ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント、及び分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤
【課題】 ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントの提供
【解決手段】（１）キノコの菌糸体の熱水抽出物を主成分とすることを特徴とするウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
（２）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、このウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを含むことを特徴とする分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
（３）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共にこのウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを投与することを特徴とするウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【解決手段】（１）キノコの菌糸体の熱水抽出物を主成分とすることを特徴とするウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
（２）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、このウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを含むことを特徴とする分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
（３）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共にこのウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを投与することを特徴とするウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ（担子菌：Basidiomycota）菌糸体の熱水抽出物を含むウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント、及び
ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と前記アジュバントを含む分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤、並びに
前記アジュバントをウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であるワクチンと共に投与することにより、ウイルス又は病原菌に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体の産生を誘導させる方法
に関する（以下、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対する（の免疫原生を高める）アジュバントを、単にアジュバントともいう）。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ等の呼吸器感染症の防御には、粘膜より分泌される特異的ＩｇＡ抗体が非常に有効であることが知られている。特に型の異なるウイルスに対する交叉防御は、粘膜で分泌されるＩｇＡ抗体が主に担っており、インフルエンザウイルスに自然罹患した後に回復したヒトには、このＩｇＡ抗体が誘導されており、同亜型の変異型ウイルスの流行に対しても感染防御ができている。
【０００３】
一方、未感染の個体におけるウイルス又は病原菌からの感染を防御する方法として、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であるワクチンを接種し、意図的に抗体を誘導させる方法があり、そのようなものとしてインフルエンザワクチン、コレラワクチン、チフスワクチン、種痘ワクチン、ＢＣＧワクチン等などが知られている。
【０００４】
ところで、そのなかでもインフルエンザ、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）等の呼吸器疾患は、呼吸器官からの感染によるものであり、したがってそのワクチンの投与により呼吸器粘膜での免疫応答が求められている。しかしながら、現在用いられている皮下注射によるワクチンでは、粘膜免疫応答が得られず、交叉防御能を有する、より効果的なワクチンの開発が求められているのが現状である。特に、呼吸器粘膜における分泌型ＩｇＡ抗体の誘導方法として、鼻腔投与（経鼻投与）による鼻粘膜へ抗原を接種する方法があるが、抗原の接種のみでは十分な抗体応答がみられず、より効果的な免疫応答発現のためには、ワクチンと同時に投与するアジュバントが必要となる。
【０００５】
これまで、そのようなワクチンに対するアジュバント作用を有する物質が種々提案されてきており、例えば、最近では、イノシン酸とシチジル酸とからなるポリヌクレオチドコポリマーであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）にアジュバント作用があることが報告されている（非特許文献１、特許文献１）。
又、セラミック化ホッキ貝の粉末にアジュバント作用があることも報告されている（特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-1184 (2002)
【特許文献２】特開２００５−９７２６７
【特許文献３】特開２００５−３１４２７７
【０００７】
本発明者らは、従来から、より効果的なアジュバント作用を有する物質、特に、天然資源によるアジュバント作用物質の検討を行ってきたが、今回、キノコ（担子菌：Basidiomycota）の菌糸体の熱水抽出物に、顕著なアジュバント作用を認めた。
すなわち、本発明者らは、粘膜免疫誘導のためのアジュバントとして、キノコ菌糸体の熱水抽出物を用い、鼻腔粘膜でのＩｇＡ抗体分泌と血清中のＩｇＧ抗体応答と、致死量のインフルエンザウイルスに対する感染防御を検討した結果、良好な粘膜でのＩｇＡ抗体分泌と血清中のＩｇＧ抗体応答が得られ、さらに致死量のインフルエンザウイルスに対する感染防御効果が認められた。
