ウイルス変種およびその検出方法
【課題】ヌクレオシドアナログ療法をモニターするためのアッセイ、および変異の影響をマスクしうる作用剤をスクリーニングするためのアッセイの開発などを行うための有効な手段を提供する。
【解決手段】特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種、より詳細には、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種；ならびにかかるウイルス変種を検出するためのアッセイ等。
【解決手段】特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種、より詳細には、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種；ならびにかかるウイルス変種を検出するためのアッセイ等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般的には、本発明は、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種に関する。より詳細には、本発明は、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種に指向される。さらに本発明は、かかるウイルス変種を検出するためのアッセイを企図し、該アッセイは抗ウイルス療法のモニタリングにおいて有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、衰弱性の疾病状態を引き起こす可能性があり、さらに急性肝不全を引き起こす可能性がある。ＨＢＶはＤＮＡウイルスであり、ＲＮＡ中間体を経て複製し、その複製方法において逆転写を用いる（非特許文献１参照）。ＨＢＶゲノムは複雑であり、表面、コア、ポリメラーゼおよびＸ遺伝子をコードしている読み枠と重複する部分的２本鎖ＤＮＡ構造を有する。ＨＢＶゲノムの複雑な性質を図１に示す。
【０００３】
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの存在はヌクレオシドアナログが有効な抗ウイルス剤として作用しうるという考えを導いた。現在試験されているヌクレオシドアナログの例はペンシクロビルおよびその経口形態であるファムシクロビル（非特許文献２〜５参照）ならびにラミブジン（非特許文献６、７参照）である。かかる作用剤が慢性ＨＢＶ感染の治療に使用される可能性がある。
【０００４】
最近、ペンシクロビルは、アヒルのＨＢＶ ＤＮＡ合成に対してインビトロで阻害活性を有することが示され、また、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ−逆転写酵素活性をインビトロで阻害することが示された（非特許文献８、９参照）。同様に、経口ファムシクロビルは、アヒルのＨＢＶウイルスの肝臓内複製をインビボにおいて阻害することが示されている（非特許文献１０参照）。ヒトにおいては、ファムシクロビルは、正所性肝臓異色（ＯＬＴ）後の重篤なＢ型肝炎患者におけるＨＢＶ ＤＮＡ複製を抑制することが示されている（非特許文献１１参照）。
【０００５】
本発明に至る研究において、ヌクレオシドアナログ抗ウイルス療法を用いて重篤なＯＬＴ後のＨＢＶ感染再発が抑制された（非特許文献１２参照）。患者が免疫抑制され、ＨＢＶ複製速度が非常に速い場合、長期治療が必須である。しかしながら、かかる状況下において、感染病原体に対する長期化学療法によくあることだが、使用治療剤に対する耐性または感受性の低下が起こる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Summers J, Mason W. Cell (1982) 29:403-415
【非特許文献２】Vere Hodge RA. Antiviral Chem Chemother. (1993) 4:67-84
【非特許文献３】Boyd MR, et al. Antiviral Chem Chemither. (1987) 32:358-363
【非特許文献４】Kruger T, et al. Hepatology (1994) 22:219A
【非特許文献５】Main J, et al. J. Viral Hepatitis (1996) 3:211-215
【非特許文献６】Scverini A, et al. Antimicrobial Agents Chemother (1995) 39:1430-1435
【非特許文献７】Dienstag JL, et al. New England J Med (1995) 333:1657-1661
【非特許文献８】Shaw T, et al. Antimicrobial Agents Chemother (1994) 38:719-723
【非特許文献９】Shaw T, et al. Hepatology (1996) 24: in press
【非特許文献１０】Tsiquaya KN, et al. J. Med Virol (1994) 42:306-310
【非特許文献１１】Boker KHW, et al. Transplantation (1994) 57:1706-1708
【非特許文献１２】Angus P, et al. J. Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ヌクレオシドアナログ療法をモニターするためのアッセイ、および変異の影響をマスクしうる作用剤をスクリーニングするためのアッセイの開発などを行うための有効な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ね、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種が提供される。より詳細には、本発明により、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種を提供することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種が提供される。より詳細には、本発明により、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種が提供される。さらに本発明により、かかるウイルス変種を検出するためのアッセイが提供され、該アッセイは抗ウイルス療法のモニタリングにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、部分２本鎖ＤＮＡ ＨＢＶゲノムをダイヤグラム的に示したものであり、表面（Ｓ）、コア（Ｃ）、ポリメラーゼ（Ｐ）およびＸ遺伝子をコードする重複した読み枠を示す。
【図２】図２は、移植患者における血清生化学的プロファイル（ＡＬＴ）およびウイルス学的プロファイル（ＨＢＶ ＤＮＡ）ならびに種々の抗ウイルス剤治療プログラム導入後の応答をグラフで示したものである。治療ＧＣＶ＋ＰＦＦ、ＧＣＶおよびＦＣＶ［Ｉ］およびＦＣＶ［ＩＩ］は実施例において詳細に説明されている。治療ＧＣＶ＋ＰＦＦはガンシクロビルおよびフォスカルネットの組み合わせ（Angus P, et al. J Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357）であり、治療ＧＣＶは非経口ガンシクロビル維持療法であり、治療ＦＣＶ［Ｉ］およびＦＣＶ［ＩＩ］はそれぞれ２５０ｍｇまたは５００ｍｇを１日２回投与する経口ファムシクロビル療法である。各治療日数をカッコ内に示す。ＡＬＴ（●−●）およびＨＢＶ ＤＮＡ（□−□）応答を、ＯＬＴ後６カ月における抗ウイルス療法開始からの時間に対してプロットしてある。配列分析の５つの鍵となる時間ポイント、すなわち治療前（ＰＲＥ−）、および抗ウイルス治療から８７、６００、８６および１３２９日後を示す。
【図３】図３は、ファムシクロビルでの治療前および治療後３７０日目（全抗ウイルス療法は８１６日行った）のＨＢＶ由来のアミノ酸、マーモット肝炎ウイルス（ＷＨＶ）由来、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のＤＮＡポリメラーゼ配列モチーフ、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＤＮＡポリメラーゼ（Poch O, et al. EMBO J. (1989) 8:3867-3874、Delarue M, et al. Protein Engineering (1990) 3:461-467）の比較可能領域のアミノ酸を並置比較したものである（配列番号：３１〜３５および５０〜５７）。ポリメラーゼモチーフ中の保存されたアスパラギン（Ｄ）およびグリシン（Ｇ）残基を太字で示し、ファムシクロビル治療後に見出されたアミノ酸変化を太字として下線を付して示す。ＨＢＶポリメラーゼ中の合致アミノ酸残基の位置を示す。ＨＳＶポリメラーゼ中の太字かつ下線を付したグリシン（Ｇ）残基はペンシクロビル治療中にシステイン（Ｃ）になる（Chiou HC, et al. Antiviral Chem Chemother (1995) 6:281-288）。
【図４】図４は、ＨＢＶのドメインＡからＥまでの保存された領域（下線部）を示す。ＹＭＤＤ中のＭはアミノ酸番号５５０である。＊はコンセンサス配列のこの位置において３つよりも多いアミノ酸の存在可能性を示す（配列番号：２９）。
【図５】図５は、ＨＢＶ由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ配列モチーフのアミノ酸並置比較を示し、ファムシクロビルおよび３ＴＣ存在下で選択されたアミノ酸変化を記載する（配列番号：３６〜４１および４５〜４９）。ＨＢＶコンセンサス配列はGenebank/Entrez中の公表配列に由来する。ポリメラーゼモチーフ中の保存されたアスパラギン（Ｄ）およびグリシン（Ｇ）残基を太字で示す。ファムシクロビル治療後に見出されたアミノ酸変化を緑の太字として下線を付し、３ＴＣ治療後に見出されたアミノ酸変化を青の太字として下線を付す。ファムシクロビル治療中に患者Ａおよび患者Ｂ、ならびにファムシクロビルに応答せず、後で３ＴＣで治療された患者Ｃから単離されたＨＢＶのアミノ酸配列を示す。その中から耐性変異を選択した。Lingら（１６）により検出された公表されている３ＴＣ治療後の変化を３ＴＣ １に示す。
【図６】図６は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列を示し、ポリメラーゼ中の変異Ｒ／Ｗ４９９Ｅならびに表面抗原中の変異Ｄ１４４ＥおよびＧ１４５Ｒを太字で示す。
【図７】図７は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の７／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図８】図８は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の８／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図９】図９は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の９／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の１０／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において多数引用される刊行物についての書誌学的な詳細を説明の終わりにまとめてある。明細書に記載されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列についての配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）は書誌学的な詳細の後に示してある。
【００１２】
本明細書全体にわたり、特記しないかぎり、用語「含む」、あるいは「含む」または「含んでいる」または「包含する」またはそれらの違った言い回しは、記載された要素または数または要素もしくは数の群を包含することを意味すると理解されるが、他の要素または数または要素もしくは数の群を除くものではない。この点において、特許請求の範囲の構築にあたり、１またはそれ以上の特徴がいずれかの請求項に付加された具体例は本発明の範囲内であるとみなされ、権利請求された本発明の必須の特徴はかかる具体例に包含されている。
【００１３】
本明細書において、アミノ酸配列における特定の変異を「Ｘａａ１ｎＸａａ２」と表し、Ｘａａ１は変異前の元のアミノ酸残基であり、ｎは残基番号であり、Ｘａａ２は変異アミノ酸である。略号「Ｘａａ」は３文字または１文字アミノ酸表記である。Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡポリメラーゼに関するアミノ酸残基を、モチーフＴｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｓｐ（ＹＭＤＤ）中のメチオニン残基を５５０番とすることにより番号付けする。先の出願であるオーストラリア特許出願第ＰＯ３５１９号（１９９６年８月１１日出願）においては当該メチオニン残基は５３０番となっていた。本明細書のＤＮＡポリメラーゼに関するアミノ酸残基は番号付けし直してある。
【００１４】
本発明によれば、本発明者らは、ヌクレオシドアナログに対するＨＢＶの感受性が様々な程度にまで低下した、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子における変異を有するＨＢＶ変種を同定した。これらのＨＢＶ変種の同定は、ヌクレオシドアナログ療法をモニターするためのアッセイ、および変異の影響をマスクしうる作用剤をスクリーニングするためのアッセイの開発にとり重要である。さらに、ＨＢＶゲノムは一連の重複した読み枠を含むので、１の読み枠におけるヌクレオチド変異は別の読み枠の翻訳産物に影響しうる。さらに本発明によれば、本発明者らは、抗体および免疫細胞のごとき免疫学的試薬のウイルス表面成分に対する相互作用活性を低下させる変異を観察した。本明細書において、存在している免疫学的記憶から潜在的に脱出するという点から、かかるウイルス変種を「エスケイプ変異株（escape mutants）」と称す。
【００１５】
したがって、本発明の１の態様は、ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種に指向され、該変種はＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異は該ＤＮＡポリメラーゼに対して少なくとも１のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせる。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種に指向され、該変種はウイルス表面成分をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異は該ウイルス表面成分に対して少なくとも１のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせる。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種に指向され、該変種は少なくとも２つの読み枠の重複部分におけるヌクレオチド変異を含み、該変異は読み枠の翻訳産物に対してアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせる。
【００１８】
好ましくは、ＤＮＡウイルスは肝炎ウイルスまたは関連ウイルスであり、最も好ましくはＨＢＶである。
【００１９】
本発明における「関連ウイルス」は、遺伝学的、免疫学的、伝染病学的および／または生化学的レベルにおいて関連するものである。
【００２０】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼにおける変異は、ヌクレオシドアナログに対するＨＢＶの感受性を低下させるものである。
【００２１】
好ましくは、ウイルス表面成分における変異は、ウイルス表面成分に対する抗体および免疫細胞のごとき免疫学的試薬の相互作用活性を低下させるものである。
【００２２】
最も好ましくは、ウイルス表面成分はウイルス表面抗原である。一般的には、ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用活性の低下は、ウイルス表面成分を認識または実質的に認識する免疫学的記憶の不存在を包含する。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、ウイルス変種は、ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原いずれかにおいてのみ変異を有していてもよく、あるいは両方の分子において変異を有していてもよい。用語「変異」は最も広い意味に解釈され、
ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原の正常な機能に実質的に影響しないサイレント変異を包含し、また、ヌクレオシドアナログ耐性またはエスケイプ変異株の表現型の誘導に影響する活性のある変異であってもよい。本発明により複数の変異が生じる場合、あるいは複数の表現型が単一の変異から生じる場合、少なくとも１の変異が活性を有するか、あるいはウイルスが少なくとも１の変化した表現型、例えばヌクレオシドアナログ耐性または表面抗原に対する免疫学的相互作用活性の低下を示す。
【００２４】
ＨＢＶポリメラーゼの領域は、他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ポリメラーゼとのアミノ酸類似性を示す（Poch O, et al. EMBO J. (1989) 8:3867-3874）。本明細書において、Pochら（Poch O, et al. EMBO J. (1989) 8:3867-3874）によりドメインＢおよびＣと定義されている保存された領域について言及が行われる。
【００２５】
好ましくは、変異は、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはそれらに近い領域におけるアミノ酸配列の変化を引き起こすものである。本発明はＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＣドメインのＹＭＤＤモチーフのみにおける変異は包含しないが、別の位置における１またはそれ以上の変異と組み合わされて生じる場合には、かかる変異は本発明により企図されるものである。
【００２６】
好ましくは、ウイルス表面成分における変異は、蛋白の主要親水性領域中、詳細にはＨＢＶウイルス表面抗原のアミノ酸配列１１８〜１６９、あるいは蛋白の外部表面上のアミノ酸配列１６９〜２０７由来の領域における１またはそれ以上のアミノ酸残基におけるものである。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異を含むＨＢＶ変種であって、該変異がＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはそれらに近い領域におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種が提供される。ただし、該変異はＣドメイン中のＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではなく、該変種はヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す。
【００２８】
本発明のもう１つの好ましい態様は、ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含むＨＢＶ変種であって、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用活性の低下を示す変種を企図し、該変異はＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに近い領域に対応する領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである。
【００２９】
本発明のさらにもう１つの好ましい態様は、ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含むＨＢＶ変種であって、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の低下した相互作用性を示す変種に関し、該変異はＨＢＶのアミノ酸１１８から１６９まで、あるいは１６９から２０７までにより画定される領域または機能的に等価な領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである。
【００３０】
本発明のさらにもう１つの態様は、ゲノム中の重複した読み枠における変異を含むＨＢＶ変種に指向され、該変異はＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメインにおけるものであり、ＣドメインのＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではない。また、該変異は、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９まで、あるいは１６９から２０７までに対応する重複領域または等価な領域におけるものであり、該変種は、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示し、ＨＢＶ表面抗原に特異的な免疫学的試薬に対する低下した相互作用活性を示す。
【００３１】
変異により表面抗原上のＢおよび／またはＴ細胞エピトープが変化してしまっているため、ウイルス曝露前またはワクチン投与後のＨＢＶに対する抗体または他の免疫学的応答がもはやウイルス表面成分を標的とするには有効でないので、免疫学的試薬に対する低下した相互作用活性を示すウイルス変種はエスケイプ変異株である。
【００３２】
本発明により企図されるヌクレオシドアナログは、ペンシクロビルおよびその経口形態ファムシクロビルならびにラミブジン（３ＴＣ）を包含する。異なる変種が異なるヌクレオシドアナログに耐性であるかもしれない。例えば、１の具体例において、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインにおける変種はファムシクロビルに耐性であるかもしれず、Ｃドメインにおける変種は３ＴＣに耐性であるかもしれない。
【００３３】
ＢドメインはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基５０５から５２９までを含むと考えられる。この配列を以下に示す：
（配列番号：２４）
【００３４】
Ｂドメインという場合、当該ドメインの両側約２０アミノ酸までを包含する近接領域を含むものとする。好ましくは、変異は下記のアミノ酸の１つまたはそれ以上におけるものである：
（配列番号：２５）
【００３５】
Ｃドメインは下記のアミノ酸５４６から５５６までを含む：
（配列番号：２６）
【００３６】
これはＹＭＤＤ（配列番号：３０）ドメインを含み、その中のメチオニン残基は残基番号５５０（以前は残基番号５３０）である。本明細書における残基番号付けは新しい番号付けによるものであり、ＹＭＤＤのメチオニンは５５０である。
【００３７】
Ｃドメインという場合、当該ドメインの両側約２０アミノ酸までを包含する近接領域を含むものとする。
【００３８】
用語「耐性」は最も一般的な意味において用いられ、ヌクレオシドアナログに対する完全または不完全な耐性ならびに低下した感受性を包含する。
【００３９】
好ましくは、変種は天然の体液から少なくとも１の精製工程を経るようにして単離される。別法として、変種を単離体液中に維持してもよく、あるいはＤＮＡ形態であってもよい。また本発明は、変種ＨＢＶ由来のゲノムまたはその一部を含む感染性分子クローンを企図する。
【００４０】
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼにおける好ましい変異は、Ａｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ５３０Ｓｅｒ、Ｉｌｅ５０９Ｖａｌ、Ｐｈｅ５１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ５２３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５２６Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５３３Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５５０Ｖａｌ／Ｉｌｅおよび／またはＳｅｒ５５９Ｔｈｒのうちの１つまたはそれ以上の変異を包含する。ＨＢＶ表面抗原における好ましい変異は、Ａｓｐ１４４Ｇｌｕおよび／またはＧｌｙ１４５Ａｒｇのうちの１つまたはそれ以上を包含する。これらはＤＮＡポリメラーゼの位置４９８および４９９にそれぞれ対応する。より好ましくは、変種は２つまたはそれ以上の上記変異を含む。
【００４１】
１の特定の変異ＨＢＶは配列番号：１７に示すヌクレオチド配列を有し、ＤＮＡポリメラーゼをヌクレオシドアナログに対して耐性にし、多表現型変異を示すものである。ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との相互作用活性を減じるように変化した表面抗原を示す。変異は、ＤＮＡポリメラーゼ読み枠におけるＲ／Ｗ４９９Ｅならびに表面抗原におけるＤ１４４ＥおよびＧ１４５Ｒである。これは、配列番号：１７のヌクレオチド番号２２６および２２７におけるＧおよびＡへの二重変異により生じる。ＨＢＶのポリメラーゼ蛋白は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＤＮＡポリメラーゼにも類似している（並置比較については図３参照）。ＨＳＶポリメラーゼにおける変異（Ｇｌｙ８４１Ｃｙｓ）がファムシクロビル存在下において選択された（Chiou HC, et al. Antiviral Chem Chemother (1995) 6:281-288）。
【００４２】
本発明は、配列番号：１７に示すヌクレオチド配列ならびにそれに対して少なくとも６０％の類似性を有するヌクレオチド配列（ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列における二重変異を担持している）を包含する。したがって、本発明は、配列番号：１７に示すヌクレオチド配列を有するＨＢＶあるいは単一または複数のヌクレオチド付加、置換および／または欠失を有するその誘導体（例えば、配列番号：１７に対して少なくとも６０％の類似性を有するヌクレオチド配列）に指向される。誘導体は、配列番号：１７の一部分、フラグメント、部分および相同体を包含する。本発明のこの態様は、４２℃における低い厳密性の条件下において配列番号：１７にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列も包含する。
【００４３】
４２℃における低い厳密性とは、少なくとも約１体積％ないし少なくとも約１５体積％のホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍないし少なくとも約２Ｍの塩（ハイブリダイゼーション時）、および少なくとも約１Ｍないし少なくとも約２Ｍの塩（洗浄時）を包含するものである。必要ならば、培地の厳密さのごとき別の厳密さの条件を用いてもよく、その厳密さの条件は、少なくとも約１６体積％ないし少なくとも約３０体積％のホルムアミドおよび少なくとも約０.５Ｍないし少なくとも約０.９Ｍの塩（ハイブリダイゼーション時）、および少なくとも約０.５Ｍないし少なくとも約０.９Ｍの塩（洗浄時）包含するものであり、あるいはまた、高い厳密さの条件（少なくとも約３１重量％ないし少なくとも約５０重量％のホルムアミドおよび少なくとも約０.０１Ｍないし少なくとも約０.１５Ｍの塩（ハイブリダイゼーション時）、および少なくとも約０.０１Ｍないし少なくとも約０.１５Ｍの塩（洗浄時））を用いてもよい。
【００４４】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性および野生型ＨＢＶ表面抗原に対する抗体に対する低下した相互作用活性を示す変種ＨＢＶを企図し、該ＨＢＶ変種は以下の特徴の１つまたはそれ以上により特徴づけられる：
（ｉ）配列番号：１７に示すゲノムのヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも６０％の類似性を有する配列；
（ｉｉ）４２℃における低い厳密さの条件下において配列番号：１７にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＢＶ表面抗原の読み枠の重複部分における変異；および
（ｉｖ）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメイン、および
ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９まであるいは１６９から２０７までに対応する領域における変異。
【００４５】
本発明のもう１つの態様によれば、下記アミノ酸配列：
（配列番号：２７）
（配列番号：２８）
［式中、Ｘ１はＳまたはＡ；
Ｘ２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む変種ＨＢＶであって、ファムシクロビル（ペンシクロビル）および／またはラミブジン
（３ＴＣ）のごときヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す変種が提供される。
【００４６】
本発明のもう１つの具体例は、下記アミノ酸配列：
［式中、Ｘ１６はＱまたはＫ；
Ｘ１７はＹまたはＦ；
Ｘ１８はＧ；
Ｘ１９はＲまたはＷまたはＥ；
Ｘ２０はＹまたはＬ；
Ｘ２１はＳまたはＡ；
Ｘ２２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼに対応する表面抗原のアミノ酸残基番号１１８から１６９まであるいは１６０から２０７までに対する少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を有する表面抗原をコードするヌクレオチド配列を含む変種ＨＢＶに指向され、該変種は、該表面抗原に対する、抗体のごとき免疫学的試薬との低下した相互作用活性を示す。
【００４７】
好ましい変種の例は図４に示すアミノ酸配列を含む。特に好ましい変異配列の例を図６（配列番号：１７）に示す。
【００４８】
本発明変種の同定は、かかる変種を検出するための広範囲のアッセイを可能にする。かかる変種の検出は、耐性変種を同定して適当な形態の化学療法を決定し、そして／あるいはワクチン投与プロトコールをモニターすることにおいて重要でありうる。
【００４９】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法を企図し、該方法は、ＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを該ＨＢＶから単離し、ついで、該ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインまたはＣドメインまたはそれらに近い領域中に少なくとも１のアミノ酸置換、欠失および／または付加を生じさせる、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関してスクリーニングを行うことを含み、かかる変異の存在が該ヌクレオシドアナログに対する耐性の可能性を示すものである。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との低下した相互作用活性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法を提供し、該方法は、該ＨＢＶからＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを単離し、該表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までまたは該表面領域中のそれらに近い領域における少なくとも１のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を生じさせる、ＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチド配列中の変異についてスクリーニングすることを含み、かかる変異の存在が該変異した表面抗原に対する該抗体の相互作用活性低下の可能性を示すものである。
【００５１】
好ましくは、アッセイは、Ｇｌｕ／Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ置換および／またはＬｅｕ５２６Ｍｅｔ置換および／またはＰｒｏ５２３Ｌｅｕ置換および／またはＳｅｒ５５９Ｔｈｒ置換、および／またはＡｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ置換を生じさせる変異を決定するものである。
