インフルエンザ核酸分子及びそれから作製したワクチン
本発明は、ＨＡ赤血球凝集素の新規なコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸配列、並びにその配列を発現する遺伝子コンストラクト／ベクター及びワクチンを提供する。また、提供されるワクチンを用いて１又は複数のインフルエンザＡ血清型に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、以下からなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する：配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたインフルエンザウイルスワクチン、インフルエンザに対する免疫応答を惹起する改良された方法、ワクチン接種を受けたインフルエンザ哺乳動物宿主対感染したインフルエンザ哺乳動物宿主を診断するため並びにインフルエンザに対して個体を予防的及び／又は治療的に免疫化するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスにより引き起こされる感染症である。インフルエンザウイルスは、トリ及び哺乳動物に感染する。オルトミクソウイルス科の５つの属のうちの３つがインフルエンザウイルスである：インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びインフルエンザＣ。これらのうち、インフルエンザＡが最も一般的である。
【０００３】
インフルエンザは通常、咳又はくしゃみにより生じたエアロゾル中の空気を介して及びウイルスを含む体液又は汚染された表面との直接接触により伝染する。インフルエンザの季節的流行は世界中で発生し、１年に数十万人が死亡する。年によっては、パンデミックが起こり、数百万人が死亡する。更に、家畜（特に家禽類及びブタ）も、年に一度の流行及び時々起こるパンデミックを受けやすく、多数の動物が死に、大きな金銭的損失が生じる。
【０００４】
インフルエンザウイルスは構造的に似ており、同様な分子成分で構成される約８０〜１２０ｎｍのほぼ球状又は繊維状のウイルス粒子を有する。ウイルスタンパク質及びウイルスＲＮＡを含む中心コアは、ウイルス粒子が産生される細胞に由来する１つの脂質コート及び２つの異なる糖タンパク質で構成されるウイルスエンベロープに囲まれている。ウイルスエンベロープ内には更に２つの異なる糖タンパク質が固定されており、これらは表面上で外側に向かって突出した部分を含む。
【０００５】
インフルエンザウイルスＲＮＡゲノムは通常、８個の異なる一本鎖マイナス鎖ＲＮＡセグメントとして与えられ、これらが１１個のタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２）をコードするゲノムの１１個のウイルス遺伝子を構成している。８個のＲＮＡセグメントは以下の通りである：１）赤血球凝集素をコードするＨＡ（１個のビリオンを作るのに約５００分子の赤血球凝集素が必要）；２）ノイラミニダーゼをコードするＮＡ（１個のビリオンを作るのに約１００分子のノイラミニダーゼが必要）；３）核タンパク質をコードするＮＰ；４）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いて２個のマトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）をコードするＭ（１個のビリオンを作るのに約３０００個のマトリックスタンパク質分子が必要）；５）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いて２個の別個の非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＥＰ）をコードするＮＳ；６）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＡ；７）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いてＲＮＡポリメラーゼ及びＰＢ１−Ｆ２タンパク質（アポトーシスを誘導する）をコードするＰＢ１；及び８）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＢ２。
【０００６】
これら１１個のタンパク質のうち、赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ウイルスエンベロープ中に固定されてウイルス粒子の外面に存在する２つの大きな糖タンパク質である。これらのタンパク質は、インフルエンザに対する免疫応答の免疫原となる。ＨＡは、標的細胞へのウイルスの結合及び標的細胞中へのウイルスゲノムの侵入を仲介するレクチンであり、単一遺伝子産物ＨＡ０として発現され、その後、宿主のプロテアーゼによりプロセシングされて２個のサブユニットＨＡ１及びＨＡ２を生じ、これらは一緒になってインフルエンザウイルス粒子表面上で複合体を形成する。ＮＡは、感染細胞中で新たに産生された成熟ウイルス粒子の放出に関与する。
【０００７】
インフルエンザＡウイルスには１６個のＨＡ血清型及び９個のＮＡ血清型が知られている。ウイルス粒子中に存在する異なる血清型を特定することによりウイルスは通常記述される。例えば、Ｈ１Ｎ１は、ＨＡ血清型がＨ１、ＮＡ血清型がＮ１のインフルエンザウイルスであり、Ｈ５Ｎ１は、ＨＡ血清型がＨ５、ＮＡ血清型がＮ１のインフルエンザウイルスである。Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３血清型並びにＮ１及びＮ２血清型だけが通常ヒトに感染する。
【０００８】
インフルエンザ株は通常、種又は属に特異的である。すなわち、ブタに感染できるインフルエンザ株（ブタインフルエンザウイルス）は通常、ヒト又はトリには感染せず、トリに感染できるインフルエンザ株（トリインフルエンザウイルス）はヒト又はブタに感染せず、ヒトに感染できるインフルエンザ株（ヒトインフルエンザウイルス）はトリ又はブタに感染しない。しかし、インフルエンザ株は、変異して、１つの種から別の種に感染可能になることがある。例えば、ブタにだけ感染する株（ブタインフルエンザ）が、変異又は組換えにより、ヒトだけ又はブタ及びヒトの両方に感染できる株になることがある。「ブタインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前はブタに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株（Ｈ１Ｎ１株等）である（すなわち、ブタインフルエンザウイルスはブタ起源ヒトインフルエンザ又はブタ由来ヒトインフルエンザである）。「トリインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前にトリに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株（Ｈ５Ｎ１株等）である（すなわちトリインフルエンザウイルスはトリ起源ヒトインフルエンザ又はトリ由来ヒトインフルエンザである）。
【０００９】
先進国の多くの人及び時には家畜に、インフルエンザに対するワクチン接種が季節的に行われる。ワクチンによって惹起される免疫応答は特定のサブタイプのウイルスに特異的なため、使用されるワクチンの保護効果は限定的である。毎年、その年にどの種類及び株のウイルスが循環するかについての国際的調査及び科学者の予測に基づいて、異なるインフルエンザワクチンが開発及び投与される。ウイルスは、セグメントの変異、組換え、及び再構築により大きく変化する。したがって、ある年に与えられたワクチンは、翌年に広く伝染する季節性の株に対して保護効果を有しないと考えられる。
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アメリカ疾病管理予防センターが一般に奨励する「インフルエンザ予防接種（ｆｌｕ ｓｈｏｔ）」は通常３種類の死菌／不活化インフルエンザウイルス、すなわち１つのＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、１つのＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、及び１つのＢウイルスを含む。そのため、サブタイプの予測及びそのサブタイプに対する特異的ワクチンの利用可能性によりワクチン接種が制限されていることは明らかである。
【００１０】
動物及びヒト疾患に対するワクチン接種のための核酸配列の直接投与が研究され、所望の抗原の必要な発現を得、それによる免疫原性反応を得るため、そして究極的にはこの技術を成功させるために、効果的且つ効率的な核酸送達手段に多くの努力がなされてきた。
【００１１】
ＤＮＡワクチンには、生菌弱毒ウイルス及び組換えタンパク質ベースのワクチンを初めとする従来のワクチン接種法と比べて多くの概念的利点がある。ＤＮＡワクチンは、ヒトにおいて安全であり、安定であり、生産が容易であり、認容性が高く（ｗｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）、前臨床試験でプラスミドの組込みを示す証拠がほとんどない［非特許文献１及び２］。更に、ＤＮＡワクチンは、ベクターに対する予め存在する抗体の力価にワクチンの有効性が影響されないため、反復投与に非常に適している［非特許文献３］。しかし、より大きな動物に移る時にプラットフォームの免疫原性が低下することが、ＤＮＡワクチンを臨床導入する際の大きな障害の１つであった［非特許文献４］。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、免疫グロブリンリーダー配列の付加等のＤＮＡワクチン免疫原の改良における近年の技術的進歩［非特許文献５〜８］及び近年開発された電気穿孔等のプラスミド送達システムにおける技術［非特許文献９〜１１］により、ＤＮＡワクチンの発現及び免疫原性が向上している。更に、コンセンサス免疫原を使用することで天然抗原のみの場合と比べて細胞性免疫応答の幅を広げることができることが研究により示唆されている［非特許文献１２及び１３］。
【００１２】
プラスミドＤＮＡ等の核酸配列を送達する方法の１つは電気穿孔（ＥＰ）技術である。この技術は、ブレオマイシン等の抗がん薬を送達するためのヒト臨床試験及び多数の動物種における多くの前臨床試験において使用されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Martin,T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integrationafter intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68
【非特許文献２】Nichols,W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N YAcad Sci, 1995. 772: p. 30-9
【非特許文献３】Chattergoon,M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines andimmune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63
【非特許文献４】Liu,M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet,2005. 55: p. 25-40
【非特許文献５】Andre,S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with asynthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p.1497-503
【非特許文献６】Deml,L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression andimmunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiencyvirus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001
【非特許文献７】Laddy,D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines againstavian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9
【非特許文献８】Frelin,L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances theimmunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther,2004. 11(6): p. 522-33
【非特許文献９】Hirao,L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improvesplasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine,2008. 26(3): p. 440-8
【非特許文献１０】Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivoelectroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesusmacaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69
【非特許文献１１】Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances theimmunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased localDNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells.J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53
【非特許文献１２】Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by anengineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther,2007. 15(2): p. 411-21
【非特許文献１３】Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestralcenter-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007.81(16): p. 8507-14
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
免疫原性インフルエンザコンセンサス赤血球凝集素タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸コンストラクト、及びインフルエンザの複数の株に対する免疫応答を惹起するのに有用な組成物に対するニーズが依然として存在する。個体を処置するための、経済的であり且つ多くのインフルエンザサブタイプに有効な、インフルエンザに対する効果的なワクチンに対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下からなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する：配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号３；配列番号３に９５％相同な核酸配列；配列番号３の断片；配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号６；配列番号６に９５％相同な核酸配列；配列番号６の断片；配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号９、配列番号９に９５％相同な核酸配列；配列番号９の断片；配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１１、配列番号１１に９５％相同な核酸配列；配列番号１１の断片；配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１３；配列番号１３に９５％相同な核酸配列；配列番号１３の断片；配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；及び配列番号１５；配列番号１５に９５％相同な核酸配列；配列番号１５の断片；配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列。
【００１６】
また、本発明は、ａ）配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号３；配列番号３に９５％相同な核酸配列；配列番号３の断片；配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号６；配列番号６に９５％相同な核酸配列；配列番号６の断片；配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号９；配列番号９に９５％相同な核酸配列；配列番号９の断片；配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１１；配列番号１１に９５％相同な核酸配列；配列番号１１の断片；配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１３；配列番号１３に９５％相同な核酸配列；配列番号１３の断片；配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１５；配列番号１５に９５％相同な核酸配列；配列番号１５の断片；及び配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列、の１又は複数からなる群から選択される第１の核酸配列と、ｂ）インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、及びその断片の１又は複数からなる群から選択されるタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明のいくつかの態様では、そのような核酸分子及び／又は組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様では、感染から個体を保護する方法が提供される。方法は、前記個体にそのような核酸配列又は組成物を含む予防有効量の核酸分子を投与するステップを含み、核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、前記核酸配列によってコードされるタンパク質に対する防御免疫応答が惹起される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ブタ起源ヒトインフルエンザに対する防御免疫応答である。
【００１９】
本発明のいくつかの態様では、インフルエンザに感染した個体を処置する方法が提供される。方法は、前記個体に、治療有効量のそのような核酸分子及び／又は組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ブタ起源ヒトインフルエンザに対する治療的免疫応答である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２９９９塩基対の骨格ベクタープラスミドｐＶＡＸ１（インビトロジェン社製、カリフォルニア州カールズバッド）のマップを示す図である。ＣＭＶプロモーターが塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミング部位が塩基６６４〜６８３にある。マルチクローニングサイトが塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルが塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子が塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣオリジンが塩基２３２０〜２９９３にある。
【００２１】
インビトロジェン社から入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づき、ｐＧＸ２００９の骨格として使用されたｐＶＡＸ１の配列中に以下の変異が見つかった：
Ｃ＞Ｇ ２４１ ＣＭＶプロモーター中
Ｃ＞Ｔ １９４２ 骨格、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）の下流
Ａ＞− ２８７６ 骨格、カナマイシン遺伝子の下流
Ｃ＞Ｔ ３２７７ ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）多コピー変異中（Nucleic Acid Research 1985参照）
Ｇ＞Ｃ ３７５３ ＲＮＡＳｅＨ部位の上流のｐＵＣ Ｏｒｉの末端中
塩基対２、３、及び４は、ＣＭＶプロモーター上流の骨格中でＡＣＴからＣＴＧに変化している。
【図２】ｐＨ１ＨＡ０９とも呼ばれるプラスミドｐＧＸ２００９の２つのマップを示す図である。プラスミドｐＧＸ２００９（配列番号５）の核酸配列は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号１にコードされるアミノ酸配列番号２）並びにそのＮ末端に連結されたＩｇＥリーダー（アミノ酸配列番号１７）及びＣ末端に連結されたＨＡタグ（配列番号１８）を含む、コンセンサスＨ１タンパク質コンストラクト（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）のコード配列を含む。コンセンサスＨ１タンパク質（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）はＳｗｉＨｕｍ Ｃｏｎ ＨＡ及びＨ１ＨＡ０９とラベルされている。
【図３】プラスミドｐＧＸ２００６のマップを示す図である。プラスミドｐＧＸ２００６の核酸配列（配列番号８）は、Ｈ２ＨＡとラベルされたコンセンサスＨ２タンパク質（配列番号６によりコードされるアミノ酸配列番号７）のコード配列を含む。
【図４】免疫化したフェレットの血清を用いて行った赤血球凝集抑制試験から得られたデータを示す図である。
【図５】新規なＨ１Ｎ１株で免疫化された又は免疫化されていないフェレットの暴露結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
インフルエンザＡのＨ１及びＨ２それぞれのコンセンサスアミノ酸配列（本明細書中でそれぞれ「コンセンサスＨ１」（配列番号２）及び「コンセンサスＨ２」（配列番号７）と呼ばれる）、並びに新規な合成ハイブリッドコンセンサスＨ１インフルエンザＡ赤血球凝集素アミノ酸配列（本明細書中で「コンセンサスＵ２」（配列番号１０）と呼ばれる）及びインフルエンザＢ赤血球凝集素のコンセンサスアミノ酸配列（本明細書中で「コンセンサスＢＨＡ」（配列番号１３）と呼ばれる）が提供され、これはインフルエンザから哺乳動物を保護することができる。更に、コンセンサスＨ１アミノ酸配列、コンセンサスＨ２アミノ酸配列、コンセンサスＵ２アミノ酸配列、及び／又はコンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの態様では、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（例えば（配列番号１）又は（配列番号３））、コンセンサスＨ２アミノ酸配列（例えば（配列番号６））、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（例えば（配列番号９）又は（配列番号１１））、及び／又はコンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（例えば（配列番号１３）又は（配列番号１５））を含むタンパク質をコードする核酸配列が提供される。
【００２３】
理論により限定されるものではないが、複数のインフルエンザサブタイプに対して幅広く免疫応答（体液性、細胞性、又は両方）を誘導するために使用できるワクチンは、以下の１又は複数を含み得る：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質；３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質；５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質；７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００２４】
以下の構成要素の２以上を使用して及び／又は組み合せて、免疫化方法を行い、ワクチンを製造することができる：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質；３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質；５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質、７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。インフルエンザに対するより広い処置のために、インフルエンザＡのＨ１〜Ｈ１６、インフルエンザＡのＮ１〜Ｎ９、インフルエンザＢ赤血球凝集素、インフルエンザＢノイラミニダーゼ等の１又は複数のその他のインフルエンザタンパク質及び／又はこれらのタンパク質をコードする遺伝子を以下の構成要素の１又は複数と一緒に使用して及び／又は組み合せて免疫化方法を行い、ワクチンを製造してもよい：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質；３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質；５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質、７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。
１．定義
本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書及び特許請求の範囲において、文脈で明らかに複数であると指定されない限り、単数形は複数形を包含する。
【００２５】
本明細書における数値範囲の記載には、その間にある同じ精度の各数値が明確に意図される。例えば、６〜９の範囲には、６及び９に加えて７及び８の数値が意図され、６．０〜７．０の範囲には、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明確に意図される。
ａ．アジュバント
本発明において、「アジュバント」とは、後述するＤＮＡプラスミド及びコード核酸配列によりコードされる抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味する。
ｂ．抗体
本発明において、「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥクラスの抗体、又は断片、又はその断片若しくは派生物、例えばＦａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆｄ、及び単鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二機能性抗体、並びにその派生物を意味する。抗体は、所望のエピトープ又はそれに由来する配列に十分な結合特異性を示す、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、又はその混合物であってよい。
ｃ．コード配列
本発明において、「コード配列」又は「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は更に、核酸が投与される個体又は哺乳動物の細胞内での発現を方向付けることができるプロモーターやポリアデニル化シグナル等の調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナル及び終止シグナルを含んでもよい。
ｄ．相補体
本発明において、「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」又は「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ間におけるワトソン・クリック（例えばＡ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）又はフーグスティーン塩基対を形成できる核酸を意味する。
ｅ．コンセンサス又はコンセンサス配列
本発明において、「コンセンサス」又は「コンセンサス配列」とは、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプのアラインメント分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列が作製され得る。コンセンサス配列を含むタンパク質及び／又はそのようなタンパクをコードする核酸分子を含むワクチンを用いて、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプ又は血清型に対する幅広い免疫を惹起することができる。コンセンサスインフルエンザ抗原には、例えばコンセンサスＨ１、コンセンサスＨ２等のインフルエンザＡのコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列、又はインフルエンザＢのコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列が含まれ得る。
ｆ．定電流
本発明において、「定電流」とは、組織又は前記組織を規定する細胞が、同じ組織に送出される電気パルスの期間中に受ける電流を意味する。電気パルスは本明細書に記載の電気穿孔装置によって送出される。本明細書に記載の電気穿孔装置はフィードバック要素を有し、好ましくは即時的フィードバックを有するため、この電流は、電気パルス存続期間中、前記組織中で一定のアンペア数である。フィードバック要素により、パルス期間中の組織（又は細胞）の抵抗を測定することができ、電気穿孔装置が電気パルス（マイクロ秒のオーダー）中に同じ組織中及びパルス間での電流が一定になるように電気エネルギー出力を変化させる（例えば電圧を上げる）ことが可能になる。いくつかの実施形態では、フィードバック要素はコントローラーを含む。
ｇ．電流フィードバック又はフィードバック
「電流フィードバック」又は「フィードバック」は同じ意味で使用することができ、電極間で組織中の電流を測定すること及びそれに基づいて電流を一定レベルに維持するためにＥＰ装置から送出されるエネルギー出力を変化させることを含む、所定の電気穿孔装置の能動的な応答を意味する。この一定レベルは、パルスシーケンス又は電気処置の開始前に、ユーザーにより予め設定される。フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えばコントローラーにより達成することができ、電気穿孔装置の電気回路が、電極間の組織中の電流を連続的に監視し、監視された電流（すなわち組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、監視される電流が予め設定されたレベルに維持されるように連続的にエネルギー出力を調整することができる。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるので、即時的であり得る。
ｈ．分散電流
本発明において、「分散電流（ｄｅｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）」とは、本明細書に記載されている電気穿孔装置の種々の針電極アレイから送られる電流のパターンであって、パターンが、電気穿孔されている組織の任意の領域において電気穿孔関連熱ストレスの発生を最小化するか好ましくは除去するものを意味する。
ｉ．電気穿孔
本発明において同じ意味で使用されている「電気穿孔」、「電気透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、又は「動電促進（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、生体膜中に微視的経路（細孔）を誘発するための膜貫通電場パルスの使用を意味する。それらの存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬、イオン、水等の生体分子が細胞膜の一方の側から他方の側へ通過することが可能となる。
ｊ．フィードバック機構
本発明において、「フィードバック機構」とは、ソフトウェア又はハードウェア（又はファームウェア）のいずれかによって実行されるロセスであって、所望の組織のインピーダンス（エネルギーパルス送出の前、間、及び／又は後）を受け取り、予め設定された値（好ましくは電流）と比較し、送出されるエネルギーパルスを予め設定された値に調整するプロセスを意味する。フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実行され得る。
ｋ．断片
本発明において、核酸配列との関連における「断片」とは、例えばインフルエンザＡのＨ１赤血球凝集素、インフルエンザＡのＨ２赤血球凝集素、インフルエンザＢの赤血球凝集素等の全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドをコードする核酸配列又はその一部を意味する。断片は、配列番号１、３、６、９、１１ １３、及び１５を初めとするコンセンサスアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列及びそのような配列を含むコンストラクトの少なくとも１つ、から選択されるＤＮＡ断片であり得る。ＤＮＡ断片は、ＩｇＥ又はＩｇＧ配列等の免疫グロブリンリーダーのコード配列を含み得る。ＤＮＡ断片の長さは、ヌクレオチド３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３６０個以上、４２０個以上、４８０個以上、５４０個以上、６００個以上、６６０個以上、７２０個以上、７８０個以上、８４０個以上、９００個以上、９６０個以上、１０２０個以上、１０８０個以上、１１４０個以上、１２００個以上、１２６０個以上、１３２０個以上、１３８０個以上、１４４０個以上、１５００個以上、１５６０個以上、１６２０個以上、１６８０個以上、１７４０個以上、１８００個以上、１８６０個以上、１８２０個以上、１８８０個以上、１９４０個以上、２０００個以上、２６００個以上、２７００個以上、２８００個以上、２９００個以上、２９１０個以上、２９２０個以上、２９３０個以上、２９３１個以上、２９３２個以上、２９３３個以上、２９３４個以上、２９３５個以上、２９３６個以上、２９３７個以上、又は２９３８個以上であり得る。ＤＮＡ断片は、ヌクレオチド１０個未満、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３６０個未満、４２０個未満、４８０個未満、５４０個未満、６００個未満、６６０個未満、７２０個未満、７８０個未満、８４０個未満、９００個未満、９６０個未満、１０２０個未満、１０８０個未満、１１４０個未満、１２００個未満、１２６０個未満、１３２０個未満、１３８０個未満、１４４０個未満、１５００個未満、１５６０個未満、１６２０個未満、１６８０個未満、又はヌクレオチド１７４０個未満、１８００個未満、１８６０個未満、１８２０個未満、１８８０個未満、１９４０個未満、２０００個未満、２６００個未満、２７００個未満、２８００個未満、２９００個未満、２９１０個未満、２９２０個未満、２９３０個未満、２９３１個未満、２９３２個未満、２９３３個未満、２９３４個未満、２９３５個未満、２９３６個未満、２９３７個未満、又は２９３８個未満であり得る。
