ウイルスベクターおよびその遺伝子治療のための使用
【課題】免疫学的遺伝子治療のために使用可能な、改善された効果を有するベクターを提供する。
【解決手段】ヒト単一鎖−ＩＬ１２をコードする核酸配列、ヒト４−１ＢＢリガンドをコードする核酸配列およびヒトＩＬ−２をコードする核酸配列を含有し、その際ベクターはアデノウイルスベクターである、遺伝子治療のためのベクター。
【解決手段】ヒト単一鎖−ＩＬ１２をコードする核酸配列、ヒト４−１ＢＢリガンドをコードする核酸配列およびヒトＩＬ−２をコードする核酸配列を含有し、その際ベクターはアデノウイルスベクターである、遺伝子治療のためのベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一鎖−インターロイキン−１２（単一鎖−ＩＬ−１２、"single chain IL-12"またはｓｃＩＬ−１２）および補助刺激因子−タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクター、ならびに遺伝子治療、特に腫瘍の治療のためのこれらのベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クレブス病は、依然として、先進国の国民において非常の高い死亡率を示すものである。肝細胞性癌腫（ＨＣＣ）は、たとえば、１個または複数個の大きな腫瘍が診断された場合に、平均生存期間が６ヶ月であるクレブズ病である（Llovet J.M. et al., Hepoatology, 1999, 29:62-67）。今日使用されている治療手段は、高周波切除、化学療法および経皮エタノール注射（ＰＥＩ）を含むものであって、これらは、小さい腫瘍の場合には一定量の結果を示すものの、大きい腫瘍の撲滅に関しては十分でないことが明らかである。
【０００３】
したがって、技術水準において遺伝子治療によるＨＣＣの治療が提案されている。遺伝子治療による治療方法は、核酸の投与に基づくものであり、この場合、これらは通常は、腫瘍細胞中に導入され、かつ腫瘍細胞を崩壊させる配列を有する。その際、多くの二者択一的なストラテジーが示され、これらのストラテジーによって、導入された核酸配列が、腫瘍細胞の崩壊を生じさせることができる。多くの二者択一的なストラテジーが生じる。ＨＣＣの治療のための相当するストラテジーに関しては、Ｒｕｉｚら（Dig. Dis. 2001, 19:324-332）に示されている。これらの開示において、今日において、ＨＣＣの治療に関する臨床試験においてヒトで試験されている核酸を、治療戦略に応じて、以下の４グループに分類した：
（１）腫瘍抑制遺伝子の導入：
これらのストラテジーは、遺伝子治療に使用される核酸が１種の遺伝子を含むものであって、この場合、これらの遺伝子産物が腫瘍の成長を食い止めるか、あるいは腫瘍のアポトーシスを誘発することに基づく。多くの臨床試験は、ｐ５３遺伝子の導入に基づく。
（２）免疫原治療：
これらのストラテジーは、遺伝子治療に使用される核酸配列が、患者の免疫系を活性化させ、かつ腫瘍細胞をターゲットとした免疫反応を引き起こす遺伝子産物を含むことに基づくものである。免疫反応自体はその後に腫瘍の崩壊を導くものである。多くのサイトカイン、補助刺激分子および腫瘍特異的分子が、免疫治療に提案されている。
（３）自殺−遺伝子治療：
これらの方法の場合には、遺伝子治療に使用される核酸が、無毒の作用物質を、腫瘍細胞に対する細胞毒に変換する遺伝子産物、たとえば酵素をコードするものである。
（４）腫瘍崩壊性ウイルスの導入：
これらの形態に関しては、遺伝子治療は核酸ベクターを使用し、この場合、これらはウイルスの配列に基づくものである。腫瘍崩壊性のウイルスの配列を有するベクターは、ウイルスの複製を制御する腫瘍特異的プロモーターを有し、これにより、腫瘍細胞中でのウイルスの選択的増殖が可能になる。
【０００４】
したがって、本発明に関連する免疫原治療（同様に免疫治療を意味する）が、核酸を使用するものである場合には、この配列は免疫系を活性化し、かつ腫瘍をターゲットとするものを含む。原則的に、免疫系は抗原に加えて、腫瘍細胞上の腫瘍−特異的構造物であるとみなされる。免疫系を活性化することで、免疫系の構成要素による腫瘍の崩壊を導くことができる。
【０００５】
技術水準においては、免疫系を刺激するか、あるいは免疫反応を修飾する多くの分子が知られており、特にサイトカインである。サイトカインはすでに抗腫瘍活性を示すことが確認されている。たとえば、ＩＬ−１２が細胞性免疫の刺激因子であり、かつ強力な抗腫瘍−活性を示すことが記載されている（Brunda et al., J. Exp. Med. 1993, 178: 1223-1230）。しかしながら、組み換えＩＬ−１２タンパク質自体の抗腫瘍剤としての使用については、治療用量のサイトカインは、毒性の副作用を示すことから失敗している（Lotze et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1997, 795:440-454; und Cohen J. Science, 1995, 270:908）。
【０００６】
したがって、サイトカインをコードする核酸を腫瘍中に導入し、それによって免疫系の局所的活性を可能にすることが提案された。Ｈｏｃｋら（proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 2774-2778）は、たとえば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ遺伝子の腫瘍細胞中への導入および動物において腫瘍を誘発するための腫瘍細胞の使用を開示している。すべての遺伝子導入腫瘍細胞は、腫瘍細胞に対して拒絶反応を生じ、その際、使用されるサイトカインに依存して、試験動物の免疫系の種々の細胞が拒絶反応に関与する（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋）。
【０００７】
ＩＬ−１２をコードするベクターについてはさらに、免疫治療に関しての適性を試験した。ＣＭＬＦ（"細胞傷害性リンパ球成熟因子"）またはＮＫＳＦ（"ナチュラルーキラー細胞刺激因子"）とも呼称されるＩＬ−１２は、ヘテロダイマーサイトカインであり、これは、通常は周縁のＢ−リンパ球を活性化させることにより形成される。このタンパク質は、相対的分子量４０ｋＤａおよび３５ｋＤａを有する２種のサブユニットから構成され、この場合、これらはジスルフィド結合を介して互いに結合されている。ジスルフィド結合は、生物学的活性に関して必要不可欠なものである。これらのタンパク質が、活性化ヒトリンパ球の増殖を刺激し、かつナチュラルキラー細胞を活性化することは、すでに種々の文献で示唆されている。
【０００８】
これらのタンパク質の種々のサブユニットをコードするベクターが、腫瘍の治療のために使用されている（Barajas et al., Hepatology, 2001, 33: 52-61; Mazzolini et al., Cancer Gene Therapy, 1999, 6:514-522）。さらに、これらのベクターは、他の配列との組合せで、特に補助刺激因子−タンパク質に関する配列との組合せで、この場合、これらは同一または他のベクター上に存在するものであって、腫瘍の治療のために使用する。（Gyorffy et al., J. Immunlogy, 2001, 166: 6212-6217; Matinet et al., Gene Therapy, 2002, 9: 786-792; Martinet et al., Journal of National Cancer Institute, 2000, 92:931-936; Guinn et al. J. Immunology, 1999, 162: 5003-5010; und Emtage et al., J. Immunology, 1998, 160: 2531-2538）。
【０００９】
ＩＬ−１２は、単一鎖−ＩＬ−１２の場合には、異なるサブユニットが融合タンパク質に結合することによるタンパク質の場合よりも良好な活性で発現する（Lieschke et al., Nature Biotechnology, 1997, 15: 35-40）。他の治療方法において、患者の腫瘍細胞を採取し、かつこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏで、プラスミドを用いて処理することが提案されており、この場合、これらのプラスミドは、単一鎖−ＩＬ−１２またはＩＬ−１２および補助刺激因子をコードするものである（US2002/0018767）。その後にｉｎ ｖｉｔｒｏ処理中において腫瘍細胞を再度移植する。したがってこれらの方法は、患者について数回に亘っての手術および患者への腫瘍細胞の再移植を含むものであり、これにより多くの患者にこのような治療を憂慮させる。
【００１０】
従来使用されていた核酸は、哺乳類、好ましくはヒトの治療に関して成果を収めるものではなかった。たとえば、Ｒｕｉｚら（前記）により示された治療方法は、ベクターの極めて高い投与量（3x10９-2.5x10１３ "プラーク形成単位" PFU／投与量）に基づくことが確認されているが、これは、相当する臨床試験において結果がでないか、あるいは単にネガティブな結果が得られるにすぎなかった。しかしながら、核酸の投与量については、遺伝子治療に関してクリティカルな要因であるために、高すぎる投与量による副作用であるか、あるいは、腫瘍からベクターが放出されることによるベクターの遊離が予測される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US2002/0018767
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Llovet J.M. et al., Hepoatology, 1999, 29:62-67
【非特許文献２】Dig. Dis. 2001, 19:324-332
【非特許文献３】Brunda et al., J. Exp. Med. 1993, 178: 1223-1230
【非特許文献４】Lotze et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1997, 795:440-454
【非特許文献５】Cohen J. Science, 1995, 270:908
【非特許文献６】proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 2774-2778
【非特許文献７】Barajas et al., Hepatology, 2001, 33: 52-61
【非特許文献８】Mazzolini et al., Cancer Gene Therapy, 1999, 6:514-522
【非特許文献９】Gyorffy et al., J. Immunlogy, 2001, 166:6212-6217
【非特許文献１０】Matinet et al., Gene Therapy, 2002, 9: 786-792
【非特許文献１１】Martinet et al., Journal of National Cancer Institute, 2000, 92:931-936
【非特許文献１２】Guinn et al. J. Immunology, 1999, 162: 5003-5010
【非特許文献１３】Emtage et al., J. Immunology, 1998, 160: 2531-2538
【非特許文献１４】Lieschke et al., Nature Biotechnology, 1997, 15: 35-40
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本発明は、免疫治療のために使用可能な、改善された効果を有するベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの課題は、驚くべきことに、単一鎖−ＩＬ１２および補助刺激因子−タンパク質をコードする核酸配列を含有し、その際、ベクターはウイルスベクターであることを特徴とする、ウイルスベクターによって解決される。
【００１５】
したがって、本発明は、驚くべきことに、単一鎖−ＩＬ−１２および補助刺激因子−タンパク質をコードするベクターが、腫瘍の治療のための特定の方法で、免疫治療の範囲内で適していることが確認された。免疫治療によって、原発腫瘍ばかりでなく転移ガンまでも取り除かれる。本発明によるコンストラクトによってコードされたタンパク質による相乗効果は、免疫刺激の際に、技術水準において提案されているものよりも、少ない用量での核酸の添加を可能にしたことである。投与量がわずかであればあるほど、副作用、たとえば患者に対する自己免疫疾患のリスクが少なくなり、それと同時に、臨床適用の場合の改善された安全性を示す。ウイルス感染の確率は公知ベクターの場合よりも少ない。少ない投与量は、さらに大きい腫瘍塊または多くの腫瘍群を同時に、副作用を示すことなく治療することを可能にする。
【００１６】
単一鎖−ＩＬ−１２−遺伝子の使用は、ＩＬ−１２双方のサブユニットをコードする部位の遺伝子を使用する場合と比較して、ベクター中で核酸の発現に関してわずかで済む。したがってこれらの配列は、単一鎖−ＩＬ−１２遺伝子の他に、免疫治療を増強させる２種またはそれ以上の外来遺伝子が存在するにもかかわらず、相対的にわずかな量のベクター、たとえばアデノウイルスベクターの使用を可能にする。
【００１７】