【００５２】
ＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡをアッセイしてもよく、別法として、ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原を変異についてスクリーニングしてもよい。
【００５３】
本発明による検出は核酸に基づく検出であってもよく、例えば、核酸ハイブリダイゼーション法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であってもよい。さらに本発明は、上記核酸に基づく検出手段の異なるアッセイフォーマットの使用も包含し、かかるフォーマットとしては、特に、制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）、増幅フラグメント長多型性（ＡＦＬＰ）、１本鎖多型性（ＳＳＣＰ）、増幅およびミスマッチ検出（ＡＭＤ）、散在繰り返し配列ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＲＳ−ＰＣＲ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等が挙られる。
【００５４】
本発明は、変種ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原を検出するための免疫学を基礎にした広範囲のアッセイを包含する。これらのアッセイは、変種ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原と相互作用しないかまたは実質的に相互作用しない、天然に存在するＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原に指向された抗体に基づくものである。別法として、天然に存在するＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原と相互作用しないかまたは実質的に相互作用しない、変種ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原に対する抗体を用いてもよい。
【００５５】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いてもよいが、大量かつ均一な形態で得られるので、モノクローナル抗体が好ましい。米国特許第４０１６０４３号、第４４２４２７９号および第４０１８６５３号に記載されたような種々のイムノアッセイ法が利用可能である。
【００５６】
便利には、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸変種の検出を、図４に示すコンセンサスアミノ酸配列を対照とすることにより行う。示される多型性は、活性のある病原性ＨＢＶ株に関する種々のデータベースに示される変化を示すものである。ＨＢＶ変種が示されたアミノ酸の相異を含む場合、かかる単離体は、変化したＤＮＡポリメラーゼ活性を有する推定上のＨＢＶであるとみなされる。
【００５７】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ＨＢＶが変種ＤＮＡポリメラーゼをコードしているかどうかを調べる方法を企図し、該方法は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を直接的に、あるいはヌクレオチド配列を介して決定し、ついで、それを下記のアミノ酸配列：
【化１】
と比較することを含み、コンセンサス配列とは異なるアミノ酸の存在が推定上のＨＢＶ変種を示すものとなる。
【００５８】
さらに本発明は、ヌクレオシドアナログ耐性ＨＢＶ変異をマスクする作用剤を企図する。かかる作用剤はヌクレオシドアナログによる長期治療において有用であろう。作用剤はＤＮＡまたはＲＮＡまたは蛋白性または非蛋白性化学分子であってよい。マスキング作用剤の潜在的に有用な源として、植物、サンゴ類および微生物のごとき天然産物のスクリーニングも企図される。作用剤は単離形態または違約組成物形態であってよく、ヌクレオシドアナログに次いで、あるいは同時に投与してもよい。
【００５９】
本発明は変種ＨＢＶアッセイ用のキットを包含する。かかるキットは、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ハイブリダイゼーション法のための試薬あるいは免疫学を基礎とする検出法のための試薬を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明は、以下を提供する。
（１）ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、ＤＮＡポリメラーゼまたはその一部をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異がＤＮＡポリメラーゼに対する少なくとも１個のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（２）ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、表面成分またはその一部をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異が表面成分に対する少なくとも１個のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（３）ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、少なくとも２つの読み枠の重複部分におけるヌクレオチド変異を含み、該変異が２つの読み枠の翻訳産物に対するアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（４）該ＤＮＡウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である上記（１）または（２）または（３）記載の変種；
（５）アミノ酸変異がＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに存在する上記（１）または（３）記載の変種；
（６）アミノ酸変異がＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに対応している上記（２）または（３）記載の変種；
（７）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの配列：
中の１個またはそれ以上のアミノ酸における変異を含む上記（１）または（３）記載の変種；
（８）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの配列：
中の１個またはそれ以上のアミノ酸における変異を含む上記（７）記載の変種；
（９）下記アミノ酸配列：
［式中、Ｘ１はＳまたはＡ；
Ｘ２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む変種であって、ファムシクロビル（ペンシクロビル）および／またはラミブジン（３ＴＣ）のごときヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す変種；
（１０）ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までまたは１６９から２０７までの１個またはそれ以上のアミノ酸における変異を有する、上記（２）または（３）記載の変種；
（１１）下記アミノ酸配列：
［式中、Ｘ１６はＱまたはＫ；
Ｘ１７はＹまたはＦ；
Ｘ１８はＧ；
Ｘ１９はＲまたはＷまたはＥ；
Ｘ２０はＹまたはＬ；
Ｘ２１はＳまたはＡ；
Ｘ２２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼを含み、ファムシクロビル（ペンシクロビル）および／またはラミブジン（３ＴＣ）のごときヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す上記（１０）記載の変種；
（１２）Ｉｌｅ５０９Ｖａｌ、Ｐｈｅ５１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ５２３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５２６Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５３３Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５５０Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ５５９Ｔｈｒ、Ａｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ５３０Ｓｅｒから選択される上記（１）または（２）または（３）記載の変種；
（１３）ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異を含み、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示すＨＢＶ変種であって、該変異がＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはそれらに近い領域におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものであり、さらに該変異がＣドメイン中のＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではない変種；
（１４）ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含み、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用活性の低下を示すＨＢＶ変種であって、該変異がＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに近い領域に対応する領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（１５）ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含み、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の低下した相互作用性を示すＨＢＶ変種であって、該変異はＨＢＶのアミノ酸１１８から１６９まで、および／または１６９から２０７までにより画定される領域または機能的に等価な領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（１６）ゲノム中の重複した読み枠における変異を含み、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示し、ＨＢＶ表面抗原に特異的な免疫学的試薬に対する低下した相互作用活性を示すＨＢＶ変種であって、該変異がＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメインにおけるものであり、ＣドメインのＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではなく、さらに該変異がＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までに対応する重複領域または等価な領域におけるものである変種；
（１７）配列番号：１７に示すヌクレオチド配列を有するＨＢＶ、あるいは単一または複数のヌクレオチド付加、置換および／または欠失を有するその誘導体（例えば、配列番号：１７に対して少なくとも６０％の類似性を有するヌクレオチド配列）；
（１８）ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性および野生型ＨＢＶ表面抗原に対する抗体に対する低下した相互作用活性を示す変種ＨＢＶであって、以下の特徴：
（ｉ）配列番号：１７に示すゲノムのヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも６０％の類似性を有する配列；
（ｉｉ）４２℃における低い厳密さの条件下において配列番号：１７にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＢＶ表面抗原の読み枠の重複部分における変異；および
（ｉｖ）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメインにおける変異、およびＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までに対応する領域における変異
の１つまたはそれ以上により特徴づけられる変種ＨＢＶ；
（１９）ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法であって、ＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを該ＨＢＶから単離し、ついで、該ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインまたはＣドメインまたはそれらに近い領域中に少なくとも１のアミノ酸置換、欠失および／または付加を生じさせる、
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関してスクリーニングを行うことを含み、かかる変異の存在が該ヌクレオシドアナログに対する耐性の可能性を示すものである方法；
（２０）ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との低下した相互作用活性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法であって、該ＨＢＶからＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを単離し、該表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までまたは該表面領域中のそれらに近い領域における少なくとも１のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を生じさせる、ＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチド配列中の変異についてスクリーニングすることを含み、かかる変異の存在が該変異した表面抗原に対する該抗体の相互作用活性低下の可能性を示すものである方法；
（２１）アッセイが、Ｉｌｅ５０９Ｖａｌ、Ｐｈｅ５１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ５２３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５２６Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５３３Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５５０Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ５５９Ｔｈｒ、Ａｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ５３０Ｓｅｒから選択される変異を検出するものである、上記（１９）または（２０）記載の方法；および
（２２）ＨＢＶが変種ＤＮＡポリメラーゼをコードしているかどうかを調べる方法をであって、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を直接的に、あるいはヌクレオチド配列を介して決定し、ついで、それを下記のアミノ酸配列：
と比較することを含み、コンセンサス配列とは異なるアミノ酸の存在が推定上のＨＢＶ変種を示すものとなる方法。
【００６１】
さらに本発明は、以下の非限定的な図面および実施例により説明される。
【実施例１】
【００６２】
症例の研究
１.患者Ａ
本発明者らは、肝臓移植後ほぼ４年間にわたりＨＢＶ感染再発に対する抗ウイルス療法を受けた患者からの一連の単離体由来のＨＢＶポリメラーゼおよびＸ読み枠を配列決定した（図２）。