そのうえ、その免疫応答はワクチン株と亜型の異なるウイルスに対する抗体誘導でもあり、またワクチン株と亜型の異なるウイルスに対する感染防御も認められ、交叉防御能を確認するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本願発明は、
（イ）キノコ菌糸体の熱水抽出物を含むウイルス又は病原菌由来の不活化抗原用アジュバント、
（ロ）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、そのアジュバントとしてキノコ菌糸体の熱水抽出物を含む分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤、
（ハ）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共に、キノコ菌糸体の熱水抽出物をアジュバントとして投与する、ウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法、
を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、下記の請求項により構成されている。
＜請求項１＞ キノコの菌糸体の熱水抽出物を主成分とすることを特徴とするウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
＜請求項２＞ キノコがメシマコブ（Phellinus linteus）、カラカサタケモドキ（Macrolepita gracilenta）、マイタケ（Grifola frondosa）、又はシイタケ（Lentinula edodes）である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
＜請求項３＞ ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
＜請求項４＞ ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、請求項１〜請求項３記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを含むことを特徴とする分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
＜請求項５＞ 呼吸器粘膜に投与する請求項４に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
＜請求項６＞ ウイルス又は病原菌が水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項４又は請求項５に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
＜請求項７＞ ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共に請求項１〜請求項３記載のアジュバントを投与することを特徴とするウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
＜請求項８＞ 呼吸器粘膜に投与する請求項７に記載のウイルス又は病原菌特異的分泌型ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
＜請求項９＞ ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項７に記載のウイルス、又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【００１０】
本願発明において、キノコとは担子菌（Basidiomycota）をいう。
【００１１】
本願発明において、重症急性呼吸器感染症候群ウイルスとは、ＳＡＲＳ（Severe Acute Respiratory Syndrome、コロナウイルスの一種）をいう。
【発明の効果】
【００１２】
（イ）本願発明が提供するアジュバントは、キノコ菌糸体から熱水抽出物として容易に製造することができる。
（ロ）本願発明が提供するアジュバントは、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原（ワクチン）と共に投与することにより、ウイルス又は病原菌に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体の産生を多量に誘導させることができる。
（ハ）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原（ワクチン）と、本願発明が提供するアジュバントを、感染疾患を予防する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤（アジュバント含有ワクチン）キットとして提供することができる。
（ニ）分泌型ＩｇＡ抗体は、外分泌液中の主要な免疫グロブリンであり、粘膜表面の感染防御に役立っている病原菌特異的ＩｇＡ抗体であって、唾液、鼻汁、腸、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多くみられ、また血清中にも存在する。
従って、本発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤は、このＩｇＡ抗体の産生を誘導することにより、ウイルス又は病原菌などの病原体による感染を防御することが可能となり、さらには感染予防のための分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤として提供することができる。
（ホ）ＰＬキノコの菌糸体の熱水抽出物をアジュバントとして用いるワクチン投与は、ワクチン株と亜型の異なるウイルスに対しても感染防御、及び交叉防御能を発現させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＊キノコの菌糸体の乾燥粉末の取得
大型タンク（１０００Ｌ）を用いて、炭素源としてグルコースを４．０％、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリぺプトンを各０．３％、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４を各０．０５％を含み、初発培地ｐＨ５．５の培養液に、各キノコの菌糸体を接種し、強制的に０．２２μｍフィルターを通した無菌空気を培地内へ通気し、温度２８℃で４５日間培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌糸体を凍結乾燥して各キノコの菌糸体の乾燥粉末を得た。
【００１４】
＊各キノコの菌糸体の熱水抽出物の取得
