説明

インプラント定着補助剤及びその製造方法

【課題】埋入されたインプラントの定着率を簡便に高めるインプラント定着補助剤を提供する。
【解決手段】骨形成能を有する細胞、好ましくは、骨分化誘導された骨髄間質細胞と、医薬として許容可能な担体とを含むインプラント定着補助剤並びに、骨分化誘導剤を含む培地で骨髄間質細胞を培養すること、培養後の骨髄間質細胞を、基材と混合すること、を含むインプラント定着補助剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インプラント定着補助剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
デンタルインプラントは、部分的、または全顎的歯牙欠損の患者における機能性や審美性を回復させる治療法として広く普及している。デンタルインプラントを必要とする患者は、有病者であることも多く、例えば、高齢化社会の背景から骨粗鬆症を有する患者にデンタルインプラントを行う機会も多い。骨粗鬆症は、インプラント治療において間接的なリスクになりうる疾患の一つであり、閉経期のエストロゲン分泌低下に起因する全身性骨格疾患である。このため、骨粗鬆症患者では、骨の微小構造と骨質の低下により骨が脆弱化し、易骨折を起こすことが多い。
【0003】
閉経10〜15年後の更年期以後の女性の約30%は骨粗鬆症に罹患していると言われており、これら骨粗鬆症においては口腔内の骨と骨格を形成する骨との間の有意な関連が報告されている。エストロゲンの欠乏状態がデンタルインプラント埋入周囲の骨組織にもたらす影響について、動物実験モデルを用いた研究がこれまでに報告されている(例えば、非特許文献1及び2)。それによると、主に海綿骨部分においては新たに形成された骨との接触状態や骨面積と骨密度が減少することが報告されている。
【0004】
骨粗鬆症による病的骨とインプラントの結合を改善しようとする様々な治療法が報告されている。例えば、骨吸収を抑制する方法として、非特許文献3には、エストロゲンによるホルモン補充療法が開示されている。また、非特許文献4には、閉経性骨粗鬆症の二次治療薬であるアレンドロネート(ビスフォスフォネート製剤)の投与法が開示されている。しかしながら、現在利用できる骨粗鬆症治療薬のほとんどは、主に骨の再吸収を抑制する働きをするもので、骨代謝を鈍化させ、結果的に骨量を減少させてしまう。それゆえ、臨床的観点から見た場合、骨粗鬆症におけるインプラントの骨結合を改善させるためには、副作用を減少させて、骨形成能を高められる方法が求められている。
【0005】
現在、研究されている様々な治療法の中で、局所的な骨質を改善させる方法の一つとして、骨髄間質細胞(BMSCs)を利用する方法が挙げられる。BMSCsを分離培養し、骨芽細胞に分化誘導させ、骨の欠損部に移植することで骨再生が得られること及び、骨密度が高くなることが報告されている(非特許文献5及び6)。BMSCsは、様々な細胞に分化することが知られており、BMSCsが分化誘導されることにより、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞になると報告されている。
【0006】
一方、欠損部を細胞のみで充たすためには多くの細胞を必要とし、また骨欠損部に細胞を維持することは容易ではなく、細胞に加えて種々の物質をスキャホールド(足場)として利用する技術も開発されている。例えば、特許文献1には、多血小板血漿(PRP)と骨形成能を有する細胞とを含んでなる骨又は歯周組織形成用の組成物が開示されている。また、特許文献2には、自己組織化能を有する両親媒性ペプチドを利用したペプチドハイドロゲルと、骨形成能を有する細胞と、多血小板血漿と、を含む再生医療用組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開2006−122518号公報
【特許文献2】特開2007−105186号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Implant Dent.; (2000) Vol.9, pp.303-309
【非特許文献2】Implant Dentistry, (2003) Vol.12, pp.340-346
【非特許文献3】Journal of Periodontology, (2005) Vol.76, pp.1496-1501
【非特許文献4】J. Oral Maxillofac Implants, (2003) Mar-Apr; Vol.18, pp.218-23
【非特許文献5】Implant Dent., (2008) Mar;17: pp.82-90
【非特許文献6】Cytotherapy,. (2008) Vol.10: pp.479-489
