウイルスのウイルス液を調製した。
【００４８】
（２）マウスの体重量の測定および肺の採取
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）３０個体について、各個体の体重量を測定した。またその３０個体のうち３個体から肺を採取した。
【００４９】
（３）マウスへのインフルエンザウイルスの接種
本実施例（２）の２７個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、麻酔後に１２個体と１５個体との２群に分け、１２個体をＡ群、１５個体をＢ群とし、Ａ群には本実施例（１）で調製した１×１０２ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を、Ｂ群には本実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種し、非致死性感染モデルマウス（Ａ群）および致死性感染モデルマウス（Ｂ群）とした。
【００５０】
（４）インフルエンザウイルスを接種したマウスの体重量の測定および肺の採取
本実施例（３）の各群について、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として６日目まで飼育して、１日目から６日目まで毎日各個体の体重量を測定した。また、１日目から６日目まで毎日、Ａ群においては２個体、Ｂ群においては３個体からそれぞれ肺を採取した。
【００５１】
（５）インフルエンザウイルスを接種したマウスの体重減少率の確認
本実施例（２）および（４）で測定した体重量および次式に基づいて体重減少率を求め、各群についてその平均値を算出した。なお、本実施例（２）で測定した体重量を０日目の体重量とした。その結果を図３のａに示す。
体重減少率＝｛（０日目の体重量）−（各日の体重量）／（０日目の体重量）｝×１００
【００５２】
図３のａに示すように、Ａ群の体重減少率は、０日目から５日目までは約０％であり、６日目は約１０％であった。一方、Ｂ群の体重減少率は、０日目および１日目は約０％であり、２日目は約１０％、３日目は約１５％、４日目は約２０％、５日目は約２５％であった。なお、６日目において、Ｂ群のすべての個体が致死した。
【００５３】
これらの結果から、致死性感染モデルマウスでは、インフルエンザウイルス接種後から致死するまで、経過日数に比例して体重減少率が増大することが確認された。すなわち、体重減少率がインフルエンザウイルス感染症の重症度の指標となることが示された。
【００５４】
（６）インフルエンザウイルスを接種したマウスのＦａｓ（ｍＦａｓ）およびＦａｓＬ（ｍＦａｓＬ）のｍＲＮＡ発現量の検討
本実施例（４）で採取した各個体の肺を、速やかにＲＮＡ抽出溶解液(ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で破砕した後、付属の使用書に従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
【００５５】
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、付属の使用書に従い、ＲｅｖａＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社）を用いて逆転写反応を行うことにより各個体の肺のｃＤＮＡを得た。
【００５６】
このｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲ装置Ｍｘ３０００Ｐ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）および試薬ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑII（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ；タカラバイオ社）を用いて、付属の使用書に従ってリアルタイムＰＣＲ法を行うことにより、各個体の肺におけるマウスＦａｓリガンド（ｍＦａｓＬ）、マウスＦａｓ（ｍＦａｓ）およびマウスグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ｍＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは下記のとおりである。
【００５７】
ｍＦａｓＬの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー；５’−ＣＣＣＴＧＴＴＡＡＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＴ−３’（配列番号２）
ｍＦａｓの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー；５’−ＴＣＧＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＣ−３’（配列番号４）
ｍＧＡＰＤＨの増幅に用いたプライマー：
センスプライマー；５’−ＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号５）
アンチセンスプライマー；５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号６）
【００５８】
測定したｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量の値を、ｍＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量の値でそれぞれ除することにより補正した後、各日におけるｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量を、０日目のｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量を１として各日におけるｍＦａｓＬおよびｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量の相対値を算出し、この相対値の各群における平均値（Ｎ＝２〜３）を算出した。ｍＦａｓＬについての結果を図３のｂに、ｍＦａｓについての結果を図３のｃにそれぞれ示す。
【００５９】