患者（４２歳の男性）は慢性ＨＢＶ感染による末期肝不全であったため移植を受けた。移植後の最初の治療コースは著しいものではなく、５カ月までに感染再発の証拠および非常に高レベルの油複製および肝機能の悪化が見られた（Angus P, et al. J Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357）。ＯＬＴから約６カ月後に抗ウイルス治療を開始した。最初は、患者は静脈経路（ｉｖ）でガンシクロビル（ＧＣＶ；１０ｍｇ／ｋｇ／日）をｉｖフォスカルネト（ＰＦＦ；５０〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日；腎機能に応じた用量）と組み合わせて投与された。これは図２のＧＣＶ＋ＰＦＦ治療であり、８６日間継続された。抗ウイルス治療の８７日目に、１週間に３回ｉｖＧＣＶ（３.３〜６.７ｍｇ／ｋｇ／日）を開始した（図２のＧＣＶ）。治療４４６日目に経口ファムシクロビル（２５０ｍｇ，１日２回）を開始し（図２のＦＣＶ［Ｉ］）、５００日目に１日２回、５００ｍｇにまで増量した（図２のＦＣＶ［ＩＩ］）。現在患者はこの治療規則を継続している。ファムシクロビル治療以前のこの患者の臨床的およびウイルス学的詳細はすでに報告されている（Angus P, et al. J Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357）。
血清試料を日常的に収集し、−７０℃で保存した。これらの試料を研究目的で使用するためにインフォームドコンセントを患者から受けた。図２は、抗ウイルス治療の全コースにわたるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびＨＢＶ ＤＮＡレベルを示す。さらなる研究のための５つの試料はほぼ４年間をカバーする。
【００６３】
２.患者Ｂ
患者Ｂは、最初の肝臓移植から１４カ月後にプレ−コア変異株（pre-core mutant）に関連したＨＢＶ関連アログラフ損失（allograph loss）のため、再移植を受けた。ＧＣＶ（７.５ｍｇ／ｋｇ／日）での抗ウイルス治療を１０カ月受け、その後中止された。次いで、経口ファムシクロビル治療（１日３回、５００ｍｇ）を受けた。
移植後、ＦＣＶ治療８５０日目に患者Ｂの血清ＨＢＶ試料から得た全ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を配列決定した。移植前のＦＣＶ治療前の血清試料から得た血清試料ＨＢＶポリメラーゼ触媒ドメインを含む領域を配列決定した。
【００６４】
３.患者Ｃ
この患者はファムシクロビルに応答せず、後でラミブジン（３ＴＣ）で治療され（６、７）、耐性変異が選択された。
【００６５】
４.患者Ｄ
この患者はファムシクロビルで治療され、耐性変異が選択される。
【実施例２】
【００６６】
血清中のウイルスマーカー
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｂｓＡｇ）、Ｂｅ型肝炎抗原（ＨｂｅＡｇ）、抗ＨＢｅ、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨｂｃＡｇ）特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ、Ａ型肝炎特異的ＩｇＭ、デルタ肝炎抗原および抗体、ならびに抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体を、市販イムノアッセイ（Abbot Laboratories, North Chicago, IL）を用いて測定した。ＨＢＶマーカーのみが陽性であった。製造者（Digene Diagnostics Inc., Beltsville, MD）の指示に従ってキャプチャハイブリダイゼーションアッセイ（capture hybridisation assay）を用いてＢ型肝炎ウイルスＤＮＡレベルを測定し、定量した。この患者はＯＬＴ前にプレ−コアＨＢＶ変異株に感染し（１２）、この状態はＯＬＴ後も変わらなかった。
【実施例３】
【００６７】
ＨＢＶ ＤＮＡの配列決定およびクローニング
１.血清からのＤＮＡ抽出：
血清５０μｌを、１５０μｌのＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）、１％ ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌプロナーゼと混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルムによりＤＮＡを脱蛋白し、イソプロパノールで沈殿させ、２５μｌのヌクレアーゼ不含水に溶解した。
【００６８】
２.ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるウイルスポリメラーゼ遺伝子およびＸ遺伝子の増幅：
Bresatec, Adelaide, Australiaによりオリゴヌクレオチドが合成された。ポリメラーゼ遺伝子の増幅には、センスプライマーは５’−ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＣＴ ＣＣ−３’［配列番号：１］（ヌクレオチド（ｎｔ）−４０から−２１まで）であり、アンチセンスプライマーは５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＡ−３’［配列番号：２］（ｎｔ ２３８１から２８４７まで）であった。Ｘ遺伝子の増幅には、センスプライマーは５’−ＣＣＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＣＧＴ ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＣ−３’［配列番号：３］（ｎｔ ２０５５から２０７４まで）であり、アンチセンスプライマーは５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＡ−３’［配列番号：４］（ｎｔ ２８３１から２８４７まで）であった。すべてのヌクレオチドはポリメラーゼ遺伝子の最初から番号付けされている。５μｌの鋳型抽出ＤＮＡ、１.５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT）、１μｍｏｌ／Ｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、２００μｍｏｌ／Ｌの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、３.５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）および０.０１％ ｗ／ｖのゼラチンを用いて各反応を行った。変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）および伸長（７２℃、１.５分）を４０サイクル行い、ついで、７分の最終伸長を行うことにより増幅を行った（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT）。１.５％ ／アガロースによるゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色後にＵＶ照射を行うことによりＰＣＲ生成物を分析した。
【００６９】
３.ＨＢＶ ＤＮＡのポリメラーゼ遺伝子およびＸ遺伝子の配列決定：
特異的に増幅された生成物をGeneclean II（Bio 101 Inc., La Jolla, CA）を用いて精製し、Sequence version 2.0（United States Biochemical Corp., Cleveland,OH）を用いて直接配列決定した。ＰＣＲプライマーを配列決定プライマーとして用い、さらに内部プライマーを合成してＰＣＲ生成物の内部領域を配列決定した。下記の内部プライマーおよび配列決定プライマーを用いた。５’−ＧＣＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＡＴ−３’［配列番号：５］（ｎｔ１０４〜１２６）、５’−ＧＧＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＴＡ ＡＣＣ ＴＴＡ ＣＣ−３’［配列番号：６］（ｎｔ３４１〜３６０）、５’−ＧＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＴＡ−３’［配列番号：７］（ｎｔ４９６−５１８）、５’−ＴＧＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣＴ−３’［配列番号：８］（ｎｔ７３１〜７５１）、５’−ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＣ−３’［配列番号：９］（ｎｔ８７９〜８９９）、５’−ＡＡＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＧＴＣ ＣＣＣ ＡＡＣ−３’［配列番号：１０］（ｎｔ１１８３〜１１９５）、５’−ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ ＣＴＧ Ｔ−３’［配列番号：１１］（ｎｔ１４２９〜１４４７）、５’−ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＴＴ ＧＧＧ ＴＡＴ−３’［配列番号：１２］（ｎｔ１６８３〜１７０３）、５’−ＣＣＡ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＴＴＴ ＣＴＧ−３’［配列番号：１３］（ｎｔ１９７８〜１９９９）、５’−ＣＡＴ ＣＧＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＡＧ ＧＣ−３’［配列番号：１４］（ｎｔ２２３９〜２２６２）。
【００７０】
４.ｐＵＣ１８中へのＨＢＶポリメラーゼ遺伝子のクローニング：
試料中のＨＢＶ ＤＮＡが少量であるため、クローニング前に、プライマー５’−ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ ＣＴＧ Ｔ−３’［配列番号：１５］（ｎｔ１４２９〜１４４７）および５’−ＡＴＡ ＣＣＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ−３’［配列番号：１６］（ｎｔ１７０３〜１６８３）を用いてＨＢＶポリメラーゼ遺伝子のｎｔ１４２９〜１７０３を含む領域を増幅した。Geneclean IIを用いてＤＮＡを精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いて、ＳｍａＩ消化され脱リン酸化されたｐＵＣ１８プラスミド（Pharmacia Biotech, NJ）中に連結した。上記のごとくクローンを直接配列決定した。
【実施例４】
【００７１】
ＤＮＡポリメラーゼアッセイ
血清試料（１００μｌ）をＴＮＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）中の２０％ ｗ／ｖクッションにアプライし、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ Ｌ８超遠心機中でＳＷ４１ローターを用いて、１０℃において３時間、２０００００ｇで遠心分離した。１.５％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１００ｍｍｏｌＫＣｌおよび０.０１％ ｖ／ｖ２−メルカプトエタノールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５にペレットを再懸濁し、４℃で一晩放置した。本質的にはPriceら（Ling R, et al. Hepatology (1996) 24:711-713）により記載されたようにして、少量の懸濁液を内在性ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイした。２０μｌの部分精製ＨＢＶおよび（最終濃度）３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、３０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、各１０μｍｏｌ／ＬのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、および０.０１μＭの［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Dupont NEN, Boston, MA）を含有する全体積３０μｌ中において各アッセイを行った。ペンシクロビル三リン酸（ＰＣＶ−ＴＰ）感受性を試験するために、過剰（１００μｍｏｌ／Ｌ）のペンシクロビル三リン酸を各ペアーのアッセイの一方に添加して、各試料につき１ペアーのアッセイを行った。３７℃で２時間後、各反応混合物から２０μｌを取り、前以て１０％ ｗ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に浸しておいた２５ｍｍ径のガラス繊維ディスク（Advantex, Tokyo, Japan）にスポットすることにより反応を停止させた。ディスクを乾燥させ、次いで、１０ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム含有１０％ ｗ／ｖ ＴＣＡで洗浄した。最後に、洗浄したディスクを無水エタノールですすぎ、風乾し、放射活性を測定した。ＰＣＶ−ＴＰによるＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害を、対照と比較した場合のＰＣＶ−ＴＰ含有アッセイ混合物中の活性の相違％値として表した。試料の量が限られていたため、酵素活性の標準化または繰り返しアッセイは不可能であった。アッセイ固有のばらつきにもかかわらず、ＰＣＶ−ＴＰに対するＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの感受性の、時間に関連した全般的な低下が明らかであった（表１参照）。
【実施例５】
【００７２】
抗ウイルス療法の効果
抗ウイルス治療ＧＣＶ＋ＰＦＦの開始により、８７日目にはＯＴＬ後のＨＢＶ ＤＮＡレベルは１０００００ｐｇ／ｍｌ以上から１０８００ｐｇ／ｍｌにまで低下した（図２）。ウイルス血症のこの低下は臨床的、生化学的および組織学的改善と関連していた（１２）。ファムシクロビル療法（処置ＧＣＶ）の継続により、３５９日間にわたりＨＢＶ ＤＮＡレベルは２つのピークを伴って変動した。４４６日目の経口ファムシクロビルへの切り替えは、ＨＢＶ ＤＮＡレベルの上昇にも関連していた。このことは、治療の成功というよりはむしろ不十分な投与の結果であった可能性がある（図２のＦＣＶ［Ｉ］）。１日５００ｍｇに用量を増加させた後、ＨＢＶ ＤＮＡが減少した。しかしながら、ＨＢＶ ＤＮＡレベルは時間とともに除々に上昇し、６００日目（ファムシクロビル治療１５４日目）に３０００ｐｇ／ｍｌであったのが８１６日目（ファムシクロビル治療３７０日目）には８８００ｐｇ／ｍｌとなり、１３０２日目（ファムシクロビル治療８５６日目）には２９０００ｐｇ／ｍｌのピークとなり、その後１３２９日目（ファムシクロビル治療８８３日目）には１２０００ｐｇ／ｍｌ付近で安定した。８１６日目から１３２９日目までの治療期間におけるＤＮＡレベルについてのStudent検定により、統計学的に有為な上昇が明らかとなった。同時期に１.５ないし２倍のＡＬＴレベルの上昇があり（図２）、臨床的状態には変化がなかった。
【実施例６】
【００７３】
ヌクレオチド変化
ＨＢＶのＸ遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子を５つの時点（図２）で配列決定した。ほぼ４年間の抗ウイルス療法において、Ｘ遺伝子については治療前の配列に対して変化がなかった。しかしながら、８１６日目および１３２９日目の試料からのポリメラーゼ遺伝子において５個のヌクレオチドの変化が検出された（表１）。これらの変化は別個のＰＣＲにおいて検出され、さらにそのうえ、両鎖の配列決定により変異が検出されたので、ＰＣＲにより生じたエラーの結果である可能性はない。ポリメラーゼ遺伝子におけるヌクレオチド変化は、はじめは治療８１６日後に検出され、その時点で患者はファムシクロビルで３７０日間治療を受けていた。しかしながら、位置１４９８および１５１９における２つのヌクレオチド変化のみが、それぞれＶａｌ５１９−ＬｅｕおよびＬｅｕ５２６−Ｍｅｔのアミノ酸変化を引き起こした。これら２つのヌクレオチド変化は同時に出現した。８１６日目に、異なるヌクレオチド（Ｃ、Ｇ、Ｔ）が位置１４９８において検出された（それらはすべてＶａｌからＬｅｕへの変化を引き起こした）。治療から１３２９日目に、位置１４９８においてチミジンが優勢種となった。治療から８２６および１３２９日目のアミノ酸変化は、ＰＣＶ−ＴＰに対する血清ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの感受性低下と一致していた（表１）。これらのヌクレオチドは、ＯＬＴ後にＨＢＶ感染再発している、ＦＣＶ治療を受けていない６人の患者において見られた。