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、骨に欠損部を形成して骨の再生を確認する場合とは異なり、インプラント移植の場合には、チタンなどの金属で作製されたインプラントが、骨に対して充分に定着し、実用に耐えられる程度まで骨に支持されていなければならない。このため、骨の不足した患者にインプラント手術を行うには、インプラントの埋入手術の前に骨を造成して骨質を改善する必要があった。このように複数回手術を受けることは、患者にとって大きな負担となっていた。
本発明は、埋入されたインプラントの定着率を簡便に高めるインプラント定着補助剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は以下のとおりである。
[1] 骨形成能を有する細胞と医薬として許容可能な担体とを含むインプラント定着補助剤。
[2] 前記骨形成能を有する細胞が、骨分化誘導された骨髄間質細胞である[1]に記載のインプラント定着補助剤。
[3] 海綿骨に対して適用される[1]又は[2]に記載のインプラント定着補助剤。
[4] 前記骨分化誘導が、骨芽細胞への分化誘導である[1]〜[3]のいずれかに記載のインプラント定着補助剤。
[5] 骨分化誘導剤を含む培地で骨髄間質細胞を培養すること、培養後の骨髄間質細胞を、担体と混合すること、を含む[1]〜[4]のいずれかに記載のインプラント定着補助剤の製造方法。
[6] 前記骨分化誘導剤が、骨芽細胞への分化を誘導しうる[5]のいずれかに記載のインプラント定着補助剤の製造方法。
[7] 前記骨分化誘導剤が、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸及びデキサメタゾンからなる群より選択された少なくとも1種である[5]又は[6]のいずれかに記載のインプラント定着補助剤の製造方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、骨に対して埋入されたインプラントの定着率を簡便に高めるインプラント定着補助剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明の実施例にかかるSHAM群(左)、OVX群(中央)及びOVX−BMSCs群(右)の大腿骨遠位骨幹端におけるインプラント埋入28日後のトルイジンブルー染色像である(上:×1.25。下:×10)
【図2】本発明の実施例にかかるSHAM群、OVX群及びOVX−BMSCs群の大腿骨遠位骨幹端におけるインプラント埋入28日の皮質骨(A)又は海綿骨(B)のインプラント−骨接触率(BIC)を示すグラフである。(*:P<0.05、**:P<0.01)
【図3】本発明の実施例にかかるSHAM群、OVX群及びOVX−BMSCs群の大腿骨遠位骨幹端におけるインプラント埋入56日の皮質骨(A)又は海綿骨(B)のインプラント−骨接触率(BIC)を示すグラフである。(*:P<0.05、**:P<0.01)
【図4】本発明の実施例にかかるSHAM群、OVX群及びOVX−BMSCs群の大腿骨遠位骨幹端におけるインプラント埋入28日の皮質骨(A)又は海綿骨(B)の骨領域(BA)を示すグラフである。(*:P<0.05、**:P<0.01)
【図5】本発明の実施例にかかるSHAM群、OVX群及びOVX−BMSCs群の大腿骨遠位骨幹端におけるインプラント埋入28日の皮質骨(A)又は海綿骨(B)の骨領域(BA)を示すグラフである。(*:P<0.05、**:P<0.01)
【図6】本発明の実施例にかかるSHAM群、OVX群及びOVX−BMSCs群の大腿骨遠位骨幹端におけるインプラント埋入28日の骨密度(BD)を示すグラフである。(*:P<0.05、**:P<0.01)
【図7】本発明の実施例にかかるSHAM群、OVX群及びOVX−BMSCs群の大腿骨遠位骨幹端におけるインプラント埋入56日の骨密度(BD)を示すグラフである。(*:P<0.05、**:P<0.01)
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明のインプラント定着補助剤は、骨分化誘導された骨髄間質細胞と、医薬として許容可能な担体とを含むインプラント定着補助剤である。
【0014】
本インプラント定着補助剤は、骨分化誘導された骨髄間質細胞を含むインプラント定着補助剤であるので、インプラントを骨に埋入する際にインプラントの埋入部位の周辺に投与すると、投与部位の骨における骨量又は骨密度等が増えて骨の改質が生じると共に、インプラントとの接触面積も増大する。このため、インプラント定着補助剤を投与するだけで、インプラント定着補助剤を投与した周囲の骨に対するインプラントの定着が高まり、インプラントを充分に支持することができる。
