インフルエンザワクチンに関連する潜在的医原性リスクの減少
【課題】インフルエンザワクチンに関連する潜在的医原性リスクを減少させる方法を提供すること。
【解決手段】ヒト用ワクチンを調製する際に使用するためのインフルエンザウイルスは、伝統的には胚含有ニワトリ卵にて増殖させていたが、より新しい技術では、例えばＶｅｒｏ、ＭＤＣＫ、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株などの哺乳動物細胞培養物内でウイルスを増殖させる。発明者は、５培養物のインフルエンザウイルスに用いた条件によって、インフルエンザウイルス以外の病原体がその細胞株で増殖する危険性が増大することが可能であることを理解し、具体的に混入汚染の危険物を特定した。従って、安全性を確保し、医原性感染を避けるために、製造の過程で適切な試験を行うことができる。
【解決手段】ヒト用ワクチンを調製する際に使用するためのインフルエンザウイルスは、伝統的には胚含有ニワトリ卵にて増殖させていたが、より新しい技術では、例えばＶｅｒｏ、ＭＤＣＫ、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株などの哺乳動物細胞培養物内でウイルスを増殖させる。発明者は、５培養物のインフルエンザウイルスに用いた条件によって、インフルエンザウイルス以外の病原体がその細胞株で増殖する危険性が増大することが可能であることを理解し、具体的に混入汚染の危険物を特定した。従って、安全性を確保し、医原性感染を避けるために、製造の過程で適切な試験を行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において引用されるすべての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルスワクチンの生産および品質管理に関係する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ヒト用ワクチンを調製する際に使用するためのインフルエンザウイルスは、伝統的には胚含有トリ卵にて増殖させていたが、より新しい技術では、例えばＶｅｒｏ、ＭＤＣＫ、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株などの哺乳動物細胞培養物でウイルスを増殖させる。ウイルス増殖基質が変わったことによって、インフルエンザワクチンの安全性規制を再評価する機会が生じた。例えば、宿主細胞ＤＮＡへの混入汚染が細胞由来のワクチンに関する規制上の問題点となっているが（特許文献１）［１］、過去における、卵内で増殖させたワクチンでは、これは問題ではなかった。
従って、卵由来のインフルエンザワクチン周辺の安全性の問題は、より厳密な安全性の下にある細胞由来のワクチンに伴う、細胞培養物にて増殖したワクチン周辺のものとは異なる。本発明の目的は、こうした異なる安全性の問題に向けられており、特に細胞培養物にて増殖したインフルエンザワクチンの安全性を高めるための方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５９４８４１０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（本発明の開示）
本質的に、インフルエンザワクチン生産のために哺乳動物細胞基質を使用することは、ウイルスの増殖および複製に良く適した条件下で細胞を培養することが関係する。発明者は、こうした条件では、インフルエンザウイルス以外の病原体が細胞培養物内で増殖する危険性が増し、よって最終ワクチン製品の混入汚染の可能性に繋がると、理解した。混入汚染に関する試験は一般に、実施するのに難しいものではないが、製造者は最初にどんな試験を行うべきかを知る必要がある。発明者は具体的な混入汚染の危険物を特定し、その成果は、細胞培養物上で増殖したインフルエンザワクチンの安全性および品質を確保するための適切な試験を、製造過程で行うことができることを意味する。混入汚染物の一部は、最終ワクチン製品において無害である場合があるが、これらの存在は、インフルエンザウイルスの増殖およびその後の精製を妨げることが可能であり、そのため、これらを除去することが、品質および複製能に関する主要な問題となる。別の一部の混入汚染物は最終ワクチンにおいて有害となる可能性もあり、そのためこれらの除去は安全性上の大きな問題である。
【０００６】
ウイルス共培養から生じる混入汚染の危険性は先例がないわけではないが（例えば初期のバッチのポリオウイルスワクチンは、ポリオーマウイルスであるシミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）で汚染されていた。）、ヒト用インフルエンザワクチン生産のための細胞培養に伴う具体的な危険物を特定することに関する開示物はこれまでに存在していない。ワクチン生産のために使用されるウイルス株は毎年変わるため、新たな培養物を毎年確立しなければならず、細胞培養物上で増殖したインフルエンザウイルスには、特に混入汚染の危険性がある。特に、製造者のために種ウイルスを調製する過程で複数継代が行われ、これによって外来性の病原体が平行増殖する危険性が増すことから、生産物が毎年変わるということは毎年新たな混入汚染の危険性がもたらされることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、細胞培養物中でインフルエンザウイルスを増殖させるための条件では増殖し得るが、ニワトリ卵では増殖しない感染因子を特定した。これらの感染因子は、インフルエンザワクチンに対する、伝統的なインフルエンザワクチン関してこれまで問題となっていない新たな混入汚染リスクである。従って、本発明は、哺乳動物細胞株の培養物内で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これはワクチンおよび／または培養物を、上記細胞株内では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵では増殖しない感染因子の存在に関して試験する工程を含む。
【０００８】
また、発明者はインフルエンザワクチンを作製するために使用する一部の細胞基質では増殖するがこれ以外では増殖しない感染因子を特定した。これらの感染因子は、従って、一部のインフルエンザウイルスのみに対する混入汚染危険物である。すなわち本発明はまた、第１の哺乳動物細胞の培養物中で増殖したインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これは、上記第１細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子の存在に関して、そのワクチンおよび／または培養物を試験する工程を含む。
【０００９】
また、本発明は、哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これは、そのワクチンおよび／または培養物を処理して、その細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化する工程を含む。同様に、本発明は、第１の哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これは、そのワクチンおよび／または培養物を処理して、上記第１細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化する工程を含む。除去および／または不活化の後、例えば感染因子が除去・不活化されたことを確認するために、感染因子の存在に関してワクチン・培養物を試験する場合がある。
【００１０】
また本発明は、本発明の方法によって得たインフルエンザワクチンを提供する。また本発明は、本発明の方法によって得ることが可能なインフルエンザワクチンを提供する。
【００１１】
また本発明は、哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザワクチンを提供し、ここで、このワクチンは、上記細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子が存在しない状態にあることが確認されている。同様に、本発明は、第１の哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザワクチンを提供し、ここで、このワクチンは、上記第１細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子が存在しない状態にあることが確認されている。
【００１２】
また本発明は、哺乳動物レオウイルスがＲＴ−ＰＣＲによって検出不能であるインフルエンザワクチンを提供する（例えばＬ１．ｒｖ５、Ｌ１．ｒｖ６、Ｌ１．ｒｖ７、およびＬ１．ｒｖ８プライマーを教示されているように使用する、文献１６にて開示されているＬ１ベースのＲＴ−ＰＣＲを用いる。）卵で増殖していないので、このワクチンには卵白アルブミンおよびニワトリＤＮＡが存在しないこととなる。
【００１３】
（哺乳動物細胞株）
本発明のインフルエンザワクチンは、胚含有卵にて増殖させるのではなく、哺乳動物細胞株にて増殖させる。生物製剤の作製に使用される典型的な哺乳動物細胞系には、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＣＲ−５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ−３８などが含まれる。インフルエンザウイルスを増殖させるのに好ましい哺乳動物細胞株には、メイディン・ダービーイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２−５］、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［６−８］、またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［９］が含まれる。
【００１４】
これらの細胞株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）収集物［１０］、またはＣｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［１１］などから、幅広く入手可能である。例えばＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７として様々な種類のＶｅｒｏ細胞を提供しており、さらにカタログ番号ＣＣＬ−３４としてＭＤＣＫ細胞を提供している。
【００１５】
哺乳動物細胞株での増殖物に由来する物質のために有用であるばかりでなく、本発明は、例えばニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）などニワトリに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば参考文献１２と１３。］に由来する材料にまで拡大し得る。
【００１６】
（胚含有ニワトリ卵にて増殖しない感染因子）
発明者は、ワクチン生産のためのインフルエンザウイルスを調製するために使用される哺乳動物細胞株（特にＭＤＣＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞の双方。）にて増殖し得るがニワトリ卵では増殖しない様々な病原体を同定した。これらの病原体による混入汚染の試験は伝統的な卵基質で調製されるワクチンには必要ないが、発明者は、ワクチンの品質管理には、最高の安全基準を確保するために、１つ以上のこれら病原体に関する試験を含めるべきであると理解している。この病原体は以下のものである。：
・ＲＳウイルス（ＲＳＶ）を含むＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属などのニューモウイルス亜科。
・麻疹ウイルスなど、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属。
・コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびエンテロウイルスなど、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属。但し、一部のコクサッキーウイルス（例えばＢ３、Ｂ４）は、ＭＤＣＫ細胞内では増殖しないことが認められている。
・哺乳動物レオウイルス科、特にオルトレオウイルス（例えば哺乳動物レオウイルス類）およびロタウイルス。レオウイルスは、ＶｅｒｏおよびＭＤＣＫ細胞にて非制限的な増殖を示すことができるので、これらに関する試験は特に重要である。ロタウイルスは、インフルエンザウイルスと同じ、細胞培養物中で増殖するためのプロテアーゼ要求性を持っており、この平行性のために混入するロタウイルスの活性化が、気づくことなく導かれる可能性が考えられる。
【００１７】
これらの病原体に異なる宿主を持つ異なる株が含まれる場合（例えばヒトＲＳＶとウシＲＳＶなど）、試験は典型的にはヒトに感染し得る株に関係するものとなる。
【００１８】
逆遺伝学の方法の過程で、ウイルス生産のための種ウイルスは哺乳動物細胞培養物中にて複数過程の処理を受け、よって外来性の感染因子による混入汚染の危険性が増すことから、これらの因子に関する試験は、逆遺伝学の手法によってできたウイルス株に対して、特に重要である。
【００１９】
（卵では増殖しないが、様々な哺乳動物細胞株で増殖する感染因子）
発明者は、ニワトリ卵では増殖せず、ＭＤＣＫ細胞で増殖しないがＶｅｒｏ細胞にて増殖する様々な種類の病原体を同定した。これらの病原体による混入汚染に対する試験は伝統的な卵基質で調製されるワクチンには必要なく、ＭＤＣＫ細胞で調製されるワクチンにも必要ないが、Ｖｅｒｏ細胞で増殖させたワクチンの品質管理には、最高の安全基準を確保するためにこれら病原体の１つ以上のものに関する試験を含めるべきであると認識した。この病原体には以下ものがある。：
・ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）など、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属類。
・Ｖｅｒｏにてよく増殖する流行性耳下腺炎ウイルスなど、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属。
・風疹ウイルスなどのトガウイルス科。
・ＳＡＲＳコロナウイルスおよび他のヒトコロナウイルスなどのコロナウイルス科。非制限的な増殖を示すＳＡＲＳウイルスと共に、これらのウイルスはＶｅｒｏ細胞にて高い増殖性を示し、これらのものに関する試験は特に重要である。
・Ｍ型リノウイルスなど、ピコルナウイルス科のライノウイルス属。
・２型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ３）とも呼ばれるＶａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒウイルス（ＶＺＶ）。ＶＺＶはＶｅｒｏ細胞にて非制限的な増殖を示すことができ、これに関する試験は特に重要である。
・ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、およびＪＣポリオーマウイルスなどのポリオーマウイルス科。これらのポリオーマウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞（特にＢＫ細胞）にて非制限的な増殖を示すことができ、これらに関する試験は特に重要である。
・ブタサーコウイルス。
・ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）およびテッシェンタルファンウイルスなどのブタピコルナウイルス。
・Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉなどのクラミジア属細菌。これらの細菌はＶｅｒｏ細胞にて増殖する場合があり、これらに関する試験は特に重要である。
・イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）またはブタパルボウイルスなどのパルボウイルス属。
【００２０】
これらの病原体に異なる宿主（例えばヒトＲＳＶとウシＲＳＶなど。）を持つ異なる株が存在する場合、試験は、典型的にはヒトに感染し得る株に関係することとなる。
【００２１】
非ヒトウイルス（例えば鳥類およびブタウイルス）に関する試験は、例えば、最初に株がブタまたはトリから単離されていた場合、または１次増殖の過程で卵を使用した場合、もしくは細胞培養物にブタトリプシンを使用した場合など、ウイルスの調製に鳥類またはブタの材料が使用される場合にのみ、主に問題となる。
【００２２】
（卵および哺乳動物細胞株にて増殖する感染因子）
また、発明者は、上記のものとは対照的に、哺乳動物細胞株とニワトリ卵の双方にて増殖する病原体を同定した。本発明の工程には当該病原体に関する試験の方法が含まれるが、この方法は、ニワトリ卵にて増殖させたウイルスの品質管理強化の一部となる可能性も考えられる。これらの病原体には以下が含まれる。：
・ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、およびＰＩＶ−３を含む、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ
ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅの一員であるパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）。
・１型単純ヘルペスウイルスおよび２型単純ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルス科。
・ヒトおよびシミアンアデノウイルスを含む、アデノウイルスなどのアデノウイルス科。・マイコプラズマ属。
・トリサーコウイルス。
・哺乳動物細胞株にて増殖し得るトリレオウイルスなどのトリレオウイルス科。特にオルトレオウイルス。
【００２３】
また、発明者は、ニワトリ卵およびＶｅｒｏ細胞では増殖するが、ＭＤＣＫ細胞では増殖しないようである病原体を同定した。本発明の方法は、当該病原体に関する試験を行う方法を含む場合があるが、この方法はニワトリ卵にて増殖させたウイルスの品質管理強化の一部となる可能性も考えられ、またこの方法はＭＤＣＫ基質を使用する場合には必要ではない。これらの病原体には、以下が含まれる。：
・伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ガンボロウイルスとも呼ばれる。）などのビルナウイルス科。
【００２４】
卵と細胞株の双方で増殖する病原体に関する試験は、例えばウイルス生産のための種ウイルスなど、卵内で複数の処理を通過した後に派生するウイルス株にとって、重要である。
【００２５】
これらの病原体は卵内で増殖することから、続いて、卵上で増殖したウイルスから調製されたウイルスに対しても、その存在の有無に関する試験を用いることができる。従って、本発明は、細胞培養物にて増殖したワクチンに限るものではなく、これはまた、「伝統的な」卵ベースのワクチンに対しても用いることができる。
【００２６】
（試験方法）
細胞培養物および生物医薬品内の病原体の存在を検出するための方法は、日常的に利用可能である。一般に方法は、免疫化学的検出（イムノアッセイ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなど。）および／または核酸検出（サザンブロット、スロットブロット、ＰＣＲなどのハイブリダイズ法。）に頼ることとなる。または、従来の細胞培養物接種によって病原体の存在に関する試験を行うことが可能である（従って、適当な条件下で培養された時に、その材料が混入する病原菌の産生を導くものであるか否かの試験。）。
【００２７】
方法は、１種の病原菌（例えば１種のウイルス）を検出する、または複数種の病原体（例えば複数種のウイルス）を検出する場合がある。試験によって複数種の病原体（例えば「Ｘ」、「Ｙ」、または「Ｚ」。）が検出された場合、具体的な結果（例えばウイルス「Ｙ」が存在する。）が得られる、または全般的な結果（例えば「Ｘ」、「Ｙ」、または「Ｚ」のうちの１種が存在する。）が得られる場合がある。方法は、定量的、準定量的、または定性的である場合がある。リアルタイム検出法が用いられる場合がある。
【００２８】
対象とする病原菌（例えばウイルス）を検出するための一般的な指針は、文献１４にて確認し得る。多数のより具体的なアッセイを、以下の文章にて提供し、技術者は、任意の選択された病原菌の存在を検出するためのアッセイを、容易に見つける、または準備し得る。
【００２９】
文献１５は、１回の試験で、主にエンテロウイルス、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、１型および３型パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの９つの呼吸器菅病原体を検出するための、多重逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを開示しており、これは「ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ」と呼ばれている。哺乳動物レオウイルスを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法は、文献１６にて開示されている。文献１７は、既知の遺伝系列からヒトメタニューモウイルスを検出するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。文献１８は、ヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）、１型、２型、および３型ヒトパラインフルエンザウイルス、およびＡ型およびＢ型インフルエンザを検出するための単回ＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。文献１９は、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、およびパルボウイルスＢ１９を検出および鑑別するための多重ＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。ヒトリノウイルスを、ピコルナウイルス科の他のウイルスと正確に識別して検出するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが、文献２０に開示されている。文献２１は、ヒトパラインフルエンザウイルス赤血球凝集素の保存された領域、ヒトコロナウイルスのスパイクタンパク質、およびヒトエンテロウイルスおよびリノウイルスのポリタンパク質遺伝子に標的化させた入れ子状のプライマーセットを用いる多重ＲＴ‐ＰＣＲアッセイを開示しており、これによって、４種類のパラインフルエンザウイルス（１、２、３、４ＡＢ）、ヒトコロナウイルス２２９ＥおよびＯＣ４３の迅速で感受性の高い同時検出および分類、およびエンテロウイルスおよびリノウイルスの一般検出が可能となる。ＲＴ−ＰＣＲによるＳＶＤＶ検出が、文献２２に開示されている。ＳＡＲＳコロナウイルスに対する１段間定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイが、文献２３に開示されている。文献２４は、ＶＺＶに関するＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、およびサーコウイルスの迅速な同時検出のための多重ＰＣＲアッセイが、文献２５にて開示されている。ＳＶ−４０ポリオーマウイルス検出に関するリアルタイムＦＲＥＴプローブＰＣＲアッセイが、文献２６に記載されている。文献２７は、迅速で感受性の高いＰＣＲ−ＥＬＡＨＡ法による、ヒトポリオーマウイルスＪＣおよびＢＫの同時検出および鑑別のためのアッセイを開示している。ＰＣＲおよび間接免疫蛍光アッセイによる、ヒト細胞株におけるブタサーコウイルスの検出が、文献２８に開示されている。ビルナウイルス検出のためのＰＣＲ法が、文献２９および３０にて開示されている。
【００３０】
本発明の検出方法は、種ウイルスおよび／または細胞基質および／または培養培地の段階から、ウイルス感染および増殖段階、ウイルス回収、任意のウイルス処理（例えば、スプリット、および／または、表面タンパク質の抽出など。）、ワクチンの処方を通じて、ワクチンパッケージングまで、ワクチン製造の過程の任意の段階で実施される場合がある。従って、本発明に従って用いられるアッセイは、ウイルス培養物を創出するのに使用する物質に関して、ウイルス培養物自体に関して、およびウイルス培養物から抽出した物質およびこれに派生する物質に関して、実行し得る。このアッセイは、ワクチンまたは培養物１つずつについて行う必要はないが、通常の品質管理の一部として、適切な間隔で用いることができる。規制当局が毎年新ためて推奨する株のためにワクチン生産が変更される場合、新たな培養物を確立して新たな品質管理を受けることが必要とされる段階で、これは特に有用である。本発明のアッセイは、ワクチン製造のために使用される種ウイルスについて行うと有益である。
【００３１】
本発明の方法では、インフルエンザウイルスを増殖させるのに使用する細胞株は、例えば無血清培地、無タンパク質培地など、任意の適切な培地にて培養される場合がある。インフルエンザウイルスの無血清培養に関する方法は文献２にて開示されており、無タンパク質培養に関する方法は、参考文献および／または無タンパク質３１にて開示されている。しかし、「無タンパク質」培地は、インフルエンザの増殖に必要な場合のある１つ以上のプロテアーゼ（例えばトリプシン）を含む場合がある。無血清培地は、血清添加物を含む場合がある。
【００３２】
ウシ由来の物質を添加しない培地でワクチンが増殖していれば、それは好ましく、これによってその培養物が任意の可能性のあるＢＳＥ混入物およびウシウイルスを含有しないことが確保される。任意の伝染性海綿状脳症に関係する成分を含有しない培地が、好ましい。
【００３３】
（インフルエンザワクチン）
本発明は、インフルエンザワクチンの品質管理に関係する。このワクチンは、生きたウイルスまたは、好ましくは不活化ウイルスの形態にある場合がある。ウイルスの不活化には、典型的には、ホルマリンまたはβ‐プロピオラクトンなど化学薬品での処理が含まれる。不活化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、ウイルス全体、スプリットウイルス（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｕｓ）、または、ウイルスサブユニットであり得る。スプリットウイルスは、ビリオンを界面活性剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、リン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、トリトンＸ‐１００、トリトンＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウムなど。）で処理し、準ウイルス粒子を作製することによって得られる。サブユニットワクチンは、共にインフルエンザ表面抗原である赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む。またインフルエンザ抗原は、ビロソームの形態にて提供されることが可能である［３２］。
【００３４】