本発明によるベクターは、哺乳類、特にヒトを治療するために使用される。定義された遺伝子配列上での以下の指示は、好ましくはヒト配列に適用される。しかしながら、遺伝子配列は、タンパク質の活性化（免疫刺激された、および／またはＴ−細胞形成）が、ヒト遺伝子産物の相当する活性化の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％である限りにおいて、さらに他の種由来のものであるか、あるいは定義されたホモロジーの範囲内で（本発明に関しては、ＢＬＡＳＴ−ソフトフェアで算定する）、従来技術から公知の方法で修飾されていてもよい。定義されたホモロジーの範囲は、生物学的活性に関して天然の遺伝子においてコードする範囲に適用される。融合タンパク質をコードする核酸配列が使用される場合には、ホモロジーの範囲は、示された生物学的活性（ＩＬ−１２、補助刺激因子）をコードする部分に適用されてもよい。タンパク質の活性化の増強を導く配列の変更が含まれる。
【００１８】
本発明の範囲内において、これに加えて用語「補助刺激因子−タンパク質をコードする配列」が使用され、配列に関しては、ヒト細胞中で発現した場合にタンパク質を生じさせ、この場合、これらのタンパク質は、細胞表面タンパク質として存在し、かつＴ−細胞レセプターと特異的に結合するものである。Ｔ−細胞の形成に伴って、補助刺激因子タンパク質は免疫反応を増強させる。相当する補助刺激因子−タンパク質、たとえば４−１ＢＢ（４−１ＢＢＬ）、Ｂ７−１（またＣＤ８０とも呼称される）およびＢ７−２は、技術水準から公知のものである。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様によれば、補助刺激因子タンパク質４−１ＢＢリガンドをコードし、特に、図２１に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を有する配列である、ベクター配列を含有し、その際、配列によりコードされたタンパク質は、Ｔ−細胞と特異的に結合する能力を有する。また４−１ＢＢＬの活性化試験については、技術水準から公知である（Vinay DS, Kwon BS. Semin. Immunol., 1998, 10:481-9. Review; Kwon et al., Mol Cells., 2000, 10: 119-26）。
【００２０】
本発明の範囲内において、タンパク質は単一鎖−ＩＬ−１２を意味し、この場合、タンパク質がアミノ酸から構成される場合には、天然のＩＬ−１２の双方のサブユニットを融合タンパク質として含む。単一鎖−ＩＬ−１２をコードする核酸配列は、通常は、図１９および２０に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を示す。示された配列は、融合遺伝子のＩＬ−１２部分を示す。サブユニットを結合した配列は当業者から公知であり、かつホモロジーの算定を考慮する必要はない。さらに単一鎖−ＩＬ−１２は、免疫刺激活性を示し、この場合、これらの活性は、ヘテロダイマーの形での天然のＩＬ−１２の相当する活性よりも、本質的に低いものではない。免疫刺激の際のヒトＩＬ−１２の効果は、γ−インターフェロンの産生を誘導することから成る。単一鎖−ＩＬ−１２の免疫刺激活性は、天然のＩＬ−１２の相当する活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％に達する。タンパク質活性は、公知物と、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で比較することができる（たとえば、Lieschke et al., a.a.o. のＩＬ−１２との活性比較のためのＶｉｔｒｏ試験を使用する）。本発明の特に好ましい実施態様によれば、単一鎖−ＩＬ−１２の免疫刺激活性は、本来のＩＬ−１２の相当する活性よりもさらに高いか、あるいは本質的に高い。
【００２１】
他の実施態様において、本発明は他のサイトカイン、サイトカイン−活性を有するタンパク質および／または補助刺激因子−タンパク質をコードする他のベクターを含む。サイトカイン−活性を有するタンパク質としては、サイトカインの免疫刺激活性を示すが、しかしながら、サイトカインとの間に構造的類似性はないタンパク質を意味する。相当するサイトカイン−アゴニストとして、たとえば拮抗性サイトカイン−レセプター抗体が、技術水準において知られている。
【００２２】
単一鎖−ＩＬ−１２および補助刺激因子−タンパク質をコードするための特定の挙げられた配列の他に、本発明によるベクターは、Ｔ−および／またはＢ−細胞を活性化する１種または複数種の他のサイトカインをコードする配列であるか、あるいは１種または複数種の他の補助刺激因子タンパク質をコードする配列を有していてもよい。
【００２３】
本発明は、特に、単一鎖−ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンドおよびＩＬ−２をコードする配列を含むベクターに関する。タンパク質は、本発明の範囲内においてＩＬ−２を意味し、この場合、これらは、図２２に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を有する配列によってコードされるものである。さらに、本発明の範囲内において使用されるＩＬ−２をコードする配列は、本質的に天然のＩＬ−２の免疫刺激活性を示すものであって、すなわち、本発明の範囲内においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫刺激活性を有するＩＬ−２をコードする配列を使用し、この場合、これらの活性は、天然のＩＬ−２の活性の少なくとも約７０％に相当する。ＩＬ−２の活性を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に相当するのは、技術水準において公知のものである。好ましくは、Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（J Immunol., 1978, 120 (6): 2027-32）に記載された活性測定のための方法を使用する。
【００２４】
他の実施態様において、本発明によるベクターは、単一鎖−ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンドおよびＩＬ−２をコードする配列の他に、補助刺激因子−タンパク質Ｂ７−１および／またはＢ７−２をコードする他の配列を包含する。
【００２５】
本発明の範囲内で、補助刺激因子−タンパク質はＢ７−１（またはＢ７−２）を意味し、この場合、これらは、図２３Ａ（またはＢ）に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を有する遺伝子によりコードされるものである。
【００２６】
本発明の実施態様によれば、ベクターは、コードされた配列の発現を可能にする他の配列を包含する。したがって、本発明によるベクターは、１種のプロモーターおよび１種または複数種の翻訳調節部位（ＩＲＥＳ）を包含することができる。プロモーターは腫瘍−特異性を示していてもよく、すなわち腫瘍中でのみ発現するか、あるいはすべての細胞中では活性化しない。
【００２７】
本発明の実施態様において、非特異的プロモーターが好ましく、それというのも相当するプロモーターは一般に良好に発現され、かつこれらのベクターを、種々の腫瘍の治療のために使用することができるためである。
【００２８】
免疫刺激遺伝子の特に高い発現は、本発明によればベクターを用いて達成され、この場合、これらのベクターは、少なくとも３種の構造遺伝子（トリシストロン）を有し、さらに発現カセット当たり１種のプロモーターのみを包含することによって特徴付けられ、かつそれぞれの構造遺伝子はプロモーターのすぐ下流に存在することはなく、ＩＲＥＳ配列を有する。それというのも、複数種のプロモーターを発現カセット中に使用する場合には、これらが互いに抑制しうることが確認されているためである。プロモーターとＩＲＥＳ−配列との組合わせは、良好な発現を生じる。互いに異なるＩＲＥＳ−配列をベクター中で使用する場合には、これらの配列下で組換え価を最小限にできることが特に有利である。
【００２９】
４種の構造遺伝子（テトラシストロン）を有するベクターを使用する場合には、構造遺伝子を複数個の発現カセットに分割することが有利であってもよい（実施例参照）。これらの場合には、好ましくは発現カセット当たり１種のプロモーターを包含する。好ましくはベクター中で互いに最大の距離を示すように２個の発現カセットを分割することによって、プロモーターは空間的に独立し、これにより相互抑制を減少させる。
【００３０】
本発明による配列は、特に、タンパク質が、ヒト細胞中で特に良好に発現するといった利点を示す。したがって、免疫治療のための本発明による配列の有利な作用は、これらの実施態様によれば、コーディング配列の高い発現に基づく。
【００３１】
本発明の範囲内で、ベクターは好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡから構成される。
【００３２】
本発明の範囲内において、ベクターは「ウイルスベクター」を意味し、これらが核酸配列である場合にはウイルス由来の配列を含むものであって、この場合、これらは、ウイルス外被中での核酸のパッケージングを可能にする。
【００３３】
配列がウイルス由来であることに依存して、ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ−随伴ウイルス、レンチウイルスベクター、ＨＳＶ−ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはセムリキ森林ウイルスベクターを含む。アデノウイルスベクターの場合には、第一世代（AdEast-コロニー系；たとえばQBio-gene GmbH, Heidelbergから入手可能なもの、Ｅ１およびＥ３領域において欠失）または第二世代ものであるか（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４で欠失）、あるいはヘルパー依存性アデノウイルスベクターであってもよい（Nicklin SA, Baker AH. Curr Gene Ther., 2002, 2: 273-93; 2: 273-93; Mah et al., Clin Pharmacokinet., 2002, 41: 901-11）。
【００３４】
特に好ましい実施態様において、本発明は、単一鎖−ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンドおよびＩＬ−２をコードする配列を含有するアデノウイルスベクターに関する。アデノウイルスベクターは、ヒトの遺伝子治療において使用するのに認められているベクターに相当することから特に有利である。したがって、このベクターは定義された使用に関して安全である（たとえば、局所的投与による腫瘍治療）。アデノウイルスベクターは、ベクター系に属し、この場合、これらは臨床においてしばしば使用されるものであり、かつこれについては使用の安全性に関して最も多くのデータが存在するものである。
【００３５】
しかしながら、アデノウイルスベクター中に収容される外来核酸配列の量は制限される。これについては以前には、免疫刺激タンパク質をコードする２種以上の遺伝子を、相当する１個のベクター中に収容することは不可能であった。以下に詳細に記載されたベクターの開発は、これらの問題を最初に回避したものであって、アデノウイルスベクターが、公知のベクターとは対照的に、複数個の免疫刺激タンパク質をコードすることを可能にした。本発明において、アデノウイルス性の３−遺伝子ベクター（３種の構造遺伝子を有するベクターを意味するものであってもよい）を使用することは特に好ましい。さらに本発明は、４種の遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを最初に使用可能にしたものであって、これらについては、実施例では２個の発現カセットに分割されている。
【００３６】
本発明は、さらに本発明によるベクターを含むウイルス粒子に関する。ウイルス粒子またはビリオンとしては、ウイルスの外被タンパク質によって包囲された核酸を意味する。
【００３７】
他の実施態様によれば本発明は医薬に関するものであって、この場合、これらの医薬は、本発明によるベクターまたはウイルス粒子を含有する。本発明によるベクターまたはウイルス粒子は、１種の担持剤と一緒に簡単に混合されるか、あるいは他の助剤と一緒に加工することができる。本発明によるベクターまたはウイルス粒子は、たとえばリポソーム中、あるいは複製可能なアデノウイルス（RCAs; Curr Cancer Drug Targets, 2001, 1:85-107参照）と一緒にリポソーム中に導入され、ポリエチレン−グリコール−被覆アデノウイルスとして、抗体−結合アデノウイルス（ウイルスおよび細胞マーカー、好ましくは腫瘍細胞マーカーに対して特異性を示す抗体と結合させたウイルス）として、ＲＣＡｓと混合され、ＲＣＡ中のカセットとして、あるいは腫瘍中で増大させるために調製されたＲＣＡとして存在する（調製ＲＣＡ：腫瘍−特異的プロモーターの調製下でＥ１−官能性を有するＲＣＡ；Van der Poel et al., J Urol., 2002, 168:266-72）。
【００３８】
ウイルス粒子の正確な投与量は、治療すべき患者、適用形の種類および使用されるベクターの構造に依存し、かつ個々の具体的な事例においては当業者によって標準的方法で定めることができる。本発明による核酸は、腫瘍の崩壊または顕著な減少を、特にわずかな投与量で得ることができる。この医薬品は、好ましくは、投与単位当たり１×１０１１以下、好ましくは１×１０１０以下、１×１０９以下または１×１０７以下の濃度を示す。しかしながら、これらの投与量は、定義された範囲をさらに顕著に下廻って、すなわち１×１０６以下にもなりうる。投与データは、感染したウイルス粒子の数に関する。ラットの腫瘍モデルにおいて、すべての個体が、腫瘍注入を１年以上の期間に亘って、５×１０７の感染性ウイルス粒子投与量によって治療した場合に生存することが示された。５×１０６の感染性ウイルス粒子の投与を含む治療では、なおも約９０％の個体が生存する。これとは対照的に、コントロール群のすべての個体は、腫瘍注入後の最初の５０日間で死亡した。これらの投与量は、相当する治療に関して技術水準で提案された投与量を大幅に下廻るものである。