【0015】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【0016】
骨形成能を有する細胞とは、骨組織を形成しうる細胞をいい、骨芽細胞、前骨芽細胞、並びに、骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞及び胚性幹細胞(ES細胞)、誘導多能性幹細胞(iPS細胞)等が挙げられる。これらの細胞は、1種を単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞を使用することが好ましい。ここで、「骨系細胞への分化能を獲得した」とは、未分化状態の間葉系幹細胞が、骨系細胞へ分化すべく方向付けされた状態をいう。骨系細胞への分化能を獲得した間葉系幹細胞は、自家細胞であることが好ましいが、同種他家細胞であってもよく、ヒト間葉系幹細胞由来の細胞を利用できる。
【0017】
前記未分化間葉系幹細胞の供給源としては、例えば、骨髄、骨膜、歯髄、さい帯血、脂肪、末梢血等が挙げられる。これらの従来公知の方法で採取した後、間葉系幹細胞をその接着性の有無に基づき選択する。すなわち、骨髄等に含まれる細胞の中で、接着性を有するもの等を選択することにより未分化間葉系幹細胞を得ることができる。
【0018】
また、簡便には、間葉系幹細胞は、骨髄間質細胞として使用することが、同様の作用を有する細胞を簡便に入手できるため好ましい。
【0019】
骨系細胞への分化能を獲得した細胞は、例えば、体内から採取した未分化細胞を、in vitroで、骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することで得ることができる。
骨系細胞への分化を誘導する条件下とは、各細胞を、骨系細胞への分化誘導因子の存在下で培養することであってもよい。
このような分化誘導因子としては、タンパク質、ペプチド、又はその他の生理活性物質を用いることができ、具体的には、デキサメタソン、ビタミンD3、β−グリセロリン酸、アスコルビン酸及びその塩、L−グルタミン、BMP−2、BMP−4、BMP−7、グルココルチコイド、インスリン、トランスフェリン、インドメタシン、Fibroblast growth factor(FGF)、Epidermal growth factor(EGF)、Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)、Hepatocyte growth factor (HGF)、Tumor necrosis factor(TNF−α)、並びにニコチンアミドからなる群より選択される少なくとも1種以上の物質を使用することができる。ただし、これらの誘導因子に限定されず、骨髄間質細胞を骨系細胞、好ましくは骨芽細胞へ分化誘導可能な物質であれば、特に制限されずに使用できる。
【0020】
上記の中でも特に好ましくは、デキサメタソン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸からなる群より選択された少なくとも1種を用いることであり、これらの組み合わせであることが更に好ましい。デキサメタゾンの添加量は、培地中に、好ましくは1×10−9〜1×10−6mol/L、より好ましくは1×10−9〜1×10−7mol/Lである。β−グリセロリン酸の添加量は、培地中に、好ましくは10〜1000mmol/l、より好ましくは20〜500mmol/Lである。アスコルビン酸又はその塩の添加量は、培地中に、好ましくは1×10−5〜1×10−2mol/L、より好ましくは5×10−5〜1×10−3mol/Lである。
【0021】
細胞の培養に用いられる培地としては特に制限はなく、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)や、RPMI1640などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。
【0022】
骨形成能を有する細胞であることは、骨芽細胞としての形態、表面抗原、又は遺伝子発現等に基づいて確認することができる。骨芽細胞としての形態、表面抗原又は遺伝子発現など指標については、既に公知であり、いずれを採用してもよい。例えば、遺伝子発現としては、アルカリホスファターゼ(ALP)、オステオネクチン(ON)、オステオポンチン(OP)、オステオカルシン(OC)、Runx2および、コラーゲン タイプI等を挙げることができる。これらの指標は、単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0023】