本発明のインフルエンザワクチンは、任意の適切なウイルス株（１種または複数種）に基づくものであることができる。ワクチンは、典型的には、Ａ型インフルエンザの少なくとも１系統、および／またはＢ型インフルエンザの少なくとも１系統に由来する抗原を含む。ワクチンに関して推奨されるウイルス型は、シーズンごとに変化する。現在の間流行期において、ワクチンは、典型的には、２種のＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）と１種のＢ型インフルエンザ株とが含まれており、３価のワクチンが好まれている。また、本発明は、Ｈ５株またはＨ７株などの汎発株に由来するウイルスを調製するのに適切であり、これらのウイルス株に対してヒト集団は免疫学的にナイーブである。流行期のワクチンは、１価である場合がある、または汎発株を加えた通常の３価ワクチンを基礎とする場合がある。
【００３５】
本発明の方法にて使用されるインフルエンザウイルス（１種または複数種）は、リアソータント株である場合がある、および／または逆遺伝学の技術によって得られたものである場合がある。ウイルスは弱毒化されている場合がある。ウイルスは温度感受性である場合がある。ウイルスは冷順応されている場合がある。
【００３６】
ワクチンが１種よりも多くのインフルエンザ株を含む場合、典型的には、別種の株を別々に増殖させ、ウイルスを回収して抗原を調製した後に混合する。従って、本発明の方法は、１種以上のインフルエンザ株に由来する抗原を混合する方法を含む場合がある。病原体に対する試験は、当該混合の前、または後に行われる場合がある。
【００３７】
ワクチンは、典型的には、注射（例えば皮下注射または筋肉内注射）によって患者に投与するために調製されるであろうが、例えば経鼻［３３−３５］、経口［３６］、皮膚内［３７、３８］経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［３９］など、他の投与経路がインフルエンザウイルスに関して周知されている
本発明に従って調製されるワクチンは、小児と成人の双方を治療するために使用される場合がある。インフルエンザワクチンは、現在、生後６ヶ月から、小児および成人の予防接種に使用するよう推奨されている。特に、免疫学的にナイーブである対象者が短期間に２回のワクチン接種を受けるように（例えば１ヶ月または２ヶ月の間隔で。）、安全性の問題は小児の予防接種に関して最も深刻である。
【００３８】
本発明のワクチンは、アジュバントを含有する場合がある。インフルエンザワクチンに使用されているアジュバントには、アルミニウム塩［４０、４１］、キトサン［４２］、ＣｐＧ ７９０９などのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド［４３］、ＭＦ ５９などの水中油型乳剤［４４］、水中油中水型乳剤［４５］、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素［３４、４６］およびこれらの無毒化変異物［４７−４８］、モノホスホリルリピッドＡ［４９］およびこれの３−ｏ−脱アシル化誘導体［５０］、百日咳毒素変異物［５１］、ムラミルジペプチド［５２］などが含まれる。
【００３９】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザ不活化ワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン投与量は、典型的には一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）法によって測定されるＨＡレベルを照会して標準化される。ワクチンは、典型的には、１株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば小児に対して、または流行状態などでは、これよりも少ない投与量でも用いられる。１／２（例えば１株当たり７．５μのＨＡ）、１／４、１／８など、分数量も用いられている［４０、５３］。従って、ワクチンは、インフルエンザ１株当たり１から２０μｇの間のＨＡを含有し、例えば約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９などであることが好ましい。
【００４０】
このワクチンは、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含有する場合がある。しかしながら、ワクチンは、例えばチオメルサールを含まないなど、水銀物質を実質的に含むべきでないこと（すなわち、５μ／ｍｌ未満など。）が好ましい［５４、５５］。水銀を含有しないワクチンがより好ましい。
【００４１】
本発明のワクチンは、１回投与量当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残余宿主細胞ＤＮＡを含有することが好ましいが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在する場合がある。例えばクロマトグラフィーなどの標準精製方法を用いて、ワクチン調製の過程で混入したＤＮＡを除去し得る。残余宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えばベンゾナーゼＴＭ ＤＮアーゼを用いるなど、ヌクレアーゼ処理によって強化し得る［１］。１５μｇの赤血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましく、同様に、ワクチンは、０．２５ｍｌ量当たり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有することが好ましい。５０μｇの赤血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンがより好ましく、同様に、０．５ｍｌ量当たり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましい。
【００４２】
このワクチンのこれら様々な特徴は、本発明の工程に適切な方法を包含させることによって達成される場合がある。従って、具体的な工程としては、以下が挙げられる：不活化させる工程；３つのウイルス株を混合して、３価のワクチンを作る工程；注射用にワクチンを処方する工程；このワクチンを患者に投与する工程；このワクチンをアジュバントと組み合わせる工程；ＨＡ量を測定する工程；例えば稀釈などによってＨＡ量を調整する工程；保存剤を添加する工程；残余宿主細胞核酸を除去する工程、など。
【００４３】
（試験するための好ましい外来作用因子）
インフルエンザウイルスの一次臨床分離物内に、呼吸器系試料にて見つかる外来作用因子（特に、ウイルス）が存在する可能性がより高いため、本発明の好ましい実施様態は、呼吸器系試料にて見つかる外来作用因子、特にウイルスを含む。呼吸器病原体には、ＲＳＶ、ＰＩＶ−３、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、アデノウイルス、リノウイルス、レオウイルス（「呼吸器腸病原性オーファンウイルス」）などが含まれる。単純ヘルペスウイルスも呼吸器系試料にて見つかることが可能である。
【００４４】
本発明を用いる対象とする特に好ましい病原体は、レオウイルス（特に哺乳動物レオウイルス）、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、およびパルボウイルスである。また、単純ヘルペスウイルスに対する試験も好ましい。
【００４５】
ワクチンを界面活性剤で処理した場合（例えばスプリットウイルスワクチンまたはサブユニットワクチンなど。）、混入ウイルスをも分断することもし得ることから、この処理段階によってさらなる安全性が得られる。しかし、混入物が外被で覆われていない場合、界面活性剤処理はワクチンに対して通常何ら影響しないこととなるため、この処理自体は安全性を改善しない。従って、以下の病原体に対する試験は、これらが外被に覆われていないため、特に重要である。：ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、パルボウイルス科、サーコウイルス科、アデノウイルス科、ポリオーマウイルス科。
【００４６】
Ｖｅｒｏ細胞基質を使用する場合、Ｖｅｒｏ細胞における高増殖性と組み合わさったこれらのウイルスの界面活性剤耐性は、ヒトエンテロウイルス、哺乳動物レオウイルス科、アデノウイルス科、およびポリオーマウイルス科に対する試験が特に重要であることを意味する。哺乳動物レオウイルス科はＭＤＣＫ細胞でも高量増殖する。また、これらのウイルスは、不活化に対する耐性が最も大きいものの一つである。
【００４７】
以下のことから、哺乳動物レオウイルス科の存在に関する試験は、本発明の好ましい一実施様態である。：（ａ）このウイルスはニワトリ卵では簡単に増殖しないため、これらのウイルスに対する試験は伝統的なインフルエンザウイルス製造の一部分ではなかった。（ｂ）このウイルスは、ＭＤＣＫおよびＶｅｒｏ細胞株の双方にて、非制限的な増殖を示すことができる。（ｃ）このウイルスは不活化に対して高い耐性を持ち、ワクチン加工の過程で継続的に安定している。（ｄ）このウイルスは、外被で覆われていないため、インフルエンザウイルスを界面活性剤処理しても残存し得る。（ｅ）このウイルスは呼吸器感染症に関係するため、一次ウイルス分離物に混入することが考えられる。ウイルスを調製する過程で鳥類の物質が使用されている場合、トリレオウイルス科に対する試験も重要であり、先に列挙した判断基準（ｂ）から（ｅ）は、等しくトリレオウイルス科に適用される
（他の生物学的事項）
インフルエンザワクチンの試験に有用であることに加え、本発明は、例えば抗体［５６］、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、受容体、ホルモン、ワクチン抗原、診断抗原などの組換えタンパク質など、他の生物学的事項にも用いることができる。
【００４８】
（一般事項）
用語「含む、包含する」とは、「含む」および「からなる」を包含する。例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘのみからなってもよいし、または（例えばＸ＋Ｙなどの）何か追加となるものを含んでもよい。
【００４９】
数値Ｘに関係する「約」という語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００５０】
「実質的に」という語は、「完全に」を除くものではない。例えば「実質的に」Ｙ「を含まない」ある組成物は、完全にＹを含まない場合がある。必要な場合、「実質的に」という語が、本発明の定義から省略される場合がある。
【００５１】
ウイルス株、増殖のための細胞株、投与量、組み合わせ、組成などを含む、インフルエンザワクチンに関するさらに全般的な情報は、文献５７の第１７および１８章にて確認し得る。ウイルス増殖過程でのウイルスライフサイクルの詳細などインフルエンザウイルスに関する詳細は、文献１４の第４６章にて確認し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子の存在に関して試験する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化するために処理する工程、
を包含する、方法。
（項目３）
前記哺乳動物細胞株が、ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株である、項目１または項目２の方法。
（項目４）
前記感染因子が、ニューモウイルス亜科、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属、哺乳動物レオウイルス科、およびビルナウイルス科からなる群より選択される、項目１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記感染因子が、ＲＳウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記哺乳動物細胞株が、Ｖｅｒｏ細胞株であり、前記感染因子が、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、トガウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオーマウイルス科、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、クラミジア属細菌、およびパルボウイルス属からなる群より選択される、項目１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記感染因子が、ヒトメタニューモウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ライノウイルスＭ株、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタ水疱病ウイルス、テッシェンタルファンウイルス、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ、イヌパルボウイルス、およびブタパルボウイルスからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ワクチンおよび／または前記培養物を、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、マイコプラズマ属、トリサーコウイルス、およびトリレオウイルス科からなる群より選択される病原体の存在に関して試験する工程；
をさらに包含する、項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
第１の哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該第１の細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子の存在に関して試験する工程；