前記各キノコの菌糸体の乾燥粉末２０ｇに、イオン交換水１４０ｍｌを加え、１０５℃で６０分、熱水抽出処理を行ない、不溶物を除去して各キノコの菌糸体の熱水抽出物を得た。この熱水抽出物を４０℃以下で減圧濃縮し、熱水抽出物（固形分５％）を得た（図１参照）。
【００１５】
一方、本願発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤により、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントと共に投与されるワクチン（ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原）としては、身体中に接種されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子又は感染因子のある部分を含む抗原性懸濁液又は溶液である。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物（例えば、ウイルス又は細菌など）又は微生物から精製された天然の産生物、合成生成物又は遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖又は同様な産生物であってもよい。
【００１６】
例えば、生ワクチンとしては、具体的には、ＢＣＧ、種痘、ポリオ、はしか、風疹、おたふく風邪、牛痘、ＮＤＶ、マレック病などをあげることができる。また、不活化ワクチンとしては、百日咳、ジフテリア（トキソイド）、破傷風（トキソイド）、インフルエンザ（ＨＡ）、日本脳炎、リケッチアなどをあげることができる。
【００１７】
また、本発明にいう不活化抗原とは、感染能を失わせた抗原をいい、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、その翻訳後修飾体、ビリオン非構成タンパク質、その翻訳後修飾体、感染防御抗原、中和反応のエピトープなどを挙げられることができる。不活化は、例えば、物理的（例えば、Ｘ線照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素）操作により行うことができる。
【００１８】
本発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤の投与は、粘膜投与の形態により行うのが好ましい。脊椎動物における粘膜には、消化器、呼吸器、排出器、生殖器などの特に外通性の中腔器官の内壁が含まれる。したがって、本発明の好ましい投与形態である粘膜投与としては、例えば、鼻腔投与（経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与などをあげることができる。そのなかでも鼻腔内粘膜投与が好ましい。鼻腔は特に、インフルエンザウイルスなどによる呼吸器感染症疾患の感染経路の門戸であることから、粘膜投与により分泌型ＩｇＡ抗体反応を引き起こし、粘膜上皮細胞中に分泌型ＩｇＡ抗体を産生させることは、呼吸器感染症の防御に結びつくものである。
【００１９】
本発明の目的である分泌型ＩｇＡ抗体の産生が誘導され、免疫防御を発揮する対象としての病原体は、宿主に対して疾患又は障害を発生し得る微生物である。具体的には、ヒトに対する病原体としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌などをあげることができる。ウイルスはどのような種類のものでもよく、例えば、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスなどがあげることできる。より具体的には、例えば、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ＨＩＶウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。このようなウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスである。
【００２０】
また、本発明が対象とする細菌は、どのような細菌であってもよく、グラム陽性菌、グラム陰性菌があげられることができ、例えば、そのような細菌としては、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌及びコレラ菌などがあげられる。
【００２１】
本発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤の投与量は、投与する対象者の年齢、体重、投与方法により一概に限定し得ないが、通常成人１日当たり、経口投与の場合には、１０〜１０００ｍｇ程度であり、また粘膜投与、特に経鼻投与の場合には、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ程度である。
【００２２】
以下に本発明を、具体的実施(試験)例により説明する。
（１）供試材料
材料として、以下のものを使用した。
（イ）アジュバント（前記段落００１４により調整したキノコの菌糸体の熱水抽出物）
（ａ）メシマコブ（Phellinus linteus、ＰＬと表記）
（ｂ）カラカサタケモドキ（Macrolepita gracilenta、ＭＧＲと表記）
（ｃ）マイタケ（Grifola frondosa、ＧＦと表記）
（ｄ）シイタケ（Lentinula edodes、ＬＥと表記）
（ロ）マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
（ハ）ウイルス：（ａ）インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株（国立感染症研究所（東京）から入手）
：（ｂ）Ａタイプ株
：（ｃ）Ｂタイプ株（Ａタイプと同じ亜型内のグレードの異なる株）
：（ｄ）Ｃタイプ株
（ニ）ワクチン：（ａ）インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株
：（ｂ）前記ウイルスＡタイプ株のワクチン
（ホ）アジュバントのポジティブコントロールとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）
なお、「Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）」とは、ポリイノシン酸（ｐＩ）とポリシチジン酸（ｐＣ）とを含む二本鎖ＲＮＡをいう（特許文献２参照）。
【００２３】
（２）実施(試験)例
（イ）６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを、各群５匹ずつ用いた。ＰＲ８ ＨＡワクチン１μｇを、アジュバント（前記４種類のキノコ熱水抽出物、ＰＬ，ＭＧＲ，ＧＦ，ＬＥ）５μｇ（５μｌ）と共に、それぞれのマウスの鼻に５μｌ接種し、更に３週間後に、同量のワクチンを同様のアジュバントと共に経鼻接種し、最終免疫（投与）の２週間後に、更に１００ｐｆｕのＰＲ８ウイルス（前記〔００２３〕の（１）−（ハ）−（ａ））を、片鼻に１．２μｌずつ注入し、ウイルス感染を行った。