インプラント定着補助剤中の骨形成能を有する細胞の濃度としては、特に制限はなく、標的部位へ細胞の活性を損なうことなく導入できる濃度であればよい。このような濃度としては、例えば、組成物1ml中に1×10個以上の細胞が存在することが好ましく、さらに好ましくは1×10〜1×10個の細胞が存在することが好ましい。この範囲の細胞濃度とすることにより、インプラント定着補助剤を導入した部位におけるインプラントとの接触面積を高めることができる。
【0024】
医薬として許容可能な担体としては、骨形成能を有する細胞を標的部位へ導入するために適する担体であればよく、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液などの液体を挙げることができる。
【0025】
インプラント定着補助剤には、上記の細胞と担体の他、骨形成タンパク質(Bone Morphogenetic Protein:BMP)等を含んでもよい。これらの薬剤の濃度としては、特に制限はなく、通常用いられる濃度であればいずれも使用可能である。
【0026】
ただし、本発明のインプラント定着補助剤は、骨形成能を有する細胞に対して特別な足場を提供可能な成分を含む必要がない。なお、特別な足場を提供可能な成分を、足場として機能しない濃度で使用することは排除されない。
このような足場を提供可能な成分としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリ(DL−ラクチド−コ−グリコシド)などの合成高分子材料、コラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどのタンパク質材料、ヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、象牙質、サンゴなどの天然由来の材料、リン酸カルシウム(β−TCP)などの無機材料を挙げることができる。本発明におけるインプラント定着補助剤では、これらの成分を、三次元構造を維持するために適用する濃度で用いる場合は排除される。
【0027】
本発明のインプラント定着補助剤の形態は、インプラントを埋入する部位に対して適切に上述した細胞を導入できればよく、液剤などの注射剤、ゲル剤、又は軟膏等であってもよい。
【0028】
本発明のインプラント定着補助剤は、インプラント定着補助剤を埋入する骨に対して直接投与されればよく、例えば、インプラントを埋入する部位に設けられたインプラント窩内部又はインプラント窩周囲の骨、好ましくは海綿骨にインプラント定着補助剤を直接投与すればよい。
投与時のインプラント定着補助剤は、細胞量として、部位あたり、1×10〜1×10細胞で投与されればよい。この場合、例えば、1×10細胞/mlの濃度に細胞懸濁液を調製して、インプラント埋入時に局所注入すればよい。これにより、周囲骨に浸潤する量の細胞を投与できる。
【0029】
本発明のインプラント定着補助剤を用いることができるインプラントとしては、特に制限はなく、当業界において使用されているあらゆる種類のインプラントを挙げることができる。インプラントを構成する材料の例示としては、チタン(Ti)、チタン(Ti)合金、ステンレス鋼、コバルト(Co)−クロム(Cr)合金などの金属材料や、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、およびポリエステルなどの高分子材料を挙げることができる。好ましくは、熱に対する安定性を有する金属材料である。
【0030】
本発明のインプラント定着補助剤は、インプラントの埋入時に好適に用いることができる。即ち、本発明は、骨上にインプラントを挿入するための孔(インプラント窩)を形成すること、前記インプラント孔に上述したインプラント定着補助剤を注入すること、インプラントを前記インプラント孔に挿入することを含むインプラント治療方法も包含する。
これにより、インプラントの定着率を高め安定性を高めることができる。
【0031】
インプラント治療方法に用いられるインプラント定着補助剤の投与量等の事項は、上述した事項をそのまま適用すればよい。インプラント孔の形成には、既知の方法をそのまま適用すればよい。
【0032】
また本発明のインプラント定着補助剤は、骨に対して投与することによって、簡便に骨量を改善することができる。
従って、本発明は、インプラント用に制限されず、広く骨量を改善する必要がある患者に対して適用可能な、骨形成能を有する細胞と、医薬として許容可能な担体とを含む骨量改善組成物も包含する。
このような患者としては、骨粗鬆症患者、骨折患者、外傷後に再建が必要な患者等を挙げることができる。
本発明の骨量改善組成物については、上述したインプラント定着補助剤において記載した事項をそのまま適用することできる。
【0033】