を包含する、方法。
（項目１０）
第１の哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該第１の細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化するために処理する工程；
を包含する、方法。
（項目１１）
（ａ）前記第１の哺乳動物細胞株が、ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株からなる群より選択され、（ｂ）前記第２の哺乳動物細胞株が、ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株からなる群より選択され、（ｃ）該第１の哺乳動物細胞株と該第２の哺乳動物細胞株とは異なる、項目９または項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の哺乳動物細胞株が、Ｖｅｒｏ細胞株であり、前記感染因子が、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、トガウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオーマウイルス科、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、クラミジア属細菌、パルボウイルス属、およびビルナウイルス科からなる群より選択される、項目９〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記感染因子が、ヒトメタニューモウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ライノウイルスＭ株、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタ水疱病ウイルス、テッシェンタルファンウイルス、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃi、イヌパルボウイルス、ブタパルボウイルス、および伝染性ファブリキウス嚢病ウ
イルスからなる群より選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ワクチンおよび／または前記培養物が、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、マイコプラズマ属、トリサーコウイルス、およびトリレオウイルス科からなる群より選択される病原体の存在に関して試験される工程；
をさらに包含する、項目９〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記除去および／または不活化の後に、前記ワクチンおよび／または前記培養物を、前記感染因子の存在に関して試験する工程；
をさらに包含する、項目２または項目１０に記載の方法。
（項目１６）
哺乳動物細胞株の培養物中またはニワトリ卵中にて増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、マイコプラズマ属、トリサーコウイルス、トリレオウイルス科、ビルナウイルス科からなる群より選択される病原体の存在に関して試験する工程；
を包含する、方法。
（項目１７）
前記病原体が、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−３、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルス、シミアンアデノウイルス、オルトレオウイルス、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記培養物を、免疫化学的検出および／または核酸検出によって試験する、項目１〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記検出が、ＥＬＩＳＡおよび／またはＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）によるものである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザワクチンであって、該細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子が存在しないことが確認されている、インフルエンザワクチン。
（項目２１）
第１の哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザワクチンであって、該第１細胞株中で増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子が存在しないことが確認されている、インフルエンザワクチン。
（項目２２）
ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株の培養物中で増殖された、項目１８または項目１９に記載のワクチン。
（項目２３）
哺乳動物レオウイルスがＲＴ−ＰＣＲによって検出不能である、インフルエンザワクチン。
（項目２４）
卵白アルブミンおよびニワトリＤＮＡを含まない、項目２３に記載のワクチン。
（項目２５）
項目１〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法によって得られるかまたは得ることが可能である、インフルエンザワクチン。
（項目２６）
生ウイルスワクチンである、項目２０〜２５のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２７）
不活化ウイルスワクチンである、項目２０〜２５のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２８）
ウイルス完全体ワクチン、スプリットウイルスワクチン、またはウイルスサブユニットワクチンである、項目２７に記載のワクチン。
（項目２９）
３価インフルエンザワクチンである、項目２０〜２８のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３０）
汎流行性インフルエンザウイルス株を含む、項目２０〜２９のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３１）
インフルエンザウイルスＨ５株またはＨ７株を含む、項目３０に記載のワクチン。
（項目３２）
注入、鼻内経路、経口経路、皮内経路、経皮経路または経皮的経路によって患者に投与するための、項目２０〜３１のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３３）
小児免疫用である、項目２０〜３２のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３４）
１株当たり１〜２０μｇのインフルエンザウイルス赤血球凝集素を含む、項目２０〜３３のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３５）
アジュバントを含む、項目２０〜３４のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
（本発明を実施するための様式）
（ＭＤＣＫ細胞）
発明者は、ワクチン調製のために血清を含まない培地中のＭＤＣＫ細胞でインフルエンザウイルスを増殖させる経験を有している。彼らは、この細胞が他の病原体にも適切な宿主であることを理解し、他の様々な病原体が同じ条件で増殖する能力を試験した（文献２にて記載されているように、特にＭＤＣＫ ３３０１６培養物、ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９として寄託、血清を含まない培地中で。）。
【００５３】
活性ウイルスの複製またはＭＤＣＫ細胞における増殖に関する試験を行った時、ＲＳウイルスＲＳＶ−Ａ２およびＲＳＶ−Ｂに対する試験は陰性であった。パラインフルエンザＰＩ−３株およびＳＶ−５株は検出された。ヒトコロナウイルス２２９ＥおよびＳＡＲＳに対する試験は陰性であり、ポリオウイルス１型、エコーウイルス６型、コクサッキーウイルスＡ１６、およびコクサッキーウイルスＢ３に対する試験も同様であった。Ｉｂ型、３７およびＮＬ．９５０１８４１ライノウイルス試験は陰性であった。レオウイルスＲｅｏ ３に対する試験は陽性であり、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１に対する試験も同様であった。ヒトアデノウイルス１型、５型、および６型に対する試験は陰性であった。ＳＶ−４０の試験は陰性であり、接種力価は１４日間安定していた。イヌパルボウイルスおよびマウス微小ウイルス試験は陰性であり、ラウス肉腫ウイルスも同様であった。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ試験は陰性であった。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ試験は陰性であったが、感染後３〜５日の間、非常に低量の増殖は排除できなかった。
【００５４】
さらに研究によって、ＭＤＣＫ細胞は、水疱性口内炎ウイルス（インディアナ）、ワクシニアウイルス、コクサッキーウイルスＢ５、レオウイルス２型、ヒトアデノウイルス４型および５型、ブタ水疱性発疹ウイルス、および伝染性イヌ肝炎ウイルスの増殖を支えることが可能なことが示された［５８］。
【００５５】
ＭＤＣＫ細胞で増殖することが可能であるウイルスの中で、パラインフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノウイルスは胚含有ニワトリ卵でも増殖し得る。対照的に、ヒトレオウイルス（および他の哺乳動物レオウイルス）は、卵では容易に増殖しない。故に、インフルエンザウイルス生産のための細胞培養系としてＭＤＣＫ細胞を使用する場合、品質管理検査はヒトレオウイルスによる混入汚染に対して調べるべきである。発明者は、ＭＤＣＫ懸濁培養物中で継代を繰り返す過程で、レオウイルス量は５ログ以上増殖し、一方アデノウイルスなどのウイルス量は６から１０ログ減少するであろうと見積もっている。８ログ以上の単純ヘルペスウイルスの増殖が可能であることから、ＨＳＶ量も調べるべきである。同様に、培養１週間後に、ＰＩＶ−３では８ログの増殖が見られた。
【００５６】
（Ｖｅｒｏ細胞）
ＭＤＣＫ細胞での試験作業に続いて、Ｖｅｒｏ細胞における病原体の複製を調べた。Ｖｅｒｏ細胞は、ＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂなどのニューモウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、麻疹ウイルスなどのモルビリウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスなどのパラミクソウイルス、風疹ウイルス、ヒトおよびトリコロナウイルス、エンテロウイルス、エコーウイルスおよびコクサッキーウイルス、ブタＳＶＤＶ、およびテッシェンタルファンウイルスなどのピコルナウイルス、哺乳動物およびトリレオウイルス、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などのヘルペスウイルス、シミアンおよびヒトアデノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＪＣ、ＢＫ、およびＳＶ−４０などのポリオーマウイルス、ガンボロウイルスなどのビルナウイルス、ブタサーコウイルス、イヌパルボウイルス、およびＣｈｌａｍｙｄｉａなどの病原体の増殖を支える。
【００５７】
これらの病原体の中で、以下のものはニワトリ卵では増殖せず、従って、Ｖｅｒｏ細胞を基質として使用する場合の、インフルエンザワクチンの混入汚染に関する新たな危険物である。：ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトコロナウイルス、エンテロウイルス、レオウイルス、ＶＺＶ、ポリオーマウイルス、ブタピコルナウイルス、パルボウイルス、およびサーコウイルス。これらの病原体の内多数のものはＭＤＣＫ細胞では増殖せず、このことは、インフルエンザワクチンの生産にはＭＤＣＫ細胞がより安全な基質であることを示している。ＳＡＲＳコロナウイルスなどの新生ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞では増殖するがＭＤＣＫ細胞上では増殖しない。同様に、ＶＺＶは、Ｖｅｒｏ細胞では増殖するが、ニワトリ卵またはＭＤＣＫ細胞では増殖しない。不注意でこのコロナウイルスまたはＶＺＶが混入した、Ｖｅｒｏ由来のインフルエンザワクチンを接種すると、ＳＡＲＳおよび／または水痘の医原性大流行に繋がると考えられ、これは人々にとっても、またワクチンの風評という点でも大きな災難と考えられる。しかし、これらの危険性を同定することによって、適切な品質管理機構を整備し得る。
【００５８】
Ｖｅｒｏ細胞に加えて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞もアデノウイルスの増殖を支える［５９、６０］。既知のウイルス特性に基づくと、ＰＥＲ．Ｃ６細胞も、少なくともパラインフルエンザウイルスおよびレオウイルスの増殖を支えると予期し得る。
【００５９】
本発明は、例示のためだけに上記に記載されていること、本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら改変がなされ得ることが、理解される。
【００６０】
参考文献（その内容が、本明細書において参考として援用される）