アジュバントのポジティブコントロールとして、Poly（I：C）５μｇ投与群、及び５μｇのＰＲ８ ＨＡワクチンのみの投与群をおいた。
感染３日後に肺洗浄液、及び血清を回収し、肺洗浄液中のＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡ法を用いて、また肺洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイ法で測定した。
同様に、経鼻免疫したマウスに４０ＬＤ５０の致死量のウイルスを２０μｌ感染してその体重変化と生存を観察した。
【００２４】
測定結果を図２、図３及び図４に示す。
図２（２）「Anti‐A/PR8 HA IgG in lung wash」は、「抗‐PR8 HA IgG（肺洗浄液中）」を表し、図２（３）「Anti‐A/PR8 HA IgG in serum」は、「抗‐PR8 HA IgG（血清中）」を表し、図２（４）「A/PR8 virus titer in lung wash」は、「肺洗浄液中のウイルス価」を表す。又、図２（５）「HI titers（HI価）」は、血中の抗体の中和の度合いを示す。
試験に供した、全てのキノコ（メシマコブ、カラカサタケモドキ、マイタケ、及びシイ
タケ）について、肺粘膜にＩｇＧ抗体の応答が認められた。すなわち、肺洗浄液中においても、又血清中においてもの抗−ＰＲ８ ＨＡ ＩｇＧ量は、顕著に増加した（図２の（２）及び（３）参照）。
以上の結果から、キノコの菌糸体の熱水抽出物には、強力なアジュバント効果があることが確認された。
【００２５】
（ロ）６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを、各群５匹ずつ用いた。
ウイルスＡタイプ株のワクチン（前記〔００２３〕の（１）−（２）−（ｂ））１μｇを、アジュバント（ＰＬ熱水抽出物）５μｇ（５μｌ）と共に、それぞれのマウスの鼻に５μｌ接種し、更に３週間後に、同量のワクチンを同様のアジュバントと共に経鼻接種した。
最終免疫（投与）の２週間後に、更に１００ｐｆｕのＡタイプ株、Ｂタイプ株、Ｃタイプ株（前記〔００２３〕の（１）−（ハ）−（ｂ），（ｃ），及び（ｄ））のウイルスを、片鼻に１．２μＬずつ注入し、ウイルス感染を行った。
感染３日後に鼻腔洗浄液、及び血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体及び血清中のＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡ法を用いて、また鼻腔洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイ法で測定した。
同様に、経鼻免疫したマウスに４０ＬＤ５０の致死量のＡタイプ株、Ｂタイプ株、Ｃタイプ株ウイルスを２０μＬ感染してその体重変化と生存を観察した。
【００２６】
測定結果を図５、及び図６に示す。
これらの結果は、ＰＬ熱水抽出物をアジュバントとして用いるワクチン投与は、ワクチン株と亜型の異なるウイルスに対しても感染防御、及び交叉防御能を発現させることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】キノコ菌糸体からその熱水抽出物を得る工程を示す図である。
【図２】実施例において試験したキノコ熱水抽出物のアジュバント効果を示すデータである。（１）ワクチン名とアジュバントの種類を示す。（２）肺洗浄液中の抗−ＰＲ８ ＨＡＩｇＧ量を示す（ｎｇ／ｍｌ）。（３）血清中の抗−ＰＲ８ ＨＡＩｇＧ量を示す（μｇ／ｍｌ）。（４）肺洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。（５）ＨＩ価（血中の抗体の中和の度合い）を示す。
【図３】体重変化を示す図である。
【図４】生存率を示す図である。
【図５】ＰＬ菌糸体の熱水抽出物の熱水抽出物のアジュバント効果を示すデータである。（１）鼻腔洗浄液中の抗−ＡタイプウイルスのＩｇＡ量を示す（Ｕ／ｍｌ）。（２）血清中の抗−ＡタイプウイルスのＩｇＧ量を示す（Ｕ／ｍｌ）。（３）Ａタイプ（ウイルス）の鼻腔洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。（４）Ｂタイプ（ウイルス）の鼻腔洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。（５）Ｃタイプ（ウイルス）の鼻腔洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。
【図６】生存率を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ（担子菌：Basidiomycota）菌糸体の熱水抽出物を含むウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント、及び
ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と前記アジュバントを含む分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤、並びに
前記アジュバントをウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であるワクチンと共に投与することにより、ウイルス又は病原菌に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体の産生を誘導させる方法
に関する（以下、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対する（の免疫原生を高める）アジュバントを、単にアジュバントともいう）。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ等の呼吸器感染症の防御には、粘膜より分泌される特異的ＩｇＡ抗体が非常に有効であることが知られている。特に型の異なるウイルスに対する交叉防御は、粘膜で分泌されるＩｇＡ抗体が主に担っており、インフルエンザウイルスに自然罹患した後に回復したヒトには、このＩｇＡ抗体が誘導されており、同亜型の変異型ウイルスの流行に対しても感染防御ができている。
【０００３】
一方、未感染の個体におけるウイルス又は病原菌からの感染を防御する方法として、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であるワクチンを接種し、意図的に抗体を誘導させる方法があり、そのようなものとしてインフルエンザワクチン、コレラワクチン、チフスワクチン、種痘ワクチン、ＢＣＧワクチン等などが知られている。
