ウイルスワクチン用のヘルペスウイルス骨格およびそれに基づくワクチン
異種ＤＮＡが組み込まれたヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡがＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする組換えデオキシリボ核酸；それを含む組換えウイルス、免疫化のためのウイルスワクチンおよび方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／２７１，９３８号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願の全体を通して、ある刊行物が参照される。これらの刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に見出すことができる。全体としてのこれらの刊行物の開示は、本発明が関係する技術水準をより十分に記述するために、本出願に参照により援用される。
【０００３】
本明細書に開示されている研究は、米国国立衛生研究所からの助成番号ＡＩ−０２４０２１の政府支援によりなされた。したがって、米国政府は本発明においてある権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ウイルスワクチンは、歴史的には、不活性化ワクチンかまたは生の弱毒化ワクチンのいずれかであるが、しかし、これらの種類のワクチンは、ヘルペスウイルスまたはＨＩＶなどのある種のウイルスを追跡するには実施不能とされてきた。単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）などのウイルスベクターを含む新種のワクチンは、現在、調査中である。単純ヘルペスウイルスにおいて、ＨＳＶ−１タンパク質ＩＣＰ０の発現は、ウイルスゲノム由来の遺伝子の効率的な発現を可能にするために必要とされ、より重要なことには、ウイルス力価を改善し、したがってワクチン収率を改善する。しかしながら、ＩＣＰ０の発現はまた先天性免疫を妨げ、その特性は理想のワクチンベクターと適合しない。
【０００５】
ＩＣＰ０の機能の１つは、細胞核ドメイン１０（ＮＤ１０）複合体を解離させ、前骨髄球性タンパク質（ＰＭＬ）をユビキチン化し、それを分解へともたらすことである。ＰＭＬは、インターフェロンの誘導に関与する細胞のゲートキーパーの１つである。
【０００６】
本明細書では、骨格として単純ヘルペスウイルスゲノムを用いる組換えウイルスが開示されるが、しかし、ＩＣＰ０の置換を伴う。組換えウイルスは、相対的に高い力価に複製し、インターフェロンに感受性である。したがって、ベクターのみが、ワクチン開発に必要とされるＩＣＰ０の特性を保持する。
【発明の概要】
【０００７】
異種ＤＮＡが組み込まれたヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡがＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする組換えデオキシリボ核酸。
【０００８】
ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む組換えヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であって、異種ＤＮＡが（ａ）ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入され、（ｂ）組換えＨＳＶが導入される宿主細胞において発現される、組換えＨＳＶ。
【０００９】
（１）薬学的に許容される担体と、（２）（ａ）ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが組み込まれており、（ｂ）各々が糖タンパク質をコードする１または複数個の異種ＤＮＡが組み込まれている、ヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む組換えデオキシリボ核酸を含むウイルスとを含むワクチン。
【００１０】
水痘帯状疱疹ウイルス感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象において水痘帯状ヘルペスに対する免疫応答を誘発し、それにより対象の免疫化をもたらすのに有効な量の上記ワクチンを投与することを含む方法。
【００１１】
ウイルスによる感染の予防に有用な組成物を調製する方法であって、当該組成物を調製するように、上記組換えウイルスを生ワクチン安定化剤と併せることを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐ（配列番号１（ＩＣＰ０）および２（ＯＲＦ６１））のアミノ酸配列のアラインメント。ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐのアミノ酸配列（それぞれＮＣＢＩタンパク質データベース受入番号ＮＰ ０４４６０１．１およびＮＰ ０４０１８３．１）は、Ｇｏｎｎｅｔ Ｍａｔｒｉｘ、オープンギャップペナルティ１０．０、および拡張ギャップペナルティ０．１を用いて整列された。Ｃ３ＨＣ４のＲＩＮＧフィンガー共通配列のＣｙｓおよびＨｉｓ残基にマークを付している。また、ＩＣＰ０のＩＣＰ０ Ｃ末端におけるＮＤ１０標的ドメイン（１８）もマークを付している。ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐのＮＬＳ領域に下線を付している（５２，６３）。ＵＳＰ７相互作用部位は、黒色のボックスでマークを付し、相互作用に必要とされるアミノ酸は矢印で特定する（１９）。また、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性をコードする２つの領域（３０）にもマークを付す。
【図２】ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐ発現細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００の再分布。カバーガラス上で増殖されたＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか（ＡおよびＤ）、またはＩＣＰ０（ＢおよびＥ）もしくはＯＲＦ６１ｐ（ＣおよびＦ）を発現するプラスミド構築物を用いて形質転換した。形質転換の４８時間後、細胞を固定し、ウイルスタンパク質およびＰＭＬ（Ａ−Ｃ）またはＳｐ１００（Ｄ−Ｆ）の局在化を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図３】ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐ発現細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００の存在量。ＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか、またはＭＯＩを５にして、Ａｄｅｍｐｔｙ、ＡｄＩＣＰ０、またはＡｄＯＲＦ６１で感染した。感染の４８時間後、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＰＭＬ、Ｓｐ１００、ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンのレベルをウェスタンブロッティングによって分析した。異種のＰＭＬおよびＳｐ１００をアステリスクで特定している。
【図４】ＯＲＦ６１ｐのＮＤ１０への標的化はＰＭＬ分解をもたらさない。（Ａ）ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐ、およびＩＣＰ０のＣ末端へのＯＲＦ６１ｐ翻訳融合物の略図。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか、またはＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐもしくはＯＲＦ６１ｐ融合タンパク質を発現する構築物で形質転換された。感染の４８時間後、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンのレベルをウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｃ−Ｅ）カバーガラス上で増殖させたＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか（Ｃ）、またはＯＲＦ６１ｐ融合タンパク質を発現するプラスミド構築物で処理した（ＤおよびＥ）。４８時間後、細胞を固定し、ＯＲＦ６１ｐおよびＰＭＬの局在化を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図５】ＨＳＶおよびＶＺＶ感染中のＰＭＬの局在化。カバーガラス上で増殖させたＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを１にしたＨＳＶ（Ａ）、またはＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶ（Ｂ−Ｄ）で感染された。ＨＳＶ感染細胞を感染６時間で固定し、ＶＺＶ感染細胞を感染２４時間で固定し、ＩＣＰ０（Ａ）、ＯＲＦ６１ｐ（Ｂ）、ＯＲＦ６２ｐ（Ｃ）、ｇＥ（Ｄ）およびＰＭＬ（Ａ−Ｄ）の存在を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図６】ＨＳＶおよびＶＺＶ感染中のＳｐ１００の局在化。カバーガラス上で増殖させたＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを１にしたＨＳＶ（Ａ）、またはＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶ（ＢおよびＣ）で感染された。ＨＳＶ感染細胞を感染６時間後に固定し、ＶＺＶ感染細胞を感染２４時間後に固定し、ＩＣＰ０（Ａ）、ＯＲＦ６２ｐ（Ｂ）、およびｇＥ（Ｃ）ならびにＳｐ１００（Ａ−Ｃ）の局在化を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図７】ＨＳＶおよびＶＺＶ感染中のＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの存在量。（Ａ）ＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを５にしたＨＳＶ、またはＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶで感染された。感染の所定時間後、ＰＭＬ、Ｓｐ１００、Ｄａｘｘ、ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンのレベルをウェスタンブロッティングによってモニタリングした。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか、または１０００もしくは２０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンアルファ含有培地とともにインキュベートした。処理の４８時間後、全細胞溶解物をＰＭＬ、Ｓｐ１００、Ｄａｘｘ、ＳＴＡＴ１、リン酸化ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２およびリン酸化ＳＴＡＴ２についてモニタリングした。
【図８】ＶＺＶ複製に対するＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの効果。（Ａ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞由来の全溶解物をＰＭＬ、Ｓｐ１００、Ｄａｘｘおよびチューブリンについてウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｂ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞を連続希釈したＶＺＶで感染した。感染５日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントし、ｓｉ対照細胞において形成された数と比較した。誤差バーは、５つの独立した実験からの標準偏差を示し、各々は２点測定で行われた。（Ｃ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞は、ＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶで感染された。感染の所定時間後、溶解物をＯＲＦ２９ｐ、ＯＲＦ６３ｐおよびチューブリンについてウェスタンブロッティングによって分析された。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化され、チューブリンについて標準化された。（Ｄ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘは、ＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶで感染させた。感染の所定時間後、細胞を回収し、新鮮なＭｅＷｏ単層上で感染中心の数を決定するために滴定した。感染の４日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントして、感染中心の力価を計算した。パネルＤは、細胞株の各々における増殖曲線を示す典型的な実験である。各データ点は、２試料の平均を表す。パネルＥは、４つの独立した実験からのデータ点の平均を示し、誤差バーは標準偏差を表す。
【図９】ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞上の感染巣の形態。ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞は、ＭＯＩを約０．０１にして感染された。感染の２および３日後、細胞を固定し、ＯＲＦ６３ｐおよびｇＥの局在化を免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１０倍対物を用いて撮像した。
【図１０】水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスの構築。（Ａ）ＩＣＰ０遺伝子座の略図。（Ｂ）ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１感染細胞から調製されたｐＣＰＣ−０６１およびＨｉｒｔ ＤＮＡは、以下の結果ＩＩの材料および方法において特定されたプライマーセットを用いて増幅された。（Ｃ）ＭｅＷｏ細胞は、模擬処理されるか、またはＭＯＩを５にして、野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３もしくはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染８時間後、細胞を回収し、材料および方法に記載の抗体を用いたウェスタンブロッティングによってＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンの存在量をモニタリングした。
【図１１】水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスの増殖分析。（Ａ）Ｖｅｒｏ細胞またはＬ７細胞は、連続希釈した野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染の３日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントした。相対的なプラーク形成効率はＸ１００である。誤差バーは、４つの独立した実験からの標準偏差を示し、各々は２点測定で行われた。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを０．１にして、野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染の２、１２、２４および４８時間後、感染細胞を回収し、３回の凍結−融解に供し、収量は、Ｌ７細胞についての滴定後に計算された。
【図１２】ウイルス特異的タンパク質の発現の時間経過。ＭｅＷｏ細胞は、ｍｏｉを０．２にして、野生型（ＨＳＶ−１）、ＩＣＰ０−（ｄｌ１４０３）およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染させた。感染された細胞を所定時間で回収し、ウェスタンブロットによって、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐの合成および存在量について試験した。全てのレーンは抗チューブリン抗体で染色され、等量の細胞タンパク質が各レーンにおいて泳動されたことを示した。
【図１３】水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスによる感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００の運命および要求条件。（Ａ）ＭｅＷｏ細胞は、模擬処理されるか、またはＭＯＩを１０にして、野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３もしくはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染２および４時間後、細胞を回収し、ウェスタンブロッティングを用いて、ＰＭＬ、Ｓｐ１００、ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンの存在量をモニタリングした。（Ｂ）空細胞、ｓｉＰＭＬ細胞、およびｓｉＳｐ１００細胞は、連続希釈された野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染３日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントし、空細胞において形成された数と比較した。誤差バーは、３つの独立した実験からの標準偏差を示し、各々は２点測定で行われた。
【図１４】インターフェロンαに対する水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスの感受性。模擬処理されたか、または一晩インターフェロンαを用いて処理されたＭｅＷｏ、ＶｅｒｏまたはＵ２ＯＳ細胞は、連続希釈された野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染３日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントした。各細胞株上の各ウイルスの相対的なプラーク形成効率は、模擬処理された細胞における力価／インターフェロンα処理された細胞における力価×１００として計算された。
【図１５】ＶＺＶゲノムの略図。ＯＲＦをコードする糖タンパク質を特定する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＨＳＶの非制限的な例には、グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）菌株７；ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＨＦ ＶＲ−２６０（商標）；ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＭａｃＩｎｔｙｐｅ ＶＲ−５３９（商標）；ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＫＯＳ ＶＲ−１４９３（商標）；ヒトヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）Ｇ ＶＲ−７３４（商標）；ヒトヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）ＭＳ ＶＲ−５４０（商標）；およびヒトヘルペスウイルス、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡ）で受託された組換えＧＨＳＶ−ＵＬ４６ ＶＲ−１５４４（商標）が挙げられる。ＶＺＶの非制限的な例には、Ｊｏｎｅｓ菌株；ＶＺＶのＯｋａ菌株、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡ）で受託されたＶＲ−７９５が挙げられる。
【００１４】
「組換え」とは、本明細書で使用するとき、核酸またはウイルスに関連して、それぞれ、核酸またはウイルスの単一形態に合わせられる２つの別々の起源の供給源を有する分子実在物またはウイルス実在物を意味する。例えば、組換えデオキシリボ核酸は、単一のＤＮＡ分子において、単純ヘルペスウイルスゲノムと水痘帯状疱疹ウイルス由来の遺伝子の両方から作製され得る。例えば、組換えウイルスは、外来または異種のコード配列／遺伝子を含む核酸をその中に有するウイルスである。一実施形態では、２つの異なる経路は、異なる種である。
【００１５】
「異種」とは、本明細書で使用するとき、例えば、異種のデオキシリボ核酸に関連して、ＤＮＡが比較して異種なものとして記載される生物のＤＮＡとは異なる生物（またはそれと同一な配列を有する）に由来することを意味する。非制限的な例には、単純ヘルペスウイルス由来のＤＮＡ内に挿入された水痘帯状疱疹ウイルス由来のＤＮＡは、単純ヘルペスウイルス由来のＤＮＡと比較して異種なＤＮＡである。
【００１６】
「ＲＩＮＧフィンガードメイン」とは、２つの亜鉛陽イオンを結合するＣｙｓ３ＨｉｓＣｙｓ４アミノ酸モチーフを含む亜鉛フィンガーポリペプチドを意味する。ＲＩＮＧは、実に興味深い新しい遺伝子（Ｒｅａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ）を意味する頭字語である。
【００１７】
「組み込まれる」とは、本明細書で使用するとき、ウイルスＤＮＡ内に組み込まれる異種遺伝子またはコード配列と関連して、ウイルスＤＮＡが当該ウイルスに感染された宿主細胞によって発現された場合、当該遺伝子またはコード配列が発現するようにＤＮＡ内に異種遺伝子またはコード配列の機能的包含を意味する。
【００１８】
ウイルスＤＮＡの「非必須」遺伝子または領域は、当業者に知られているＤＮＡの領域であり、宿主細胞に感染し、その中で複製するウイルスの能力を妨げないＤＮＡ配列の挿入である。
【００１９】
水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質およびそれらをコードする核酸配列は、当該技術分野において、例えば、糖タンパク質Ｈ、ＢおよびＥ（それぞれｇＨ、ｇＢおよびｇＥ）であり、例えば、全体として参照により本明細書に援用されるＭａｒｅｓｏｖａら，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（２）：９９７−１００７を参照されたい。
【００２０】
水痘帯状疱疹ウイルス中和エピトープは、当該技術分野において周知であり、例えば、各々が、全体として参照により本明細書に援用されるＡｋａｈｏｒｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９，ｐ．２０２０−２０２４，Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．４；およびＦｏｒｇｈａｎｉら．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２８（１１）：２５００−２５０６を参照されたい。
【００２１】
感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）は、ヘルペスウイルスのＤＮＡにコードされたタンパク質である（全体として参照により援用される、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入番号ＮＰ ０４４６０１．１を参照されたい）。ＯＲＦ６１は、オープンリーディングフレーム６１タンパク質（水痘帯状疱疹ウイルス）である（全体として参照により援用される、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入番号ＮＰ ０４０１８３．１を参照されたい）。
【００２２】
免疫化とは、本明細書で使用するとき、免疫応答を引き起こし、その後のウイルス抗原（単数または複数）への暴露において防御体液性および／または細胞性免疫を誘発する対象の免疫系、例えば、ヒトの免疫系に対するウイルス抗原（単数または複数）（例えば、ワクチンにおいて）の提示である。
【００２３】
ウイルスワクチン用の組成物は、当該技術分野において知られ、米国特許第６，６１６，９３１号，Ｂｕｒｋｅら，２００３年９月９日；米国特許第６，２５８，３６２号，Ｌｏｕｄｏｎら，２００１年７月１０日；および米国特許第６，７８７，３５１号，Ｃｈｅｎら，２００４年９月７日に記載され、各々は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されているウイルスベクターワクチンは、薬学的に許容される溶液、例えば、これらに限定されないが、無菌生理食塩水または無菌緩衝生理食塩水において投与することができ、当該技術分野において知られているワクチン用アジュバントとともにまたはアジュバントを伴わないで投与され得る。ワクチンを「投与すること」は、当業者に公知のいずれかの種々の方法および送達システムを用いてもたらされるかまたは実施され得る。ウイルスワクチンは、当該技術分野において公知の方法、例えば、これらに限定されないが、局所的におよび粘膜／鼻粘膜に注射によって投与され得る。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「薬学的な担体」は、上記ウイルスベクターを動物またはヒトに送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤またはビヒクルである。担体は、液体、エアロゾル、ゲルまたは固体であってもよく、計画された投与方法を考慮して選択される。一つの実施形態では、薬学的な担体は、無菌の薬学的に許容される溶媒である。
【００２５】
ウイルスワクチンを製造および貯蔵する方法は当該技術分野において知られ、さらに、全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ／２００６／０１２０９２号に記載されている。そこに記載されているように、一般的に、麻疹、風疹および流行性耳下腺炎などのウイルスの生ワクチンにしばしば使用される安定化剤には、１または複数の糖、アミノ酸、糖アルコール、ゼラチンおよびゼラチン誘導体が含まれ、ウイルスを安定化し、多くの場合、濃縮工程中に変性からウイルスを保持する。本明細書中に記載されている組換えウイルスは、この目的のために、安定化剤、または天然もしくは組換え血清アルブミンを含む他の添加物を用いて、ワクチンに配合されてもよい。また、米国特許第６，２１０，６８３号；同第５，７２８，３８６号、同第６，０５１，２３８号、同第６，０３９，９５８号、および同第６，２５８，３６２号には、安定化剤の詳細、および生ウイルスワクチンをより穏やかに処理するための方法が含まれる。これらの開示の各々は、特に、安定化剤組成物および安定化させる方法を記載するそれらの部分は、全体として参照により具体的に組み込まれる。安定化剤を用いて調製後、ワクチンは、例えば、凍結乾燥ワクチン、凍結乾燥混合ワクチン、液体ワクチンまたは液体混合ワクチンとして保存されてもよい。これらを形成する方法は公知である。典型的には、凍結乾燥ワクチンは、約３〜３０ｍｌ容量のバイアルまたはアンプル中でワクチンを凍結乾燥させ、きつく密封し、５℃またはそれより低い温度で保存することによって調製される。保存された調製ワクチンは、典型的には、製品の同封説明書またはバイアルもしくは他の容器上の注意書きとして、そこに貼り付けられた使用説明書に従って使用される。多くの場合、凍結乾燥ワクチンは、使用前に無菌の蒸留水の添加によって再構成され、得られた溶液は、例えば、０．５ｍｌ／用量の量で皮下注射によって接種される。また、ワクチンは経口または鼻腔内に与えることができる。
【００２６】
異種ＤＮＡが組み込まれたヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡがＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする組換えデオキシリボ核酸。
【００２７】
一つの実施形態では、ＨＳＶ ＤＮＡはゲノムＤＮＡであり、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ゲノムＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて、ＨＳＶ ＤＮＡ内に組み込まれる。一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のゲノムＨＳＶ ＤＮＡ内に挿入される。一つの実施形態では、挿入された異種ＤＮＡは、ＩＣＰ０プロモータおよび３’ＵＴＲの制御下にある。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドは、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む異種ポリペプチドは、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスのタンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＨＳＶ ＤＮＡはＨＳＶゲノムである。
【００２８】
一つの実施形態では、組換えデオキシリボ核酸は、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡをさらに含む。一つの実施形態では、組換えデオキシリボ核酸は、各々異なる糖タンパク質をコードする最大８つの異種ＤＮＡをさらに含む。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む。
【００２９】
一つの実施形態では、組換えデオキシリボ核酸によってコードされるポリペプチドは、哺乳動物の前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）を分解しない。
【００３０】
一つの実施形態では、ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡは、組換えデオキシリボ核酸が適切な宿主細胞のゲノム内に組み込まれた場合、ポリペプチドを発現するように組み込まれる。一つの実施形態では、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＤＮＡの非必須遺伝子または領域内に挿入される。
【００３１】
ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む組換えヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であって、異種ＤＮＡが、（ａ）ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入され、（ｂ）組換えＨＳＶが導入される宿主細胞において発現される、組換えＨＳＶ。
【００３２】