【００２６】
ポリペプチド配列との関連における「断片」とは、例えばインフルエンザＡのＨ１赤血球凝集素、インフルエンザＡのＨ２赤血球凝集素、又はインフルエンザＢの赤血球凝集素等の全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する、哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドを意味する。断片は、配列番号２、４、７、１０、１２、１４、１６を初めとする本発明の種々のポリペプチド配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。ポリペプチド断片は、ロスアラモス国立研究所のＨＡ配列データベース等の公的に利用可能なデータベースにより提供されるように、少なくとも１つの抗原性エピトープと接触するように分析することができる。ポリペプチドＨＡ断片は、ＩｇＥ又はＩｇＧ等の免疫グロブリンリーダーのアミノ酸配列を更に含んでよい。ポリペプチド断片の長さは、アミノ酸３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３６０個以上、４２０個以上、４８０個以上、５４０個以上、６００個以上、６６０個以上、又は７１０個以上であり得る。ポリペプチド断片の長さは、アミノ酸１０個未満、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３６０個未満、４２０個未満、４８０個未満、５４０個未満、６００個未満、６６０個未満、７００個未満、７０１個未満、７０２個未満、７０３個未満、７０４個未満、７０５個未満、７０６個未満、７０７個未満、７０８個未満、７０９個未満、又は７１０個未満であり得る。
ｌ．遺伝子コンストラクト
本発明において、「遺伝子コンストラクト」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個体の細胞中での発現を方向付けることができるプロモーター、ポリアデニル化シグナル等の調節エレメントに作動可能に連結された開始及び終止シグナルが含まれる。本発明において、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在するときにコード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必須調節エレメントを含む遺伝子コンストラクトを指す。
ｍ．同一
本発明において、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「同一性」とは、特定の領域にわたり同じである特定のパーセンテージの残基を有する配列を意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたり２つの配列を比較し、両方の配列中で残基が同一である位置の数を決定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数をその特定領域中の全ての位置の数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。２つの配列の長さが異なる場合又はアラインメントにより１又は複数の付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄ）が生じて特定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合、単一配列の残基は計算の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は同等であると見なすことができる。同一性は、手作業で行ってもよく、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを用いて行ってもよい。
ｎ．インピーダンス
「インピーダンス」は、フィードバック機構を議論する時に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。
ｏ．免疫応答
本発明において、「免疫応答」とは、インフルエンザ赤血球凝集素コンセンサス抗原等の抗原の導入に応答した、宿主免疫系（例えば哺乳動物の免疫系）の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答の形態であってもよく、体液性応答の形態であってもよく、両方であってもよい。
ｐ．核酸
本発明において、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」とは、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述によって相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、記述されている一本鎖の相補鎖も包含する。所与の核酸と同じ目的に核酸の多くのバリアントを用いることができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２７】
核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよく、二本鎖配列部分及び一本鎖配列部分の両方を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ（ゲノム及びｃＤＮＡの両方）であってもよく、ＲＮＡであってもよく、核酸がデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組合せ並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含み得るハイブリッドであってもよい。核酸は化学合成法によって得てもよく、組換え法によって得てもよい。
ｑ．作動可能に連結された
本発明において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、空間的に関係する（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）プロモーターの制御下における遺伝子の発現を意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）に位置してもよく、３’（下流）に位置してもよい。プロモーターと遺伝子の距離は、プロモーターが由来する遺伝子中におけるプロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で公知のように、この距離はプロモーター機能を消失させることなく変えることができる。
ｒ．プロモーター
本発明において、「プロモーター」とは、細胞中での核酸の発現を付与、活性化、又は促進できる合成又は天然由来分子を意味する。プロモーターは発現を更に促進する並びに／又は空間的発現及び／若しくはその一時的発現を変化させる１又は複数の特定の転写制御配列を含み得る。プロモーターは更に、転写開始部位から数万塩基対も離れて位置し得る遠位性のエンハンサー又は抑制エレメントを含んでもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、動物等を起源とし得る。プロモーターによる遺伝子構成要素の発現制御は、構成的であってもよく、発現が起こる細胞、組織、又は臓器に関して異なってもよく、発現の起こる発生段階に関して異なってもよく、生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応じて異なってもよい。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター 及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。
ｓ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸複合混合物中におけるように、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、環境によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、（所定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下において）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度であり得る（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、平衡時にプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、例えば約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は別の塩）、温度が、短いプローブ（例えば約１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）で少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成されてもよい。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣで洗浄、並びに６５℃で０．１％ＳＤＳ。
ｔ．実質的に相補的
本発明において、「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、２０７０、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸領域にわたって第１の配列が第２の配列の相補体に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であることあるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
ｕ．実質的に同一
本発明において、「実質的に同一」とは、第１の配列が第２の配列の相補体に実質的に相補的である場合、第１及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、２０７０、又はそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸領域にわたって、又は核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを意味する。
ｖ．サブタイプ又は血清型
本発明において、「サブタイプ」又は「血清型」は同じ意味で使用されており、インフルエンザウイルスに関して、インフルエンザウイルスの遺伝的バリアントを意味し、１つのサブタイプは免疫系によって異なるサブタイプとは別に認識される。
ｗ．バリアント
本発明において、核酸と関連して使用される「バリアント」とは、（ｉ）参照されているヌクレオチド配列の一部又は断片；（ｉｉ）参照されているヌクレオチド配列又はその一部の相補体；（ｉｉｉ）参照されている核酸又はその相補体と実質的に同一な核酸；又は（ｉｖ）参照されている核酸、その相補体、若しくはそれと実質的に同一な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００２８】
ペプチド又はポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸が異なっているが、少なくとも１つの生物学的活性を保持している。更に、バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、同様な特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する異なるアミノ酸でアミノ酸を置換することは通常、当該技術分野で、軽微な変化を伴うと認識されている。これらの軽微な変化は、一部、当該技術分野で理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー・インデックスを考慮することによって特定することができる（Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)）。アミノ酸のハイドロパシー・インデックスは、その疎水性及び荷電の考慮に基づく。同様なハイドロパシー・インデックスのアミノ酸を置換してなおタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野で公知である。一態様では、ハイドロパシー・インデックスが±２のアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性も、生物学的機能を保持したタンパク質が得られる置換を明らかにするために利用することができる。ペプチド中のアミノ酸の親水性を考慮することで、ペプチドの最も大きい局所的平均親水性を計算することができ、これは抗原性及び免疫原性と相関性が高いことが報告されている有用な尺度である（参照により全体を本明細書に援用する米国特許第４，５５４，１０１号）。同様な親水性値のアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されるように、免疫原性等の生物学的活性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性インデックス及び親水性値はどちらも、アミノ酸の特定の側鎖に影響される。この観察結果と一致し、生物学的機能と両立するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、サイズ、及びその他の特性により示されるようなアミノ酸（特にそれらのアミノ酸の側鎖）の相対的な類似性に依存すると理解される。
ｘ．ベクター
本発明において、「ベクター」とは、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、バクテリア人工染色体、又は酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは自己複製染色体外ベクターであってよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
２．インフルエンザ抗原
本発明は、哺乳動物において１又は複数のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原を提供する。この抗原は、哺乳動物において、１又は複数のインフルエンザ血清型に対する、例えば２００９Ｈ１Ｎ１ブタ起源インフルエンザ等の１又は複数のパンデミック株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、哺乳動物において、１又は複数のインフルエンザ血清型に対する、例えばブタ由来ヒトインフルエンザの１又は複数の株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、抗インフルエンザ免疫応答を惹起できる免疫原としてそれらを特に効果的にするエピトープを含み得る。
【００２９】
抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、そのバリアント、その断片、又はその組合せを含み得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ２の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株の異なる集合に由来する２つの異なるコンセンサス配列の一部を含むハイブリッド配列、又はインフルエンザＢの複数の株に由来するコンセンサス配列であり得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原はインフルエンザＢに由来し得る。抗原は、免疫応答を惹起し得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原性エピトープを含み得る。抗原は、インタクトなインフルエンザウイルス中に存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提供し得る。抗原は、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株（例えば血清型Ｈ１又は血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株）の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。抗原は、２つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列又はその一部の組合せに由来し得るハイブリッドコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。２つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列のそれぞれは、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株等の１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株の異なる集合に由来し得る。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。
【００３０】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、アミノ酸１〜３４３が前駆体ＨＡ０コンセンサスＨ１アミノ酸配列のＨＡ１サブユニットに対応し且つアミノ酸３４４〜５６６がＨＡ０コンセンサスＨ１アミノ酸配列のＨＡ２サブユニットに対応する、配列番号２（コンセンサスＨ１アミノ酸配列）を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号７（コンセンサスＨ２アミノ酸配列）を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、それぞれが互いに異なる集合の配列に由来する２つの異なるコンセンサスＨ１配列の一部を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であり得る。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の例は、配列番号１０（Ｕ２アミノ酸配列）を含むタンパク質である。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、インフルエンザＢ株の赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質、例えば配列番号１４（コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列）を含むタンパク質であり得る。
【００３１】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、１又は複数の付加的アミノ酸配列エレメントを更に含み得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、Ｎ末端にＩｇＥ又はＩｇＧリーダーアミノ酸配列を更に含み得る。ＩｇＥリーダーアミノ酸配列は配列番号１７であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出できる固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグを更に含み得る。そのような免疫原性タグの例は、コンセンサス赤血球凝集素Ｃ末端に連結され得る９アミノ酸インフルエンザＨＡタグである。ＨＡタグアミノ酸配列は配列番号１８であり得る。いくつかの実施形態では、コンセンサス赤血球凝集素抗原は、Ｎ末端にＩｇＥ又はＩｇＧリーダーアミノ酸配列及びＣ末端にＨＡタグを更に含み得る。
【００３２】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列又はその断片及びバリアントからなるコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、非インフルエンザタンパク質配列及びインフルエンザタンパク質配列又はその断片及びバリアントを含むコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。
【００３３】
コンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号２）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方等の付加的エレメントを更に含むものが含まれる。ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むコンセンサスＨ１タンパク質の例は配列番号４であり、これはＮ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）に連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結されたコンセンサスＨ１アミノ酸コード配列（配列番号２）を含む。
【００３４】
コンセンサスＨ２タンパク質の例としては、コンセンサスＨ２アミノ酸配列（配列番号７）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を更に含むものが含まれる。
【００３５】
ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（配列番号１０）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むものが含まれる。コンセンサスＵ２タンパク質の例は配列番号１２であり、これはＮ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）が連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結された、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（配列番号１０）を含む。
【００３６】
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢ赤血球凝集素タンパク質の例としては、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（配列番号１４）からなり得るものが含まれ、あるいは、ＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含んでもよい。コンセンサスＢＨＡタンパク質の例は配列番号１６であり、これは、Ｎ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）が連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結された、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（配列番号１４）を含む。
【００３７】
コンセンサス赤血球凝集素タンパク質は、コンセンサス赤血球凝集素核酸、そのバリアント、又はその断片にコードされ得る。異なる株及びバリアントの複数の異なる赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサス赤血球凝集素タンパク質と異なり、コンセンサス赤血球凝集素核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサス赤血球凝集素タンパク質配列が由来する複数の異なる赤血球凝集素配列中の特定のアミノ酸配列をコードするのに使用されるものとは異なってよい。コンセンサス核酸配列は、最適化されたコドン及び／又は最適化されたＲＮＡであってよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、５’非翻訳領域中にコザック配列を含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は赤血球凝集素コード配列の５’にある。Ｎ末端リーダーは分泌を促進し得る。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダー又はＩｇＧリーダーであり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端にあってよく、それをコードする配列はＨＡコード配列の３’にある。免疫原性タグの与えるエピトープに対して容易に入手可能な抗体があるため、それにより、そのような抗体をアッセイ中で用いてタンパク質の発現を検出及び確認することができる。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端のＨタグであり得る。
【００３８】
コンセンサス赤血球凝集素核酸は、配列番号２、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有し得る。配列番号２、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１４をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸はそれぞれ配列番号１、配列番号６、配列番号９、又は配列番号１３であり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸は、ＩｇＥリーダーアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列若しくはＨＡタグアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列又はその両方を更に含んでよい。配列番号１７はＩｇＥリーダーポリペプチド配列である。配列番号１８はＨＡタグポリペプチド配列である。ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグをコードするポリヌクレオチド配列を更に含む赤血球凝集素コンセンサス核酸の例としては、配列番号４、配列番号１２、又は配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子が含まれる。配列番号４、配列番号１２、又は配列番号１６をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸は、それぞれ配列番号３、配列番号１１、又は配列番号１５であり得る。
３．遺伝子コンストラクト及びプラスミド
赤血球凝集素抗原をコードする核酸配列を含み得る遺伝子コンストラクトを提供する。遺伝子コンストラクトは、赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む機能性染色体外分子として細胞中に存在し得る。赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトは、セントロメアを含む線状ミニ染色体、テロマー、又はプラスミド若しくはコスミドであり得る。
【００３９】
更に、遺伝子コンストラクトは、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、組換えワクシニア等の組換えウイルスベクターのゲノムの一部であってもよい。遺伝子コンストラクトは、弱毒化された生きた微生物中又は細胞中で生きる組換え微生物ベクター中に含まれる遺伝材料の一部であってよい。
【００４０】
遺伝子コンストラクトは、赤血球凝集素核酸の遺伝子発現の調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー開始コドン、終止コドン、又はポリアデニル化シグナルであり得る。
【００４１】
組成物は、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素Ｈ１抗原、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素Ｈ２抗原、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素Ｕ２抗原、及びインフルエンザＢコンセンサス赤血球凝集素タンパク質ＢＨＡの１又は複数からなる群から選択される赤血球凝集素コンセンサス抗原をコードする第１の核酸配列を含み得、インフルエンザＡ赤血球凝集素タンパク質Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ赤血球凝集素（ＢＨＡ）、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ（ＢＮＡ）からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列を更に含み得る。第１の核酸配列及び付加的核酸配列は、同じ核酸分子上に存在してもよく、異なる核酸分子上に存在してもよい。第１の核酸配列及び付加的核酸配列は、ヒト細胞中で機能する調節エレメントの制御下にあってよい。付加的コード配列は、インフルエンザの１又は複数の株の１又は複数のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、ＢＨＡ、及びＢＮＡをコードしてもよく、又はその血清型を有する複数の株に由来するコンセンサスであってよく、又は２つ以上のコンセンサス配列に由来する配列を含むハイブリッドであってよい。
【００４２】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子コンストラクトを構成し得る。ベクターは、哺乳動物中で免疫応答を誘発するのに有効な量のコンセンサス赤血球凝集素抗原を哺乳動物細胞中で発現することができる。ベクターは組換え体であってよい。ベクターはコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであってよい。ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞はコンセンサス赤血球凝集素抗原の発現が起こる条件下で培養及び維持される。
【００４３】
ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含んでよく、コンセンサス赤血球凝集素コード配列の上流であり得る開始コドン及びコンセンサス赤血球凝集素の下流であり得る終止コドンを更に含んでよい。開始及び終止コドンは、コンセンサス赤血球凝集素コード配列とインフレームであり得る。ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素コード配列に作動可能に連結されたプロモーターも含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。更に、プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子に由来するプロモーターであってもよい。プロモーターは更に、天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されている。
【００４４】
ベクターは更に、ポリアデニル化シグナルを含んでもよく、これはＨＡコード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）のポリアデニル化シグナルであり得る。
【００４５】
ベクターは更に、コンセンサス赤血球凝集素コーティングの上流にエンハンサーを含んでもよい。エンハンサーがＤＮＡ発現に必須であってもよい。エンハンサーはヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、又はＥＢＶに由来するエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能亢進については、それぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及び国際公開第９４／０１６７３７号に記載されている。
【００４６】
ベクターは、ベクターを染色体外に維持するため及び細胞中で多コピーのベクターを生成するために、哺乳動物の複製起点を更に含んでよい。ベクターは、インビトロジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のｐＶＡＸ１（図１）、ｐＣＥＰ４、又はｐＲＥＰ４であり得、これはエプスタイン・バーウイルス複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得、組み込まれることなく多コピーのエピソーム複製を可能にする。ベクターは、上記の図面の簡単な説明の図１に関するパラグラフに記載されているような変化を有するｐＶＡＸ１であり得る。ベクターの骨格はｐＡＶ０２４２であってよい。ベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであってよい。
【００４７】
ベクターは更に、ベクターが投与される哺乳動物又はヒトの細胞中における遺伝子発現に良く適し得る制御配列を含んでもよい。コンセンサス赤血球凝集素コード配列は、宿主細胞中でのコード配列のより効率的な転写を可能にすることができるコドンを含んでよい。
【００４８】
ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質産生に使用可能なｐＳＥ４２０（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）であってよい。ベクターは、酵母のサッカロミセス・セレビシア株でのタンパク質産生に使用可能なｐＹＥＳ２（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）であってもよい。また、ベクターは、昆虫細胞でのタンパク質産生に使用可能なＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）のものであってもよい。また、ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞でのタンパク質産生に使用可能なｐｃＤＮＡ Ｉ又はｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）であってもよい。ベクターは、参照により全体を本明細書に援用するSambrook etal., Molecular Cloning an Laboratory Manual, Second Ed. , Cold Spring Harbor(1989)を含むルーチンな技術及び容易に入手可能な出発材料によりタンパク質を産生するための発現ベクター又は系であってよい。
【００４９】
ベクターはｐＧＸ２００９又はｐＧＸ２００６であってよく、これはコンセンサス赤血球凝集素抗原を発現させるために使用することができる。ベクターｐＧＸ２００９（４７３９ｂｐ、図２；配列番号５）は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号１によりコードされるアミノ酸配列番号２）に連結したＩｇＥリーダー配列（配列番号１１によりコードされるアミノ酸配列番号１２）を含むコンセンサスＨ１タンパク質（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）をコードする核酸配列を有する改変ｐＶＡＸ１プラスミドである。ベクターｐＧＸ２００６（４６２８ｂｐ；図３、配列番号８）は、コンセンサスＨ２タンパク質（配列番号６によりコードされるアミノ酸配列番号７）をコードする核酸配列を有するｐＶＡＸ１プラスミドである。