【００６１】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において引用されるすべての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルスワクチンの生産および品質管理に関係する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ヒト用ワクチンを調製する際に使用するためのインフルエンザウイルスは、伝統的には胚含有トリ卵にて増殖させていたが、より新しい技術では、例えばＶｅｒｏ、ＭＤＣＫ、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株などの哺乳動物細胞培養物でウイルスを増殖させる。ウイルス増殖基質が変わったことによって、インフルエンザワクチンの安全性規制を再評価する機会が生じた。例えば、宿主細胞ＤＮＡへの混入汚染が細胞由来のワクチンに関する規制上の問題点となっているが（特許文献１）［１］、過去における、卵内で増殖させたワクチンでは、これは問題ではなかった。
従って、卵由来のインフルエンザワクチン周辺の安全性の問題は、より厳密な安全性の下にある細胞由来のワクチンに伴う、細胞培養物にて増殖したワクチン周辺のものとは異なる。本発明の目的は、こうした異なる安全性の問題に向けられており、特に細胞培養物にて増殖したインフルエンザワクチンの安全性を高めるための方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５９４８４１０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（本発明の開示）
本質的に、インフルエンザワクチン生産のために哺乳動物細胞基質を使用することは、ウイルスの増殖および複製に良く適した条件下で細胞を培養することが関係する。発明者は、こうした条件では、インフルエンザウイルス以外の病原体が細胞培養物内で増殖する危険性が増し、よって最終ワクチン製品の混入汚染の可能性に繋がると、理解した。混入汚染に関する試験は一般に、実施するのに難しいものではないが、製造者は最初にどんな試験を行うべきかを知る必要がある。発明者は具体的な混入汚染の危険物を特定し、その成果は、細胞培養物上で増殖したインフルエンザワクチンの安全性および品質を確保するための適切な試験を、製造過程で行うことができることを意味する。混入汚染物の一部は、最終ワクチン製品において無害である場合があるが、これらの存在は、インフルエンザウイルスの増殖およびその後の精製を妨げることが可能であり、そのため、これらを除去することが、品質および複製能に関する主要な問題となる。別の一部の混入汚染物は最終ワクチンにおいて有害となる可能性もあり、そのためこれらの除去は安全性上の大きな問題である。
【０００６】
ウイルス共培養から生じる混入汚染の危険性は先例がないわけではないが（例えば初期のバッチのポリオウイルスワクチンは、ポリオーマウイルスであるシミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）で汚染されていた。）、ヒト用インフルエンザワクチン生産のための細胞培養に伴う具体的な危険物を特定することに関する開示物はこれまでに存在していない。ワクチン生産のために使用されるウイルス株は毎年変わるため、新たな培養物を毎年確立しなければならず、細胞培養物上で増殖したインフルエンザウイルスには、特に混入汚染の危険性がある。特に、製造者のために種ウイルスを調製する過程で複数継代が行われ、これによって外来性の病原体が平行増殖する危険性が増すことから、生産物が毎年変わるということは毎年新たな混入汚染の危険性がもたらされることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、細胞培養物中でインフルエンザウイルスを増殖させるための条件では増殖し得るが、ニワトリ卵では増殖しない感染因子を特定した。これらの感染因子は、インフルエンザワクチンに対する、伝統的なインフルエンザワクチン関してこれまで問題となっていない新たな混入汚染リスクである。従って、本発明は、哺乳動物細胞株の培養物内で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これはワクチンおよび／または培養物を、上記細胞株内では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵では増殖しない感染因子の存在に関して試験する工程を含む。
【０００８】
また、発明者はインフルエンザワクチンを作製するために使用する一部の細胞基質では増殖するがこれ以外では増殖しない感染因子を特定した。これらの感染因子は、従って、一部のインフルエンザウイルスのみに対する混入汚染危険物である。すなわち本発明はまた、第１の哺乳動物細胞の培養物中で増殖したインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これは、上記第１細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子の存在に関して、そのワクチンおよび／または培養物を試験する工程を含む。
【０００９】
また、本発明は、哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これは、そのワクチンおよび／または培養物を処理して、その細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化する工程を含む。同様に、本発明は、第１の哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法を提供し、これは、そのワクチンおよび／または培養物を処理して、上記第１細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化する工程を含む。除去および／または不活化の後、例えば感染因子が除去・不活化されたことを確認するために、感染因子の存在に関してワクチン・培養物を試験する場合がある。
【００１０】
また本発明は、本発明の方法によって得たインフルエンザワクチンを提供する。また本発明は、本発明の方法によって得ることが可能なインフルエンザワクチンを提供する。
【００１１】
また本発明は、哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザワクチンを提供し、ここで、このワクチンは、上記細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子が存在しない状態にあることが確認されている。同様に、本発明は、第１の哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザワクチンを提供し、ここで、このワクチンは、上記第１細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子が存在しない状態にあることが確認されている。
【００１２】
また本発明は、哺乳動物レオウイルスがＲＴ−ＰＣＲによって検出不能であるインフルエンザワクチンを提供する（例えばＬ１．ｒｖ５、Ｌ１．ｒｖ６、Ｌ１．ｒｖ７、およびＬ１．ｒｖ８プライマーを教示されているように使用する、文献１６にて開示されているＬ１ベースのＲＴ−ＰＣＲを用いる。）卵で増殖していないので、このワクチンには卵白アルブミンおよびニワトリＤＮＡが存在しないこととなる。
【００１３】
（哺乳動物細胞株）
本発明のインフルエンザワクチンは、胚含有卵にて増殖させるのではなく、哺乳動物細胞株にて増殖させる。生物製剤の作製に使用される典型的な哺乳動物細胞系には、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＭＣＲ−５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ−３８などが含まれる。インフルエンザウイルスを増殖させるのに好ましい哺乳動物細胞株には、メイディン・ダービーイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２−５］、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［６−８］、またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［９］が含まれる。
【００１４】
これらの細胞株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）収集物［１０］、またはＣｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［１１］などから、幅広く入手可能である。例えばＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７として様々な種類のＶｅｒｏ細胞を提供しており、さらにカタログ番号ＣＣＬ−３４としてＭＤＣＫ細胞を提供している。
【００１５】
哺乳動物細胞株での増殖物に由来する物質のために有用であるばかりでなく、本発明は、例えばニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）などニワトリに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば参考文献１２と１３。］に由来する材料にまで拡大し得る。
【００１６】
（胚含有ニワトリ卵にて増殖しない感染因子）
発明者は、ワクチン生産のためのインフルエンザウイルスを調製するために使用される哺乳動物細胞株（特にＭＤＣＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞の双方。）にて増殖し得るがニワトリ卵では増殖しない様々な病原体を同定した。これらの病原体による混入汚染の試験は伝統的な卵基質で調製されるワクチンには必要ないが、発明者は、ワクチンの品質管理には、最高の安全基準を確保するために、１つ以上のこれら病原体に関する試験を含めるべきであると理解している。この病原体は以下のものである。：
・ＲＳウイルス（ＲＳＶ）を含むＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属などのニューモウイルス亜科。
・麻疹ウイルスなど、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属。
・コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびエンテロウイルスなど、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属。但し、一部のコクサッキーウイルス（例えばＢ３、Ｂ４）は、ＭＤＣＫ細胞内では増殖しないことが認められている。
・哺乳動物レオウイルス科、特にオルトレオウイルス（例えば哺乳動物レオウイルス類）およびロタウイルス。レオウイルスは、ＶｅｒｏおよびＭＤＣＫ細胞にて非制限的な増殖を示すことができるので、これらに関する試験は特に重要である。ロタウイルスは、インフルエンザウイルスと同じ、細胞培養物中で増殖するためのプロテアーゼ要求性を持っており、この平行性のために混入するロタウイルスの活性化が、気づくことなく導かれる可能性が考えられる。
【００１７】
これらの病原体に異なる宿主を持つ異なる株が含まれる場合（例えばヒトＲＳＶとウシＲＳＶなど）、試験は典型的にはヒトに感染し得る株に関係するものとなる。
【００１８】
逆遺伝学の方法の過程で、ウイルス生産のための種ウイルスは哺乳動物細胞培養物中にて複数過程の処理を受け、よって外来性の感染因子による混入汚染の危険性が増すことから、これらの因子に関する試験は、逆遺伝学の手法によってできたウイルス株に対して、特に重要である。
【００１９】
（卵では増殖しないが、様々な哺乳動物細胞株で増殖する感染因子）
発明者は、ニワトリ卵では増殖せず、ＭＤＣＫ細胞で増殖しないがＶｅｒｏ細胞にて増殖する様々な種類の病原体を同定した。これらの病原体による混入汚染に対する試験は伝統的な卵基質で調製されるワクチンには必要なく、ＭＤＣＫ細胞で調製されるワクチンにも必要ないが、Ｖｅｒｏ細胞で増殖させたワクチンの品質管理には、最高の安全基準を確保するためにこれら病原体の１つ以上のものに関する試験を含めるべきであると認識した。この病原体には以下ものがある。：
・ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）など、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属類。
・Ｖｅｒｏにてよく増殖する流行性耳下腺炎ウイルスなど、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属。
・風疹ウイルスなどのトガウイルス科。
・ＳＡＲＳコロナウイルスおよび他のヒトコロナウイルスなどのコロナウイルス科。非制限的な増殖を示すＳＡＲＳウイルスと共に、これらのウイルスはＶｅｒｏ細胞にて高い増殖性を示し、これらのものに関する試験は特に重要である。
・Ｍ型リノウイルスなど、ピコルナウイルス科のライノウイルス属。
・２型ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ３）とも呼ばれるＶａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒウイルス（ＶＺＶ）。ＶＺＶはＶｅｒｏ細胞にて非制限的な増殖を示すことができ、これに関する試験は特に重要である。
・ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、およびＪＣポリオーマウイルスなどのポリオーマウイルス科。これらのポリオーマウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞（特にＢＫ細胞）にて非制限的な増殖を示すことができ、これらに関する試験は特に重要である。