【００３９】
医薬に関しては、ベクターを良好に腫瘍に運搬できるように処方される。好ましくは、医薬は、腫瘍内注入のための溶液の形で存在する。相当する溶液の製造は、技術水準から公知である。さらに二者択一的に、医薬は担持材料として処方されてもよく、この場合、これらはベクターを腫瘍中に移植した後に、一定の期間に亘って放出される。相当する担持材料は、たとえば技術水準から公知の硫酸セルロース等である。
【００４０】
最終的に本発明は、腫瘍を治療するため、特にヒトのＨＣＣ、腸ガン、乳ガン等を治療するためのベクターまたはウイルス粒子の使用に関する。
【００４１】
二者択一的な実施態様によれば、本発明は、感染症またはプリオン感染症（Prionenerkrankungen）の治療のためのベクターまたはウイルス粒子の使用に関する。免疫刺激治療は、特に遺伝子治療の形で、相当する感染症の治療のためにすでに提案されている（Van det Meide et al., Vaccine., 2002, 20: 2296-302）。
【００４２】
したがって、本発明によるベクターおよびウイルス粒子の免疫刺激作用は、さらに感染症の治療、たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎ウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および子宮頸ガンを引き起こしうるヒト パピローマウイルス ＨＰＶによる感染症の治療のための、治療有効性を示す。さらにプリオン感染症の治療に関しては、ベクターまたはウイルス粒子を、有利に使用することができ、それというのも、非特異的免疫刺激が、すでに動物モデルにおいて治癒結果を得られているためである（Sethi et al., Lancet, 2002, 36：229-30）。
【００４３】
本発明による製薬学的使用に関しては、ベクターは１×１０１１以下、好ましくは１×１０１０以下、１×１０９以下または１×１０７以下の濃度で存在する。しかしながら、投与量は、定義された範囲をさらに顕著に下廻って、すなわち１×１０６以下であってもよい。投与データは、ここでは感染性ウイルス粒子の数に関する。
【００４４】
以下の例は、本発明を例証するものである。例に挙げられたベクターの製造および使用に関する詳細な記載は、さらに"Adenovirale Immuntherapie solider Tumore a, HCC-Modell der Ratte (Rattus norvergicus, Berkenhout 1769)"des Fachbereichs Biologie der Universitaet hamburgで、Reinhard Waehlerによる論文において見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ベクターＡｄ−１〜Ａｄ−３を示す概略図
【図２】調整後のＡｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３のＩＬ−１２レベル試験を示すグラフ図
【図３】細胞培養中での４−１ＢＢＬ発現を示す図
【図４】細胞培養中でのインターロイキン−２の発現を示す図
【図５】段階的投与量拡大試験（Dosiseskalationsstudie）の結果を示す図
【図６】段階的投与量拡大試験（Dosiseskalationsstudie）のＭＲＴ−画像を示す図
【図７】Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３の試験について時間的経過を示す図
【図８】ウイルス注入後０週の腫瘍を示す図
【図９】ウイルス注入後３週の腫瘍を示す図
【図１０】ウイルス注入後７週の腫瘍を示す図
【図１１】ＭＲＴデータに基づく腫瘍の大きさの７週の経過を示すグラフ図
【図１２】ウイルス注入後１００日までの処理群の生存率を示すグラフ図
【図１３】pTrident３を示す図
【図１４】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBL［IRES］IL-2を示す図
【図１５】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBLを示す図
【図１６】pShuttle［CMV］IL-12を示す図
【図１７】プラスミドpAd-3を示す図
【図１８】図１のＡｄ−３インサートに相当する、トリシストロン性発現カセット（マウスｃＤＮＡｓを含む）の配列を示す図
【図１９】ヒトＩＬ−１２ｐ４０（４０ｋＤａ）のコーディング配列を示す図
【図２０】ヒトＩＬ−１２ｐ３５（３５ｋＤａ）のコーディング配列を示す図
【図２１】ヒト４−１ＢＢＬのコーディング配列を示す図
【図２２】ヒトＩＬ−２のコーディング配列を示す図
【図２３】ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）（図Ａ）およびヒトＢ７−２（ＣＤ８６）（図Ｂ）のコーディング配列を示す図
【図２４】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBL［IRES］IL-2の配列を示す図
【図２５】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBLの配列を示す図
【図２６】pShuttle［CMV］IL-12の配列を示す図
【図２７】PAd-3の配列を示す図
【図２８】１年までの長期試験における効果を示すグラフ図
【図２９】Ａｄ−１およびＡｄ−３での処理後に腫瘍成長について、コントロールベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）と比較しての効果を示す図
【実施例】
【００４６】
例
Ｉ．ベクターＡｄ−１、Ａｄ−２、Ａｄ−３の構築およびこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＩＩ．ベクターＡｄ−４の構築
Ｉ．ベクターＡｄ−１、Ａｄ−２、Ａｄ−３の構築およびこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験
１．ベクターの製造
最初に、プラスミドｐＴｒｉｄｅｎｔ３（図１）中で、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−２のマウスｃＤＮＡｓをクローニングした。結果物は、ｐＴ３ ｓｃＩＬ１２［ＩＲＥＳ］４−１ＢＢＬ［ＩＲＥＳ］ＩＬ２（図なし）である。
【００４７】
予め３個の構成成分の読み枠の５’−側およびＩＲＥＳ−要素までのこれらの距離を、最適化された翻訳開始部位を形成するために修飾する。
【００４８】
このようにして構築された３個の構造遺伝子を含む発現カセットは、プロモーターを用いることなく、かつ３’−非翻訳配列を、AdEasy-Systems（QBiogene GmbH; Heidelberg）のpShuttle-CMVプラスミド中でクローニングする。この結果物は、プラスミドpShuttle［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL2（図２）である。このプラスミドからのカセット［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL2は、ＤＮＡシークエンシングによりその正確性について検査した。
【００４９】
その後にこれらのコンストラクトは、Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３中でプラスミドｐＡｄＥａｓｙと一緒に同時形質転換することによって、プラスミドｐＡｄ−３（図参照）に組み換えられ、この場合、Ａｄ−３に関して包含されるすべての組み換えＤＮＡが挙げられる。
【００５０】
pShuttle-［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL2から出発して、プラスミドはＡｄ−２に関して、pShuttle-［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL（図参照）、およびＡｄ−１に関して、pShuttle-［CMV］scIL12（図参照）をクローニングし、かつ同様の方法でｐＡｄ−３を製造するために、プラスミドｐＡｄ−２およびｐＡｄ−１を製造した。
【００５１】
アデノウイルスは、プラスミド準備工程においてPacI-制限酵素を用いて切断した後に、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションさせ、かつ得られたウイルス性プラーク（ウイルス粒子ともいう）を単離し、かつ増殖させた。
【００５２】
発現カセットの概略図：図１。
【００５３】
発現試験
２．１ ＩＬ−１２
ラットの肝細胞ガン細胞、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を、ウイルス（ウイルス粒子）Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３を用いて感染させ、かつＩＬ−１２発現を、ＩＬ−１２ ｐ７０−ＥＬＩＳＡを用いて細胞培養上清中で、種々の時間の後に定量した。
概略図：図２。
【００５４】
２．２ ４−１ＢＢＬ
ラットの肝細胞ガン細胞、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を、ウイルス（ウイルス粒子）Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３を用いて感染させ、かつＩＬ−１２発現を、フローサイトメトリーを用いて、４−１ＢＢＬを抗体ＴＫＳ−１（BD Pharmingen, Heidelberg）で染色した後に観察した。Ａｄ−１は、コントロールとして使用し、それというのもこれらは４−１ＢＢＬ発現が見込まれないためである。
概略図：図３。
【００５５】
２．３ ＩＬ−２
ラットの肝細胞ガン細胞、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を、ウイルス（ウイルス粒子）Ａｄ−１、Ａｄ−２、およびＡｄ−３を用いて感染させ、かつＩＬ−１２発現を、細胞培養上清中で種々の期間の後に、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ここでＡｄ−１およびＡｄ−２はコントロールとして使用し、それというのもこれらはＩＬ−２発現が見込まれないためである（示されていない）。
概略図：図４。
【００５６】
３．ｉｎ ｖｉｖｏ試験
３．１ 段階的投与量拡大試験 １
ベクターＡｄ−３（図５ａ）をラットモデルにおいて、肝細胞ガン性癌腫（ＨＣＣ）について試験した。ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞株（ラットの肝細胞ガン性癌腫）は、Ｂｕｆｆａｌｏ−Ｒａｔｔｅ同質遺伝子群を含むものであって、腫瘍の被膜下肝移植に使用された。
【００５７】
１００万個の細胞移植後に腫瘍の増大について、磁気共鳴断層撮影法（ＭＲＴ）によって、Ｄｒ ．Ｇｅｒｒｉｔ Ｋｒｕｐｓｋｉ−Ｂｅｒｄｉｅｎ（radiologischen Klinik, UKE）との共同研究で、ウイルス注入の前後について観察した。図５ｂは、ウイルス注入後第３日と１２日との間の腫瘍容積についての経過を示した。これらの短い期間においてベクターの顕著な効果は、投与量依存的であり、かつ最も高い投与量でのウイルス注入により、腫瘍容積は２７％の大きさに減少した。これらの結果については図６において、選択されたＭＲＴ−図を用いて個々の動物について示し、腫瘍の大きさは動物の大きさに比例して改善されていることが明らかにされた。
【００５８】
これらのデータに基づいて、より多くの動物群の長期間に亘っての処理に関する投与量は、腫瘍あたり５×１０７の感染性粒子を用いることに定めた。以下の研究において、個々のベクター（Ａｄ−１〜Ａｄ−３）の効果は、専らこれらのわずかな投与量で達成された。図７の概略図で示されているように、腫瘍を移植し、１４日後にＡ−群の６個体の動物をベクターで処理し、かつ抗腫瘍免疫応答のパラメータについてはさらに２週間の後に分析した。それぞれ１０個体の動物についてＢ−群を形成した（長期間処理群）。段階的投与量拡大試験に関する差異において（図５および６）、２個の腫瘍のみを使用し、これについて１個のみをウイルスを用いて処理し、免疫刺激の遠位の効果を算出した。Ｂ−群は、腫瘍減少の長期間に亘っての動態および生存率の分析のために用いた。３ヶ月の後に、これらの概略図中で、生存している動物について、腫瘍再発の診断および撲滅に関しての免疫記憶試験のために、さらに肝臓内腫瘍移植おこなった。さらに３ヶ月間に亘って、再度生存率を測定した。これらのデータは、５×１０７の選択された投与量の場合に、最初の１４日間のインターバルで、腫瘍増加の封じ込めが示された。Ｂ−群はすでに１００日間に亘って観察した。これらの処理による腫瘍減少の結果は、ＭＲＴ−撮影の形で、図８〜１０に示した。
【００５９】
これらの図は、ウイルス投与後７週間に亘って選択された投与量については、肝蔵注入された腫瘍、さらには注入されていない腫瘍の完全な排除を達成したことを示している。注目すべきは、肝臓および腹腔内への転移（Ａｄ−２、３週間）が同様に排除されたというさらなる効果である（Ａｄ−２群、図８〜１０参照）。
【００６０】
ＭＲＴ−データから測定された腫瘍容積の詳細については、図１１で示し、かつ説明している。生存率として処理群中での％で示される試験経過は、図１２に示した。
【００６１】