一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ＨＳＶゲノムの一部に代えて、ＨＳＶゲノム内に組み込まれる。一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のＨＳＶゲノム内に挿入される。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドは、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドは、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスのタンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、組換えＨＳＶは、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡをさらに含み、ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入される。一つの実施形態における、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む。一つの実施形態では、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡは、ＨＳＶゲノムの非必須遺伝子または領域内に挿入される。一つの実施形態では、組換えＨＳＶゲノムによってコードされるポリペプチドはＰＭＬを分解しない。一つの実施形態では、組換えＨＳＶは、各々異なる水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質をコードする最大８つの異なる異種ＤＮＡを含む。一つの実施形態では、組換えウイルスは、当該技術分野において公知のそれらの方法によって弱毒化される。
【００３３】
（１）薬学的に許容される担体と、（２）（ａ）ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが組み込まれており、且つ（ｂ）各々が糖タンパク質をコードする１または複数個の異種ＤＮＡが組み込まれているヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムを含む組換えデオキシリボ核酸を含む組換えウイルスとを含むワクチン。
【００３４】
一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて、ＨＳＶゲノム内に組み込まれる。一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のＨＳＶゲノム内に挿入される。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む異種ポリペプチドは、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む異種ポリペプチドは、ＥＨＶ、ＢＨＶ、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む。一つの実施形態では、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡ、およびＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡは、各々、ＨＳＶゲノムの非必須遺伝子または領域内に挿入される。一つの実施形態では、組換えウイルスは、当該技術分野において公知のそれらの方法によって弱毒化される。
【００３５】
水痘帯状ヘルペスウイルス感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象において水痘帯状ヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発し、それにより対象の免疫化をもたらすのに有効な量の上記ワクチンを対象に投与することを含む方法。
【００３６】
ウイルスによる感染予防に有用な組成物を調製する方法であって、該組成物を調製するように、上記組換えウイルスの１つと生ワクチン安定化剤とを併せることを含む方法。
【００３７】
本明細書に記載されている方法の一つの実施形態では、対象は哺乳動物である。一つの実施形態では、対象はヒトである。該方法の一つの実施形態では、宿主細胞は哺乳類であるかまたは哺乳動物由来である。一つの実施形態では、宿主細胞はヒトから得られる。
【００３８】
本明細書に記載されている種々のエレメントの全ての組み合わせは、本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明は、続く実験の詳細を参照することによってより良く理解されるが、当業者は、詳述された具体的な実験が、以下に続く特許請求の範囲においてより十分に記載される本発明の単なる例示であることを容易に認めるだろう。
【００４０】
実験の詳細
以下に開示された研究は、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）におけるＨＳＶ ＩＣＰ０の対応するオルソログであるＯＲＦ６１がＰＭＬを分解することができず、したがって、宿主の先天性免疫を妨げないことを示す。本明細書では、組換えＨＳＶの構築が開示され、ここで、α遺伝子ＩＣＰ０のコード配列はＯＲＦ６１ｐをコードする配列で置換される。
【００４１】
結果Ｉ
核ドメイン１０（ＮＤ１０）は、ＰＭＬ核小体およびＰＭＬ発癌性ドメインとしも知られ、核において染色体間空間内に形成する細胞タンパク質の動的高分子包含物である（２，６５）。これらの小体の大きさおよび頻度は、それぞれ０．２〜１μｍおよび２〜３０／細胞の範囲であり、細胞種および細胞周期の段階に依存している（２，１７，６２）。これらの部位で蓄積される細胞タンパク質は、２つのグループに分けられる：常在コンポーネントであるタンパク質、例えば、ＰＭＬ（前骨髄球性白血病タンパク質）、Ｓｐ１００（１００ｋＤａの斑点（ｓｐｅｃｋｌｅｄ）タンパク質）、Ｄａｎｎ、ＳＵＭＯ−Ｉおよびブルーム症候群ヘリカーゼ、ならびに特定の条件下（例えば、ＤＮＡ修復機構）または過剰発現（例えば、ＢＲＣＡ１）下においてＮＤ１０とのみ結合するタンパク質（７０）。
【００４２】
ＤＮＡウイルスゲノムは、それらの複製周期の初期段階でＮＤ１０コンポーネントと結合する。新たに形成した転写物および複製部位は、通常、ＮＤ１０内に存在するタンパク質近傍に局在化する（６１）。ウイルス複製がＮＤ１０に影響を及ぼす最初の示唆は、ＰＭＬ染色が単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染後に消失したという実証であった（４６）。その後、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびパピローマウイルスの親ゲノムが、ＮＤ１０と結合することが示された（１０，１４，３２，３３，３５，４７）。
【００４３】
ＨＳＶとＮＤ１０のコンポーネントとの間のアンタゴニスト関係は、広範囲にわたって研究されている。ウイルスタンパク質であるＩＣＰ０の発現は、核構造の破壊に必要十分である（１８，４５，４６）。ＩＣＰ０は、見掛けの分子量が１１０ｋＤａである核リン酸タンパク質を含むＣ３ＨＣ４ ＲＩＮＧフィンガーであり（５６）、ウイルス遺伝子と細胞遺伝子の両方の乱交雑アクチベーター（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）として挙動する（１２，２３，５９）。ＩＣＰ０遺伝子を欠損するウイルス変異体は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）に対して増大した粒子比、実質的に低い収率、およびα遺伝子発現レベルの減少を有する（１３，６４）。また、ＩＣＰ０は、プロテアソーム分解のための宿主タンパク質のリスト増加を標的とするためのＥ３ユビキチンリガーゼとして機能し、ＮＤ１０小体のコンポーネント、例えば、ＰＭＬおよびＳｐ１００のＳＵＭＯ−Ｉ改変形態が含まれる（８，１５，１８，２６，４１，５３）。
【００４４】
ＩＣＰ０を発現しないＨＳＶ変異体は、ＮＤ１０コンポーネントを修飾および分解するそれらの能力を欠いている（４６）。ＰＭＬおよびＳｐ１００の枯渇は、ウイルス遺伝子発現を加速させ、ＨＳＶ ＩＣＰ０欠損ウイルスのプラーク形成効率を増加させるが、野生型ウイルスには影響を及ぼさなかった。これらのデータは、効率的なウイルス複製および増殖を確実にするＩＣＰ０ Ｅ３リガーゼ活性によって対抗される固有の抗ＨＳＶ防御機構のコンポーネントであることを示す（２１，２２）。
【００４５】
水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）は、アルファヘルペスウイルスとしてＨＳＶとともに分類される共通のヒト病原体である。ＶＺＶは、ＩＣＰ０と類似し、ウイルスプロモータを転写的に活性化し、ウイルスＤＮＡの感染性を高めるＩＣＰ０オルソログ（ＯＲＦ６１ｐ）（４９，５７）をコードする（４９，５０）。重要なことには、ＯＲＦ６１ｐは、ＩＣＰ０のトランス活性化、ならびにＮＤ１０の解離活性および分解活性に必須であるものに相同なＲＩＮＧフィンガードメインを含む。
【００４６】
ＨＳＶによるＩＣＰ０の発現は、ウイルス遺伝子発現およびタンパク質蓄積を刺激する宿主コシャペロンタンパク質であるＢＡＧ３の枯渇を克服するために必要とされることが従来示されている（３８）。ＯＲＦ６１ｐはＩＣＰ０と機能的に類似していると考えられるが（４９）、ＶＺＶはＢＡＧ３の枯渇によって影響を受け（３７）、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐが、別々に、ウイルス複製に異なる機能を付与するように発展してきたことを示唆する。
【００４７】
本報告は、ＯＲＦ６１ｐおよび他のＶＺＶをコードするタンパク質が、ＨＳＶ感染細胞におけるＩＣＰ０と同じように、ＮＤ１０コンポーネントを分解しないことを示す。また、ＶＺＶ感染中のＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの役割が研究され、本報告は、２つの関連したアルファヘルペスウイルス間の主な相違を強調する。
【００４８】
材料および方法：哺乳動物細胞。ヒト黒色腫（ＭｅＷｏ）、ｓｉＢＡＧ３（３７）、ｓｉＰＭＬ（３８）および２９３Ａ細胞は、従来報告（３７）されるように維持された。ｓｉＲＮＡ標的のＳｐ１００およびＤａｘｘ ｍＲＮＡを発現する安定な細胞株を生成するために、ＭｅＷｏ細胞はレトロウイルスで感染され、２００μｇ／ｍｌ、続く５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む増殖培地中で選択された。
【００４９】
ＤＮＡ形質転換。Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ［Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ］を用いて適切な細胞株にＤＮＡを形質転換した。
【００５０】
薬物処理。インターフェロンαをＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ［Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ］から購入した。
【００５１】
ウイルス。［ｉ］ＶＺＶ．Ｊｏｎｅｓ，野生型臨床単離物は、報告（２４）されるように増殖され、力価決定された。細胞不含ウイルスを報告（３６，５８）されるように調製した。［ｉｉ］レトロウイルス。プロウイルスベクターｐＣＫ−Ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｈｙｇｒｏ（３８）、ｐＣＫ−ｓｉＳｐ１００またはｐＣＫ−ｓｉＤａｘｘおよびｐｇａｇ−ｐｏｌｇｐｔ（４４）およびｐＨＣＭＶ−Ｇ（７５）を用いて２９３Ｔ細胞の一過性の同時形質転換によってレトロウイルスを構築した。
【００５２】
［ｉｉ］アデノウイルス。アデノウイルスであるＡｄｅｍｐｔｙ、ＡｄＩＣＰ０およびＡｄＯＲＦ６１は従来報告された（７４，７６）。
【００５３】
ウイルス増殖アッセイ。［ｉ］プラークアッセイ。ＭｅＷｏ、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００またはｓｉＤａｘｘ細胞を１０倍に連続希釈したウイルスストックを用いて感染させ、感染細胞を固定し、染色し、およびプラークをカウントした。［ｉｉ］増殖曲線。ＭｅＷｏ、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００またはｓｉＤａｘｘ細胞の感染後の細胞に結合したＶＺＶの力価は、未感染のＭｅＷｏ細胞で感染した細胞を混合し、固定および染色後に得られたプラークをカウントすることによって決定された。
【００５４】
プラスミド構築物。［ｉ］ｓｉＲＮＡプラスミド。従来報告されているｓｉＲＮＡオリゴ標的のＳｐ１００およびＤａｘｘ ｍＲＮＡ（２２，６８）は、ｐＣＫ−ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｈｙｇｒｏ（３８）にクローニングするために修飾された。ｐＣＫ−ｓｉＳｐ１００およびｐＣＫ−ｓｉＤａｘｘを生成するために、アニーリングされるオリゴ対のｓｉＳｐ１００ 上流：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＴＴＡ−３’およびｓｉＳｐ１００ 下流：５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＧ、またはｓｉＤａｘｘ 上流：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡ−３’ ｓｉＤａｘｘ 下流：５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＧ−３’は、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ開裂させたｐＣＫ−ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｈｙｇｒｏ（３８）に連結された。
【００５５】
全てのプライマーをＯｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ［Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ］から得て、全てのベクター挿入物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００５６】
抗体。ＯＲＦ２９ｐのアミノ酸［ａａ］１０８６〜１２０１、およびＯＲＦ６３ｐのａａ１〜２６５に対するウサギポリクローナル抗体は（４３）に記載されている。
【００５７】
ＩＣＰ０に対するポリクローナル抗体はすでに報告されている（４０）。モノクローナルＩＣＰ０およびＯＲＦ６２ｐ抗体は、Ｒｕｍｂａｕｇｈ−Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ］から購入した。ＯＲＦ６１ｐのアミノ酸１３６〜２４８を含むＧＳＴ融合タンパク質に対するポリクローナル抗体をウサギに発生させ、以前に報告（３７）されるように、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＰＭＬ、ＧＡＰＤＨおよびチューブリンに対するモノクローナル抗体、およびＤａｘｘに対するポリクローナル抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ］から得た。ＰＭＬおよびＳｐ１００に対するポリクローナル抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ［Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ］から購入した。ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２およびリン酸化ＳＴＡＴ１に対する抗体をＡｂｅａｍ［Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ］から得た。リン酸化ＳＴＡＴ２に対する抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【００５８】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８をコンジュゲートした抗体マウス抗体、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６をコンジュゲートしたウサギ抗体をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ［Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］から得た。免疫ブロッティングのための西洋ワサビヤギペルオキシダーゼに結合された抗ウサギ抗体および抗マウス抗体をＫＰＬ［Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ］から得た。
【００５９】
間接免疫蛍光顕微鏡。従来報告（３７）されるように、カバーガラス上の細胞を固定し、抗体およびＨｏｅｃｈｓｔで染色した。全ての試料は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立顕微鏡［Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ］で視覚化し、Ｏｐｅｎｌａｂ ５ソフトウェア［Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ］を用いて、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ４７４２−８０−１２ＡＧデジタルＣＣＤカメラ［Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ−Ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ］を用いて撮像した。画像は、Ｏｐｅｎｌａｂ ５を用いてデコンヴォルブされ、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３［Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｘ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ］に集めた。
【００６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング。感染させたかまたは生化学的に形質転換された細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１．５×ＳＤＳ試料緩衝液［７５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ６．８，１５０ｍＭ ＤＴＴ，３％ＳＤＳ，０．１５％ブロモフェノールブルー，１５％グリセロール］中で溶解し、沸騰し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質分析を行った（３９）。ウェスタンブロッティング前に、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を移した。５％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中でメンブレンをブロッキング後、固定したタンパク質を１％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中の適切な抗体と反応させた。メンブレンをＰＢＳＴで３回、各々５分間洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された抗ウサギ抗体または抗マウス抗体とともにインキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで再び３回、各５分間、およびＰＢＳで２回洗浄した。ＬｕｍｉＧＬＯ基質［ＫＰＬ］の添加によって抗体を視覚化し、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００６１】
ＳＴＡＴタンパク質に対する抗体を用いた場合、ブロッキングおよび抗体インキュベーションは、５０ｍＭ ＮａＦおよび１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4および３％ＢＳＡが補足されたＰＢＳＴ中で行われた。
【００６２】
配列アラインメント。ＯＲＦ６１ｐ（ＮＰ ０４０１８３．１）およびＩＣＰ０（ＮＰ ０４４６０１．１）のアミノ酸配列は、Ｇｏｎｎｅｔ Ｍａｔｒｉｘ、オープンギャップペナルティ１０．０、および拡張ギャップペナルティ０．１を用いたＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖｅｒ １０．０［ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ］により整列された。
【００６３】
ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとの間の配列類似性。従来の報告は、アルファヘルペスウイルスオルソログ、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐが、遺伝子発現のアクチベーター、およびウイルスＤＮＡ感染性のエンハンサーとして機能するそれらの能力を含む、いくつかの生物学的特徴を共有することを示唆した（４９，５０，５７）。しかしながら、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、ウイルス感染中、ＢＡＧ３の代わりにならなかったことも報告され、これらのタンパク質がそれらの自然な状況において同一の機能を果たさないことが示唆されている（３８）。ＩＣＰ０の多機能は、特定ドメインについてマッピングされている（１６）。これは、これらのタンパク質間のアミノ酸配列のアラインメントがそれらの相違に洞察を与えるという仮説へと導いた。ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベース（それぞれ受入番号ＮＰ ０４４６０１．１およびＮＰ ０４０１８３．１）から得られ、整列された（図１）。それらの核酸配列のいくつかの保存（９）にも関わらず、それらの間でアミノ酸配列の保存が全体で僅かしかないことが見出された（アミノ酸レベルで１０％類似性）。しかしながら、その両方は、それらのＮ末端近傍でＣ3ＨＣ4 ＲＩＮＧフィンガー［Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（９−３９）−Ｃ−Ｘ（１−３）−Ｈ−Ｘ（２−３）−Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（４−４８）−Ｃ−Ｘ２−Ｃ］（３）を含む。これらの２つのタンパク質間の顕著な相違は、ＯＲＦ６１の配列において、ＩＣＰ０のＣ末端（青色で付される）がないことである。重要なことに、この領域は、ＩＣＰ０をＮＤ１０小体に標的化し、次いでそれらのコンポーネントを分解するために必要とされる（１６，１８，４５）。したがって、ＰＭＬおよびＳｐ１００の分解を媒介するＯＲＦ６１ｐの能力の調査を行った。
【００６４】
ＯＲＦ６１ｐは、効率的にＰＭＬおよびＳｐ１００を分解することができない。ＯＲＦ６１ｐおよびＩＣＰ０の２つのオルソログをコードするプラスミドで形質転換されたＭｅＷｏ細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００の局在化に対するＯＲＦ６１ｐおよびＩＣＰ０の効果は、免疫蛍光顕微鏡を用いてモニタリングされた。模擬処理された細胞では、ＰＭＬおよびＳｐ１００は、点状の核小体として出現した（図２Ａおよび２Ｄ）（２）。従来報告されるように、ＩＣＰ０の発現は、両方の細胞タンパク質の消失をもたらした（図２Ｂおよび２Ｅ）（４６）。しかしながら、ＯＲＦ６１ｐを発現する細胞は、異なる表現型を提示した。ＰＭＬ含有小体は、模擬処理された細胞と比較してより消失され、小さいが、タンパク質は、点状の細胞内構造の大部分においてなおも検出された（図２Ｃ）。ＯＲＦ６１ｐを発現する大部分の細胞から消失されたＳｐ１００核小体の染色として、ＯＲＦ６１ｐおよびＳｐ１００の効果はＩＣＰ０の効果とより類似しているようであった（図２Ｆ）。ＰＭＬおよびＳｐ１００量に対するウイルス産物の効果を直接アッセイするために、ＭｅＷｏ細胞は模擬処理されるか、またはヘルペスウイルスタンパク質なし（Ａｄｅｍｐｔｙ）、ＩＣＰ０（ＡｄＩＣＰ０）もしくはＯＲＦ６１ｐ（ＡｄＯＲＦ６１ｐ）のいずれかを発現する複製欠損アデノウイルスで感染され、ウイルスおよび細胞タンパク質レベルをウェスタンブロッティングによってモニタリングした（図３）。５の感染の多重度（ＭＯＩ）を用いて、全ての細胞が感染し、対象のタンパク質を発現したことを確認した。模擬感染細胞またはＡｄｅｍｐｔｙで感染された細胞では、異なる分子量の一連のバンドとしてＰＭＬが出現した。これらは、ＰＭＬの選択的スプライシングされ、翻訳後修飾形態を表した（５４）。Ｓｐ１００（Ｓｐ１００Ａ、Ｓｐ１００Ａ−ＳＵＭＯおよびＳｐ１００−ＨＭＧ）の３つの優勢型が従来報告（２７，６６）されるように検出された。ＩＣＰ０発現は、多様なＰＭＬアイソフォームの完全な消失とＳｐ１００のより遅い移動種とをもたらした（図３）（８）。対照的に、ＯＲＦ６１ｐの発現は、このアッセイによって検出されたＰＭＬの存在量および種に影響を及ぼさなかった。ＯＲＦ６１ｐは、Ｓｐ１００レベルを一貫して減少させたが、ＩＣＰ０ほど効率的ではなかった（図３）。並行して感染させた免疫蛍光分析によって、全ての細胞は感染され、ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐを発現したことが確認された（データ示さず）。Ａｄｅｍｐｔｙで感染された細胞のＰＭＬは、恐らくはアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ３の発現に応答して、延長されたトラックとして再構成された（６）。ＡｄＩＣＰ０によるＩＣＰ０の発現はＰＭＬの消失をもたらし、一方、ＡｄＯＲＦ６１ｐ感染された細胞におけるＰＭＬ染色はＡｄｅｍｐｔｙ試料と同じであった（データ示さず）。この観察は、ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとをさらに区別する。
【００６５】
まとめると、免疫蛍光データおよびウェスタンブロッティング分析は、ＯＲＦ６１ｐがＮＤ１０小体の全体性および染色パターンを変更するが、その発現はＰＭＬの消失に至らなかった。しかしながら、ＯＲＦ６１ｐ発現はＳｐ１００レベルに影響を及ぼさない。
【００６６】
ＯＲＦ６１ｐのＮＤ１０への標的はＰＭＬ分解を引き起こさない。上述した通り、ＩＣＰ０のＣ末端は、ＮＤ１０への標的およびＰＭＬの効率的分解に必要とされ（１６，１８，４５）、ＯＲＦ６１ｐは存在しない（図１）。β−ガラクトシダーゼのこのドメインの追加は、ＰＭＬによるその部分的な同時局在化を引き起こした（１８）。ＰＭＬレベルの減少に対するＯＲＦ６１ｐの不具合が、このドメインの欠損に起因して、ＮＤ１０を標的化できないという結果であるかどうかを試験するために、ＩＣＰ０のＣ末端の１８８個のアミノ酸を用いてＯＲＦ６１ｐの翻訳融合を作製した（図４Ａ）。得られたタンパク質は、ＰＭＬ標的化および分解に必要とされるＩＣＰ０の全ての領域（相同ＲＩＮＧフィンガーおよびＣ末端標的領域）（１６）を含んでいるべきであった。
【００６７】
ＭｅＷＯ細胞は、模擬処理されるかまたはＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐもしくはその融合タンパク質を発現する構築物で形質転換された。細胞溶解物のウェスタンブロッティングにより、全てのタンパク質産物は類似したレベルで蓄積され、ＩＣＰ０のＣ末端領域の追加はＯＲＦ６１ｐ安定性を変更しないことが示された（図４Ｂ）。次に、これらのタンパク質の局在化および量をモニタリングした。上記した通り、ＩＣＰ０発現は、ＰＭＬ染色の消失をもたらし、一方、ＯＲＦ６１ｐの発現は、その細胞内染色パターンにほんの僅かな変化をもたらした（図２Ｂおよび２Ｃ）。融合タンパク質は、ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐとは異なる細胞内局在化パターンを有した。大部分の細胞（約８０〜９０％）では、融合タンパク質は主に細胞質にあった（図４Ｄ）。このドメインに対するβ−ガラクトシダーゼ融合を用いて観察されるもの（１８）と類似して、細胞質ＰＭＬを含有する小体の部分集団は融合タンパク質と共局在化した。タンパク質が核にある集団の１０〜２０％では、クロマチンは辺縁性となり、融合タンパク質が残りの核空間を満たした（図４Ｅ）。しかしながら、両方のケースでは、ＰＭＬ分布が変更されたが、なおも検出された。このようにして、ＰＭＬの細胞内レベルを低下させるＯＲＦ６１ｐの不成功はタンパク質の固有の性質であり、ＯＲＦ６１ｐがＮＤ１０標的ドメインを欠損するために生じない。
【００６８】
ＶＺＶ感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００の分布および存在量。ＯＲＦ６１ｐ単独では、効率的にＰＭＬおよびＳｐ１００を分解しない（図２および３）。他のＶＺＶタンパク質が感染中のこれらのタンパク質の分布に影響を及ぼすかどうかという問いに答えるために、ＭｅＷｏ細胞をＨＳＶまたは細胞不含ＶＺＶで感染させ、ウイルスタンパク質および細胞タンパク質の細胞内分布を免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。従来報告されるように、ＨＳＶで感染された細胞では、ＰＭＬおよびＳｐ１００の染色は消失した（図５Ａおよび６Ａ）。最初の分析中、ＯＲＦ６１ｐの染色は、ウイルス感染された細胞のマーカーであった。ＯＲＦ６１ｐを発現する細胞では、ＰＭＬ含有小体は、未感染細胞と比較すると、大きさが小さく、明るさが少ないようであった。しかしながら、ＨＳＶで感染された細胞の場合とは異なり、ＰＭＬは、ＶＺＶ感染細胞においてなおも検出された（図５Ｂ）。それにも関わらず、ＶＺＶをコードしたタンパク質の発現動力学は十分に理解されず、ＯＲＦ６１ｐ後に発現した他のタンパク質が感染中にＰＭＬの消失に寄与するという可能性があったため、ＯＲＦ６２ｐを感染細胞の代替マーカーとして使用した。このタンパク質は、初期には感染細胞の核に局在化する；しかしながら、その後リン酸化され、感染の後期に細胞質に移行する（１１）。したがって、その細胞内局在化パターンは、感染細胞のマーカーとして、およびウイルス複製サイクルの段階の指標として有用である。ＯＲＦ６２ｐが核にある細胞では、ＰＭＬおよびＳｐ１００は球形構造として現れ、未感染細胞に見られるものと非常に類似していた（図５Ｃおよび６Ｂ）。感染後の後期時間点での感染細胞は、糖タンパク質ｇＥの染色を用いてモニタリングされた。ＶＺＶ感染の後期では、ＮＤ１０コンポーネントの局在化は、形質転換細胞において観察されるものと類似していた（図２）。具体的には、ＰＭＬ小体は、それらの存在量は減少するように見えるが、依然として存在し、それらの染色強度は、未感染細胞において見られるものよりも少なかった（図５Ｄ）。対照的に、Ｓｐ１００の特徴的な点状染色は観察されなかった（図６Ｃ）。
【００６９】
ＶＺＶ感染中のＮＤ１０コンポーネントの運命をさらに調査し、それらの存在量を定量的に測定するために、ＭｅＷｏ細胞をＨＳＶまたは細胞不含ＶＺＶのいずれかで感染させ、細胞タンパク質レベルをウェスタンブロッティングによってモニタリングした。従来報告されるように、ＨＳＶ感染は、ＰＭＬおよびＳｐ１００の多数のアイソフォームの急速な分解をもたらした（図７Ａ）（８）。ＶＺＶ細胞不含の力価は低く、ウイルス複製の動力学はＨＳＶと比較して非常に遅い。したがって、これらのタンパク質に対するウイルス感染の効果を評価するために、それらのレベルは感染後の数日間追跡した。ＨＳＶ感染中に生じたものと比較して、ＰＭＬとＳｐ１００との両方のレベルは、感染のこの期間中に増加した（図７Ａ）。ＰＭＬおよびＳｐ１００の増加速度は、チューブリンの増加速度よりも有意に高く、これは、これらのタンパク質の量の増加が細胞増殖および複製の結果ではないことを示した。これを確認するために、ＮＤ１０の別の構成コンポーネントをモニタリングした。ＰＭＬおよびＳｐ１００とは異なり、Ｄａｘｘ細胞レベルは、観察の経過中にほぼ一定のままであった（図７Ａ）。
【００７０】