図３のｂに示すように、Ａ群におけるｍＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量は、０日目から３日目までは約１であり、４日目は約２．５、５日目は約４．４、６日目は約５．５であった。これに対し、Ｂ群におけるｍＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量は、０日目および１日目は約１であり、２日目および３日目は約６、４日目は約５．５、５日目は約８であった。これらの結果から、致死性感染モデルマウスでは、インフルエンザウイルス接種後から致死するまで、経過日数に比例して肺中ＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量が増大することが確認された。すなわち、ウイルス感染症の重症度が高いほど肺中ＦａｓＬのｍＲＮＡ発現量が大きいという相関関係が成立することが示された。
【００６０】
また、図３のｃに示すように、Ａ群およびＢ群におけるｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量は、０日目から６日目までのいずれも２未満であった。これらの結果から、非致死性感染モデルマウスと致死性感染モデルマウスのいずれにおいても、ウイルス接種後の経過日数に関わらず、ｍＦａｓのｍＲＮＡ発現量が同程度であることが確認された。すなわち、ウイルス感染症の重症度と肺中ＦａｓのｍＲＮＡ発現量とは相関しないことが示された。
【００６１】
＜実施例３＞インフルエンザウイルスを接種したＦａｓＬ機能喪失型変異マウスの生存率の確認
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）１０個体およびＣｓ７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴのＦａｓＬ機能喪失型変異マウスであるＣ５７ＢＬ／６−ｇｌｄ／ｇｌｄ（ｇｌｄマウス；日本チャールス・リバー社）１０個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、麻酔後にコントロールＡ群、コントロールＢ群、変異型Ａ群および変異型Ｂ群の４群に分け、コントロールＡ群および変異型Ａ群には実施例２（１）で調製した１×１０２ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液を、コントロールＢ群および変異型Ｂ群には実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した。コントロールＡ群、コントロールＢ群、変異型Ａ群および変異型Ｂ群の構成は下記のとおりである。
コントロール型Ａ群；Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ／ＷＴ ５個体、１×１０２ｐｆｕ／個体
コントロール型Ｂ群；Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ／ＷＴ ５個体、１×１０５ｐｆｕ／個体
変異型Ａ群 ；ｇｌｄマウス ５個体、１×１０２ｐｆｕ／個体
変異型Ｂ群 ；ｇｌｄマウス ５個体、１×１０５ｐｆｕ／個体
【００６２】
その後、実施例１（３）に記載の方法により、０日目から１９日目まで飼育して各群の生存率を求めた。その結果を図４に示す。
【００６３】
図４に示すように、コントロールＢ群の生存率は、６日目は６０％、７日目は４０％、８日目以降は０％であったのに対し、変異型Ｂ群の生存率は、６日目は８０％、７日目以降１９日目までは６０％であった。また、コントロールＡ群および変異型Ａ群の生存率は０日目から１９日目まで１００％であった。
【００６４】
これらの結果から、ＦａｓＬの機能を抑制することにより、致死性感染モデルマウスの生存率が上昇することが確認された。
【００６５】
＜実施例４＞インフルエンザウイルスを接種したｇｌｄマウスのアポトーシス誘導細胞の観察
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）６個体および６週齢の雄のｇｌｄマウス（日本チャールス・リバー社）６個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種し、それぞれコントロール群および変異型群とした。
【００６６】
次に、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として４日目まで飼育し、２日目、３日目および４日目に、各群につき２個体から肺を採取した。採取した肺は、速やかに１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬し、４℃で２週間静置することにより固定を行った。その後、常法に従って肺のパラフィン切片を作製し、札幌総合病理研究所社に委託してＴＵＮＥＬ法（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）により染色した。染色したパラフィン切片について、ＥＣＬＩＰＳＥ８０ｉ（Ｎｉｋｏｎ社）を用いて観察を行った。細気管支周辺および肺血管周辺を撮影して作成した写真図を図５に、拡大撮影して作成した写真図を図６に、それぞれ示す。
【００６７】
図５に示すように、コントロール群では、２日目には陽性シグナルが検出されず、３日目に気管支へ浸潤する好中球および肺上皮細胞において陽性シグナルが検出され、４日目に、肺胞間質の顕著な肥厚部分において陽性シグナルが検出された。これに対し、変異型群では、２日目には陽性シグナルが検出されず、３日目に気管支へ浸潤する好中球において陽性シグナルが検出されたが、肺上皮細胞では陽性シグナルが検出されなかった。また、４日目には、肺胞間質の肥厚部分においてＴＵＮＥＬ染色陽性シグナルが検出されたが、その肥厚の程度は軽微であった。
【００６８】
また、図６に示すように、コントロール群では、３日目には陽性シグナルが検出されず、４日目に肺血管に浸潤する細胞に強い陽性シグナルが検出された。これに対し、変異型群では、３日目には陽性シグナルが検出されず、４日目には肺血管に浸潤する細胞が認められるものの、これらの細胞における陽性シグナルは検出されなかった。
【００６９】
これらの結果から、ＦａｓＬの機能を抑制することにより、インフルエンザウイルスの感染に伴う肺組織におけるアポトーシスを抑制できることが示された。
【００７０】
＜実施例５＞インフルエンザウイルスを接種したＦａｓＬ機能喪失型変異マウスの肺におけるウイルス量の確認