動物実験の範囲において、ＩＬ−１２はラット血清中で検出された。同様に、インターフェロン−γを測定したが、この場合、これは免疫細胞のＩＬ−１２−免疫刺激後に産出され、抗腫瘍作用の大部分を担うものである。同様にインターフェロン−γは、顕著に検出された。さらに、これらの測定については、腫瘍を特異的にターゲットとするＴ−細胞を、いわゆる細胞毒性試験で観察した。免疫応答が存在し、さらに処理された動物の組織標本について特徴付けた。処理された腫瘍組織は、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を、コントロールベクターで処理された組織と比較して高められた量で検出した。
【００６２】
３．２ 長時間試験の実施のためのプロトコール
２種の腫瘍を、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７−細胞を注入することによって使用した。これらの細胞は、２種の異なる肝葉に注入した。１個の腫瘍に対して、１００万細胞を使用した。その後に、これらの左側の腫瘍には遅れてウイルス注入をおこなった。もう一つの腫瘍は右側であり、６５０．０００個の細胞を使用した。これらの腫瘍については、肝臓内転移モデルとして使用した。これらの腫瘍については、刺激された免疫細胞の効果を、遠位の腫瘍病巣で再度検査した。これらの結果は、図９〜１２および図２８〜３０に示した。
【００６３】
ＩＩ．Ａｄ−４の構築
Ｅ．Ｃｏｌｉ−細胞中の相同的組み換えによる他の挿入系を用いて、Ｂ７−１のための発現カセットを、アデノウイルスＥ３−領域中の位置に挿入した。これらの領域は機能的に不活性であり、したがってこれら領域の大部分は、ここで使用されるベクター中で削除した。発現カセットは、ヒトホスホグリセレートキナーゼであるか、あるいは、プロモーターと類似の能力を有する固有のプロモーターを有している。
【００６４】
ウイルスの製造は、前記プロトコールと同様の方法で実施した。
図面の簡単な説明
図１ ベクターＡｄ−１〜Ａｄ−３の概略図
図２ Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３での感染後の、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞の細胞培養上清中のインターロイキン量の測定。動物実験に使用するためのベクターは、同一のインターロイキン−１２−発現に対して調製した。図２は、ラット肝細胞ガン細胞ＭｃＡ−ＲＨ７７７７中で３日間に亘っての発現の時間経過を示す。
方法：ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞は、ＭＯＩｓ １０により、Ａｄ−１、Ａｄ−２またはＡｄ−３を用いて感染させた。上清を、感染後０日、１日、２日および３日で測定した。ｓｃＩＬ−１２濃度について、ＥＬＩＳＡによって、抗−マウスＩＬ−１２ｐ７０抗体を用いて測定した（Pharmingen）。
図３ ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞培養中での４−１ＢＢＬの検出。４−１ＢＢＬ発現のフローサイトメトリーによる測定。Ａｄ−２およびＡｄ−３は、４−１ＢＢＬを発現したが、Ａｄ−１は発現しなかった。
方法：ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞をＡｄ−１、Ａｄ−２またはＡｄ−３を用いてＭＯＩ １０で調整されたウイルス濃度で感染させた。細胞を、感染後２４時間にハーベストし、かつラット 抗−マウス４−１ＢＢＬモノクローナル抗体（TKS-1, Phraming）を用いてインキュベートし、かつＲ−ＰＥ−結合ヤギ−抗−ラットＩｇポリクローナル抗体（Pharmingen）を用いて検出するために着色した。
図４ ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞中のＩＬ−２についての３日間に亘っての発現。Ａｄ−３は、ＩＬ−２よりも４６６倍大きいＩＬ−１２のモル量を発現した（第３日目の算定）。
方法；ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞は、Ａｄ−３を用いてＭＯＩ １０で感染させた。上清を第０日、第１日、第２日および第３日目のものである。ＩＬ−２の濃度は、ＥＬＩＳＡによって、抗−マウスＩＬ−２抗体の使用下で測定した（Pharmingen）。
図５ 段階的投与量拡大試験。Ａｄ３での処理後９日間に亘っての腫瘍の大きさの変化。
方法；腫瘍の容量はＭＲＴを用いて、９日間のインターバルで測定した。ウイルス注入後３日目の腫瘍の大きさを１００％とし（１．ＭＲＴ）、ここで示された最終的な大きさについてウイルス投与後１２日目に測定した（２．ＭＲＴ）。ベクターＡｄ３（ａ）を定められた投与量で（ｉ．ｐ．＝感染性粒子）、直径７〜１１ｍｍの大きさの腫瘍に注入した（ｂ）。
図６ 段階的投与量拡大試験のＭＢＴ画像。
方法；１０７〜１０９個の感染性ウイルス粒子Ａｄ−３または１０９個の感染性粒子Ａｄ−ＧＦＰ（コントロール）で処理した腫瘍を、注入後３日目および１２日目でＭＲＴによってスキャンした。
図７ Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３の使用下での動物試験の経過を示す概略図。
図８ ウイルス注入前、第０週目の腫瘍のＭＲＴ−撮影図。
図９ ウイルス注入後、第３週目の腫瘍のＭＲＴ−撮影図。
図１０ ウイルス注入後、第７週目の腫瘍のＭＲＴ−撮影図。
図１１ ＭＲＴ−データから腫瘍の大きさの経過を示す図。
方法：全腫瘍容積は、ＭＲＴによって観察した。ウイルス投与前１日、投与後３週目および７週目に、大きさを測定した。コントロール群Ａｄ−ＧＦＰ：９個体；免疫処理群；Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３群それぞれ１０個体。Ａｄ−１の群では、１個体のラットのみが進行した腫瘍の成長を示した。コントロール群の動物はすべて７週間内に死亡した。
図１２ ウイルス注入後１００日までの試験動物の長期生存率
図１３ ベクターpTrident3のマップ
図１４ ベクターpShuttle［CMV］IL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL-2のマップ
図１５ ベクターpShuttle［CMV］IL12［IRES］4-1BBLのマップ
図１６ ベクターpShuttle［CMV］IL12のマップ
図１７ ベクターｐＡｄ−３のマップ
図１８ ３個の構造遺伝子を有する発現カセットの配列、この場合、これらはマウス由来のｃＤＮＡｓを含有し、図１からのインサートＡｄ−３に相当する。
図１９ ヒトＩＬ−１２のコーディング配列（４０ｋＤａ）
図２０ ヒトＩＬ−１２のコーディング配列（３５ｋＤａ）
図２１ ヒト４−１ＢＢＬのコーディング配列
図２２ ヒトＩＬ−２のコーディング配列
図２３ ヒトＢ７−１およびＢ７−２のコーディング配列
図２４〜２７ 種々のベクターの配列
図２８ １年までの観察期間における作用を示す図。グラフは、それぞれの時点での生存するラットの割合を示す（生存率１＝１群の動物１００％）。処理群：Ａｄ−３、５×１０６（ｎ＝１２）、Ａｄ−３、５×１０７（ｎ＝１０）。コントロール群：５×１０８ Ａｄ−ＧＦＰ（ｎ＝９）。
【００６５】
これらの長期試験の場合には、個々の動物は２種の肝臓腫瘍を有していた。２週間後（図においては第０日目）に、双方の腫瘍の一つを、一度だけベクター注入によって処理した。腫瘍容積は、これらの時点では約１ｍｌであった。図は、コントロール群の個体（Ａｄ−ＧＦＰ処理したもの）は、ベクター注入後４７日間内に死亡することを示した。５×１０６i.u.（"感染単位"または感染性粒子）で、Ａｄ−３処理群は、９０日後に１個体が死亡し、かつ５×１０７i.u.でのＡｄ−３処理群は、すべての個体が生存していた。"再度の注入"：５×１０７i.u.でのＡｄ−３処理群では、すべての個体についてベクター注入後９２日後（１３週）に、再度腫瘍を肝臓中に移植した。この腫瘍細胞移植は、すべての１０個体の場合にはさらに処理することなく消滅した。
図２９ Ａｄ−１およびＡｄ−３での処理後に腫瘍成長について、コントロールベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）のものと比較しての効果を示す図。
【００６６】
その際、Ａｄ−１およびＡｄ−３に関しては、２種の異なる投与工程で適用し、かつ処理後２週間目の腫瘍の大きさを測定した。群毎の動物個体数：ｎ＝３。図は、Ａｄ−１およびＡｄ−３の異なるベクター投与の場合の腫瘍容積の変化を示した。肝臓の右葉中に１×１０６ＭＨ−７７７７Ａ腫瘍細胞を適用し、かつ２週間後に左の腫瘍にベクターを注入した。ＭＲＴ−スキャンは、ベクター適用前１日および適用後１３日目で実施した。５×１０６i.u.のＡｄ−１の場合には平均の腫瘍容積が顕著に増加するのに比べて、１×１０７i.u.Ａｄ−１の場合には最小限の増加にとどまる。これらの最小限の増加は、Ａｄ−３に関しての５×１０６i.u.の投与量の場合にすでに確認されており、１×１０７i.u.の場合には、これに反して、すでに減少することが明らかである。これにより、Ａｄ−３は、Ａｄ−１よりも著しく効果的であることが証明された。１×１０７i.uのＡｄ−３に関しての値は、ベクター注入後第３日目と第１２日目で算出した。コントロール（Ａｄ−ＧＦＰ）は、２週間に亘っての観察期間内に著しく増加した。動物において後に生じる肝臓外への転移については算定に考慮していない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一鎖−インターロイキン−１２（単一鎖−ＩＬ−１２、"single chain IL-12"またはｓｃＩＬ−１２）および補助刺激因子−タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクター、ならびに遺伝子治療、特に腫瘍の治療のためのこれらのベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クレブス病は、依然として、先進国の国民において非常の高い死亡率を示すものである。肝細胞性癌腫（ＨＣＣ）は、たとえば、１個または複数個の大きな腫瘍が診断された場合に、平均生存期間が６ヶ月であるクレブズ病である（Llovet J.M. et al., Hepoatology, 1999, 29:62-67）。今日使用されている治療手段は、高周波切除、化学療法および経皮エタノール注射（ＰＥＩ）を含むものであって、これらは、小さい腫瘍の場合には一定量の結果を示すものの、大きい腫瘍の撲滅に関しては十分でないことが明らかである。
【０００３】
したがって、技術水準において遺伝子治療によるＨＣＣの治療が提案されている。遺伝子治療による治療方法は、核酸の投与に基づくものであり、この場合、これらは通常は、腫瘍細胞中に導入され、かつ腫瘍細胞を崩壊させる配列を有する。その際、多くの二者択一的なストラテジーが示され、これらのストラテジーによって、導入された核酸配列が、腫瘍細胞の崩壊を生じさせることができる。多くの二者択一的なストラテジーが生じる。ＨＣＣの治療のための相当するストラテジーに関しては、Ｒｕｉｚら（Dig. Dis. 2001, 19:324-332）に示されている。これらの開示において、今日において、ＨＣＣの治療に関する臨床試験においてヒトで試験されている核酸を、治療戦略に応じて、以下の４グループに分類した：
（１）腫瘍抑制遺伝子の導入：
これらのストラテジーは、遺伝子治療に使用される核酸が１種の遺伝子を含むものであって、この場合、これらの遺伝子産物が腫瘍の成長を食い止めるか、あるいは腫瘍のアポトーシスを誘発することに基づく。多くの臨床試験は、ｐ５３遺伝子の導入に基づく。
（２）免疫原治療：
これらのストラテジーは、遺伝子治療に使用される核酸配列が、患者の免疫系を活性化させ、かつ腫瘍細胞をターゲットとした免疫反応を引き起こす遺伝子産物を含むことに基づくものである。免疫反応自体はその後に腫瘍の崩壊を導くものである。多くのサイトカイン、補助刺激分子および腫瘍特異的分子が、免疫治療に提案されている。
（３）自殺−遺伝子治療：
これらの方法の場合には、遺伝子治療に使用される核酸が、無毒の作用物質を、腫瘍細胞に対する細胞毒に変換する遺伝子産物、たとえば酵素をコードするものである。
（４）腫瘍崩壊性ウイルスの導入：
これらの形態に関しては、遺伝子治療は核酸ベクターを使用し、この場合、これらはウイルスの配列に基づくものである。腫瘍崩壊性のウイルスの配列を有するベクターは、ウイルスの複製を制御する腫瘍特異的プロモーターを有し、これにより、腫瘍細胞中でのウイルスの選択的増殖が可能になる。
【０００４】
したがって、本発明に関連する免疫原治療（同様に免疫治療を意味する）が、核酸を使用するものである場合には、この配列は免疫系を活性化し、かつ腫瘍をターゲットとするものを含む。原則的に、免疫系は抗原に加えて、腫瘍細胞上の腫瘍−特異的構造物であるとみなされる。免疫系を活性化することで、免疫系の構成要素による腫瘍の崩壊を導くことができる。
【０００５】
技術水準においては、免疫系を刺激するか、あるいは免疫反応を修飾する多くの分子が知られており、特にサイトカインである。サイトカインはすでに抗腫瘍活性を示すことが確認されている。たとえば、ＩＬ−１２が細胞性免疫の刺激因子であり、かつ強力な抗腫瘍−活性を示すことが記載されている（Brunda et al., J. Exp. Med. 1993, 178: 1223-1230）。しかしながら、組み換えＩＬ−１２タンパク質自体の抗腫瘍剤としての使用については、治療用量のサイトカインは、毒性の副作用を示すことから失敗している（Lotze et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1997, 795:440-454; und Cohen J. Science, 1995, 270:908）。