ＰＭＬおよびＳｐ１００はインターフェロンによって誘導されるため（２５，６０）、この実験は、これらのタンパク質の発現がＭｅＷｏ細胞においてインターフェロンに感受性であるかどうか、およびインターフェロンがＤａｘｘに影響があるかどうかという問いに答えるために試みられた。ＭｅＷｏ細胞は、２つの異なる濃度のインターフェロンαで処理された。インターフェロン経路がＭｅＷｏ細胞において刺激されたことを確認するため、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２レベルおよびそれらの活性化されたリン酸化形態をウェスタンブロッティングによってモニタリングした（図７Ｂ）。これらのシグナル伝達分子の増加量およびリン酸化によって明らかにされるように、インターフェロン反応はＭｅＷｏ細胞において活性であった。３つのＤＮ１０コンポーネントの存在量を測定した。ＰＭＬおよびＳｐ１００発現が誘導されたが、Ｄａｘｘレベルは、インターフェロン処理によって不変のままであった（図７Ｂ）。
【００７１】
これらの実験は、ＶＺＶ感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００の増加レベルが、感染細胞によって分泌されたインターフェロンに応答して誘導すること、およびＶＺＶが分解のためにこれらのタンパク質を標的とできないことに起因する。
【００７２】
ＶＺＶ感染中のＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの機能。ＰＭＬおよびＳｐ１００のＩＣＰ０指向された分解はＨＳＶ複製に有益である（２１，２２）。ＤａｘｘはＨＣＭＶおよびアデノウイルスによる感染を制限する（３４，６８，７２）。ＶＺＶはＮＤ１０コンポーネントのレベルを効率的に減少しないため、この実験は、これらのタンパク質の下方制御がＶＺＶ複製動力学および収量を変更したかどうかという問いに答えることを試みた。
【００７３】
無し、ＰＭＬ、Ｓｐ１００またはＤａｘｘ ｍＲＮＡのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡを発現する組換えレトロウイルスを用いて、ＭｅＷｏ細胞を形質導入し、安定な細胞株（それぞれｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ）を生じさせた。標的とれたタンパク質の存在量および局在化は、これらの細胞株においてウェスタンブロッティング（図８Ａ）および免疫蛍光顕微鏡（データ示さず）によってモニタリングされた。従来報告（２１，２２）されるように、ＰＭＬの枯渇は、ＮＤ１０小体の完全性の消失、Ｓｐ１００の発現パターンの変化をもたらしたが、Ｄａｘｘレベルでは有意な差がなかった。対照的に、Ｓｐ１００またはＤａｘｘの下方制御は、他のＮＤ１０コンポーネントのレベルおよび分布を変更しなかった。
【００７４】
次に、これらの細胞株を用いてＶＺＶプラーク形成効率を測定した。コンフルエントな単層を細胞不含ウイルスストックのいくつかの希釈を用いて感染させた。感染の数日後、単層を固定し、染色し、およびプラークをカウントした。各細胞株上で形成されたプラーク数を対照細胞上に形成された数に標準化した。結果は、ＰＭＬレベルが減少した場合、プラークの数が約２．５倍（ｔ(val)＝０．００１７）に増加したことを示した（図８Ｂ）。この結果は、ＨＳＶのＩＣＰ０-変位体を用いて観察されたものを模倣していた（２２）。対照的に、Ｓｐ１００の下方制御は小さい（１．２倍）が、ＶＡＶ力価の一定の増加をもたらした（ｔ(val)＝０．０３１）。Ｄａｘｘの枯渇は影響を及ぼさなかった（図８Ｂ）。
【００７５】
ＶＺＶ増殖に対するＮＤ１０コンポーネントの役割をさらに調査するために、ｓｉＲＮＡ細胞株を細胞不含ウイルスで感染させ、ウイルスタンパク質の蓄積を経時的にモニタリングした（図８Ｃ）。各枯渇した細胞株におけるウイルスタンパク質に対応するバンド強度は、同じ時間点での対照細胞において存在していたものに標準化された。ＯＲＦ６３ｐの細胞内レベル、前初期タンパク質、およびＯＲＦ２９ｐ、初期タンパク質は、ｓｉＰＭＬおよびｓｉＤａｘｘ細胞の感染後の初期時間点で増加した。しかしながら、後期時間では、そのレベルは対照細胞において観察されたものと類似していた。プラーク形成効率の結果と同様に、Ｓｐ１００の枯渇は、ウイルスタンパク質レベルにほんの小さな影響を有した。
【００７６】
感染中心の形成を研究するため、ｓｉＲＮＡ細胞株を細胞不含ＶＺＶで感染させ、感染後の種々の時間で、細胞に結合したウイルスの力価を測定した。ウェスタン解析（図８Ｃ）と一致して、ｓｉＰＭＬおよびｓｉＤａｘｘ細胞において形成された感染中心の数は、ｓｉ対照細胞において生じたものと類似したプラークに到達する前に感染初期で増加した。Ｓｐ１００の枯渇は、感染中心の収量にほとんど影響がなかった（図８Ｄおよび８Ｅ）。細胞変性効果（ＣＰＥ）はｓｉＰＭＬ細胞の感染中により顕著であり、プラークは他の細胞株よりも約２４時間早く視認された。対照的に、ｓｉＤａｘｘ単層におけるプラークサイズは、全ての他の細胞株と比較して顕著に小さく、ウイルス誘導ＣＰＥは感染の後期時間でさえ最小であった。さらに、タンパク質蓄積および感染中心アッセイはｓｉＰＭＬ細胞において生じたものと類似した、加速されたウイルス複製を示したが（図８Ｃ−Ｅ）、驚くべきことに、ｓｉＤａｘｘにおけるプラーク形成効率は対照細胞と同じであった（図８Ｂ）。これらの相違の理由を調べるために、カバーガラス上で増殖させたｓｉＲＮＡ細胞を感染させ、感染の２および３日後、細胞を固定し、前初期タンパク質（ＯＲＦ６３ｐ）および後期糖タンパク質（ｇＥ）の発現を免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした（図９）。感染２日後の対照細胞の核は、細胞融合および有効なウイルス伝播の指標となる特徴的な環形状構造を形成した（３７，７１）。Ｓｐ１００枯渇細胞における感染巣は、ｓｉ対照細胞において形成されたものと類似した大きさであった。対照的に、ＶＺＶは、感染２日後により大きな病巣の形成によって明らかなように、ＰＭＬとＤａｘｘとを欠損している細胞において非常に速く伝播した。しかしながら、広範な誘導を生じたｓｉＰＭＬ細胞とは異なり、ｓｉＤａｘｘ細胞の感染は見掛けのＣＰＥがない状態で伝播した。さらに、感染２日後に、細胞は、ｓｉＰＭＬ単層から脱着しただけであり、これはプラークとして記録されるホールをもたらした。
【００７７】
感染３日後（図９）、ＣＰＥは、ｓｉＤａｘｘを除く全ての細胞株の単層において明らかであった。広範囲な細胞融合は、融合細胞形成、およびウイルスタンパク質の均一な染色パターンによって明らかにされるように検出された。他の細胞株とは対照的に、ｓｉＤａｘｘ細胞における感染の伝播は異なっていた。ＶＺＶは伝播し、隣接する細胞に影響を及ぼしたが、個々の無傷な感染細胞が検出され、細胞融合のいずれの証拠もなかった。この形態は、ｓｉ対照細胞とは顕著に異なっていた。重要なことに、細胞は、ウイルス感染におけるこの後期段階でさえ検出されず、これは、顕著に小さなプラークサイズについて説明する。重要なことに、感染した細胞は単層状態のままであり、丸くはならないため、それらは、多くの場合、ｓｉＤａｘｘ数においてプラークとして記録されず、これは、外見上、より低いプラーク形成効率をもたらした（図８Ｂ）。
【００７８】
ＮＤ１０小体の主要なコンポーネントを欠損している細胞におけるウイルス複製のこの分析により、ＰＭＬは野生型ＶＺＶ増殖のリプレッサーであり、一方、Ｓｐ１００はこのプロセスにおいてほとんど役割をもたないことが示された。Ｄａｘｘは異なる機能を有するようであり、これは、このタンパク質のサイレンシングが、初期には、加速された複製とタンパク質複製とをもたらしたが、ウイルス指向の融合細胞形成を欠いていたためであった。
【００７９】
検討
ＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘを含むＮＤ１０小体のコンポーネントは、ＤＮＡウイルスゲノムと結合し、これらのゲノムの発現を抑制するように作用する固有の抗ウイルス機構に貢献する（１０、２１、２２、３２、３５、４７、６７−６９）。ヘルペスウイルスは、それらの効率的な複製と伝播とを確実にするこの細胞抑制機構をバイパスする対向手段を進化させた。ＨＳＶは、プロテアソーム分解についてＮＤ１０結合タンパク質を標的とする、強力な転写アクチベーターであるＩＣＰ０をコードし、これは前初期ウイルス遺伝子の発現増加をもたらした（２１，２２）。
【００８０】
ＶＺＶは、密接に関連したアルファヘルペスウイルスであり、ＩＣＰ０オルソログであるＯＲＦ６１ｐをコードする。従来の研究は、これらのタンパク質間の生物学的活性の保存を強調し、これらの両者が遺伝子発現のアクチベーターであることを示した（４９，５０）。しかしながら、従来、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、ウイルス複製中にコシャペロンタンパク質ＢＡＧ３についての要求条件を克服しないことも示され、オルソログが多機能を有することを示唆した（３８）。
【００８１】
これらのタンパク質のアミノ酸配列アラインメントは、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０の保存されたＲＩＮＧフィンガー残基を保持する一方で、そのＨＳＶオルソログのＣ末端を欠如していることを示した（図１）。これらの領域の両方は、ＮＤ１０小体へのＩＣＰ０の効率的な標的、およびそれらのコンポーネントの分解に必要である（１６）。ＩＣＰ０のＣ末端およびその結合したＮＤ１０標的ドメインのＯＲＦ６１ｐ欠損は、ＯＲＦ６１ｐがＰＭＬ小体のコンポーネントを分解することができないという可能性を生じさせた。ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐを一過性に発現する細胞の免疫蛍光分析、およびヘルペスウイルスタンパク質を発現する組換えアデノウイルスを用いて感染させた細胞由来のタンパク質のウェスタンブロット解析により、ＯＲＦ６１ｐがＰＭＬを枯渇せず、Ｓｐ１００レベルがＩＣＰ０を発現する細胞よりも、非常に低い効率で減少したことを示した（図３）。さらに、ＩＣＰ０標的ドメインの追加によるＮＤ１０にＯＲＦ６１ｐを標的化する試みは、この表現型を変化させなかった（図４）。
【００８２】
ＩＣＰ０は２つの別々のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を含むため、２つのユビキチンリガーゼとして報告された（（３０）に概説される）（図１）。単純ヘルペスウイルスユビキチンリガーゼ（ＨＵＬ）−１は、ＩＣＰ０のエクソン３によってコードされ、ｃｄｃ３４の分解に関与する（２８，２９，３１）。しかしながら、ＰＭＬおよびＳｐ１００の分解を促進するＨＵＬ−２活性は、ＩＣＰ０のＲＩＮＧフィンガードメインについてマッピングする（４，３１）。適切な分子環境におけるＲＩＮＧドメインは、プロテアソーム分解に関わっている（４２）。重要なことに、ＩＣＰ０のＣ末端へのユビキチンプロテアーゼ（ＨＡＵＳＰ−ＵＳＰ７）の結合は、ＲＩＮＧフィンガー基質の分解を促進することが示唆された（３０）。この結合は、新たにユビキチン化されたＨＵＬ−２基質由来のＵＳＰ７の遊離をもたらし、プロテアソーム分解にそれらの効果的な標的を確認することができた（５，２０，３０）。
【００８３】
これらの観察に基づけば、ＯＲＦ６１ｐがＰＭＬおよびＳｐ１００の消失を生じさせない理由を説明する２つのシナリオが描かれる。ＲＩＮＧフィンガードメインはその転写活性化活性に必要とされるが（４８）、ＯＲＦ６１ｐの残りの分子環境は、それがＥ３ユビキチンリガーゼとして作用するには不適切である可能性がある。あるいは、ＯＲＦ６１ｐ内のユビキチン特異的プロテアーゼ結合部位の欠損は、ＵＳＰ７の利用可能性、その標的の迅速な脱ユビキチン化、したがって、プロテアソーム分解からの保護をもたらす可能性がある。後者の仮説が好ましいとされ、それは、蓄積されている証拠が、ＵＳＰ７の結合に依存する（５）ＩＣＰ０の自己保存特性とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、機能的ＲＩＮＧフィンガードメインを必要とするプロテアソーム分解的に急速に分解されるためである（Ｋｙｒａｔｓｏｕｓ、ＤｅＬｏｎｇ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、未刊行）。この観察は、ＯＲＦ６１ｐのＲＩＮＧフィンガーがＥ３リガーゼ活性を有し、自己ユビキチン化を駆動することができるが、しかし、プロテアーゼ結合部位の欠損がその枯渇をもたらすことを意味する。これを支持して、ＵＳＰ７の結合に必要とされるＩＣＰ０の配列内のアミノ酸はＯＲＦ６１ｐに見出されない（図１）。ＶＺＶタンパク質とＮＤ１０のコンポーネントとの関係のさらなる分析により、ＨＳＶ感染中に生じるものとは異なり、ＰＭＬおよびＳｐ１００の存在量はＶＺＶ感染中に増加することが観察された（図７Ａ）。この増加は、インターフェロン刺激されたＮＤ１０のコンポーネントに特異的であり（図７Ｂ）、それは、Ｄａｘｘレベルが感染の経過を通じて変化しないためである（図７Ａ）。ＶＺＶはインターフェロンを誘導するため、ウイルスタンパク質はＮＤ１０の合成を直接誘導せず、したがって、ＰＭＬおよびＳｐ１００の量の増加はインターフェロン刺激の間接的な効果であると考えられる。インターフェロンに関係しない他の経路は、感染細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００レベルの増加に寄与する可能性を排除することができない。
【００８４】
驚くべきことに、ＯＲＦ６１ｐの自主発現はＳｐ１００レベルの減少をもたらすが（図３）、ＶＺＶ感染は増加に至らない（図７）。感染中のインターフェロンによる誘導は、ＯＲＦ６１ｐによるＳｐ１００の分解を隠すことが推測される。これは、ＨＳＶ感染中に観察されるものと対照をなすが、ＩＣＰ０は、ＯＲＦ６１ｐと比較した場合、Ｓｐ１００のより効果的な減少を引き起こすという本発明者らの観察と一致していた（図３）。
【００８５】
ＩＣＰ０を欠損しているＨＳＶ変異体はインターフェロンに過敏であり（５１）、この効果はＰＭＬによって媒介される（７）。対照的に、ＶＺＶはインターフェロンに感受性であるが、ＯＲＦ６１変異体は、ＩＣＰ０変異体とは異なり、インターフェロンに過敏ではない（１）。これらのデータは、ＰＭＬがＶＺＶ感染中に分解しないという観察とともに、インターフェロンが、異なる機構によってこれらの２つのヒトアルファヘルペスウイルスの複製を阻害し、これらのウイルスが異なる特異的な対抗手段を発展させていることを示唆する。結果として、ＨＳＶと対照的に、ＶＺＶは、インターフェロンによる阻害を克服するためにＰＭＬの分解を必要としない可能性がある。ＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘは、ヘルペスウイルス複製の初期段階を抑制することが報告された（２１，２２，６−６９）。これらのタンパク質の各々を枯渇した安定な細胞株を用いて、これらのタンパク質が、ＶＺＶの複製動力学および収量にも影響を及ぼすかどうかを分析した（図８Ａ）。ＨＳＶ感染におけるその役割とは異なり、Ｓｐ１００は、ＶＺＶを用いて感染させた細胞において、プラーク形成効率、遺伝子発現、および感染中心力価にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、ｓｉＰＭＬとｓｉＤａｘｘとの両方の細胞株への感染は、初期時間での力価およびウイルスタンパク質の蓄積の増加をもたらした。したがって、これらのタンパク質は、ウイルス複製の初期段階を特異的に阻害する。これらの相違にも関わらず、ＶＺＶの細胞結合力価は、全ての細胞株において感染の後期時間で同じピーク力価に達した。ＶＺＶ複製は、２つの独立した宿主媒介段階：ＰＭＬ、Ｄａｘｘおよび可能な他の宿主タンパク質によって媒介される初期ブロック、およびウイルス収量を決定する後期ブロック、によって制御されることが推測される。ウイルスのライフサイクルの初期段階を阻害するように初期に機能するタンパク質の枯渇が加速された複製動力学をもたらすが、感染中止の伝播および発生を増加するのに十分ではない。
【００８６】
野生型ＨＳＶ感染中のＮＤ１０コンポーネントの機能は研究するには困難であり、それは、これらのタンパク質がＩＣＰ０発現後に急速に分解し、感染細胞に存在しないためである。したがって、これらの宿主産物の枯渇は、野生型ウイルス複製動力学および収量に対する影響がないが、分解を指向しないＩＣＰ０-ウイルスの複製を増大させる（２１，２２）。この研究の結果は、野生型ＶＺＶがＰＭＬ枯渇細胞においてＩＣＰ０-ウイルス複製を模倣し（図８）、ＮＤ１０小体の主要なコンポーネントの分解を指向しない（図４）ことを示す。ＰＭＬとは対照的に、Ｓｐ１００量は、ＯＲＦ６１ｐが発現する場合に特に減少し（図３）、タンパク質の枯渇はウイルス複製のほんの僅かな効果を有する（図８）。このようにして、ＶＺＶは、効率的な複製に必要とされる程度までＳｐ１００レベルを力価決定するように進展されたといっても差し支えない。あるいは、ｓｉＲＮＡ複製後の細胞内に残る少量のＳｐ１００は、それがＶＺＶをサイレンスにするのに十分であったといっても差し支えない。
【００８７】
結論として、この研究は、細胞培養において増殖されたＶＺＶが、アルファヘルペスウイルスファミリーの固有のメンバーとして振る舞うことを示す。他のＩＣＰ０オルソログ（５５）とは異なり、ＯＲＦ６１ｐはＮＤ１０コンポーネントの分解を指向しない。この固有の防御機構とのＶＡＶ相互作用は、アデノウイルスが宿主媒介性サイレンシングをどのように処理するかに最も類似している（７２，７３）。いずれのウイルスもＮＤ１０タンパク質を分解することができないが、両方ともインターフェロンによる制限を克服することができる。さらに、アデノウイルスと同種であるが、ＨＳＶと比較して、ＶＺＶ複製は、Ｓｐ１００の枯渇によって影響を受けないが、しかし、その複製はＰＭＬおよびＤａｘｘがサイレンスでる場合に加速される。ＨＳＶおよびＶＺＶは非常に類似していると考えられるが、この研究は、それらが、それらの増殖および伝播を確認するために、宿主細胞抑制を妨げる、固有であり、特有の方法を進展させてきたことを示す。
【００８８】
結果ＩＩ
アルファヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）α遺伝子産物であるＩＣＰ０のオルソログをコードする。ＩＣＰ０は、ウイルス遺伝子と細胞遺伝子との乱交雑アクチベーターとして振る舞う核リンタンパク質である（８３，８７，１０４，１０５）。また、ＩＣＰ０は、プロテアソーム分解のためのいくつかの宿主タンパク質を標的とするＥ３ユビキチンリガーゼとして機能する（８０，８６，８７，１０４，１０５）。この活性を通じて、ＩＣＰ０は、前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）タンパク質およびＳｐ１００を含む、核ドメイン１０のコンポーネントの分解を促進する。これらのタンパク質は、ヘルペスウイルスゲノムのサイレンシングに関与する（８６，８７，９８，１１０）。したがって、ＩＣＰ０を媒介したＮＤ１０コンポーネントの分解は、効率的な遺伝子発現を可能にするために、ＨＳＶ遺伝子のサイレンシングを崩壊し得る。この仮説は、どのようにしてＩＣＰ０が遺伝子活性化を誘導するかについての説得力のある機構説明を与える。
【００８９】
また、ＨＳＶ、ウシヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルスおよび水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）由来のＩＣＰ０オルソログをコードするＤＮＡの導入は、核構造およびタンパク質に影響を与えることができる（１０３）。本報告に加えて、さらに具体的には、ＶＡＶオルソログであるＯＲＦ６１ｐは、この遺伝子ファミリーの原型であるＩＣＰ０と同様に、ウイルスプロモータを活性化し、ウイルスＤＮＡの感染性を高める（１００，１０１）。しかしながら、ＨＳＶとＶＺＶオルソログとの間の２つ主な生物学的相違は、従来示されている。ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、宿主コシャペロンタンパク質であるＢＡＧ３の枯渇を補完することができない。結果として、ＶＺＶは、ＢＡＧ３のサイレンシングによって影響を受ける（９１）一方で、ＨＳＶの増殖は、ＩＣＰ０が発現しない場合にも単に変更される（９３）。さらに、両方のタンパク質はＮＤ１０のコンポーネントを標的とするが、ＩＣＰ０の発現はＰＭＬとＳｐ１００の両方の分解をもたらす一方で、ＯＲＦ６１ｐはＳｐ１００レベルを特異的に減少させる（９２）。これらの所見は、これらのタンパク質がウイルス複製について、別々に異なる機能を与えるように進化してきたことを示唆する。
【００９０】
ＩＣＰ０を欠損しているウイルス変異体は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）に対して増大した粒子比、実質的に低い収率、感染多重度（ｍｏｉ）および細胞型に依存したα遺伝子発現のレベルの減少を有する（７８，８０，８４，１０９）。また、これらの変異体はＮＤ１０コンポーネントの分解を欠いている（９９）。ＰＭＬおよびＳｐ１００の枯渇は、ウイルス遺伝子発現を加速し、ＨＳＶ ＩＣＰ０欠損ウイルスのプラーク形成効率を増加させるが、野生型に対しては影響がなく、これは、ＰＭＬおよびＳｐ１００がＩＣＰ０のＥ３リガーゼ活性によって対抗される固有の抗ＨＳＶ防御機構のコンポーネントであることを示唆する（８６，８７）。興味深いことに、ＩＣＰ０ヌルウイルスはまた、インターフェロン（ＩＦＭ）に過敏であり（１０２）、これはＰＭＬを介していることを示唆する特性である（７９）。
【００９１】
ＩＣＰ０に代えてＯＲＦ６１ｐを発現するＨＳＶ変異体ウイルスは、２つのオルソログの活性を直接比較するために構築された。得られたキメラウイルスは、ＩＣＰ０ヌル表現型を部分的にのみ救済する。このような研究は、ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとの間の生物学的相違を強調し、感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００に対する要求条件を明らかにする。
【００９２】
材料および方法：哺乳動物細胞。ヒト黒色腫（ＭｅＷＯ）、ｓｉＰＭＬ（９３）、ｓｉＳｐ１００（９２）、Ｌ７（１０６）およびＵＳ０Ｓ細胞は、従来報告（９１，１１１）されるように維持された。
【００９３】
ＤＮＡ形質転換。Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ［Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ］を用いて、適切な細胞株にＤＮＡを形質転換した。
【００９４】
薬物処理。インターフェロンαをＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ［Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ］から購入した。
【００９５】
ウイルス。［ｉ］ＨＳＶ。使用される菌株は野生型ＨＳＶ−１（グラスゴー菌株１７）および菌株１７のＩＣＰ０ヌルウイルス誘導体（ｄｌ１４０３）であった（１０９）。［ｉｉ］ＨＳＶを発現するＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐ（ＨＳＶ−ＯＲＦ６１）。ｄｌ１４０３ヌクレオカプシドは、線状化ｐＣＰＣ−０６１を用いてＭｅＷＯ細胞内にコトランスフェクトされた。巨大プラークを拾い上げ、ＰＣＲによって組換えウイルスについてスクリーニングした。ＯＲＦ６１ｐについては陽性であるが、ＩＣＰ０をコードする配列については陽性ではないプラークは、５回精製したプラークであった。
【００９６】
ウイルス増殖アッセイ。［ｉ］プラークアッセイ。ＭｅＷｏ、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００、Ｌ７またはＵ２ＯＳ細胞のコンフルエントな単層は、１０倍に連続希釈したウイルスストックで感染され、単層を固定し、染色し、プラークをカウントした。［ｉｉ］増殖曲線。全てのＨＳＶストックの力価は、ＩＣＰ０を補完する細胞株Ｌ７に対する滴定による分析前に決定された。ウイルス収量は従来報告（９３）されるように決定された。
【００９７】
Ｈｉｒｔ ＤＮＡ抽出。Ｈｉｒｔ ＤＮＡを報告（９０）されるように調製した。
【００９８】
プラスミド構築。ＶＺＶ ＯＲＦ６１は、ＲＶ６１（５’ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴ−３’）（配列番号：７）と３’Ｓａｌ６１（５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＧＡＣＴＴＣＴ−３’）（配列番号：８）とを用いてＶＺＶゲノムＤＮＡ（Ｊｏｎｅｓ菌株）からＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＰＣ−Ｔ６１ｃＪを生じさせた。ＯＲＦ６１コード配列は、ｐＣＰＣ−０６１を得るために、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化されたｐＤＳ１７（１１３）においてＩＣＰ０をコードする配列を置換するために使用されるＮｃｏＩ／ＳａｌＩ断片として抽出された。
【００９９】
全てのプライマーをＯｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ［Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ］から得て、全てのベクター挿入物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１００】
組換えウイルスゲノムの分析。Ｈｉｒｔ ＤＮＡは、プライマー：０ｆｏｒ：５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＧＴＴ−３’、０ｒｅｖ：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣ−３’、６１ｆｏｒ：５’ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＣＧＴＣＧＧＣＴＡＧ−３’、６１ｒｅｖ：５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＣＴＣＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣ−３’（それぞれ配列番号３−６）を用いてＰＣＲを行うことによって、ＯＲＦ６１配列の存在およびＩＥ−０コード配列の不存在について調べた。
【０１０１】
抗体。ＩＣＰ０に対するポリクローナル抗体は報告された（２０）。ＩＣＰ０およびＩＣＰ４に対するモノクローナル抗体は、Ｒｕｍｂａｕｇｈ−Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ］から購入された。ＯＲＦ６１ｐに対するポリクローナル抗体は（９２）に報告された。チューブリンに対するモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ］から得られた。ＰＭＬおよびＳｐ１００に対するポリクローナル抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ［Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ］から購入された。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギ抗体および抗マウス抗体をＫＰＬ［Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ］から得た。
【０１０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング。感染させたかまたは生化学的に形質転換された細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１．５×ＳＤＳ試料緩衝液［７５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ６．８，１５０ｍＭ ＤＴＴ，３％ＳＤＳ，０．１５％ブロモフェノールブルー，１５％グリセロール］中で溶解し、沸騰した。宿主タンパク質およびウイルスタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（９４）。ウェスタンブロッティング前に、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を移した。５％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中でメンブレンをブロッキング後、固定したタンパク質を１％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中の適切な抗体と反応させた。メンブレンをＰＢＳＴで３回、各々５分間洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された抗ウサギ抗体または抗マウス抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳＴで再び３回、各５分間、およびＰＢＳで２回洗浄した。ＬｕｍｉＧＬＯ基質［ＫＰＬ］の添加によって抗体を視覚化し、Ｘ線フィルムに暴露した。
【０１０３】
結果
ＶＺＶ−ＨＳＶ組換え発現ＯＲＦ６１ｐの生成。ＶＺＶを用いたコインフェクションはＨＳＶ−ＩＣＰ０変異体の増殖を補完した（１０９）。次いで、条件付けでＯＲＦ６１ｐを発現した細胞株を用いて、ＩＣＰ０ヌル変異体を補完した（２４）。この後者の実験は、これらのウイルスオルソログがいくつかの生物学的活性を共有することを示唆した。しかしながら、これらのタンパク質は、ＮＤ１０コンポーネントに特異的に影響を及ぼし、野生型ＶＺＶは、ＨＳＶではないが、これらのコンポーネントに異なる要求を示した（９２）。したがって、ＯＲＦ６１ｐの機能をさらに分析するために、この研究は、それが二重の前初期０（ＩＥ−０）遺伝子座を置換する場合に、ＨＳＶ ＩＣＰ０と置き換わる可能性があるかどうかを調べた。
【０１０４】
ＩＣＰ０ ＨＳＶをコードする遺伝子座を置換するために、ウイルス骨格としてｄｌ１４０３を使用した。ｄｌ１４０３は、ＩＥ−０遺伝子の第２と第３のエクソンのフレーム融合外から誘導される最初の１０５ａａと追加の５６ａａをコードする。ＯＲＦ６１ｐをコードする配列は、材料および方法に記載されるように、増幅され、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化されたＩＣＰ０クローンに挿入された。ＮｃｏＩ部位は、それらの各タンパク質の合成を開始するために、両方の遺伝子によって使用されるＡＵＧコドンを含む。得られたプラスミド（ｐＣＰＣ−０６１）の構造的完全性は、ＩＥ−０プロモータおよび３’ＵＴＲを保持し、制限エンドヌクレアーゼ開裂およびＤＮＡ配列分析によって確認された。次いで、ｐＣＰＣ−０６１は線状化され、ｄｌ１４０３ヌクレオカプシドを用いてＭｅＷｏ細胞にコトランスフェクトされた（１０７）。得られた組換えウイルスは、ＭｅＷｏ細胞に対して滴定され、巨大プラークは、ＯＲＦ６１ｐの発現がＩＣＰ０欠陥を補完するであろうという推測により拾い上げられた（１００，１０９）。これらのプラークから調製されたＨｉｒｔ ＤＮＡは、ＩＥ−０の上流と下流のプライマー、およびＯＲＦ６１ｐに相同な２つの内部プライマーを用いてＰＣＲによってスクリーニングされた（図１０Ａ）。ＯＲＦ６１ｐをコードする配列を有し、ＩＣＰ０をコードするＤＮＡを欠損している配列を有するウイルスＤＮＡを含むプラークをさらに精製し、これを用いて、細胞がＯＲＦ６１ｐを発現するかどうかを決定するために細胞に感染させた。この分析の結果は図１０Ｃに示され、次のように概要される：ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された細胞のウェスタンブロット分析は、細胞が感染後６時間で類似した量のＩＣＰ４を発現し、ＩＣＰ０は発現されなかったこと、およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１はＯＲＦ６１ｐを発現したことを示した。このようにして、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１では、欠損ＩＥ−０の両方のコピーがＯＲＦ６１ｐコード配列と置換され、得られたウイルスがＩＥ−０プロモータの制御下でＯＲＦ６１ｐを発現した。