【００７４】
１３２９日目の試料から、アミノ酸変化を生じさせたヌクレオチド変異を含む領域をクローン化し、配列決定した。３つの亜種が検出された。７５％（２０個のうち１５個）のクローンは１４９８および１５１９における両変異を含んでおり、それらは同時に生じていた。治療前の配列が２０個のうち３個のクローンにおいて検出された。位置５２３のプロリンをロイシンに変化させるヌクレオチド１５１１におけるさらなる変異が２０個のうち２個のクローンにおいて検出された。この変異は２つの主要変異（１４９８（Ｖａｌ５１９−Ｌｅｕ）および１５１９（Ｌｅｕ５２６−Ｍｅｔ））と一緒には検出されず、さらに直接ＰＣＲによっても検出されず、おそらく低頻度であることが示された。６００日目（ＦＣＶ治療１５０日目）の試料からのウイルスＤＮＡもクローン化し、配列決定した。しかしながら、治療前の配列のみが検出された。
【実施例７】
【００７５】
患者Ｂ、ＣおよびＤにおけるヌクレオチド変化
患者ＢおよびＣから単離されたＨＢＶにおけるアミノ酸変化を図５に示し、患者Ｄから単離されたＨＢＶにおけるアミノ酸変化を図６に示す。図５において、患者Ａは図３に示した患者と同一患者である。患者Ｂは長期のファムシクロビル治療（８５０日以上）を受けていた。ファムシクロビル治療期間中に選択されたアミノ酸変化を、ＨＢＶ（患者Ｂ）として図５に示す。患者Ｃはファムシクロビルに応答せず、後で３ＴＣ（ラミブジン［６、７］）で治療された。ＦＣＶ治療期間中に患者Ｃから単離されたＨＢＶを、ＨＢＶ（患者Ｃ−ＦＣＶ）として示す。３ＴＣでの治療期間中に発生したすべての３ＴＣ耐性変異をＨＢＶ（患者Ｃ−３ＴＣ）として示す。配列分析により、ＨＢＶポリメラーゼのＣドメイン近くに変異（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ置換）が示されたが、最初はＹＭＤＤモチーフ中には変異は検出されなかった。Ｔｈｒ−Ｓｅｒ置換を含むＨＢＶが単離されてから３２日目（治療後３３３日目）に、ＹＭＤＤモチーフにおけるＭｅｔ５５０からＩｌｅへの変異が検出された。
【実施例８】
【００７６】
エスケイプ変異株
上記方法を用いて、ＨＢＶ変種をエスケイプ変異についてスクリーニングした。これらは、ＨＢＶ表面抗原のごとき表面成分における変異であり、抗体または他の免疫学的試薬に対する表面成分の相互作用活性を低下させる。ＨＢＶゲノムの重複した読み枠があると、単一の変異が複数の表現型に影響しうる。例えば、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ中の変異はＨＢＶ表面抗原に対しても影響しうる。
ＨＢＶ表面抗原中の好ましい変異はアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までにおける例えばＤ１４４ＥまたはＧ１４５Ｒのごときものである。これらに対応するＤＮＡポリメラーゼの変異はＲ／Ｗ４９９Ｅである。
特に好ましいエスケイプ変異株およびヌクレオシドアナログ耐性変異株は、ＤＮＡポリメラーゼおよび表面抗原のアミノ酸配列に対応する、図６に示すヌクレオチド配列を有する。
【００７７】
当業者は、本明細書記載された以外の本発明のバリエーションおよび修飾物もありうることを理解するであろう。本発明はすべてのかかるバリエーションおよび修飾物を包含することが理解されよう。また本発明は、本明細書において個々に、またはまとめて言及し、または示したすべての工程、特徴、組成物および化合物、ならびに２つまたはそれ以上の該工程または特徴のすべての組み合わせを包含する。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種が提供される。より詳細には、本発明により、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種が提供される。本発明により、かかるウイルス変種を検出するためのアッセイが提供され、該アッセイは抗ウイルス療法のモニタリングにおいて有用である。したがって、本発明は、ウイルス性疾患の診断薬および診断キット、ウイルス性疾患のモニタリング用試薬およびキットなどの製造分野ならびにかかる試薬およびキットを用いる研究および医療関連分野において利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
一般的には、本発明は、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種に関する。より詳細には、本発明は、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種に指向される。さらに本発明は、かかるウイルス変種を検出するためのアッセイを企図し、該アッセイは抗ウイルス療法のモニタリングにおいて有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、衰弱性の疾病状態を引き起こす可能性があり、さらに急性肝不全を引き起こす可能性がある。ＨＢＶはＤＮＡウイルスであり、ＲＮＡ中間体を経て複製し、その複製方法において逆転写を用いる（非特許文献１参照）。ＨＢＶゲノムは複雑であり、表面、コア、ポリメラーゼおよびＸ遺伝子をコードしている読み枠と重複する部分的２本鎖ＤＮＡ構造を有する。ＨＢＶゲノムの複雑な性質を図１に示す。
【０００３】
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの存在はヌクレオシドアナログが有効な抗ウイルス剤として作用しうるという考えを導いた。現在試験されているヌクレオシドアナログの例はペンシクロビルおよびその経口形態であるファムシクロビル（非特許文献２〜５参照）ならびにラミブジン（非特許文献６、７参照）である。かかる作用剤が慢性ＨＢＶ感染の治療に使用される可能性がある。
【０００４】
最近、ペンシクロビルは、アヒルのＨＢＶ ＤＮＡ合成に対してインビトロで阻害活性を有することが示され、また、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ−逆転写酵素活性をインビトロで阻害することが示された（非特許文献８、９参照）。同様に、経口ファムシクロビルは、アヒルのＨＢＶウイルスの肝臓内複製をインビボにおいて阻害することが示されている（非特許文献１０参照）。ヒトにおいては、ファムシクロビルは、正所性肝臓異色（ＯＬＴ）後の重篤なＢ型肝炎患者におけるＨＢＶ ＤＮＡ複製を抑制することが示されている（非特許文献１１参照）。
【０００５】
本発明に至る研究において、ヌクレオシドアナログ抗ウイルス療法を用いて重篤なＯＬＴ後のＨＢＶ感染再発が抑制された（非特許文献１２参照）。患者が免疫抑制され、ＨＢＶ複製速度が非常に速い場合、長期治療が必須である。しかしながら、かかる状況下において、感染病原体に対する長期化学療法によくあることだが、使用治療剤に対する耐性または感受性の低下が起こる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Summers J, Mason W. Cell (1982) 29:403-415
【非特許文献２】Vere Hodge RA. Antiviral Chem Chemother. (1993) 4:67-84
【非特許文献３】Boyd MR, et al. Antiviral Chem Chemither. (1987) 32:358-363
【非特許文献４】Kruger T, et al. Hepatology (1994) 22:219A
【非特許文献５】Main J, et al. J. Viral Hepatitis (1996) 3:211-215
【非特許文献６】Scverini A, et al. Antimicrobial Agents Chemother (1995) 39:1430-1435
【非特許文献７】Dienstag JL, et al. New England J Med (1995) 333:1657-1661
【非特許文献８】Shaw T, et al. Antimicrobial Agents Chemother (1994) 38:719-723
【非特許文献９】Shaw T, et al. Hepatology (1996) 24: in press
【非特許文献１０】Tsiquaya KN, et al. J. Med Virol (1994) 42:306-310
【非特許文献１１】Boker KHW, et al. Transplantation (1994) 57:1706-1708
【非特許文献１２】Angus P, et al. J. Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ヌクレオシドアナログ療法をモニターするためのアッセイ、および変異の影響をマスクしうる作用剤をスクリーニングするためのアッセイの開発などを行うための有効な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ね、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種が提供される。より詳細には、本発明により、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種を提供することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種が提供される。より詳細には、本発明により、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種が提供される。さらに本発明により、かかるウイルス変種を検出するためのアッセイが提供され、該アッセイは抗ウイルス療法のモニタリングにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、部分２本鎖ＤＮＡ ＨＢＶゲノムをダイヤグラム的に示したものであり、表面（Ｓ）、コア（Ｃ）、ポリメラーゼ（Ｐ）およびＸ遺伝子をコードする重複した読み枠を示す。
【図２】図２は、移植患者における血清生化学的プロファイル（ＡＬＴ）およびウイルス学的プロファイル（ＨＢＶ ＤＮＡ）ならびに種々の抗ウイルス剤治療プログラム導入後の応答をグラフで示したものである。治療ＧＣＶ＋ＰＦＦ、ＧＣＶおよびＦＣＶ［Ｉ］およびＦＣＶ［ＩＩ］は実施例において詳細に説明されている。治療ＧＣＶ＋ＰＦＦはガンシクロビルおよびフォスカルネットの組み合わせ（Angus P, et al. J Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357）であり、治療ＧＣＶは非経口ガンシクロビル維持療法であり、治療ＦＣＶ［Ｉ］およびＦＣＶ［ＩＩ］はそれぞれ２５０ｍｇまたは５００ｍｇを１日２回投与する経口ファムシクロビル療法である。各治療日数をカッコ内に示す。ＡＬＴ（●−●）およびＨＢＶ ＤＮＡ（□−□）応答を、ＯＬＴ後６カ月における抗ウイルス療法開始からの時間に対してプロットしてある。配列分析の５つの鍵となる時間ポイント、すなわち治療前（ＰＲＥ−）、および抗ウイルス治療から８７、６００、８６および１３２９日後を示す。
【図３】図３は、ファムシクロビルでの治療前および治療後３７０日目（全抗ウイルス療法は８１６日行った）のＨＢＶ由来のアミノ酸、マーモット肝炎ウイルス（ＷＨＶ）由来、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のＤＮＡポリメラーゼ配列モチーフ、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＤＮＡポリメラーゼ（Poch O, et al. EMBO J. (1989) 8:3867-3874、Delarue M, et al. Protein Engineering (1990) 3:461-467）の比較可能領域のアミノ酸を並置比較したものである（配列番号：３１〜３５および５０〜５７）。ポリメラーゼモチーフ中の保存されたアスパラギン（Ｄ）およびグリシン（Ｇ）残基を太字で示し、ファムシクロビル治療後に見出されたアミノ酸変化を太字として下線を付して示す。ＨＢＶポリメラーゼ中の合致アミノ酸残基の位置を示す。ＨＳＶポリメラーゼ中の太字かつ下線を付したグリシン（Ｇ）残基はペンシクロビル治療中にシステイン（Ｃ）になる（Chiou HC, et al. Antiviral Chem Chemother (1995) 6:281-288）。
【図４】図４は、ＨＢＶのドメインＡからＥまでの保存された領域（下線部）を示す。ＹＭＤＤ中のＭはアミノ酸番号５５０である。＊はコンセンサス配列のこの位置において３つよりも多いアミノ酸の存在可能性を示す（配列番号：２９）。
【図５】図５は、ＨＢＶ由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ配列モチーフのアミノ酸並置比較を示し、ファムシクロビルおよび３ＴＣ存在下で選択されたアミノ酸変化を記載する（配列番号：３６〜４１および４５〜４９）。ＨＢＶコンセンサス配列はGenebank/Entrez中の公表配列に由来する。ポリメラーゼモチーフ中の保存されたアスパラギン（Ｄ）およびグリシン（Ｇ）残基を太字で示す。ファムシクロビル治療後に見出されたアミノ酸変化を緑の太字として下線を付し、３ＴＣ治療後に見出されたアミノ酸変化を青の太字として下線を付す。ファムシクロビル治療中に患者Ａおよび患者Ｂ、ならびにファムシクロビルに応答せず、後で３ＴＣで治療された患者Ｃから単離されたＨＢＶのアミノ酸配列を示す。その中から耐性変異を選択した。Lingら（１６）により検出された公表されている３ＴＣ治療後の変化を３ＴＣ １に示す。
【図６】図６は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列を示し、ポリメラーゼ中の変異Ｒ／Ｗ４９９Ｅならびに表面抗原中の変異Ｄ１４４ＥおよびＧ１４５Ｒを太字で示す。
【図７】図７は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の７／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図８】図８は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の８／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図９】図９は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の９／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、ＨＶＢ ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＶＢ表面抗原に関する、ＨＢＶ変種のヌクレオチド配列および対応アミノ酸配列であって、図６の１０／１０の位置に記載されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において多数引用される刊行物についての書誌学的な詳細を説明の終わりにまとめてある。明細書に記載されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列についての配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）は書誌学的な詳細の後に示してある。
【００１２】
本明細書全体にわたり、特記しないかぎり、用語「含む」、あるいは「含む」または「含んでいる」または「包含する」またはそれらの違った言い回しは、記載された要素または数または要素もしくは数の群を包含することを意味すると理解されるが、他の要素または数または要素もしくは数の群を除くものではない。この点において、特許請求の範囲の構築にあたり、１またはそれ以上の特徴がいずれかの請求項に付加された具体例は本発明の範囲内であるとみなされ、権利請求された本発明の必須の特徴はかかる具体例に包含されている。
【００１３】
