インボルクリン産生促進剤
【課題】日常生活のなかで加齢、ストレス又は紫外線などにより引き起こされた皮膚の肌荒れ、バリア機能の低下又キメの粗さなどの改善予防効果及び治療効果に優れた、安全で安定な、安価な、化粧品及び医薬品に配合して好適なヒト皮膚表皮角化細胞を改善できるインボルクリン産生促進剤を提供すること。
【解決手段】コンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン産生促進剤、当該インボルクリン産生促進剤を含有する化粧品及び医薬品である。
【解決手段】コンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン産生促進剤、当該インボルクリン産生促進剤を含有する化粧品及び医薬品である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインボルクリン産生促進剤に関し、詳細には、ヒト皮膚表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進させることにより表皮機能を改善でき、さらに皮膚の肌荒れ、バリア機能低下及びキメなども改善できるインボルクリン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴う新陳代謝の減衰により皮膚の老化が生じるが、太陽光（紫外線）や酸化等による乾燥や肌荒れも皮膚の老化の原因となる。皮膚の老化は、表皮におけるしわ増加などの形態学的変化、あるいは表皮水分量の減少や皮膚弾性の低下などの生理学的・機能的変化として現れる。皮膚の表皮は本来の機能が正常に働くことによって、うるおいがあり、キメが整い、滑らかな表面状態を保つことができる。しかし、日常生活の中で、ストレス、睡眠不足、乾燥環境又は紫外線暴露等によって表皮角化細胞の機能に低下や不調が生じた場合、健康で美しい皮膚を維持できなくなる。
【０００３】
インボルクリンは表皮角化細胞によって産生され、健全な角層バリア機能形成に関わるコーニファイドエンベロープの前駆体タンパクの一つである。そして、他の角化不溶性膜のタンパク質やロリクリンなどとトランスグルタミナーゼによって架橋され不溶化し、さらに、その一部はセラミドなどと共有結合し、角層バリア機能に重要な役割を担っていることが知られている。
【０００４】
老化した皮膚を改善するために保湿剤を配合した化粧品が数多く提案されている。保湿剤としては、ヒアルロン酸ナトリウムやコンドロイチン硫酸ナトリウムなどのムコ多糖類、水溶性コラーゲンやポリペプチドなどのコラーゲン、グリシンやセリンなどのアミノ酸等の生態高分子（生化学製品）及びグリセリンやポリエチレングリコールなどの多価アルコール等の合成高分子製品がある。しかしながら、これらの保湿剤では、皮膚表面の水分を保持するだけで、本質的に老化した皮膚を改善したり、老化を防止したりすることができない。そこで、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及び抗酸化作用のいずれかの作用又はこれら複数の作用を有する物質の検索と配合が試みられている。表皮角化細胞のコラーゲン産生を促進する物質としては、例えばカキの葉又はサンザシの果実の抽出物（例えば、特許文献１参照。）、カッコン抽出物（例えば、特許文献２参照。）等が知られている。また、エタノールアミン誘導体、ペントキシフィリン、硫酸塩及びセリン誘導体などのコラゲナーゼ産生促進物質と、アスコルビン酸誘導体などのコラーゲン合成促進物質を組み合わせたもの（例えば、特許文献３参照。）もある。表皮角化細胞のヒアルロン酸産生を促進する物質としては、例えばＮ−アセチルグルコサミン（例えば、特許文献４参照。）、しそ科植物抽出物（例えば、特許文献５参照。）等が知られている。表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進する物質としては、例えばオトギリソウ科セイロンテツボクの種子抽出物（例えば、特許文献６参照。）、シラカンバ樹液（例えば、特許文献７参照。）等が知られている。
【０００５】
しかし、各物質の安定性、副作用、効果や入手容易性などの点から未だ十分なものではなかった。また、外用による表皮機能改善剤を開発する場合、物質による角層透過率の差を考慮し、当該物質の表皮角化細胞環境濃度を、コラーゲン産生促進物質、ヒアルロン酸産生促進物質又はインボルクリン産生促進物質の各々が効果を発揮する濃度になるように設定することは極めて困難であった。この観点からも、複数の効果を併せ持つ物質が望まれた。このようなものとして、本発明者らは、γ−アミノ酪酸が表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つこと（例えば、特許文献８参照。）を見出している。
【０００６】
インボルクリン産生促進作用を有する成分としては上記以外にも、例えばサイシン及びラフマなどの抽出物（例えば、特許文献９参照。）、サンショウ、セイヨウハッカ、ユーカリ、ユキノシタ、ローズマリー、アスパラサス、ヒレハリソウ、シイタケ、ショウブ、イブキジャコウソウ、ワレモコウ、ガンビール、イチョウ、クズ、カリン、クチナシ、ビワ、アカキナノキ、サンザシ、チョウジノキ、ヨモギ及びキハダなどの抽出物（例えば、特許文献１０参照。）、酵母、モモ、アロエ、ノイバラ、トウキンセンカ、アルニカ、ダイダイ、ラベンダー、オトギリソウ、ウンシュウミカン、メリッサ、ヘチマ及びスギナなどの抽出物（例えば、特許文献１１参照。）、褐藻植物のコンブ科コンブ属マコンブの抽出物（例えば、特許文献１２参照。）、キク科レオントポディウム属植物のエーデルワイスの抽出物（例えば、特許文献１３参照。）、グリチルリチン酸ジカリウム（例えば、特許文献１４参照。）、ローヤルゼリーの抽出物（例えば、特許文献１５参照。）、グリセロールリン酸誘導体（例えば、特許文献１６参照。）、バンレイシの種子抽出物（例えば、特許文献１７参照。）、カルダモニン（例えば、特許文献１８参照。）、ノニの抽出物（例えば、特許文献１９参照。）、１６−メチルオクタデシルリン酸、１７−メチルオクタデシルリン酸、１１−（２−メチルブトキシ）ウンデシルリン酸、オクタデシルリン酸、ヘキサデシルリン酸、テトラデシルリン酸及びドデシルリン酸（例えば、特許文献２０参照。）などが知られている。
【０００７】
一方、コンドロイチン硫酸は、保湿剤、感触改良剤、増粘剤、乳化安定剤等として、通常ナトリウム塩として市販されており、化粧品、医薬部外品、医薬品及び食品などに用いられている。このようなものとしては、皮膚保湿のための水中油型乳剤性ローション剤（例えば、特許文献２１参照。）や、創傷（潰瘍）のようなコラーゲン原線維形成に関連する疾患又は状態を治療するための医薬品（例えば、特許文献２２参照。）や、眼圧上昇の危険を減少させる眼科外科用の弾粘性溶液（例えば、特許文献２３参照。）などがある。しかしながら、コンドロイチン硫酸自体にインボルクリン産生促進作用があることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１６０６２９号公報
【特許文献２】特開２００１−３４８３３８号公報
【特許文献３】特開平６−１５７２３２号公報
【特許文献４】特開２００１−２５５１号公報
【特許文献５】特開平１０−９５７３５号公報
【特許文献６】特開２００５−２１３１８７号公報
【特許文献７】特開２００７−２１７３２６号公報
【特許文献８】特開２００９−１０７９３１号公報
【特許文献９】特開２００７−１９１４号公報
【特許文献１０】特開２００７−２７７１４９号公報
【特許文献１１】特開２００８−７４１２号公報
【特許文献１２】特開２００９−８４１９５号公報
【特許文献１３】特開２００９−８４２１２号公報
【特許文献１４】特開２００９−１１４１４６号公報
【特許文献１５】特開２００９−１８４９５５号公報
【特許文献１６】特開２００９−２０３１９２号公報
【特許文献１７】特開２００９−２４２３１０号公報
【特許文献１８】特開２０１０−２４１９０号公報
【特許文献１９】特開２０１０−９００９３号公報
【特許文献２０】特開２０１０−１１１６１９号公報
【特許文献２１】特開平１１−１８０８２１号公報
【特許文献２２】特表２００７−５３４７４９号公報
【特許文献２３】特許第３２２４８１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ヒト皮膚表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進させることにより、日常生活のなかで加齢、ストレス又は紫外線などによって引き起こされた皮膚の肌荒れ、バリア機能の低下又はキメの粗さなどの改善予防効果及び治療効果に優れた、安全で安定な、安価な、化粧品及び医薬品に配合して好適なヒト皮膚表皮角化細胞を改善できるインボルクリン産生促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行った結果、コンドロイチン硫酸がインボルクリン産生促進作用及びインボルクリン遺伝子（インボルクリンメッセンジャーＲＮＡ、以下インボルクリンｍＲＮＡという。）発現促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明はコンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン産生促進剤である。また、本発明はコンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン遺伝子発現促進剤である。本発明は上記インボルクリン産生促進剤又はインボルクリン遺伝子発現促進剤を含有する化粧品及び医薬品も包含する。上記化粧品は、さらにＮ−アセチルグルコサミンを含有することが望ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のインボルクリン産生促進剤は、ヒト皮膚表皮角化細胞のインボルクリン産生及びインボルクリンｍＲＮＡ発現を促進することにより、日常生活のなかで加齢、ストレス又は紫外線などによって引き起こされた皮膚の肌荒れ、バリア機能の低下又はキメの粗さなどの改善予防効果及び治療効果に優れるため、皮膚のうるおい、キメ、バリア機能等を改善できる。また、安全で安定な、安価な、ヒト皮膚表皮角化細胞の改善できる化粧品及び医薬品が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明における表皮角化細胞のインボルクリンｍＲＮＡ発現に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を示すグラフである。