【０１０５】
ＨＳＶ−ＯＲＦ６１の増殖およびプラーク形成効率。２つの実験は、ＯＲＦ６１ｐの発現がＩＣＰ０ヌル表現型を救済するかどうかを試験するために行われた。第１に、野生型のｄｌ１４０３とＨＳＶ−ＯＲＦ６１は、Ｌ７とＶｅｒｏ細胞について滴定され、相対的プラーク形成効率は、Ｌ７細胞についての力価対Ｖｅｒｏ細胞についての力価の割合として計算された。ＨＳＶ ｄｌ１４０３、および他のＩＣＰ０変異ウイルスは、それらの力価がＬ７などの補完細胞について測定され、親のＶｅｒｏ細胞株についてのそれらの力価と比較した場合に明らかである高い粒子／ｐｆｕ比を有する。３つのウイルスのプラーク形成効率は以下の通りであった：野生型＝０．９、ｄｌ１４０３＝３４０、およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１＝９．５（図１１Ａ）。このようにして、ＯＲＦ６１ｐの発現はｄｌ１４０３に対するＨＳＶ−ＯＲＦ６１のプラーク形成効率を約３５倍に増大させたが、野生型プラーク形成を回復するには十分ではなかった。次に、この研究は、どのようにしてＯＲＦ６１ｐの発現が、ＭｅＷｏ細胞において組換えウイルスの増殖動力学に影響を与えるかを調べた。細胞を低ｍｏｉで感染させ、試料を経時的に回収し、細胞あたりの感染ウイルスの収量をＬ７細胞においてプラークアッセイによって決定した。増殖曲線の分析は、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１が野生型とｄｌ１４０３との間を媒介する動力学で置換されることを表した（図１１Ｂ）。これらの２つの実験は、プラーク形成効率とウイルス収量の観点から、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０の欠損を十分に補完することができなかったという結論へと導いた。
【０１０６】
ＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染させた細胞におけるウイルス特異的タンパク質の蓄積。低ｍｏｉでのＩＣＰ０変異体の増殖欠損は、全種類のウイルス特異的タンパク質の発現遅延と蓄積減少として現れた（２，４）。したがって、ＭｅＷＯ細胞は、ｍｏｉを０．２にして、野生型、ｄｌ１４０３およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１を用いて感染された。ＩＣＰ４についての免疫蛍光分析（データ示さず）を用いて、各ウイルスが等しい数の細胞を感染したことを確認した。細胞溶解物を所定時間で調製し、ウェスタンブロット分析用に処理された。タンパク質の存在量および分析の動力学の分析は、低ｍｏｉのこの条件下で、ＩＣＰ４の蓄積が、感染４時間後に野生型ウイルスで感染された細胞において検出されたことを表した。対照的に、このタンパク質は、感染６時間までｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１のいずれかで感染された細胞において検出されなかった（図１２）。さらに、感染８時間後のＩＣＰ４の存在量は、野生型感染細胞と比較して、変異ウイルスで感染させた細胞において有意に減少した。従来報告されるように、ＩＣＰ２７の合成および蓄積の動力学は機能的ＩＣＰ０の発現に依存している（９７）。この表現型は、ＯＲＦ６１ｐが発現された場合、部分的に逆転されただけであった（図１３）。予想した通り、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐは、これらのタンパク質を発現したウイルスで感染された細胞において検出されただけであった。これらのデータは、プラーク形成効率および増殖に関する研究と一致し（図１１）、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０の生物学的特性を十分に表現型模倣しなかったが、ＩＣＰ０−ウイルスの複製を明らかに高めたことを示した。
【０１０７】
感染後のＮＤ１０コンポーネントの運命。ＩＣＰ０は、プロテアソーム分解のためにＮＤ１０を解離し、それらの２つの主なコンポーネントであるＰＭＬおよびＳｐ１００を標的とするには必要であり、十分である。対照的に、ＯＲＦ６１ｐは、ＰＭＬを分解しないが、Ｓｐ１００レベルを減少させる（９２）。したがって、ＰＭＬおよびＳｐ１００の運命は、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１による感染中に追跡され、野生型またはｄｌ１４０３で感染された細胞において生じたものと比較された。ウェスタンブロット分析は、ＰＭＬの分解が、感染２時間後の初期程度で、野生型で感染された細胞において検出されたことを表した。対照的に、ＰＭＬレベルは、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１のいずれかで感染された細胞において変化しなかった（図１３Ａ）。これらの結果は、従来の所見を確証し、他のＨＳＶ前初期または初期タンパク質が存在する場合でされ、ＰＭＬの安定レベルに影響を及ぼさないことを示した。Ｓｐ１００は、ＮＤ１０の別の主なコンポーネントであり、ＩＣＰ０に依存して、ＨＳＶでの感染後に効率的に分解されることは周知である（８０）。この研究は、ＨＳＶ遺伝子発現に照らして、ＯＲＦ６１ｐがＳｐ１００の分解を効率的に指向することを示した（図１３Ａ）。
【０１０８】
野生型ＨＳＶおよびＶＺＶは、ＰＭＬまたはＳｐ１００の枯渇によって特異的に影響される（９２）。ｓｉＰＭＬおよびｓｉＳｐ１００におけるＨＳＶ−ＯＲＦ６１の相対的なプラーク形成効率を測定し、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１が宿主タンパク質であるＰＭＬまたはＳｐ１００の下方制御によって影響されるかどうかを決定するために、野生型ＨＳＶとｄｌ１４０３の効率と比較した。従来報告されるように、野生型ウイルスのプラーク形成効率は、ＰＭＬ（ｓｉＰＭＬ）またはＳｐ１００（ｓｉＳｐ１００）について枯渇した細胞に対して滴定される場合に影響を及ぼさなかった（図１３Ｂ）。対照的に、ｄｌ１４０３は、これらのＮＤ１０コンポーネントの不存在において部分的に補完された（図１３Ｂ）。ＨＳＶ−ＯＲＦ６１の相対的なプラーク形成効率はＶＺＶと表現型模倣した（９２）。より具体的には、ウイルス力価はｓｉＰＭＬ細胞において増加した一方で、ｓｉＳｐ１００細胞においては未変化のままであった（図１３Ｂ）。
【０１０９】
ウイルス複製に対するインターフェロンの効果。従来の研究は、ＨＳＶインターフェロン（ＩＦＮ）感受性がＰＭＬを媒介することを示唆し、ＩＣＰ０−ウイルスがこの細胞タンパク質を分解できないため、幾分過敏であることを提唱した。ＨＳＶ−ＯＲＦ６１はＰＭＬを分解することができないことが示されたため、この研究はどのようにしてＩＦＮ処置がこの変異ウイルスの増殖に影響を及ぼすかを調べた。ＩＦＮの有無において、ＭｅＷｏ、Ｖｅｒｏ（ＩＦＮに反応するが、発現しない（８２））およびＵ２０Ｓ（ＩＣＰ０変異ウイルスを補完する細胞株（１１２））に対するＨＳＶ−ＯＲＦ６１ｐ、野生型ＨＳＶ−１およびｄｌ１４０３のプラーク形成効率の比較を行った。ＭｅＷｏ細胞およびＶｅｒｏ細胞におけるｄｌ１４０３とＨＳＶ−ＯＲＦ６１の両方のプラーク形成効率は、ＩＦＮに反応して推定上合成されたインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）によって影響された（図１４）。ＭｅＷｏ細胞とＶｅｒｏ細胞に対して野生型ウイルスで見られた感受性における小さな相違（４〜５倍）は、絶対的なプラーク形成効率における相違の結果ではないが、むしろＶｅｒｏ細胞におけるＩＦＮの効果に対する全てのウイルスのより大きな感受性を反映していた（表１）。
【表１】
【０１１０】
これを支持して、Ｖｅｒｏ細胞においてＩＦＮに対するｄｌ１４０３の感受性が増加する。従来報告（１０２）されるように、Ｕ２ＯＳ細胞は、ＩＦＮに対するＩＣＰ０変異体の感受性を救済した。同じようにして、ＩＦＮによる処理後のＨＳＶ−ＯＲＦ６１のプラーク形成効率もまた救済された（図１４）。これらの分析は、ＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐはＩＣＰ０機能のいくつかと置き換わったが、野生型ＩＦＮ耐性表現型をＨＳＶ−ＯＲＦ６１が反復しないことによって明らかなように、ｄｌ１４０３におえる欠陥の全てを補完しなかったことは明らかであった（図１４）。
【０１１１】
検討
ＨＳＶ ＩＣＰ０は、遺伝子発現の強力な無差別的な転写アクチベーターとして作用するＲＩＮＧフィンガータンパク質である。ＩＣＰ０のオルソログは、アルファヘルペスウイルスファミリーの他のメンバーに存在する。これらのタンパク質は、ウイルスゲノム内のそれらの局在化、および遺伝子発現に影響を及ぼす能力によってＩＣＰ０と関連する。全てのオルソログにおけるＮ末端近傍のＲＩＮＧフィンガーを除いて、配列類似性が制限される。具体的には、ＶＺＶにおけるＩＣＰ０オルソログであるＯＲＦ６１ｐは、同時発現した場合、ＩＣＰ０−ウイルスの複製を加速し、さらに遺伝子発現に影響を及ぼす（１００，１０１）。これらの類似性にも関わらず、ＯＲＦ６１遺伝子内の相同なＩＣＰ０配列の欠損は従来強調され、これらのタンパク質が多機能を有するという示唆（９２）がなされている。
【０１１２】
この研究は、ＩＣＰ０プロモータおよび３’ＵＴＲの制御下で、ＩＣＰ０に代えてＯＲＦ６１ｐを発現する変異ＨＳＶウイルスを構築することによってＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐの活性を比較する。したがって、オルソログは同一の遺伝的背景において発現され、２つのウイルスの生物学的活性において観察された任意の相違は、ウイルスタンパク質が発現される単なる結果であるべきである。
【０１１３】
野生型、ＩＣＰ０−およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１による感染中の増殖とタンパク質発現プロフィールとの比較は、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０ヌル表現型を部分的に救済するが、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１ｐの複製は野生型ウイルスの複製よりも効率が低いことを示した。これらのタンパク質が異なるレベルに発現され、異なる半減期を有し、および別々にＨＳＶタンパク質と相互作用するという可能性があり、ならびにこれはＨＳＶ−ＯＲＦ６１の増殖表現型に影響を及ぼし得るという可能性がある。結果は、ＯＲＦ６１ｐが発現されると、ＩＣＰ０機能のいくつかを欠損するということである。
【０１１４】
アデノウイルスから発現されたＩＣＰ０は、２つの主なＮＤ１０コンポーネント、ＰＭＬおよびＳｐ１００の効率的な枯渇を引き起こした一方で、ＯＲＦ６１ｐを発現するアデノウイルスがＳｐ１００レベルだけを減少させた。ここで、ウイルス複製中のＮＤ１０コンポーネント存在量に対するこれらのタンパク質の効果を比較した。他のＨＳＶタンパク質が発現されたときでさえ、ＯＲＦ６１ｐは特異的にＳｐ１００を減少させ、ＰＭＬに対して効果がないことが観察された。
【０１１５】
ＮＤ１０は、先天性免疫の核形態を与えることが示唆されている。具体的には、ＮＤ１０コンポーネントは、ヘルペスウイルスおよび他のＤＮＡウイルスゲノムの発現を抑制するように作用する。その流れでは、野生型ウイルスではなく、ｄｌ１４０３の複製およびプラーク形成効率は、ＰＭＬまたはＳｐ１００を欠損する細胞において増加されることは興味深い（８５，８６）。対照的に、野生型ＶＺＶの複製およびプラーク形成効率は、Ｓｐ１００の枯渇によって影響を受けず、ｓｉＰＭＬ細胞において増加する（９２）。これらの観察、およびＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐだけが異なる細胞株において観察されたプラーク形成効率に必要とされるという仮定に基づいて、ＩＣＰ０の代わりにＯＲＦ６１ｐを発現するＨＳＶがＶＺＶを表現型模倣することが期待され得た。したがって、ｓｉＰＭＬおよびｓｉＳｐ１００細胞におけるＨＳＶ−ＯＲＦ６１のプラーク形成効率はそれらの親対照細胞株と比較された。ウイルス複製は、ＰＭＬが枯渇された場合に部分的に補完されたが、Ｓｐ１００レベルの減少はウイルス複製に影響を及ぼさなかった。これは、ＯＲＦ６１ｐが効率的なウイルス複製を可能にするＳｐ１００レベルを滴定するために進展してきたというさらなる実証であった。しかしながら、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐはＰＭＬを標的としない；したがって、ＯＲＦ６１ｐだけが発現される場合、ＰＭＬ宿主タンパク質は、ウイルス増殖と複製を抑制するために利用可能なままである。
【０１１６】
ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１を発現するウイルスはＳｐ１００分解に特異的に影響を及ぼす。Ｓｐ１００は、通常、ＳＤＳ電気泳動中に３種として分解される（８９，１０８）。研究抗体によって認識された種は、電気泳動の移動速度に照らして、Ｓｐ１００、Ｓｐ１００−ＳＵＭＯおよびＳｐ１００−ＨＭＧであった。野生型ウイルスで感染された細胞では、Ｓｐ１００の高分子量種が徐々に消失する一方で、Ｓｐ１００Ａは安定化された（図１４）。Ｓｐ１００のこの電気泳動パターンは、ｓｉＲＮＡによってＰＭＬが枯渇した細胞において観察されたものと模倣した（８５，９２）。対照的に、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０に代えて発現された場合、Ｓｐ１００の全てのアイソフォームおよび改変種は、感染中に徐々に消失し、ＰＭＬの電気泳動パターンにおいて見掛けの相違がなかった。これは、ｓｉＲＮＡ実験と一致し、ＰＭＬの枯渇とは異なり、Ｓｐ１００の下方制御がＮＤ１０小体の他のコンポーネントに効果がなかったことを示す（８５，８６，９２）。さらに、ＩＣＰ０を発現するアデノウイルスを用いた細胞の感染は、ＰＭＬとＳｐ１００Ａを除くＳｐ１００の消失をもたらした一方で、ＯＲＦ６１ｐを発現するアデノウイルスは全てのＳｐ１００形態を減少させ、ＰＭＬに対して効果がなかった（９２）。
【０１１７】
これらの結果は、これらのアルファヘルペスウイルスオルソログがＮＤ１０コンポーネントを標的とする一方で、それらは異なる方法でそうするという提案をもたらした。ＨＳＶ ＩＣＰ０はプロテアソーム分解についてＰＭＬを標的とする。ＰＭＬレベルの減少は、Ｓｐ１００Ａを除いて、Ｓｐ１００種の消失をもたらす。したがって、ＰＭＬを標的とすることによって、ＩＣＰ０は、両方の主要なＮＤ１０コンポーネントを直接的または間接的に標的とする。対照的に、ＯＲＦ６１ｐは、独立して、分解についてＳｐ１００を標的とする。ＩＣＰ０とは異なり、Ｓｐ１００の減少は他のＮＤ１０タンパク質に対して見掛けの効果はない。これらのオルソログによるＮＤ１０タンパク質の特異的標的化は、それらの生物学的活性において観察された相違の少なくともいくつかの原因となり得る。
【０１１８】
ウイルス感染中のＰＭＬの正確な役割は捕らえられないままである。しかしながら、ＩＣＰ０を欠損しているＨＳＶ変異体とＯＲＦ６３ｐを欠損しているＶＺＶ変異体はインターフェロンに過敏であり（１０２）、この効果はＰＭＬによって媒介される（７９）ことは知られている。対照的に、野生型ＨＳＶ（１０２）およびＶＺＶ（７７）は、ＩＦＮにあまり感受性でない。これらのデータは、ＰＭＬがＶＺＶ感染中に分解されないという観察（９２）とともに、インターフェロンが異なる機構によってこれらの２つのヒトアルファヘルペスウイルスの複製を阻害し、これらのウイルスが異なる特異的な対抗手段を進化させてきたことを示唆する。結果として、ＨＳＶとは対照的に、ＶＺＶはインターフェロンによる阻害を克服するためにＰＭＬの分解を必要としない可能性がある。これらの研究は、ＨＳＶ ＩＣＰ０とＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐとの間の機能的相違の分子的理解の根拠を与える。未公開の観察は、その機能的ハンディーキャップにも関わらず、ＯＲＦ６１ｐはＶＺＶプロモータとＨＳＶプロモータの両方をなおも活性化するという従来の報告と一致している。しかしながら、上述した通り、ＯＲＦ６１ｐは、ＩＣＰ０の免疫調節活性を欠損する。これらの観察に基づいて、Ｓｐ１００枯渇はウイルス遺伝子発現を高めるために必要とされる一方で、先天性免疫系のインターフェロンアームの徴発に影響を及ぼす活性はＰＭＬによって媒介されるだけであり得るという可能性がある。したがって、これらのオルソログの機能のさらなる詳細な分析は、感染中のＮＤ１０コンポーネントの役割に洞察を与えることができた。
【０１１９】
これらの結果は、ワクチンベクターとしてＨＳＶ骨格に関して重要である（１９）。ＩＣＰ０の発現は、クロマチン修飾、およびウイルス遺伝子の効率的な発現を可能にするリモデリングに必要とされる（８１，８８，９５）。しかしながら、ＩＣＰ０の発現は先天性免疫を妨げる。さらに、ＩＣＰ０の枯渇はウイルス力価の減少をもたらす。このようにして、ＩＣＰ０に代えて、骨格の基礎としてのＨＳＶ−ＯＲＦ６１の使用は、現在のヘルペスウイルスに基づくベクターの有利な代替物を提供する。
【０１２０】
結果ＩＩＩ
アルファヘルペスウイルスはＨＳＶα遺伝子産物のオルソログであるＩＣＰ０をコードする。ＩＣＰ０はウイルス遺伝子および細胞遺伝子の乱交雑アクチベーターとして振る舞う核リンタンパク質であり、プロテアソーム分解のために宿主タンパク質を標的とするＥ３ユビキチンリガーゼとしても機能する。この活性を通じて、ＩＣＰ０は、ＰＭＬおよびＳｐ１００を含むＮＤ１０小体のコンポーネントの分解を促進する。これらのタンパク質は、ヘルペスウイルスゲノムのサイレンシングに関与する。したがって、ＩＣＰ０を媒介したＮＤ１０コンポーネントの分解は、効率的な遺伝子発現を可能にするＨＳＶ遺伝子のサイレンシングを崩壊し得る。この仮説は、どのようにしてＩＣＰ０が遺伝子活性化を誘導するかについての説得力のある機構説明を与える。ＯＲＦ６１ｐは、ＶＺＶオルソログであり、ウイルスプロモータを活性化し、ＩＣＰ０のようなウイルスＤＮＡの感染性を高める。しかしながら、ＨＳＶオルソログとＶＺＶオルソログとの間の２つの主な生物学的相違が示されている。第１に、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、宿主のコシャペロンタンパク質であるＢＡＧ３の枯渇を補完することができない。結果として、ＶＺＶは、ＢＡＧ３のサイレンシングによって影響されない一方で、ＨＳＶの増殖は、ＩＣＰ０が発現しない場合に変更されないだけである。さらに、両方のタンパク質はＮＤ１０のコンポーネントを標的とし、ＩＣＰ０の発現がＰＭＬとＳｐ１００の両方の分解をもたらす一方で、ＯＲＦ６１ｐはＳｐ１００レベルを特異的に減少させた。このようにして、これらのタンパク質は、ウイルス複製について異なる機能を提供するために別々に進化してきた。これらのオルソログを直接比較するために、ＩＣＰ０の代わりにＯＲＦ６１ｐを発現するＨＳＶ変異ウイルスを構築した（図１０）。
【０１２１】
添付のグラフでは（図１１ｂ）、ＩＣＰ０−ウイルス（ｄｌ１４０３）から欠損しているＯＲＦ６１ｐが力強い増殖を回復する一方で、得られたキメラウイルスは、単にＩＣＰ０ヌル表現型を部分的に救済したことが示される。この所見は、ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとの間に顕著な生物学的相違があることを示した。より重要なことには、ＶＺＶワクチンを考慮するとき、ＨＳＶではないＶＺＶがインターフェロン（ＩＦＮ）に感受性であるということを想起する必要がある。したがって、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１は、ＰＭＬを分解するその能力について試験され、野生型ＶＺＶのように、分解しないことが示された。したがって、ＩＦＮ処理がこの変異ウイルスの増殖に影響を及ぼすかどうかが問われ、ＭｅＷｏ細胞とＶｅｒｏ細胞において、ｄｌ１４０３とＨＳＶ−ＯＲＦ６１の両方のプラーク形成効率がＩＦＮに反応して推定上合成されたＩＳＧによって減少したことが示された。これらの分析は、ＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐはＩＣＰ０機能のいくつかと置き換わったが、野生型ＩＦＮ耐性表現型をＨＳＶ−ＯＲＦ６１が反復しないことによって明らかなように、ｄｌ１４０３における欠陥の全てを補完しなかったことを表した。
【０１２２】
この組換えウイルスは、ＶＺＶ Ｏｋａワクチン菌株のＩＦＮ感受性を反復する特徴を有する。ＶＺＶは、主要な中和ウイルスエピトープを表す８つの糖タンパク質をコードする（図１５）。ＨＳＶのＵｓ領域をコードする糖タンパク質は、ＶＺＶの対応するＵｓ領域に位置される主要な糖タンパク質遺伝子ＯＲＦ６７および６８で置換され得る。これは、ＩＣＰ０をコードする配列の代わりに、ＯＲＦ６１ｐを含むＨＳＶ−１バクミドを用いて行われる。組換え構築物は、次に回復されるウイルスを作製するために細胞内にトランスフェクトされる。当該技術分野において知られるように、組換えウイルスは、プラスミド／バクミドにおける所望のＤＮＡ断片を宿主細胞内に、それとの組換えを可能にするウイルスと組換えウイルス産物とともに同時に導入することによって構築され得る。ＶＺＶ由来の対応する配列によるＨＳＶ糖タンパク質の１つずつの置換は、糖タンパク質遺伝子がＶＺＶ糖タンパク質遺伝子を用いて完全に置換されるＨＳＶ菌株を再構築するために行うことができる。これは、天然のＶＺＶと比べて改善された安定性を提供し、ワクチン産物について高い力価まで増殖可能である。
【参考文献】
【０１２３】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／２７１，９３８号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願の全体を通して、ある刊行物が参照される。これらの刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に見出すことができる。全体としてのこれらの刊行物の開示は、本発明が関係する技術水準をより十分に記述するために、本出願に参照により援用される。
【０００３】
本明細書に開示されている研究は、米国国立衛生研究所からの助成番号ＡＩ−０２４０２１の政府支援によりなされた。したがって、米国政府は本発明においてある権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ウイルスワクチンは、歴史的には、不活性化ワクチンかまたは生の弱毒化ワクチンのいずれかであるが、しかし、これらの種類のワクチンは、ヘルペスウイルスまたはＨＩＶなどのある種のウイルスを追跡するには実施不能とされてきた。単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）などのウイルスベクターを含む新種のワクチンは、現在、調査中である。単純ヘルペスウイルスにおいて、ＨＳＶ−１タンパク質ＩＣＰ０の発現は、ウイルスゲノム由来の遺伝子の効率的な発現を可能にするために必要とされ、より重要なことには、ウイルス力価を改善し、したがってワクチン収率を改善する。しかしながら、ＩＣＰ０の発現はまた先天性免疫を妨げ、その特性は理想のワクチンベクターと適合しない。
【０００５】
ＩＣＰ０の機能の１つは、細胞核ドメイン１０（ＮＤ１０）複合体を解離させ、前骨髄球性タンパク質（ＰＭＬ）をユビキチン化し、それを分解へともたらすことである。ＰＭＬは、インターフェロンの誘導に関与する細胞のゲートキーパーの１つである。
【０００６】
本明細書では、骨格として単純ヘルペスウイルスゲノムを用いる組換えウイルスが開示されるが、しかし、ＩＣＰ０の置換を伴う。組換えウイルスは、相対的に高い力価に複製し、インターフェロンに感受性である。したがって、ベクターのみが、ワクチン開発に必要とされるＩＣＰ０の特性を保持する。
【発明の概要】
【０００７】
異種ＤＮＡが組み込まれたヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡがＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする組換えデオキシリボ核酸。
【０００８】
ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む組換えヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であって、異種ＤＮＡが（ａ）ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入され、（ｂ）組換えＨＳＶが導入される宿主細胞において発現される、組換えＨＳＶ。
【０００９】
（１）薬学的に許容される担体と、（２）（ａ）ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが組み込まれており、（ｂ）各々が糖タンパク質をコードする１または複数個の異種ＤＮＡが組み込まれている、ヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む組換えデオキシリボ核酸を含むウイルスとを含むワクチン。
【００１０】
水痘帯状疱疹ウイルス感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象において水痘帯状ヘルペスに対する免疫応答を誘発し、それにより対象の免疫化をもたらすのに有効な量の上記ワクチンを投与することを含む方法。
【００１１】
ウイルスによる感染の予防に有用な組成物を調製する方法であって、当該組成物を調製するように、上記組換えウイルスを生ワクチン安定化剤と併せることを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐ（配列番号１（ＩＣＰ０）および２（ＯＲＦ６１））のアミノ酸配列のアラインメント。ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐのアミノ酸配列（それぞれＮＣＢＩタンパク質データベース受入番号ＮＰ ０４４６０１．１およびＮＰ ０４０１８３．１）は、Ｇｏｎｎｅｔ Ｍａｔｒｉｘ、オープンギャップペナルティ１０．０、および拡張ギャップペナルティ０．１を用いて整列された。Ｃ３ＨＣ４のＲＩＮＧフィンガー共通配列のＣｙｓおよびＨｉｓ残基にマークを付している。また、ＩＣＰ０のＩＣＰ０ Ｃ末端におけるＮＤ１０標的ドメイン（１８）もマークを付している。ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐのＮＬＳ領域に下線を付している（５２，６３）。ＵＳＰ７相互作用部位は、黒色のボックスでマークを付し、相互作用に必要とされるアミノ酸は矢印で特定する（１９）。また、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性をコードする２つの領域（３０）にもマークを付す。
【図２】ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐ発現細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００の再分布。カバーガラス上で増殖されたＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか（ＡおよびＤ）、またはＩＣＰ０（ＢおよびＥ）もしくはＯＲＦ６１ｐ（ＣおよびＦ）を発現するプラスミド構築物を用いて形質転換した。形質転換の４８時間後、細胞を固定し、ウイルスタンパク質およびＰＭＬ（Ａ−Ｃ）またはＳｐ１００（Ｄ−Ｆ）の局在化を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図３】ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐ発現細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００の存在量。ＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか、またはＭＯＩを５にして、Ａｄｅｍｐｔｙ、ＡｄＩＣＰ０、またはＡｄＯＲＦ６１で感染した。感染の４８時間後、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＰＭＬ、Ｓｐ１００、ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンのレベルをウェスタンブロッティングによって分析した。異種のＰＭＬおよびＳｐ１００をアステリスクで特定している。
【図４】ＯＲＦ６１ｐのＮＤ１０への標的化はＰＭＬ分解をもたらさない。（Ａ）ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐ、およびＩＣＰ０のＣ末端へのＯＲＦ６１ｐ翻訳融合物の略図。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか、またはＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐもしくはＯＲＦ６１ｐ融合タンパク質を発現する構築物で形質転換された。感染の４８時間後、全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンのレベルをウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｃ−Ｅ）カバーガラス上で増殖させたＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか（Ｃ）、またはＯＲＦ６１ｐ融合タンパク質を発現するプラスミド構築物で処理した（ＤおよびＥ）。４８時間後、細胞を固定し、ＯＲＦ６１ｐおよびＰＭＬの局在化を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図５】ＨＳＶおよびＶＺＶ感染中のＰＭＬの局在化。カバーガラス上で増殖させたＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを１にしたＨＳＶ（Ａ）、またはＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶ（Ｂ−Ｄ）で感染された。ＨＳＶ感染細胞を感染６時間で固定し、ＶＺＶ感染細胞を感染２４時間で固定し、ＩＣＰ０（Ａ）、ＯＲＦ６１ｐ（Ｂ）、ＯＲＦ６２ｐ（Ｃ）、ｇＥ（Ｄ）およびＰＭＬ（Ａ−Ｄ）の存在を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図６】ＨＳＶおよびＶＺＶ感染中のＳｐ１００の局在化。カバーガラス上で増殖させたＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを１にしたＨＳＶ（Ａ）、またはＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶ（ＢおよびＣ）で感染された。ＨＳＶ感染細胞を感染６時間後に固定し、ＶＺＶ感染細胞を感染２４時間後に固定し、ＩＣＰ０（Ａ）、ＯＲＦ６２ｐ（Ｂ）、およびｇＥ（Ｃ）ならびにＳｐ１００（Ａ−Ｃ）の局在化を間接免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１００倍の対物を用いて撮像し、ボリュームデコンボリューションによって分析した。
【図７】ＨＳＶおよびＶＺＶ感染中のＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの存在量。（Ａ）ＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを５にしたＨＳＶ、またはＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶで感染された。感染の所定時間後、ＰＭＬ、Ｓｐ１００、Ｄａｘｘ、ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンのレベルをウェスタンブロッティングによってモニタリングした。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞を模擬処理するか、または１０００もしくは２０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンアルファ含有培地とともにインキュベートした。処理の４８時間後、全細胞溶解物をＰＭＬ、Ｓｐ１００、Ｄａｘｘ、ＳＴＡＴ１、リン酸化ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２およびリン酸化ＳＴＡＴ２についてモニタリングした。