【００５０】
コンセンサス赤血球凝集素コード配列を含む本明細書に開示されている遺伝子コンストラクト及び構成要素は、コンセンサス赤血球凝集素コード配列の代わりに他のインフルエンザタンパク質、例えばインフルエンザＡタンパク質Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、又はノイラミニダーゼタンパク質のコード配列を含めることにより、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、又はノイラミニダーゼタンパク質を発現させるために用いてもよい。
４．医薬組成物
約１ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む本発明に係る医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ナノグラム、又は少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、若しくは１０００マイクログラム、又は少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、若しくは１０ｍｇ、又はそれ以上から、２）１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ナノグラムまで、又は１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、若しくは１０００マイクログラムまで、又は１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、若しくは１０ｍｇまでを含む。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、約５ナノグラムから約１０ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、約２５ナノグラム〜約５ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約５０ナノグラム〜約１ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２０〜約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２５〜約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３０ナノグラム〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３５ナノグラム〜約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００５１】
本発明に係る医薬組成物は、使用される投与形態に従って製剤化される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは無菌であり、発熱性物質を含まず（ｐｙｒｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）、微粒子を含まない。好ましくは等張性の製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液が好ましい。安定化剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、製剤に血管収縮剤が添加される。
【００５２】
好ましくは、医薬組成物はワクチンであり、より好ましくはＤＮＡワクチンである。
【００５３】
１又は複数のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を哺乳動物で生じさせることができるワクチンを提供する。ワクチンは上記の遺伝子コンストラクトを含み得る。ワクチンは、それぞれが１又は複数のインフルエンザＡ血清型、例えばＨ１〜Ｈ１６インフルエンザＢ赤血球凝集素、又はその組合せに対する複数のベクターを含んでもよい。ワクチンは、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする１又は複数の核酸配列を含んでもよい。ワクチンが２以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、全てのそのような配列が１つの核酸分子上に存在してもよく、そのような配列のそれぞれが異なる核酸分子上に存在してもよい。あるいは、２以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、１つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子及び２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子を含み得る。更に、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、及びインフルエンザＢノイラミニーゼからなる群から選択される１又は複数のタンパク質のコード配列を更に含んでもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ワクチンはタンパク質を含み得る。いくつかのワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、ＢＨＡ等の１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含み得る。ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼからなる群から選択される１又は複数の他のタンパク質を含んでもよい。ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼからなる群から選択される１又は複数の他のタンパク質と組み合わせて１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含んでもよい。
【００５５】
ワクチンはＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、コンセンサス赤血球凝集素核酸配列の１又は複数を含む複数の同じ又は異なるプラスミドを含み得る。ＤＮＡワクチンは、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする１又は複数の核酸配列を含み得る。ＤＮＡワクチンが２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、そのような全配列が１つのプラスミド上に存在してもよく、そのような配列のそれぞれが異なるプラスミド上に存在してもよく、いくつかのプラスミドが１つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含んで、他のプラスミドが２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有してもよい。更に、ＤＮＡワクチンは、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼからなる群から選択される１又は複数のタンパク質の１又は複数のコンセンサスコード配列を更に含んでもよい。そのような付加的コード配列は、互いに異なり且つコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の１又は複数を含むプラスミドとは異なるプラスミド上に存在してもよく、同じプラスミド上に存在してもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザ抗原をコードする核酸配列をインフルエンザ抗原と組み合わせて含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、ＢＨＡ等の１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列は、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼからなる群から選択される１又は複数の１又は複数の他のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、ＢＨＡ等の１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼからなる群から選択される１又は複数の１又は複数の他のタンパク質を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡの１又は複数をコードするものを含む３つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＵ２、コンセンサスＢＨＡ、及びＨ３赤血球凝集素をコードするものを含む３つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＢＨＡ、Ｈ１赤血球凝集素、及びＨ３赤血球凝集素をコードするものを含む３つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、参照により本明細書に援用する米国特許出願第１２／３７５，５１８号及び／又は参照により本明細書に援用する米国特許出願第１２／２６９，８２４号に開示されている１又は複数のインフルエンザ抗原をコードする１又は複数の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２０をコードする核酸配列である配列番号１９（これは米国特許出願第１２／３７５，５１８号中でそれぞれ配列番号３７及び配列番号３６として開示されているＨ１赤血球凝集素である）及び／又は配列番号２２をコードする核酸配列である配列番号２１（これは米国特許出願第１２／２６９，８２４号中でそれぞれ配列番号１０及び配列番号９として開示されているＨ１赤血球凝集素である）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２４をコードする核酸配列である配列番号２３（これは米国特許出願第１２／２６９，８２４号中でそれぞれ配列番号１２及び配列番号１１として開示されているＨ３赤血球凝集素である）を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡの１又は複数を含む３つ以上のコンセンサス赤血球凝集素タンパク質の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＵ２、コンセンサスＢＨＡ、及びＨ３赤血球凝集素を含む３つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＢＨＡ、Ｈ１赤血球凝集素、及びＨ３赤血球凝集素を含む３つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、米国特許出願第１２／３７５，５１８号及び／又は米国特許出願第１２／２６９，８２４号の１又は複数の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２０及び／又は配列番号２２及び／又は配列番号２４を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、１）コンセンサス赤血球凝集素Ｕ２タンパク質及び／又はコンセンサス赤血球凝集素Ｕ２タンパク質をコードする核酸配列、２）コンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質及び／又はコンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質をコードする核酸配列、及び３）配列番号２４に開示されている赤血球凝集素Ｈ３タンパク質、の組合せを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、１）コンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質及び／又はコンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質をコードする核酸配列；２）配列番号２０及び／若しくは配列番号２２を有する赤血球凝集素Ｈ１タンパク質並びに／又は赤血球凝集素Ｈ１タンパク質をコードする核酸配列である配列番号１９及び／若しくは配列番号２１；及び３）配列番号２４を有する赤血球凝集素Ｈ３タンパク質及び／又はその中に赤血球凝集素Ｈ３タンパク質をコードする核酸配列である配列番号２３）の組合せを含む。
【００６１】
ＤＮＡワクチンが、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、及び同第５，６７６，５９４号に開示されている。ＤＮＡワクチンは、染色体に組み込まれることを防ぐエレメント又は試薬を更に含んでもよい。ワクチンは赤血球凝集素抗原のＲＮＡであり得る。ＲＮＡワクチンは細胞中に導入することができる。
【００６２】
ワクチンは、上記の遺伝子コンストラクト又は抗原を含む組換えワクチンであり得る。ワクチンはまた、１若しくは複数のタンパク質サブユニットの形態の１若しくは複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原、１若しくは複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む１若しくは複数の死菌インフルエンザ粒子、又は１若しくは複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む１若しくは複数の弱毒化インフルエンザ粒子を含み得る。弱毒化ワクチンは、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組換えベクターを用いるワクチン、弱毒化生菌ワクチン、及び死菌ワクチン、並びにサブユニットワクチン及び糖タンパク質ワクチンであり得る。弱毒化生菌ワクチン、外来抗原の送達に組換えベクターを用いたワクチン、サブユニットワクチン、及び糖タンパク質ワクチンの例が、それぞれを参照により本明細書に援用する米国特許第４，５１０，２４５号；同第４，７９７，３６８号；同第４，７２２，８４８号；同第４，７９０，９８７号；同第４，９２０，２０９号；同第５，０１７，４８７号；同第５，０７７，０４４号；同第５，１１０，５８７号；同第５，１１２，７４９号；同第５，１７４，９９３号；同第５，２２３，４２４号；同第５，２２５，３３６号；同第５，２４０，７０３号；同第５，２４２，８２９号；同第５，２９４，４４１号；同第５，２９４，５４８号；同第５，３１０，６６８号；同第５，３８７，７４４号；同第５，３８９，３６８号；同第５，４２４，０６５号；同第５，４５１，４９９号；同第５，４５３，３６４号；同第５，４６２，７３４号；同第５，４７０，７３４号；同第５，４７４，９３５号；同第５，４８２，７１３号；同第５，５９１，４３９号；同第５，６４３，５７９号；同第５，６５０，３０９号；同第５，６９８，２０２号；同第５，９５５，０８８号；同第６，０３４，２９８号；同第６，０４２，８３６号；同第６，１５６，３１９号、及び同第６，５８９，５２９号に記載されている。
【００６３】
ワクチンは、世界の特定の地域、例えばアジアのインフルエンザＡ血清型に対するベクター及び／又はタンパク質を含み得る。ワクチンは、現在はヒトに感染するブタ起源のインフルエンザＡ血清型に対するものであってよい。ワクチンは、世界の特定の地域のインフルエンザＢに対するベクター及び／又はタンパク質を含み得る。ワクチンは、ヒトに感染するインフルエンザＢに対するものであってよい。ワクチンは、インフルエンザＡ及び／又はＢの１又は複数の株に対する１若しくは複数のベクター及び／又は１若しくは複数のタンパク質を含んでもよい。
【００６４】
提供されるワクチンは、治療的又は予防的免疫応答を含む免疫応答を惹起するために使用され得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原に対して、また、インフルエンザウイルスの複数のサブタイプに対して幅広く、抗体及び／又はキラーＴ細胞が作製され得る。そのような抗体及び細胞を単離してもよい。
【００６５】
ワクチンは、薬学的に許容される医薬品添加物（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を更に含んでもよい。薬学的に許容される医薬品添加物は、機能的分子、例えばビヒクル、アジュバント、キャリア、又は希釈剤であり得る。薬学的に許容される医薬品添加物は、トランスフェクション促進剤であってもよく、それには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）等の表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレン及びスクアレン等の小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、又はナノ粒子、又はその他の公知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
【００６６】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）、又は脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸はワクチン中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。トランスフェクション促進剤には、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）等の表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレン及びスクアレン等の小胞も含まれ得、ヒアルロン酸を遺伝子コンストラクトと組み合わせて投与することもできる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームを含むリポソーム、又はＤＮＡ−リポソーム混合物等の当該技術分野で公知のその他のリポソーム（例えば国際公開第９３２４６４０号参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、又はナノ粒子、又はその他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）、又は脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、又は０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００６７】
薬学的に許容される医薬品添加物はアジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミド中で発現される他の遺伝子であってもよく、あるいはワクチン中で上記プラスミドと組み合わされたタンパク質として送達される。アジュバントは以下からなる群から選択され得る：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因ケモカイン（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ−ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ：ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｈｙｍｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ：ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナルペプチドを欠失し且つＩｇＥ由来シグナルペプチドを含んでもよいＩＬ−１５を含む）。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、又はその組合せであり得る。
【００６８】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、以下をコードするものが含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体形態のＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びその機能的断片。
【００６９】
ワクチンは、参照により全体を本明細書に援用する１９９４年４月１日付で提出された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されている遺伝子ワクチン促進因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ａｇｅｎｔ）を更に含んでよい。
５．送達方法
インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を惹起し得る特に効果的な免疫原とするためのエピトープを含む赤血球凝集素抗原の遺伝子コンストラクト及びタンパク質を提供するための医薬製剤、好ましくはワクチンを送達する方法を提供する。ワクチン送達方法は又はワクチン接種方法は、治療的及び／又は予防的免疫応答を惹起するようになされ得る。ワクチン接種プロセスは、哺乳動物において、２００９ブタ起源Ｈ１Ｎ１等のＨ１Ｎ１血清型、又は他の季節性及び／若しくはパンデミックの種類を含む複数のインフルエンザサブタイプに対する免疫応答を生じさせることができる。ワクチンは、哺乳動物の免疫系の活性を調節して免疫応答を高めるように個体へと送達され得る。ワクチンの送達は、細胞中で発現されて細胞表面（この上で免疫系に認識されて細胞性、体液性、又は細胞性及び体液性の応答を惹起する）に送達される核酸分子としてのＨＡ抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの送達を用いて、本明細書に記載のワクチンを哺乳動物に投与することにより、哺乳動物において複数のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を惹起又は誘発することができる。
【００７０】
哺乳動物へのワクチン送達後、ベクターが哺乳動物の細胞内に入った後、トランスフェクト細胞は、コンセンサス抗原、好ましくはＨ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡの少なくとも１つを含む、対応するインフルエンザタンパク質を発現及び分泌する。これらの分泌タンパク質、又は合成抗原は、免疫系により異物として認識され、抗原に対する抗体の産生及び抗原に特異的なＴ細胞応答を含み得る免疫応答を開始させる。いくつかの例では、本明細書に記載のワクチンの予防接種を受けた哺乳動物は、初回刺激された免疫系を有し、インフルエンザウイルス株に暴露された時、この初回刺激された免疫系により、その後のインフルエンザウイルスを、体液性、細胞性、又はその両方により、迅速に排除することができる。ワクチンは、個体の免疫系の活性を調節することにより免疫応答を亢進するように個体に送達され得る。
【００７１】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンの形態で送達され得、ＤＮＡワクチンを送達する方法は、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，０３６，００６号に記載されている。
【００７２】
ワクチンは、哺乳動物において免疫応答を誘発するように哺乳動物に投与され得る。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、又はニワトリ、好ましくはヒト、雌ウシ、ブタ、又はニワトリであり得る。
ａ．併用処置
医薬組成物、好ましくは、ワクチンは、１又は複数の他のインフルエンザタンパク質又は以下をコードする遺伝子と組み合わせて投与され得る：インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼ。ワクチンは、アジュバントをコードする遺伝子又はタンパク質と組み合わせて投与され得、アジュバントとしては以下が含まれ得る：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体形態のＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、又はＴＡＰ２、又はその機能的断片。
ｂ．投与経路
ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入、頬側投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内くも膜下腔内、及び関節内、又はその組合せを含む種々の経路で投与され得る。獣医用途では、組成物は、通常の獣医学的実務に従う好適で許容可能な製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適した投与計画及び投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子銃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、又は他の物理的方法、例えば電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、又は超音波により投与され得る。
【００７３】
ワクチンのベクターは、複数の周知の技術、例えば、生体内電気穿孔、リポソーム仲介、ナノ粒子促進、組換えベクター（組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、組換えワクシニア等）、を使用する又は使用しないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種ともいう）により哺乳動物に送達され得る。ＨＡ抗原は、生体内電気穿孔及びＤＮＡ注入により送達され得る。
ｃ．電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔によるワクチン投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送出するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスはユーザーにより入力された予め設定された電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント及び電極アセンブリー又はハンドルアセンブリーを含み得る。電気穿孔コンポーネントには、コントローラー、定波形ジェネレーター、インピーダンステスター、波形ロガー、入力要素、状態報告要素、通信ポート、メモリーコンポーネント、電源、及びパワースイッチを含む電気穿孔装置の種々の要素の１又は複数が含まれ得る。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化する生体内電気穿孔装置、例えばＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標） ＥＰシステム（ＶＧＸファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）又はＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ジェネトロニクス社（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）製、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて達成され得る。
【００７４】
電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の１つの要素として機能してよく、他の要素は電気穿孔コンポーネントと通信する別個の要素（又はコンポーネント）である。電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能してよく、電気穿孔コンポーネントとは別個の電気穿孔装置の更なる別の要素と通信してよい。１つの電気機械的又は機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、１つの装置として又は互いに通信する別個の要素として機能し得る要素に限定されなくてもよい。電気穿孔コンポーネントは、所望の組織において定電流を生み出すエネルギーパルスを送出することができ得、フィードバック機構を含む。電極アセンブリーは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含んでよく、電極アセンブリーは、電気穿孔コンポーネントからのエネルギーパルスを受け取り、電極を介してそれを所望の組織に送出する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルス送出中、中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、電気穿孔コンポーネントにインピーダンスを伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けることができ、電気穿孔コンポーネントにより送出されるエネルギーパルスを調整して定電流を維持することができる。
【００７５】
複数の電極がエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。複数の電極は、ユーザーによって電気穿孔コンポーネントに入力されたプログラムシーケンス下において電極の制御によりエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。プログラムシーケンスは、シーケンス中に送出される複数のパルスを含み得、複数のパルスの各パルスは、電極の１つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極によって送出され、複数のパルスの次のパルスは、電極の１つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極の異なる１つによって送出される。
【００７６】
フィードバック機構は、ハードウェア又はソフトウェアによって実行され得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実行され得る。フィードバックは５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、又は１μｓ毎に起こるが、好ましくはリアルタイムフィードバック又は即時的（すなわち、応答時間を測定するための利用可能な技術による決定で実質的に即時的）である。中性電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定することができ、インピーダンスをフィードバック機構へと伝達し、フィードバック機構はこのインピーダンスに応答して、予め設定された電流に近い値に定電流を維持するようにエネルギーのパルスを調整する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送出中、定電流を連続的且つ即時的に維持し得る。
【００７７】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を容易にし得る電気穿孔装置及び電気穿孔法の例としては、その内容全体を参照により本明細書に援用するDraghia-Akli, et al.の米国特許第７，２４５，９６３号、Smith, et al.により提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれる。ＤＮＡワクチンの送達を容易にするために使用され得るその他の電気穿孔装置及び電気穿孔方法としては、同時係属中であり且つ共同で所有されている、２００７年１０月１７日付で提出された米国特許出願第１１／８７４０７２号に記載されているものが含まれ、同特許出願は、２００６年１０月１７日付で提出された米国仮出願第６０／８５２，１４９号及び２００７年１０月１０日付で提出された同第６０／９７８，９８２号に対してアメリカ合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものである。これらの全ての全体を参照により本明細書に援用する。
【００７８】
Draghia-Akli,et al.の米国特許第７，２４５，９６３号は、身体又は植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を容易にするためのモジュール電極システム及びその使用を記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極と、皮下注射針と、プログラム可能な定電流パルスコントローラーから複数の針電極へと導電リンクを形成する電気コネクターと、電源とを備え得る。オペレーターは、支持構造体に装着されている複数の針電極を把持して、それらを身体又は植物の選択された組織中に確実に挿入することができる。次いで、皮下注射針により、選択された組織中に生体分子が送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラーが作動され、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への生体分子の導入を容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【００７９】
Smith,et al.により提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、身体又は植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を効果的に容易にするために使用可能な電気穿孔装置を記載している。電気穿孔装置は、その動作がソフトウェア又はファームウェアによって定められる導電装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。ＥＫＤ装置は、ユーザーによる制御及びパルスパラメーターの入力に基づいて、アレイ状の電極間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存及び取得を可能にする。また、電気穿孔装置は、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスクと、注射針用の中央注射チャネルと、取り外し可能なガイドディスクとを備える。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【００８０】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極アレイ及び方法は、筋肉等の組織だけでなく他の組織又は臓器中への深部透過にも適合し得る。電極アレイの構成により、（選択された生体分子を送達するための）注射針も標的臓器中に完全に挿入され、電極によって予め輪郭付けられた領域で、注入物が標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極は、好ましくは長さ２０ｍｍ、２１ゲージである。
【００８１】