【０００６】
したがって、サイトカインをコードする核酸を腫瘍中に導入し、それによって免疫系の局所的活性を可能にすることが提案された。Ｈｏｃｋら（proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 2774-2778）は、たとえば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ遺伝子の腫瘍細胞中への導入および動物において腫瘍を誘発するための腫瘍細胞の使用を開示している。すべての遺伝子導入腫瘍細胞は、腫瘍細胞に対して拒絶反応を生じ、その際、使用されるサイトカインに依存して、試験動物の免疫系の種々の細胞が拒絶反応に関与する（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋）。
【０００７】
ＩＬ−１２をコードするベクターについてはさらに、免疫治療に関しての適性を試験した。ＣＭＬＦ（"細胞傷害性リンパ球成熟因子"）またはＮＫＳＦ（"ナチュラルーキラー細胞刺激因子"）とも呼称されるＩＬ−１２は、ヘテロダイマーサイトカインであり、これは、通常は周縁のＢ−リンパ球を活性化させることにより形成される。このタンパク質は、相対的分子量４０ｋＤａおよび３５ｋＤａを有する２種のサブユニットから構成され、この場合、これらはジスルフィド結合を介して互いに結合されている。ジスルフィド結合は、生物学的活性に関して必要不可欠なものである。これらのタンパク質が、活性化ヒトリンパ球の増殖を刺激し、かつナチュラルキラー細胞を活性化することは、すでに種々の文献で示唆されている。
【０００８】
これらのタンパク質の種々のサブユニットをコードするベクターが、腫瘍の治療のために使用されている（Barajas et al., Hepatology, 2001, 33: 52-61; Mazzolini et al., Cancer Gene Therapy, 1999, 6:514-522）。さらに、これらのベクターは、他の配列との組合せで、特に補助刺激因子−タンパク質に関する配列との組合せで、この場合、これらは同一または他のベクター上に存在するものであって、腫瘍の治療のために使用する。（Gyorffy et al., J. Immunlogy, 2001, 166: 6212-6217; Matinet et al., Gene Therapy, 2002, 9: 786-792; Martinet et al., Journal of National Cancer Institute, 2000, 92:931-936; Guinn et al. J. Immunology, 1999, 162: 5003-5010; und Emtage et al., J. Immunology, 1998, 160: 2531-2538）。
【０００９】
ＩＬ−１２は、単一鎖−ＩＬ−１２の場合には、異なるサブユニットが融合タンパク質に結合することによるタンパク質の場合よりも良好な活性で発現する（Lieschke et al., Nature Biotechnology, 1997, 15: 35-40）。他の治療方法において、患者の腫瘍細胞を採取し、かつこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏで、プラスミドを用いて処理することが提案されており、この場合、これらのプラスミドは、単一鎖−ＩＬ−１２またはＩＬ−１２および補助刺激因子をコードするものである（US2002/0018767）。その後にｉｎ ｖｉｔｒｏ処理中において腫瘍細胞を再度移植する。したがってこれらの方法は、患者について数回に亘っての手術および患者への腫瘍細胞の再移植を含むものであり、これにより多くの患者にこのような治療を憂慮させる。
【００１０】
従来使用されていた核酸は、哺乳類、好ましくはヒトの治療に関して成果を収めるものではなかった。たとえば、Ｒｕｉｚら（前記）により示された治療方法は、ベクターの極めて高い投与量（3x10９-2.5x10１３ "プラーク形成単位" PFU／投与量）に基づくことが確認されているが、これは、相当する臨床試験において結果がでないか、あるいは単にネガティブな結果が得られるにすぎなかった。しかしながら、核酸の投与量については、遺伝子治療に関してクリティカルな要因であるために、高すぎる投与量による副作用であるか、あるいは、腫瘍からベクターが放出されることによるベクターの遊離が予測される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US2002/0018767
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Llovet J.M. et al., Hepoatology, 1999, 29:62-67
【非特許文献２】Dig. Dis. 2001, 19:324-332
【非特許文献３】Brunda et al., J. Exp. Med. 1993, 178: 1223-1230
【非特許文献４】Lotze et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1997, 795:440-454
【非特許文献５】Cohen J. Science, 1995, 270:908
【非特許文献６】proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 2774-2778
【非特許文献７】Barajas et al., Hepatology, 2001, 33: 52-61
【非特許文献８】Mazzolini et al., Cancer Gene Therapy, 1999, 6:514-522
【非特許文献９】Gyorffy et al., J. Immunlogy, 2001, 166:6212-6217
【非特許文献１０】Matinet et al., Gene Therapy, 2002, 9: 786-792
【非特許文献１１】Martinet et al., Journal of National Cancer Institute, 2000, 92:931-936
【非特許文献１２】Guinn et al. J. Immunology, 1999, 162: 5003-5010
【非特許文献１３】Emtage et al., J. Immunology, 1998, 160: 2531-2538
【非特許文献１４】Lieschke et al., Nature Biotechnology, 1997, 15: 35-40
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本発明は、免疫治療のために使用可能な、改善された効果を有するベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの課題は、驚くべきことに、単一鎖−ＩＬ１２および補助刺激因子−タンパク質をコードする核酸配列を含有し、その際、ベクターはウイルスベクターであることを特徴とする、ウイルスベクターによって解決される。
【００１５】
したがって、本発明は、驚くべきことに、単一鎖−ＩＬ−１２および補助刺激因子−タンパク質をコードするベクターが、腫瘍の治療のための特定の方法で、免疫治療の範囲内で適していることが確認された。免疫治療によって、原発腫瘍ばかりでなく転移ガンまでも取り除かれる。本発明によるコンストラクトによってコードされたタンパク質による相乗効果は、免疫刺激の際に、技術水準において提案されているものよりも、少ない用量での核酸の添加を可能にしたことである。投与量がわずかであればあるほど、副作用、たとえば患者に対する自己免疫疾患のリスクが少なくなり、それと同時に、臨床適用の場合の改善された安全性を示す。ウイルス感染の確率は公知ベクターの場合よりも少ない。少ない投与量は、さらに大きい腫瘍塊または多くの腫瘍群を同時に、副作用を示すことなく治療することを可能にする。
【００１６】
単一鎖−ＩＬ−１２−遺伝子の使用は、ＩＬ−１２双方のサブユニットをコードする部位の遺伝子を使用する場合と比較して、ベクター中で核酸の発現に関してわずかで済む。したがってこれらの配列は、単一鎖−ＩＬ−１２遺伝子の他に、免疫治療を増強させる２種またはそれ以上の外来遺伝子が存在するにもかかわらず、相対的にわずかな量のベクター、たとえばアデノウイルスベクターの使用を可能にする。
【００１７】
本発明によるベクターは、哺乳類、特にヒトを治療するために使用される。定義された遺伝子配列上での以下の指示は、好ましくはヒト配列に適用される。しかしながら、遺伝子配列は、タンパク質の活性化（免疫刺激された、および／またはＴ−細胞形成）が、ヒト遺伝子産物の相当する活性化の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％である限りにおいて、さらに他の種由来のものであるか、あるいは定義されたホモロジーの範囲内で（本発明に関しては、ＢＬＡＳＴ−ソフトフェアで算定する）、従来技術から公知の方法で修飾されていてもよい。定義されたホモロジーの範囲は、生物学的活性に関して天然の遺伝子においてコードする範囲に適用される。融合タンパク質をコードする核酸配列が使用される場合には、ホモロジーの範囲は、示された生物学的活性（ＩＬ−１２、補助刺激因子）をコードする部分に適用されてもよい。タンパク質の活性化の増強を導く配列の変更が含まれる。
【００１８】
本発明の範囲内において、これに加えて用語「補助刺激因子−タンパク質をコードする配列」が使用され、配列に関しては、ヒト細胞中で発現した場合にタンパク質を生じさせ、この場合、これらのタンパク質は、細胞表面タンパク質として存在し、かつＴ−細胞レセプターと特異的に結合するものである。Ｔ−細胞の形成に伴って、補助刺激因子タンパク質は免疫反応を増強させる。相当する補助刺激因子−タンパク質、たとえば４−１ＢＢ（４−１ＢＢＬ）、Ｂ７−１（またＣＤ８０とも呼称される）およびＢ７−２は、技術水準から公知のものである。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様によれば、補助刺激因子タンパク質４−１ＢＢリガンドをコードし、特に、図２１に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を有する配列である、ベクター配列を含有し、その際、配列によりコードされたタンパク質は、Ｔ−細胞と特異的に結合する能力を有する。また４−１ＢＢＬの活性化試験については、技術水準から公知である（Vinay DS, Kwon BS. Semin. Immunol., 1998, 10:481-9. Review; Kwon et al., Mol Cells., 2000, 10: 119-26）。
【００２０】
本発明の範囲内において、タンパク質は単一鎖−ＩＬ−１２を意味し、この場合、タンパク質がアミノ酸から構成される場合には、天然のＩＬ−１２の双方のサブユニットを融合タンパク質として含む。単一鎖−ＩＬ−１２をコードする核酸配列は、通常は、図１９および２０に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を示す。示された配列は、融合遺伝子のＩＬ−１２部分を示す。サブユニットを結合した配列は当業者から公知であり、かつホモロジーの算定を考慮する必要はない。さらに単一鎖−ＩＬ−１２は、免疫刺激活性を示し、この場合、これらの活性は、ヘテロダイマーの形での天然のＩＬ−１２の相当する活性よりも、本質的に低いものではない。免疫刺激の際のヒトＩＬ−１２の効果は、γ−インターフェロンの産生を誘導することから成る。単一鎖−ＩＬ−１２の免疫刺激活性は、天然のＩＬ−１２の相当する活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％に達する。タンパク質活性は、公知物と、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で比較することができる（たとえば、Lieschke et al., a.a.o. のＩＬ−１２との活性比較のためのＶｉｔｒｏ試験を使用する）。本発明の特に好ましい実施態様によれば、単一鎖−ＩＬ−１２の免疫刺激活性は、本来のＩＬ−１２の相当する活性よりもさらに高いか、あるいは本質的に高い。
【００２１】
他の実施態様において、本発明は他のサイトカイン、サイトカイン−活性を有するタンパク質および／または補助刺激因子−タンパク質をコードする他のベクターを含む。サイトカイン−活性を有するタンパク質としては、サイトカインの免疫刺激活性を示すが、しかしながら、サイトカインとの間に構造的類似性はないタンパク質を意味する。相当するサイトカイン−アゴニストとして、たとえば拮抗性サイトカイン−レセプター抗体が、技術水準において知られている。
【００２２】
単一鎖−ＩＬ−１２および補助刺激因子−タンパク質をコードするための特定の挙げられた配列の他に、本発明によるベクターは、Ｔ−および／またはＢ−細胞を活性化する１種または複数種の他のサイトカインをコードする配列であるか、あるいは１種または複数種の他の補助刺激因子タンパク質をコードする配列を有していてもよい。
【００２３】