また、本発明は、骨量を改善する必要がある患者に対して、骨形成能を有する細胞と、医薬として許容可能な担体とを含む骨量改善組成物を投与することを含む骨量改善方法も包含する。この骨量改善方法は、例えば、骨粗鬆症、骨折、外傷後に再建が必要な患者等の疾患の治療方法としても適用可能である。
骨量改善方法に用いられる骨量改善組成物については、上述したインプラント定着補助剤において記載事項をそのまま適用することができる。
骨量改善方法において投与される骨量改善組成物の投与量としては、ラットの大腿骨遠位骨幹端部に直径1mm×深さ1mmの骨欠損に対して、1×10細胞/mlとすることができる。
【実施例】
【0034】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。
【0035】
[実施例1]
(1)骨形成能を有する細胞の調製
骨髄間質細胞(BMSCs)は、168日齢のメスSDラット大腿骨の骨髄腔から採取した。全身麻酔下で大腿骨近位骨端および、遠位骨端を除去し、骨髄を10mL採取し、10v/v%牛胎児血清、抗菌薬(ペニシリン1000U/mL、ストレプトマイシン0.1mg/mL)を添加したDMEM培地中で37℃、5%CO条件下で3継代培養した。培地は3日毎に交換した。その後、50μg/mLのアスコルビン酸、10mMのβ−グリセロリン酸及び50nMのデキサメタゾンを加えた骨分化誘導培地培地で14日間培養し、80%コンフレントになったところで、0.05%トリプシン−EDTA溶液によって剥がし、移植用細胞として調製した。
【0036】
培養後の細胞が骨形成能を有する細胞であることは、骨分化誘導培地にて培養し、3継代目のBMSCsをRT−PCR法を用いて確認した。
具体的には、未処理のBMSCsと、骨分化誘導培地で培養したBMSCsからそれぞれトータルRNAを抽出し、RT−PCR法にてcDNA合成を行い、得られたcDNAに対して、骨形成関連遺伝子であるALP、ON、OP、OC、Runx2およびCollagen type1の6つのプライマー(表1)を用いて、常法に従ってPCRを行ない、アガロースゲル電気泳動を用いて、遺伝子発現を確認した。
【0037】
【表1】

【0038】
その結果、分化誘導処理群(Dex(+))のBMSCsは、骨分化誘導していない未処理群(Dex(−))のBMSCsと比べて、ALP、ON、OP、OC、Runx2および、Collagen type1の6つの骨形成表現型マーカーの強い発現が確認できた。これにより、処理群のMBSCsは、骨形成能を有する骨髄間質細胞であることが確認できた。この細胞を以下の実験に供した。
【0039】
(2)骨粗鬆症マウスの作製
36匹の生後84日齢メスSDラット(体重220〜230g、プラスチックゲージに入れ、食餌と飲料水は任意に与えた)を使用した。
これらの36匹のSDラットを、無作為に、卵巣摘出群(OVX;n=12)、偽手術群(SHAM;n=12)、さらに、OVXにBMSCsを移植した群(OVX−BMSCs;n=12)の3群に分類した。
【0040】
OVX群、又はSHAM群の各ラットに対して、ペントバルビタールナトリウム(40mg/kg)(ソムノペンチル[登録商標]:共立製薬)を腹腔内麻酔した。OVX群(n=24)は、背側より卵巣を露出し、完全に摘出した。一方、SHAM群(n=12)は、卵巣を持ち上げ、最初の位置に戻した。
【0041】
卵巣摘出後の評価は以下のようにして行った。
卵巣摘出による骨粗鬆症の発症は、手術後84日で各群から2匹のラットを屠殺し、遠位大腿骨骨端と子宮角の病理組織標本によって評価した。標本は10%緩衝バッファー・ホルマリンで固定したのち、大腿骨は脱灰液(カルキトックス[登録商標]:Wako)で脱灰し、トリミングし、パラフィン包埋した。子宮角の切片と大腿骨の縦軸方向5μ厚の切片は、光学顕微鏡で評価するためヘマトキシリン−エオジン染色で染色した。
卵巣摘出および、偽手術の84日後における遠位大腿骨の骨量変化については、マイクロCT(Scan Xmate−A090S:コムスキャンテクノ)を電圧31kV、電流100μAの条件下で使用して、観察した。大腿骨の断層スライス幅は18.03μm、400枚の画像から再構成した(n=3)。
【0042】
その結果、全ての動物に体重の自然増加がみられた。SHAMラットの手術時の体重は255.26±8.22gであり、一方、OVXラットの手術時の体重は257、45±9.26gであった。OVXラットは、SHAMラットと比較して、常に体重の増大が認められた。
【0043】
また、卵巣摘出84日後、遠位大腿骨骨幹端はOVX群において、著明な骨粗鬆症の変化がみられた。海綿骨の領域において骨量がまばらで、不規則で、不連続であった。一方、卵巣摘出後の子宮角に著明な萎縮がみられた。また、子宮角の腺組織は欠乏している。