本明細書において、アミノ酸配列における特定の変異を「Ｘａａ１ｎＸａａ２」と表し、Ｘａａ１は変異前の元のアミノ酸残基であり、ｎは残基番号であり、Ｘａａ２は変異アミノ酸である。略号「Ｘａａ」は３文字または１文字アミノ酸表記である。Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡポリメラーゼに関するアミノ酸残基を、モチーフＴｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｓｐ（ＹＭＤＤ）中のメチオニン残基を５５０番とすることにより番号付けする。先の出願であるオーストラリア特許出願第ＰＯ３５１９号（１９９６年８月１１日出願）においては当該メチオニン残基は５３０番となっていた。本明細書のＤＮＡポリメラーゼに関するアミノ酸残基は番号付けし直してある。
【００１４】
本発明によれば、本発明者らは、ヌクレオシドアナログに対するＨＢＶの感受性が様々な程度にまで低下した、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子における変異を有するＨＢＶ変種を同定した。これらのＨＢＶ変種の同定は、ヌクレオシドアナログ療法をモニターするためのアッセイ、および変異の影響をマスクしうる作用剤をスクリーニングするためのアッセイの開発にとり重要である。さらに、ＨＢＶゲノムは一連の重複した読み枠を含むので、１の読み枠におけるヌクレオチド変異は別の読み枠の翻訳産物に影響しうる。さらに本発明によれば、本発明者らは、抗体および免疫細胞のごとき免疫学的試薬のウイルス表面成分に対する相互作用活性を低下させる変異を観察した。本明細書において、存在している免疫学的記憶から潜在的に脱出するという点から、かかるウイルス変種を「エスケイプ変異株（escape mutants）」と称す。
【００１５】
したがって、本発明の１の態様は、ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種に指向され、該変種はＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異は該ＤＮＡポリメラーゼに対して少なくとも１のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせる。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種に指向され、該変種はウイルス表面成分をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異は該ウイルス表面成分に対して少なくとも１のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせる。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種に指向され、該変種は少なくとも２つの読み枠の重複部分におけるヌクレオチド変異を含み、該変異は読み枠の翻訳産物に対してアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせる。
【００１８】
好ましくは、ＤＮＡウイルスは肝炎ウイルスまたは関連ウイルスであり、最も好ましくはＨＢＶである。
【００１９】
本発明における「関連ウイルス」は、遺伝学的、免疫学的、伝染病学的および／または生化学的レベルにおいて関連するものである。
【００２０】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼにおける変異は、ヌクレオシドアナログに対するＨＢＶの感受性を低下させるものである。
【００２１】
好ましくは、ウイルス表面成分における変異は、ウイルス表面成分に対する抗体および免疫細胞のごとき免疫学的試薬の相互作用活性を低下させるものである。
【００２２】
最も好ましくは、ウイルス表面成分はウイルス表面抗原である。一般的には、ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用活性の低下は、ウイルス表面成分を認識または実質的に認識する免疫学的記憶の不存在を包含する。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、ウイルス変種は、ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原いずれかにおいてのみ変異を有していてもよく、あるいは両方の分子において変異を有していてもよい。用語「変異」は最も広い意味に解釈され、
ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原の正常な機能に実質的に影響しないサイレント変異を包含し、また、ヌクレオシドアナログ耐性またはエスケイプ変異株の表現型の誘導に影響する活性のある変異であってもよい。本発明により複数の変異が生じる場合、あるいは複数の表現型が単一の変異から生じる場合、少なくとも１の変異が活性を有するか、あるいはウイルスが少なくとも１の変化した表現型、例えばヌクレオシドアナログ耐性または表面抗原に対する免疫学的相互作用活性の低下を示す。
【００２４】
ＨＢＶポリメラーゼの領域は、他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ポリメラーゼとのアミノ酸類似性を示す（Poch O, et al. EMBO J. (1989) 8:3867-3874）。本明細書において、Pochら（Poch O, et al. EMBO J. (1989) 8:3867-3874）によりドメインＢおよびＣと定義されている保存された領域について言及が行われる。
【００２５】
好ましくは、変異は、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはそれらに近い領域におけるアミノ酸配列の変化を引き起こすものである。本発明はＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＣドメインのＹＭＤＤモチーフのみにおける変異は包含しないが、別の位置における１またはそれ以上の変異と組み合わされて生じる場合には、かかる変異は本発明により企図されるものである。
【００２６】
好ましくは、ウイルス表面成分における変異は、蛋白の主要親水性領域中、詳細にはＨＢＶウイルス表面抗原のアミノ酸配列１１８〜１６９、あるいは蛋白の外部表面上のアミノ酸配列１６９〜２０７由来の領域における１またはそれ以上のアミノ酸残基におけるものである。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異を含むＨＢＶ変種であって、該変異がＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはそれらに近い領域におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種が提供される。ただし、該変異はＣドメイン中のＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではなく、該変種はヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す。
【００２８】
本発明のもう１つの好ましい態様は、ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含むＨＢＶ変種であって、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用活性の低下を示す変種を企図し、該変異はＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに近い領域に対応する領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである。
【００２９】
本発明のさらにもう１つの好ましい態様は、ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含むＨＢＶ変種であって、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の低下した相互作用性を示す変種に関し、該変異はＨＢＶのアミノ酸１１８から１６９まで、あるいは１６９から２０７までにより画定される領域または機能的に等価な領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである。
【００３０】
本発明のさらにもう１つの態様は、ゲノム中の重複した読み枠における変異を含むＨＢＶ変種に指向され、該変異はＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメインにおけるものであり、ＣドメインのＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではない。また、該変異は、ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９まで、あるいは１６９から２０７までに対応する重複領域または等価な領域におけるものであり、該変種は、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示し、ＨＢＶ表面抗原に特異的な免疫学的試薬に対する低下した相互作用活性を示す。
【００３１】
変異により表面抗原上のＢおよび／またはＴ細胞エピトープが変化してしまっているため、ウイルス曝露前またはワクチン投与後のＨＢＶに対する抗体または他の免疫学的応答がもはやウイルス表面成分を標的とするには有効でないので、免疫学的試薬に対する低下した相互作用活性を示すウイルス変種はエスケイプ変異株である。
【００３２】
本発明により企図されるヌクレオシドアナログは、ペンシクロビルおよびその経口形態ファムシクロビルならびにラミブジン（３ＴＣ）を包含する。異なる変種が異なるヌクレオシドアナログに耐性であるかもしれない。例えば、１の具体例において、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインにおける変種はファムシクロビルに耐性であるかもしれず、Ｃドメインにおける変種は３ＴＣに耐性であるかもしれない。
【００３３】
ＢドメインはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基５０５から５２９までを含むと考えられる。この配列を以下に示す：
（配列番号：２４）
【００３４】
Ｂドメインという場合、当該ドメインの両側約２０アミノ酸までを包含する近接領域を含むものとする。好ましくは、変異は下記のアミノ酸の１つまたはそれ以上におけるものである：
（配列番号：２５）
【００３５】
Ｃドメインは下記のアミノ酸５４６から５５６までを含む：
（配列番号：２６）
【００３６】
これはＹＭＤＤ（配列番号：３０）ドメインを含み、その中のメチオニン残基は残基番号５５０（以前は残基番号５３０）である。本明細書における残基番号付けは新しい番号付けによるものであり、ＹＭＤＤのメチオニンは５５０である。
【００３７】
Ｃドメインという場合、当該ドメインの両側約２０アミノ酸までを包含する近接領域を含むものとする。
【００３８】
用語「耐性」は最も一般的な意味において用いられ、ヌクレオシドアナログに対する完全または不完全な耐性ならびに低下した感受性を包含する。
【００３９】
好ましくは、変種は天然の体液から少なくとも１の精製工程を経るようにして単離される。別法として、変種を単離体液中に維持してもよく、あるいはＤＮＡ形態であってもよい。また本発明は、変種ＨＢＶ由来のゲノムまたはその一部を含む感染性分子クローンを企図する。
【００４０】
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼにおける好ましい変異は、Ａｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ５３０Ｓｅｒ、Ｉｌｅ５０９Ｖａｌ、Ｐｈｅ５１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ５２３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５２６Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５３３Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５５０Ｖａｌ／Ｉｌｅおよび／またはＳｅｒ５５９Ｔｈｒのうちの１つまたはそれ以上の変異を包含する。ＨＢＶ表面抗原における好ましい変異は、Ａｓｐ１４４Ｇｌｕおよび／またはＧｌｙ１４５Ａｒｇのうちの１つまたはそれ以上を包含する。これらはＤＮＡポリメラーゼの位置４９８および４９９にそれぞれ対応する。より好ましくは、変種は２つまたはそれ以上の上記変異を含む。
【００４１】
１の特定の変異ＨＢＶは配列番号：１７に示すヌクレオチド配列を有し、ＤＮＡポリメラーゼをヌクレオシドアナログに対して耐性にし、多表現型変異を示すものである。ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との相互作用活性を減じるように変化した表面抗原を示す。変異は、ＤＮＡポリメラーゼ読み枠におけるＲ／Ｗ４９９Ｅならびに表面抗原におけるＤ１４４ＥおよびＧ１４５Ｒである。これは、配列番号：１７のヌクレオチド番号２２６および２２７におけるＧおよびＡへの二重変異により生じる。ＨＢＶのポリメラーゼ蛋白は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＤＮＡポリメラーゼにも類似している（並置比較については図３参照）。ＨＳＶポリメラーゼにおける変異（Ｇｌｙ８４１Ｃｙｓ）がファムシクロビル存在下において選択された（Chiou HC, et al. Antiviral Chem Chemother (1995) 6:281-288）。
【００４２】
本発明は、配列番号：１７に示すヌクレオチド配列ならびにそれに対して少なくとも６０％の類似性を有するヌクレオチド配列（ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＢＶ表面抗原のアミノ酸配列における二重変異を担持している）を包含する。したがって、本発明は、配列番号：１７に示すヌクレオチド配列を有するＨＢＶあるいは単一または複数のヌクレオチド付加、置換および／または欠失を有するその誘導体（例えば、配列番号：１７に対して少なくとも６０％の類似性を有するヌクレオチド配列）に指向される。誘導体は、配列番号：１７の一部分、フラグメント、部分および相同体を包含する。本発明のこの態様は、４２℃における低い厳密性の条件下において配列番号：１７にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列も包含する。
【００４３】
４２℃における低い厳密性とは、少なくとも約１体積％ないし少なくとも約１５体積％のホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍないし少なくとも約２Ｍの塩（ハイブリダイゼーション時）、および少なくとも約１Ｍないし少なくとも約２Ｍの塩（洗浄時）を包含するものである。必要ならば、培地の厳密さのごとき別の厳密さの条件を用いてもよく、その厳密さの条件は、少なくとも約１６体積％ないし少なくとも約３０体積％のホルムアミドおよび少なくとも約０.５Ｍないし少なくとも約０.９Ｍの塩（ハイブリダイゼーション時）、および少なくとも約０.５Ｍないし少なくとも約０.９Ｍの塩（洗浄時）包含するものであり、あるいはまた、高い厳密さの条件（少なくとも約３１重量％ないし少なくとも約５０重量％のホルムアミドおよび少なくとも約０.０１Ｍないし少なくとも約０.１５Ｍの塩（ハイブリダイゼーション時）、および少なくとも約０.０１Ｍないし少なくとも約０.１５Ｍの塩（洗浄時））を用いてもよい。
【００４４】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性および野生型ＨＢＶ表面抗原に対する抗体に対する低下した相互作用活性を示す変種ＨＢＶを企図し、該ＨＢＶ変種は以下の特徴の１つまたはそれ以上により特徴づけられる：
（ｉ）配列番号：１７に示すゲノムのヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも６０％の類似性を有する配列；
（ｉｉ）４２℃における低い厳密さの条件下において配列番号：１７にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＢＶ表面抗原の読み枠の重複部分における変異；および
（ｉｖ）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメイン、および
ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９まであるいは１６９から２０７までに対応する領域における変異。
【００４５】
本発明のもう１つの態様によれば、下記アミノ酸配列：
（配列番号：２７）
（配列番号：２８）
［式中、Ｘ１はＳまたはＡ；
Ｘ２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む変種ＨＢＶであって、ファムシクロビル（ペンシクロビル）および／またはラミブジン
（３ＴＣ）のごときヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す変種が提供される。
【００４６】
本発明のもう１つの具体例は、下記アミノ酸配列：
［式中、Ｘ１６はＱまたはＫ；
Ｘ１７はＹまたはＦ；
Ｘ１８はＧ；
Ｘ１９はＲまたはＷまたはＥ；
Ｘ２０はＹまたはＬ；
Ｘ２１はＳまたはＡ；
Ｘ２２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼに対応する表面抗原のアミノ酸残基番号１１８から１６９まであるいは１６０から２０７までに対する少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を有する表面抗原をコードするヌクレオチド配列を含む変種ＨＢＶに指向され、該変種は、該表面抗原に対する、抗体のごとき免疫学的試薬との低下した相互作用活性を示す。
【００４７】
好ましい変種の例は図４に示すアミノ酸配列を含む。特に好ましい変異配列の例を図６（配列番号：１７）に示す。
【００４８】
本発明変種の同定は、かかる変種を検出するための広範囲のアッセイを可能にする。かかる変種の検出は、耐性変種を同定して適当な形態の化学療法を決定し、そして／あるいはワクチン投与プロトコールをモニターすることにおいて重要でありうる。
【００４９】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法を企図し、該方法は、ＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを該ＨＢＶから単離し、ついで、該ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインまたはＣドメインまたはそれらに近い領域中に少なくとも１のアミノ酸置換、欠失および／または付加を生じさせる、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関してスクリーニングを行うことを含み、かかる変異の存在が該ヌクレオシドアナログに対する耐性の可能性を示すものである。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との低下した相互作用活性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法を提供し、該方法は、該ＨＢＶからＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを単離し、該表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までまたは該表面領域中のそれらに近い領域における少なくとも１のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を生じさせる、ＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチド配列中の変異についてスクリーニングすることを含み、かかる変異の存在が該変異した表面抗原に対する該抗体の相互作用活性低下の可能性を示すものである。
【００５１】
好ましくは、アッセイは、Ｇｌｕ／Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ置換および／またはＬｅｕ５２６Ｍｅｔ置換および／またはＰｒｏ５２３Ｌｅｕ置換および／またはＳｅｒ５５９Ｔｈｒ置換、および／またはＡｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ置換を生じさせる変異を決定するものである。
【００５２】
ＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡをアッセイしてもよく、別法として、ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原を変異についてスクリーニングしてもよい。
【００５３】
本発明による検出は核酸に基づく検出であってもよく、例えば、核酸ハイブリダイゼーション法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であってもよい。さらに本発明は、上記核酸に基づく検出手段の異なるアッセイフォーマットの使用も包含し、かかるフォーマットとしては、特に、制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）、増幅フラグメント長多型性（ＡＦＬＰ）、１本鎖多型性（ＳＳＣＰ）、増幅およびミスマッチ検出（ＡＭＤ）、散在繰り返し配列ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＲＳ−ＰＣＲ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等が挙られる。
【００５４】
本発明は、変種ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原を検出するための免疫学を基礎にした広範囲のアッセイを包含する。これらのアッセイは、変種ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原と相互作用しないかまたは実質的に相互作用しない、天然に存在するＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原に指向された抗体に基づくものである。別法として、天然に存在するＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原と相互作用しないかまたは実質的に相互作用しない、変種ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼまたは表面抗原に対する抗体を用いてもよい。
【００５５】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いてもよいが、大量かつ均一な形態で得られるので、モノクローナル抗体が好ましい。米国特許第４０１６０４３号、第４４２４２７９号および第４０１８６５３号に記載されたような種々のイムノアッセイ法が利用可能である。
【００５６】
便利には、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸変種の検出を、図４に示すコンセンサスアミノ酸配列を対照とすることにより行う。示される多型性は、活性のある病原性ＨＢＶ株に関する種々のデータベースに示される変化を示すものである。ＨＢＶ変種が示されたアミノ酸の相異を含む場合、かかる単離体は、変化したＤＮＡポリメラーゼ活性を有する推定上のＨＢＶであるとみなされる。
【００５７】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ＨＢＶが変種ＤＮＡポリメラーゼをコードしているかどうかを調べる方法を企図し、該方法は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を直接的に、あるいはヌクレオチド配列を介して決定し、ついで、それを下記のアミノ酸配列：
【化１】
と比較することを含み、コンセンサス配列とは異なるアミノ酸の存在が推定上のＨＢＶ変種を示すものとなる。
【００５８】
さらに本発明は、ヌクレオシドアナログ耐性ＨＢＶ変異をマスクする作用剤を企図する。かかる作用剤はヌクレオシドアナログによる長期治療において有用であろう。作用剤はＤＮＡまたはＲＮＡまたは蛋白性または非蛋白性化学分子であってよい。マスキング作用剤の潜在的に有用な源として、植物、サンゴ類および微生物のごとき天然産物のスクリーニングも企図される。作用剤は単離形態または違約組成物形態であってよく、ヌクレオシドアナログに次いで、あるいは同時に投与してもよい。
【００５９】
本発明は変種ＨＢＶアッセイ用のキットを包含する。かかるキットは、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ハイブリダイゼーション法のための試薬あるいは免疫学を基礎とする検出法のための試薬を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明は、以下を提供する。
（１）ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、ＤＮＡポリメラーゼまたはその一部をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異がＤＮＡポリメラーゼに対する少なくとも１個のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（２）ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、表面成分またはその一部をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異が表面成分に対する少なくとも１個のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（３）ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、少なくとも２つの読み枠の重複部分におけるヌクレオチド変異を含み、該変異が２つの読み枠の翻訳産物に対するアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（４）該ＤＮＡウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である上記（１）または（２）または（３）記載の変種；
（５）アミノ酸変異がＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに存在する上記（１）または（３）記載の変種；
（６）アミノ酸変異がＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに対応している上記（２）または（３）記載の変種；
（７）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの配列：
中の１個またはそれ以上のアミノ酸における変異を含む上記（１）または（３）記載の変種；
（８）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの配列：
中の１個またはそれ以上のアミノ酸における変異を含む上記（７）記載の変種；
（９）下記アミノ酸配列：
［式中、Ｘ１はＳまたはＡ；
Ｘ２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む変種であって、ファムシクロビル（ペンシクロビル）および／またはラミブジン（３ＴＣ）のごときヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す変種；
（１０）ＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までまたは１６９から２０７までの１個またはそれ以上のアミノ酸における変異を有する、上記（２）または（３）記載の変種；
（１１）下記アミノ酸配列：
［式中、Ｘ１６はＱまたはＫ；
Ｘ１７はＹまたはＦ；
Ｘ１８はＧ；
Ｘ１９はＲまたはＷまたはＥ；
Ｘ２０はＹまたはＬ；
Ｘ２１はＳまたはＡ；
Ｘ２２はＩまたはＶ；
Ｘ３はＦまたはＬ；
Ｘ４はＩまたはＬ；
Ｘ５はＬまたはＶまたはＧ；
Ｘ６はＰまたはＬ；
Ｘ７はＬまたはＭ；
Ｘ８はＩまたはＬ；
Ｘ９はＣまたはＬ；
Ｘ１０はＡまたはＶ；
Ｘ１１はＳまたはＡ；
Ｘ１２はＭまたはＩまたはＶ；
Ｘ１３はＶまたはＬまたはＭ；
Ｘ１４はＫまたはＲ；そして／または
Ｘ１５はＳまたはＴである］
を有するＤＮＡポリメラーゼを含み、ファムシクロビル（ペンシクロビル）および／またはラミブジン（３ＴＣ）のごときヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示す上記（１０）記載の変種；
（１２）Ｉｌｅ５０９Ｖａｌ、Ｐｈｅ５１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ５２３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５２６Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５３３Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５５０Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ５５９Ｔｈｒ、Ａｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ５３０Ｓｅｒから選択される上記（１）または（２）または（３）記載の変種；
（１３）ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異を含み、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示すＨＢＶ変種であって、該変異がＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはそれらに近い領域におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものであり、さらに該変異がＣドメイン中のＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではない変種；
（１４）ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含み、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用活性の低下を示すＨＢＶ変種であって、該変異がＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインまたはＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインおよび／またはＣドメインに近い領域に対応する領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（１５）ウイルス表面成分をコードするヌクレオチド配列中の変異を含み、該ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の低下した相互作用性を示すＨＢＶ変種であって、該変異はＨＢＶのアミノ酸１１８から１６９まで、および／または１６９から２０７までにより画定される領域または機能的に等価な領域中のウイルス表面成分におけるアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種；
（１６）ゲノム中の重複した読み枠における変異を含み、ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示し、ＨＢＶ表面抗原に特異的な免疫学的試薬に対する低下した相互作用活性を示すＨＢＶ変種であって、該変異がＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメインにおけるものであり、ＣドメインのＹＭＤＤモチーフのみにおけるものではなく、さらに該変異がＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までに対応する重複領域または等価な領域におけるものである変種；
（１７）配列番号：１７に示すヌクレオチド配列を有するＨＢＶ、あるいは単一または複数のヌクレオチド付加、置換および／または欠失を有するその誘導体（例えば、配列番号：１７に対して少なくとも６０％の類似性を有するヌクレオチド配列）；
（１８）ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性および野生型ＨＢＶ表面抗原に対する抗体に対する低下した相互作用活性を示す変種ＨＢＶであって、以下の特徴：