【図８】ＶＺＶ複製に対するＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの効果。（Ａ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞由来の全溶解物をＰＭＬ、Ｓｐ１００、Ｄａｘｘおよびチューブリンについてウェスタンブロッティングによって分析した。（Ｂ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞を連続希釈したＶＺＶで感染した。感染５日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントし、ｓｉ対照細胞において形成された数と比較した。誤差バーは、５つの独立した実験からの標準偏差を示し、各々は２点測定で行われた。（Ｃ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞は、ＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶで感染された。感染の所定時間後、溶解物をＯＲＦ２９ｐ、ＯＲＦ６３ｐおよびチューブリンについてウェスタンブロッティングによって分析された。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化され、チューブリンについて標準化された。（Ｄ）ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘは、ＭＯＩを約０．０１にした細胞不含ＶＺＶで感染させた。感染の所定時間後、細胞を回収し、新鮮なＭｅＷｏ単層上で感染中心の数を決定するために滴定した。感染の４日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントして、感染中心の力価を計算した。パネルＤは、細胞株の各々における増殖曲線を示す典型的な実験である。各データ点は、２試料の平均を表す。パネルＥは、４つの独立した実験からのデータ点の平均を示し、誤差バーは標準偏差を表す。
【図９】ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞上の感染巣の形態。ｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ細胞は、ＭＯＩを約０．０１にして感染された。感染の２および３日後、細胞を固定し、ＯＲＦ６３ｐおよびｇＥの局在化を免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。１０倍対物を用いて撮像した。
【図１０】水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスの構築。（Ａ）ＩＣＰ０遺伝子座の略図。（Ｂ）ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１感染細胞から調製されたｐＣＰＣ−０６１およびＨｉｒｔ ＤＮＡは、以下の結果ＩＩの材料および方法において特定されたプライマーセットを用いて増幅された。（Ｃ）ＭｅＷｏ細胞は、模擬処理されるか、またはＭＯＩを５にして、野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３もしくはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染８時間後、細胞を回収し、材料および方法に記載の抗体を用いたウェスタンブロッティングによってＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンの存在量をモニタリングした。
【図１１】水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスの増殖分析。（Ａ）Ｖｅｒｏ細胞またはＬ７細胞は、連続希釈した野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染の３日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントした。相対的なプラーク形成効率はＸ１００である。誤差バーは、４つの独立した実験からの標準偏差を示し、各々は２点測定で行われた。（Ｂ）ＭｅＷｏ細胞は、ＭＯＩを０．１にして、野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染の２、１２、２４および４８時間後、感染細胞を回収し、３回の凍結−融解に供し、収量は、Ｌ７細胞についての滴定後に計算された。
【図１２】ウイルス特異的タンパク質の発現の時間経過。ＭｅＷｏ細胞は、ｍｏｉを０．２にして、野生型（ＨＳＶ−１）、ＩＣＰ０−（ｄｌ１４０３）およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染させた。感染された細胞を所定時間で回収し、ウェスタンブロットによって、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐの合成および存在量について試験した。全てのレーンは抗チューブリン抗体で染色され、等量の細胞タンパク質が各レーンにおいて泳動されたことを示した。
【図１３】水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスによる感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００の運命および要求条件。（Ａ）ＭｅＷｏ細胞は、模擬処理されるか、またはＭＯＩを１０にして、野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３もしくはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染２および４時間後、細胞を回収し、ウェスタンブロッティングを用いて、ＰＭＬ、Ｓｐ１００、ＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐおよびチューブリンの存在量をモニタリングした。（Ｂ）空細胞、ｓｉＰＭＬ細胞、およびｓｉＳｐ１００細胞は、連続希釈された野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染３日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントし、空細胞において形成された数と比較した。誤差バーは、３つの独立した実験からの標準偏差を示し、各々は２点測定で行われた。
【図１４】インターフェロンαに対する水痘帯状疱疹ウイルスＯＲＦ６１ｐを発現する単純ヘルペスウイルスの感受性。模擬処理されたか、または一晩インターフェロンαを用いて処理されたＭｅＷｏ、ＶｅｒｏまたはＵ２ＯＳ細胞は、連続希釈された野生型ＨＳＶ−１、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された。感染３日後、単層を固定し、染色し、プラークをカウントした。各細胞株上の各ウイルスの相対的なプラーク形成効率は、模擬処理された細胞における力価／インターフェロンα処理された細胞における力価×１００として計算された。
【図１５】ＶＺＶゲノムの略図。ＯＲＦをコードする糖タンパク質を特定する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＨＳＶの非制限的な例には、グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）菌株７；ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＨＦ ＶＲ−２６０（商標）；ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＭａｃＩｎｔｙｐｅ ＶＲ−５３９（商標）；ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＫＯＳ ＶＲ−１４９３（商標）；ヒトヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）Ｇ ＶＲ−７３４（商標）；ヒトヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）ＭＳ ＶＲ−５４０（商標）；およびヒトヘルペスウイルス、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡ）で受託された組換えＧＨＳＶ−ＵＬ４６ ＶＲ−１５４４（商標）が挙げられる。ＶＺＶの非制限的な例には、Ｊｏｎｅｓ菌株；ＶＺＶのＯｋａ菌株、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡ）で受託されたＶＲ−７９５が挙げられる。
【００１４】
「組換え」とは、本明細書で使用するとき、核酸またはウイルスに関連して、それぞれ、核酸またはウイルスの単一形態に合わせられる２つの別々の起源の供給源を有する分子実在物またはウイルス実在物を意味する。例えば、組換えデオキシリボ核酸は、単一のＤＮＡ分子において、単純ヘルペスウイルスゲノムと水痘帯状疱疹ウイルス由来の遺伝子の両方から作製され得る。例えば、組換えウイルスは、外来または異種のコード配列／遺伝子を含む核酸をその中に有するウイルスである。一実施形態では、２つの異なる経路は、異なる種である。
【００１５】
「異種」とは、本明細書で使用するとき、例えば、異種のデオキシリボ核酸に関連して、ＤＮＡが比較して異種なものとして記載される生物のＤＮＡとは異なる生物（またはそれと同一な配列を有する）に由来することを意味する。非制限的な例には、単純ヘルペスウイルス由来のＤＮＡ内に挿入された水痘帯状疱疹ウイルス由来のＤＮＡは、単純ヘルペスウイルス由来のＤＮＡと比較して異種なＤＮＡである。
【００１６】
「ＲＩＮＧフィンガードメイン」とは、２つの亜鉛陽イオンを結合するＣｙｓ３ＨｉｓＣｙｓ４アミノ酸モチーフを含む亜鉛フィンガーポリペプチドを意味する。ＲＩＮＧは、実に興味深い新しい遺伝子（Ｒｅａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅ）を意味する頭字語である。
【００１７】
「組み込まれる」とは、本明細書で使用するとき、ウイルスＤＮＡ内に組み込まれる異種遺伝子またはコード配列と関連して、ウイルスＤＮＡが当該ウイルスに感染された宿主細胞によって発現された場合、当該遺伝子またはコード配列が発現するようにＤＮＡ内に異種遺伝子またはコード配列の機能的包含を意味する。
【００１８】
ウイルスＤＮＡの「非必須」遺伝子または領域は、当業者に知られているＤＮＡの領域であり、宿主細胞に感染し、その中で複製するウイルスの能力を妨げないＤＮＡ配列の挿入である。
【００１９】
水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質およびそれらをコードする核酸配列は、当該技術分野において、例えば、糖タンパク質Ｈ、ＢおよびＥ（それぞれｇＨ、ｇＢおよびｇＥ）であり、例えば、全体として参照により本明細書に援用されるＭａｒｅｓｏｖａら，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（２）：９９７−１００７を参照されたい。
【００２０】
水痘帯状疱疹ウイルス中和エピトープは、当該技術分野において周知であり、例えば、各々が、全体として参照により本明細書に援用されるＡｋａｈｏｒｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９，ｐ．２０２０−２０２４，Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．４；およびＦｏｒｇｈａｎｉら．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２８（１１）：２５００−２５０６を参照されたい。
【００２１】
感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）は、ヘルペスウイルスのＤＮＡにコードされたタンパク質である（全体として参照により援用される、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入番号ＮＰ ０４４６０１．１を参照されたい）。ＯＲＦ６１は、オープンリーディングフレーム６１タンパク質（水痘帯状疱疹ウイルス）である（全体として参照により援用される、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入番号ＮＰ ０４０１８３．１を参照されたい）。
【００２２】
免疫化とは、本明細書で使用するとき、免疫応答を引き起こし、その後のウイルス抗原（単数または複数）への暴露において防御体液性および／または細胞性免疫を誘発する対象の免疫系、例えば、ヒトの免疫系に対するウイルス抗原（単数または複数）（例えば、ワクチンにおいて）の提示である。
【００２３】
ウイルスワクチン用の組成物は、当該技術分野において知られ、米国特許第６，６１６，９３１号，Ｂｕｒｋｅら，２００３年９月９日；米国特許第６，２５８，３６２号，Ｌｏｕｄｏｎら，２００１年７月１０日；および米国特許第６，７８７，３５１号，Ｃｈｅｎら，２００４年９月７日に記載され、各々は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されているウイルスベクターワクチンは、薬学的に許容される溶液、例えば、これらに限定されないが、無菌生理食塩水または無菌緩衝生理食塩水において投与することができ、当該技術分野において知られているワクチン用アジュバントとともにまたはアジュバントを伴わないで投与され得る。ワクチンを「投与すること」は、当業者に公知のいずれかの種々の方法および送達システムを用いてもたらされるかまたは実施され得る。ウイルスワクチンは、当該技術分野において公知の方法、例えば、これらに限定されないが、局所的におよび粘膜／鼻粘膜に注射によって投与され得る。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「薬学的な担体」は、上記ウイルスベクターを動物またはヒトに送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤またはビヒクルである。担体は、液体、エアロゾル、ゲルまたは固体であってもよく、計画された投与方法を考慮して選択される。一つの実施形態では、薬学的な担体は、無菌の薬学的に許容される溶媒である。
【００２５】
ウイルスワクチンを製造および貯蔵する方法は当該技術分野において知られ、さらに、全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ／２００６／０１２０９２号に記載されている。そこに記載されているように、一般的に、麻疹、風疹および流行性耳下腺炎などのウイルスの生ワクチンにしばしば使用される安定化剤には、１または複数の糖、アミノ酸、糖アルコール、ゼラチンおよびゼラチン誘導体が含まれ、ウイルスを安定化し、多くの場合、濃縮工程中に変性からウイルスを保持する。本明細書中に記載されている組換えウイルスは、この目的のために、安定化剤、または天然もしくは組換え血清アルブミンを含む他の添加物を用いて、ワクチンに配合されてもよい。また、米国特許第６，２１０，６８３号；同第５，７２８，３８６号、同第６，０５１，２３８号、同第６，０３９，９５８号、および同第６，２５８，３６２号には、安定化剤の詳細、および生ウイルスワクチンをより穏やかに処理するための方法が含まれる。これらの開示の各々は、特に、安定化剤組成物および安定化させる方法を記載するそれらの部分は、全体として参照により具体的に組み込まれる。安定化剤を用いて調製後、ワクチンは、例えば、凍結乾燥ワクチン、凍結乾燥混合ワクチン、液体ワクチンまたは液体混合ワクチンとして保存されてもよい。これらを形成する方法は公知である。典型的には、凍結乾燥ワクチンは、約３〜３０ｍｌ容量のバイアルまたはアンプル中でワクチンを凍結乾燥させ、きつく密封し、５℃またはそれより低い温度で保存することによって調製される。保存された調製ワクチンは、典型的には、製品の同封説明書またはバイアルもしくは他の容器上の注意書きとして、そこに貼り付けられた使用説明書に従って使用される。多くの場合、凍結乾燥ワクチンは、使用前に無菌の蒸留水の添加によって再構成され、得られた溶液は、例えば、０．５ｍｌ／用量の量で皮下注射によって接種される。また、ワクチンは経口または鼻腔内に与えることができる。
【００２６】
異種ＤＮＡが組み込まれたヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡがＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする組換えデオキシリボ核酸。
【００２７】
一つの実施形態では、ＨＳＶ ＤＮＡはゲノムＤＮＡであり、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ゲノムＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて、ＨＳＶ ＤＮＡ内に組み込まれる。一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のゲノムＨＳＶ ＤＮＡ内に挿入される。一つの実施形態では、挿入された異種ＤＮＡは、ＩＣＰ０プロモータおよび３’ＵＴＲの制御下にある。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドは、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む異種ポリペプチドは、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスのタンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＨＳＶ ＤＮＡはＨＳＶゲノムである。
【００２８】
一つの実施形態では、組換えデオキシリボ核酸は、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡをさらに含む。一つの実施形態では、組換えデオキシリボ核酸は、各々異なる糖タンパク質をコードする最大８つの異種ＤＮＡをさらに含む。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む。
【００２９】
一つの実施形態では、組換えデオキシリボ核酸によってコードされるポリペプチドは、哺乳動物の前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）を分解しない。
【００３０】
一つの実施形態では、ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡは、組換えデオキシリボ核酸が適切な宿主細胞のゲノム内に組み込まれた場合、ポリペプチドを発現するように組み込まれる。一つの実施形態では、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＤＮＡの非必須遺伝子または領域内に挿入される。
【００３１】
ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む組換えヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であって、異種ＤＮＡが、（ａ）ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入され、（ｂ）組換えＨＳＶが導入される宿主細胞において発現される、組換えＨＳＶ。
【００３２】
一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ＨＳＶゲノムの一部に代えて、ＨＳＶゲノム内に組み込まれる。一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のＨＳＶゲノム内に挿入される。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドは、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドは、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスのタンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、組換えＨＳＶは、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡをさらに含み、ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入される。一つの実施形態における、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む。一つの実施形態では、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡは、ＨＳＶゲノムの非必須遺伝子または領域内に挿入される。一つの実施形態では、組換えＨＳＶゲノムによってコードされるポリペプチドはＰＭＬを分解しない。一つの実施形態では、組換えＨＳＶは、各々異なる水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質をコードする最大８つの異なる異種ＤＮＡを含む。一つの実施形態では、組換えウイルスは、当該技術分野において公知のそれらの方法によって弱毒化される。
【００３３】
（１）薬学的に許容される担体と、（２）（ａ）ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが組み込まれており、且つ（ｂ）各々が糖タンパク質をコードする１または複数個の異種ＤＮＡが組み込まれているヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムを含む組換えデオキシリボ核酸を含む組換えウイルスとを含むワクチン。
【００３４】
一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて、ＨＳＶゲノム内に組み込まれる。一つの実施形態では、異種ＤＮＡは、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のＨＳＶゲノム内に挿入される。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む異種ポリペプチドは、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む異種ポリペプチドは、ＥＨＶ、ＢＨＶ、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、糖タンパク質は、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む。一つの実施形態では、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡ、およびＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡは、各々、ＨＳＶゲノムの非必須遺伝子または領域内に挿入される。一つの実施形態では、組換えウイルスは、当該技術分野において公知のそれらの方法によって弱毒化される。
【００３５】
水痘帯状ヘルペスウイルス感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象において水痘帯状ヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発し、それにより対象の免疫化をもたらすのに有効な量の上記ワクチンを対象に投与することを含む方法。
【００３６】
ウイルスによる感染予防に有用な組成物を調製する方法であって、該組成物を調製するように、上記組換えウイルスの１つと生ワクチン安定化剤とを併せることを含む方法。
【００３７】
本明細書に記載されている方法の一つの実施形態では、対象は哺乳動物である。一つの実施形態では、対象はヒトである。該方法の一つの実施形態では、宿主細胞は哺乳類であるかまたは哺乳動物由来である。一つの実施形態では、宿主細胞はヒトから得られる。
【００３８】
本明細書に記載されている種々のエレメントの全ての組み合わせは、本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明は、続く実験の詳細を参照することによってより良く理解されるが、当業者は、詳述された具体的な実験が、以下に続く特許請求の範囲においてより十分に記載される本発明の単なる例示であることを容易に認めるだろう。
【００４０】
実験の詳細
以下に開示された研究は、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）におけるＨＳＶ ＩＣＰ０の対応するオルソログであるＯＲＦ６１がＰＭＬを分解することができず、したがって、宿主の先天性免疫を妨げないことを示す。本明細書では、組換えＨＳＶの構築が開示され、ここで、α遺伝子ＩＣＰ０のコード配列はＯＲＦ６１ｐをコードする配列で置換される。
【００４１】
結果Ｉ
核ドメイン１０（ＮＤ１０）は、ＰＭＬ核小体およびＰＭＬ発癌性ドメインとしも知られ、核において染色体間空間内に形成する細胞タンパク質の動的高分子包含物である（２，６５）。これらの小体の大きさおよび頻度は、それぞれ０．２〜１μｍおよび２〜３０／細胞の範囲であり、細胞種および細胞周期の段階に依存している（２，１７，６２）。これらの部位で蓄積される細胞タンパク質は、２つのグループに分けられる：常在コンポーネントであるタンパク質、例えば、ＰＭＬ（前骨髄球性白血病タンパク質）、Ｓｐ１００（１００ｋＤａの斑点（ｓｐｅｃｋｌｅｄ）タンパク質）、Ｄａｎｎ、ＳＵＭＯ−Ｉおよびブルーム症候群ヘリカーゼ、ならびに特定の条件下（例えば、ＤＮＡ修復機構）または過剰発現（例えば、ＢＲＣＡ１）下においてＮＤ１０とのみ結合するタンパク質（７０）。
【００４２】
ＤＮＡウイルスゲノムは、それらの複製周期の初期段階でＮＤ１０コンポーネントと結合する。新たに形成した転写物および複製部位は、通常、ＮＤ１０内に存在するタンパク質近傍に局在化する（６１）。ウイルス複製がＮＤ１０に影響を及ぼす最初の示唆は、ＰＭＬ染色が単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染後に消失したという実証であった（４６）。その後、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびパピローマウイルスの親ゲノムが、ＮＤ１０と結合することが示された（１０，１４，３２，３３，３５，４７）。
【００４３】
ＨＳＶとＮＤ１０のコンポーネントとの間のアンタゴニスト関係は、広範囲にわたって研究されている。ウイルスタンパク質であるＩＣＰ０の発現は、核構造の破壊に必要十分である（１８，４５，４６）。ＩＣＰ０は、見掛けの分子量が１１０ｋＤａである核リン酸タンパク質を含むＣ３ＨＣ４ ＲＩＮＧフィンガーであり（５６）、ウイルス遺伝子と細胞遺伝子の両方の乱交雑アクチベーター（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）として挙動する（１２，２３，５９）。ＩＣＰ０遺伝子を欠損するウイルス変異体は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）に対して増大した粒子比、実質的に低い収率、およびα遺伝子発現レベルの減少を有する（１３，６４）。また、ＩＣＰ０は、プロテアソーム分解のための宿主タンパク質のリスト増加を標的とするためのＥ３ユビキチンリガーゼとして機能し、ＮＤ１０小体のコンポーネント、例えば、ＰＭＬおよびＳｐ１００のＳＵＭＯ−Ｉ改変形態が含まれる（８，１５，１８，２６，４１，５３）。
【００４４】
ＩＣＰ０を発現しないＨＳＶ変異体は、ＮＤ１０コンポーネントを修飾および分解するそれらの能力を欠いている（４６）。ＰＭＬおよびＳｐ１００の枯渇は、ウイルス遺伝子発現を加速させ、ＨＳＶ ＩＣＰ０欠損ウイルスのプラーク形成効率を増加させるが、野生型ウイルスには影響を及ぼさなかった。これらのデータは、効率的なウイルス複製および増殖を確実にするＩＣＰ０ Ｅ３リガーゼ活性によって対抗される固有の抗ＨＳＶ防御機構のコンポーネントであることを示す（２１，２２）。
【００４５】
水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）は、アルファヘルペスウイルスとしてＨＳＶとともに分類される共通のヒト病原体である。ＶＺＶは、ＩＣＰ０と類似し、ウイルスプロモータを転写的に活性化し、ウイルスＤＮＡの感染性を高めるＩＣＰ０オルソログ（ＯＲＦ６１ｐ）（４９，５７）をコードする（４９，５０）。重要なことには、ＯＲＦ６１ｐは、ＩＣＰ０のトランス活性化、ならびにＮＤ１０の解離活性および分解活性に必須であるものに相同なＲＩＮＧフィンガードメインを含む。
【００４６】
ＨＳＶによるＩＣＰ０の発現は、ウイルス遺伝子発現およびタンパク質蓄積を刺激する宿主コシャペロンタンパク質であるＢＡＧ３の枯渇を克服するために必要とされることが従来示されている（３８）。ＯＲＦ６１ｐはＩＣＰ０と機能的に類似していると考えられるが（４９）、ＶＺＶはＢＡＧ３の枯渇によって影響を受け（３７）、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐが、別々に、ウイルス複製に異なる機能を付与するように発展してきたことを示唆する。
【００４７】
本報告は、ＯＲＦ６１ｐおよび他のＶＺＶをコードするタンパク質が、ＨＳＶ感染細胞におけるＩＣＰ０と同じように、ＮＤ１０コンポーネントを分解しないことを示す。また、ＶＺＶ感染中のＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの役割が研究され、本報告は、２つの関連したアルファヘルペスウイルス間の主な相違を強調する。
【００４８】
材料および方法：哺乳動物細胞。ヒト黒色腫（ＭｅＷｏ）、ｓｉＢＡＧ３（３７）、ｓｉＰＭＬ（３８）および２９３Ａ細胞は、従来報告（３７）されるように維持された。ｓｉＲＮＡ標的のＳｐ１００およびＤａｘｘ ｍＲＮＡを発現する安定な細胞株を生成するために、ＭｅＷｏ細胞はレトロウイルスで感染され、２００μｇ／ｍｌ、続く５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む増殖培地中で選択された。
【００４９】
ＤＮＡ形質転換。Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ［Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ］を用いて適切な細胞株にＤＮＡを形質転換した。
【００５０】
薬物処理。インターフェロンαをＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ［Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ］から購入した。
【００５１】
ウイルス。［ｉ］ＶＺＶ．Ｊｏｎｅｓ，野生型臨床単離物は、報告（２４）されるように増殖され、力価決定された。細胞不含ウイルスを報告（３６，５８）されるように調製した。［ｉｉ］レトロウイルス。プロウイルスベクターｐＣＫ−Ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｈｙｇｒｏ（３８）、ｐＣＫ−ｓｉＳｐ１００またはｐＣＫ−ｓｉＤａｘｘおよびｐｇａｇ−ｐｏｌｇｐｔ（４４）およびｐＨＣＭＶ−Ｇ（７５）を用いて２９３Ｔ細胞の一過性の同時形質転換によってレトロウイルスを構築した。