・ブタサーコウイルス。
・ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）およびテッシェンタルファンウイルスなどのブタピコルナウイルス。
・Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉなどのクラミジア属細菌。これらの細菌はＶｅｒｏ細胞にて増殖する場合があり、これらに関する試験は特に重要である。
・イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）またはブタパルボウイルスなどのパルボウイルス属。
【００２０】
これらの病原体に異なる宿主（例えばヒトＲＳＶとウシＲＳＶなど。）を持つ異なる株が存在する場合、試験は、典型的にはヒトに感染し得る株に関係することとなる。
【００２１】
非ヒトウイルス（例えば鳥類およびブタウイルス）に関する試験は、例えば、最初に株がブタまたはトリから単離されていた場合、または１次増殖の過程で卵を使用した場合、もしくは細胞培養物にブタトリプシンを使用した場合など、ウイルスの調製に鳥類またはブタの材料が使用される場合にのみ、主に問題となる。
【００２２】
（卵および哺乳動物細胞株にて増殖する感染因子）
また、発明者は、上記のものとは対照的に、哺乳動物細胞株とニワトリ卵の双方にて増殖する病原体を同定した。本発明の工程には当該病原体に関する試験の方法が含まれるが、この方法は、ニワトリ卵にて増殖させたウイルスの品質管理強化の一部となる可能性も考えられる。これらの病原体には以下が含まれる。：
・ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、およびＰＩＶ−３を含む、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ
ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅの一員であるパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）。
・１型単純ヘルペスウイルスおよび２型単純ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルス科。
・ヒトおよびシミアンアデノウイルスを含む、アデノウイルスなどのアデノウイルス科。・マイコプラズマ属。
・トリサーコウイルス。
・哺乳動物細胞株にて増殖し得るトリレオウイルスなどのトリレオウイルス科。特にオルトレオウイルス。
【００２３】
また、発明者は、ニワトリ卵およびＶｅｒｏ細胞では増殖するが、ＭＤＣＫ細胞では増殖しないようである病原体を同定した。本発明の方法は、当該病原体に関する試験を行う方法を含む場合があるが、この方法はニワトリ卵にて増殖させたウイルスの品質管理強化の一部となる可能性も考えられ、またこの方法はＭＤＣＫ基質を使用する場合には必要ではない。これらの病原体には、以下が含まれる。：
・伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ガンボロウイルスとも呼ばれる。）などのビルナウイルス科。
【００２４】
卵と細胞株の双方で増殖する病原体に関する試験は、例えばウイルス生産のための種ウイルスなど、卵内で複数の処理を通過した後に派生するウイルス株にとって、重要である。
【００２５】
これらの病原体は卵内で増殖することから、続いて、卵上で増殖したウイルスから調製されたウイルスに対しても、その存在の有無に関する試験を用いることができる。従って、本発明は、細胞培養物にて増殖したワクチンに限るものではなく、これはまた、「伝統的な」卵ベースのワクチンに対しても用いることができる。
【００２６】
（試験方法）
細胞培養物および生物医薬品内の病原体の存在を検出するための方法は、日常的に利用可能である。一般に方法は、免疫化学的検出（イムノアッセイ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなど。）および／または核酸検出（サザンブロット、スロットブロット、ＰＣＲなどのハイブリダイズ法。）に頼ることとなる。または、従来の細胞培養物接種によって病原体の存在に関する試験を行うことが可能である（従って、適当な条件下で培養された時に、その材料が混入する病原菌の産生を導くものであるか否かの試験。）。
【００２７】
方法は、１種の病原菌（例えば１種のウイルス）を検出する、または複数種の病原体（例えば複数種のウイルス）を検出する場合がある。試験によって複数種の病原体（例えば「Ｘ」、「Ｙ」、または「Ｚ」。）が検出された場合、具体的な結果（例えばウイルス「Ｙ」が存在する。）が得られる、または全般的な結果（例えば「Ｘ」、「Ｙ」、または「Ｚ」のうちの１種が存在する。）が得られる場合がある。方法は、定量的、準定量的、または定性的である場合がある。リアルタイム検出法が用いられる場合がある。
【００２８】
対象とする病原菌（例えばウイルス）を検出するための一般的な指針は、文献１４にて確認し得る。多数のより具体的なアッセイを、以下の文章にて提供し、技術者は、任意の選択された病原菌の存在を検出するためのアッセイを、容易に見つける、または準備し得る。
【００２９】
文献１５は、１回の試験で、主にエンテロウイルス、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、１型および３型パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの９つの呼吸器菅病原体を検出するための、多重逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを開示しており、これは「ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ」と呼ばれている。哺乳動物レオウイルスを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法は、文献１６にて開示されている。文献１７は、既知の遺伝系列からヒトメタニューモウイルスを検出するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。文献１８は、ヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）、１型、２型、および３型ヒトパラインフルエンザウイルス、およびＡ型およびＢ型インフルエンザを検出するための単回ＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。文献１９は、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、およびパルボウイルスＢ１９を検出および鑑別するための多重ＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。ヒトリノウイルスを、ピコルナウイルス科の他のウイルスと正確に識別して検出するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが、文献２０に開示されている。文献２１は、ヒトパラインフルエンザウイルス赤血球凝集素の保存された領域、ヒトコロナウイルスのスパイクタンパク質、およびヒトエンテロウイルスおよびリノウイルスのポリタンパク質遺伝子に標的化させた入れ子状のプライマーセットを用いる多重ＲＴ‐ＰＣＲアッセイを開示しており、これによって、４種類のパラインフルエンザウイルス（１、２、３、４ＡＢ）、ヒトコロナウイルス２２９ＥおよびＯＣ４３の迅速で感受性の高い同時検出および分類、およびエンテロウイルスおよびリノウイルスの一般検出が可能となる。ＲＴ−ＰＣＲによるＳＶＤＶ検出が、文献２２に開示されている。ＳＡＲＳコロナウイルスに対する１段間定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイが、文献２３に開示されている。文献２４は、ＶＺＶに関するＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを開示している。仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、およびサーコウイルスの迅速な同時検出のための多重ＰＣＲアッセイが、文献２５にて開示されている。ＳＶ−４０ポリオーマウイルス検出に関するリアルタイムＦＲＥＴプローブＰＣＲアッセイが、文献２６に記載されている。文献２７は、迅速で感受性の高いＰＣＲ−ＥＬＡＨＡ法による、ヒトポリオーマウイルスＪＣおよびＢＫの同時検出および鑑別のためのアッセイを開示している。ＰＣＲおよび間接免疫蛍光アッセイによる、ヒト細胞株におけるブタサーコウイルスの検出が、文献２８に開示されている。ビルナウイルス検出のためのＰＣＲ法が、文献２９および３０にて開示されている。
【００３０】
本発明の検出方法は、種ウイルスおよび／または細胞基質および／または培養培地の段階から、ウイルス感染および増殖段階、ウイルス回収、任意のウイルス処理（例えば、スプリット、および／または、表面タンパク質の抽出など。）、ワクチンの処方を通じて、ワクチンパッケージングまで、ワクチン製造の過程の任意の段階で実施される場合がある。従って、本発明に従って用いられるアッセイは、ウイルス培養物を創出するのに使用する物質に関して、ウイルス培養物自体に関して、およびウイルス培養物から抽出した物質およびこれに派生する物質に関して、実行し得る。このアッセイは、ワクチンまたは培養物１つずつについて行う必要はないが、通常の品質管理の一部として、適切な間隔で用いることができる。規制当局が毎年新ためて推奨する株のためにワクチン生産が変更される場合、新たな培養物を確立して新たな品質管理を受けることが必要とされる段階で、これは特に有用である。本発明のアッセイは、ワクチン製造のために使用される種ウイルスについて行うと有益である。
【００３１】
本発明の方法では、インフルエンザウイルスを増殖させるのに使用する細胞株は、例えば無血清培地、無タンパク質培地など、任意の適切な培地にて培養される場合がある。インフルエンザウイルスの無血清培養に関する方法は文献２にて開示されており、無タンパク質培養に関する方法は、参考文献および／または無タンパク質３１にて開示されている。しかし、「無タンパク質」培地は、インフルエンザの増殖に必要な場合のある１つ以上のプロテアーゼ（例えばトリプシン）を含む場合がある。無血清培地は、血清添加物を含む場合がある。
【００３２】
ウシ由来の物質を添加しない培地でワクチンが増殖していれば、それは好ましく、これによってその培養物が任意の可能性のあるＢＳＥ混入物およびウシウイルスを含有しないことが確保される。任意の伝染性海綿状脳症に関係する成分を含有しない培地が、好ましい。
【００３３】
（インフルエンザワクチン）
本発明は、インフルエンザワクチンの品質管理に関係する。このワクチンは、生きたウイルスまたは、好ましくは不活化ウイルスの形態にある場合がある。ウイルスの不活化には、典型的には、ホルマリンまたはβ‐プロピオラクトンなど化学薬品での処理が含まれる。不活化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、ウイルス全体、スプリットウイルス（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｕｓ）、または、ウイルスサブユニットであり得る。スプリットウイルスは、ビリオンを界面活性剤（例えばエチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、リン酸トリ‐Ｎ‐ブチル、トリトンＸ‐１００、トリトンＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウムなど。）で処理し、準ウイルス粒子を作製することによって得られる。サブユニットワクチンは、共にインフルエンザ表面抗原である赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む。またインフルエンザ抗原は、ビロソームの形態にて提供されることが可能である［３２］。
【００３４】
本発明のインフルエンザワクチンは、任意の適切なウイルス株（１種または複数種）に基づくものであることができる。ワクチンは、典型的には、Ａ型インフルエンザの少なくとも１系統、および／またはＢ型インフルエンザの少なくとも１系統に由来する抗原を含む。ワクチンに関して推奨されるウイルス型は、シーズンごとに変化する。現在の間流行期において、ワクチンは、典型的には、２種のＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）と１種のＢ型インフルエンザ株とが含まれており、３価のワクチンが好まれている。また、本発明は、Ｈ５株またはＨ７株などの汎発株に由来するウイルスを調製するのに適切であり、これらのウイルス株に対してヒト集団は免疫学的にナイーブである。流行期のワクチンは、１価である場合がある、または汎発株を加えた通常の３価ワクチンを基礎とする場合がある。
【００３５】
本発明の方法にて使用されるインフルエンザウイルス（１種または複数種）は、リアソータント株である場合がある、および／または逆遺伝学の技術によって得られたものである場合がある。ウイルスは弱毒化されている場合がある。ウイルスは温度感受性である場合がある。ウイルスは冷順応されている場合がある。
【００３６】
ワクチンが１種よりも多くのインフルエンザ株を含む場合、典型的には、別種の株を別々に増殖させ、ウイルスを回収して抗原を調製した後に混合する。従って、本発明の方法は、１種以上のインフルエンザ株に由来する抗原を混合する方法を含む場合がある。病原体に対する試験は、当該混合の前、または後に行われる場合がある。
【００３７】