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）６個体および６週齢の雄のｇｌｄマウス（日本チャールス・リバー社）６個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種し、それぞれコントロール群および変異型群とした。
【００７１】
次に、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として５日目まで飼育し、３日目、４日目および５日目に、各群につき２個体から肺を採取した。採取した肺は、重量を測定した後、ビーズ式細胞破砕装置ＭＳ−１００Ｒ（トミー精工社）を用いて下記の条件により破砕して破砕液を得た。
【００７２】
１ｍｍジルコニアビーズ
５ｍｍステンレスビーズ
２ｍＬサンプルチューブ
３５００ｒｐｍ、３０秒間を１セットとして２セット
【００７３】
得られた破砕液を、１２穴プレートで単層培養したＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）に添加して、３７℃で１時間培養した。続いて、培養上清を除去し、Ｂａｃｔ−ａｇａｒ１％（ｗ／ｖ）およびトリプシン５μｇ／ｍＬを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加して、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養し、出現したプラークを数え、肺組織重量に対するウイルス量の割合（ｐｆｕ／ｇ）を求めた。その結果を図７に示す。
【００７４】
図７に示すように、３日目、４日目および５日目のいずれにおいても、コントロール群と変異型群とではウイルス量の割合がほぼ同じであった。これらの結果から、ＦａｓＬの機能を抑制した場合とＦａｓＬの機能を抑制しない場合とでは、肺の中のインフルエンザウイルスのウイルス増幅量はほとんど変わらないことが確認された。
【００７５】
＜実施例６＞インフルエンザウイルスを接種した後にＦａｓの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質を投与したマウスの生存率の確認
（１）Ｆａｓの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質の調製
［１−１］ベクターの調製
ｍＦａｓの細胞外領域であるアミノ酸配列１番目〜１６９番目（配列番号８）に相当する塩基配列（アクセッション番号ＮＭ００７９８７；配列番号７）とヒトＩｇＧのＦｃ領域（配列番号１０）に相当する塩基配列（アクセッション番号Ｚ１７３７０；配列番号９）とを、翻訳フレームが合うように繋げて得られる融合タンパク質（ｍＦａｓ−Ｆｃ；配列番号１２）に相当する塩基配列（配列番号１１）を有するＤＮＡ断片を調製した。具体的には、ｍＦａｓの細胞外領域であるアミノ酸１番目〜１６９番目に相当する塩基配列（配列番号７）とヒトＩｇＧのＦｃ領域に相当する塩基配列とを、ＢａｍＨIサイトを付加したプライマーを用いて、それぞれマウス末梢リンパ細胞およびヒト末梢リンパ細胞ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ法にて増幅し、翻訳フレームが合うように連結させることにより調製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎIおよびＸｂａIで消化した後、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＫｐｎI／ＸｂａIサイトに挿入し、ｐｃＤＮＡ３−ｍＦａｓ−Ｆｃを得た。
【００７６】
［１−２］ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのベクターの導入
本実施例（１）［１−１］のｐｃＤＮＡ３．１−ｍＦａｓ−Ｆｃおよびピューロマイシン耐性遺伝子が挿入されたベクターｐＧＬ４．１（Ｐｒｏｍｅｇａ社)を１：１の重量比の割合で含むベクター液を調製した。このベクター液に含まれるベクターを、遺伝子病制御研究所の上出利光氏より供与されたヒト胎児腎線維芽細胞由来株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて導入した。
【００７７】
その後、胎児牛血清（ＦＢＳ；Ｃａｎｓｅｒａ社）を１０％（ｖ／ｖ）含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地；シグマ社）で、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養した。次に、培地にピューロマイシン（ＣＡＹＬＡ社）を３μｇ／ｍＬとなるよう添加してさらに約２週間培養し、耐性細胞を得た。続いて、得られた耐性細胞について、ｍＦａｓ−Ｆｃ／ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とした。
【００７８】
［１−３］ｍＦａｓ−Ｆｃの精製
本実施例（１）［１−２］のｍＦａｓ−Ｆｃ／ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎでコートした培養面積１５０ｃｍ２の細胞培養フラスコ（北海道和光純薬社）にて、本実施例（１）［１−２］に記載の条件下でサブコンフルエントの状態まで約２４時間培養した。
【００７９】
続いて、培養液を除去してＰＢＳで洗浄を４回行った後、ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２％（ｖ／ｖ）含むＣＤ２９３Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０ｍＬを添加して３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２週間培養した。
【００８０】
その後、培養上清を回収し、３５００×ｇ、４℃の条件下で１５分間遠心分離を行って上清を得た。得られた上清を、０．４５ｕｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ；ミリポア社）を用いて濾過し、濾過液を得た。
【００８１】
次に、４℃の環境下でｐｒｏｔｅｉｎ Ａ結合アガロースゲル１ｍＬを充填したアフィニティーカラム（ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ；ＧＥヘルスケア社）に濾過液を通した後、５ｍＬのＰＢＳを用いて洗浄した。続いて、０．１ｍｏｌ／Ｌのｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）５ｍＬを添加して、０．５ｍＬずつ、計１０フラクションの溶出液を回収した。各溶出液には速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）１５μＬを加えて中和した。