本発明は、特に、単一鎖−ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンドおよびＩＬ−２をコードする配列を含むベクターに関する。タンパク質は、本発明の範囲内においてＩＬ−２を意味し、この場合、これらは、図２２に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を有する配列によってコードされるものである。さらに、本発明の範囲内において使用されるＩＬ−２をコードする配列は、本質的に天然のＩＬ−２の免疫刺激活性を示すものであって、すなわち、本発明の範囲内においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫刺激活性を有するＩＬ−２をコードする配列を使用し、この場合、これらの活性は、天然のＩＬ−２の活性の少なくとも約７０％に相当する。ＩＬ−２の活性を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に相当するのは、技術水準において公知のものである。好ましくは、Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（J Immunol., 1978, 120 (6): 2027-32）に記載された活性測定のための方法を使用する。
【００２４】
他の実施態様において、本発明によるベクターは、単一鎖−ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンドおよびＩＬ−２をコードする配列の他に、補助刺激因子−タンパク質Ｂ７−１および／またはＢ７−２をコードする他の配列を包含する。
【００２５】
本発明の範囲内で、補助刺激因子−タンパク質はＢ７−１（またはＢ７−２）を意味し、この場合、これらは、図２３Ａ（またはＢ）に示された配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列相同性を有する遺伝子によりコードされるものである。
【００２６】
本発明の実施態様によれば、ベクターは、コードされた配列の発現を可能にする他の配列を包含する。したがって、本発明によるベクターは、１種のプロモーターおよび１種または複数種の翻訳調節部位（ＩＲＥＳ）を包含することができる。プロモーターは腫瘍−特異性を示していてもよく、すなわち腫瘍中でのみ発現するか、あるいはすべての細胞中では活性化しない。
【００２７】
本発明の実施態様において、非特異的プロモーターが好ましく、それというのも相当するプロモーターは一般に良好に発現され、かつこれらのベクターを、種々の腫瘍の治療のために使用することができるためである。
【００２８】
免疫刺激遺伝子の特に高い発現は、本発明によればベクターを用いて達成され、この場合、これらのベクターは、少なくとも３種の構造遺伝子（トリシストロン）を有し、さらに発現カセット当たり１種のプロモーターのみを包含することによって特徴付けられ、かつそれぞれの構造遺伝子はプロモーターのすぐ下流に存在することはなく、ＩＲＥＳ配列を有する。それというのも、複数種のプロモーターを発現カセット中に使用する場合には、これらが互いに抑制しうることが確認されているためである。プロモーターとＩＲＥＳ−配列との組合わせは、良好な発現を生じる。互いに異なるＩＲＥＳ−配列をベクター中で使用する場合には、これらの配列下で組換え価を最小限にできることが特に有利である。
【００２９】
４種の構造遺伝子（テトラシストロン）を有するベクターを使用する場合には、構造遺伝子を複数個の発現カセットに分割することが有利であってもよい（実施例参照）。これらの場合には、好ましくは発現カセット当たり１種のプロモーターを包含する。好ましくはベクター中で互いに最大の距離を示すように２個の発現カセットを分割することによって、プロモーターは空間的に独立し、これにより相互抑制を減少させる。
【００３０】
本発明による配列は、特に、タンパク質が、ヒト細胞中で特に良好に発現するといった利点を示す。したがって、免疫治療のための本発明による配列の有利な作用は、これらの実施態様によれば、コーディング配列の高い発現に基づく。
【００３１】
本発明の範囲内で、ベクターは好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡから構成される。
【００３２】
本発明の範囲内において、ベクターは「ウイルスベクター」を意味し、これらが核酸配列である場合にはウイルス由来の配列を含むものであって、この場合、これらは、ウイルス外被中での核酸のパッケージングを可能にする。
【００３３】
配列がウイルス由来であることに依存して、ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ−随伴ウイルス、レンチウイルスベクター、ＨＳＶ−ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはセムリキ森林ウイルスベクターを含む。アデノウイルスベクターの場合には、第一世代（AdEast-コロニー系；たとえばQBio-gene GmbH, Heidelbergから入手可能なもの、Ｅ１およびＥ３領域において欠失）または第二世代ものであるか（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４で欠失）、あるいはヘルパー依存性アデノウイルスベクターであってもよい（Nicklin SA, Baker AH. Curr Gene Ther., 2002, 2: 273-93; 2: 273-93; Mah et al., Clin Pharmacokinet., 2002, 41: 901-11）。
【００３４】
特に好ましい実施態様において、本発明は、単一鎖−ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンドおよびＩＬ−２をコードする配列を含有するアデノウイルスベクターに関する。アデノウイルスベクターは、ヒトの遺伝子治療において使用するのに認められているベクターに相当することから特に有利である。したがって、このベクターは定義された使用に関して安全である（たとえば、局所的投与による腫瘍治療）。アデノウイルスベクターは、ベクター系に属し、この場合、これらは臨床においてしばしば使用されるものであり、かつこれについては使用の安全性に関して最も多くのデータが存在するものである。
【００３５】
しかしながら、アデノウイルスベクター中に収容される外来核酸配列の量は制限される。これについては以前には、免疫刺激タンパク質をコードする２種以上の遺伝子を、相当する１個のベクター中に収容することは不可能であった。以下に詳細に記載されたベクターの開発は、これらの問題を最初に回避したものであって、アデノウイルスベクターが、公知のベクターとは対照的に、複数個の免疫刺激タンパク質をコードすることを可能にした。本発明において、アデノウイルス性の３−遺伝子ベクター（３種の構造遺伝子を有するベクターを意味するものであってもよい）を使用することは特に好ましい。さらに本発明は、４種の遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを最初に使用可能にしたものであって、これらについては、実施例では２個の発現カセットに分割されている。
【００３６】
本発明は、さらに本発明によるベクターを含むウイルス粒子に関する。ウイルス粒子またはビリオンとしては、ウイルスの外被タンパク質によって包囲された核酸を意味する。
【００３７】
他の実施態様によれば本発明は医薬に関するものであって、この場合、これらの医薬は、本発明によるベクターまたはウイルス粒子を含有する。本発明によるベクターまたはウイルス粒子は、１種の担持剤と一緒に簡単に混合されるか、あるいは他の助剤と一緒に加工することができる。本発明によるベクターまたはウイルス粒子は、たとえばリポソーム中、あるいは複製可能なアデノウイルス（RCAs; Curr Cancer Drug Targets, 2001, 1:85-107参照）と一緒にリポソーム中に導入され、ポリエチレン−グリコール−被覆アデノウイルスとして、抗体−結合アデノウイルス（ウイルスおよび細胞マーカー、好ましくは腫瘍細胞マーカーに対して特異性を示す抗体と結合させたウイルス）として、ＲＣＡｓと混合され、ＲＣＡ中のカセットとして、あるいは腫瘍中で増大させるために調製されたＲＣＡとして存在する（調製ＲＣＡ：腫瘍−特異的プロモーターの調製下でＥ１−官能性を有するＲＣＡ；Van der Poel et al., J Urol., 2002, 168:266-72）。
【００３８】
ウイルス粒子の正確な投与量は、治療すべき患者、適用形の種類および使用されるベクターの構造に依存し、かつ個々の具体的な事例においては当業者によって標準的方法で定めることができる。本発明による核酸は、腫瘍の崩壊または顕著な減少を、特にわずかな投与量で得ることができる。この医薬品は、好ましくは、投与単位当たり１×１０１１以下、好ましくは１×１０１０以下、１×１０９以下または１×１０７以下の濃度を示す。しかしながら、これらの投与量は、定義された範囲をさらに顕著に下廻って、すなわち１×１０６以下にもなりうる。投与データは、感染したウイルス粒子の数に関する。ラットの腫瘍モデルにおいて、すべての個体が、腫瘍注入を１年以上の期間に亘って、５×１０７の感染性ウイルス粒子投与量によって治療した場合に生存することが示された。５×１０６の感染性ウイルス粒子の投与を含む治療では、なおも約９０％の個体が生存する。これとは対照的に、コントロール群のすべての個体は、腫瘍注入後の最初の５０日間で死亡した。これらの投与量は、相当する治療に関して技術水準で提案された投与量を大幅に下廻るものである。
【００３９】
医薬に関しては、ベクターを良好に腫瘍に運搬できるように処方される。好ましくは、医薬は、腫瘍内注入のための溶液の形で存在する。相当する溶液の製造は、技術水準から公知である。さらに二者択一的に、医薬は担持材料として処方されてもよく、この場合、これらはベクターを腫瘍中に移植した後に、一定の期間に亘って放出される。相当する担持材料は、たとえば技術水準から公知の硫酸セルロース等である。
【００４０】
最終的に本発明は、腫瘍を治療するため、特にヒトのＨＣＣ、腸ガン、乳ガン等を治療するためのベクターまたはウイルス粒子の使用に関する。
【００４１】
二者択一的な実施態様によれば、本発明は、感染症またはプリオン感染症（Prionenerkrankungen）の治療のためのベクターまたはウイルス粒子の使用に関する。免疫刺激治療は、特に遺伝子治療の形で、相当する感染症の治療のためにすでに提案されている（Van det Meide et al., Vaccine., 2002, 20: 2296-302）。
【００４２】
したがって、本発明によるベクターおよびウイルス粒子の免疫刺激作用は、さらに感染症の治療、たとえばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎ウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および子宮頸ガンを引き起こしうるヒト パピローマウイルス ＨＰＶによる感染症の治療のための、治療有効性を示す。さらにプリオン感染症の治療に関しては、ベクターまたはウイルス粒子を、有利に使用することができ、それというのも、非特異的免疫刺激が、すでに動物モデルにおいて治癒結果を得られているためである（Sethi et al., Lancet, 2002, 36：229-30）。
【００４３】
本発明による製薬学的使用に関しては、ベクターは１×１０１１以下、好ましくは１×１０１０以下、１×１０９以下または１×１０７以下の濃度で存在する。しかしながら、投与量は、定義された範囲をさらに顕著に下廻って、すなわち１×１０６以下であってもよい。投与データは、ここでは感染性ウイルス粒子の数に関する。
【００４４】
以下の例は、本発明を例証するものである。例に挙げられたベクターの製造および使用に関する詳細な記載は、さらに"Adenovirale Immuntherapie solider Tumore a, HCC-Modell der Ratte (Rattus norvergicus, Berkenhout 1769)"des Fachbereichs Biologie der Universitaet hamburgで、Reinhard Waehlerによる論文において見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ベクターＡｄ−１〜Ａｄ−３を示す概略図
【図２】調整後のＡｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３のＩＬ−１２レベル試験を示すグラフ図
【図３】細胞培養中での４−１ＢＢＬ発現を示す図
【図４】細胞培養中でのインターロイキン−２の発現を示す図
【図５】段階的投与量拡大試験（Dosiseskalationsstudie）の結果を示す図
【図６】段階的投与量拡大試験（Dosiseskalationsstudie）のＭＲＴ−画像を示す図
【図７】Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３の試験について時間的経過を示す図
【図８】ウイルス注入後０週の腫瘍を示す図
【図９】ウイルス注入後３週の腫瘍を示す図
【図１０】ウイルス注入後７週の腫瘍を示す図
【図１１】ＭＲＴデータに基づく腫瘍の大きさの７週の経過を示すグラフ図
【図１２】ウイルス注入後１００日までの処理群の生存率を示すグラフ図
【図１３】pTrident３を示す図
【図１４】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBL［IRES］IL-2を示す図
【図１５】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBLを示す図
【図１６】pShuttle［CMV］IL-12を示す図
【図１７】プラスミドpAd-3を示す図
【図１８】図１のＡｄ−３インサートに相当する、トリシストロン性発現カセット（マウスｃＤＮＡｓを含む）の配列を示す図
【図１９】ヒトＩＬ−１２ｐ４０（４０ｋＤａ）のコーディング配列を示す図
【図２０】ヒトＩＬ−１２ｐ３５（３５ｋＤａ）のコーディング配列を示す図
【図２１】ヒト４−１ＢＢＬのコーディング配列を示す図