【図２】本発明における表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を示すグラフである。
【図３】本発明における表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明のインボルクリン産生促進剤に用いるコンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ及びこれらの塩が挙げられる。コンドロイチン硫酸の塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、ルビジウム塩などのアルカリ金属塩、ベリリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩などのアルカリ土類金属塩が挙げられる。上記コンドロイチン硫酸は、鮭、サメ、イカ、鯨、ウシ及び豚などの動物から得られ、通常は軟骨、皮膚などの部位が用いられる。上記コンドロイチン硫酸は市販品を用いることができる。例えば、「コンドロイチン硫酸Ａ．ナトリウム塩（クジラ軟骨）．ＳＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ａ．ナトリウム塩（クジラ軟骨）．
ＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ａ．ナトリウム塩（チョウザメ脊索）」、「コンドロイチン硫酸Ｂ．ナトリウム塩（ブタ皮）」、「コンドロイチン硫酸Ｃ．ナトリウム塩（サメ軟骨）．ＳＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ｃ．ナトリウム塩（サメ軟骨）．ＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ｄナトリウム塩（サメ軟骨）」、「コンドロイチン硫酸Ｅ．ナトリウム塩（イカ軟骨）」など（以上、生化学バイオビジネス株式会社）、秋鮭鼻軟骨由来のコンドロイチン硫酸ナトリウムであってコンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃが混在する「ＭＣマリンコンドロイチン」及び「ＳＣＳマリンコンドロイチン」（ともに株式会社日本バリアフリー）、豚気管軟骨由来の「コンドロイチン硫酸ナトリウム（外原基）」、「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＴ−Ｐ」及び「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＣ−Ｐ」（以上、ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）などが挙げられる。上記コンドロイチン硫酸のなかでは、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びこれらのナトリウム塩が好ましく、更にはコンドロイチン硫酸Ｃ及びその塩が好ましいが、現時点ではその作用メカニズムは明らかではない。これらコンドロイチン硫酸は、１種単独又は２種以上を有効成分として本発明のインボルクリン産生促進剤に配合する。コンドロイチン硫酸は化粧品、医薬部外品、医薬品及び食品などに用いられてきた物質であって安全性に問題はなく、安定性においても優れている。
【００１５】
上記コンドロイチン硫酸は、例えば次の製造方法によって得られる。まず原料として、鮭、サメ、イカ、鯨、ウシ又は豚由来の軟骨又は皮膚を適宜使用する。次に、この原料に常法による酵素処理を施して、タンパク質を除去する。さらに常法による脱カルシウム処理、脱脂処理、脱色処理及び脱臭処理を施す。各処理工程を経て得られた溶液にトリクロル酢酸を添加し、トリクロル酢酸の最終濃度が１０％になるように調製する。調製液を４℃で２４時間静置した後、遠心分離し、得られた上清を２４時間透析する。透析内液に１０％酢酸ナトリウムを加えて、得られた上清にエタノールを添加し、得られる沈殿物をコンドロイチン硫酸の粗抽出物として回収する。コンドロイチン硫酸の粗抽出物はゲルろ過クロマトグラフィー用担体「セファデックスＧ−２５」（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製し、得られた精製物を粉末にして回収する。
【００１６】
本発明のインボルクリン産生促進剤には、有効成分である上記コンドロイチン硫酸以外に、目的に応じて化粧品又は医薬品に通常使用されている成分又は使用が許容されている成分を、本発明の効果を損なわない範囲内で適宜配合することができる。
【００１７】
本発明のインボルクリン産生促進剤の剤型としては、上記製造方法例により得られた粉末状のほか、適宜溶媒を用いて液状にしたり、適宜賦形剤を用いて顆粒状にしたりするなど使用し易い状態に製剤化されたものを用いればよい。これらの剤形のインボルクリン産生促進剤は、皮膚に直接に塗布、貼布または散布する経皮投与や、経口投与などの投与方法をとることができる。
【００１８】
本発明のインボルクリン産生促進剤を含有する化粧品又は医薬品において、有効成分であるコンドロイチン硫酸の配合量は、化粧品又は医薬品の総量を基準として、乾燥固形分換算で０．００５質量％（以下、ｗｔ％と表記する。）以上、１０ｗｔ％以下が効果の発現性や原価の点から考えて好ましい。特に０．００５ｗｔ％以上、５ｗｔ％以下が製品に配合して応用する際に好ましい。
【００１９】
本発明のインボルクリン産生促進剤を化粧品又は医薬品に配合する際に、インボルクリン産生促進剤とともに配合する他の成分としては、化粧品又は医薬品のそれぞれにおいて通常使用できるものなら全て使用でき、効能、効果に応じ適宜選択する。
【００２０】
本発明の化粧品の形態は特に限定されるものではないが、例えばクリーム、乳液、化粧水、エッセンス、洗顔料、クレンジング料、パックなどの基礎化粧品、口紅、ファンデーシ
ョン、アイカラーなどのメイクアップ化粧品、ボディソープ、石鹸、シャンプー、リンス、コンデッショナーなどのトイレタリー製品、毛髪用セット剤などの毛髪用化粧品として用いることができる。本発明のインボルクリン産生促進剤を含有する化粧品は、皮膚老化防止効果に優れることから、皮膚外用形態の化粧品が好適である。
【００２１】
上記化粧品には、例えば一般に化粧品に用いられている賦形剤、香料などをはじめ、油脂類、界面活性剤、保湿剤、美白剤、ｐＨ調整剤、粘結剤類、多価アルコール類、精油及び香料類、増粘剤、防腐剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、顔料、植物粉砕物及び生薬類、無機塩類及び無機酸類、洗浄剤、乳化剤などの各種化粧品成分を適宜配合することができる。
【００２２】
本発明の化粧品は、上記配合可能な化粧品成分のなかでもＮ−アセチルグルコサミンを、コンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン産生促進剤とともに配合することが好ましい。両者を併用した場合、肌弾力性など老化した皮膚の改善効果がより優れたものとなる。Ｎ−アセチルグルコサミンの配合量は特に限定されないが、化粧品の総量を基準として、乾燥固形分換算で０．００５ｗｔ％以上、１０ｗｔ％以下が効果の発現性や原価の点から考えて好ましい。
【００２３】
本発明の医薬品の剤型としては特に限定されず、経口投与製剤でも非経口投与製剤のいずれであっても構わない。具体的には、エアゾール剤、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセル）、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、経皮吸収型製剤、懸濁剤、乳剤、坐剤（含膣剤）、散剤、酒精剤、錠剤（素錠、コーティング錠、特殊錠）、シロップ剤、浸剤・煎剤、注射剤（水溶性注射剤、非水溶性注射剤）、貼付剤、チンキ剤、点眼剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤などが挙げられる。これらの製剤は、製剤技術分野における慣用方法にて製造でき、例えば日本薬局方記載の方法で製造することができる。これらの製剤は、ヒトを含む哺乳動物に対して安全に投与することができるものである。
【００２４】