【０００４】
ところで、そのなかでもインフルエンザ、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）等の呼吸器疾患は、呼吸器官からの感染によるものであり、したがってそのワクチンの投与により呼吸器粘膜での免疫応答が求められている。しかしながら、現在用いられている皮下注射によるワクチンでは、粘膜免疫応答が得られず、交叉防御能を有する、より効果的なワクチンの開発が求められているのが現状である。特に、呼吸器粘膜における分泌型ＩｇＡ抗体の誘導方法として、鼻腔投与（経鼻投与）による鼻粘膜へ抗原を接種する方法があるが、抗原の接種のみでは十分な抗体応答がみられず、より効果的な免疫応答発現のためには、ワクチンと同時に投与するアジュバントが必要となる。
【０００５】
これまで、そのようなワクチンに対するアジュバント作用を有する物質が種々提案されてきており、例えば、最近では、イノシン酸とシチジル酸とからなるポリヌクレオチドコポリマーであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）にアジュバント作用があることが報告されている（非特許文献１、特許文献１）。
又、セラミック化ホッキ貝の粉末にアジュバント作用があることも報告されている（特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-1184 (2002)
【特許文献２】特開２００５−９７２６７
【特許文献３】特開２００５−３１４２７７
【０００７】
本発明者らは、従来から、より効果的なアジュバント作用を有する物質、特に、天然資源によるアジュバント作用物質の検討を行ってきたが、今回、キノコ（担子菌：Basidiomycota）の菌糸体の熱水抽出物に、顕著なアジュバント作用を認めた。
すなわち、本発明者らは、粘膜免疫誘導のためのアジュバントとして、キノコ菌糸体の熱水抽出物を用い、鼻腔粘膜でのＩｇＡ抗体分泌と血清中のＩｇＧ抗体応答と、致死量のインフルエンザウイルスに対する感染防御を検討した結果、良好な粘膜でのＩｇＡ抗体分泌と血清中のＩｇＧ抗体応答が得られ、さらに致死量のインフルエンザウイルスに対する感染防御効果が認められた。
そのうえ、その免疫応答はワクチン株と亜型の異なるウイルスに対する抗体誘導でもあり、またワクチン株と亜型の異なるウイルスに対する感染防御も認められ、交叉防御能を確認するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本願発明は、
（イ）キノコ菌糸体の熱水抽出物を含むウイルス又は病原菌由来の不活化抗原用アジュバント、
（ロ）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、そのアジュバントとしてキノコ菌糸体の熱水抽出物を含む分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤、
（ハ）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共に、キノコ菌糸体の熱水抽出物をアジュバントとして投与する、ウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法、
を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、下記の請求項により構成されている。
＜請求項１＞ キノコの菌糸体の熱水抽出物を主成分とすることを特徴とするウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
＜請求項２＞ キノコがメシマコブ（Phellinus linteus）、カラカサタケモドキ（Macrolepita gracilenta）、マイタケ（Grifola frondosa）、又はシイタケ（Lentinula edodes）である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
＜請求項３＞ ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
＜請求項４＞ ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、請求項１〜請求項３記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを含むことを特徴とする分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
＜請求項５＞ 呼吸器粘膜に投与する請求項４に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
＜請求項６＞ ウイルス又は病原菌が水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項４又は請求項５に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
＜請求項７＞ ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共に請求項１〜請求項３記載のアジュバントを投与することを特徴とするウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
＜請求項８＞ 呼吸器粘膜に投与する請求項７に記載のウイルス又は病原菌特異的分泌型ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
＜請求項９＞ ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項７に記載のウイルス、又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【００１０】
本願発明において、キノコとは担子菌（Basidiomycota）をいう。
【００１１】
本願発明において、重症急性呼吸器感染症候群ウイルスとは、ＳＡＲＳ（Severe Acute Respiratory Syndrome、コロナウイルスの一種）をいう。
【発明の効果】
【００１２】
（イ）本願発明が提供するアジュバントは、キノコ菌糸体から熱水抽出物として容易に製造することができる。
（ロ）本願発明が提供するアジュバントは、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原（ワクチン）と共に投与することにより、ウイルス又は病原菌に特異的な分泌型ＩｇＡ抗体の産生を多量に誘導させることができる。