対照的にSHAM群では大腿骨の密度は高く、規則正しく配列していた。また、マイクロCT画像において、OVX群はSHAM群と比較し、著しい海綿骨の微小構造の劣化および骨量減少が観察された。SHAMにおいて、緊密に海綿骨領域に充実した骨組織が認められた。
このように、OVX群では、大腿骨遠位骨幹端および、子宮角の組織学的評価において、腺組織の萎縮や骨量の減少が認められ、骨粗鬆症を誘発したことが確認された。
このOVX群を、以下の細胞移植及びインプラント移植に供した。
【0044】
(3)細胞移植とインプラント移植
全身麻酔下で遠位大腿皮膚を10mm切開し、骨を露出させた。その後、生理食塩水による持続的注水下で大腿骨遠位骨端から7mmの位置に、バイコルチカルに上皮質骨から海面骨、下皮質骨に向けてインプラント床を、歯科用バー(直径1mm、深さ1mm)で1500rpm以下の回転数で形成した。
OVX−BMSCs群では、生理食塩水中に1×10cell/mLで調整されたBMSCs懸濁液100μLを、インプラント窩より海綿骨に注入した。その後、超音波浴槽中で無水エタノール洗浄し、滅菌した全長5mm、スレッド径2mm、ピッチ1mmのスクリュー型チタンインプラント(ATSM F67、Grade2、西島メディカル株式会社)を、スレッドが完全に皮質骨内に隠れるように埋入し、軟組織を元の位置で縫合した。
【0045】
インプラント埋入後28日又は56日後に各群のラットを屠殺し、大腿骨を摘出後、60v/v%エタノールで24時間固定した。その後、非脱灰切片を、60v/v%〜100v/v%にそれぞれ調整したエタノール溶液にこの順に順次浸漬して脱水を行い、グリコールメタクリレート(テクノビット7200[登録商標]:Hereus Kulzer)中に樹脂包埋した。続いて研磨標本(80μm)を作製し、1%トルイジンブルーにて染色した。
以下に示すように、研磨標本の写真画像を用いて、インプラントスレッド内部における骨とインプラントが接触している表面全体の長さと、インプラント全体における骨とインプラントが接触している長さとの割合(接触率:BIC)および、スレッド内部の骨面積(ねじ溝に侵入した骨の面積)(BA)の割合を求めた。さらに、インプラント表面(ねじ最端部の外周)から側方へ500μmの幅にある石灰化基質の割合を骨密度(BD)とし、インプラント画像の左右双方に対してそれぞれの計算した(Image−Pro[登録商標]:Media Cybernetics)。データは皮質骨および海綿骨において計測し、骨密度は海綿骨においてのみ測定した。なお、インプラントスレッド(ネジ山)から、インプラントスレッドスレッド(ネジ山)までの凹部を、「スレッド内部」又は「インプラントスレッド内部」と称することがある。
【0046】
【数1】

【0047】
統計分析は、IBM SPSS Statistics Server 18[登録商標](SPSS)を用いて行った。はじめに全てのラットのデータを集計し、平均±標準偏差(SD)を算出した。その後、シャピロ・ウイルクの正規性の検定を全てのパラメーターについて実施し、テューキーの多重比較検定(α=0.05)によりそれぞれの群間の差を判定した。各関連グループのインプラント埋入後28日および56日のBIC、BA、BDの経時的な差はt検定を用いて比較した。統計的有意差判定として、有意確率は5%未満(P<0.05)とした。
【0048】
(4)結果
1)組織形態学的結果
(a)インプラント埋入後28日(図1参照)
皮質骨の領域では、各群とも、インプラント表面の多くは新生骨と直接接触しており、スレッド内も多くの部分が骨組織で満たされていた。各群の間に明らかな違いはみられなかった。
SHAM群においてはスレッド内に新生骨の形成がみられ、インプラント表面では新生骨は網状の構造を呈していた。スレッド内では、SHAM群の骨はOVX群に比べやや多くみられた。一方、OVX群ではスレッド内の骨は他群に比べ薄くまばらで、インプラント表面に接触する骨も少なかった。OVX−BMSCsは、OVX群よりやや多くの骨形成が見られた。
スレッド外ではSHAM群に比べ、OVX群は骨形成される領域が明らかに少なかった。また、OVX−BMSCs群では、OVX群に比べ、スレッド外でも高率に骨形成が見られた。
【0049】
(b) インプラント埋入後56日
皮質骨の領域では、各群ともインプラント表面の新生骨と直接接触している領域が28日に比べ多くなり、スレッド内を満たす骨組織の量も増加したが、各群の間に明らかな違いはみられなかった。
海綿骨の領域において、インプラント表面では接触している骨が各群で増加した。SHAM群とOVX−BMSCsでは大きな違いはみられなかった。SHAM群、OVX群、OVX−BMSCs群の各群においては28日に比べスレッド内の新生骨がより多くみられた。