【図２２】ヒトＩＬ−２のコーディング配列を示す図
【図２３】ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）（図Ａ）およびヒトＢ７−２（ＣＤ８６）（図Ｂ）のコーディング配列を示す図
【図２４】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBL［IRES］IL-2の配列を示す図
【図２５】pShuttle［CMV］IL-12［IRES］4-1BBLの配列を示す図
【図２６】pShuttle［CMV］IL-12の配列を示す図
【図２７】PAd-3の配列を示す図
【図２８】１年までの長期試験における効果を示すグラフ図
【図２９】Ａｄ−１およびＡｄ−３での処理後に腫瘍成長について、コントロールベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）と比較しての効果を示す図
【実施例】
【００４６】
例
Ｉ．ベクターＡｄ−１、Ａｄ−２、Ａｄ−３の構築およびこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＩＩ．ベクターＡｄ−４の構築
Ｉ．ベクターＡｄ−１、Ａｄ−２、Ａｄ−３の構築およびこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験
１．ベクターの製造
最初に、プラスミドｐＴｒｉｄｅｎｔ３（図１）中で、ｓｃＩＬ−１２、４−１ＢＢＬおよびＩＬ−２のマウスｃＤＮＡｓをクローニングした。結果物は、ｐＴ３ ｓｃＩＬ１２［ＩＲＥＳ］４−１ＢＢＬ［ＩＲＥＳ］ＩＬ２（図なし）である。
【００４７】
予め３個の構成成分の読み枠の５’−側およびＩＲＥＳ−要素までのこれらの距離を、最適化された翻訳開始部位を形成するために修飾する。
【００４８】
このようにして構築された３個の構造遺伝子を含む発現カセットは、プロモーターを用いることなく、かつ３’−非翻訳配列を、AdEasy-Systems（QBiogene GmbH; Heidelberg）のpShuttle-CMVプラスミド中でクローニングする。この結果物は、プラスミドpShuttle［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL2（図２）である。このプラスミドからのカセット［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL2は、ＤＮＡシークエンシングによりその正確性について検査した。
【００４９】
その後にこれらのコンストラクトは、Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３中でプラスミドｐＡｄＥａｓｙと一緒に同時形質転換することによって、プラスミドｐＡｄ−３（図参照）に組み換えられ、この場合、Ａｄ−３に関して包含されるすべての組み換えＤＮＡが挙げられる。
【００５０】
pShuttle-［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL2から出発して、プラスミドはＡｄ−２に関して、pShuttle-［CMV］scIL12［IRES］4-1BBL（図参照）、およびＡｄ−１に関して、pShuttle-［CMV］scIL12（図参照）をクローニングし、かつ同様の方法でｐＡｄ−３を製造するために、プラスミドｐＡｄ−２およびｐＡｄ−１を製造した。
【００５１】
アデノウイルスは、プラスミド準備工程においてPacI-制限酵素を用いて切断した後に、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションさせ、かつ得られたウイルス性プラーク（ウイルス粒子ともいう）を単離し、かつ増殖させた。
【００５２】
発現カセットの概略図：図１。
【００５３】
発現試験
２．１ ＩＬ−１２
ラットの肝細胞ガン細胞、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を、ウイルス（ウイルス粒子）Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３を用いて感染させ、かつＩＬ−１２発現を、ＩＬ−１２ ｐ７０−ＥＬＩＳＡを用いて細胞培養上清中で、種々の時間の後に定量した。
概略図：図２。
【００５４】
２．２ ４−１ＢＢＬ
ラットの肝細胞ガン細胞、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を、ウイルス（ウイルス粒子）Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３を用いて感染させ、かつＩＬ−１２発現を、フローサイトメトリーを用いて、４−１ＢＢＬを抗体ＴＫＳ−１（BD Pharmingen, Heidelberg）で染色した後に観察した。Ａｄ−１は、コントロールとして使用し、それというのもこれらは４−１ＢＢＬ発現が見込まれないためである。
概略図：図３。
【００５５】
２．３ ＩＬ−２
ラットの肝細胞ガン細胞、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７を、ウイルス（ウイルス粒子）Ａｄ−１、Ａｄ−２、およびＡｄ−３を用いて感染させ、かつＩＬ−１２発現を、細胞培養上清中で種々の期間の後に、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ここでＡｄ−１およびＡｄ−２はコントロールとして使用し、それというのもこれらはＩＬ−２発現が見込まれないためである（示されていない）。
概略図：図４。
【００５６】
３．ｉｎ ｖｉｖｏ試験
３．１ 段階的投与量拡大試験 １
ベクターＡｄ−３（図５ａ）をラットモデルにおいて、肝細胞ガン性癌腫（ＨＣＣ）について試験した。ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞株（ラットの肝細胞ガン性癌腫）は、Ｂｕｆｆａｌｏ−Ｒａｔｔｅ同質遺伝子群を含むものであって、腫瘍の被膜下肝移植に使用された。
【００５７】
１００万個の細胞移植後に腫瘍の増大について、磁気共鳴断層撮影法（ＭＲＴ）によって、Ｄｒ ．Ｇｅｒｒｉｔ Ｋｒｕｐｓｋｉ−Ｂｅｒｄｉｅｎ（radiologischen Klinik, UKE）との共同研究で、ウイルス注入の前後について観察した。図５ｂは、ウイルス注入後第３日と１２日との間の腫瘍容積についての経過を示した。これらの短い期間においてベクターの顕著な効果は、投与量依存的であり、かつ最も高い投与量でのウイルス注入により、腫瘍容積は２７％の大きさに減少した。これらの結果については図６において、選択されたＭＲＴ−図を用いて個々の動物について示し、腫瘍の大きさは動物の大きさに比例して改善されていることが明らかにされた。
【００５８】
これらのデータに基づいて、より多くの動物群の長期間に亘っての処理に関する投与量は、腫瘍あたり５×１０７の感染性粒子を用いることに定めた。以下の研究において、個々のベクター（Ａｄ−１〜Ａｄ−３）の効果は、専らこれらのわずかな投与量で達成された。図７の概略図で示されているように、腫瘍を移植し、１４日後にＡ−群の６個体の動物をベクターで処理し、かつ抗腫瘍免疫応答のパラメータについてはさらに２週間の後に分析した。それぞれ１０個体の動物についてＢ−群を形成した（長期間処理群）。段階的投与量拡大試験に関する差異において（図５および６）、２個の腫瘍のみを使用し、これについて１個のみをウイルスを用いて処理し、免疫刺激の遠位の効果を算出した。Ｂ−群は、腫瘍減少の長期間に亘っての動態および生存率の分析のために用いた。３ヶ月の後に、これらの概略図中で、生存している動物について、腫瘍再発の診断および撲滅に関しての免疫記憶試験のために、さらに肝臓内腫瘍移植おこなった。さらに３ヶ月間に亘って、再度生存率を測定した。これらのデータは、５×１０７の選択された投与量の場合に、最初の１４日間のインターバルで、腫瘍増加の封じ込めが示された。Ｂ−群はすでに１００日間に亘って観察した。これらの処理による腫瘍減少の結果は、ＭＲＴ−撮影の形で、図８〜１０に示した。
【００５９】
これらの図は、ウイルス投与後７週間に亘って選択された投与量については、肝蔵注入された腫瘍、さらには注入されていない腫瘍の完全な排除を達成したことを示している。注目すべきは、肝臓および腹腔内への転移（Ａｄ−２、３週間）が同様に排除されたというさらなる効果である（Ａｄ−２群、図８〜１０参照）。
【００６０】
ＭＲＴ−データから測定された腫瘍容積の詳細については、図１１で示し、かつ説明している。生存率として処理群中での％で示される試験経過は、図１２に示した。
【００６１】
動物実験の範囲において、ＩＬ−１２はラット血清中で検出された。同様に、インターフェロン−γを測定したが、この場合、これは免疫細胞のＩＬ−１２−免疫刺激後に産出され、抗腫瘍作用の大部分を担うものである。同様にインターフェロン−γは、顕著に検出された。さらに、これらの測定については、腫瘍を特異的にターゲットとするＴ−細胞を、いわゆる細胞毒性試験で観察した。免疫応答が存在し、さらに処理された動物の組織標本について特徴付けた。処理された腫瘍組織は、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を、コントロールベクターで処理された組織と比較して高められた量で検出した。
【００６２】
３．２ 長時間試験の実施のためのプロトコール
２種の腫瘍を、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７−細胞を注入することによって使用した。これらの細胞は、２種の異なる肝葉に注入した。１個の腫瘍に対して、１００万細胞を使用した。その後に、これらの左側の腫瘍には遅れてウイルス注入をおこなった。もう一つの腫瘍は右側であり、６５０．０００個の細胞を使用した。これらの腫瘍については、肝臓内転移モデルとして使用した。これらの腫瘍については、刺激された免疫細胞の効果を、遠位の腫瘍病巣で再度検査した。これらの結果は、図９〜１２および図２８〜３０に示した。
【００６３】
ＩＩ．Ａｄ−４の構築
Ｅ．Ｃｏｌｉ−細胞中の相同的組み換えによる他の挿入系を用いて、Ｂ７−１のための発現カセットを、アデノウイルスＥ３−領域中の位置に挿入した。これらの領域は機能的に不活性であり、したがってこれら領域の大部分は、ここで使用されるベクター中で削除した。発現カセットは、ヒトホスホグリセレートキナーゼであるか、あるいは、プロモーターと類似の能力を有する固有のプロモーターを有している。
【００６４】
ウイルスの製造は、前記プロトコールと同様の方法で実施した。
図面の簡単な説明
図１ ベクターＡｄ−１〜Ａｄ−３の概略図
図２ Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３での感染後の、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞の細胞培養上清中のインターロイキン量の測定。動物実験に使用するためのベクターは、同一のインターロイキン−１２−発現に対して調製した。図２は、ラット肝細胞ガン細胞ＭｃＡ−ＲＨ７７７７中で３日間に亘っての発現の時間経過を示す。
方法：ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞は、ＭＯＩｓ １０により、Ａｄ−１、Ａｄ−２またはＡｄ−３を用いて感染させた。上清を、感染後０日、１日、２日および３日で測定した。ｓｃＩＬ−１２濃度について、ＥＬＩＳＡによって、抗−マウスＩＬ−１２ｐ７０抗体を用いて測定した（Pharmingen）。
図３ ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞培養中での４−１ＢＢＬの検出。４−１ＢＢＬ発現のフローサイトメトリーによる測定。Ａｄ−２およびＡｄ−３は、４−１ＢＢＬを発現したが、Ａｄ−１は発現しなかった。
方法：ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞をＡｄ−１、Ａｄ−２またはＡｄ−３を用いてＭＯＩ １０で調整されたウイルス濃度で感染させた。細胞を、感染後２４時間にハーベストし、かつラット 抗−マウス４−１ＢＢＬモノクローナル抗体（TKS-1, Phraming）を用いてインキュベートし、かつＲ−ＰＥ−結合ヤギ−抗−ラットＩｇポリクローナル抗体（Pharmingen）を用いて検出するために着色した。
図４ ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞中のＩＬ−２についての３日間に亘っての発現。Ａｄ−３は、ＩＬ−２よりも４６６倍大きいＩＬ−１２のモル量を発現した（第３日目の算定）。
方法；ＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞は、Ａｄ−３を用いてＭＯＩ １０で感染させた。上清を第０日、第１日、第２日および第３日目のものである。ＩＬ−２の濃度は、ＥＬＩＳＡによって、抗−マウスＩＬ−２抗体の使用下で測定した（Pharmingen）。
図５ 段階的投与量拡大試験。Ａｄ３での処理後９日間に亘っての腫瘍の大きさの変化。
方法；腫瘍の容量はＭＲＴを用いて、９日間のインターバルで測定した。ウイルス注入後３日目の腫瘍の大きさを１００％とし（１．ＭＲＴ）、ここで示された最終的な大きさについてウイルス投与後１２日目に測定した（２．ＭＲＴ）。ベクターＡｄ３（ａ）を定められた投与量で（ｉ．ｐ．＝感染性粒子）、直径７〜１１ｍｍの大きさの腫瘍に注入した（ｂ）。
図６ 段階的投与量拡大試験のＭＢＴ画像。
方法；１０７〜１０９個の感染性ウイルス粒子Ａｄ−３または１０９個の感染性粒子Ａｄ−ＧＦＰ（コントロール）で処理した腫瘍を、注入後３日目および１２日目でＭＲＴによってスキャンした。