（ハ）ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原（ワクチン）と、本願発明が提供するアジュバントを、感染疾患を予防する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤（アジュバント含有ワクチン）キットとして提供することができる。
（ニ）分泌型ＩｇＡ抗体は、外分泌液中の主要な免疫グロブリンであり、粘膜表面の感染防御に役立っている病原菌特異的ＩｇＡ抗体であって、唾液、鼻汁、腸、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多くみられ、また血清中にも存在する。
従って、本発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤は、このＩｇＡ抗体の産生を誘導することにより、ウイルス又は病原菌などの病原体による感染を防御することが可能となり、さらには感染予防のための分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤として提供することができる。
（ホ）ＰＬキノコの菌糸体の熱水抽出物をアジュバントとして用いるワクチン投与は、ワクチン株と亜型の異なるウイルスに対しても感染防御、及び交叉防御能を発現させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＊キノコの菌糸体の乾燥粉末の取得
大型タンク（１０００Ｌ）を用いて、炭素源としてグルコースを４．０％、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリぺプトンを各０．３％、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４を各０．０５％を含み、初発培地ｐＨ５．５の培養液に、各キノコの菌糸体を接種し、強制的に０．２２μｍフィルターを通した無菌空気を培地内へ通気し、温度２８℃で４５日間培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌糸体を凍結乾燥して各キノコの菌糸体の乾燥粉末を得た。
【００１４】
＊各キノコの菌糸体の熱水抽出物の取得
前記各キノコの菌糸体の乾燥粉末２０ｇに、イオン交換水１４０ｍｌを加え、１０５℃で６０分、熱水抽出処理を行ない、不溶物を除去して各キノコの菌糸体の熱水抽出物を得た。この熱水抽出物を４０℃以下で減圧濃縮し、熱水抽出物（固形分５％）を得た（図１参照）。
【００１５】
一方、本願発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤により、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントと共に投与されるワクチン（ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原）としては、身体中に接種されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子又は感染因子のある部分を含む抗原性懸濁液又は溶液である。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物（例えば、ウイルス又は細菌など）又は微生物から精製された天然の産生物、合成生成物又は遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖又は同様な産生物であってもよい。
【００１６】
例えば、生ワクチンとしては、具体的には、ＢＣＧ、種痘、ポリオ、はしか、風疹、おたふく風邪、牛痘、ＮＤＶ、マレック病などをあげることができる。また、不活化ワクチンとしては、百日咳、ジフテリア（トキソイド）、破傷風（トキソイド）、インフルエンザ（ＨＡ）、日本脳炎、リケッチアなどをあげることができる。
【００１７】
また、本発明にいう不活化抗原とは、感染能を失わせた抗原をいい、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、その翻訳後修飾体、ビリオン非構成タンパク質、その翻訳後修飾体、感染防御抗原、中和反応のエピトープなどを挙げられることができる。不活化は、例えば、物理的（例えば、Ｘ線照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素）操作により行うことができる。
【００１８】
本発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤の投与は、粘膜投与の形態により行うのが好ましい。脊椎動物における粘膜には、消化器、呼吸器、排出器、生殖器などの特に外通性の中腔器官の内壁が含まれる。したがって、本発明の好ましい投与形態である粘膜投与としては、例えば、鼻腔投与（経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与などをあげることができる。そのなかでも鼻腔内粘膜投与が好ましい。鼻腔は特に、インフルエンザウイルスなどによる呼吸器感染症疾患の感染経路の門戸であることから、粘膜投与により分泌型ＩｇＡ抗体反応を引き起こし、粘膜上皮細胞中に分泌型ＩｇＡ抗体を産生させることは、呼吸器感染症の防御に結びつくものである。
【００１９】
本発明の目的である分泌型ＩｇＡ抗体の産生が誘導され、免疫防御を発揮する対象としての病原体は、宿主に対して疾患又は障害を発生し得る微生物である。具体的には、ヒトに対する病原体としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌などをあげることができる。ウイルスはどのような種類のものでもよく、例えば、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスなどがあげることできる。より具体的には、例えば、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ＨＩＶウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。このようなウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスである。
【００２０】
また、本発明が対象とする細菌は、どのような細菌であってもよく、グラム陽性菌、グラム陰性菌があげられることができ、例えば、そのような細菌としては、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌及びコレラ菌などがあげられる。
【００２１】