前記薬理学的に許容される担体としては特に限定されず、製剤素材として公知である各種担体物質を使用することができる。前記担体物質としては特に限定されず、例えば、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等を挙げることができる。前記担体物質に加えて、更に、防腐剤、着色剤、天然色素、甘味剤等の製剤添加物も必要に応じて用いることができる。これらの物質として、乳糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、トウモロコシデンプン、結晶セルロース、カルメロースカルシウム、無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク等が具体的に例示できるが、これらに限られるものではない。
【００２５】
液状製剤における前記担体物質としては特に限定されず、例えば、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合されるもの等を挙げることができる。更に、防腐剤、着色剤、水不溶性レーキ色素、甘味剤等の製剤添加物も必要に応じて用いることができる。これらの物質として、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース等の等張化剤、亜硫酸ナトリウム等の安定化剤、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸メチル等の保存剤等の他、溶解補助剤、無痛化剤やｐＨ調整剤等が具体的に例示できるが、これらに限られるものではない。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例及び比較例を例示することにより、本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２７】
（コンドロイチン硫酸の抽出・調製）
鮭の鼻軟骨を常法による酵素処理を施して、タンパク質を除去した。次に、常法による脱カルシウム処理、脱脂処理、脱色処理及び脱臭処理を施した。各処理工程を経て得られた溶液に、トリクロル酢酸を添加し、トリクロル酢酸の最終濃度が１０％になるように調製した。調製液を４℃で２４時間静置した後、遠心分離し、得られた上清を２４時間透析した。透析内液に１０％酢酸ナトリウムを加えて得られた上清に、エタノールを添加して、得られた沈殿物をコンドロイチン硫酸の粗抽出物として回収した。コンドロイチン硫酸の粗抽出物はゲルろ過クロマトグラフィー用担体「セファデックスＧ−２５」（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製し、得られた精製物を粉末にして回収した。粉末回収したコンドロイチン硫酸は、表皮角化細胞の増殖用無血清培地（ＫＧＭ）にて、コンドロイチン硫酸の終濃度が１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００ｍｇ／ｍｌの各濃度になるように調製し、以下の評価試験１及び２に用いた。これらのコンドロイチン硫酸には、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃが含まれる。
【００２８】
（評価細胞の調製）
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞増殖用無血清培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液処理により細胞を遊離させて回収し、以下の評価試験１〜３に用いた。
【００２９】
（評価試験１：インボルクリンｍＲＮＡ発現促進作用）
表皮角化細胞の分化マーカーであるインボルクリンｍＲＮＡ発現に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を以下の方法で評価した。
【００３０】
上記の方法で得られた評価細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、６ウェル培養プレートに２×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、１００μｇ／ｍｌ及び４００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸並びに１．５ｍＭの塩化カルシウムをそれぞれ添加して２４時間培養を行ったのち、細胞を回収して市販のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製「Ｓｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ」）にてインボルクリンｍＲＮＡ発現量を測定した。コンドロイチン硫酸無添加（以下、コントロールという。）を１００としたときのインボルクリンｍＲＮＡ発現量を図１に示す。図１から明らかなように、コンドロイチン硫酸はインボルクリンｍＲＮＡの発現を促進する作用があり、特に４００μｇ／ｍｌの濃度で顕著であった。
【００３１】
（評価試験２：インボルクリン産生促進作用）
表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を以下の方法で評価した。
【００３２】
上記の方法で得られた評価細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８ウェル培養プレートに２×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸並びに１．５ｍＭの塩化カルシウムをそれぞれ添加して４８時間培養を行った。その後、培地を抜いてからＰＢＳ（−）で洗浄したのち、細胞を培養プレートに固定させ、細胞表面に発現したインボルクリンの量を、モノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてインボルクリン産生量を定量した。コントロールを１００としたときのインボルクリン産生量を図２に示す。図２から明らかなように、コンドロイチン硫酸は濃度依存的にインボルクリン産生を促進した。
【００３３】
（評価試験３：コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃのインボルクリン産生促進作用）
表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃの影響を以下の方法で評価した。
【００３４】
コンドロイチン硫酸Ａとしてコンドロイチン硫酸Ａ約７０％とコンドロイチン硫酸Ｃ約３０％の「コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（牛気管由来）」、コンドロイチン硫酸Ｃとしてコンドロイチン硫酸Ｃ約９０％とコンドロイチン硫酸Ａ約１０％の「コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩（サメ軟骨由来）」（いずれもシグマ社製）を用い、表皮角化細胞の増殖用無血清培地（ＫＧＭ）にて、コンドロイチン硫酸の終濃度が１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００ｍｇ／ｍｌの各濃度になるように調製した。次に、上記の方法で得られた評価細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８ウェル培養プレートに２×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ並びに１．５ｍＭの塩化カルシウムをそれぞれ添加して４８時間培養を行った。その後、培地を抜いてからＰＢＳ（−）で洗浄したのち、細胞を培養プレートに固定させ、細胞表面に発現したインボルクリンの量を、モノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてインボルクリン産生量を定量した。コントロールを１００としたときのインボルクリン産生量を図３に示す。図３から明らかなように、いずれのコンドロイチン硫酸も濃度依存的にインボルクリン産生を促進するが、コンドロイチン硫酸Ａよりもコンドロイチン硫酸Ｃの関与が大きい。
【００３５】
以下に、本発明のインボルクリン産生促進剤を含有する化粧品及び医薬品組成物の実施例を示す。組成はｗｔ％で示す。なお、以下の実施例では、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「ＳＣＳマリンコンドロイチン」（株式会社日本バリアフリー）を用いた
【００３６】
（実施例１） 化粧水 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
Ｎ−アセチルグルコサミン ０．０５
エタノール ７．５
プラセンタエキス ０．０５
Ｄ−パントテニルアルコール ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
フェノキシエタノール ０．３
モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） ０．３
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．０５
エデト酸二ナトリウム ０．０５
濃グリセリン ３．５
１，３−ブチレングリコール ２．５
ポリグリセリン ０．５
キサンタンガム ０．５
ソルビット液 ５．０
カルボキシビニルポリマー ０．１
精製水 ｔｏ １００
【００３７】
（実施例２） 乳液 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
Ｄ−パントテニルアルコール ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