更に、電気穿孔装置及びその使用を含むいくつかの実施形態では、以下の特許に記載されている電気穿孔装置が想定される：１９９３年１２月２８日に付与された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に付与された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に付与された同第６，２６１，２８１号、及び２００５年１０月２５日に付与された同第６，９５８，０６０号、及び２００５年９月６日に付与された同第第６，９３９，８６２号。更に、種々の装置のいずれかを用いたＤＮＡの送達に関する２００４年２月２４日に付与された米国特許第６，６９７，６６９号及びＤＮＡの導入方法に関する２００８年２月５日に付与された米国特許第７，３２８，０６４号で提供されている主題をカバーする特許も本明細書の想定内である。上記特許の全体を参照により本明細書に援用する。
ｄ．ワクチンの製造方法
本明細書に記載のＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドの調製方法を提供する。ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物用発現プラスミド中への最後のサブクローニングステップ後、当該技術分野で公知の方法を用いて大規模発酵タンク中の細胞培養液への接種に使用することができる。
【００８２】
本発明のＥＰ装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、公知の装置及び技術を組み合わせて用いることにより処方又は製造することができるが、好ましくは、ライセンスされた、２００７年５月２３日付で提出された同時係属中の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で処方され得る。また、製造技術には、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているものに加え、当業者に一般的に知られている種々の装置及びプロトコールが含まれ、ライセンスされた、２００７年７月３日に付与された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものも含まれる。上記の出願及び特許、それぞれ米国特許出願第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号の全体を参照により本明細書に援用する。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を用いて本発明を更に説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載されるものと理解されるべきである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更例及び改変例を作ることができる。したがって、本明細書中に示され説明されているものに加え、本発明の種々の改変例が上記の説明から当業者には明らかである。そのような改変例も特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図される。
【００８４】
（実施例１）
ｐＧＸ２００９（ｐＨ１ＨＡ０９）−２００９Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（ブタインフルエンザ）赤血球凝集素抗原をコードするプラスミド
ｐＧＸ２００９（Ｈ１ＨＡ０９）の骨格は、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある改変発現ベクターｐＶＡＸ１（インビトロジェン社製、カリフォルニア州カールズバッド）である。元のｐＶＡＸ１はインビトロジェン社から購入し（カタログ番号Ｖ２６０−２０）、−２０℃に維持した。前述のとおり、配列分析により、ｐＧＸ２００９の骨格として使用するｐＶＡＸ１の配列とインビトロジェン社から入手可能なｐＶＡＸ１配列との間の差を明らかにした。差は前述の通りである。
【００８５】
プラスミドｐＧＸ２００９（ｐＨ１ＨＡ０９ともいう）は、コンセンサス２００９Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（ブタインフルエンザ）赤血球凝集素分子をコードする核酸配列を含む。コンセンサス配列を生成するために使用した７９個の一次配列はインフルエンザ配列データベースから選択した。
【００８６】
種々のインフルエンザＡ赤血球凝集素Ｈ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及びヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の寄託番号はＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける以下の寄託番号に対応する。括弧内にない寄託番号はヌクレオチド配列及びそれらによりコードされるアミノ酸配列の更なる一覧を開示している。括弧内の寄託番号は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース中の対応するアミノ酸配列のエントリーのものである。寄託番号は以下の通りである：ＧＱ３２３５７９．１（ＡＣＳ７２６５７．１）、ＧＱ３２３５６４．１（ＡＣＳ７２６５４．１）、ＧＱ３２３５５１．１（ＡＣＳ７２６５２．１）、ＧＱ３２３５３０．１（ＡＣＳ７２６５１．１）、ＧＱ３２３５２０．１（ＡＣＳ７２６５０．１）、ＧＱ３２３４９５．１（ＡＣＳ７２６４８．１）、ＧＱ３２３４８９．１（ＡＣＳ７２６４７．１）、ＧＱ３２３４８６．１（ＡＣＳ７２６４６．１）、ＧＱ３２３４８３．１（ＡＣＳ７２６４５．１）、ＧＱ３２３４５５．１（ＡＣＳ７２６４１．１）、ＧＱ３２３４５１．１（ＡＣＳ７２６４０．１）、ＧＱ３２３４４３．１（ＡＣＳ７２６３８．１）、ＧＱ２９３０７７．１（ＡＣＳ６８８２２．１）、ＧＱ２８８３７２．１（ＡＣＳ５４３０１．１）、ＧＱ２８７６２５．１（ＡＣＳ５４２６２．１）、ＧＱ２８７６２７．１（ＡＣＳ５４２６３．１）、ＧＱ２８７６２３．１（ＡＣＳ５４２６１．１）、ＧＱ２８７６２１．１（ＡＣＳ５４２６０．１）、ＧＱ２８６１７５．１（ＡＣＳ５４２５８．１）、ＧＱ２８３４８８．１（ＡＣＳ５００８８．１）、ＧＱ２８０７９７．１（ＡＣＳ４５０３５．１）、ＧＱ２８０６２４．１（ＡＣＳ４５０１７．１）、ＧＱ２８０１２１．１（ＡＣＳ４５１８９．１）、ＧＱ２６１２７７．１（ＡＣＳ３４９６８．１）、ＧＱ２５３４９８．１（ＡＣＳ２７７８７．１）、ＧＱ３２３４７０．１（ＡＣＳ７２６４３．１）、ＧＱ２５３４９２．１（ＡＣＳ２７７８０．１）、ＦＪ９８１６１３．１（ＡＣＱ５５３５９．１）、ＦＪ９７１０７６．１（ＡＣＰ５２５６５．１）、ＦＪ９６９５４０．１（ＡＣＰ４４１８９．１）、ＦＪ９６９５１１．１（ＡＣＰ４４１５０．１）、ＦＪ９６９５０９．１（ＡＣＰ４４１４７．１）、ＧＱ２５５９００．１（ＡＣＳ２７７７４．１）、ＧＱ２５５９０１．１（ＡＣＳ２７７７５．１）、ＦＪ９６６９７４．１（ＡＣＰ４１９５３．１）、ＧＱ２６１２７５．１（ＡＣＳ３４９６７．１）、ＦＪ９６６９６０．１（ＡＣＰ４１９３５．１）、ＦＪ９６６９５２．１（ＡＣＰ４１９２６．１）、ＦＪ９６６０８２．１（ＡＣＰ４１１０５．１）、ＧＱ２５５８９７．１（ＡＣＳ２７７７０．１）、ＣＹ０４１６４５．１（ＡＣＳ２７２４９．１）、ＣＹ０４１６３７．１（ＡＣＳ２７２３９．１）、ＣＹ０４１６２９（ＡＣＳ２７２２９．１）、ＧＱ３２３４４６．１（ＡＣＳ７２６３９．１）、ＣＹ０４１５９７．１（ＡＣＳ２７１８９．１）、ＣＹ０４１５８１．１（ＡＣＳ１４７２６．１）、ＣＹ０４０６５３．１（ＡＣＳ１４６６６．１）、ＣＹ０４１５７３．１（ＡＣＳ１４７１６．１）、ＣＹ０４１５６５．１（ＡＣＳ１４７０６．１）、ＣＹ０４１５４１．１（ＡＣＳ１４６７６．１）、ＧＱ２５８４６２．１（ＡＣＳ３４６６７．１）、ＣＹ０４１５５７．１（ＡＣＳ１４６９６．１）、ＣＹ０４１５４９．１（ＡＣＳ１４６８６．１）、ＧＱ２８３４８４．１（ＡＣＳ５００８４．１）、ＧＱ２８３４９３．１（ＡＣＳ５００９５．１）、ＧＱ３０３３４０．１（ＡＣＳ７１６５６．１）、ＧＱ２８７６１９．１（ＡＣＳ５４２５９．１）、ＧＱ２６７８３９．１（ＡＣＳ３６６３２．１）、ＧＱ２６８００３．１（ＡＣＳ３６６４５．１）、ＣＹ０４１６２１．１（ＡＣＳ２７２１９．１）、ＣＹ０４１６１３．１（ＡＣＳ２７２０９．１）、ＣＹ０４１６０５．１（ＡＣＳ２７１９９．１）、ＦＪ９６６９５９．１（ＡＣＰ４１９３４．１）、ＦＪ９６６９８２．１（ＡＣＰ４１９６３．１）、ＣＹ０３９５２７．２（ＡＣＱ４５３３８．１）、ＦＪ９８１６１２．１（ＡＣＱ５５３５８．１）、ＦＪ９８１６１５．１（ＡＣＱ５５３６１．１）、ＦＪ９８２４３０．１（ＡＣＱ５９１９５．１）、ＦＪ９９８２０８．１（ＡＣＱ７３３８６．１）、ＧＱ２５９９０９．１（ＡＣＳ３４７０５．１）、ＧＱ２６１２７２．１（ＡＣＳ３４９６６．１）、ＧＱ２８７６２１．１（ＡＣＳ５４２６０．１）、ＧＱ２９００５９．１（ＡＣＳ６６８２１．１）、ＧＱ３２３４６４．１（ＡＣＳ７２６４２．１）、ＧＱ３２３４７３．１（ＡＣＳ７２６４４．１）、ＧＱ３２３５０９．１（ＡＣＳ７２６４９．１）、ＧＱ３２３５６０．１（ＡＣＳ７２６５３．１）、ＧＱ３２３５７４．１（ＡＣＳ７２６５５．１）、及びＧＱ３２３５７６．１（ＡＣＳ７２６５６．１）。アミノ酸配列はＮＣＢＩ配列データベースからダウンロードされ、アラインメント及びコンセンサス配列はＣｌｕｓｔａｌ Ｘを用いて作製した。発現を容易化するために、非常に効率的なリーダー配列であるＩｇＥリーダーを開始コドンの上流にインフレームで融合させた。より高レベルで発現させるために、この融合遺伝子のコドン使用頻度をヒト遺伝子のコドン偏位（ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ）に適合させた。更に、ＲＮＡの最適化も行った。すなわち、ＧＣ含量が非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）領域及び内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位等のシス作用性配列モチーフを避けた。全体配列はジーンアート社（Ｇｅｎｅａｒｔ）（ドイツ、レーゲンスブルク）で合成により作製された。改変された合成Ｈ１ＨＡ０９遺伝子は、長さが１８１８ｂｐであり（配列番号１）、ジーンアート社により、ＢａｍＨ１とＸｈｏＩの部位でｐＶＡＸ１にクローニングされた（図２）。
【００８７】
（実施例２）
インフルエンザｐＧＸ２００９免疫化フェレットのＡ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９暴露
暴露実験は、インフルエンザの好ましいモデルであるフェレットを用いて行った。フェレットをプラスミドｐＧＸ２００９を用いて免疫化した。
【００８８】
動物：４群×５頭／群及び４頭の対照群＝合計２４フェレット（雄）
期間：１８週間（暴露含む）
用量：．２ｍｇプラスミド
プロトコール概要：フェレットをＤＮＡワクチン群にランダムに割り振った。動物を実験０日目、２８日目、及び５６日目に免疫化した。承認されている麻酔プロトコールに従い、ケタミン／ミダゾラムカクテル、イソフルラン、又は同等物を用いて、動物に麻酔をかけ、インフルエンザＤＮＡワクチンの組合せを用いて筋肉内（ＩＭ）へのワクチン接種を行った。第１群及び第２群は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応定電流電気穿孔（ＥＰ）装置を０．５Ａｍｐ、５２ミリ秒パルス、パルス間０．２ｓｅｃ、発火遅延４ｓｅｃ、合計３パルスで用いて、すぐに電気穿孔した。対照動物は未処置（ｎａｉｖｅ）対照とした（プラスミドなし、ＥＰなし）。フェレットは、ケージ中で麻酔から回復させ、２４時間注意深く監視して確実に完全に回復させた。
【００８９】
餌及び水は実験期間中自由に摂取させた。８４日目に、１ｍｌのＭＸ１０（Ａ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９；５×１０５ＰＦＵ／ｍｌ）を用いて鼻腔内感染により動物を暴露した。確立及び承認されたスコアシートを用いて、動物の臨床徴候（体重、温度等）を毎日監視した。感染後１、３、６、９、及び１５日目（ｄｐｉ）に、鼻洗浄物及び直腸スワブを回収した。肺を１５日目に回収した。サンプルを適宜、リアルタイムＰＣＲによりウイルス負荷を調べるためのＲＮＡｌａｔｅｒ、感染性ウイルスを調べるための培地（ＴＣＤＩ５０）、及び組織学的検査のためのホルマリンに保管した。
【００９０】
図４は、免疫化したフェレット（３回免疫化）の血清を用いて行った赤血球凝集抑制試験を示す図である。タイターが＞１：４０であるものを「保護的」と見なした。点線は１：４０のマークを示す。３回免疫化後では全ての動物が１：４０のマークを超えていた。図５は、免疫化されたフェレット及び免疫化されなかったフェレットを新規なＨ１Ｎ１株ＭＸ１０（Ａ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９）に暴露した結果を示す。免疫化されたフェレットは全て生存したが、未処置フェレットは１５日の期間内に７５％が死亡した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたインフルエンザウイルスワクチン、インフルエンザに対する免疫応答を惹起する改良された方法、ワクチン接種を受けたインフルエンザ哺乳動物宿主対感染したインフルエンザ哺乳動物宿主を診断するため並びにインフルエンザに対して個体を予防的及び／又は治療的に免疫化するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスにより引き起こされる感染症である。インフルエンザウイルスは、トリ及び哺乳動物に感染する。オルトミクソウイルス科の５つの属のうちの３つがインフルエンザウイルスである：インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びインフルエンザＣ。これらのうち、インフルエンザＡが最も一般的である。
【０００３】
インフルエンザは通常、咳又はくしゃみにより生じたエアロゾル中の空気を介して及びウイルスを含む体液又は汚染された表面との直接接触により伝染する。インフルエンザの季節的流行は世界中で発生し、１年に数十万人が死亡する。年によっては、パンデミックが起こり、数百万人が死亡する。更に、家畜（特に家禽類及びブタ）も、年に一度の流行及び時々起こるパンデミックを受けやすく、多数の動物が死に、大きな金銭的損失が生じる。
【０００４】
インフルエンザウイルスは構造的に似ており、同様な分子成分で構成される約８０〜１２０ｎｍのほぼ球状又は繊維状のウイルス粒子を有する。ウイルスタンパク質及びウイルスＲＮＡを含む中心コアは、ウイルス粒子が産生される細胞に由来する１つの脂質コート及び２つの異なる糖タンパク質で構成されるウイルスエンベロープに囲まれている。ウイルスエンベロープ内には更に２つの異なる糖タンパク質が固定されており、これらは表面上で外側に向かって突出した部分を含む。
【０００５】
インフルエンザウイルスＲＮＡゲノムは通常、８個の異なる一本鎖マイナス鎖ＲＮＡセグメントとして与えられ、これらが１１個のタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２）をコードするゲノムの１１個のウイルス遺伝子を構成している。８個のＲＮＡセグメントは以下の通りである：１）赤血球凝集素をコードするＨＡ（１個のビリオンを作るのに約５００分子の赤血球凝集素が必要）；２）ノイラミニダーゼをコードするＮＡ（１個のビリオンを作るのに約１００分子のノイラミニダーゼが必要）；３）核タンパク質をコードするＮＰ；４）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いて２個のマトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）をコードするＭ（１個のビリオンを作るのに約３０００個のマトリックスタンパク質分子が必要）；５）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いて２個の別個の非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＥＰ）をコードするＮＳ；６）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＡ；７）同じＲＮＡセグメントの異なる読み枠を用いてＲＮＡポリメラーゼ及びＰＢ１−Ｆ２タンパク質（アポトーシスを誘導する）をコードするＰＢ１；及び８）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＢ２。
【０００６】
これら１１個のタンパク質のうち、赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、ウイルスエンベロープ中に固定されてウイルス粒子の外面に存在する２つの大きな糖タンパク質である。これらのタンパク質は、インフルエンザに対する免疫応答の免疫原となる。ＨＡは、標的細胞へのウイルスの結合及び標的細胞中へのウイルスゲノムの侵入を仲介するレクチンであり、単一遺伝子産物ＨＡ０として発現され、その後、宿主のプロテアーゼによりプロセシングされて２個のサブユニットＨＡ１及びＨＡ２を生じ、これらは一緒になってインフルエンザウイルス粒子表面上で複合体を形成する。ＮＡは、感染細胞中で新たに産生された成熟ウイルス粒子の放出に関与する。
【０００７】
インフルエンザＡウイルスには１６個のＨＡ血清型及び９個のＮＡ血清型が知られている。ウイルス粒子中に存在する異なる血清型を特定することによりウイルスは通常記述される。例えば、Ｈ１Ｎ１は、ＨＡ血清型がＨ１、ＮＡ血清型がＮ１のインフルエンザウイルスであり、Ｈ５Ｎ１は、ＨＡ血清型がＨ５、ＮＡ血清型がＮ１のインフルエンザウイルスである。Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３血清型並びにＮ１及びＮ２血清型だけが通常ヒトに感染する。
【０００８】
インフルエンザ株は通常、種又は属に特異的である。すなわち、ブタに感染できるインフルエンザ株（ブタインフルエンザウイルス）は通常、ヒト又はトリには感染せず、トリに感染できるインフルエンザ株（トリインフルエンザウイルス）はヒト又はブタに感染せず、ヒトに感染できるインフルエンザ株（ヒトインフルエンザウイルス）はトリ又はブタに感染しない。しかし、インフルエンザ株は、変異して、１つの種から別の種に感染可能になることがある。例えば、ブタにだけ感染する株（ブタインフルエンザ）が、変異又は組換えにより、ヒトだけ又はブタ及びヒトの両方に感染できる株になることがある。「ブタインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前はブタに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株（Ｈ１Ｎ１株等）である（すなわち、ブタインフルエンザウイルスはブタ起源ヒトインフルエンザ又はブタ由来ヒトインフルエンザである）。「トリインフルエンザ」と一般的に呼ばれるインフルエンザウイルスは、ヒトに感染できる、以前にトリに特異的であった株に由来するインフルエンザウイルス株（Ｈ５Ｎ１株等）である（すなわちトリインフルエンザウイルスはトリ起源ヒトインフルエンザ又はトリ由来ヒトインフルエンザである）。
【０００９】
先進国の多くの人及び時には家畜に、インフルエンザに対するワクチン接種が季節的に行われる。ワクチンによって惹起される免疫応答は特定のサブタイプのウイルスに特異的なため、使用されるワクチンの保護効果は限定的である。毎年、その年にどの種類及び株のウイルスが循環するかについての国際的調査及び科学者の予測に基づいて、異なるインフルエンザワクチンが開発及び投与される。ウイルスは、セグメントの変異、組換え、及び再構築により大きく変化する。したがって、ある年に与えられたワクチンは、翌年に広く伝染する季節性の株に対して保護効果を有しないと考えられる。
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アメリカ疾病管理予防センターが一般に奨励する「インフルエンザ予防接種（ｆｌｕ ｓｈｏｔ）」は通常３種類の死菌／不活化インフルエンザウイルス、すなわち１つのＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、１つのＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、及び１つのＢウイルスを含む。そのため、サブタイプの予測及びそのサブタイプに対する特異的ワクチンの利用可能性によりワクチン接種が制限されていることは明らかである。
【００１０】
動物及びヒト疾患に対するワクチン接種のための核酸配列の直接投与が研究され、所望の抗原の必要な発現を得、それによる免疫原性反応を得るため、そして究極的にはこの技術を成功させるために、効果的且つ効率的な核酸送達手段に多くの努力がなされてきた。
【００１１】
ＤＮＡワクチンには、生菌弱毒ウイルス及び組換えタンパク質ベースのワクチンを初めとする従来のワクチン接種法と比べて多くの概念的利点がある。ＤＮＡワクチンは、ヒトにおいて安全であり、安定であり、生産が容易であり、認容性が高く（ｗｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）、前臨床試験でプラスミドの組込みを示す証拠がほとんどない［非特許文献１及び２］。更に、ＤＮＡワクチンは、ベクターに対する予め存在する抗体の力価にワクチンの有効性が影響されないため、反復投与に非常に適している［非特許文献３］。しかし、より大きな動物に移る時にプラットフォームの免疫原性が低下することが、ＤＮＡワクチンを臨床導入する際の大きな障害の１つであった［非特許文献４］。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、免疫グロブリンリーダー配列の付加等のＤＮＡワクチン免疫原の改良における近年の技術的進歩［非特許文献５〜８］及び近年開発された電気穿孔等のプラスミド送達システムにおける技術［非特許文献９〜１１］により、ＤＮＡワクチンの発現及び免疫原性が向上している。更に、コンセンサス免疫原を使用することで天然抗原のみの場合と比べて細胞性免疫応答の幅を広げることができることが研究により示唆されている［非特許文献１２及び１３］。
【００１２】
プラスミドＤＮＡ等の核酸配列を送達する方法の１つは電気穿孔（ＥＰ）技術である。この技術は、ブレオマイシン等の抗がん薬を送達するためのヒト臨床試験及び多数の動物種における多くの前臨床試験において使用されてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Martin,T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integrationafter intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68
【非特許文献２】Nichols,W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N YAcad Sci, 1995. 772: p. 30-9
【非特許文献３】Chattergoon,M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines andimmune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63
【非特許文献４】Liu,M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet,2005. 55: p. 25-40
【非特許文献５】Andre,S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with asynthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p.1497-503
【非特許文献６】Deml,L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression andimmunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiencyvirus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001
【非特許文献７】Laddy,D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines againstavian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9
【非特許文献８】Frelin,L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances theimmunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther,2004. 11(6): p. 522-33
【非特許文献９】Hirao,L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improvesplasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine,2008. 26(3): p. 440-8
【非特許文献１０】Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivoelectroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesusmacaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69
【非特許文献１１】Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances theimmunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased localDNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells.J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53
【非特許文献１２】Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by anengineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther,2007. 15(2): p. 411-21
【非特許文献１３】Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestralcenter-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007.81(16): p. 8507-14
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
免疫原性インフルエンザコンセンサス赤血球凝集素タンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸コンストラクト、及びインフルエンザの複数の株に対する免疫応答を惹起するのに有用な組成物に対するニーズが依然として存在する。個体を処置するための、経済的であり且つ多くのインフルエンザサブタイプに有効な、インフルエンザに対する効果的なワクチンに対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下からなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する：配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号３；配列番号３に９５％相同な核酸配列；配列番号３の断片；配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号６；配列番号６に９５％相同な核酸配列；配列番号６の断片；配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号９、配列番号９に９５％相同な核酸配列；配列番号９の断片；配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１１、配列番号１１に９５％相同な核酸配列；配列番号１１の断片；配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１３；配列番号１３に９５％相同な核酸配列；配列番号１３の断片；配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；及び配列番号１５；配列番号１５に９５％相同な核酸配列；配列番号１５の断片；配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列。
【００１６】
また、本発明は、ａ）配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号３；配列番号３に９５％相同な核酸配列；配列番号３の断片；配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号６；配列番号６に９５％相同な核酸配列；配列番号６の断片；配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号９；配列番号９に９５％相同な核酸配列；配列番号９の断片；配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１１；配列番号１１に９５％相同な核酸配列；配列番号１１の断片；配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１３；配列番号１３に９５％相同な核酸配列；配列番号１３の断片；配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；配列番号１５；配列番号１５に９５％相同な核酸配列；配列番号１５の断片；及び配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列、の１又は複数からなる群から選択される第１の核酸配列と、ｂ）インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、及びその断片の１又は複数からなる群から選択されるタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明のいくつかの態様では、そのような核酸分子及び／又は組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様では、感染から個体を保護する方法が提供される。方法は、前記個体にそのような核酸配列又は組成物を含む予防有効量の核酸分子を投与するステップを含み、核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、前記核酸配列によってコードされるタンパク質に対する防御免疫応答が惹起される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ブタ起源ヒトインフルエンザに対する防御免疫応答である。
【００１９】
本発明のいくつかの態様では、インフルエンザに感染した個体を処置する方法が提供される。方法は、前記個体に、治療有効量のそのような核酸分子及び／又は組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ブタ起源ヒトインフルエンザに対する治療的免疫応答である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２９９９塩基対の骨格ベクタープラスミドｐＶＡＸ１（インビトロジェン社製、カリフォルニア州カールズバッド）のマップを示す図である。ＣＭＶプロモーターが塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミング部位が塩基６６４〜６８３にある。マルチクローニングサイトが塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルが塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子が塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣオリジンが塩基２３２０〜２９９３にある。
【００２１】
インビトロジェン社から入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づき、ｐＧＸ２００９の骨格として使用されたｐＶＡＸ１の配列中に以下の変異が見つかった：
Ｃ＞Ｇ ２４１ ＣＭＶプロモーター中
Ｃ＞Ｔ １９４２ 骨格、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）の下流
Ａ＞− ２８７６ 骨格、カナマイシン遺伝子の下流
Ｃ＞Ｔ ３２７７ ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）多コピー変異中（Nucleic Acid Research 1985参照）
Ｇ＞Ｃ ３７５３ ＲＮＡＳｅＨ部位の上流のｐＵＣ Ｏｒｉの末端中
塩基対２、３、及び４は、ＣＭＶプロモーター上流の骨格中でＡＣＴからＣＴＧに変化している。
【図２】ｐＨ１ＨＡ０９とも呼ばれるプラスミドｐＧＸ２００９の２つのマップを示す図である。プラスミドｐＧＸ２００９（配列番号５）の核酸配列は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号１にコードされるアミノ酸配列番号２）並びにそのＮ末端に連結されたＩｇＥリーダー（アミノ酸配列番号１７）及びＣ末端に連結されたＨＡタグ（配列番号１８）を含む、コンセンサスＨ１タンパク質コンストラクト（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）のコード配列を含む。コンセンサスＨ１タンパク質（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）はＳｗｉＨｕｍ Ｃｏｎ ＨＡ及びＨ１ＨＡ０９とラベルされている。
【図３】プラスミドｐＧＸ２００６のマップを示す図である。プラスミドｐＧＸ２００６の核酸配列（配列番号８）は、Ｈ２ＨＡとラベルされたコンセンサスＨ２タンパク質（配列番号６によりコードされるアミノ酸配列番号７）のコード配列を含む。
【図４】免疫化したフェレットの血清を用いて行った赤血球凝集抑制試験から得られたデータを示す図である。
【図５】新規なＨ１Ｎ１株で免疫化された又は免疫化されていないフェレットの暴露結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