本発明が提供する分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤の投与量は、投与する対象者の年齢、体重、投与方法により一概に限定し得ないが、通常成人１日当たり、経口投与の場合には、１０〜１０００ｍｇ程度であり、また粘膜投与、特に経鼻投与の場合には、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ程度である。
【００２２】
以下に本発明を、具体的実施(試験)例により説明する。
（１）供試材料
材料として、以下のものを使用した。
（イ）アジュバント（前記段落００１４により調整したキノコの菌糸体の熱水抽出物）
（ａ）メシマコブ（Phellinus linteus、ＰＬと表記）
（ｂ）カラカサタケモドキ（Macrolepita gracilenta、ＭＧＲと表記）
（ｃ）マイタケ（Grifola frondosa、ＧＦと表記）
（ｄ）シイタケ（Lentinula edodes、ＬＥと表記）
（ロ）マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
（ハ）ウイルス：（ａ）インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株（国立感染症研究所（東京）から入手）
：（ｂ）Ａタイプ株
：（ｃ）Ｂタイプ株（Ａタイプと同じ亜型内のグレードの異なる株）
：（ｄ）Ｃタイプ株
（ニ）ワクチン：（ａ）インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株
：（ｂ）前記ウイルスＡタイプ株のワクチン
（ホ）アジュバントのポジティブコントロールとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）
なお、「Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）」とは、ポリイノシン酸（ｐＩ）とポリシチジン酸（ｐＣ）とを含む二本鎖ＲＮＡをいう（特許文献２参照）。
【００２３】
（２）実施(試験)例
（イ）６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを、各群５匹ずつ用いた。ＰＲ８ ＨＡワクチン１μｇを、アジュバント（前記４種類のキノコ熱水抽出物、ＰＬ，ＭＧＲ，ＧＦ，ＬＥ）５μｇ（５μｌ）と共に、それぞれのマウスの鼻に５μｌ接種し、更に３週間後に、同量のワクチンを同様のアジュバントと共に経鼻接種し、最終免疫（投与）の２週間後に、更に１００ｐｆｕのＰＲ８ウイルス（前記〔００２３〕の（１）−（ハ）−（ａ））を、片鼻に１．２μｌずつ注入し、ウイルス感染を行った。
アジュバントのポジティブコントロールとして、Poly（I：C）５μｇ投与群、及び５μｇのＰＲ８ ＨＡワクチンのみの投与群をおいた。
感染３日後に肺洗浄液、及び血清を回収し、肺洗浄液中のＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡ法を用いて、また肺洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイ法で測定した。
同様に、経鼻免疫したマウスに４０ＬＤ５０の致死量のウイルスを２０μｌ感染してその体重変化と生存を観察した。
【００２４】
測定結果を図２、図３及び図４に示す。
図２（２）「Anti‐A/PR8 HA IgG in lung wash」は、「抗‐PR8 HA IgG（肺洗浄液中）」を表し、図２（３）「Anti‐A/PR8 HA IgG in serum」は、「抗‐PR8 HA IgG（血清中）」を表し、図２（４）「A/PR8 virus titer in lung wash」は、「肺洗浄液中のウイルス価」を表す。又、図２（５）「HI titers（HI価）」は、血中の抗体の中和の度合いを示す。
試験に供した、全てのキノコ（メシマコブ、カラカサタケモドキ、マイタケ、及びシイ
タケ）について、肺粘膜にＩｇＧ抗体の応答が認められた。すなわち、肺洗浄液中においても、又血清中においてもの抗−ＰＲ８ ＨＡ ＩｇＧ量は、顕著に増加した（図２の（２）及び（３）参照）。
以上の結果から、キノコの菌糸体の熱水抽出物には、強力なアジュバント効果があることが確認された。
【００２５】
（ロ）６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを、各群５匹ずつ用いた。
ウイルスＡタイプ株のワクチン（前記〔００２３〕の（１）−（２）−（ｂ））１μｇを、アジュバント（ＰＬ熱水抽出物）５μｇ（５μｌ）と共に、それぞれのマウスの鼻に５μｌ接種し、更に３週間後に、同量のワクチンを同様のアジュバントと共に経鼻接種した。
最終免疫（投与）の２週間後に、更に１００ｐｆｕのＡタイプ株、Ｂタイプ株、Ｃタイプ株（前記〔００２３〕の（１）−（ハ）−（ｂ），（ｃ），及び（ｄ））のウイルスを、片鼻に１．２μＬずつ注入し、ウイルス感染を行った。
感染３日後に鼻腔洗浄液、及び血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体及び血清中のＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡ法を用いて、また鼻腔洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイ法で測定した。
同様に、経鼻免疫したマウスに４０ＬＤ５０の致死量のＡタイプ株、Ｂタイプ株、Ｃタイプ株ウイルスを２０μＬ感染してその体重変化と生存を観察した。
【００２６】
測定結果を図５、及び図６に示す。
これらの結果は、ＰＬ熱水抽出物をアジュバントとして用いるワクチン投与は、ワクチン株と亜型の異なるウイルスに対しても感染防御、及び交叉防御能を発現させることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】キノコ菌糸体からその熱水抽出物を得る工程を示す図である。
【図２】実施例において試験したキノコ熱水抽出物のアジュバント効果を示すデータである。（１）ワクチン名とアジュバントの種類を示す。（２）肺洗浄液中の抗−ＰＲ８ ＨＡＩｇＧ量を示す（ｎｇ／ｍｌ）。（３）血清中の抗−ＰＲ８ ＨＡＩｇＧ量を示す（μｇ／ｍｌ）。（４）肺洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。（５）ＨＩ価（血中の抗体の中和の度合い）を示す。
【図３】体重変化を示す図である。
【図４】生存率を示す図である。