流動パラフィン １０．０
濃グリセリン ５．０
ジプロピレングリコール １０．０
ソルビット液 ５．０
サラシミツロウ ０．５
流動パラフィン １．５
親油型モノステアリン酸グリセリル ０．１
ステアリン酸 ０．３
メチルポリシロキサン １．０
ワセリン １．０
コレステロール ０．０２
ベントナイト ０．１
Ｎ−ステアロイル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ０．３
キサンタンガム ０．２
ベヘニルアルコール ０．３
フェノキシエタノール ０．２
ヒアルロン酸ナトリウム（２） ０．０５
水溶性コラーゲン（Ｆ） ０．１
鮭卵巣抽出物 ０．１
パラオキシ安息香酸エステル ０．１
Ｎ−アセチルグルコサミン ０．０５
精製水 ｔｏ １００
【００３８】
（実施例３） クリーム ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
Ｄ−パントテニルアルコール １．０
グリチルリチン酸ジカリウム ０．５
流動パラフィン ４．０
サラシミツロウ ０．５
コレステロール １．０
メチルシクロポリシロキサン ２．０
ジプロピレングリコール ７．０
親油型モノステアリン酸グリセリル ０．３
セチル硫酸ナトリウム １．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール １．０
ヒアルロン酸ナトリウム（２） ０．５
水溶性コラーゲン（Ｆ） ０．１
フェノキシエタノール ０．５
エデト酸二ナトリウム ０．０５
Ｎ−アセチルグルコサミン ０．０５
精製水 ｔｏ １００
【００３９】
（実施例４） 栄養クリーム ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １．０
ステアリン酸 ２．５
ステアリルアルコール ８．０
スクワラン ５．０
オクチルドデカノール ７．０
グリセリルモノステアレート ４．０
防腐剤 適 量
香料 適 量
グリセリン ６．０
ソルビトール １３．０
乳酸カリウム ０．５
精製水 ｔｏ １００
【００４０】
（実施例５） リップトリートメント ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
キャンデリラロウ １２．０
固形パラフィン ８．０
ミツロウ ５．０
カルナバロウ ２．０
ラノリン １４．０
マンニット １５．０
イソプロピルミリステート １０．０
香料 適 量
酸化防止剤 適 量
ヒマシ油 ｔｏ １００
【００４１】
（実施例６） パック ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．５
タルク ２５．０
プロピレングリコール ６．０
塩化カリウム ０．１
香料 適 量
カオリン ｔｏ １００
【００４２】
（実施例７） 乳液 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．２
ステアリン酸 ２．０
セタノール ２．０
ワセリン ２．０
ラノリンアルコール １．５
流動パラフィン ９．０
スクワラン ３．５
ソルビトール １０．０
トリエタノールアミン １．０
プロピレングリコール ５．０
防腐剤 適 量
香料 適 量
精製水 ｔｏ １００
【００４３】
（実施例８） 栄養クリーム ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １．０
ステアリン酸 ２．０
ステアリルアルコール ８．０
還元ラノリン ２．０
スクワラン ８．０
オクチルドデカノール ６．０
防腐剤 適 量
香料 適 量
プロピレングリコール ５．０
グリセリン ３．０
乳酸 ０．３
クエン酸ナトリウム ０．５
精製水 ｔｏ １００
【００４４】
（実施例９） スリミングマッサージジェル ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ２．０
グリセリン ６０．０
ポリエチレングリコール２００ １４．０
ポリビニルアルコール ０．２
精製水 ｔｏ １００
【００４５】
（実施例１０） スリミングマッサージソープ ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ５．０
ラウリン酸 １０．０
水酸化カリウム ２．８
ヤシ油脂肪酸カリウム液 ３０．０
エデト酸２ナトリウム ０．１５
メチルセルロース ０．５
ラウリン酸アミノプロピルベタイン液 ２．０
グリセリン ８．０
香料 適 量
精製水 ｔｏ １００
【００４６】
（実施例１１） マッサージ用ジェル ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．５
カフェイン ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．５
ポリビニルアルコール ３．０
グリセリン ３５．０
ポリエチレングリコール４００ ４５．０
エタノール 適 量
防腐剤 適 量
精製水 ｔｏ １００
【００４７】
実施例１から実施例１１の製法は通常の化粧品の方法に準じた。いずれの化粧品も連用により、肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００４８】
（実施例１２） 顆粒剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １０．０
デンプン ３０．０
乳糖 ４９．０
結晶セルロース ｔｏ １００
【００４９】
上記の各重量部を均一に混合し、常法により作製し顆粒剤とした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＴ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１包２０ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム２ｍｇ）を１日３回食後に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００５０】
（実施例１３） 錠剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １．０
結晶セルロース １．５
ビタミンＣ ２０．０
香料 １．０
グアガム ０．１
ショ糖脂肪酸エステル １．５
粉糖 ｔｏ １００
【００５１】
上記の各重量部を均一に混合し、常法により作製し錠剤とした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＴ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１錠５００ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム５ｍｇ）を毎晩就寝前に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００５２】
（実施例１４） ソフトカプセル剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ３．０
ビタミンＥ ２０．０
小麦胚芽油 １５．０
グリセリン脂肪酸エステル ５．０
ミツロウ ２．０
シソ油 ｔｏ １００
【００５３】
上記成分を混合し、ゼラチン、グリセリンからなるセラチン皮膜に充填し常法に準じソフトカプセルとした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＣ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１カプセル１００ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム３ｍｇ）を朝晩食後に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００５４】
（実施例１５） ハードカプセル剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １５．０
アスコルビン酸ナトリウム １８．０
デキストリン ２４．０
グリセリン脂肪酸エステル ０．５
粉糖 ｔｏ １００
【００５５】
上記成分を混合し、ゼラチンからなるカプセル容器に充填し常法に準じハードカプセルとした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＣ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１カプセル５０ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム７．５ｍｇ）を毎晩就寝前に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【技術分野】
【０００１】
本発明はインボルクリン産生促進剤に関し、詳細には、ヒト皮膚表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進させることにより表皮機能を改善でき、さらに皮膚の肌荒れ、バリア機能低下及びキメなども改善できるインボルクリン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴う新陳代謝の減衰により皮膚の老化が生じるが、太陽光（紫外線）や酸化等による乾燥や肌荒れも皮膚の老化の原因となる。皮膚の老化は、表皮におけるしわ増加などの形態学的変化、あるいは表皮水分量の減少や皮膚弾性の低下などの生理学的・機能的変化として現れる。皮膚の表皮は本来の機能が正常に働くことによって、うるおいがあり、キメが整い、滑らかな表面状態を保つことができる。しかし、日常生活の中で、ストレス、睡眠不足、乾燥環境又は紫外線暴露等によって表皮角化細胞の機能に低下や不調が生じた場合、健康で美しい皮膚を維持できなくなる。