【００８２】
続いて、各溶出液について波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を求め、タンパク質濃度が２００ｕｇ／ｍＬ以上である溶出液を選択し、計約１ｍｇのｍＦａｓ−Ｆｃを得た。これら選択した溶出液は、−８０℃で保存した。
【００８３】
［１−４］ｍＦａｓ−Ｆｃの大量調製
本実施例（１）［１−３］の操作を繰り返して、１５ｍｇのｍＦａｓ−Ｆｃを含む溶出液を得た。ＰＢＳを透析液として、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ １０ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、４℃で二晩透析し、ｍＦａｓ−Ｆｃ溶液３０ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。得られたｍＦａｓ−Ｆｃ溶液は−８０℃で保存した。
【００８４】
（２）インフルエンザウイルスを接種した後、ｍＦａｓ−Ｆｃを投与したマウスの生存率の確認
［２−１］マウスへのインフルエンザウイルスの接種
６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６−ＷＴ／ＷＴ（ホクドー社）１５個体について、実施例１（２）に記載の方法に従い、麻酔後に５個体ずつ３群に分け、１００μｇ投与群、５０μｇ投与群およびコントロール群として、実施例１（１）で調製した１×１０５ｐｆｕ／５０μＬのウイルス液をそれぞれ投与することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した。
【００８５】
［２−２］ｍＦａｓ−Ｆｃの投与
本実施例（１）［１−４］のｍＦａｓ−Ｆｃ溶液を、ＰＢＳを用いて希釈することにより、５００μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液および２５０μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液を調製した。本実施例（２）［２−１］の各群について、ＰＲ８ウイルスを接種した日を０日目として１９日目まで飼育した。この際、０日目から４日目まで、１００μｇ投与群には５００μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液０．２ｍＬ（１００μｇ相当）／１個体を腹腔内に１回／日（計５回）投与し、５０μｇ投与群には２５０μｇ／ｍＬのｍＦａｓ−Ｆｃ溶液０．２ｍＬ（５０μｇ相当）／１個体を腹腔内に１回／隔日（計３回）投与し、コントロール群にはＰＢＳ０．２ｍＬ／１個体を腹腔内に１回／日（計５回）投与した。
【００８６】
［２−３］インフルエンザウイルスを接種した後、ｍＦａｓ−Ｆｃを投与したマウスの生存率の確認
本実施例（２）［２−２］の各群について、実施例１（３）に記載の方法により生存率を求めた。その結果を図８に示す。
【００８７】
図８に示すように、１００μｇ投与群の生存率は、ｍＦａｓ−Ｆｃの投与以降、５日目および６日目は６０％、７日目から１９日目までは４０％であった。５０μｇ投与群の生存率は、ｍＦａｓ−Ｆｃの投与以降、５日目は８０％、６日目から１９日目までは２０％であった。これに対し、コントロール群の生存率は、ＰＢＳの投与以降、５日目は４０％、６日目は２０％、７日目以降は０％であった。
【００８８】
これらの結果から、ｍＦａｓ−Ｆｃを投与することにより、致死性感染モデルマウスの生存率の上昇が確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤であって、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とする前記剤。
【請求項２】
Ｆａｓリガンドと相互作用する物質が、Ｆａｓレセプターの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質Ｆａｓ−Ｆｃである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
Ｆａｓレセプターの細胞外領域が、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってＦａｓリガンドと相互作用するポリペプチドである、請求項２に記載の剤。
【請求項１】
Ｆａｓリガンド／Ｆａｓレセプター系を介するアポトーシスを抑制するインフルエンザウイルス感染症の治療および／または発症抑制剤であって、Ｆａｓリガンドと相互作用する物質を有効成分とする前記剤。
【請求項２】
Ｆａｓリガンドと相互作用する物質が、Ｆａｓレセプターの細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域とを結合させた融合タンパク質Ｆａｓ−Ｆｃである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
Ｆａｓレセプターの細胞外領域が、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってＦａｓリガンドと相互作用するポリペプチドである、請求項２に記載の剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−６８５２（Ｐ２０１２−６８５２Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４２５９５（Ｐ２０１０−１４２５９５）
【出願日】平成２２年６月２３日（２０１０．６．２３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、文部科学省、地域イノベーション創出総合支援事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２３日（２０１０．６．２３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、文部科学省、地域イノベーション創出総合支援事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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