ワクチンは、典型的には、注射（例えば皮下注射または筋肉内注射）によって患者に投与するために調製されるであろうが、例えば経鼻［３３−３５］、経口［３６］、皮膚内［３７、３８］経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［３９］など、他の投与経路がインフルエンザウイルスに関して周知されている
本発明に従って調製されるワクチンは、小児と成人の双方を治療するために使用される場合がある。インフルエンザワクチンは、現在、生後６ヶ月から、小児および成人の予防接種に使用するよう推奨されている。特に、免疫学的にナイーブである対象者が短期間に２回のワクチン接種を受けるように（例えば１ヶ月または２ヶ月の間隔で。）、安全性の問題は小児の予防接種に関して最も深刻である。
【００３８】
本発明のワクチンは、アジュバントを含有する場合がある。インフルエンザワクチンに使用されているアジュバントには、アルミニウム塩［４０、４１］、キトサン［４２］、ＣｐＧ ７９０９などのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド［４３］、ＭＦ ５９などの水中油型乳剤［４４］、水中油中水型乳剤［４５］、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素［３４、４６］およびこれらの無毒化変異物［４７−４８］、モノホスホリルリピッドＡ［４９］およびこれの３−ｏ−脱アシル化誘導体［５０］、百日咳毒素変異物［５１］、ムラミルジペプチド［５２］などが含まれる。
【００３９】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザ不活化ワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン投与量は、典型的には一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）法によって測定されるＨＡレベルを照会して標準化される。ワクチンは、典型的には、１株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば小児に対して、または流行状態などでは、これよりも少ない投与量でも用いられる。１／２（例えば１株当たり７．５μのＨＡ）、１／４、１／８など、分数量も用いられている［４０、５３］。従って、ワクチンは、インフルエンザ１株当たり１から２０μｇの間のＨＡを含有し、例えば約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９などであることが好ましい。
【００４０】
このワクチンは、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含有する場合がある。しかしながら、ワクチンは、例えばチオメルサールを含まないなど、水銀物質を実質的に含むべきでないこと（すなわち、５μ／ｍｌ未満など。）が好ましい［５４、５５］。水銀を含有しないワクチンがより好ましい。
【００４１】
本発明のワクチンは、１回投与量当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残余宿主細胞ＤＮＡを含有することが好ましいが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在する場合がある。例えばクロマトグラフィーなどの標準精製方法を用いて、ワクチン調製の過程で混入したＤＮＡを除去し得る。残余宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えばベンゾナーゼＴＭ ＤＮアーゼを用いるなど、ヌクレアーゼ処理によって強化し得る［１］。１５μｇの赤血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましく、同様に、ワクチンは、０．２５ｍｌ量当たり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有することが好ましい。５０μｇの赤血球凝集素につき＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンがより好ましく、同様に、０．５ｍｌ量当たり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましい。
【００４２】
このワクチンのこれら様々な特徴は、本発明の工程に適切な方法を包含させることによって達成される場合がある。従って、具体的な工程としては、以下が挙げられる：不活化させる工程；３つのウイルス株を混合して、３価のワクチンを作る工程；注射用にワクチンを処方する工程；このワクチンを患者に投与する工程；このワクチンをアジュバントと組み合わせる工程；ＨＡ量を測定する工程；例えば稀釈などによってＨＡ量を調整する工程；保存剤を添加する工程；残余宿主細胞核酸を除去する工程、など。
【００４３】
（試験するための好ましい外来作用因子）
インフルエンザウイルスの一次臨床分離物内に、呼吸器系試料にて見つかる外来作用因子（特に、ウイルス）が存在する可能性がより高いため、本発明の好ましい実施様態は、呼吸器系試料にて見つかる外来作用因子、特にウイルスを含む。呼吸器病原体には、ＲＳＶ、ＰＩＶ−３、ＳＡＲＳ、コロナウイルス、アデノウイルス、リノウイルス、レオウイルス（「呼吸器腸病原性オーファンウイルス」）などが含まれる。単純ヘルペスウイルスも呼吸器系試料にて見つかることが可能である。
【００４４】
本発明を用いる対象とする特に好ましい病原体は、レオウイルス（特に哺乳動物レオウイルス）、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、およびパルボウイルスである。また、単純ヘルペスウイルスに対する試験も好ましい。
【００４５】
ワクチンを界面活性剤で処理した場合（例えばスプリットウイルスワクチンまたはサブユニットワクチンなど。）、混入ウイルスをも分断することもし得ることから、この処理段階によってさらなる安全性が得られる。しかし、混入物が外被で覆われていない場合、界面活性剤処理はワクチンに対して通常何ら影響しないこととなるため、この処理自体は安全性を改善しない。従って、以下の病原体に対する試験は、これらが外被に覆われていないため、特に重要である。：ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、パルボウイルス科、サーコウイルス科、アデノウイルス科、ポリオーマウイルス科。
【００４６】
Ｖｅｒｏ細胞基質を使用する場合、Ｖｅｒｏ細胞における高増殖性と組み合わさったこれらのウイルスの界面活性剤耐性は、ヒトエンテロウイルス、哺乳動物レオウイルス科、アデノウイルス科、およびポリオーマウイルス科に対する試験が特に重要であることを意味する。哺乳動物レオウイルス科はＭＤＣＫ細胞でも高量増殖する。また、これらのウイルスは、不活化に対する耐性が最も大きいものの一つである。
【００４７】
以下のことから、哺乳動物レオウイルス科の存在に関する試験は、本発明の好ましい一実施様態である。：（ａ）このウイルスはニワトリ卵では簡単に増殖しないため、これらのウイルスに対する試験は伝統的なインフルエンザウイルス製造の一部分ではなかった。（ｂ）このウイルスは、ＭＤＣＫおよびＶｅｒｏ細胞株の双方にて、非制限的な増殖を示すことができる。（ｃ）このウイルスは不活化に対して高い耐性を持ち、ワクチン加工の過程で継続的に安定している。（ｄ）このウイルスは、外被で覆われていないため、インフルエンザウイルスを界面活性剤処理しても残存し得る。（ｅ）このウイルスは呼吸器感染症に関係するため、一次ウイルス分離物に混入することが考えられる。ウイルスを調製する過程で鳥類の物質が使用されている場合、トリレオウイルス科に対する試験も重要であり、先に列挙した判断基準（ｂ）から（ｅ）は、等しくトリレオウイルス科に適用される
（他の生物学的事項）
インフルエンザワクチンの試験に有用であることに加え、本発明は、例えば抗体［５６］、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、受容体、ホルモン、ワクチン抗原、診断抗原などの組換えタンパク質など、他の生物学的事項にも用いることができる。
【００４８】
（一般事項）
用語「含む、包含する」とは、「含む」および「からなる」を包含する。例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘのみからなってもよいし、または（例えばＸ＋Ｙなどの）何か追加となるものを含んでもよい。
【００４９】
数値Ｘに関係する「約」という語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００５０】
「実質的に」という語は、「完全に」を除くものではない。例えば「実質的に」Ｙ「を含まない」ある組成物は、完全にＹを含まない場合がある。必要な場合、「実質的に」という語が、本発明の定義から省略される場合がある。
【００５１】
ウイルス株、増殖のための細胞株、投与量、組み合わせ、組成などを含む、インフルエンザワクチンに関するさらに全般的な情報は、文献５７の第１７および１８章にて確認し得る。ウイルス増殖過程でのウイルスライフサイクルの詳細などインフルエンザウイルスに関する詳細は、文献１４の第４６章にて確認し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子の存在に関して試験する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
哺乳動物細胞株の培養物中で増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化するために処理する工程、
を包含する、方法。
（項目３）
前記哺乳動物細胞株が、ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株である、項目１または項目２の方法。
（項目４）
前記感染因子が、ニューモウイルス亜科、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属、哺乳動物レオウイルス科、およびビルナウイルス科からなる群より選択される、項目１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記感染因子が、ＲＳウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記哺乳動物細胞株が、Ｖｅｒｏ細胞株であり、前記感染因子が、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、トガウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオーマウイルス科、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、クラミジア属細菌、およびパルボウイルス属からなる群より選択される、項目１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記感染因子が、ヒトメタニューモウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ライノウイルスＭ株、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタ水疱病ウイルス、テッシェンタルファンウイルス、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ、イヌパルボウイルス、およびブタパルボウイルスからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ワクチンおよび／または前記培養物を、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、マイコプラズマ属、トリサーコウイルス、およびトリレオウイルス科からなる群より選択される病原体の存在に関して試験する工程；
をさらに包含する、項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
第１の哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該第１の細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子の存在に関して試験する工程；
を包含する、方法。
（項目１０）
第１の哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、該第１の細胞株中では増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子を除去および／または不活化するために処理する工程；
を包含する、方法。
（項目１１）
（ａ）前記第１の哺乳動物細胞株が、ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株からなる群より選択され、（ｂ）前記第２の哺乳動物細胞株が、ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株からなる群より選択され、（ｃ）該第１の哺乳動物細胞株と該第２の哺乳動物細胞株とは異なる、項目９または項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第１の哺乳動物細胞株が、Ｖｅｒｏ細胞株であり、前記感染因子が、パラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属、トガウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科のライノウイルス属、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオーマウイルス科、ブタサーコウイルス、ブタピコルナウイルス、クラミジア属細菌、パルボウイルス属、およびビルナウイルス科からなる群より選択される、項目９〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記感染因子が、ヒトメタニューモウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ライノウイルスＭ株、ＳＶ−４０ポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ブタ水疱病ウイルス、テッシェンタルファンウイルス、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃi、イヌパルボウイルス、ブタパルボウイルス、および伝染性ファブリキウス嚢病ウ