【００５２】
［ｉｉ］アデノウイルス。アデノウイルスであるＡｄｅｍｐｔｙ、ＡｄＩＣＰ０およびＡｄＯＲＦ６１は従来報告された（７４，７６）。
【００５３】
ウイルス増殖アッセイ。［ｉ］プラークアッセイ。ＭｅＷｏ、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００またはｓｉＤａｘｘ細胞を１０倍に連続希釈したウイルスストックを用いて感染させ、感染細胞を固定し、染色し、およびプラークをカウントした。［ｉｉ］増殖曲線。ＭｅＷｏ、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００またはｓｉＤａｘｘ細胞の感染後の細胞に結合したＶＺＶの力価は、未感染のＭｅＷｏ細胞で感染した細胞を混合し、固定および染色後に得られたプラークをカウントすることによって決定された。
【００５４】
プラスミド構築物。［ｉ］ｓｉＲＮＡプラスミド。従来報告されているｓｉＲＮＡオリゴ標的のＳｐ１００およびＤａｘｘ ｍＲＮＡ（２２，６８）は、ｐＣＫ−ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｈｙｇｒｏ（３８）にクローニングするために修飾された。ｐＣＫ−ｓｉＳｐ１００およびｐＣＫ−ｓｉＤａｘｘを生成するために、アニーリングされるオリゴ対のｓｉＳｐ１００ 上流：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＴＴＡ−３’およびｓｉＳｐ１００ 下流：５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＧ、またはｓｉＤａｘｘ 上流：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡ−３’ ｓｉＤａｘｘ 下流：５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＧ−３’は、ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ開裂させたｐＣＫ−ｓｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｈｙｇｒｏ（３８）に連結された。
【００５５】
全てのプライマーをＯｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ［Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ］から得て、全てのベクター挿入物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００５６】
抗体。ＯＲＦ２９ｐのアミノ酸［ａａ］１０８６〜１２０１、およびＯＲＦ６３ｐのａａ１〜２６５に対するウサギポリクローナル抗体は（４３）に記載されている。
【００５７】
ＩＣＰ０に対するポリクローナル抗体はすでに報告されている（４０）。モノクローナルＩＣＰ０およびＯＲＦ６２ｐ抗体は、Ｒｕｍｂａｕｇｈ−Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ］から購入した。ＯＲＦ６１ｐのアミノ酸１３６〜２４８を含むＧＳＴ融合タンパク質に対するポリクローナル抗体をウサギに発生させ、以前に報告（３７）されるように、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＰＭＬ、ＧＡＰＤＨおよびチューブリンに対するモノクローナル抗体、およびＤａｘｘに対するポリクローナル抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ］から得た。ＰＭＬおよびＳｐ１００に対するポリクローナル抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ［Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ］から購入した。ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２およびリン酸化ＳＴＡＴ１に対する抗体をＡｂｅａｍ［Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ］から得た。リン酸化ＳＴＡＴ２に対する抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【００５８】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８をコンジュゲートした抗体マウス抗体、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６をコンジュゲートしたウサギ抗体をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ［Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ］から得た。免疫ブロッティングのための西洋ワサビヤギペルオキシダーゼに結合された抗ウサギ抗体および抗マウス抗体をＫＰＬ［Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ］から得た。
【００５９】
間接免疫蛍光顕微鏡。従来報告（３７）されるように、カバーガラス上の細胞を固定し、抗体およびＨｏｅｃｈｓｔで染色した。全ての試料は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立顕微鏡［Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ］で視覚化し、Ｏｐｅｎｌａｂ ５ソフトウェア［Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ］を用いて、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ４７４２−８０−１２ＡＧデジタルＣＣＤカメラ［Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ−Ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ］を用いて撮像した。画像は、Ｏｐｅｎｌａｂ ５を用いてデコンヴォルブされ、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３［Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｘ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ］に集めた。
【００６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング。感染させたかまたは生化学的に形質転換された細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１．５×ＳＤＳ試料緩衝液［７５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ６．８，１５０ｍＭ ＤＴＴ，３％ＳＤＳ，０．１５％ブロモフェノールブルー，１５％グリセロール］中で溶解し、沸騰し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質分析を行った（３９）。ウェスタンブロッティング前に、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を移した。５％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中でメンブレンをブロッキング後、固定したタンパク質を１％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中の適切な抗体と反応させた。メンブレンをＰＢＳＴで３回、各々５分間洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された抗ウサギ抗体または抗マウス抗体とともにインキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで再び３回、各５分間、およびＰＢＳで２回洗浄した。ＬｕｍｉＧＬＯ基質［ＫＰＬ］の添加によって抗体を視覚化し、Ｘ線フィルムに暴露した。
【００６１】
ＳＴＡＴタンパク質に対する抗体を用いた場合、ブロッキングおよび抗体インキュベーションは、５０ｍＭ ＮａＦおよび１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4および３％ＢＳＡが補足されたＰＢＳＴ中で行われた。
【００６２】
配列アラインメント。ＯＲＦ６１ｐ（ＮＰ ０４０１８３．１）およびＩＣＰ０（ＮＰ ０４４６０１．１）のアミノ酸配列は、Ｇｏｎｎｅｔ Ｍａｔｒｉｘ、オープンギャップペナルティ１０．０、および拡張ギャップペナルティ０．１を用いたＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖｅｒ １０．０［ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ］により整列された。
【００６３】
ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとの間の配列類似性。従来の報告は、アルファヘルペスウイルスオルソログ、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐが、遺伝子発現のアクチベーター、およびウイルスＤＮＡ感染性のエンハンサーとして機能するそれらの能力を含む、いくつかの生物学的特徴を共有することを示唆した（４９，５０，５７）。しかしながら、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、ウイルス感染中、ＢＡＧ３の代わりにならなかったことも報告され、これらのタンパク質がそれらの自然な状況において同一の機能を果たさないことが示唆されている（３８）。ＩＣＰ０の多機能は、特定ドメインについてマッピングされている（１６）。これは、これらのタンパク質間のアミノ酸配列のアラインメントがそれらの相違に洞察を与えるという仮説へと導いた。ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベース（それぞれ受入番号ＮＰ ０４４６０１．１およびＮＰ ０４０１８３．１）から得られ、整列された（図１）。それらの核酸配列のいくつかの保存（９）にも関わらず、それらの間でアミノ酸配列の保存が全体で僅かしかないことが見出された（アミノ酸レベルで１０％類似性）。しかしながら、その両方は、それらのＮ末端近傍でＣ3ＨＣ4 ＲＩＮＧフィンガー［Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（９−３９）−Ｃ−Ｘ（１−３）−Ｈ−Ｘ（２−３）−Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ（４−４８）−Ｃ−Ｘ２−Ｃ］（３）を含む。これらの２つのタンパク質間の顕著な相違は、ＯＲＦ６１の配列において、ＩＣＰ０のＣ末端（青色で付される）がないことである。重要なことに、この領域は、ＩＣＰ０をＮＤ１０小体に標的化し、次いでそれらのコンポーネントを分解するために必要とされる（１６，１８，４５）。したがって、ＰＭＬおよびＳｐ１００の分解を媒介するＯＲＦ６１ｐの能力の調査を行った。
【００６４】
ＯＲＦ６１ｐは、効率的にＰＭＬおよびＳｐ１００を分解することができない。ＯＲＦ６１ｐおよびＩＣＰ０の２つのオルソログをコードするプラスミドで形質転換されたＭｅＷｏ細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００の局在化に対するＯＲＦ６１ｐおよびＩＣＰ０の効果は、免疫蛍光顕微鏡を用いてモニタリングされた。模擬処理された細胞では、ＰＭＬおよびＳｐ１００は、点状の核小体として出現した（図２Ａおよび２Ｄ）（２）。従来報告されるように、ＩＣＰ０の発現は、両方の細胞タンパク質の消失をもたらした（図２Ｂおよび２Ｅ）（４６）。しかしながら、ＯＲＦ６１ｐを発現する細胞は、異なる表現型を提示した。ＰＭＬ含有小体は、模擬処理された細胞と比較してより消失され、小さいが、タンパク質は、点状の細胞内構造の大部分においてなおも検出された（図２Ｃ）。ＯＲＦ６１ｐを発現する大部分の細胞から消失されたＳｐ１００核小体の染色として、ＯＲＦ６１ｐおよびＳｐ１００の効果はＩＣＰ０の効果とより類似しているようであった（図２Ｆ）。ＰＭＬおよびＳｐ１００量に対するウイルス産物の効果を直接アッセイするために、ＭｅＷｏ細胞は模擬処理されるか、またはヘルペスウイルスタンパク質なし（Ａｄｅｍｐｔｙ）、ＩＣＰ０（ＡｄＩＣＰ０）もしくはＯＲＦ６１ｐ（ＡｄＯＲＦ６１ｐ）のいずれかを発現する複製欠損アデノウイルスで感染され、ウイルスおよび細胞タンパク質レベルをウェスタンブロッティングによってモニタリングした（図３）。５の感染の多重度（ＭＯＩ）を用いて、全ての細胞が感染し、対象のタンパク質を発現したことを確認した。模擬感染細胞またはＡｄｅｍｐｔｙで感染された細胞では、異なる分子量の一連のバンドとしてＰＭＬが出現した。これらは、ＰＭＬの選択的スプライシングされ、翻訳後修飾形態を表した（５４）。Ｓｐ１００（Ｓｐ１００Ａ、Ｓｐ１００Ａ−ＳＵＭＯおよびＳｐ１００−ＨＭＧ）の３つの優勢型が従来報告（２７，６６）されるように検出された。ＩＣＰ０発現は、多様なＰＭＬアイソフォームの完全な消失とＳｐ１００のより遅い移動種とをもたらした（図３）（８）。対照的に、ＯＲＦ６１ｐの発現は、このアッセイによって検出されたＰＭＬの存在量および種に影響を及ぼさなかった。ＯＲＦ６１ｐは、Ｓｐ１００レベルを一貫して減少させたが、ＩＣＰ０ほど効率的ではなかった（図３）。並行して感染させた免疫蛍光分析によって、全ての細胞は感染され、ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐを発現したことが確認された（データ示さず）。Ａｄｅｍｐｔｙで感染された細胞のＰＭＬは、恐らくはアデノウイルスＥ４ ＯＲＦ３の発現に応答して、延長されたトラックとして再構成された（６）。ＡｄＩＣＰ０によるＩＣＰ０の発現はＰＭＬの消失をもたらし、一方、ＡｄＯＲＦ６１ｐ感染された細胞におけるＰＭＬ染色はＡｄｅｍｐｔｙ試料と同じであった（データ示さず）。この観察は、ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとをさらに区別する。
【００６５】
まとめると、免疫蛍光データおよびウェスタンブロッティング分析は、ＯＲＦ６１ｐがＮＤ１０小体の全体性および染色パターンを変更するが、その発現はＰＭＬの消失に至らなかった。しかしながら、ＯＲＦ６１ｐ発現はＳｐ１００レベルに影響を及ぼさない。
【００６６】
ＯＲＦ６１ｐのＮＤ１０への標的はＰＭＬ分解を引き起こさない。上述した通り、ＩＣＰ０のＣ末端は、ＮＤ１０への標的およびＰＭＬの効率的分解に必要とされ（１６，１８，４５）、ＯＲＦ６１ｐは存在しない（図１）。β−ガラクトシダーゼのこのドメインの追加は、ＰＭＬによるその部分的な同時局在化を引き起こした（１８）。ＰＭＬレベルの減少に対するＯＲＦ６１ｐの不具合が、このドメインの欠損に起因して、ＮＤ１０を標的化できないという結果であるかどうかを試験するために、ＩＣＰ０のＣ末端の１８８個のアミノ酸を用いてＯＲＦ６１ｐの翻訳融合を作製した（図４Ａ）。得られたタンパク質は、ＰＭＬ標的化および分解に必要とされるＩＣＰ０の全ての領域（相同ＲＩＮＧフィンガーおよびＣ末端標的領域）（１６）を含んでいるべきであった。
【００６７】
ＭｅＷＯ細胞は、模擬処理されるかまたはＩＣＰ０、ＯＲＦ６１ｐもしくはその融合タンパク質を発現する構築物で形質転換された。細胞溶解物のウェスタンブロッティングにより、全てのタンパク質産物は類似したレベルで蓄積され、ＩＣＰ０のＣ末端領域の追加はＯＲＦ６１ｐ安定性を変更しないことが示された（図４Ｂ）。次に、これらのタンパク質の局在化および量をモニタリングした。上記した通り、ＩＣＰ０発現は、ＰＭＬ染色の消失をもたらし、一方、ＯＲＦ６１ｐの発現は、その細胞内染色パターンにほんの僅かな変化をもたらした（図２Ｂおよび２Ｃ）。融合タンパク質は、ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐとは異なる細胞内局在化パターンを有した。大部分の細胞（約８０〜９０％）では、融合タンパク質は主に細胞質にあった（図４Ｄ）。このドメインに対するβ−ガラクトシダーゼ融合を用いて観察されるもの（１８）と類似して、細胞質ＰＭＬを含有する小体の部分集団は融合タンパク質と共局在化した。タンパク質が核にある集団の１０〜２０％では、クロマチンは辺縁性となり、融合タンパク質が残りの核空間を満たした（図４Ｅ）。しかしながら、両方のケースでは、ＰＭＬ分布が変更されたが、なおも検出された。このようにして、ＰＭＬの細胞内レベルを低下させるＯＲＦ６１ｐの不成功はタンパク質の固有の性質であり、ＯＲＦ６１ｐがＮＤ１０標的ドメインを欠損するために生じない。
【００６８】
ＶＺＶ感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００の分布および存在量。ＯＲＦ６１ｐ単独では、効率的にＰＭＬおよびＳｐ１００を分解しない（図２および３）。他のＶＺＶタンパク質が感染中のこれらのタンパク質の分布に影響を及ぼすかどうかという問いに答えるために、ＭｅＷｏ細胞をＨＳＶまたは細胞不含ＶＺＶで感染させ、ウイルスタンパク質および細胞タンパク質の細胞内分布を免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした。従来報告されるように、ＨＳＶで感染された細胞では、ＰＭＬおよびＳｐ１００の染色は消失した（図５Ａおよび６Ａ）。最初の分析中、ＯＲＦ６１ｐの染色は、ウイルス感染された細胞のマーカーであった。ＯＲＦ６１ｐを発現する細胞では、ＰＭＬ含有小体は、未感染細胞と比較すると、大きさが小さく、明るさが少ないようであった。しかしながら、ＨＳＶで感染された細胞の場合とは異なり、ＰＭＬは、ＶＺＶ感染細胞においてなおも検出された（図５Ｂ）。それにも関わらず、ＶＺＶをコードしたタンパク質の発現動力学は十分に理解されず、ＯＲＦ６１ｐ後に発現した他のタンパク質が感染中にＰＭＬの消失に寄与するという可能性があったため、ＯＲＦ６２ｐを感染細胞の代替マーカーとして使用した。このタンパク質は、初期には感染細胞の核に局在化する；しかしながら、その後リン酸化され、感染の後期に細胞質に移行する（１１）。したがって、その細胞内局在化パターンは、感染細胞のマーカーとして、およびウイルス複製サイクルの段階の指標として有用である。ＯＲＦ６２ｐが核にある細胞では、ＰＭＬおよびＳｐ１００は球形構造として現れ、未感染細胞に見られるものと非常に類似していた（図５Ｃおよび６Ｂ）。感染後の後期時間点での感染細胞は、糖タンパク質ｇＥの染色を用いてモニタリングされた。ＶＺＶ感染の後期では、ＮＤ１０コンポーネントの局在化は、形質転換細胞において観察されるものと類似していた（図２）。具体的には、ＰＭＬ小体は、それらの存在量は減少するように見えるが、依然として存在し、それらの染色強度は、未感染細胞において見られるものよりも少なかった（図５Ｄ）。対照的に、Ｓｐ１００の特徴的な点状染色は観察されなかった（図６Ｃ）。
【００６９】
ＶＺＶ感染中のＮＤ１０コンポーネントの運命をさらに調査し、それらの存在量を定量的に測定するために、ＭｅＷｏ細胞をＨＳＶまたは細胞不含ＶＺＶのいずれかで感染させ、細胞タンパク質レベルをウェスタンブロッティングによってモニタリングした。従来報告されるように、ＨＳＶ感染は、ＰＭＬおよびＳｐ１００の多数のアイソフォームの急速な分解をもたらした（図７Ａ）（８）。ＶＺＶ細胞不含の力価は低く、ウイルス複製の動力学はＨＳＶと比較して非常に遅い。したがって、これらのタンパク質に対するウイルス感染の効果を評価するために、それらのレベルは感染後の数日間追跡した。ＨＳＶ感染中に生じたものと比較して、ＰＭＬとＳｐ１００との両方のレベルは、感染のこの期間中に増加した（図７Ａ）。ＰＭＬおよびＳｐ１００の増加速度は、チューブリンの増加速度よりも有意に高く、これは、これらのタンパク質の量の増加が細胞増殖および複製の結果ではないことを示した。これを確認するために、ＮＤ１０の別の構成コンポーネントをモニタリングした。ＰＭＬおよびＳｐ１００とは異なり、Ｄａｘｘ細胞レベルは、観察の経過中にほぼ一定のままであった（図７Ａ）。
【００７０】
ＰＭＬおよびＳｐ１００はインターフェロンによって誘導されるため（２５，６０）、この実験は、これらのタンパク質の発現がＭｅＷｏ細胞においてインターフェロンに感受性であるかどうか、およびインターフェロンがＤａｘｘに影響があるかどうかという問いに答えるために試みられた。ＭｅＷｏ細胞は、２つの異なる濃度のインターフェロンαで処理された。インターフェロン経路がＭｅＷｏ細胞において刺激されたことを確認するため、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２レベルおよびそれらの活性化されたリン酸化形態をウェスタンブロッティングによってモニタリングした（図７Ｂ）。これらのシグナル伝達分子の増加量およびリン酸化によって明らかにされるように、インターフェロン反応はＭｅＷｏ細胞において活性であった。３つのＤＮ１０コンポーネントの存在量を測定した。ＰＭＬおよびＳｐ１００発現が誘導されたが、Ｄａｘｘレベルは、インターフェロン処理によって不変のままであった（図７Ｂ）。
【００７１】
これらの実験は、ＶＺＶ感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００の増加レベルが、感染細胞によって分泌されたインターフェロンに応答して誘導すること、およびＶＺＶが分解のためにこれらのタンパク質を標的とできないことに起因する。
【００７２】
ＶＺＶ感染中のＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘの機能。ＰＭＬおよびＳｐ１００のＩＣＰ０指向された分解はＨＳＶ複製に有益である（２１，２２）。ＤａｘｘはＨＣＭＶおよびアデノウイルスによる感染を制限する（３４，６８，７２）。ＶＺＶはＮＤ１０コンポーネントのレベルを効率的に減少しないため、この実験は、これらのタンパク質の下方制御がＶＺＶ複製動力学および収量を変更したかどうかという問いに答えることを試みた。
【００７３】
無し、ＰＭＬ、Ｓｐ１００またはＤａｘｘ ｍＲＮＡのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡを発現する組換えレトロウイルスを用いて、ＭｅＷｏ細胞を形質導入し、安定な細胞株（それぞれｓｉ対照、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００およびｓｉＤａｘｘ）を生じさせた。標的とれたタンパク質の存在量および局在化は、これらの細胞株においてウェスタンブロッティング（図８Ａ）および免疫蛍光顕微鏡（データ示さず）によってモニタリングされた。従来報告（２１，２２）されるように、ＰＭＬの枯渇は、ＮＤ１０小体の完全性の消失、Ｓｐ１００の発現パターンの変化をもたらしたが、Ｄａｘｘレベルでは有意な差がなかった。対照的に、Ｓｐ１００またはＤａｘｘの下方制御は、他のＮＤ１０コンポーネントのレベルおよび分布を変更しなかった。
【００７４】
次に、これらの細胞株を用いてＶＺＶプラーク形成効率を測定した。コンフルエントな単層を細胞不含ウイルスストックのいくつかの希釈を用いて感染させた。感染の数日後、単層を固定し、染色し、およびプラークをカウントした。各細胞株上で形成されたプラーク数を対照細胞上に形成された数に標準化した。結果は、ＰＭＬレベルが減少した場合、プラークの数が約２．５倍（ｔ(val)＝０．００１７）に増加したことを示した（図８Ｂ）。この結果は、ＨＳＶのＩＣＰ０-変位体を用いて観察されたものを模倣していた（２２）。対照的に、Ｓｐ１００の下方制御は小さい（１．２倍）が、ＶＡＶ力価の一定の増加をもたらした（ｔ(val)＝０．０３１）。Ｄａｘｘの枯渇は影響を及ぼさなかった（図８Ｂ）。
【００７５】
ＶＺＶ増殖に対するＮＤ１０コンポーネントの役割をさらに調査するために、ｓｉＲＮＡ細胞株を細胞不含ウイルスで感染させ、ウイルスタンパク質の蓄積を経時的にモニタリングした（図８Ｃ）。各枯渇した細胞株におけるウイルスタンパク質に対応するバンド強度は、同じ時間点での対照細胞において存在していたものに標準化された。ＯＲＦ６３ｐの細胞内レベル、前初期タンパク質、およびＯＲＦ２９ｐ、初期タンパク質は、ｓｉＰＭＬおよびｓｉＤａｘｘ細胞の感染後の初期時間点で増加した。しかしながら、後期時間では、そのレベルは対照細胞において観察されたものと類似していた。プラーク形成効率の結果と同様に、Ｓｐ１００の枯渇は、ウイルスタンパク質レベルにほんの小さな影響を有した。
【００７６】
感染中心の形成を研究するため、ｓｉＲＮＡ細胞株を細胞不含ＶＺＶで感染させ、感染後の種々の時間で、細胞に結合したウイルスの力価を測定した。ウェスタン解析（図８Ｃ）と一致して、ｓｉＰＭＬおよびｓｉＤａｘｘ細胞において形成された感染中心の数は、ｓｉ対照細胞において生じたものと類似したプラークに到達する前に感染初期で増加した。Ｓｐ１００の枯渇は、感染中心の収量にほとんど影響がなかった（図８Ｄおよび８Ｅ）。細胞変性効果（ＣＰＥ）はｓｉＰＭＬ細胞の感染中により顕著であり、プラークは他の細胞株よりも約２４時間早く視認された。対照的に、ｓｉＤａｘｘ単層におけるプラークサイズは、全ての他の細胞株と比較して顕著に小さく、ウイルス誘導ＣＰＥは感染の後期時間でさえ最小であった。さらに、タンパク質蓄積および感染中心アッセイはｓｉＰＭＬ細胞において生じたものと類似した、加速されたウイルス複製を示したが（図８Ｃ−Ｅ）、驚くべきことに、ｓｉＤａｘｘにおけるプラーク形成効率は対照細胞と同じであった（図８Ｂ）。これらの相違の理由を調べるために、カバーガラス上で増殖させたｓｉＲＮＡ細胞を感染させ、感染の２および３日後、細胞を固定し、前初期タンパク質（ＯＲＦ６３ｐ）および後期糖タンパク質（ｇＥ）の発現を免疫蛍光顕微鏡によってモニタリングした（図９）。感染２日後の対照細胞の核は、細胞融合および有効なウイルス伝播の指標となる特徴的な環形状構造を形成した（３７，７１）。Ｓｐ１００枯渇細胞における感染巣は、ｓｉ対照細胞において形成されたものと類似した大きさであった。対照的に、ＶＺＶは、感染２日後により大きな病巣の形成によって明らかなように、ＰＭＬとＤａｘｘとを欠損している細胞において非常に速く伝播した。しかしながら、広範な誘導を生じたｓｉＰＭＬ細胞とは異なり、ｓｉＤａｘｘ細胞の感染は見掛けのＣＰＥがない状態で伝播した。さらに、感染２日後に、細胞は、ｓｉＰＭＬ単層から脱着しただけであり、これはプラークとして記録されるホールをもたらした。
【００７７】
感染３日後（図９）、ＣＰＥは、ｓｉＤａｘｘを除く全ての細胞株の単層において明らかであった。広範囲な細胞融合は、融合細胞形成、およびウイルスタンパク質の均一な染色パターンによって明らかにされるように検出された。他の細胞株とは対照的に、ｓｉＤａｘｘ細胞における感染の伝播は異なっていた。ＶＺＶは伝播し、隣接する細胞に影響を及ぼしたが、個々の無傷な感染細胞が検出され、細胞融合のいずれの証拠もなかった。この形態は、ｓｉ対照細胞とは顕著に異なっていた。重要なことに、細胞は、ウイルス感染におけるこの後期段階でさえ検出されず、これは、顕著に小さなプラークサイズについて説明する。重要なことに、感染した細胞は単層状態のままであり、丸くはならないため、それらは、多くの場合、ｓｉＤａｘｘ数においてプラークとして記録されず、これは、外見上、より低いプラーク形成効率をもたらした（図８Ｂ）。
【００７８】
ＮＤ１０小体の主要なコンポーネントを欠損している細胞におけるウイルス複製のこの分析により、ＰＭＬは野生型ＶＺＶ増殖のリプレッサーであり、一方、Ｓｐ１００はこのプロセスにおいてほとんど役割をもたないことが示された。Ｄａｘｘは異なる機能を有するようであり、これは、このタンパク質のサイレンシングが、初期には、加速された複製とタンパク質複製とをもたらしたが、ウイルス指向の融合細胞形成を欠いていたためであった。
【００７９】
検討
ＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘを含むＮＤ１０小体のコンポーネントは、ＤＮＡウイルスゲノムと結合し、これらのゲノムの発現を抑制するように作用する固有の抗ウイルス機構に貢献する（１０、２１、２２、３２、３５、４７、６７−６９）。ヘルペスウイルスは、それらの効率的な複製と伝播とを確実にするこの細胞抑制機構をバイパスする対向手段を進化させた。ＨＳＶは、プロテアソーム分解についてＮＤ１０結合タンパク質を標的とする、強力な転写アクチベーターであるＩＣＰ０をコードし、これは前初期ウイルス遺伝子の発現増加をもたらした（２１，２２）。
【００８０】
ＶＺＶは、密接に関連したアルファヘルペスウイルスであり、ＩＣＰ０オルソログであるＯＲＦ６１ｐをコードする。従来の研究は、これらのタンパク質間の生物学的活性の保存を強調し、これらの両者が遺伝子発現のアクチベーターであることを示した（４９，５０）。しかしながら、従来、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、ウイルス複製中にコシャペロンタンパク質ＢＡＧ３についての要求条件を克服しないことも示され、オルソログが多機能を有することを示唆した（３８）。
【００８１】
これらのタンパク質のアミノ酸配列アラインメントは、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０の保存されたＲＩＮＧフィンガー残基を保持する一方で、そのＨＳＶオルソログのＣ末端を欠如していることを示した（図１）。これらの領域の両方は、ＮＤ１０小体へのＩＣＰ０の効率的な標的、およびそれらのコンポーネントの分解に必要である（１６）。ＩＣＰ０のＣ末端およびその結合したＮＤ１０標的ドメインのＯＲＦ６１ｐ欠損は、ＯＲＦ６１ｐがＰＭＬ小体のコンポーネントを分解することができないという可能性を生じさせた。ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１ｐを一過性に発現する細胞の免疫蛍光分析、およびヘルペスウイルスタンパク質を発現する組換えアデノウイルスを用いて感染させた細胞由来のタンパク質のウェスタンブロット解析により、ＯＲＦ６１ｐがＰＭＬを枯渇せず、Ｓｐ１００レベルがＩＣＰ０を発現する細胞よりも、非常に低い効率で減少したことを示した（図３）。さらに、ＩＣＰ０標的ドメインの追加によるＮＤ１０にＯＲＦ６１ｐを標的化する試みは、この表現型を変化させなかった（図４）。
【００８２】
ＩＣＰ０は２つの別々のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を含むため、２つのユビキチンリガーゼとして報告された（（３０）に概説される）（図１）。単純ヘルペスウイルスユビキチンリガーゼ（ＨＵＬ）−１は、ＩＣＰ０のエクソン３によってコードされ、ｃｄｃ３４の分解に関与する（２８，２９，３１）。しかしながら、ＰＭＬおよびＳｐ１００の分解を促進するＨＵＬ−２活性は、ＩＣＰ０のＲＩＮＧフィンガードメインについてマッピングする（４，３１）。適切な分子環境におけるＲＩＮＧドメインは、プロテアソーム分解に関わっている（４２）。重要なことに、ＩＣＰ０のＣ末端へのユビキチンプロテアーゼ（ＨＡＵＳＰ−ＵＳＰ７）の結合は、ＲＩＮＧフィンガー基質の分解を促進することが示唆された（３０）。この結合は、新たにユビキチン化されたＨＵＬ−２基質由来のＵＳＰ７の遊離をもたらし、プロテアソーム分解にそれらの効果的な標的を確認することができた（５，２０，３０）。
【００８３】