【０００３】
インボルクリンは表皮角化細胞によって産生され、健全な角層バリア機能形成に関わるコーニファイドエンベロープの前駆体タンパクの一つである。そして、他の角化不溶性膜のタンパク質やロリクリンなどとトランスグルタミナーゼによって架橋され不溶化し、さらに、その一部はセラミドなどと共有結合し、角層バリア機能に重要な役割を担っていることが知られている。
【０００４】
老化した皮膚を改善するために保湿剤を配合した化粧品が数多く提案されている。保湿剤としては、ヒアルロン酸ナトリウムやコンドロイチン硫酸ナトリウムなどのムコ多糖類、水溶性コラーゲンやポリペプチドなどのコラーゲン、グリシンやセリンなどのアミノ酸等の生態高分子（生化学製品）及びグリセリンやポリエチレングリコールなどの多価アルコール等の合成高分子製品がある。しかしながら、これらの保湿剤では、皮膚表面の水分を保持するだけで、本質的に老化した皮膚を改善したり、老化を防止したりすることができない。そこで、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用及び抗酸化作用のいずれかの作用又はこれら複数の作用を有する物質の検索と配合が試みられている。表皮角化細胞のコラーゲン産生を促進する物質としては、例えばカキの葉又はサンザシの果実の抽出物（例えば、特許文献１参照。）、カッコン抽出物（例えば、特許文献２参照。）等が知られている。また、エタノールアミン誘導体、ペントキシフィリン、硫酸塩及びセリン誘導体などのコラゲナーゼ産生促進物質と、アスコルビン酸誘導体などのコラーゲン合成促進物質を組み合わせたもの（例えば、特許文献３参照。）もある。表皮角化細胞のヒアルロン酸産生を促進する物質としては、例えばＮ−アセチルグルコサミン（例えば、特許文献４参照。）、しそ科植物抽出物（例えば、特許文献５参照。）等が知られている。表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進する物質としては、例えばオトギリソウ科セイロンテツボクの種子抽出物（例えば、特許文献６参照。）、シラカンバ樹液（例えば、特許文献７参照。）等が知られている。
【０００５】
しかし、各物質の安定性、副作用、効果や入手容易性などの点から未だ十分なものではなかった。また、外用による表皮機能改善剤を開発する場合、物質による角層透過率の差を考慮し、当該物質の表皮角化細胞環境濃度を、コラーゲン産生促進物質、ヒアルロン酸産生促進物質又はインボルクリン産生促進物質の各々が効果を発揮する濃度になるように設定することは極めて困難であった。この観点からも、複数の効果を併せ持つ物質が望まれた。このようなものとして、本発明者らは、γ−アミノ酪酸が表皮角化細胞に対しヒアルロン酸産生促進効果とインボルクリン産生促進効果とを併せ持つこと（例えば、特許文献８参照。）を見出している。
【０００６】
インボルクリン産生促進作用を有する成分としては上記以外にも、例えばサイシン及びラフマなどの抽出物（例えば、特許文献９参照。）、サンショウ、セイヨウハッカ、ユーカリ、ユキノシタ、ローズマリー、アスパラサス、ヒレハリソウ、シイタケ、ショウブ、イブキジャコウソウ、ワレモコウ、ガンビール、イチョウ、クズ、カリン、クチナシ、ビワ、アカキナノキ、サンザシ、チョウジノキ、ヨモギ及びキハダなどの抽出物（例えば、特許文献１０参照。）、酵母、モモ、アロエ、ノイバラ、トウキンセンカ、アルニカ、ダイダイ、ラベンダー、オトギリソウ、ウンシュウミカン、メリッサ、ヘチマ及びスギナなどの抽出物（例えば、特許文献１１参照。）、褐藻植物のコンブ科コンブ属マコンブの抽出物（例えば、特許文献１２参照。）、キク科レオントポディウム属植物のエーデルワイスの抽出物（例えば、特許文献１３参照。）、グリチルリチン酸ジカリウム（例えば、特許文献１４参照。）、ローヤルゼリーの抽出物（例えば、特許文献１５参照。）、グリセロールリン酸誘導体（例えば、特許文献１６参照。）、バンレイシの種子抽出物（例えば、特許文献１７参照。）、カルダモニン（例えば、特許文献１８参照。）、ノニの抽出物（例えば、特許文献１９参照。）、１６−メチルオクタデシルリン酸、１７−メチルオクタデシルリン酸、１１−（２−メチルブトキシ）ウンデシルリン酸、オクタデシルリン酸、ヘキサデシルリン酸、テトラデシルリン酸及びドデシルリン酸（例えば、特許文献２０参照。）などが知られている。
【０００７】
一方、コンドロイチン硫酸は、保湿剤、感触改良剤、増粘剤、乳化安定剤等として、通常ナトリウム塩として市販されており、化粧品、医薬部外品、医薬品及び食品などに用いられている。このようなものとしては、皮膚保湿のための水中油型乳剤性ローション剤（例えば、特許文献２１参照。）や、創傷（潰瘍）のようなコラーゲン原線維形成に関連する疾患又は状態を治療するための医薬品（例えば、特許文献２２参照。）や、眼圧上昇の危険を減少させる眼科外科用の弾粘性溶液（例えば、特許文献２３参照。）などがある。しかしながら、コンドロイチン硫酸自体にインボルクリン産生促進作用があることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１６０６２９号公報
【特許文献２】特開２００１−３４８３３８号公報
【特許文献３】特開平６−１５７２３２号公報
【特許文献４】特開２００１−２５５１号公報
【特許文献５】特開平１０−９５７３５号公報
【特許文献６】特開２００５−２１３１８７号公報
【特許文献７】特開２００７−２１７３２６号公報
【特許文献８】特開２００９−１０７９３１号公報
【特許文献９】特開２００７−１９１４号公報
【特許文献１０】特開２００７−２７７１４９号公報
【特許文献１１】特開２００８−７４１２号公報
【特許文献１２】特開２００９−８４１９５号公報
【特許文献１３】特開２００９−８４２１２号公報
【特許文献１４】特開２００９−１１４１４６号公報
【特許文献１５】特開２００９−１８４９５５号公報
【特許文献１６】特開２００９−２０３１９２号公報
【特許文献１７】特開２００９−２４２３１０号公報
【特許文献１８】特開２０１０−２４１９０号公報
【特許文献１９】特開２０１０−９００９３号公報
【特許文献２０】特開２０１０−１１１６１９号公報
【特許文献２１】特開平１１−１８０８２１号公報
【特許文献２２】特表２００７−５３４７４９号公報
【特許文献２３】特許第３２２４８１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ヒト皮膚表皮角化細胞のインボルクリン産生を促進させることにより、日常生活のなかで加齢、ストレス又は紫外線などによって引き起こされた皮膚の肌荒れ、バリア機能の低下又はキメの粗さなどの改善予防効果及び治療効果に優れた、安全で安定な、安価な、化粧品及び医薬品に配合して好適なヒト皮膚表皮角化細胞を改善できるインボルクリン産生促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行った結果、コンドロイチン硫酸がインボルクリン産生促進作用及びインボルクリン遺伝子（インボルクリンメッセンジャーＲＮＡ、以下インボルクリンｍＲＮＡという。）発現促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明はコンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン産生促進剤である。また、本発明はコンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン遺伝子発現促進剤である。本発明は上記インボルクリン産生促進剤又はインボルクリン遺伝子発現促進剤を含有する化粧品及び医薬品も包含する。上記化粧品は、さらにＮ−アセチルグルコサミンを含有することが望ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のインボルクリン産生促進剤は、ヒト皮膚表皮角化細胞のインボルクリン産生及びインボルクリンｍＲＮＡ発現を促進することにより、日常生活のなかで加齢、ストレス又は紫外線などによって引き起こされた皮膚の肌荒れ、バリア機能の低下又はキメの粗さなどの改善予防効果及び治療効果に優れるため、皮膚のうるおい、キメ、バリア機能等を改善できる。また、安全で安定な、安価な、ヒト皮膚表皮角化細胞の改善できる化粧品及び医薬品が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明における表皮角化細胞のインボルクリンｍＲＮＡ発現に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を示すグラフである。
【図２】本発明における表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を示すグラフである。