図７ Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３の使用下での動物試験の経過を示す概略図。
図８ ウイルス注入前、第０週目の腫瘍のＭＲＴ−撮影図。
図９ ウイルス注入後、第３週目の腫瘍のＭＲＴ−撮影図。
図１０ ウイルス注入後、第７週目の腫瘍のＭＲＴ−撮影図。
図１１ ＭＲＴ−データから腫瘍の大きさの経過を示す図。
方法：全腫瘍容積は、ＭＲＴによって観察した。ウイルス投与前１日、投与後３週目および７週目に、大きさを測定した。コントロール群Ａｄ−ＧＦＰ：９個体；免疫処理群；Ａｄ−１、Ａｄ−２およびＡｄ−３群それぞれ１０個体。Ａｄ−１の群では、１個体のラットのみが進行した腫瘍の成長を示した。コントロール群の動物はすべて７週間内に死亡した。
図１２ ウイルス注入後１００日までの試験動物の長期生存率
図１３ ベクターpTrident3のマップ
図１４ ベクターpShuttle［CMV］IL12［IRES］4-1BBL［IRES］IL-2のマップ
図１５ ベクターpShuttle［CMV］IL12［IRES］4-1BBLのマップ
図１６ ベクターpShuttle［CMV］IL12のマップ
図１７ ベクターｐＡｄ−３のマップ
図１８ ３個の構造遺伝子を有する発現カセットの配列、この場合、これらはマウス由来のｃＤＮＡｓを含有し、図１からのインサートＡｄ−３に相当する。
図１９ ヒトＩＬ−１２のコーディング配列（４０ｋＤａ）
図２０ ヒトＩＬ−１２のコーディング配列（３５ｋＤａ）
図２１ ヒト４−１ＢＢＬのコーディング配列
図２２ ヒトＩＬ−２のコーディング配列
図２３ ヒトＢ７−１およびＢ７−２のコーディング配列
図２４〜２７ 種々のベクターの配列
図２８ １年までの観察期間における作用を示す図。グラフは、それぞれの時点での生存するラットの割合を示す（生存率１＝１群の動物１００％）。処理群：Ａｄ−３、５×１０６（ｎ＝１２）、Ａｄ−３、５×１０７（ｎ＝１０）。コントロール群：５×１０８ Ａｄ−ＧＦＰ（ｎ＝９）。
【００６５】
これらの長期試験の場合には、個々の動物は２種の肝臓腫瘍を有していた。２週間後（図においては第０日目）に、双方の腫瘍の一つを、一度だけベクター注入によって処理した。腫瘍容積は、これらの時点では約１ｍｌであった。図は、コントロール群の個体（Ａｄ−ＧＦＰ処理したもの）は、ベクター注入後４７日間内に死亡することを示した。５×１０６i.u.（"感染単位"または感染性粒子）で、Ａｄ−３処理群は、９０日後に１個体が死亡し、かつ５×１０７i.u.でのＡｄ−３処理群は、すべての個体が生存していた。"再度の注入"：５×１０７i.u.でのＡｄ−３処理群では、すべての個体についてベクター注入後９２日後（１３週）に、再度腫瘍を肝臓中に移植した。この腫瘍細胞移植は、すべての１０個体の場合にはさらに処理することなく消滅した。
図２９ Ａｄ−１およびＡｄ−３での処理後に腫瘍成長について、コントロールベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）のものと比較しての効果を示す図。
【００６６】
その際、Ａｄ−１およびＡｄ−３に関しては、２種の異なる投与工程で適用し、かつ処理後２週間目の腫瘍の大きさを測定した。群毎の動物個体数：ｎ＝３。図は、Ａｄ−１およびＡｄ−３の異なるベクター投与の場合の腫瘍容積の変化を示した。肝臓の右葉中に１×１０６ＭＨ−７７７７Ａ腫瘍細胞を適用し、かつ２週間後に左の腫瘍にベクターを注入した。ＭＲＴ−スキャンは、ベクター適用前１日および適用後１３日目で実施した。５×１０６i.u.のＡｄ−１の場合には平均の腫瘍容積が顕著に増加するのに比べて、１×１０７i.u.Ａｄ−１の場合には最小限の増加にとどまる。これらの最小限の増加は、Ａｄ−３に関しての５×１０６i.u.の投与量の場合にすでに確認されており、１×１０７i.u.の場合には、これに反して、すでに減少することが明らかである。これにより、Ａｄ−３は、Ａｄ−１よりも著しく効果的であることが証明された。１×１０７i.uのＡｄ−３に関しての値は、ベクター注入後第３日目と第１２日目で算出した。コントロール（Ａｄ−ＧＦＰ）は、２週間に亘っての観察期間内に著しく増加した。動物において後に生じる肝臓外への転移については算定に考慮していない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列が、
（ａ）天然のヒトＩＬ−１２の双方のサブユニットを融合タンパク質として含む、ヒト単一鎖−ＩＬ−１２をコードする核酸配列、
（ｂ）ヒト４−１ＢＢリガンドをコードする核酸配列および
（ｃ）ヒトＩＬ−２をコードする核酸配列
を含むアデノウイルスベクターであることを特徴とする、核酸配列を含有するベクター。
【請求項２】
核酸配列（ａ）が配列番号２及び配列番号３に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を示す、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
核酸配列（ｂ）が配列番号４に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を示す、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
核酸配列（ｃ）が配列番号５に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を示す、請求項１から３までのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
核酸がさらに、１種以上のプロモーターおよび１種以上のＩＲＥＳを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターが、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターである、請求項１から５までのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
さらに以下の特徴：
（ａ）ベクターが、腫瘍−非特異的プロモーターを有し、この場合、このプロモーターは、免疫刺激タンパク質をコードする遺伝子配列のすべてを発現させ；かつ
（ｂ）ベクターが、（ａ）で挙げられたプロモーターのすぐ下流には存在しない各遺伝子配列、ＩＲＥＳ配列を含む、
によって特徴付けられる、請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載のベクターを含有する、ウイルス粒子。
【請求項９】
請求項１から７までのいずれか１項に記載のベクターまたは請求項８に記載のウイルス粒子を含有する、腫瘍及び感染症を治療するための医薬。
【請求項１０】
ベクターが、投与単位当たり１×１０11以下、好ましくは１×１０10以下、１×１０9以下または１×１０7以下の濃度で存在する、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
医薬が、腫瘍内注入のための溶液として処方されている、請求項９または１０に記載の医薬。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の医薬を製造するための、請求項１から７までのいずれか１項に記載のベクターまたは請求項５に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項１】
核酸配列が、
（ａ）天然のヒトＩＬ−１２の双方のサブユニットを融合タンパク質として含む、ヒト単一鎖−ＩＬ−１２をコードする核酸配列、
（ｂ）ヒト４−１ＢＢリガンドをコードする核酸配列および
（ｃ）ヒトＩＬ−２をコードする核酸配列
を含むアデノウイルスベクターであることを特徴とする、核酸配列を含有するベクター。
【請求項２】
核酸配列（ａ）が配列番号２及び配列番号３に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を示す、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
核酸配列（ｂ）が配列番号４に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を示す、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
核酸配列（ｃ）が配列番号５に記載の配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を示す、請求項１から３までのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
核酸がさらに、１種以上のプロモーターおよび１種以上のＩＲＥＳを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターが、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターである、請求項１から５までのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
さらに以下の特徴：
（ａ）ベクターが、腫瘍−非特異的プロモーターを有し、この場合、このプロモーターは、免疫刺激タンパク質をコードする遺伝子配列のすべてを発現させ；かつ
（ｂ）ベクターが、（ａ）で挙げられたプロモーターのすぐ下流には存在しない各遺伝子配列、ＩＲＥＳ配列を含む、
によって特徴付けられる、請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載のベクターを含有する、ウイルス粒子。
【請求項９】
請求項１から７までのいずれか１項に記載のベクターまたは請求項８に記載のウイルス粒子を含有する、腫瘍及び感染症を治療するための医薬。
【請求項１０】
ベクターが、投与単位当たり１×１０11以下、好ましくは１×１０10以下、１×１０9以下または１×１０7以下の濃度で存在する、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
医薬が、腫瘍内注入のための溶液として処方されている、請求項９または１０に記載の医薬。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の医薬を製造するための、請求項１から７までのいずれか１項に記載のベクターまたは請求項５に記載のウイルス粒子の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１８−３】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２４−３】
【図２４−４】
【図２４−５】
【図２５−１】
【図２５−２】
【図２５−３】
【図２５−４】
【図２５−５】
【図２６−１】
【図２６−２】
【図２６−３】
【図２６−４】
【図２７−１】
【図２７−２】
【図２７−３】
【図２７−４】
【図２７−５】
【図２７−６】
【図２７−７】
【図２７−８】
【図２７−９】
【図２７−１０】
【図２７−１１】
【図２７−１２】
【図２７−１３】
【図２７−１４】
【図２７−１５】
【図２７−１６】
【図２８】
【図２９】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１８−３】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２４−３】
【図２４−４】
【図２４−５】
【図２５−１】
【図２５−２】
【図２５−３】
【図２５−４】
【図２５−５】
【図２６−１】
【図２６−２】
【図２６−３】
【図２６−４】
【図２７−１】
【図２７−２】
【図２７−３】
【図２７−４】
【図２７−５】
【図２７−６】
【図２７−７】
【図２７−８】
【図２７−９】
【図２７−１０】
【図２７−１１】
【図２７−１２】
【図２７−１３】
【図２７−１４】
【図２７−１５】
【図２７−１６】
【図２８】
【図２９】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−３６２５１（Ｐ２０１１−３６２５１Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９２８３２（Ｐ２０１０−１９２８３２）
【出願日】平成２２年８月３０日（２０１０．８．３０）
【分割の表示】特願２００４−５４４１４１（Ｐ２００４−５４４１４１）の分割
【原出願日】平成１５年１０月１０日（２００３．１０．１０）
【出願人】（５０８３５９７４５）プロヴェクス メディカル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｖｅｃｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｍａｒｔｉｎｉｓｔｒ．５２， Ｄ−２０２４６ Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３０日（２０１０．８．３０）
【分割の表示】特願２００４−５４４１４１（Ｐ２００４−５４４１４１）の分割
【原出願日】平成１５年１０月１０日（２００３．１０．１０）
【出願人】（５０８３５９７４５）プロヴェクス メディカル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｖｅｃｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｍａｒｔｉｎｉｓｔｒ．５２， Ｄ−２０２４６ Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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