これらの観察に基づけば、ＯＲＦ６１ｐがＰＭＬおよびＳｐ１００の消失を生じさせない理由を説明する２つのシナリオが描かれる。ＲＩＮＧフィンガードメインはその転写活性化活性に必要とされるが（４８）、ＯＲＦ６１ｐの残りの分子環境は、それがＥ３ユビキチンリガーゼとして作用するには不適切である可能性がある。あるいは、ＯＲＦ６１ｐ内のユビキチン特異的プロテアーゼ結合部位の欠損は、ＵＳＰ７の利用可能性、その標的の迅速な脱ユビキチン化、したがって、プロテアソーム分解からの保護をもたらす可能性がある。後者の仮説が好ましいとされ、それは、蓄積されている証拠が、ＵＳＰ７の結合に依存する（５）ＩＣＰ０の自己保存特性とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、機能的ＲＩＮＧフィンガードメインを必要とするプロテアソーム分解的に急速に分解されるためである（Ｋｙｒａｔｓｏｕｓ、ＤｅＬｏｎｇ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、未刊行）。この観察は、ＯＲＦ６１ｐのＲＩＮＧフィンガーがＥ３リガーゼ活性を有し、自己ユビキチン化を駆動することができるが、しかし、プロテアーゼ結合部位の欠損がその枯渇をもたらすことを意味する。これを支持して、ＵＳＰ７の結合に必要とされるＩＣＰ０の配列内のアミノ酸はＯＲＦ６１ｐに見出されない（図１）。ＶＺＶタンパク質とＮＤ１０のコンポーネントとの関係のさらなる分析により、ＨＳＶ感染中に生じるものとは異なり、ＰＭＬおよびＳｐ１００の存在量はＶＺＶ感染中に増加することが観察された（図７Ａ）。この増加は、インターフェロン刺激されたＮＤ１０のコンポーネントに特異的であり（図７Ｂ）、それは、Ｄａｘｘレベルが感染の経過を通じて変化しないためである（図７Ａ）。ＶＺＶはインターフェロンを誘導するため、ウイルスタンパク質はＮＤ１０の合成を直接誘導せず、したがって、ＰＭＬおよびＳｐ１００の量の増加はインターフェロン刺激の間接的な効果であると考えられる。インターフェロンに関係しない他の経路は、感染細胞におけるＰＭＬおよびＳｐ１００レベルの増加に寄与する可能性を排除することができない。
【００８４】
驚くべきことに、ＯＲＦ６１ｐの自主発現はＳｐ１００レベルの減少をもたらすが（図３）、ＶＺＶ感染は増加に至らない（図７）。感染中のインターフェロンによる誘導は、ＯＲＦ６１ｐによるＳｐ１００の分解を隠すことが推測される。これは、ＨＳＶ感染中に観察されるものと対照をなすが、ＩＣＰ０は、ＯＲＦ６１ｐと比較した場合、Ｓｐ１００のより効果的な減少を引き起こすという本発明者らの観察と一致していた（図３）。
【００８５】
ＩＣＰ０を欠損しているＨＳＶ変異体はインターフェロンに過敏であり（５１）、この効果はＰＭＬによって媒介される（７）。対照的に、ＶＺＶはインターフェロンに感受性であるが、ＯＲＦ６１変異体は、ＩＣＰ０変異体とは異なり、インターフェロンに過敏ではない（１）。これらのデータは、ＰＭＬがＶＺＶ感染中に分解しないという観察とともに、インターフェロンが、異なる機構によってこれらの２つのヒトアルファヘルペスウイルスの複製を阻害し、これらのウイルスが異なる特異的な対抗手段を発展させていることを示唆する。結果として、ＨＳＶと対照的に、ＶＺＶは、インターフェロンによる阻害を克服するためにＰＭＬの分解を必要としない可能性がある。ＰＭＬ、Ｓｐ１００およびＤａｘｘは、ヘルペスウイルス複製の初期段階を抑制することが報告された（２１，２２，６−６９）。これらのタンパク質の各々を枯渇した安定な細胞株を用いて、これらのタンパク質が、ＶＺＶの複製動力学および収量にも影響を及ぼすかどうかを分析した（図８Ａ）。ＨＳＶ感染におけるその役割とは異なり、Ｓｐ１００は、ＶＺＶを用いて感染させた細胞において、プラーク形成効率、遺伝子発現、および感染中心力価にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、ｓｉＰＭＬとｓｉＤａｘｘとの両方の細胞株への感染は、初期時間での力価およびウイルスタンパク質の蓄積の増加をもたらした。したがって、これらのタンパク質は、ウイルス複製の初期段階を特異的に阻害する。これらの相違にも関わらず、ＶＺＶの細胞結合力価は、全ての細胞株において感染の後期時間で同じピーク力価に達した。ＶＺＶ複製は、２つの独立した宿主媒介段階：ＰＭＬ、Ｄａｘｘおよび可能な他の宿主タンパク質によって媒介される初期ブロック、およびウイルス収量を決定する後期ブロック、によって制御されることが推測される。ウイルスのライフサイクルの初期段階を阻害するように初期に機能するタンパク質の枯渇が加速された複製動力学をもたらすが、感染中止の伝播および発生を増加するのに十分ではない。
【００８６】
野生型ＨＳＶ感染中のＮＤ１０コンポーネントの機能は研究するには困難であり、それは、これらのタンパク質がＩＣＰ０発現後に急速に分解し、感染細胞に存在しないためである。したがって、これらの宿主産物の枯渇は、野生型ウイルス複製動力学および収量に対する影響がないが、分解を指向しないＩＣＰ０-ウイルスの複製を増大させる（２１，２２）。この研究の結果は、野生型ＶＺＶがＰＭＬ枯渇細胞においてＩＣＰ０-ウイルス複製を模倣し（図８）、ＮＤ１０小体の主要なコンポーネントの分解を指向しない（図４）ことを示す。ＰＭＬとは対照的に、Ｓｐ１００量は、ＯＲＦ６１ｐが発現する場合に特に減少し（図３）、タンパク質の枯渇はウイルス複製のほんの僅かな効果を有する（図８）。このようにして、ＶＺＶは、効率的な複製に必要とされる程度までＳｐ１００レベルを力価決定するように進展されたといっても差し支えない。あるいは、ｓｉＲＮＡ複製後の細胞内に残る少量のＳｐ１００は、それがＶＺＶをサイレンスにするのに十分であったといっても差し支えない。
【００８７】
結論として、この研究は、細胞培養において増殖されたＶＺＶが、アルファヘルペスウイルスファミリーの固有のメンバーとして振る舞うことを示す。他のＩＣＰ０オルソログ（５５）とは異なり、ＯＲＦ６１ｐはＮＤ１０コンポーネントの分解を指向しない。この固有の防御機構とのＶＡＶ相互作用は、アデノウイルスが宿主媒介性サイレンシングをどのように処理するかに最も類似している（７２，７３）。いずれのウイルスもＮＤ１０タンパク質を分解することができないが、両方ともインターフェロンによる制限を克服することができる。さらに、アデノウイルスと同種であるが、ＨＳＶと比較して、ＶＺＶ複製は、Ｓｐ１００の枯渇によって影響を受けないが、しかし、その複製はＰＭＬおよびＤａｘｘがサイレンスでる場合に加速される。ＨＳＶおよびＶＺＶは非常に類似していると考えられるが、この研究は、それらが、それらの増殖および伝播を確認するために、宿主細胞抑制を妨げる、固有であり、特有の方法を進展させてきたことを示す。
【００８８】
結果ＩＩ
アルファヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）α遺伝子産物であるＩＣＰ０のオルソログをコードする。ＩＣＰ０は、ウイルス遺伝子と細胞遺伝子との乱交雑アクチベーターとして振る舞う核リンタンパク質である（８３，８７，１０４，１０５）。また、ＩＣＰ０は、プロテアソーム分解のためのいくつかの宿主タンパク質を標的とするＥ３ユビキチンリガーゼとして機能する（８０，８６，８７，１０４，１０５）。この活性を通じて、ＩＣＰ０は、前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）タンパク質およびＳｐ１００を含む、核ドメイン１０のコンポーネントの分解を促進する。これらのタンパク質は、ヘルペスウイルスゲノムのサイレンシングに関与する（８６，８７，９８，１１０）。したがって、ＩＣＰ０を媒介したＮＤ１０コンポーネントの分解は、効率的な遺伝子発現を可能にするために、ＨＳＶ遺伝子のサイレンシングを崩壊し得る。この仮説は、どのようにしてＩＣＰ０が遺伝子活性化を誘導するかについての説得力のある機構説明を与える。
【００８９】
また、ＨＳＶ、ウシヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルスおよび水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）由来のＩＣＰ０オルソログをコードするＤＮＡの導入は、核構造およびタンパク質に影響を与えることができる（１０３）。本報告に加えて、さらに具体的には、ＶＡＶオルソログであるＯＲＦ６１ｐは、この遺伝子ファミリーの原型であるＩＣＰ０と同様に、ウイルスプロモータを活性化し、ウイルスＤＮＡの感染性を高める（１００，１０１）。しかしながら、ＨＳＶとＶＺＶオルソログとの間の２つ主な生物学的相違は、従来示されている。ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、宿主コシャペロンタンパク質であるＢＡＧ３の枯渇を補完することができない。結果として、ＶＺＶは、ＢＡＧ３のサイレンシングによって影響を受ける（９１）一方で、ＨＳＶの増殖は、ＩＣＰ０が発現しない場合にも単に変更される（９３）。さらに、両方のタンパク質はＮＤ１０のコンポーネントを標的とするが、ＩＣＰ０の発現はＰＭＬとＳｐ１００の両方の分解をもたらす一方で、ＯＲＦ６１ｐはＳｐ１００レベルを特異的に減少させる（９２）。これらの所見は、これらのタンパク質がウイルス複製について、別々に異なる機能を与えるように進化してきたことを示唆する。
【００９０】
ＩＣＰ０を欠損しているウイルス変異体は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）に対して増大した粒子比、実質的に低い収率、感染多重度（ｍｏｉ）および細胞型に依存したα遺伝子発現のレベルの減少を有する（７８，８０，８４，１０９）。また、これらの変異体はＮＤ１０コンポーネントの分解を欠いている（９９）。ＰＭＬおよびＳｐ１００の枯渇は、ウイルス遺伝子発現を加速し、ＨＳＶ ＩＣＰ０欠損ウイルスのプラーク形成効率を増加させるが、野生型に対しては影響がなく、これは、ＰＭＬおよびＳｐ１００がＩＣＰ０のＥ３リガーゼ活性によって対抗される固有の抗ＨＳＶ防御機構のコンポーネントであることを示唆する（８６，８７）。興味深いことに、ＩＣＰ０ヌルウイルスはまた、インターフェロン（ＩＦＭ）に過敏であり（１０２）、これはＰＭＬを介していることを示唆する特性である（７９）。
【００９１】
ＩＣＰ０に代えてＯＲＦ６１ｐを発現するＨＳＶ変異体ウイルスは、２つのオルソログの活性を直接比較するために構築された。得られたキメラウイルスは、ＩＣＰ０ヌル表現型を部分的にのみ救済する。このような研究は、ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとの間の生物学的相違を強調し、感染中のＰＭＬおよびＳｐ１００に対する要求条件を明らかにする。
【００９２】
材料および方法：哺乳動物細胞。ヒト黒色腫（ＭｅＷＯ）、ｓｉＰＭＬ（９３）、ｓｉＳｐ１００（９２）、Ｌ７（１０６）およびＵＳ０Ｓ細胞は、従来報告（９１，１１１）されるように維持された。
【００９３】
ＤＮＡ形質転換。Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ［Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ］を用いて、適切な細胞株にＤＮＡを形質転換した。
【００９４】
薬物処理。インターフェロンαをＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ［Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ］から購入した。
【００９５】
ウイルス。［ｉ］ＨＳＶ。使用される菌株は野生型ＨＳＶ−１（グラスゴー菌株１７）および菌株１７のＩＣＰ０ヌルウイルス誘導体（ｄｌ１４０３）であった（１０９）。［ｉｉ］ＨＳＶを発現するＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐ（ＨＳＶ−ＯＲＦ６１）。ｄｌ１４０３ヌクレオカプシドは、線状化ｐＣＰＣ−０６１を用いてＭｅＷＯ細胞内にコトランスフェクトされた。巨大プラークを拾い上げ、ＰＣＲによって組換えウイルスについてスクリーニングした。ＯＲＦ６１ｐについては陽性であるが、ＩＣＰ０をコードする配列については陽性ではないプラークは、５回精製したプラークであった。
【００９６】
ウイルス増殖アッセイ。［ｉ］プラークアッセイ。ＭｅＷｏ、ｓｉＰＭＬ、ｓｉＳｐ１００、Ｌ７またはＵ２ＯＳ細胞のコンフルエントな単層は、１０倍に連続希釈したウイルスストックで感染され、単層を固定し、染色し、プラークをカウントした。［ｉｉ］増殖曲線。全てのＨＳＶストックの力価は、ＩＣＰ０を補完する細胞株Ｌ７に対する滴定による分析前に決定された。ウイルス収量は従来報告（９３）されるように決定された。
【００９７】
Ｈｉｒｔ ＤＮＡ抽出。Ｈｉｒｔ ＤＮＡを報告（９０）されるように調製した。
【００９８】
プラスミド構築。ＶＺＶ ＯＲＦ６１は、ＲＶ６１（５’ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴ−３’）（配列番号：７）と３’Ｓａｌ６１（５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＧＡＣＴＴＣＴ−３’）（配列番号：８）とを用いてＶＺＶゲノムＤＮＡ（Ｊｏｎｅｓ菌株）からＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＰＣ−Ｔ６１ｃＪを生じさせた。ＯＲＦ６１コード配列は、ｐＣＰＣ−０６１を得るために、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化されたｐＤＳ１７（１１３）においてＩＣＰ０をコードする配列を置換するために使用されるＮｃｏＩ／ＳａｌＩ断片として抽出された。
【００９９】
全てのプライマーをＯｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ［Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ］から得て、全てのベクター挿入物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１００】
組換えウイルスゲノムの分析。Ｈｉｒｔ ＤＮＡは、プライマー：０ｆｏｒ：５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＧＴＴ−３’、０ｒｅｖ：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣ−３’、６１ｆｏｒ：５’ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＣＧＴＣＧＧＣＴＡＧ−３’、６１ｒｅｖ：５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＣＴＣＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣ−３’（それぞれ配列番号３−６）を用いてＰＣＲを行うことによって、ＯＲＦ６１配列の存在およびＩＥ−０コード配列の不存在について調べた。
【０１０１】
抗体。ＩＣＰ０に対するポリクローナル抗体は報告された（２０）。ＩＣＰ０およびＩＣＰ４に対するモノクローナル抗体は、Ｒｕｍｂａｕｇｈ−Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ］から購入された。ＯＲＦ６１ｐに対するポリクローナル抗体は（９２）に報告された。チューブリンに対するモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ］から得られた。ＰＭＬおよびＳｐ１００に対するポリクローナル抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ［Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ］から購入された。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギ抗体および抗マウス抗体をＫＰＬ［Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ］から得た。
【０１０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング。感染させたかまたは生化学的に形質転換された細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１．５×ＳＤＳ試料緩衝液［７５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ６．８，１５０ｍＭ ＤＴＴ，３％ＳＤＳ，０．１５％ブロモフェノールブルー，１５％グリセロール］中で溶解し、沸騰した。宿主タンパク質およびウイルスタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（９４）。ウェスタンブロッティング前に、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を移した。５％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中でメンブレンをブロッキング後、固定したタンパク質を１％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ中の適切な抗体と反応させた。メンブレンをＰＢＳＴで３回、各々５分間洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された抗ウサギ抗体または抗マウス抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳＴで再び３回、各５分間、およびＰＢＳで２回洗浄した。ＬｕｍｉＧＬＯ基質［ＫＰＬ］の添加によって抗体を視覚化し、Ｘ線フィルムに暴露した。
【０１０３】
結果
ＶＺＶ−ＨＳＶ組換え発現ＯＲＦ６１ｐの生成。ＶＺＶを用いたコインフェクションはＨＳＶ−ＩＣＰ０変異体の増殖を補完した（１０９）。次いで、条件付けでＯＲＦ６１ｐを発現した細胞株を用いて、ＩＣＰ０ヌル変異体を補完した（２４）。この後者の実験は、これらのウイルスオルソログがいくつかの生物学的活性を共有することを示唆した。しかしながら、これらのタンパク質は、ＮＤ１０コンポーネントに特異的に影響を及ぼし、野生型ＶＺＶは、ＨＳＶではないが、これらのコンポーネントに異なる要求を示した（９２）。したがって、ＯＲＦ６１ｐの機能をさらに分析するために、この研究は、それが二重の前初期０（ＩＥ−０）遺伝子座を置換する場合に、ＨＳＶ ＩＣＰ０と置き換わる可能性があるかどうかを調べた。
【０１０４】
ＩＣＰ０ ＨＳＶをコードする遺伝子座を置換するために、ウイルス骨格としてｄｌ１４０３を使用した。ｄｌ１４０３は、ＩＥ−０遺伝子の第２と第３のエクソンのフレーム融合外から誘導される最初の１０５ａａと追加の５６ａａをコードする。ＯＲＦ６１ｐをコードする配列は、材料および方法に記載されるように、増幅され、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化されたＩＣＰ０クローンに挿入された。ＮｃｏＩ部位は、それらの各タンパク質の合成を開始するために、両方の遺伝子によって使用されるＡＵＧコドンを含む。得られたプラスミド（ｐＣＰＣ−０６１）の構造的完全性は、ＩＥ−０プロモータおよび３’ＵＴＲを保持し、制限エンドヌクレアーゼ開裂およびＤＮＡ配列分析によって確認された。次いで、ｐＣＰＣ−０６１は線状化され、ｄｌ１４０３ヌクレオカプシドを用いてＭｅＷｏ細胞にコトランスフェクトされた（１０７）。得られた組換えウイルスは、ＭｅＷｏ細胞に対して滴定され、巨大プラークは、ＯＲＦ６１ｐの発現がＩＣＰ０欠陥を補完するであろうという推測により拾い上げられた（１００，１０９）。これらのプラークから調製されたＨｉｒｔ ＤＮＡは、ＩＥ−０の上流と下流のプライマー、およびＯＲＦ６１ｐに相同な２つの内部プライマーを用いてＰＣＲによってスクリーニングされた（図１０Ａ）。ＯＲＦ６１ｐをコードする配列を有し、ＩＣＰ０をコードするＤＮＡを欠損している配列を有するウイルスＤＮＡを含むプラークをさらに精製し、これを用いて、細胞がＯＲＦ６１ｐを発現するかどうかを決定するために細胞に感染させた。この分析の結果は図１０Ｃに示され、次のように概要される：ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染された細胞のウェスタンブロット分析は、細胞が感染後６時間で類似した量のＩＣＰ４を発現し、ＩＣＰ０は発現されなかったこと、およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１はＯＲＦ６１ｐを発現したことを示した。このようにして、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１では、欠損ＩＥ−０の両方のコピーがＯＲＦ６１ｐコード配列と置換され、得られたウイルスがＩＥ−０プロモータの制御下でＯＲＦ６１ｐを発現した。
【０１０５】
ＨＳＶ−ＯＲＦ６１の増殖およびプラーク形成効率。２つの実験は、ＯＲＦ６１ｐの発現がＩＣＰ０ヌル表現型を救済するかどうかを試験するために行われた。第１に、野生型のｄｌ１４０３とＨＳＶ−ＯＲＦ６１は、Ｌ７とＶｅｒｏ細胞について滴定され、相対的プラーク形成効率は、Ｌ７細胞についての力価対Ｖｅｒｏ細胞についての力価の割合として計算された。ＨＳＶ ｄｌ１４０３、および他のＩＣＰ０変異ウイルスは、それらの力価がＬ７などの補完細胞について測定され、親のＶｅｒｏ細胞株についてのそれらの力価と比較した場合に明らかである高い粒子／ｐｆｕ比を有する。３つのウイルスのプラーク形成効率は以下の通りであった：野生型＝０．９、ｄｌ１４０３＝３４０、およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１＝９．５（図１１Ａ）。このようにして、ＯＲＦ６１ｐの発現はｄｌ１４０３に対するＨＳＶ−ＯＲＦ６１のプラーク形成効率を約３５倍に増大させたが、野生型プラーク形成を回復するには十分ではなかった。次に、この研究は、どのようにしてＯＲＦ６１ｐの発現が、ＭｅＷｏ細胞において組換えウイルスの増殖動力学に影響を与えるかを調べた。細胞を低ｍｏｉで感染させ、試料を経時的に回収し、細胞あたりの感染ウイルスの収量をＬ７細胞においてプラークアッセイによって決定した。増殖曲線の分析は、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１が野生型とｄｌ１４０３との間を媒介する動力学で置換されることを表した（図１１Ｂ）。これらの２つの実験は、プラーク形成効率とウイルス収量の観点から、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０の欠損を十分に補完することができなかったという結論へと導いた。
【０１０６】
ＨＳＶ−ＯＲＦ６１で感染させた細胞におけるウイルス特異的タンパク質の蓄積。低ｍｏｉでのＩＣＰ０変異体の増殖欠損は、全種類のウイルス特異的タンパク質の発現遅延と蓄積減少として現れた（２，４）。したがって、ＭｅＷＯ細胞は、ｍｏｉを０．２にして、野生型、ｄｌ１４０３およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１を用いて感染された。ＩＣＰ４についての免疫蛍光分析（データ示さず）を用いて、各ウイルスが等しい数の細胞を感染したことを確認した。細胞溶解物を所定時間で調製し、ウェスタンブロット分析用に処理された。タンパク質の存在量および分析の動力学の分析は、低ｍｏｉのこの条件下で、ＩＣＰ４の蓄積が、感染４時間後に野生型ウイルスで感染された細胞において検出されたことを表した。対照的に、このタンパク質は、感染６時間までｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１のいずれかで感染された細胞において検出されなかった（図１２）。さらに、感染８時間後のＩＣＰ４の存在量は、野生型感染細胞と比較して、変異ウイルスで感染させた細胞において有意に減少した。従来報告されるように、ＩＣＰ２７の合成および蓄積の動力学は機能的ＩＣＰ０の発現に依存している（９７）。この表現型は、ＯＲＦ６１ｐが発現された場合、部分的に逆転されただけであった（図１３）。予想した通り、ＩＣＰ０およびＯＲＦ６１ｐは、これらのタンパク質を発現したウイルスで感染された細胞において検出されただけであった。これらのデータは、プラーク形成効率および増殖に関する研究と一致し（図１１）、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０の生物学的特性を十分に表現型模倣しなかったが、ＩＣＰ０−ウイルスの複製を明らかに高めたことを示した。
【０１０７】
感染後のＮＤ１０コンポーネントの運命。ＩＣＰ０は、プロテアソーム分解のためにＮＤ１０を解離し、それらの２つの主なコンポーネントであるＰＭＬおよびＳｐ１００を標的とするには必要であり、十分である。対照的に、ＯＲＦ６１ｐは、ＰＭＬを分解しないが、Ｓｐ１００レベルを減少させる（９２）。したがって、ＰＭＬおよびＳｐ１００の運命は、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１による感染中に追跡され、野生型またはｄｌ１４０３で感染された細胞において生じたものと比較された。ウェスタンブロット分析は、ＰＭＬの分解が、感染２時間後の初期程度で、野生型で感染された細胞において検出されたことを表した。対照的に、ＰＭＬレベルは、ｄｌ１４０３またはＨＳＶ−ＯＲＦ６１のいずれかで感染された細胞において変化しなかった（図１３Ａ）。これらの結果は、従来の所見を確証し、他のＨＳＶ前初期または初期タンパク質が存在する場合でされ、ＰＭＬの安定レベルに影響を及ぼさないことを示した。Ｓｐ１００は、ＮＤ１０の別の主なコンポーネントであり、ＩＣＰ０に依存して、ＨＳＶでの感染後に効率的に分解されることは周知である（８０）。この研究は、ＨＳＶ遺伝子発現に照らして、ＯＲＦ６１ｐがＳｐ１００の分解を効率的に指向することを示した（図１３Ａ）。
【０１０８】
野生型ＨＳＶおよびＶＺＶは、ＰＭＬまたはＳｐ１００の枯渇によって特異的に影響される（９２）。ｓｉＰＭＬおよびｓｉＳｐ１００におけるＨＳＶ−ＯＲＦ６１の相対的なプラーク形成効率を測定し、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１が宿主タンパク質であるＰＭＬまたはＳｐ１００の下方制御によって影響されるかどうかを決定するために、野生型ＨＳＶとｄｌ１４０３の効率と比較した。従来報告されるように、野生型ウイルスのプラーク形成効率は、ＰＭＬ（ｓｉＰＭＬ）またはＳｐ１００（ｓｉＳｐ１００）について枯渇した細胞に対して滴定される場合に影響を及ぼさなかった（図１３Ｂ）。対照的に、ｄｌ１４０３は、これらのＮＤ１０コンポーネントの不存在において部分的に補完された（図１３Ｂ）。ＨＳＶ−ＯＲＦ６１の相対的なプラーク形成効率はＶＺＶと表現型模倣した（９２）。より具体的には、ウイルス力価はｓｉＰＭＬ細胞において増加した一方で、ｓｉＳｐ１００細胞においては未変化のままであった（図１３Ｂ）。
【０１０９】
ウイルス複製に対するインターフェロンの効果。従来の研究は、ＨＳＶインターフェロン（ＩＦＮ）感受性がＰＭＬを媒介することを示唆し、ＩＣＰ０−ウイルスがこの細胞タンパク質を分解できないため、幾分過敏であることを提唱した。ＨＳＶ−ＯＲＦ６１はＰＭＬを分解することができないことが示されたため、この研究はどのようにしてＩＦＮ処置がこの変異ウイルスの増殖に影響を及ぼすかを調べた。ＩＦＮの有無において、ＭｅＷｏ、Ｖｅｒｏ（ＩＦＮに反応するが、発現しない（８２））およびＵ２０Ｓ（ＩＣＰ０変異ウイルスを補完する細胞株（１１２））に対するＨＳＶ−ＯＲＦ６１ｐ、野生型ＨＳＶ−１およびｄｌ１４０３のプラーク形成効率の比較を行った。ＭｅＷｏ細胞およびＶｅｒｏ細胞におけるｄｌ１４０３とＨＳＶ−ＯＲＦ６１の両方のプラーク形成効率は、ＩＦＮに反応して推定上合成されたインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）によって影響された（図１４）。ＭｅＷｏ細胞とＶｅｒｏ細胞に対して野生型ウイルスで見られた感受性における小さな相違（４〜５倍）は、絶対的なプラーク形成効率における相違の結果ではないが、むしろＶｅｒｏ細胞におけるＩＦＮの効果に対する全てのウイルスのより大きな感受性を反映していた（表１）。
【表１】
【０１１０】
これを支持して、Ｖｅｒｏ細胞においてＩＦＮに対するｄｌ１４０３の感受性が増加する。従来報告（１０２）されるように、Ｕ２ＯＳ細胞は、ＩＦＮに対するＩＣＰ０変異体の感受性を救済した。同じようにして、ＩＦＮによる処理後のＨＳＶ−ＯＲＦ６１のプラーク形成効率もまた救済された（図１４）。これらの分析は、ＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐはＩＣＰ０機能のいくつかと置き換わったが、野生型ＩＦＮ耐性表現型をＨＳＶ−ＯＲＦ６１が反復しないことによって明らかなように、ｄｌ１４０３におえる欠陥の全てを補完しなかったことは明らかであった（図１４）。
【０１１１】
検討
ＨＳＶ ＩＣＰ０は、遺伝子発現の強力な無差別的な転写アクチベーターとして作用するＲＩＮＧフィンガータンパク質である。ＩＣＰ０のオルソログは、アルファヘルペスウイルスファミリーの他のメンバーに存在する。これらのタンパク質は、ウイルスゲノム内のそれらの局在化、および遺伝子発現に影響を及ぼす能力によってＩＣＰ０と関連する。全てのオルソログにおけるＮ末端近傍のＲＩＮＧフィンガーを除いて、配列類似性が制限される。具体的には、ＶＺＶにおけるＩＣＰ０オルソログであるＯＲＦ６１ｐは、同時発現した場合、ＩＣＰ０−ウイルスの複製を加速し、さらに遺伝子発現に影響を及ぼす（１００，１０１）。これらの類似性にも関わらず、ＯＲＦ６１遺伝子内の相同なＩＣＰ０配列の欠損は従来強調され、これらのタンパク質が多機能を有するという示唆（９２）がなされている。
【０１１２】
この研究は、ＩＣＰ０プロモータおよび３’ＵＴＲの制御下で、ＩＣＰ０に代えてＯＲＦ６１ｐを発現する変異ＨＳＶウイルスを構築することによってＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐの活性を比較する。したがって、オルソログは同一の遺伝的背景において発現され、２つのウイルスの生物学的活性において観察された任意の相違は、ウイルスタンパク質が発現される単なる結果であるべきである。
【０１１３】
野生型、ＩＣＰ０−およびＨＳＶ−ＯＲＦ６１による感染中の増殖とタンパク質発現プロフィールとの比較は、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０ヌル表現型を部分的に救済するが、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１ｐの複製は野生型ウイルスの複製よりも効率が低いことを示した。これらのタンパク質が異なるレベルに発現され、異なる半減期を有し、および別々にＨＳＶタンパク質と相互作用するという可能性があり、ならびにこれはＨＳＶ−ＯＲＦ６１の増殖表現型に影響を及ぼし得るという可能性がある。結果は、ＯＲＦ６１ｐが発現されると、ＩＣＰ０機能のいくつかを欠損するということである。
【０１１４】
アデノウイルスから発現されたＩＣＰ０は、２つの主なＮＤ１０コンポーネント、ＰＭＬおよびＳｐ１００の効率的な枯渇を引き起こした一方で、ＯＲＦ６１ｐを発現するアデノウイルスがＳｐ１００レベルだけを減少させた。ここで、ウイルス複製中のＮＤ１０コンポーネント存在量に対するこれらのタンパク質の効果を比較した。他のＨＳＶタンパク質が発現されたときでさえ、ＯＲＦ６１ｐは特異的にＳｐ１００を減少させ、ＰＭＬに対して効果がないことが観察された。
【０１１５】
ＮＤ１０は、先天性免疫の核形態を与えることが示唆されている。具体的には、ＮＤ１０コンポーネントは、ヘルペスウイルスおよび他のＤＮＡウイルスゲノムの発現を抑制するように作用する。その流れでは、野生型ウイルスではなく、ｄｌ１４０３の複製およびプラーク形成効率は、ＰＭＬまたはＳｐ１００を欠損する細胞において増加されることは興味深い（８５，８６）。対照的に、野生型ＶＺＶの複製およびプラーク形成効率は、Ｓｐ１００の枯渇によって影響を受けず、ｓｉＰＭＬ細胞において増加する（９２）。これらの観察、およびＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐだけが異なる細胞株において観察されたプラーク形成効率に必要とされるという仮定に基づいて、ＩＣＰ０の代わりにＯＲＦ６１ｐを発現するＨＳＶがＶＺＶを表現型模倣することが期待され得た。したがって、ｓｉＰＭＬおよびｓｉＳｐ１００細胞におけるＨＳＶ−ＯＲＦ６１のプラーク形成効率はそれらの親対照細胞株と比較された。ウイルス複製は、ＰＭＬが枯渇された場合に部分的に補完されたが、Ｓｐ１００レベルの減少はウイルス複製に影響を及ぼさなかった。これは、ＯＲＦ６１ｐが効率的なウイルス複製を可能にするＳｐ１００レベルを滴定するために進展してきたというさらなる実証であった。しかしながら、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐはＰＭＬを標的としない；したがって、ＯＲＦ６１ｐだけが発現される場合、ＰＭＬ宿主タンパク質は、ウイルス増殖と複製を抑制するために利用可能なままである。