インフルエンザＡのＨ１及びＨ２それぞれのコンセンサスアミノ酸配列（本明細書中でそれぞれ「コンセンサスＨ１」（配列番号２）及び「コンセンサスＨ２」（配列番号７）と呼ばれる）、並びに新規な合成ハイブリッドコンセンサスＨ１インフルエンザＡ赤血球凝集素アミノ酸配列（本明細書中で「コンセンサスＵ２」（配列番号１０）と呼ばれる）及びインフルエンザＢ赤血球凝集素のコンセンサスアミノ酸配列（本明細書中で「コンセンサスＢＨＡ」（配列番号１３）と呼ばれる）が提供され、これはインフルエンザから哺乳動物を保護することができる。更に、コンセンサスＨ１アミノ酸配列、コンセンサスＨ２アミノ酸配列、コンセンサスＵ２アミノ酸配列、及び／又はコンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの態様では、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（例えば（配列番号１）又は（配列番号３））、コンセンサスＨ２アミノ酸配列（例えば（配列番号６））、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（例えば（配列番号９）又は（配列番号１１））、及び／又はコンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（例えば（配列番号１３）又は（配列番号１５））を含むタンパク質をコードする核酸配列が提供される。
【００２３】
理論により限定されるものではないが、複数のインフルエンザサブタイプに対して幅広く免疫応答（体液性、細胞性、又は両方）を誘導するために使用できるワクチンは、以下の１又は複数を含み得る：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質；３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質；５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質；７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００２４】
以下の構成要素の２以上を使用して及び／又は組み合せて、免疫化方法を行い、ワクチンを製造することができる：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質；３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質；５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質、７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。インフルエンザに対するより広い処置のために、インフルエンザＡのＨ１〜Ｈ１６、インフルエンザＡのＮ１〜Ｎ９、インフルエンザＢ赤血球凝集素、インフルエンザＢノイラミニダーゼ等の１又は複数のその他のインフルエンザタンパク質及び／又はこれらのタンパク質をコードする遺伝子を以下の構成要素の１又は複数と一緒に使用して及び／又は組み合せて免疫化方法を行い、ワクチンを製造してもよい：１）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列；２）コンセンサスＨ１アミノ酸配列を含むタンパク質；３）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、４）コンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むタンパク質；５）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、６）コンセンサスＵ２アミノ酸配列を含むタンパク質、７）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、及び８）コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質。
１．定義
本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書及び特許請求の範囲において、文脈で明らかに複数であると指定されない限り、単数形は複数形を包含する。
【００２５】
本明細書における数値範囲の記載には、その間にある同じ精度の各数値が明確に意図される。例えば、６〜９の範囲には、６及び９に加えて７及び８の数値が意図され、６．０〜７．０の範囲には、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明確に意図される。
ａ．アジュバント
本発明において、「アジュバント」とは、後述するＤＮＡプラスミド及びコード核酸配列によりコードされる抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味する。
ｂ．抗体
本発明において、「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥクラスの抗体、又は断片、又はその断片若しくは派生物、例えばＦａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆｄ、及び単鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二機能性抗体、並びにその派生物を意味する。抗体は、所望のエピトープ又はそれに由来する配列に十分な結合特異性を示す、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、又はその混合物であってよい。
ｃ．コード配列
本発明において、「コード配列」又は「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は更に、核酸が投与される個体又は哺乳動物の細胞内での発現を方向付けることができるプロモーターやポリアデニル化シグナル等の調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナル及び終止シグナルを含んでもよい。
ｄ．相補体
本発明において、「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」又は「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ間におけるワトソン・クリック（例えばＡ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）又はフーグスティーン塩基対を形成できる核酸を意味する。
ｅ．コンセンサス又はコンセンサス配列
本発明において、「コンセンサス」又は「コンセンサス配列」とは、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプのアラインメント分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列が作製され得る。コンセンサス配列を含むタンパク質及び／又はそのようなタンパクをコードする核酸分子を含むワクチンを用いて、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプ又は血清型に対する幅広い免疫を惹起することができる。コンセンサスインフルエンザ抗原には、例えばコンセンサスＨ１、コンセンサスＨ２等のインフルエンザＡのコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列、又はインフルエンザＢのコンセンサス赤血球凝集素アミノ酸配列が含まれ得る。
ｆ．定電流
本発明において、「定電流」とは、組織又は前記組織を規定する細胞が、同じ組織に送出される電気パルスの期間中に受ける電流を意味する。電気パルスは本明細書に記載の電気穿孔装置によって送出される。本明細書に記載の電気穿孔装置はフィードバック要素を有し、好ましくは即時的フィードバックを有するため、この電流は、電気パルス存続期間中、前記組織中で一定のアンペア数である。フィードバック要素により、パルス期間中の組織（又は細胞）の抵抗を測定することができ、電気穿孔装置が電気パルス（マイクロ秒のオーダー）中に同じ組織中及びパルス間での電流が一定になるように電気エネルギー出力を変化させる（例えば電圧を上げる）ことが可能になる。いくつかの実施形態では、フィードバック要素はコントローラーを含む。
ｇ．電流フィードバック又はフィードバック
「電流フィードバック」又は「フィードバック」は同じ意味で使用することができ、電極間で組織中の電流を測定すること及びそれに基づいて電流を一定レベルに維持するためにＥＰ装置から送出されるエネルギー出力を変化させることを含む、所定の電気穿孔装置の能動的な応答を意味する。この一定レベルは、パルスシーケンス又は電気処置の開始前に、ユーザーにより予め設定される。フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えばコントローラーにより達成することができ、電気穿孔装置の電気回路が、電極間の組織中の電流を連続的に監視し、監視された電流（すなわち組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、監視される電流が予め設定されたレベルに維持されるように連続的にエネルギー出力を調整することができる。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるので、即時的であり得る。
ｈ．分散電流
本発明において、「分散電流（ｄｅｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）」とは、本明細書に記載されている電気穿孔装置の種々の針電極アレイから送られる電流のパターンであって、パターンが、電気穿孔されている組織の任意の領域において電気穿孔関連熱ストレスの発生を最小化するか好ましくは除去するものを意味する。
ｉ．電気穿孔
本発明において同じ意味で使用されている「電気穿孔」、「電気透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、又は「動電促進（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、生体膜中に微視的経路（細孔）を誘発するための膜貫通電場パルスの使用を意味する。それらの存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬、イオン、水等の生体分子が細胞膜の一方の側から他方の側へ通過することが可能となる。
ｊ．フィードバック機構
本発明において、「フィードバック機構」とは、ソフトウェア又はハードウェア（又はファームウェア）のいずれかによって実行されるロセスであって、所望の組織のインピーダンス（エネルギーパルス送出の前、間、及び／又は後）を受け取り、予め設定された値（好ましくは電流）と比較し、送出されるエネルギーパルスを予め設定された値に調整するプロセスを意味する。フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実行され得る。
ｋ．断片
本発明において、核酸配列との関連における「断片」とは、例えばインフルエンザＡのＨ１赤血球凝集素、インフルエンザＡのＨ２赤血球凝集素、インフルエンザＢの赤血球凝集素等の全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドをコードする核酸配列又はその一部を意味する。断片は、配列番号１、３、６、９、１１ １３、及び１５を初めとするコンセンサスアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列及びそのような配列を含むコンストラクトの少なくとも１つ、から選択されるＤＮＡ断片であり得る。ＤＮＡ断片は、ＩｇＥ又はＩｇＧ配列等の免疫グロブリンリーダーのコード配列を含み得る。ＤＮＡ断片の長さは、ヌクレオチド３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３６０個以上、４２０個以上、４８０個以上、５４０個以上、６００個以上、６６０個以上、７２０個以上、７８０個以上、８４０個以上、９００個以上、９６０個以上、１０２０個以上、１０８０個以上、１１４０個以上、１２００個以上、１２６０個以上、１３２０個以上、１３８０個以上、１４４０個以上、１５００個以上、１５６０個以上、１６２０個以上、１６８０個以上、１７４０個以上、１８００個以上、１８６０個以上、１８２０個以上、１８８０個以上、１９４０個以上、２０００個以上、２６００個以上、２７００個以上、２８００個以上、２９００個以上、２９１０個以上、２９２０個以上、２９３０個以上、２９３１個以上、２９３２個以上、２９３３個以上、２９３４個以上、２９３５個以上、２９３６個以上、２９３７個以上、又は２９３８個以上であり得る。ＤＮＡ断片は、ヌクレオチド１０個未満、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３６０個未満、４２０個未満、４８０個未満、５４０個未満、６００個未満、６６０個未満、７２０個未満、７８０個未満、８４０個未満、９００個未満、９６０個未満、１０２０個未満、１０８０個未満、１１４０個未満、１２００個未満、１２６０個未満、１３２０個未満、１３８０個未満、１４４０個未満、１５００個未満、１５６０個未満、１６２０個未満、１６８０個未満、又はヌクレオチド１７４０個未満、１８００個未満、１８６０個未満、１８２０個未満、１８８０個未満、１９４０個未満、２０００個未満、２６００個未満、２７００個未満、２８００個未満、２９００個未満、２９１０個未満、２９２０個未満、２９３０個未満、２９３１個未満、２９３２個未満、２９３３個未満、２９３４個未満、２９３５個未満、２９３６個未満、２９３７個未満、又は２９３８個未満であり得る。
【００２６】
ポリペプチド配列との関連における「断片」とは、例えばインフルエンザＡのＨ１赤血球凝集素、インフルエンザＡのＨ２赤血球凝集素、又はインフルエンザＢの赤血球凝集素等の全長野生型株インフルエンザ抗原と交差反応する、哺乳動物において免疫応答を誘発できるポリペプチドを意味する。断片は、配列番号２、４、７、１０、１２、１４、１６を初めとする本発明の種々のポリペプチド配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。ポリペプチド断片は、ロスアラモス国立研究所のＨＡ配列データベース等の公的に利用可能なデータベースにより提供されるように、少なくとも１つの抗原性エピトープと接触するように分析することができる。ポリペプチドＨＡ断片は、ＩｇＥ又はＩｇＧ等の免疫グロブリンリーダーのアミノ酸配列を更に含んでよい。ポリペプチド断片の長さは、アミノ酸３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３６０個以上、４２０個以上、４８０個以上、５４０個以上、６００個以上、６６０個以上、又は７１０個以上であり得る。ポリペプチド断片の長さは、アミノ酸１０個未満、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３６０個未満、４２０個未満、４８０個未満、５４０個未満、６００個未満、６６０個未満、７００個未満、７０１個未満、７０２個未満、７０３個未満、７０４個未満、７０５個未満、７０６個未満、７０７個未満、７０８個未満、７０９個未満、又は７１０個未満であり得る。
ｌ．遺伝子コンストラクト
本発明において、「遺伝子コンストラクト」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個体の細胞中での発現を方向付けることができるプロモーター、ポリアデニル化シグナル等の調節エレメントに作動可能に連結された開始及び終止シグナルが含まれる。本発明において、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在するときにコード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必須調節エレメントを含む遺伝子コンストラクトを指す。
ｍ．同一
本発明において、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「同一性」とは、特定の領域にわたり同じである特定のパーセンテージの残基を有する配列を意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたり２つの配列を比較し、両方の配列中で残基が同一である位置の数を決定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数をその特定領域中の全ての位置の数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。２つの配列の長さが異なる場合又はアラインメントにより１又は複数の付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄ）が生じて特定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合、単一配列の残基は計算の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は同等であると見なすことができる。同一性は、手作業で行ってもよく、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを用いて行ってもよい。
ｎ．インピーダンス
「インピーダンス」は、フィードバック機構を議論する時に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。
ｏ．免疫応答
本発明において、「免疫応答」とは、インフルエンザ赤血球凝集素コンセンサス抗原等の抗原の導入に応答した、宿主免疫系（例えば哺乳動物の免疫系）の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答の形態であってもよく、体液性応答の形態であってもよく、両方であってもよい。
ｐ．核酸
本発明において、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」とは、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述によって相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、記述されている一本鎖の相補鎖も包含する。所与の核酸と同じ目的に核酸の多くのバリアントを用いることができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２７】
核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよく、二本鎖配列部分及び一本鎖配列部分の両方を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ（ゲノム及びｃＤＮＡの両方）であってもよく、ＲＮＡであってもよく、核酸がデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組合せ並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含み得るハイブリッドであってもよい。核酸は化学合成法によって得てもよく、組換え法によって得てもよい。
ｑ．作動可能に連結された
本発明において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、空間的に関係する（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）プロモーターの制御下における遺伝子の発現を意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）に位置してもよく、３’（下流）に位置してもよい。プロモーターと遺伝子の距離は、プロモーターが由来する遺伝子中におけるプロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で公知のように、この距離はプロモーター機能を消失させることなく変えることができる。
ｒ．プロモーター
本発明において、「プロモーター」とは、細胞中での核酸の発現を付与、活性化、又は促進できる合成又は天然由来分子を意味する。プロモーターは発現を更に促進する並びに／又は空間的発現及び／若しくはその一時的発現を変化させる１又は複数の特定の転写制御配列を含み得る。プロモーターは更に、転写開始部位から数万塩基対も離れて位置し得る遠位性のエンハンサー又は抑制エレメントを含んでもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、動物等を起源とし得る。プロモーターによる遺伝子構成要素の発現制御は、構成的であってもよく、発現が起こる細胞、組織、又は臓器に関して異なってもよく、発現の起こる発生段階に関して異なってもよく、生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応じて異なってもよい。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター 及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。
ｓ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸複合混合物中におけるように、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、環境によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、（所定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下において）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度であり得る（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、平衡時にプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、例えば約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は別の塩）、温度が、短いプローブ（例えば約１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）で少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成されてもよい。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣで洗浄、並びに６５℃で０．１％ＳＤＳ。
ｔ．実質的に相補的
本発明において、「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、２０７０、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸領域にわたって第１の配列が第２の配列の相補体に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であることあるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
ｕ．実質的に同一
本発明において、「実質的に同一」とは、第１の配列が第２の配列の相補体に実質的に相補的である場合、第１及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、２０７０、又はそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸領域にわたって、又は核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを意味する。
ｖ．サブタイプ又は血清型
本発明において、「サブタイプ」又は「血清型」は同じ意味で使用されており、インフルエンザウイルスに関して、インフルエンザウイルスの遺伝的バリアントを意味し、１つのサブタイプは免疫系によって異なるサブタイプとは別に認識される。
ｗ．バリアント
本発明において、核酸と関連して使用される「バリアント」とは、（ｉ）参照されているヌクレオチド配列の一部又は断片；（ｉｉ）参照されているヌクレオチド配列又はその一部の相補体；（ｉｉｉ）参照されている核酸又はその相補体と実質的に同一な核酸；又は（ｉｖ）参照されている核酸、その相補体、若しくはそれと実質的に同一な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００２８】
ペプチド又はポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸が異なっているが、少なくとも１つの生物学的活性を保持している。更に、バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、同様な特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する異なるアミノ酸でアミノ酸を置換することは通常、当該技術分野で、軽微な変化を伴うと認識されている。これらの軽微な変化は、一部、当該技術分野で理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー・インデックスを考慮することによって特定することができる（Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)）。アミノ酸のハイドロパシー・インデックスは、その疎水性及び荷電の考慮に基づく。同様なハイドロパシー・インデックスのアミノ酸を置換してなおタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野で公知である。一態様では、ハイドロパシー・インデックスが±２のアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性も、生物学的機能を保持したタンパク質が得られる置換を明らかにするために利用することができる。ペプチド中のアミノ酸の親水性を考慮することで、ペプチドの最も大きい局所的平均親水性を計算することができ、これは抗原性及び免疫原性と相関性が高いことが報告されている有用な尺度である（参照により全体を本明細書に援用する米国特許第４，５５４，１０１号）。同様な親水性値のアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されるように、免疫原性等の生物学的活性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性インデックス及び親水性値はどちらも、アミノ酸の特定の側鎖に影響される。この観察結果と一致し、生物学的機能と両立するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、サイズ、及びその他の特性により示されるようなアミノ酸（特にそれらのアミノ酸の側鎖）の相対的な類似性に依存すると理解される。
ｘ．ベクター
本発明において、「ベクター」とは、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、バクテリア人工染色体、又は酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは自己複製染色体外ベクターであってよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
２．インフルエンザ抗原
本発明は、哺乳動物において１又は複数のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原を提供する。この抗原は、哺乳動物において、１又は複数のインフルエンザ血清型に対する、例えば２００９Ｈ１Ｎ１ブタ起源インフルエンザ等の１又は複数のパンデミック株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、哺乳動物において、１又は複数のインフルエンザ血清型に対する、例えばブタ由来ヒトインフルエンザの１又は複数の株に対する、免疫応答を誘発することができる。抗原は、抗インフルエンザ免疫応答を惹起できる免疫原としてそれらを特に効果的にするエピトープを含み得る。
【００２９】
抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、そのバリアント、その断片、又はその組合せを含み得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ２の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株の異なる集合に由来する２つの異なるコンセンサス配列の一部を含むハイブリッド配列、又はインフルエンザＢの複数の株に由来するコンセンサス配列であり得る。インフルエンザ赤血球凝集素抗原はインフルエンザＢに由来し得る。抗原は、免疫応答を惹起し得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原性エピトープを含み得る。抗原は、インタクトなインフルエンザウイルス中に存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提供し得る。抗原は、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株（例えば血清型Ｈ１又は血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株）の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。抗原は、２つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列又はその一部の組合せに由来し得るハイブリッドコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。２つの異なるコンセンサス赤血球凝集素抗原配列のそれぞれは、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株等の１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株の異なる集合に由来し得る。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株の赤血球凝集素抗原配列に由来し得るコンセンサス赤血球凝集素抗原配列であり得る。
【００３０】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、アミノ酸１〜３４３が前駆体ＨＡ０コンセンサスＨ１アミノ酸配列のＨＡ１サブユニットに対応し且つアミノ酸３４４〜５６６がＨＡ０コンセンサスＨ１アミノ酸配列のＨＡ２サブユニットに対応する、配列番号２（コンセンサスＨ１アミノ酸配列）を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、配列番号７（コンセンサスＨ２アミノ酸配列）を含むタンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、それぞれが互いに異なる集合の配列に由来する２つの異なるコンセンサスＨ１配列の一部を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であり得る。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の例は、配列番号１０（Ｕ２アミノ酸配列）を含むタンパク質である。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、インフルエンザＢ株の赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス赤血球凝集素タンパク質、例えば配列番号１４（コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列）を含むタンパク質であり得る。
【００３１】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、１又は複数の付加的アミノ酸配列エレメントを更に含み得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、Ｎ末端にＩｇＥ又はＩｇＧリーダーアミノ酸配列を更に含み得る。ＩｇＥリーダーアミノ酸配列は配列番号１７であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出できる固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグを更に含み得る。そのような免疫原性タグの例は、コンセンサス赤血球凝集素Ｃ末端に連結され得る９アミノ酸インフルエンザＨＡタグである。ＨＡタグアミノ酸配列は配列番号１８であり得る。いくつかの実施形態では、コンセンサス赤血球凝集素抗原は、Ｎ末端にＩｇＥ又はＩｇＧリーダーアミノ酸配列及びＣ末端にＨＡタグを更に含み得る。
【００３２】
コンセンサス赤血球凝集素抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列又はその断片及びバリアントからなるコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原は、非インフルエンザタンパク質配列及びインフルエンザタンパク質配列又はその断片及びバリアントを含むコンセンサス赤血球凝集素タンパク質であり得る。
【００３３】
コンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号２）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方等の付加的エレメントを更に含むものが含まれる。ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むコンセンサスＨ１タンパク質の例は配列番号４であり、これはＮ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）に連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結されたコンセンサスＨ１アミノ酸コード配列（配列番号２）を含む。
【００３４】
コンセンサスＨ２タンパク質の例としては、コンセンサスＨ２アミノ酸配列（配列番号７）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を更に含むものが含まれる。
【００３５】
ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例としては、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（配列番号１０）からなり得るものあるいはＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むものが含まれる。コンセンサスＵ２タンパク質の例は配列番号１２であり、これはＮ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）が連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結された、コンセンサスＵ２アミノ酸配列（配列番号１０）を含む。
【００３６】
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢ赤血球凝集素タンパク質の例としては、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（配列番号１４）からなり得るものが含まれ、あるいは、ＩｇＥリーダー配列若しくはＨＡタグ又はＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含んでもよい。コンセンサスＢＨＡタンパク質の例は配列番号１６であり、これは、Ｎ末端にＩｇＥリーダーアミノ酸配列（配列番号１７）が連結され、Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１８）が連結された、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列（配列番号１４）を含む。