【図３】本発明における表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明のインボルクリン産生促進剤に用いるコンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ及びこれらの塩が挙げられる。コンドロイチン硫酸の塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、ルビジウム塩などのアルカリ金属塩、ベリリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩などのアルカリ土類金属塩が挙げられる。上記コンドロイチン硫酸は、鮭、サメ、イカ、鯨、ウシ及び豚などの動物から得られ、通常は軟骨、皮膚などの部位が用いられる。上記コンドロイチン硫酸は市販品を用いることができる。例えば、「コンドロイチン硫酸Ａ．ナトリウム塩（クジラ軟骨）．ＳＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ａ．ナトリウム塩（クジラ軟骨）．
ＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ａ．ナトリウム塩（チョウザメ脊索）」、「コンドロイチン硫酸Ｂ．ナトリウム塩（ブタ皮）」、「コンドロイチン硫酸Ｃ．ナトリウム塩（サメ軟骨）．ＳＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ｃ．ナトリウム塩（サメ軟骨）．ＳＧ」、「コンドロイチン硫酸Ｄナトリウム塩（サメ軟骨）」、「コンドロイチン硫酸Ｅ．ナトリウム塩（イカ軟骨）」など（以上、生化学バイオビジネス株式会社）、秋鮭鼻軟骨由来のコンドロイチン硫酸ナトリウムであってコンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃが混在する「ＭＣマリンコンドロイチン」及び「ＳＣＳマリンコンドロイチン」（ともに株式会社日本バリアフリー）、豚気管軟骨由来の「コンドロイチン硫酸ナトリウム（外原基）」、「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＴ−Ｐ」及び「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＣ−Ｐ」（以上、ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）などが挙げられる。上記コンドロイチン硫酸のなかでは、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ及びこれらのナトリウム塩が好ましく、更にはコンドロイチン硫酸Ｃ及びその塩が好ましいが、現時点ではその作用メカニズムは明らかではない。これらコンドロイチン硫酸は、１種単独又は２種以上を有効成分として本発明のインボルクリン産生促進剤に配合する。コンドロイチン硫酸は化粧品、医薬部外品、医薬品及び食品などに用いられてきた物質であって安全性に問題はなく、安定性においても優れている。
【００１５】
上記コンドロイチン硫酸は、例えば次の製造方法によって得られる。まず原料として、鮭、サメ、イカ、鯨、ウシ又は豚由来の軟骨又は皮膚を適宜使用する。次に、この原料に常法による酵素処理を施して、タンパク質を除去する。さらに常法による脱カルシウム処理、脱脂処理、脱色処理及び脱臭処理を施す。各処理工程を経て得られた溶液にトリクロル酢酸を添加し、トリクロル酢酸の最終濃度が１０％になるように調製する。調製液を４℃で２４時間静置した後、遠心分離し、得られた上清を２４時間透析する。透析内液に１０％酢酸ナトリウムを加えて、得られた上清にエタノールを添加し、得られる沈殿物をコンドロイチン硫酸の粗抽出物として回収する。コンドロイチン硫酸の粗抽出物はゲルろ過クロマトグラフィー用担体「セファデックスＧ−２５」（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製し、得られた精製物を粉末にして回収する。
【００１６】
本発明のインボルクリン産生促進剤には、有効成分である上記コンドロイチン硫酸以外に、目的に応じて化粧品又は医薬品に通常使用されている成分又は使用が許容されている成分を、本発明の効果を損なわない範囲内で適宜配合することができる。
【００１７】
本発明のインボルクリン産生促進剤の剤型としては、上記製造方法例により得られた粉末状のほか、適宜溶媒を用いて液状にしたり、適宜賦形剤を用いて顆粒状にしたりするなど使用し易い状態に製剤化されたものを用いればよい。これらの剤形のインボルクリン産生促進剤は、皮膚に直接に塗布、貼布または散布する経皮投与や、経口投与などの投与方法をとることができる。
【００１８】
本発明のインボルクリン産生促進剤を含有する化粧品又は医薬品において、有効成分であるコンドロイチン硫酸の配合量は、化粧品又は医薬品の総量を基準として、乾燥固形分換算で０．００５質量％（以下、ｗｔ％と表記する。）以上、１０ｗｔ％以下が効果の発現性や原価の点から考えて好ましい。特に０．００５ｗｔ％以上、５ｗｔ％以下が製品に配合して応用する際に好ましい。
【００１９】
本発明のインボルクリン産生促進剤を化粧品又は医薬品に配合する際に、インボルクリン産生促進剤とともに配合する他の成分としては、化粧品又は医薬品のそれぞれにおいて通常使用できるものなら全て使用でき、効能、効果に応じ適宜選択する。
【００２０】
本発明の化粧品の形態は特に限定されるものではないが、例えばクリーム、乳液、化粧水、エッセンス、洗顔料、クレンジング料、パックなどの基礎化粧品、口紅、ファンデーシ
ョン、アイカラーなどのメイクアップ化粧品、ボディソープ、石鹸、シャンプー、リンス、コンデッショナーなどのトイレタリー製品、毛髪用セット剤などの毛髪用化粧品として用いることができる。本発明のインボルクリン産生促進剤を含有する化粧品は、皮膚老化防止効果に優れることから、皮膚外用形態の化粧品が好適である。
【００２１】
上記化粧品には、例えば一般に化粧品に用いられている賦形剤、香料などをはじめ、油脂類、界面活性剤、保湿剤、美白剤、ｐＨ調整剤、粘結剤類、多価アルコール類、精油及び香料類、増粘剤、防腐剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、顔料、植物粉砕物及び生薬類、無機塩類及び無機酸類、洗浄剤、乳化剤などの各種化粧品成分を適宜配合することができる。
【００２２】
本発明の化粧品は、上記配合可能な化粧品成分のなかでもＮ−アセチルグルコサミンを、コンドロイチン硫酸を有効成分として含有するインボルクリン産生促進剤とともに配合することが好ましい。両者を併用した場合、肌弾力性など老化した皮膚の改善効果がより優れたものとなる。Ｎ−アセチルグルコサミンの配合量は特に限定されないが、化粧品の総量を基準として、乾燥固形分換算で０．００５ｗｔ％以上、１０ｗｔ％以下が効果の発現性や原価の点から考えて好ましい。
【００２３】
本発明の医薬品の剤型としては特に限定されず、経口投与製剤でも非経口投与製剤のいずれであっても構わない。具体的には、エアゾール剤、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセル）、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、経皮吸収型製剤、懸濁剤、乳剤、坐剤（含膣剤）、散剤、酒精剤、錠剤（素錠、コーティング錠、特殊錠）、シロップ剤、浸剤・煎剤、注射剤（水溶性注射剤、非水溶性注射剤）、貼付剤、チンキ剤、点眼剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤などが挙げられる。これらの製剤は、製剤技術分野における慣用方法にて製造でき、例えば日本薬局方記載の方法で製造することができる。これらの製剤は、ヒトを含む哺乳動物に対して安全に投与することができるものである。
【００２４】
前記薬理学的に許容される担体としては特に限定されず、製剤素材として公知である各種担体物質を使用することができる。前記担体物質としては特に限定されず、例えば、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等を挙げることができる。前記担体物質に加えて、更に、防腐剤、着色剤、天然色素、甘味剤等の製剤添加物も必要に応じて用いることができる。これらの物質として、乳糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、トウモロコシデンプン、結晶セルロース、カルメロースカルシウム、無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク等が具体的に例示できるが、これらに限られるものではない。
【００２５】
液状製剤における前記担体物質としては特に限定されず、例えば、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合されるもの等を挙げることができる。更に、防腐剤、着色剤、水不溶性レーキ色素、甘味剤等の製剤添加物も必要に応じて用いることができる。これらの物質として、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース等の等張化剤、亜硫酸ナトリウム等の安定化剤、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸メチル等の保存剤等の他、溶解補助剤、無痛化剤やｐＨ調整剤等が具体的に例示できるが、これらに限られるものではない。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例及び比較例を例示することにより、本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２７】
（コンドロイチン硫酸の抽出・調製）