【図５】ＰＬ菌糸体の熱水抽出物の熱水抽出物のアジュバント効果を示すデータである。（１）鼻腔洗浄液中の抗−ＡタイプウイルスのＩｇＡ量を示す（Ｕ／ｍｌ）。（２）血清中の抗−ＡタイプウイルスのＩｇＧ量を示す（Ｕ／ｍｌ）。（３）Ａタイプ（ウイルス）の鼻腔洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。（４）Ｂタイプ（ウイルス）の鼻腔洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。（５）Ｃタイプ（ウイルス）の鼻腔洗浄液中のウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ；１０n）を示す。
【図６】生存率を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キノコの菌糸体の熱水抽出物を主成分とすることを特徴とするウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
【請求項２】
キノコがメシマコブ（Phellinus linteus）、カラカサタケモドキ（Macrolepita gracilenta）、マイタケ（Grifola frondosa）、又はシイタケ（Lentinula edodes）である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
【請求項３】
ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
【請求項４】
ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、請求項１〜請求項３記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを含むことを特徴とする分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
【請求項５】
呼吸器粘膜に投与する請求項４に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
【請求項６】
ウイルス又は病原菌が水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項４又は請求項５に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
【請求項７】
ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共に請求項１〜請求項３記載のアジュバントを投与することを特徴とするウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【請求項８】
呼吸器粘膜に投与する請求項７に記載のウイルス又は病原菌特異的分泌型ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【請求項９】
ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項７に記載のウイルス、又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【請求項１】
キノコの菌糸体の熱水抽出物を主成分とすることを特徴とするウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
【請求項２】
キノコがメシマコブ（Phellinus linteus）、カラカサタケモドキ（Macrolepita gracilenta）、マイタケ（Grifola frondosa）、又はシイタケ（Lentinula edodes）である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
【請求項３】
ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項１記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバント。
【請求項４】
ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、請求項１〜請求項３記載のウイルス又は病原菌由来の不活化抗原に対するアジュバントを含むことを特徴とする分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
【請求項５】
呼吸器粘膜に投与する請求項４に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
【請求項６】
ウイルス又は病原菌が水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項４又は請求項５に記載の分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤。
【請求項７】
ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共に請求項１〜請求項３記載のアジュバントを投与することを特徴とするウイルス又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【請求項８】
呼吸器粘膜に投与する請求項７に記載のウイルス又は病原菌特異的分泌型ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【請求項９】
ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群ウイルス又はＨＩＶウイルスであり、又病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌又はコレラ菌である請求項７に記載のウイルス、又は病原菌特異的ＩｇＡ抗体を誘導させる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２７３８４６（Ｐ２００８−２７３８４６Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１５７３９（Ｐ２００７−１１５７３９）
【出願日】平成１９年４月２５日（２００７．４．２５）
【出願人】（５００００３１７６）
【出願人】（５００００３１６５）
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２５日（２００７．４．２５）
【出願人】（５００００３１７６）
【出願人】（５００００３１６５）
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【Ｆターム（参考）】
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