【００３７】
コンセンサス赤血球凝集素タンパク質は、コンセンサス赤血球凝集素核酸、そのバリアント、又はその断片にコードされ得る。異なる株及びバリアントの複数の異なる赤血球凝集素配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサス赤血球凝集素タンパク質と異なり、コンセンサス赤血球凝集素核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサス赤血球凝集素タンパク質配列が由来する複数の異なる赤血球凝集素配列中の特定のアミノ酸配列をコードするのに使用されるものとは異なってよい。コンセンサス核酸配列は、最適化されたコドン及び／又は最適化されたＲＮＡであってよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、５’非翻訳領域中にコザック配列を含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は赤血球凝集素コード配列の５’にある。Ｎ末端リーダーは分泌を促進し得る。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダー又はＩｇＧリーダーであり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端にあってよく、それをコードする配列はＨＡコード配列の３’にある。免疫原性タグの与えるエピトープに対して容易に入手可能な抗体があるため、それにより、そのような抗体をアッセイ中で用いてタンパク質の発現を検出及び確認することができる。免疫原性タグはタンパク質のＣ末端のＨタグであり得る。
【００３８】
コンセンサス赤血球凝集素核酸は、配列番号２、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有し得る。配列番号２、配列番号７、配列番号１０、又は配列番号１４をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸はそれぞれ配列番号１、配列番号６、配列番号９、又は配列番号１３であり得る。コンセンサス赤血球凝集素核酸は、ＩｇＥリーダーアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列若しくはＨＡタグアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列又はその両方を更に含んでよい。配列番号１７はＩｇＥリーダーポリペプチド配列である。配列番号１８はＨＡタグポリペプチド配列である。ＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグをコードするポリヌクレオチド配列を更に含む赤血球凝集素コンセンサス核酸の例としては、配列番号４、配列番号１２、又は配列番号１６のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子が含まれる。配列番号４、配列番号１２、又は配列番号１６をコードするコンセンサス赤血球凝集素核酸は、それぞれ配列番号３、配列番号１１、又は配列番号１５であり得る。
３．遺伝子コンストラクト及びプラスミド
赤血球凝集素抗原をコードする核酸配列を含み得る遺伝子コンストラクトを提供する。遺伝子コンストラクトは、赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む機能性染色体外分子として細胞中に存在し得る。赤血球凝集素抗原をコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトは、セントロメアを含む線状ミニ染色体、テロマー、又はプラスミド若しくはコスミドであり得る。
【００３９】
更に、遺伝子コンストラクトは、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、組換えワクシニア等の組換えウイルスベクターのゲノムの一部であってもよい。遺伝子コンストラクトは、弱毒化された生きた微生物中又は細胞中で生きる組換え微生物ベクター中に含まれる遺伝材料の一部であってよい。
【００４０】
遺伝子コンストラクトは、赤血球凝集素核酸の遺伝子発現の調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー開始コドン、終止コドン、又はポリアデニル化シグナルであり得る。
【００４１】
組成物は、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素Ｈ１抗原、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素Ｈ２抗原、インフルエンザＡコンセンサス赤血球凝集素Ｕ２抗原、及びインフルエンザＢコンセンサス赤血球凝集素タンパク質ＢＨＡの１又は複数からなる群から選択される赤血球凝集素コンセンサス抗原をコードする第１の核酸配列を含み得、インフルエンザＡ赤血球凝集素タンパク質Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢ赤血球凝集素（ＢＨＡ）、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ（ＢＮＡ）からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列を更に含み得る。第１の核酸配列及び付加的核酸配列は、同じ核酸分子上に存在してもよく、異なる核酸分子上に存在してもよい。第１の核酸配列及び付加的核酸配列は、ヒト細胞中で機能する調節エレメントの制御下にあってよい。付加的コード配列は、インフルエンザの１又は複数の株の１又は複数のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、ＢＨＡ、及びＢＮＡをコードしてもよく、又はその血清型を有する複数の株に由来するコンセンサスであってよく、又は２つ以上のコンセンサス配列に由来する配列を含むハイブリッドであってよい。
【００４２】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子コンストラクトを構成し得る。ベクターは、哺乳動物中で免疫応答を誘発するのに有効な量のコンセンサス赤血球凝集素抗原を哺乳動物細胞中で発現することができる。ベクターは組換え体であってよい。ベクターはコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであってよい。ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞はコンセンサス赤血球凝集素抗原の発現が起こる条件下で培養及び維持される。
【００４３】
ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする異種核酸を含んでよく、コンセンサス赤血球凝集素コード配列の上流であり得る開始コドン及びコンセンサス赤血球凝集素の下流であり得る終止コドンを更に含んでよい。開始及び終止コドンは、コンセンサス赤血球凝集素コード配列とインフレームであり得る。ベクターは、コンセンサス赤血球凝集素コード配列に作動可能に連結されたプロモーターも含んでよい。コンセンサス赤血球凝集素コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。更に、プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子に由来するプロモーターであってもよい。プロモーターは更に、天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、その内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されている。
【００４４】
ベクターは更に、ポリアデニル化シグナルを含んでもよく、これはＨＡコード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）のポリアデニル化シグナルであり得る。
【００４５】
ベクターは更に、コンセンサス赤血球凝集素コーティングの上流にエンハンサーを含んでもよい。エンハンサーがＤＮＡ発現に必須であってもよい。エンハンサーはヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、又はＥＢＶに由来するエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能亢進については、それぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及び国際公開第９４／０１６７３７号に記載されている。
【００４６】
ベクターは、ベクターを染色体外に維持するため及び細胞中で多コピーのベクターを生成するために、哺乳動物の複製起点を更に含んでよい。ベクターは、インビトロジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のｐＶＡＸ１（図１）、ｐＣＥＰ４、又はｐＲＥＰ４であり得、これはエプスタイン・バーウイルス複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得、組み込まれることなく多コピーのエピソーム複製を可能にする。ベクターは、上記の図面の簡単な説明の図１に関するパラグラフに記載されているような変化を有するｐＶＡＸ１であり得る。ベクターの骨格はｐＡＶ０２４２であってよい。ベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであってよい。
【００４７】
ベクターは更に、ベクターが投与される哺乳動物又はヒトの細胞中における遺伝子発現に良く適し得る制御配列を含んでもよい。コンセンサス赤血球凝集素コード配列は、宿主細胞中でのコード配列のより効率的な転写を可能にすることができるコドンを含んでよい。
【００４８】
ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質産生に使用可能なｐＳＥ４２０（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）であってよい。ベクターは、酵母のサッカロミセス・セレビシア株でのタンパク質産生に使用可能なｐＹＥＳ２（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）であってもよい。また、ベクターは、昆虫細胞でのタンパク質産生に使用可能なＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）のものであってもよい。また、ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞でのタンパク質産生に使用可能なｐｃＤＮＡ Ｉ又はｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）であってもよい。ベクターは、参照により全体を本明細書に援用するSambrook etal., Molecular Cloning an Laboratory Manual, Second Ed. , Cold Spring Harbor(1989)を含むルーチンな技術及び容易に入手可能な出発材料によりタンパク質を産生するための発現ベクター又は系であってよい。
【００４９】
ベクターはｐＧＸ２００９又はｐＧＸ２００６であってよく、これはコンセンサス赤血球凝集素抗原を発現させるために使用することができる。ベクターｐＧＸ２００９（４７３９ｂｐ、図２；配列番号５）は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列（配列番号１によりコードされるアミノ酸配列番号２）に連結したＩｇＥリーダー配列（配列番号１１によりコードされるアミノ酸配列番号１２）を含むコンセンサスＨ１タンパク質（配列番号３によりコードされるアミノ酸配列番号４）をコードする核酸配列を有する改変ｐＶＡＸ１プラスミドである。ベクターｐＧＸ２００６（４６２８ｂｐ；図３、配列番号８）は、コンセンサスＨ２タンパク質（配列番号６によりコードされるアミノ酸配列番号７）をコードする核酸配列を有するｐＶＡＸ１プラスミドである。
【００５０】
コンセンサス赤血球凝集素コード配列を含む本明細書に開示されている遺伝子コンストラクト及び構成要素は、コンセンサス赤血球凝集素コード配列の代わりに他のインフルエンザタンパク質、例えばインフルエンザＡタンパク質Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、又はノイラミニダーゼタンパク質のコード配列を含めることにより、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、又はノイラミニダーゼタンパク質を発現させるために用いてもよい。
４．医薬組成物
約１ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む本発明に係る医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ナノグラム、又は少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、若しくは１０００マイクログラム、又は少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、若しくは１０ｍｇ、又はそれ以上から、２）１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ナノグラムまで、又は１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、若しくは１０００マイクログラムまで、又は１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、若しくは１０ｍｇまでを含む。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、約５ナノグラムから約１０ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、約２５ナノグラム〜約５ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約５０ナノグラム〜約１ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約１０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２０〜約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約２５〜約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３０ナノグラム〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は約３５ナノグラム〜約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００５１】
本発明に係る医薬組成物は、使用される投与形態に従って製剤化される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは無菌であり、発熱性物質を含まず（ｐｙｒｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）、微粒子を含まない。好ましくは等張性の製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液が好ましい。安定化剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、製剤に血管収縮剤が添加される。
【００５２】
好ましくは、医薬組成物はワクチンであり、より好ましくはＤＮＡワクチンである。
【００５３】
１又は複数のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を哺乳動物で生じさせることができるワクチンを提供する。ワクチンは上記の遺伝子コンストラクトを含み得る。ワクチンは、それぞれが１又は複数のインフルエンザＡ血清型、例えばＨ１〜Ｈ１６インフルエンザＢ赤血球凝集素、又はその組合せに対する複数のベクターを含んでもよい。ワクチンは、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする１又は複数の核酸配列を含んでもよい。ワクチンが２以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、全てのそのような配列が１つの核酸分子上に存在してもよく、そのような配列のそれぞれが異なる核酸分子上に存在してもよい。あるいは、２以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、１つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子及び２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有する核酸分子を含み得る。更に、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含むワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、及びインフルエンザＢノイラミニーゼからなる群から選択される１又は複数のタンパク質のコード配列を更に含んでもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ワクチンはタンパク質を含み得る。いくつかのワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、ＢＨＡ等の１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含み得る。ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼからなる群から選択される１又は複数の他のタンパク質を含んでもよい。ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミニダーゼからなる群から選択される１又は複数の他のタンパク質と組み合わせて１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含んでもよい。
【００５５】
ワクチンはＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、コンセンサス赤血球凝集素核酸配列の１又は複数を含む複数の同じ又は異なるプラスミドを含み得る。ＤＮＡワクチンは、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする１又は複数の核酸配列を含み得る。ＤＮＡワクチンが２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含む場合、そのような全配列が１つのプラスミド上に存在してもよく、そのような配列のそれぞれが異なるプラスミド上に存在してもよく、いくつかのプラスミドが１つのコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を含んで、他のプラスミドが２つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列を有してもよい。更に、ＤＮＡワクチンは、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼからなる群から選択される１又は複数のタンパク質の１又は複数のコンセンサスコード配列を更に含んでもよい。そのような付加的コード配列は、互いに異なり且つコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の１又は複数を含むプラスミドとは異なるプラスミド上に存在してもよく、同じプラスミド上に存在してもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザ抗原をコードする核酸配列をインフルエンザ抗原と組み合わせて含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、ＢＨＡ等の１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列は、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼからなる群から選択される１又は複数の１又は複数の他のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、ＢＨＡ等の１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼからなる群から選択される１又は複数の１又は複数の他のタンパク質を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡの１又は複数をコードするものを含む３つ以上のコンセンサス赤血球凝集素核酸配列の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＵ２、コンセンサスＢＨＡ、及びＨ３赤血球凝集素をコードするものを含む３つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＢＨＡ、Ｈ１赤血球凝集素、及びＨ３赤血球凝集素をコードするものを含む３つ以上の赤血球凝集素核酸配列の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、参照により本明細書に援用する米国特許出願第１２／３７５，５１８号及び／又は参照により本明細書に援用する米国特許出願第１２／２６９，８２４号に開示されている１又は複数のインフルエンザ抗原をコードする１又は複数の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２０をコードする核酸配列である配列番号１９（これは米国特許出願第１２／３７５，５１８号中でそれぞれ配列番号３７及び配列番号３６として開示されているＨ１赤血球凝集素である）及び／又は配列番号２２をコードする核酸配列である配列番号２１（これは米国特許出願第１２／２６９，８２４号中でそれぞれ配列番号１０及び配列番号９として開示されているＨ１赤血球凝集素である）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２４をコードする核酸配列である配列番号２３（これは米国特許出願第１２／２６９，８２４号中でそれぞれ配列番号１２及び配列番号１１として開示されているＨ３赤血球凝集素である）を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡの１又は複数を含む３つ以上のコンセンサス赤血球凝集素タンパク質の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＵ２、コンセンサスＢＨＡ、及びＨ３赤血球凝集素を含む３つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＢＨＡ、Ｈ１赤血球凝集素、及びＨ３赤血球凝集素を含む３つ以上の赤血球凝集素タンパク質の組合せを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、米国特許出願第１２／３７５，５１８号及び／又は米国特許出願第１２／２６９，８２４号の１又は複数の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２０及び／又は配列番号２２及び／又は配列番号２４を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、１）コンセンサス赤血球凝集素Ｕ２タンパク質及び／又はコンセンサス赤血球凝集素Ｕ２タンパク質をコードする核酸配列、２）コンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質及び／又はコンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質をコードする核酸配列、及び３）配列番号２４に開示されている赤血球凝集素Ｈ３タンパク質、の組合せを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、１）コンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質及び／又はコンセンサス赤血球凝集素ＢＨＡタンパク質をコードする核酸配列；２）配列番号２０及び／若しくは配列番号２２を有する赤血球凝集素Ｈ１タンパク質並びに／又は赤血球凝集素Ｈ１タンパク質をコードする核酸配列である配列番号１９及び／若しくは配列番号２１；及び３）配列番号２４を有する赤血球凝集素Ｈ３タンパク質及び／又はその中に赤血球凝集素Ｈ３タンパク質をコードする核酸配列である配列番号２３）の組合せを含む。
【００６１】
ＤＮＡワクチンが、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、及び同第５，６７６，５９４号に開示されている。ＤＮＡワクチンは、染色体に組み込まれることを防ぐエレメント又は試薬を更に含んでもよい。ワクチンは赤血球凝集素抗原のＲＮＡであり得る。ＲＮＡワクチンは細胞中に導入することができる。
【００６２】
ワクチンは、上記の遺伝子コンストラクト又は抗原を含む組換えワクチンであり得る。ワクチンはまた、１若しくは複数のタンパク質サブユニットの形態の１若しくは複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原、１若しくは複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む１若しくは複数の死菌インフルエンザ粒子、又は１若しくは複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原を含む１若しくは複数の弱毒化インフルエンザ粒子を含み得る。弱毒化ワクチンは、１又は複数のコンセンサス赤血球凝集素抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組換えベクターを用いるワクチン、弱毒化生菌ワクチン、及び死菌ワクチン、並びにサブユニットワクチン及び糖タンパク質ワクチンであり得る。弱毒化生菌ワクチン、外来抗原の送達に組換えベクターを用いたワクチン、サブユニットワクチン、及び糖タンパク質ワクチンの例が、それぞれを参照により本明細書に援用する米国特許第４，５１０，２４５号；同第４，７９７，３６８号；同第４，７２２，８４８号；同第４，７９０，９８７号；同第４，９２０，２０９号；同第５，０１７，４８７号；同第５，０７７，０４４号；同第５，１１０，５８７号；同第５，１１２，７４９号；同第５，１７４，９９３号；同第５，２２３，４２４号；同第５，２２５，３３６号；同第５，２４０，７０３号；同第５，２４２，８２９号；同第５，２９４，４４１号；同第５，２９４，５４８号；同第５，３１０，６６８号；同第５，３８７，７４４号；同第５，３８９，３６８号；同第５，４２４，０６５号；同第５，４５１，４９９号；同第５，４５３，３６４号；同第５，４６２，７３４号；同第５，４７０，７３４号；同第５，４７４，９３５号；同第５，４８２，７１３号；同第５，５９１，４３９号；同第５，６４３，５７９号；同第５，６５０，３０９号；同第５，６９８，２０２号；同第５，９５５，０８８号；同第６，０３４，２９８号；同第６，０４２，８３６号；同第６，１５６，３１９号、及び同第６，５８９，５２９号に記載されている。
【００６３】
ワクチンは、世界の特定の地域、例えばアジアのインフルエンザＡ血清型に対するベクター及び／又はタンパク質を含み得る。ワクチンは、現在はヒトに感染するブタ起源のインフルエンザＡ血清型に対するものであってよい。ワクチンは、世界の特定の地域のインフルエンザＢに対するベクター及び／又はタンパク質を含み得る。ワクチンは、ヒトに感染するインフルエンザＢに対するものであってよい。ワクチンは、インフルエンザＡ及び／又はＢの１又は複数の株に対する１若しくは複数のベクター及び／又は１若しくは複数のタンパク質を含んでもよい。
【００６４】
提供されるワクチンは、治療的又は予防的免疫応答を含む免疫応答を惹起するために使用され得る。コンセンサス赤血球凝集素抗原に対して、また、インフルエンザウイルスの複数のサブタイプに対して幅広く、抗体及び／又はキラーＴ細胞が作製され得る。そのような抗体及び細胞を単離してもよい。
【００６５】
ワクチンは、薬学的に許容される医薬品添加物（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を更に含んでもよい。薬学的に許容される医薬品添加物は、機能的分子、例えばビヒクル、アジュバント、キャリア、又は希釈剤であり得る。薬学的に許容される医薬品添加物は、トランスフェクション促進剤であってもよく、それには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）等の表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレン及びスクアレン等の小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、又はナノ粒子、又はその他の公知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
【００６６】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）、又は脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸はワクチン中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。トランスフェクション促進剤には、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）等の表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、スクアレン及びスクアレン等の小胞も含まれ得、ヒアルロン酸を遺伝子コンストラクトと組み合わせて投与することもできる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームを含むリポソーム、又はＤＮＡ−リポソーム混合物等の当該技術分野で公知のその他のリポソーム（例えば国際公開第９３２４６４０号参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、又はナノ粒子、又はその他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）、又は脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、又は０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００６７】
薬学的に許容される医薬品添加物はアジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミド中で発現される他の遺伝子であってもよく、あるいはワクチン中で上記プラスミドと組み合わされたタンパク質として送達される。アジュバントは以下からなる群から選択され得る：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因ケモカイン（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ−ａｔｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ：ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｈｙｍｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ：ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナルペプチドを欠失し且つＩｇＥ由来シグナルペプチドを含んでもよいＩＬ−１５を含む）。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、又はその組合せであり得る。
【００６８】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、以下をコードするものが含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体形態のＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びその機能的断片。
【００６９】
ワクチンは、参照により全体を本明細書に援用する１９９４年４月１日付で提出された米国特許出願第０２１，５７９号に記載されている遺伝子ワクチン促進因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ａｇｅｎｔ）を更に含んでよい。
５．送達方法
インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を惹起し得る特に効果的な免疫原とするためのエピトープを含む赤血球凝集素抗原の遺伝子コンストラクト及びタンパク質を提供するための医薬製剤、好ましくはワクチンを送達する方法を提供する。ワクチン送達方法は又はワクチン接種方法は、治療的及び／又は予防的免疫応答を惹起するようになされ得る。ワクチン接種プロセスは、哺乳動物において、２００９ブタ起源Ｈ１Ｎ１等のＨ１Ｎ１血清型、又は他の季節性及び／若しくはパンデミックの種類を含む複数のインフルエンザサブタイプに対する免疫応答を生じさせることができる。ワクチンは、哺乳動物の免疫系の活性を調節して免疫応答を高めるように個体へと送達され得る。ワクチンの送達は、細胞中で発現されて細胞表面（この上で免疫系に認識されて細胞性、体液性、又は細胞性及び体液性の応答を惹起する）に送達される核酸分子としてのＨＡ抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの送達を用いて、本明細書に記載のワクチンを哺乳動物に投与することにより、哺乳動物において複数のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を惹起又は誘発することができる。
【００７０】
哺乳動物へのワクチン送達後、ベクターが哺乳動物の細胞内に入った後、トランスフェクト細胞は、コンセンサス抗原、好ましくはＨ１、Ｈ２、Ｕ２、及びＢＨＡの少なくとも１つを含む、対応するインフルエンザタンパク質を発現及び分泌する。これらの分泌タンパク質、又は合成抗原は、免疫系により異物として認識され、抗原に対する抗体の産生及び抗原に特異的なＴ細胞応答を含み得る免疫応答を開始させる。いくつかの例では、本明細書に記載のワクチンの予防接種を受けた哺乳動物は、初回刺激された免疫系を有し、インフルエンザウイルス株に暴露された時、この初回刺激された免疫系により、その後のインフルエンザウイルスを、体液性、細胞性、又はその両方により、迅速に排除することができる。ワクチンは、個体の免疫系の活性を調節することにより免疫応答を亢進するように個体に送達され得る。