【０１１６】
ＩＣＰ０またはＯＲＦ６１を発現するウイルスはＳｐ１００分解に特異的に影響を及ぼす。Ｓｐ１００は、通常、ＳＤＳ電気泳動中に３種として分解される（８９，１０８）。研究抗体によって認識された種は、電気泳動の移動速度に照らして、Ｓｐ１００、Ｓｐ１００−ＳＵＭＯおよびＳｐ１００−ＨＭＧであった。野生型ウイルスで感染された細胞では、Ｓｐ１００の高分子量種が徐々に消失する一方で、Ｓｐ１００Ａは安定化された（図１４）。Ｓｐ１００のこの電気泳動パターンは、ｓｉＲＮＡによってＰＭＬが枯渇した細胞において観察されたものと模倣した（８５，９２）。対照的に、ＯＲＦ６１ｐがＩＣＰ０に代えて発現された場合、Ｓｐ１００の全てのアイソフォームおよび改変種は、感染中に徐々に消失し、ＰＭＬの電気泳動パターンにおいて見掛けの相違がなかった。これは、ｓｉＲＮＡ実験と一致し、ＰＭＬの枯渇とは異なり、Ｓｐ１００の下方制御がＮＤ１０小体の他のコンポーネントに効果がなかったことを示す（８５，８６，９２）。さらに、ＩＣＰ０を発現するアデノウイルスを用いた細胞の感染は、ＰＭＬとＳｐ１００Ａを除くＳｐ１００の消失をもたらした一方で、ＯＲＦ６１ｐを発現するアデノウイルスは全てのＳｐ１００形態を減少させ、ＰＭＬに対して効果がなかった（９２）。
【０１１７】
これらの結果は、これらのアルファヘルペスウイルスオルソログがＮＤ１０コンポーネントを標的とする一方で、それらは異なる方法でそうするという提案をもたらした。ＨＳＶ ＩＣＰ０はプロテアソーム分解についてＰＭＬを標的とする。ＰＭＬレベルの減少は、Ｓｐ１００Ａを除いて、Ｓｐ１００種の消失をもたらす。したがって、ＰＭＬを標的とすることによって、ＩＣＰ０は、両方の主要なＮＤ１０コンポーネントを直接的または間接的に標的とする。対照的に、ＯＲＦ６１ｐは、独立して、分解についてＳｐ１００を標的とする。ＩＣＰ０とは異なり、Ｓｐ１００の減少は他のＮＤ１０タンパク質に対して見掛けの効果はない。これらのオルソログによるＮＤ１０タンパク質の特異的標的化は、それらの生物学的活性において観察された相違の少なくともいくつかの原因となり得る。
【０１１８】
ウイルス感染中のＰＭＬの正確な役割は捕らえられないままである。しかしながら、ＩＣＰ０を欠損しているＨＳＶ変異体とＯＲＦ６３ｐを欠損しているＶＺＶ変異体はインターフェロンに過敏であり（１０２）、この効果はＰＭＬによって媒介される（７９）ことは知られている。対照的に、野生型ＨＳＶ（１０２）およびＶＺＶ（７７）は、ＩＦＮにあまり感受性でない。これらのデータは、ＰＭＬがＶＺＶ感染中に分解されないという観察（９２）とともに、インターフェロンが異なる機構によってこれらの２つのヒトアルファヘルペスウイルスの複製を阻害し、これらのウイルスが異なる特異的な対抗手段を進化させてきたことを示唆する。結果として、ＨＳＶとは対照的に、ＶＺＶはインターフェロンによる阻害を克服するためにＰＭＬの分解を必要としない可能性がある。これらの研究は、ＨＳＶ ＩＣＰ０とＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐとの間の機能的相違の分子的理解の根拠を与える。未公開の観察は、その機能的ハンディーキャップにも関わらず、ＯＲＦ６１ｐはＶＺＶプロモータとＨＳＶプロモータの両方をなおも活性化するという従来の報告と一致している。しかしながら、上述した通り、ＯＲＦ６１ｐは、ＩＣＰ０の免疫調節活性を欠損する。これらの観察に基づいて、Ｓｐ１００枯渇はウイルス遺伝子発現を高めるために必要とされる一方で、先天性免疫系のインターフェロンアームの徴発に影響を及ぼす活性はＰＭＬによって媒介されるだけであり得るという可能性がある。したがって、これらのオルソログの機能のさらなる詳細な分析は、感染中のＮＤ１０コンポーネントの役割に洞察を与えることができた。
【０１１９】
これらの結果は、ワクチンベクターとしてＨＳＶ骨格に関して重要である（１９）。ＩＣＰ０の発現は、クロマチン修飾、およびウイルス遺伝子の効率的な発現を可能にするリモデリングに必要とされる（８１，８８，９５）。しかしながら、ＩＣＰ０の発現は先天性免疫を妨げる。さらに、ＩＣＰ０の枯渇はウイルス力価の減少をもたらす。このようにして、ＩＣＰ０に代えて、骨格の基礎としてのＨＳＶ−ＯＲＦ６１の使用は、現在のヘルペスウイルスに基づくベクターの有利な代替物を提供する。
【０１２０】
結果ＩＩＩ
アルファヘルペスウイルスはＨＳＶα遺伝子産物のオルソログであるＩＣＰ０をコードする。ＩＣＰ０はウイルス遺伝子および細胞遺伝子の乱交雑アクチベーターとして振る舞う核リンタンパク質であり、プロテアソーム分解のために宿主タンパク質を標的とするＥ３ユビキチンリガーゼとしても機能する。この活性を通じて、ＩＣＰ０は、ＰＭＬおよびＳｐ１００を含むＮＤ１０小体のコンポーネントの分解を促進する。これらのタンパク質は、ヘルペスウイルスゲノムのサイレンシングに関与する。したがって、ＩＣＰ０を媒介したＮＤ１０コンポーネントの分解は、効率的な遺伝子発現を可能にするＨＳＶ遺伝子のサイレンシングを崩壊し得る。この仮説は、どのようにしてＩＣＰ０が遺伝子活性化を誘導するかについての説得力のある機構説明を与える。ＯＲＦ６１ｐは、ＶＺＶオルソログであり、ウイルスプロモータを活性化し、ＩＣＰ０のようなウイルスＤＮＡの感染性を高める。しかしながら、ＨＳＶオルソログとＶＺＶオルソログとの間の２つの主な生物学的相違が示されている。第１に、ＩＣＰ０とは異なり、ＯＲＦ６１ｐは、宿主のコシャペロンタンパク質であるＢＡＧ３の枯渇を補完することができない。結果として、ＶＺＶは、ＢＡＧ３のサイレンシングによって影響されない一方で、ＨＳＶの増殖は、ＩＣＰ０が発現しない場合に変更されないだけである。さらに、両方のタンパク質はＮＤ１０のコンポーネントを標的とし、ＩＣＰ０の発現がＰＭＬとＳｐ１００の両方の分解をもたらす一方で、ＯＲＦ６１ｐはＳｐ１００レベルを特異的に減少させた。このようにして、これらのタンパク質は、ウイルス複製について異なる機能を提供するために別々に進化してきた。これらのオルソログを直接比較するために、ＩＣＰ０の代わりにＯＲＦ６１ｐを発現するＨＳＶ変異ウイルスを構築した（図１０）。
【０１２１】
添付のグラフでは（図１１ｂ）、ＩＣＰ０−ウイルス（ｄｌ１４０３）から欠損しているＯＲＦ６１ｐが力強い増殖を回復する一方で、得られたキメラウイルスは、単にＩＣＰ０ヌル表現型を部分的に救済したことが示される。この所見は、ＩＣＰ０とＯＲＦ６１ｐとの間に顕著な生物学的相違があることを示した。より重要なことには、ＶＺＶワクチンを考慮するとき、ＨＳＶではないＶＺＶがインターフェロン（ＩＦＮ）に感受性であるということを想起する必要がある。したがって、ＨＳＶ−ＯＲＦ６１は、ＰＭＬを分解するその能力について試験され、野生型ＶＺＶのように、分解しないことが示された。したがって、ＩＦＮ処理がこの変異ウイルスの増殖に影響を及ぼすかどうかが問われ、ＭｅＷｏ細胞とＶｅｒｏ細胞において、ｄｌ１４０３とＨＳＶ−ＯＲＦ６１の両方のプラーク形成効率がＩＦＮに反応して推定上合成されたＩＳＧによって減少したことが示された。これらの分析は、ＶＺＶ ＯＲＦ６１ｐはＩＣＰ０機能のいくつかと置き換わったが、野生型ＩＦＮ耐性表現型をＨＳＶ−ＯＲＦ６１が反復しないことによって明らかなように、ｄｌ１４０３における欠陥の全てを補完しなかったことを表した。
【０１２２】
この組換えウイルスは、ＶＺＶ Ｏｋａワクチン菌株のＩＦＮ感受性を反復する特徴を有する。ＶＺＶは、主要な中和ウイルスエピトープを表す８つの糖タンパク質をコードする（図１５）。ＨＳＶのＵｓ領域をコードする糖タンパク質は、ＶＺＶの対応するＵｓ領域に位置される主要な糖タンパク質遺伝子ＯＲＦ６７および６８で置換され得る。これは、ＩＣＰ０をコードする配列の代わりに、ＯＲＦ６１ｐを含むＨＳＶ−１バクミドを用いて行われる。組換え構築物は、次に回復されるウイルスを作製するために細胞内にトランスフェクトされる。当該技術分野において知られるように、組換えウイルスは、プラスミド／バクミドにおける所望のＤＮＡ断片を宿主細胞内に、それとの組換えを可能にするウイルスと組換えウイルス産物とともに同時に導入することによって構築され得る。ＶＺＶ由来の対応する配列によるＨＳＶ糖タンパク質の１つずつの置換は、糖タンパク質遺伝子がＶＺＶ糖タンパク質遺伝子を用いて完全に置換されるＨＳＶ菌株を再構築するために行うことができる。これは、天然のＶＺＶと比べて改善された安定性を提供し、ワクチン産物について高い力価まで増殖可能である。
【参考文献】
【０１２３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ＤＮＡが組み込まれたヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡがＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする組換えデオキシリボ核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＨＳＶ ＤＮＡがゲノムＤＮＡであり、前記異種ＤＮＡが、前記ＨＳＶ ＤＮＡ内に、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードするゲノムＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて組み込まれる組換えデオキシリボ核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のゲノムＨＳＶ ＤＮＡ内に挿入される組換えデオキシリボ核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドが、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えデオキシリボ核酸。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記異種ポリペプチドが、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有する組換えデオキシリボ核酸。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＨＳＶ ＤＮＡがＨＳＶゲノムである組換えデオキシリボ核酸。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡをさらに含む組換えデオキシリボ核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記糖タンパク質が水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えデオキシリボ核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記糖タンパク質が水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項の組換えデオキシリボ核酸であって、前記組換えデオキシリボ核酸によってコードされたポリペプチドが、哺乳動物の前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）を分解しない組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記組換えデオキシリボ核酸が適切な宿主細胞のゲノム内に組み込まれた場合に前記ポリペプチドが発現されるように、前記ポリペプチドをコードする前記異種ＤＮＡが組み込まれている組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記糖タンパク質をコードする前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＤＮＡの非必須遺伝子または領域内に組み込まれている組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１３】
ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む組換えヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であって、前記異種ＤＮＡが、（ａ）前記ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入され、（ｂ）前記組換えＨＳＶが導入されている宿主細胞内で発現される組換えＨＳＶ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えＨＳＶであって、前記異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする前記ＨＳＶゲノムの一部に代えて、前記ＨＳＶゲノム内に組み込まれる組換えＨＳＶ。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の組換えＨＳＶであって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間の前記ＨＳＶゲノム内に挿入される組換えＨＳＶ。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記ポリペプチドが、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えＨＳＶ。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記ポリペプチドが、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有する組換えＨＳＶ。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、糖タンパク質をコードし、前記ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入された異種ＤＮＡをさらに含む組換えＨＳＶ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換えＨＳＶであって、前記糖タンパク質が、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えＨＳＶ。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組換えＨＳＶであって、前記糖タンパク質が、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む組換えＨＳＶ。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組換えＨＳＶであって、前記糖タンパク質をコードする前記異種ＤＮＡが、非必須遺伝子または前記ＨＳＶゲノムの領域内に挿入される組換えＨＳＶ。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、前記組換えＨＳＶゲノムによってコードされたポリペプチドがいずれもＰＭＬを分解しない組換えＨＳＶ。
【請求項２３】
請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、最大８つの異なる異種ＤＮＡを含み、各々が異なる水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質をコードしている組換えＨＳＶ。
【請求項２４】
（１）薬学的に許容される担体と、（２）（ａ）ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが組み込まれており、且つ（ｂ）各々が糖タンパク質をコードする１または複数個の異種ＤＮＡが組み込まれているヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムを含む組換えデオキシリボ核酸を含む組換えウイルスとを含むワクチン。
【請求項２５】
請求項２４に記載のワクチンであって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて、ＨＳＶゲノム内に組み込まれるワクチン。
【請求項２６】
請求項２４または２６に記載のワクチンであって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のＨＳＶゲノム内に挿入されるワクチン。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のワクチンであって、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記異種ポリペプチドが、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有するワクチン。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のワクチンであって、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記異種ポリペプチドが、ＥＨＶ、ＢＨＶ、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有するワクチン。
【請求項２９】
請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記糖タンパク質が、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有するワクチン。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記糖タンパク質が水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含むワクチン。
【請求項３１】
請求項２４〜３０のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記糖タンパク質をコードする前記異種ＤＮＡ、およびＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが、各々、ＨＳＶゲノムの非必須遺伝子または領域内に挿入されるワクチン。
【請求項３２】
水痘帯状ヘルペスウイルス感染に対して対象を免疫化する方法であって、前記対象において前記水痘帯状ヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発し、それにより前記対象の免疫化をもたらすのに有効な量の請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のワクチンを対象に投与することを含む方法。
【請求項３３】
ウイルスによる感染予防に有用な組成物を調製する方法であって、前記組成物を調製するように、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の組換えウイルスを生ワクチン安定化剤と併せることを含む方法。
【請求項１】
異種ＤＮＡが組み込まれたヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡがＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする組換えデオキシリボ核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＨＳＶ ＤＮＡがゲノムＤＮＡであり、前記異種ＤＮＡが、前記ＨＳＶ ＤＮＡ内に、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードするゲノムＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて組み込まれる組換えデオキシリボ核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のゲノムＨＳＶ ＤＮＡ内に挿入される組換えデオキシリボ核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドが、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えデオキシリボ核酸。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記異種ポリペプチドが、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有する組換えデオキシリボ核酸。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記ＨＳＶ ＤＮＡがＨＳＶゲノムである組換えデオキシリボ核酸。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、糖タンパク質をコードする異種ＤＮＡをさらに含む組換えデオキシリボ核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記糖タンパク質が水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えデオキシリボ核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記糖タンパク質が水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項の組換えデオキシリボ核酸であって、前記組換えデオキシリボ核酸によってコードされたポリペプチドが、哺乳動物の前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）を分解しない組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記組換えデオキシリボ核酸が適切な宿主細胞のゲノム内に組み込まれた場合に前記ポリペプチドが発現されるように、前記ポリペプチドをコードする前記異種ＤＮＡが組み込まれている組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸であって、前記糖タンパク質をコードする前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＤＮＡの非必須遺伝子または領域内に組み込まれている組換えデオキシリボ核酸。
【請求項１３】
ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む組換えヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であって、前記異種ＤＮＡが、（ａ）前記ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入され、（ｂ）前記組換えＨＳＶが導入されている宿主細胞内で発現される組換えＨＳＶ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えＨＳＶであって、前記異種ＤＮＡは、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする前記ＨＳＶゲノムの一部に代えて、前記ＨＳＶゲノム内に組み込まれる組換えＨＳＶ。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の組換えＨＳＶであって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間の前記ＨＳＶゲノム内に挿入される組換えＨＳＶ。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記ポリペプチドが、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えＨＳＶ。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、前記ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記ポリペプチドが、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有する組換えＨＳＶ。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、糖タンパク質をコードし、前記ＨＳＶゲノムの非必須領域内に挿入された異種ＤＮＡをさらに含む組換えＨＳＶ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換えＨＳＶであって、前記糖タンパク質が、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えＨＳＶ。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組換えＨＳＶであって、前記糖タンパク質が、水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含む組換えＨＳＶ。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組換えＨＳＶであって、前記糖タンパク質をコードする前記異種ＤＮＡが、非必須遺伝子または前記ＨＳＶゲノムの領域内に挿入される組換えＨＳＶ。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、前記組換えＨＳＶゲノムによってコードされたポリペプチドがいずれもＰＭＬを分解しない組換えＨＳＶ。
【請求項２３】
請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組換えＨＳＶであって、最大８つの異なる異種ＤＮＡを含み、各々が異なる水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質をコードしている組換えＨＳＶ。
【請求項２４】
（１）薬学的に許容される担体と、（２）（ａ）ＲＩＮＧフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが組み込まれており、且つ（ｂ）各々が糖タンパク質をコードする１または複数個の異種ＤＮＡが組み込まれているヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムを含む組換えデオキシリボ核酸を含む組換えウイルスとを含むワクチン。
【請求項２５】
請求項２４に記載のワクチンであって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ感染細胞ポリペプチド０（ＩＣＰ０）をコードする、ＨＳＶ ＤＮＡの一部に代えて、ＨＳＶゲノム内に組み込まれるワクチン。
【請求項２６】
請求項２４または２６に記載のワクチンであって、前記異種ＤＮＡが、ＨＳＶ ＩＣＰ０ ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）とＨＳＶ ＩＣＰ０ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間のＨＳＶゲノム内に挿入されるワクチン。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のワクチンであって、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記異種ポリペプチドが、水痘帯状ヘルペスウイルスＯＲＦ６１タンパク質のアミノ酸配列を有するワクチン。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のワクチンであって、ＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記異種ポリペプチドが、ＥＨＶ、ＢＨＶ、または仮性狂犬病ウイルスタンパク質のアミノ酸配列を有するワクチン。
【請求項２９】
請求項２４〜２８のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記糖タンパク質が、水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列を有するワクチン。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記糖タンパク質が水痘帯状ヘルペスウイルス中和エピトープを含むワクチン。
【請求項３１】
請求項２４〜３０のいずれか１項に記載のワクチンであって、前記糖タンパク質をコードする前記異種ＤＮＡ、およびＲＩＮＧフィンガードメインを含む前記ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡが、各々、ＨＳＶゲノムの非必須遺伝子または領域内に挿入されるワクチン。
【請求項３２】
水痘帯状ヘルペスウイルス感染に対して対象を免疫化する方法であって、前記対象において前記水痘帯状ヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発し、それにより前記対象の免疫化をもたらすのに有効な量の請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のワクチンを対象に投与することを含む方法。
【請求項３３】
ウイルスによる感染予防に有用な組成物を調製する方法であって、前記組成物を調製するように、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の組換えウイルスを生ワクチン安定化剤と併せることを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１３−５０００４４（Ｐ２０１３−５０００４４Ａ）
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２２８０１（Ｐ２０１２−５２２８０１）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２０１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１６８３０
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５９２１０４７８２）ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク (21)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＣＯＬＵＭＢＩＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮ ＴＨＥ ＣＩＴＹ ＯＦ ＮＥＷ ＹＯＲＫ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２０１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１６８３０
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５９２１０４７８２）ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク (21)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＣＯＬＵＭＢＩＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮ ＴＨＥ ＣＩＴＹ ＯＦ ＮＥＷ ＹＯＲＫ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]