イルスからなる群より選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ワクチンおよび／または前記培養物が、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、マイコプラズマ属、トリサーコウイルス、およびトリレオウイルス科からなる群より選択される病原体の存在に関して試験される工程；
をさらに包含する、項目９〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記除去および／または不活化の後に、前記ワクチンおよび／または前記培養物を、前記感染因子の存在に関して試験する工程；
をさらに包含する、項目２または項目１０に記載の方法。
（項目１６）
哺乳動物細胞株の培養物中またはニワトリ卵中にて増殖させたインフルエンザウイルスからインフルエンザワクチンを調製するための方法であって、
該ワクチンおよび／または該培養物を、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、マイコプラズマ属、トリサーコウイルス、トリレオウイルス科、ビルナウイルス科からなる群より選択される病原体の存在に関して試験する工程；
を包含する、方法。
（項目１７）
前記病原体が、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−３、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ヒトアデノウイルス、シミアンアデノウイルス、オルトレオウイルス、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記培養物を、免疫化学的検出および／または核酸検出によって試験する、項目１〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記検出が、ＥＬＩＳＡおよび／またはＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）によるものである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザワクチンであって、該細胞株中では増殖し得るが胚含有ニワトリ卵中では増殖しない感染因子が存在しないことが確認されている、インフルエンザワクチン。
（項目２１）
第１の哺乳動物細胞株の培養物中にて増殖させたインフルエンザワクチンであって、該第１細胞株中で増殖し得るが第２の哺乳動物細胞株中では増殖しない感染因子が存在しないことが確認されている、インフルエンザワクチン。
（項目２２）
ＭＤＣＫ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞株の培養物中で増殖された、項目１８または項目１９に記載のワクチン。
（項目２３）
哺乳動物レオウイルスがＲＴ−ＰＣＲによって検出不能である、インフルエンザワクチン。
（項目２４）
卵白アルブミンおよびニワトリＤＮＡを含まない、項目２３に記載のワクチン。
（項目２５）
項目１〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法によって得られるかまたは得ることが可能である、インフルエンザワクチン。
（項目２６）
生ウイルスワクチンである、項目２０〜２５のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２７）
不活化ウイルスワクチンである、項目２０〜２５のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目２８）
ウイルス完全体ワクチン、スプリットウイルスワクチン、またはウイルスサブユニットワクチンである、項目２７に記載のワクチン。
（項目２９）
３価インフルエンザワクチンである、項目２０〜２８のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３０）
汎流行性インフルエンザウイルス株を含む、項目２０〜２９のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３１）
インフルエンザウイルスＨ５株またはＨ７株を含む、項目３０に記載のワクチン。
（項目３２）
注入、鼻内経路、経口経路、皮内経路、経皮経路または経皮的経路によって患者に投与するための、項目２０〜３１のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３３）
小児免疫用である、項目２０〜３２のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３４）
１株当たり１〜２０μｇのインフルエンザウイルス赤血球凝集素を含む、項目２０〜３３のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
（項目３５）
アジュバントを含む、項目２０〜３４のうちのいずれか１項に記載のワクチン。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
（本発明を実施するための様式）
（ＭＤＣＫ細胞）
発明者は、ワクチン調製のために血清を含まない培地中のＭＤＣＫ細胞でインフルエンザウイルスを増殖させる経験を有している。彼らは、この細胞が他の病原体にも適切な宿主であることを理解し、他の様々な病原体が同じ条件で増殖する能力を試験した（文献２にて記載されているように、特にＭＤＣＫ ３３０１６培養物、ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９として寄託、血清を含まない培地中で。）。
【００５３】
活性ウイルスの複製またはＭＤＣＫ細胞における増殖に関する試験を行った時、ＲＳウイルスＲＳＶ−Ａ２およびＲＳＶ−Ｂに対する試験は陰性であった。パラインフルエンザＰＩ−３株およびＳＶ−５株は検出された。ヒトコロナウイルス２２９ＥおよびＳＡＲＳに対する試験は陰性であり、ポリオウイルス１型、エコーウイルス６型、コクサッキーウイルスＡ１６、およびコクサッキーウイルスＢ３に対する試験も同様であった。Ｉｂ型、３７およびＮＬ．９５０１８４１ライノウイルス試験は陰性であった。レオウイルスＲｅｏ ３に対する試験は陽性であり、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１に対する試験も同様であった。ヒトアデノウイルス１型、５型、および６型に対する試験は陰性であった。ＳＶ−４０の試験は陰性であり、接種力価は１４日間安定していた。イヌパルボウイルスおよびマウス微小ウイルス試験は陰性であり、ラウス肉腫ウイルスも同様であった。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ試験は陰性であった。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ試験は陰性であったが、感染後３〜５日の間、非常に低量の増殖は排除できなかった。
【００５４】
さらに研究によって、ＭＤＣＫ細胞は、水疱性口内炎ウイルス（インディアナ）、ワクシニアウイルス、コクサッキーウイルスＢ５、レオウイルス２型、ヒトアデノウイルス４型および５型、ブタ水疱性発疹ウイルス、および伝染性イヌ肝炎ウイルスの増殖を支えることが可能なことが示された［５８］。
【００５５】
ＭＤＣＫ細胞で増殖することが可能であるウイルスの中で、パラインフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノウイルスは胚含有ニワトリ卵でも増殖し得る。対照的に、ヒトレオウイルス（および他の哺乳動物レオウイルス）は、卵では容易に増殖しない。故に、インフルエンザウイルス生産のための細胞培養系としてＭＤＣＫ細胞を使用する場合、品質管理検査はヒトレオウイルスによる混入汚染に対して調べるべきである。発明者は、ＭＤＣＫ懸濁培養物中で継代を繰り返す過程で、レオウイルス量は５ログ以上増殖し、一方アデノウイルスなどのウイルス量は６から１０ログ減少するであろうと見積もっている。８ログ以上の単純ヘルペスウイルスの増殖が可能であることから、ＨＳＶ量も調べるべきである。同様に、培養１週間後に、ＰＩＶ−３では８ログの増殖が見られた。
【００５６】
（Ｖｅｒｏ細胞）
ＭＤＣＫ細胞での試験作業に続いて、Ｖｅｒｏ細胞における病原体の複製を調べた。Ｖｅｒｏ細胞は、ＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂなどのニューモウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、麻疹ウイルスなどのモルビリウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスなどのパラミクソウイルス、風疹ウイルス、ヒトおよびトリコロナウイルス、エンテロウイルス、エコーウイルスおよびコクサッキーウイルス、ブタＳＶＤＶ、およびテッシェンタルファンウイルスなどのピコルナウイルス、哺乳動物およびトリレオウイルス、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などのヘルペスウイルス、シミアンおよびヒトアデノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ＪＣ、ＢＫ、およびＳＶ−４０などのポリオーマウイルス、ガンボロウイルスなどのビルナウイルス、ブタサーコウイルス、イヌパルボウイルス、およびＣｈｌａｍｙｄｉａなどの病原体の増殖を支える。
【００５７】
これらの病原体の中で、以下のものはニワトリ卵では増殖せず、従って、Ｖｅｒｏ細胞を基質として使用する場合の、インフルエンザワクチンの混入汚染に関する新たな危険物である。：ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトコロナウイルス、エンテロウイルス、レオウイルス、ＶＺＶ、ポリオーマウイルス、ブタピコルナウイルス、パルボウイルス、およびサーコウイルス。これらの病原体の内多数のものはＭＤＣＫ細胞では増殖せず、このことは、インフルエンザワクチンの生産にはＭＤＣＫ細胞がより安全な基質であることを示している。ＳＡＲＳコロナウイルスなどの新生ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞では増殖するがＭＤＣＫ細胞上では増殖しない。同様に、ＶＺＶは、Ｖｅｒｏ細胞では増殖するが、ニワトリ卵またはＭＤＣＫ細胞では増殖しない。不注意でこのコロナウイルスまたはＶＺＶが混入した、Ｖｅｒｏ由来のインフルエンザワクチンを接種すると、ＳＡＲＳおよび／または水痘の医原性大流行に繋がると考えられ、これは人々にとっても、またワクチンの風評という点でも大きな災難と考えられる。しかし、これらの危険性を同定することによって、適切な品質管理機構を整備し得る。
【００５８】
Ｖｅｒｏ細胞に加えて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞もアデノウイルスの増殖を支える［５９、６０］。既知のウイルス特性に基づくと、ＰＥＲ．Ｃ６細胞も、少なくともパラインフルエンザウイルスおよびレオウイルスの増殖を支えると予期し得る。
【００５９】
本発明は、例示のためだけに上記に記載されていること、本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら改変がなされ得ることが、理解される。
【００６０】
参考文献（その内容が、本明細書において参考として援用される）
【００６１】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【公開番号】特開２０１３−１００３５８（Ｐ２０１３−１００３５８Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１３−３０６２４（Ｐ２０１３−３０６２４）
【出願日】平成２５年２月２０日（２０１３．２．２０）
【分割の表示】特願２０１１−２４４９０４（Ｐ２０１１−２４４９０４）の分割
【原出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５９７１２５９５５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−３０６２４（Ｐ２０１３−３０６２４）
【出願日】平成２５年２月２０日（２０１３．２．２０）
【分割の表示】特願２０１１−２４４９０４（Ｐ２０１１−２４４９０４）の分割
【原出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５９７１２５９５５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー (17)
【Ｆターム（参考）】
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