【００７１】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンの形態で送達され得、ＤＮＡワクチンを送達する方法は、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，０３６，００６号に記載されている。
【００７２】
ワクチンは、哺乳動物において免疫応答を誘発するように哺乳動物に投与され得る。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、又はニワトリ、好ましくはヒト、雌ウシ、ブタ、又はニワトリであり得る。
ａ．併用処置
医薬組成物、好ましくは、ワクチンは、１又は複数の他のインフルエンザタンパク質又は以下をコードする遺伝子と組み合わせて投与され得る：インフルエンザＡのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、インフルエンザＢの赤血球凝集素、及びノイラミダーゼ。ワクチンは、アジュバントをコードする遺伝子又はタンパク質と組み合わせて投与され得、アジュバントとしては以下が含まれ得る：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、変異体形態のＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、又はＴＡＰ２、又はその機能的断片。
ｂ．投与経路
ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入、頬側投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内くも膜下腔内、及び関節内、又はその組合せを含む種々の経路で投与され得る。獣医用途では、組成物は、通常の獣医学的実務に従う好適で許容可能な製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適した投与計画及び投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子銃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、又は他の物理的方法、例えば電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、又は超音波により投与され得る。
【００７３】
ワクチンのベクターは、複数の周知の技術、例えば、生体内電気穿孔、リポソーム仲介、ナノ粒子促進、組換えベクター（組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、組換えワクシニア等）、を使用する又は使用しないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種ともいう）により哺乳動物に送達され得る。ＨＡ抗原は、生体内電気穿孔及びＤＮＡ注入により送達され得る。
ｃ．電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔によるワクチン投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送出するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスはユーザーにより入力された予め設定された電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント及び電極アセンブリー又はハンドルアセンブリーを含み得る。電気穿孔コンポーネントには、コントローラー、定波形ジェネレーター、インピーダンステスター、波形ロガー、入力要素、状態報告要素、通信ポート、メモリーコンポーネント、電源、及びパワースイッチを含む電気穿孔装置の種々の要素の１又は複数が含まれ得る。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化する生体内電気穿孔装置、例えばＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標） ＥＰシステム（ＶＧＸファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル）又はＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ジェネトロニクス社（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）製、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて達成され得る。
【００７４】
電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の１つの要素として機能してよく、他の要素は電気穿孔コンポーネントと通信する別個の要素（又はコンポーネント）である。電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能してよく、電気穿孔コンポーネントとは別個の電気穿孔装置の更なる別の要素と通信してよい。１つの電気機械的又は機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、１つの装置として又は互いに通信する別個の要素として機能し得る要素に限定されなくてもよい。電気穿孔コンポーネントは、所望の組織において定電流を生み出すエネルギーパルスを送出することができ得、フィードバック機構を含む。電極アセンブリーは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含んでよく、電極アセンブリーは、電気穿孔コンポーネントからのエネルギーパルスを受け取り、電極を介してそれを所望の組織に送出する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルス送出中、中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、電気穿孔コンポーネントにインピーダンスを伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けることができ、電気穿孔コンポーネントにより送出されるエネルギーパルスを調整して定電流を維持することができる。
【００７５】
複数の電極がエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。複数の電極は、ユーザーによって電気穿孔コンポーネントに入力されたプログラムシーケンス下において電極の制御によりエネルギーパルスを分散パターンで送達してもよい。プログラムシーケンスは、シーケンス中に送出される複数のパルスを含み得、複数のパルスの各パルスは、電極の１つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極によって送出され、複数のパルスの次のパルスは、電極の１つがインピーダンスを測定する中性電極である少なくとも２つの活性電極の異なる１つによって送出される。
【００７６】
フィードバック機構は、ハードウェア又はソフトウェアによって実行され得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実行され得る。フィードバックは５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、又は１μｓ毎に起こるが、好ましくはリアルタイムフィードバック又は即時的（すなわち、応答時間を測定するための利用可能な技術による決定で実質的に即時的）である。中性電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定することができ、インピーダンスをフィードバック機構へと伝達し、フィードバック機構はこのインピーダンスに応答して、予め設定された電流に近い値に定電流を維持するようにエネルギーのパルスを調整する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送出中、定電流を連続的且つ即時的に維持し得る。
【００７７】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を容易にし得る電気穿孔装置及び電気穿孔法の例としては、その内容全体を参照により本明細書に援用するDraghia-Akli, et al.の米国特許第７，２４５，９６３号、Smith, et al.により提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれる。ＤＮＡワクチンの送達を容易にするために使用され得るその他の電気穿孔装置及び電気穿孔方法としては、同時係属中であり且つ共同で所有されている、２００７年１０月１７日付で提出された米国特許出願第１１／８７４０７２号に記載されているものが含まれ、同特許出願は、２００６年１０月１７日付で提出された米国仮出願第６０／８５２，１４９号及び２００７年１０月１０日付で提出された同第６０／９７８，９８２号に対してアメリカ合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものである。これらの全ての全体を参照により本明細書に援用する。
【００７８】
Draghia-Akli,et al.の米国特許第７，２４５，９６３号は、身体又は植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を容易にするためのモジュール電極システム及びその使用を記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極と、皮下注射針と、プログラム可能な定電流パルスコントローラーから複数の針電極へと導電リンクを形成する電気コネクターと、電源とを備え得る。オペレーターは、支持構造体に装着されている複数の針電極を把持して、それらを身体又は植物の選択された組織中に確実に挿入することができる。次いで、皮下注射針により、選択された組織中に生体分子が送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラーが作動され、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への生体分子の導入を容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【００７９】
Smith,et al.により提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、身体又は植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を効果的に容易にするために使用可能な電気穿孔装置を記載している。電気穿孔装置は、その動作がソフトウェア又はファームウェアによって定められる導電装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。ＥＫＤ装置は、ユーザーによる制御及びパルスパラメーターの入力に基づいて、アレイ状の電極間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存及び取得を可能にする。また、電気穿孔装置は、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスクと、注射針用の中央注射チャネルと、取り外し可能なガイドディスクとを備える。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【００８０】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極アレイ及び方法は、筋肉等の組織だけでなく他の組織又は臓器中への深部透過にも適合し得る。電極アレイの構成により、（選択された生体分子を送達するための）注射針も標的臓器中に完全に挿入され、電極によって予め輪郭付けられた領域で、注入物が標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極は、好ましくは長さ２０ｍｍ、２１ゲージである。
【００８１】
更に、電気穿孔装置及びその使用を含むいくつかの実施形態では、以下の特許に記載されている電気穿孔装置が想定される：１９９３年１２月２８日に付与された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に付与された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に付与された同第６，２６１，２８１号、及び２００５年１０月２５日に付与された同第６，９５８，０６０号、及び２００５年９月６日に付与された同第第６，９３９，８６２号。更に、種々の装置のいずれかを用いたＤＮＡの送達に関する２００４年２月２４日に付与された米国特許第６，６９７，６６９号及びＤＮＡの導入方法に関する２００８年２月５日に付与された米国特許第７，３２８，０６４号で提供されている主題をカバーする特許も本明細書の想定内である。上記特許の全体を参照により本明細書に援用する。
ｄ．ワクチンの製造方法
本明細書に記載のＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドの調製方法を提供する。ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物用発現プラスミド中への最後のサブクローニングステップ後、当該技術分野で公知の方法を用いて大規模発酵タンク中の細胞培養液への接種に使用することができる。
【００８２】
本発明のＥＰ装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、公知の装置及び技術を組み合わせて用いることにより処方又は製造することができるが、好ましくは、ライセンスされた、２００７年５月２３日付で提出された同時係属中の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で処方され得る。また、製造技術には、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているものに加え、当業者に一般的に知られている種々の装置及びプロトコールが含まれ、ライセンスされた、２００７年７月３日に付与された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものも含まれる。上記の出願及び特許、それぞれ米国特許出願第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号の全体を参照により本明細書に援用する。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を用いて本発明を更に説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載されるものと理解されるべきである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更例及び改変例を作ることができる。したがって、本明細書中に示され説明されているものに加え、本発明の種々の改変例が上記の説明から当業者には明らかである。そのような改変例も特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図される。
【００８４】
（実施例１）
ｐＧＸ２００９（ｐＨ１ＨＡ０９）−２００９Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（ブタインフルエンザ）赤血球凝集素抗原をコードするプラスミド
ｐＧＸ２００９（Ｈ１ＨＡ０９）の骨格は、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある改変発現ベクターｐＶＡＸ１（インビトロジェン社製、カリフォルニア州カールズバッド）である。元のｐＶＡＸ１はインビトロジェン社から購入し（カタログ番号Ｖ２６０−２０）、−２０℃に維持した。前述のとおり、配列分析により、ｐＧＸ２００９の骨格として使用するｐＶＡＸ１の配列とインビトロジェン社から入手可能なｐＶＡＸ１配列との間の差を明らかにした。差は前述の通りである。
【００８５】
プラスミドｐＧＸ２００９（ｐＨ１ＨＡ０９ともいう）は、コンセンサス２００９Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（ブタインフルエンザ）赤血球凝集素分子をコードする核酸配列を含む。コンセンサス配列を生成するために使用した７９個の一次配列はインフルエンザ配列データベースから選択した。
【００８６】
種々のインフルエンザＡ赤血球凝集素Ｈ１タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及びヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の寄託番号はＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける以下の寄託番号に対応する。括弧内にない寄託番号はヌクレオチド配列及びそれらによりコードされるアミノ酸配列の更なる一覧を開示している。括弧内の寄託番号は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース中の対応するアミノ酸配列のエントリーのものである。寄託番号は以下の通りである：ＧＱ３２３５７９．１（ＡＣＳ７２６５７．１）、ＧＱ３２３５６４．１（ＡＣＳ７２６５４．１）、ＧＱ３２３５５１．１（ＡＣＳ７２６５２．１）、ＧＱ３２３５３０．１（ＡＣＳ７２６５１．１）、ＧＱ３２３５２０．１（ＡＣＳ７２６５０．１）、ＧＱ３２３４９５．１（ＡＣＳ７２６４８．１）、ＧＱ３２３４８９．１（ＡＣＳ７２６４７．１）、ＧＱ３２３４８６．１（ＡＣＳ７２６４６．１）、ＧＱ３２３４８３．１（ＡＣＳ７２６４５．１）、ＧＱ３２３４５５．１（ＡＣＳ７２６４１．１）、ＧＱ３２３４５１．１（ＡＣＳ７２６４０．１）、ＧＱ３２３４４３．１（ＡＣＳ７２６３８．１）、ＧＱ２９３０７７．１（ＡＣＳ６８８２２．１）、ＧＱ２８８３７２．１（ＡＣＳ５４３０１．１）、ＧＱ２８７６２５．１（ＡＣＳ５４２６２．１）、ＧＱ２８７６２７．１（ＡＣＳ５４２６３．１）、ＧＱ２８７６２３．１（ＡＣＳ５４２６１．１）、ＧＱ２８７６２１．１（ＡＣＳ５４２６０．１）、ＧＱ２８６１７５．１（ＡＣＳ５４２５８．１）、ＧＱ２８３４８８．１（ＡＣＳ５００８８．１）、ＧＱ２８０７９７．１（ＡＣＳ４５０３５．１）、ＧＱ２８０６２４．１（ＡＣＳ４５０１７．１）、ＧＱ２８０１２１．１（ＡＣＳ４５１８９．１）、ＧＱ２６１２７７．１（ＡＣＳ３４９６８．１）、ＧＱ２５３４９８．１（ＡＣＳ２７７８７．１）、ＧＱ３２３４７０．１（ＡＣＳ７２６４３．１）、ＧＱ２５３４９２．１（ＡＣＳ２７７８０．１）、ＦＪ９８１６１３．１（ＡＣＱ５５３５９．１）、ＦＪ９７１０７６．１（ＡＣＰ５２５６５．１）、ＦＪ９６９５４０．１（ＡＣＰ４４１８９．１）、ＦＪ９６９５１１．１（ＡＣＰ４４１５０．１）、ＦＪ９６９５０９．１（ＡＣＰ４４１４７．１）、ＧＱ２５５９００．１（ＡＣＳ２７７７４．１）、ＧＱ２５５９０１．１（ＡＣＳ２７７７５．１）、ＦＪ９６６９７４．１（ＡＣＰ４１９５３．１）、ＧＱ２６１２７５．１（ＡＣＳ３４９６７．１）、ＦＪ９６６９６０．１（ＡＣＰ４１９３５．１）、ＦＪ９６６９５２．１（ＡＣＰ４１９２６．１）、ＦＪ９６６０８２．１（ＡＣＰ４１１０５．１）、ＧＱ２５５８９７．１（ＡＣＳ２７７７０．１）、ＣＹ０４１６４５．１（ＡＣＳ２７２４９．１）、ＣＹ０４１６３７．１（ＡＣＳ２７２３９．１）、ＣＹ０４１６２９（ＡＣＳ２７２２９．１）、ＧＱ３２３４４６．１（ＡＣＳ７２６３９．１）、ＣＹ０４１５９７．１（ＡＣＳ２７１８９．１）、ＣＹ０４１５８１．１（ＡＣＳ１４７２６．１）、ＣＹ０４０６５３．１（ＡＣＳ１４６６６．１）、ＣＹ０４１５７３．１（ＡＣＳ１４７１６．１）、ＣＹ０４１５６５．１（ＡＣＳ１４７０６．１）、ＣＹ０４１５４１．１（ＡＣＳ１４６７６．１）、ＧＱ２５８４６２．１（ＡＣＳ３４６６７．１）、ＣＹ０４１５５７．１（ＡＣＳ１４６９６．１）、ＣＹ０４１５４９．１（ＡＣＳ１４６８６．１）、ＧＱ２８３４８４．１（ＡＣＳ５００８４．１）、ＧＱ２８３４９３．１（ＡＣＳ５００９５．１）、ＧＱ３０３３４０．１（ＡＣＳ７１６５６．１）、ＧＱ２８７６１９．１（ＡＣＳ５４２５９．１）、ＧＱ２６７８３９．１（ＡＣＳ３６６３２．１）、ＧＱ２６８００３．１（ＡＣＳ３６６４５．１）、ＣＹ０４１６２１．１（ＡＣＳ２７２１９．１）、ＣＹ０４１６１３．１（ＡＣＳ２７２０９．１）、ＣＹ０４１６０５．１（ＡＣＳ２７１９９．１）、ＦＪ９６６９５９．１（ＡＣＰ４１９３４．１）、ＦＪ９６６９８２．１（ＡＣＰ４１９６３．１）、ＣＹ０３９５２７．２（ＡＣＱ４５３３８．１）、ＦＪ９８１６１２．１（ＡＣＱ５５３５８．１）、ＦＪ９８１６１５．１（ＡＣＱ５５３６１．１）、ＦＪ９８２４３０．１（ＡＣＱ５９１９５．１）、ＦＪ９９８２０８．１（ＡＣＱ７３３８６．１）、ＧＱ２５９９０９．１（ＡＣＳ３４７０５．１）、ＧＱ２６１２７２．１（ＡＣＳ３４９６６．１）、ＧＱ２８７６２１．１（ＡＣＳ５４２６０．１）、ＧＱ２９００５９．１（ＡＣＳ６６８２１．１）、ＧＱ３２３４６４．１（ＡＣＳ７２６４２．１）、ＧＱ３２３４７３．１（ＡＣＳ７２６４４．１）、ＧＱ３２３５０９．１（ＡＣＳ７２６４９．１）、ＧＱ３２３５６０．１（ＡＣＳ７２６５３．１）、ＧＱ３２３５７４．１（ＡＣＳ７２６５５．１）、及びＧＱ３２３５７６．１（ＡＣＳ７２６５６．１）。アミノ酸配列はＮＣＢＩ配列データベースからダウンロードされ、アラインメント及びコンセンサス配列はＣｌｕｓｔａｌ Ｘを用いて作製した。発現を容易化するために、非常に効率的なリーダー配列であるＩｇＥリーダーを開始コドンの上流にインフレームで融合させた。より高レベルで発現させるために、この融合遺伝子のコドン使用頻度をヒト遺伝子のコドン偏位（ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ）に適合させた。更に、ＲＮＡの最適化も行った。すなわち、ＧＣ含量が非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）領域及び内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位等のシス作用性配列モチーフを避けた。全体配列はジーンアート社（Ｇｅｎｅａｒｔ）（ドイツ、レーゲンスブルク）で合成により作製された。改変された合成Ｈ１ＨＡ０９遺伝子は、長さが１８１８ｂｐであり（配列番号１）、ジーンアート社により、ＢａｍＨ１とＸｈｏＩの部位でｐＶＡＸ１にクローニングされた（図２）。
【００８７】
（実施例２）
インフルエンザｐＧＸ２００９免疫化フェレットのＡ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９暴露
暴露実験は、インフルエンザの好ましいモデルであるフェレットを用いて行った。フェレットをプラスミドｐＧＸ２００９を用いて免疫化した。
【００８８】
動物：４群×５頭／群及び４頭の対照群＝合計２４フェレット（雄）
期間：１８週間（暴露含む）
用量：．２ｍｇプラスミド
プロトコール概要：フェレットをＤＮＡワクチン群にランダムに割り振った。動物を実験０日目、２８日目、及び５６日目に免疫化した。承認されている麻酔プロトコールに従い、ケタミン／ミダゾラムカクテル、イソフルラン、又は同等物を用いて、動物に麻酔をかけ、インフルエンザＤＮＡワクチンの組合せを用いて筋肉内（ＩＭ）へのワクチン接種を行った。第１群及び第２群は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応定電流電気穿孔（ＥＰ）装置を０．５Ａｍｐ、５２ミリ秒パルス、パルス間０．２ｓｅｃ、発火遅延４ｓｅｃ、合計３パルスで用いて、すぐに電気穿孔した。対照動物は未処置（ｎａｉｖｅ）対照とした（プラスミドなし、ＥＰなし）。フェレットは、ケージ中で麻酔から回復させ、２４時間注意深く監視して確実に完全に回復させた。
【００８９】
餌及び水は実験期間中自由に摂取させた。８４日目に、１ｍｌのＭＸ１０（Ａ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９；５×１０５ＰＦＵ／ｍｌ）を用いて鼻腔内感染により動物を暴露した。確立及び承認されたスコアシートを用いて、動物の臨床徴候（体重、温度等）を毎日監視した。感染後１、３、６、９、及び１５日目（ｄｐｉ）に、鼻洗浄物及び直腸スワブを回収した。肺を１５日目に回収した。サンプルを適宜、リアルタイムＰＣＲによりウイルス負荷を調べるためのＲＮＡｌａｔｅｒ、感染性ウイルスを調べるための培地（ＴＣＤＩ５０）、及び組織学的検査のためのホルマリンに保管した。
【００９０】
図４は、免疫化したフェレット（３回免疫化）の血清を用いて行った赤血球凝集抑制試験を示す図である。タイターが＞１：４０であるものを「保護的」と見なした。点線は１：４０のマークを示す。３回免疫化後では全ての動物が１：４０のマークを超えていた。図５は、免疫化されたフェレット及び免疫化されなかったフェレットを新規なＨ１Ｎ１株ＭＸ１０（Ａ／Ｍｅｘｉｃｏ／ＩｎＤＲＥ４４８７／２００９）に暴露した結果を示す。免疫化されたフェレットは全て生存したが、未処置フェレットは１５日の期間内に７５％が死亡した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む単離された核酸分子：
ａ）以下からなる群から選択される：配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｂ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号３、配列番号３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；
ｃ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号６、配列番号６に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；
ｄ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号９、配列番号９に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
ｅ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１１、配列番号１１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｆ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１３、配列番号１３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｇ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１５、配列番号１５に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１に９５％相同な核酸配列、配列番号３に９５％相同な核酸配列、配列番号６に９５％相同な核酸配列、配列番号９に９５％相同な核酸配列、配列番号１１に９５％相同な核酸配列、配列番号１３に９５％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号１に９８％相同な核酸配列、配列番号３に９８％相同な核酸配列、配列番号６に９８％相同な核酸配列、配列番号９に９８％相同な核酸配列、配列番号１１に９８％相同な核酸配列、配列番号１３に９８％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９８％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号１、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択される核酸配列並びにＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
調節エレメントに作動可能に連結された請求項１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項７】
ヒト細胞中で機能的である調節エレメントに作動可能に連結された請求項１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターがｐＧＸ２００９である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
以下のａ）及びｂ）を含む組成物：
ａ）以下からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む複数の１又は複数の核酸分子：
ｉ）以下からなる群から選択される：配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｉｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号３、配列番号３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；
ｉｉｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号６、配列番号６に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；
ｉｖ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号９、配列番号９に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
ｖ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１１、配列番号１１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｖｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１３、配列番号１３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｖｉｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１５、配列番号１５に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｂ）以下の１又は複数からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列：インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ２、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡ Ｈ４ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡ Ｎ１．．．インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ８、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ９、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１０、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１２、インフルエンザＡ Ｈ１３ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１４、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ２、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ３、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ４、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ５、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ７、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ８、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ９、インフルエンザＢヘマグルチニン、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ。
【請求項１１】
前記１又は複数の付加的核酸配列が、ａ）に記載の複数の核酸分子とは異なる複数の１又は複数の核酸分子上に存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ａ）に記載の複数の核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ａ）に記載の複数の核酸分子が、配列番号１に９５％相同な核酸配列、配列番号３に９５％相同な核酸配列、配列番号６に９５％相同な核酸配列、配列番号９に９５％相同な核酸配列、配列番号１１に９５％相同な核酸配列、配列番号１３に９５％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９５％相同な核酸配列からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ａ）に記載の複数の核酸分子が、配列番号１に９８％相同な核酸配列、配列番号３に９８％相同な核酸配列、配列番号６に９８％相同な核酸配列、配列番号９に９８％相同な核酸配列、配列番号１１に９８％相同な核酸配列、配列番号１３に９８％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９８％相同な核酸配列からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ａ）及びｂ）に記載の核酸配列がそれぞれ調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ａ及びｂ）に記載の核酸配列がそれぞれ、ヒト細胞中で機能的である調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ａ）及びｂ）に記載の核酸配列が、１又は複数の発現ベクターの一部である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１又は複数の発現ベクターがプラスミドである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
ｐＧＸ２００９及び／又はｐＧＸ２００６を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
以下の１又は複数を含む、請求項１０に記載の組成物：
配列番号１を含む核酸配列；
配列番号６を含む核酸配列；
配列番号９を含む核酸配列；
配列番号１３を含む核酸配列；
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする核酸配列；及び
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする核酸配列。
【請求項２１】
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする前記核酸配列が配列番号２１を含み、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする前記核酸配列が配列番号２３を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２２】