OVX−BMSCs群では、骨梁様構造を呈し、網状構造を呈していた。一方、OVX群ではスレッド内の骨形成とインプラント表面での骨の接触は28日に比べ多くみられたが、SHAM群、OVX−BMSCs群に比べ、少なかった。スレッド外では、SHAM群に比べOVX群の骨形成がより多く見られた。
【0050】
2) インプラント−骨接触率(BIC)
図2(A)に示されるように、SHAM群、OVX群及びOVX−BMSCs群の各群は、皮質骨において、インプラント埋入後28日では有意な差はみられなかった(P>0.05)。図3(A)に示されるように、インプラント埋入後56日では、各群ともBIC値は増加した(P<0.01)。
一方、海綿骨については、図2(B)に示されるように、インプラント埋入後28日では、SHAM群、OVX−BMSCs群の各群の間に有意差はみられなかったが(P>0.05)、OVX群はSHAM群、OVX−BMSCs群に比べ明らかに低値であった(P<0.01)。また、図3(B)に示されるようにインプラント埋入後56日では、各群とも数値は増加した(P<0.05)。一方、OVX群は、SHAM群、OVX−BMSCs群に比べ明らかに低値であった(P<0.01)
【0051】
3) インプラントスレッド内の骨領域(BA)
皮質骨においては、図4(A)及び図5(A)に示されるように、インプラント埋入後28日及び56日では、共に、各群に有意差はみられなかった(P<0.05)
海綿骨においては、図4(B)に示されるように、インプラント埋入後28日では、OVX群はSHAM群、OVX−BMSCs群に比べ明らかに低値であった(P<0.01)。図5(B)に示されるように、インプラント埋入後56日では、各群とも数値の増加がみられたが、SHAMとOVX−BMSCsに有意差はみられなかった(P<0.05)。
4)インプラント周囲の骨密度(BD)
図6に示されるように、インプラント埋入後28日では、OVX群は他群と比較して、低値を示したが(P<0.01)、 OVX群と比べてOVX−BMSCs群ではOVX群と比べて、有意に高値を示した(P<0.01)。
図7に示されるように、インプラント埋入後56日では、各群とも数値は増加した(P<0.05)。OVX−BMSCs群では、OVX群と比べてほぼ高値であった(P<0.05)。
【0052】
このように、インプラント埋入後28日および56日では,OVX−BMSCs群ではOVX群に比べBICやBAが向上した。さらにインプラントスレッド外のBDにおいても骨量の向上がみられた。これはBMSCsがインプラント表面のごくわずかな範囲だけでなく、細胞を注入した広い範囲の骨質が改善されたことを示しており、接触率も良好に向上することが明らかである。この結果、インプラントの生着の向上が期待できる。
【0053】
従って、本発明のインプラント定着補助剤を用いることにより、骨質、特に海綿骨の骨質を改善でき、また、インプラントと骨との接触率が向上して、インプラントの定着が良好になることがわかる。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨形成能を有する細胞と医薬として許容可能な担体とを含むインプラント定着補助剤。
【請求項2】
前記骨形成能を有する細胞が、骨分化誘導された骨髄間質細胞である請求項1記載のインプラント定着補助剤。
【請求項3】
海綿骨に対して適用される請求項1又は請求項2記載のインプラント定着補助剤。
【請求項4】
前記骨分化誘導が、骨芽細胞への分化誘導である請求項1〜請求項3のいずれか1項記載のインプラント定着補助剤。
【請求項5】
骨分化誘導剤を含む培地で骨髄間質細胞を培養すること、
培養後の骨髄間質細胞を、担体と混合すること、
を含む請求項1〜請求項4のいずれか1項記載のインプラント定着補助剤の製造方法。
【請求項6】
前記骨分化誘導剤が、骨芽細胞への分化を誘導しうる請求項5記載の製造方法。
【請求項7】
前記骨分化誘導剤が、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸及びデキサメタゾンからなる群より選択された少なくとも1種である請求項5又は請求項6記載の製造方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【公開番号】特開2012−90822(P2012−90822A)
【公開日】平成24年5月17日(2012.5.17)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−241399(P2010−241399)
【出願日】平成22年10月27日(2010.10.27)
【出願人】(504139662)国立大学法人名古屋大学 (996)
【Fターム(参考)】