鮭の鼻軟骨を常法による酵素処理を施して、タンパク質を除去した。次に、常法による脱カルシウム処理、脱脂処理、脱色処理及び脱臭処理を施した。各処理工程を経て得られた溶液に、トリクロル酢酸を添加し、トリクロル酢酸の最終濃度が１０％になるように調製した。調製液を４℃で２４時間静置した後、遠心分離し、得られた上清を２４時間透析した。透析内液に１０％酢酸ナトリウムを加えて得られた上清に、エタノールを添加して、得られた沈殿物をコンドロイチン硫酸の粗抽出物として回収した。コンドロイチン硫酸の粗抽出物はゲルろ過クロマトグラフィー用担体「セファデックスＧ−２５」（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製し、得られた精製物を粉末にして回収した。粉末回収したコンドロイチン硫酸は、表皮角化細胞の増殖用無血清培地（ＫＧＭ）にて、コンドロイチン硫酸の終濃度が１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００ｍｇ／ｍｌの各濃度になるように調製し、以下の評価試験１及び２に用いた。これらのコンドロイチン硫酸には、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃが含まれる。
【００２８】
（評価細胞の調製）
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞増殖用無血清培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液処理により細胞を遊離させて回収し、以下の評価試験１〜３に用いた。
【００２９】
（評価試験１：インボルクリンｍＲＮＡ発現促進作用）
表皮角化細胞の分化マーカーであるインボルクリンｍＲＮＡ発現に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を以下の方法で評価した。
【００３０】
上記の方法で得られた評価細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、６ウェル培養プレートに２×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、１００μｇ／ｍｌ及び４００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸並びに１．５ｍＭの塩化カルシウムをそれぞれ添加して２４時間培養を行ったのち、細胞を回収して市販のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製「Ｓｍａｒｔ ｃｙｃｌｅｒ」）にてインボルクリンｍＲＮＡ発現量を測定した。コンドロイチン硫酸無添加（以下、コントロールという。）を１００としたときのインボルクリンｍＲＮＡ発現量を図１に示す。図１から明らかなように、コンドロイチン硫酸はインボルクリンｍＲＮＡの発現を促進する作用があり、特に４００μｇ／ｍｌの濃度で顕著であった。
【００３１】
（評価試験２：インボルクリン産生促進作用）
表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を以下の方法で評価した。
【００３２】
上記の方法で得られた評価細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８ウェル培養プレートに２×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸並びに１．５ｍＭの塩化カルシウムをそれぞれ添加して４８時間培養を行った。その後、培地を抜いてからＰＢＳ（−）で洗浄したのち、細胞を培養プレートに固定させ、細胞表面に発現したインボルクリンの量を、モノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてインボルクリン産生量を定量した。コントロールを１００としたときのインボルクリン産生量を図２に示す。図２から明らかなように、コンドロイチン硫酸は濃度依存的にインボルクリン産生を促進した。
【００３３】
（評価試験３：コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃのインボルクリン産生促進作用）
表皮角化細胞のインボルクリン産生に及ぼすコンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃの影響を以下の方法で評価した。
【００３４】
コンドロイチン硫酸Ａとしてコンドロイチン硫酸Ａ約７０％とコンドロイチン硫酸Ｃ約３０％の「コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（牛気管由来）」、コンドロイチン硫酸Ｃとしてコンドロイチン硫酸Ｃ約９０％とコンドロイチン硫酸Ａ約１０％の「コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩（サメ軟骨由来）」（いずれもシグマ社製）を用い、表皮角化細胞の増殖用無血清培地（ＫＧＭ）にて、コンドロイチン硫酸の終濃度が１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００ｍｇ／ｍｌの各濃度になるように調製した。次に、上記の方法で得られた評価細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８ウェル培養プレートに２×１０４個ずつ播種し、５％ＣＯ２環境下、３７℃で２４時間培養した。培養終了後、１００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ及び８００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ並びに１．５ｍＭの塩化カルシウムをそれぞれ添加して４８時間培養を行った。その後、培地を抜いてからＰＢＳ（−）で洗浄したのち、細胞を培養プレートに固定させ、細胞表面に発現したインボルクリンの量を、モノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてインボルクリン産生量を定量した。コントロールを１００としたときのインボルクリン産生量を図３に示す。図３から明らかなように、いずれのコンドロイチン硫酸も濃度依存的にインボルクリン産生を促進するが、コンドロイチン硫酸Ａよりもコンドロイチン硫酸Ｃの関与が大きい。
【００３５】
以下に、本発明のインボルクリン産生促進剤を含有する化粧品及び医薬品組成物の実施例を示す。組成はｗｔ％で示す。なお、以下の実施例では、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「ＳＣＳマリンコンドロイチン」（株式会社日本バリアフリー）を用いた
【００３６】
（実施例１） 化粧水 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
Ｎ−アセチルグルコサミン ０．０５
エタノール ７．５
プラセンタエキス ０．０５
Ｄ−パントテニルアルコール ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
フェノキシエタノール ０．３
モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） ０．３
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．０５
エデト酸二ナトリウム ０．０５
濃グリセリン ３．５
１，３−ブチレングリコール ２．５
ポリグリセリン ０．５
キサンタンガム ０．５
ソルビット液 ５．０
カルボキシビニルポリマー ０．１
精製水 ｔｏ １００
【００３７】
（実施例２） 乳液 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
Ｄ−パントテニルアルコール ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
流動パラフィン １０．０
濃グリセリン ５．０
ジプロピレングリコール １０．０
ソルビット液 ５．０
サラシミツロウ ０．５
流動パラフィン １．５
親油型モノステアリン酸グリセリル ０．１
ステアリン酸 ０．３
メチルポリシロキサン １．０
ワセリン １．０
コレステロール ０．０２
ベントナイト ０．１
Ｎ−ステアロイル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ０．３
キサンタンガム ０．２
ベヘニルアルコール ０．３
フェノキシエタノール ０．２
ヒアルロン酸ナトリウム（２） ０．０５
水溶性コラーゲン（Ｆ） ０．１
鮭卵巣抽出物 ０．１
パラオキシ安息香酸エステル ０．１
Ｎ−アセチルグルコサミン ０．０５
精製水 ｔｏ １００
【００３８】
（実施例３） クリーム ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
Ｄ−パントテニルアルコール １．０
グリチルリチン酸ジカリウム ０．５
流動パラフィン ４．０
サラシミツロウ ０．５
コレステロール １．０
メチルシクロポリシロキサン ２．０
ジプロピレングリコール ７．０
親油型モノステアリン酸グリセリル ０．３
セチル硫酸ナトリウム １．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール １．０
ヒアルロン酸ナトリウム（２） ０．５