以下を含む請求項２０に記載の組成物：
配列番号９を含む核酸分子；
配列番号１３を含む核酸分子；及び
配列番号２３を含む核酸分子。
【請求項２３】
配列番号９を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号１３を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号２３を含む前記核酸分子がプラスミドである、
請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸配列を含む核酸分子を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載の組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法。
【請求項２７】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株による感染から個体を保護する方法であって、
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子を予防有効量で前記個体に投与するステップを含み、
前記核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記タンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項２８】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株による感染から個体を保護する方法であって、
ａ）以下からなる群から選択される第１の核酸配列：
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｂ）以下の１又は複数からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列：インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ２、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡ Ｈ４ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡ Ｎ１．．．インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ８、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ９、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１０、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１２、インフルエンザＡ Ｈ１３ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１４、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ２、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ３、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ４、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ５、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ７、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ８、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ９、インフルエンザＢヘマグルチニン、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ；
を含む予防有効量の組成物を個体に投与するステップを含み、
前記第１の核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記第１のタンパク質に対する免疫応答が惹起され、前記１又は複数の付加的核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、前記１又は複数の第２のタンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項２９】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項２８に記載の方法：
配列番号１を含む核酸配列；
配列番号９を含む核酸配列；
配列番号１３を含む核酸配列；
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする核酸配列；及び
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする核酸配列。
【請求項３０】
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする前記核酸配列が配列番号２１を含み、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする前記核酸配列が配列番号２３を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項２８に記載の方法：
配列番号９を含む核酸分子；
配列番号１３を含む核酸分子；及び
配列番号２３を含む核酸分子。
【請求項３２】
配列番号９を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号１３を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号２３を含む前記核酸分子がプラスミドである
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株に感染した個体を処置する方法であって、
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列を含む治療有効量の核酸分子を前記固体に投与するステップを含み、
前記核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記タンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項３４】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株に感染した個体を処置する方法であって、
ａ）以下からなる群から選択される第１の核酸配列：
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｂ）以下の１又は複数からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列：インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ２、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡ Ｈ４ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡ Ｎ１．．．インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ８、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ９、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１０、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１２、インフルエンザＡ Ｈ１３ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１４、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ２、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ３、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ４、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ５、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ７、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ８、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ９、インフルエンザＢヘマグルチニン、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ；
を含む治療有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含み、
前記第１の核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記第１のタンパク質に対する免疫応答が惹起され、前記１又は複数の付加的核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、前記１又は複数の第２のタンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項３５】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項３４に記載の方法：
配列番号１を含む核酸配列；
配列番号９を含む核酸配列；
配列番号１３を含む核酸配列；
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする核酸配列；及び
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする核酸配列。
【請求項３６】
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする前記核酸配列が配列番号２１を含み、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする前記核酸配列が配列番号２３を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項３４に記載の方法：
配列番号９を含む核酸分子；
配列番号１３を含む核酸分子；及び
配列番号２３を含む核酸分子。
【請求項３８】
配列番号９を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号１３を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号２３を含む前記核酸分子がプラスミドである、
請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
以下からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む単離された核酸分子：
ａ）以下からなる群から選択される：配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｂ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号３、配列番号３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；
ｃ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号６、配列番号６に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；
ｄ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号９、配列番号９に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
ｅ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１１、配列番号１１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｆ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１３、配列番号１３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｇ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１５、配列番号１５に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１に９５％相同な核酸配列、配列番号３に９５％相同な核酸配列、配列番号６に９５％相同な核酸配列、配列番号９に９５％相同な核酸配列、配列番号１１に９５％相同な核酸配列、配列番号１３に９５％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９５％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号１に９８％相同な核酸配列、配列番号３に９８％相同な核酸配列、配列番号６に９８％相同な核酸配列、配列番号９に９８％相同な核酸配列、配列番号１１に９８％相同な核酸配列、配列番号１３に９８％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９８％相同な核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号１、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択される核酸配列並びにＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
調節エレメントに作動可能に連結された請求項１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項７】
ヒト細胞中で機能的である調節エレメントに作動可能に連結された請求項１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターがｐＧＸ２００９である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
以下のａ）及びｂ）を含む組成物：
ａ）以下からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む複数の１又は複数の核酸分子：
ｉ）以下からなる群から選択される：配列番号１、配列番号１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｉｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号３、配列番号３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号３の断片に９５％相同な核酸配列；
ｉｉｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号６、配列番号６に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号６の断片に９５％相同な核酸配列；
ｉｖ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号９、配列番号９に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
ｖ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１１、配列番号１１に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１１の断片に９５％相同な核酸配列；
ｖｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１３、配列番号１３に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１３の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｖｉｉ）以下からなる群から選択される核酸配列：配列番号１５、配列番号１５に９５％相同な核酸配列；少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片、及び少なくとも６０個のヌクレオチドを含む配列番号１５の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｂ）以下の１又は複数からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列：インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ２、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡ Ｈ４ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡ Ｎ１．．．インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ８、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ９、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１０、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１２、インフルエンザＡ Ｈ１３ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１４、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ２、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ３、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ４、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ５、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ７、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ８、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ９、インフルエンザＢヘマグルチニン、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ。
【請求項１１】
前記１又は複数の付加的核酸配列が、ａ）に記載の複数の核酸分子とは異なる複数の１又は複数の核酸分子上に存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ａ）に記載の複数の核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ａ）に記載の複数の核酸分子が、配列番号１に９５％相同な核酸配列、配列番号３に９５％相同な核酸配列、配列番号６に９５％相同な核酸配列、配列番号９に９５％相同な核酸配列、配列番号１１に９５％相同な核酸配列、配列番号１３に９５％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９５％相同な核酸配列からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ａ）に記載の複数の核酸分子が、配列番号１に９８％相同な核酸配列、配列番号３に９８％相同な核酸配列、配列番号６に９８％相同な核酸配列、配列番号９に９８％相同な核酸配列、配列番号１１に９８％相同な核酸配列、配列番号１３に９８％相同な核酸配列、及び配列番号１５に９８％相同な核酸配列からなる群から選択される１又は複数の核酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ａ）及びｂ）に記載の核酸配列がそれぞれ調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ａ及びｂ）に記載の核酸配列がそれぞれ、ヒト細胞中で機能的である調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ａ）及びｂ）に記載の核酸配列が、１又は複数の発現ベクターの一部である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１又は複数の発現ベクターがプラスミドである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
ｐＧＸ２００９及び／又はｐＧＸ２００６を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
以下の１又は複数を含む、請求項１０に記載の組成物：
配列番号１を含む核酸配列；
配列番号６を含む核酸配列；
配列番号９を含む核酸配列；
配列番号１３を含む核酸配列；
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする核酸配列；及び
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする核酸配列。
【請求項２１】
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする前記核酸配列が配列番号２１を含み、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする前記核酸配列が配列番号２３を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２２】
以下を含む請求項２０に記載の組成物：
配列番号９を含む核酸分子；
配列番号１３を含む核酸分子；及び
配列番号２３を含む核酸分子。
【請求項２３】
配列番号９を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号１３を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号２３を含む前記核酸分子がプラスミドである、
請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸配列を含む核酸分子を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載の組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の組成物を個体に投与するステップを含む、免疫応答を惹起する方法。
【請求項２７】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株による感染から個体を保護する方法であって、
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子を予防有効量で前記個体に投与するステップを含み、
前記核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記タンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項２８】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株による感染から個体を保護する方法であって、
ａ）以下からなる群から選択される第１の核酸配列：
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｂ）以下の１又は複数からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列：インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ２、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡ Ｈ４ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡ Ｎ１．．．インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ８、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ９、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１０、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１２、インフルエンザＡ Ｈ１３ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１４、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ２、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ３、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ４、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ５、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ７、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ８、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ９、インフルエンザＢヘマグルチニン、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ；
を含む予防有効量の組成物を個体に投与するステップを含み、
前記第１の核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記第１のタンパク質に対する免疫応答が惹起され、前記１又は複数の付加的核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、前記１又は複数の第２のタンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項２９】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項２８に記載の方法：
配列番号１を含む核酸配列；
配列番号９を含む核酸配列；
配列番号１３を含む核酸配列；
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする核酸配列；及び
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする核酸配列。
【請求項３０】
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする前記核酸配列が配列番号２１を含み、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする前記核酸配列が配列番号２３を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項２８に記載の方法：
配列番号９を含む核酸分子；
配列番号１３を含む核酸分子；及び
配列番号２３を含む核酸分子。
【請求項３２】
配列番号９を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号１３を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号２３を含む前記核酸分子がプラスミドである
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株に感染した個体を処置する方法であって、
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；
からなる群から選択される核酸配列を含む治療有効量の核酸分子を前記固体に投与するステップを含み、
前記核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記タンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項３４】
ブタ起源ヒトインフルエンザＡ株に感染した個体を処置する方法であって、
ａ）以下からなる群から選択される第１の核酸配列：
配列番号１、
配列番号１に９５％相同な核酸配列；
配列番号１の断片、
配列番号１の断片に９５％相同な核酸配列；
配列番号９、
配列番号９に９５％相同な核酸配列；
配列番号９の断片、及び
配列番号９の断片に９５％相同な核酸配列；並びに
ｂ）以下の１又は複数からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の付加的核酸配列：インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ２、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡ Ｈ４ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡ Ｎ１．．．インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ６、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ７、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ８、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ９、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１０、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１１、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１２、インフルエンザＡ Ｈ１３ インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１４、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１５、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ１、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ２、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ３、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ４、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ５、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ６、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ７、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ８、インフルエンザＡノイラミニダーゼＮ９、インフルエンザＢヘマグルチニン、及びインフルエンザＢノイラミニダーゼ；
を含む治療有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含み、
前記第１の核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、ブタ起源ヒトインフルエンザＡに対する防御免疫応答である前記第１のタンパク質に対する免疫応答が惹起され、前記１又は複数の付加的核酸配列が前記個体の細胞中で発現され、前記１又は複数の第２のタンパク質に対する免疫応答が惹起される、方法。
【請求項３５】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項３４に記載の方法：
配列番号１を含む核酸配列；
配列番号９を含む核酸配列；
配列番号１３を含む核酸配列；
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする核酸配列；及び
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする核酸配列。
【請求項３６】
インフルエンザＡヘマグルチニンＨ１をコードする前記核酸配列が配列番号２１を含み、インフルエンザＡヘマグルチニンＨ３をコードする前記核酸配列が配列番号２３を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が以下の１又は複数を含む、請求項３４に記載の方法：
配列番号９を含む核酸分子；
配列番号１３を含む核酸分子；及び
配列番号２３を含む核酸分子。
【請求項３８】
配列番号９を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号１３を含む前記核酸分子がプラスミドであり、
配列番号２３を含む前記核酸分子がプラスミドである、
請求項３７に記載の方法。
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５１７８００（Ｐ２０１３−５１７８００Ａ）
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５１２７５（Ｐ２０１２−５５１２７５）
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２６４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９４３５８
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５０４０７４７１０）ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア (20)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２６４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９４３５８
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５０４０７４７１０）ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア (20)
【Ｆターム（参考）】
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