水溶性コラーゲン（Ｆ） ０．１
フェノキシエタノール ０．５
エデト酸二ナトリウム ０．０５
Ｎ−アセチルグルコサミン ０．０５
精製水 ｔｏ １００
【００３９】
（実施例４） 栄養クリーム ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １．０
ステアリン酸 ２．５
ステアリルアルコール ８．０
スクワラン ５．０
オクチルドデカノール ７．０
グリセリルモノステアレート ４．０
防腐剤 適 量
香料 適 量
グリセリン ６．０
ソルビトール １３．０
乳酸カリウム ０．５
精製水 ｔｏ １００
【００４０】
（実施例５） リップトリートメント ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．１
キャンデリラロウ １２．０
固形パラフィン ８．０
ミツロウ ５．０
カルナバロウ ２．０
ラノリン １４．０
マンニット １５．０
イソプロピルミリステート １０．０
香料 適 量
酸化防止剤 適 量
ヒマシ油 ｔｏ １００
【００４１】
（実施例６） パック ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．５
タルク ２５．０
プロピレングリコール ６．０
塩化カリウム ０．１
香料 適 量
カオリン ｔｏ １００
【００４２】
（実施例７） 乳液 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．２
ステアリン酸 ２．０
セタノール ２．０
ワセリン ２．０
ラノリンアルコール １．５
流動パラフィン ９．０
スクワラン ３．５
ソルビトール １０．０
トリエタノールアミン １．０
プロピレングリコール ５．０
防腐剤 適 量
香料 適 量
精製水 ｔｏ １００
【００４３】
（実施例８） 栄養クリーム ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １．０
ステアリン酸 ２．０
ステアリルアルコール ８．０
還元ラノリン ２．０
スクワラン ８．０
オクチルドデカノール ６．０
防腐剤 適 量
香料 適 量
プロピレングリコール ５．０
グリセリン ３．０
乳酸 ０．３
クエン酸ナトリウム ０．５
精製水 ｔｏ １００
【００４４】
（実施例９） スリミングマッサージジェル ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ２．０
グリセリン ６０．０
ポリエチレングリコール２００ １４．０
ポリビニルアルコール ０．２
精製水 ｔｏ １００
【００４５】
（実施例１０） スリミングマッサージソープ ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ５．０
ラウリン酸 １０．０
水酸化カリウム ２．８
ヤシ油脂肪酸カリウム液 ３０．０
エデト酸２ナトリウム ０．１５
メチルセルロース ０．５
ラウリン酸アミノプロピルベタイン液 ２．０
グリセリン ８．０
香料 適 量
精製水 ｔｏ １００
【００４６】
（実施例１１） マッサージ用ジェル ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．５
カフェイン ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．５
ポリビニルアルコール ３．０
グリセリン ３５．０
ポリエチレングリコール４００ ４５．０
エタノール 適 量
防腐剤 適 量
精製水 ｔｏ １００
【００４７】
実施例１から実施例１１の製法は通常の化粧品の方法に準じた。いずれの化粧品も連用により、肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００４８】
（実施例１２） 顆粒剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １０．０
デンプン ３０．０
乳糖 ４９．０
結晶セルロース ｔｏ １００
【００４９】
上記の各重量部を均一に混合し、常法により作製し顆粒剤とした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＴ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１包２０ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム２ｍｇ）を１日３回食後に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００５０】
（実施例１３） 錠剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １．０
結晶セルロース １．５
ビタミンＣ ２０．０
香料 １．０
グアガム ０．１
ショ糖脂肪酸エステル １．５
粉糖 ｔｏ １００
【００５１】
上記の各重量部を均一に混合し、常法により作製し錠剤とした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＴ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１錠５００ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム５ｍｇ）を毎晩就寝前に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００５２】
（実施例１４） ソフトカプセル剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ３．０
ビタミンＥ ２０．０
小麦胚芽油 １５．０
グリセリン脂肪酸エステル ５．０
ミツロウ ２．０
シソ油 ｔｏ １００
【００５３】
上記成分を混合し、ゼラチン、グリセリンからなるセラチン皮膜に充填し常法に準じソフトカプセルとした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＣ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１カプセル１００ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム３ｍｇ）を朝晩食後に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【００５４】
（実施例１５） ハードカプセル剤 ｗｔ％
コンドロイチン硫酸ナトリウム １５．０
アスコルビン酸ナトリウム １８．０
デキストリン ２４．０
グリセリン脂肪酸エステル ０．５
粉糖 ｔｏ １００
【００５５】
上記成分を混合し、ゼラチンからなるカプセル容器に充填し常法に準じハードカプセルとした。なお、コンドロイチン硫酸ナトリウムとして「コンドロイチン硫酸ナトリウム（局外基）ＦＤＣ−Ｐ」（ＢｉｏｆａｃＡ／Ｓ）を使用した。１カプセル５０ｍｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム７．５ｍｇ）を毎晩就寝前に服用したところ、一ヶ月経過後に肌のしわ、水分量、弾力性などが改善された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸を有効成分として含有することを特徴とするインボルクリン産生促進剤。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸を有効成分として含有することを特徴とするインボルクリン遺伝子発現促進剤。
【請求項３】
請求項１に記載のインボルクリン産生促進剤又は請求項２に記載のインボルクリン遺伝子発現促進剤を含有する化粧品。
【請求項４】
さらにＮ−アセチルグルコサミンを含有する請求項２に記載の化粧品。
【請求項５】
請求項１に記載のインボルクリン産生促進剤又は請求項２に記載のインボルクリン遺伝子発現促進剤を含有する医薬品。
【請求項１】
コンドロイチン硫酸を有効成分として含有することを特徴とするインボルクリン産生促進剤。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸を有効成分として含有することを特徴とするインボルクリン遺伝子発現促進剤。
【請求項３】
請求項１に記載のインボルクリン産生促進剤又は請求項２に記載のインボルクリン遺伝子発現促進剤を含有する化粧品。
【請求項４】
さらにＮ−アセチルグルコサミンを含有する請求項２に記載の化粧品。
【請求項５】
請求項１に記載のインボルクリン産生促進剤又は請求項２に記載のインボルクリン遺伝子発現促進剤を含有する医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−４６４４２（Ｐ２０１２−４６４４２Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８９０２２（Ｐ２０１０−１８９０２２）
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（３０６０１８３６５）クラシエホームプロダクツ株式会社 (188)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（３０６０１８３６５）クラシエホームプロダクツ株式会社 (188)
【Ｆターム（参考）】
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