（ｉ）配列番号：１７に示すゲノムのヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも６０％の類似性を有する配列；
（ｉｉ）４２℃における低い厳密さの条件下において配列番号：１７にハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＨＢＶ表面抗原の読み枠の重複部分における変異；および
（ｉｖ）ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼのＢおよび／またはＣドメインにおける変異、およびＨＢＶ表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までに対応する領域における変異
の１つまたはそれ以上により特徴づけられる変種ＨＢＶ；
（１９）ヌクレオシドアナログに対する低下した感受性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法であって、ＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを該ＨＢＶから単離し、ついで、該ＤＮＡポリメラーゼのＢドメインまたはＣドメインまたはそれらに近い領域中に少なくとも１のアミノ酸置換、欠失および／または付加を生じさせる、
ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関してスクリーニングを行うことを含み、かかる変異の存在が該ヌクレオシドアナログに対する耐性の可能性を示すものである方法；
（２０）ＨＢＶ表面抗原に対する抗体との低下した相互作用活性を示すＨＢＶの潜在能力を調べる方法であって、該ＨＢＶからＤＮＡまたは対応ｍＲＮＡを単離し、該表面抗原のアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までまたは該表面領域中のそれらに近い領域における少なくとも１のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を生じさせる、ＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチド配列中の変異についてスクリーニングすることを含み、かかる変異の存在が該変異した表面抗原に対する該抗体の相互作用活性低下の可能性を示すものである方法；
（２１）アッセイが、Ｉｌｅ５０９Ｖａｌ、Ｐｈｅ５１２Ｌｅｕ、Ｖａｌ５１９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ５２３Ｌｅｕ、Ｌｅｕ５２６Ｍｅｔ、Ｉｌｅ５３３Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５５０Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ５５９Ｔｈｒ、Ａｒｇ／Ｔｒｐ４９９Ｇｌｕ、Ｔｈｒ５３０Ｓｅｒから選択される変異を検出するものである、上記（１９）または（２０）記載の方法；および
（２２）ＨＢＶが変種ＤＮＡポリメラーゼをコードしているかどうかを調べる方法をであって、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を直接的に、あるいはヌクレオチド配列を介して決定し、ついで、それを下記のアミノ酸配列：
と比較することを含み、コンセンサス配列とは異なるアミノ酸の存在が推定上のＨＢＶ変種を示すものとなる方法。
【００６１】
さらに本発明は、以下の非限定的な図面および実施例により説明される。
【実施例１】
【００６２】
症例の研究
１.患者Ａ
本発明者らは、肝臓移植後ほぼ４年間にわたりＨＢＶ感染再発に対する抗ウイルス療法を受けた患者からの一連の単離体由来のＨＢＶポリメラーゼおよびＸ読み枠を配列決定した（図２）。
患者（４２歳の男性）は慢性ＨＢＶ感染による末期肝不全であったため移植を受けた。移植後の最初の治療コースは著しいものではなく、５カ月までに感染再発の証拠および非常に高レベルの油複製および肝機能の悪化が見られた（Angus P, et al. J Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357）。ＯＬＴから約６カ月後に抗ウイルス治療を開始した。最初は、患者は静脈経路（ｉｖ）でガンシクロビル（ＧＣＶ；１０ｍｇ／ｋｇ／日）をｉｖフォスカルネト（ＰＦＦ；５０〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日；腎機能に応じた用量）と組み合わせて投与された。これは図２のＧＣＶ＋ＰＦＦ治療であり、８６日間継続された。抗ウイルス治療の８７日目に、１週間に３回ｉｖＧＣＶ（３.３〜６.７ｍｇ／ｋｇ／日）を開始した（図２のＧＣＶ）。治療４４６日目に経口ファムシクロビル（２５０ｍｇ，１日２回）を開始し（図２のＦＣＶ［Ｉ］）、５００日目に１日２回、５００ｍｇにまで増量した（図２のＦＣＶ［ＩＩ］）。現在患者はこの治療規則を継続している。ファムシクロビル治療以前のこの患者の臨床的およびウイルス学的詳細はすでに報告されている（Angus P, et al. J Gastroenterol Hepatol (1993) 8:353-357）。
血清試料を日常的に収集し、−７０℃で保存した。これらの試料を研究目的で使用するためにインフォームドコンセントを患者から受けた。図２は、抗ウイルス治療の全コースにわたるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびＨＢＶ ＤＮＡレベルを示す。さらなる研究のための５つの試料はほぼ４年間をカバーする。
【００６３】
２.患者Ｂ
患者Ｂは、最初の肝臓移植から１４カ月後にプレ−コア変異株（pre-core mutant）に関連したＨＢＶ関連アログラフ損失（allograph loss）のため、再移植を受けた。ＧＣＶ（７.５ｍｇ／ｋｇ／日）での抗ウイルス治療を１０カ月受け、その後中止された。次いで、経口ファムシクロビル治療（１日３回、５００ｍｇ）を受けた。
移植後、ＦＣＶ治療８５０日目に患者Ｂの血清ＨＢＶ試料から得た全ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を配列決定した。移植前のＦＣＶ治療前の血清試料から得た血清試料ＨＢＶポリメラーゼ触媒ドメインを含む領域を配列決定した。
【００６４】
３.患者Ｃ
この患者はファムシクロビルに応答せず、後でラミブジン（３ＴＣ）で治療され（６、７）、耐性変異が選択された。
【００６５】
４.患者Ｄ
この患者はファムシクロビルで治療され、耐性変異が選択される。
【実施例２】
【００６６】
血清中のウイルスマーカー
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｂｓＡｇ）、Ｂｅ型肝炎抗原（ＨｂｅＡｇ）、抗ＨＢｅ、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨｂｃＡｇ）特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ、Ａ型肝炎特異的ＩｇＭ、デルタ肝炎抗原および抗体、ならびに抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体を、市販イムノアッセイ（Abbot Laboratories, North Chicago, IL）を用いて測定した。ＨＢＶマーカーのみが陽性であった。製造者（Digene Diagnostics Inc., Beltsville, MD）の指示に従ってキャプチャハイブリダイゼーションアッセイ（capture hybridisation assay）を用いてＢ型肝炎ウイルスＤＮＡレベルを測定し、定量した。この患者はＯＬＴ前にプレ−コアＨＢＶ変異株に感染し（１２）、この状態はＯＬＴ後も変わらなかった。
【実施例３】
【００６７】
ＨＢＶ ＤＮＡの配列決定およびクローニング
１.血清からのＤＮＡ抽出：
血清５０μｌを、１５０μｌのＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）、１％ ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌプロナーゼと混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルムによりＤＮＡを脱蛋白し、イソプロパノールで沈殿させ、２５μｌのヌクレアーゼ不含水に溶解した。
【００６８】
２.ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるウイルスポリメラーゼ遺伝子およびＸ遺伝子の増幅：
Bresatec, Adelaide, Australiaによりオリゴヌクレオチドが合成された。ポリメラーゼ遺伝子の増幅には、センスプライマーは５’−ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＣＴ ＣＣ−３’［配列番号：１］（ヌクレオチド（ｎｔ）−４０から−２１まで）であり、アンチセンスプライマーは５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＡ−３’［配列番号：２］（ｎｔ ２３８１から２８４７まで）であった。Ｘ遺伝子の増幅には、センスプライマーは５’−ＣＣＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＣＧＴ ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＣ−３’［配列番号：３］（ｎｔ ２０５５から２０７４まで）であり、アンチセンスプライマーは５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＡ−３’［配列番号：４］（ｎｔ ２８３１から２８４７まで）であった。すべてのヌクレオチドはポリメラーゼ遺伝子の最初から番号付けされている。５μｌの鋳型抽出ＤＮＡ、１.５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT）、１μｍｏｌ／Ｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、２００μｍｏｌ／Ｌの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、３.５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）および０.０１％ ｗ／ｖのゼラチンを用いて各反応を行った。変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）および伸長（７２℃、１.５分）を４０サイクル行い、ついで、７分の最終伸長を行うことにより増幅を行った（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT）。１.５％ ／アガロースによるゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色後にＵＶ照射を行うことによりＰＣＲ生成物を分析した。
【００６９】
３.ＨＢＶ ＤＮＡのポリメラーゼ遺伝子およびＸ遺伝子の配列決定：
特異的に増幅された生成物をGeneclean II（Bio 101 Inc., La Jolla, CA）を用いて精製し、Sequence version 2.0（United States Biochemical Corp., Cleveland,OH）を用いて直接配列決定した。ＰＣＲプライマーを配列決定プライマーとして用い、さらに内部プライマーを合成してＰＣＲ生成物の内部領域を配列決定した。下記の内部プライマーおよび配列決定プライマーを用いた。５’−ＧＣＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＡＴ−３’［配列番号：５］（ｎｔ１０４〜１２６）、５’−ＧＧＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ＣＴＡ ＡＣＣ ＴＴＡ ＣＣ−３’［配列番号：６］（ｎｔ３４１〜３６０）、５’−ＧＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＴＡ−３’［配列番号：７］（ｎｔ４９６−５１８）、５’−ＴＧＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＧＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣＴ−３’［配列番号：８］（ｎｔ７３１〜７５１）、５’−ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＣ−３’［配列番号：９］（ｎｔ８７９〜８９９）、５’−ＡＡＡ ＴＴＣ ＧＣＡ ＧＴＣ ＣＣＣ ＡＡＣ−３’［配列番号：１０］（ｎｔ１１８３〜１１９５）、５’−ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ ＣＴＧ Ｔ−３’［配列番号：１１］（ｎｔ１４２９〜１４４７）、５’−ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＴＴ ＧＧＧ ＴＡＴ−３’［配列番号：１２］（ｎｔ１６８３〜１７０３）、５’−ＣＣＡ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＴＴＴ ＣＴＧ−３’［配列番号：１３］（ｎｔ１９７８〜１９９９）、５’−ＣＡＴ ＣＧＴ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＡＧ ＧＣ−３’［配列番号：１４］（ｎｔ２２３９〜２２６２）。
【００７０】
４.ｐＵＣ１８中へのＨＢＶポリメラーゼ遺伝子のクローニング：
試料中のＨＢＶ ＤＮＡが少量であるため、クローニング前に、プライマー５’−ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ ＣＴＧ Ｔ−３’［配列番号：１５］（ｎｔ１４２９〜１４４７）および５’−ＡＴＡ ＣＣＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ−３’［配列番号：１６］（ｎｔ１７０３〜１６８３）を用いてＨＢＶポリメラーゼ遺伝子のｎｔ１４２９〜１７０３を含む領域を増幅した。Geneclean IIを用いてＤＮＡを精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いて、ＳｍａＩ消化され脱リン酸化されたｐＵＣ１８プラスミド（Pharmacia Biotech, NJ）中に連結した。上記のごとくクローンを直接配列決定した。
【実施例４】
【００７１】
ＤＮＡポリメラーゼアッセイ
血清試料（１００μｌ）をＴＮＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）中の２０％ ｗ／ｖクッションにアプライし、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ Ｌ８超遠心機中でＳＷ４１ローターを用いて、１０℃において３時間、２０００００ｇで遠心分離した。１.５％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１００ｍｍｏｌＫＣｌおよび０.０１％ ｖ／ｖ２−メルカプトエタノールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５にペレットを再懸濁し、４℃で一晩放置した。本質的にはPriceら（Ling R, et al. Hepatology (1996) 24:711-713）により記載されたようにして、少量の懸濁液を内在性ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイした。２０μｌの部分精製ＨＢＶおよび（最終濃度）３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、３０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、各１０μｍｏｌ／ＬのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、および０.０１μＭの［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Dupont NEN, Boston, MA）を含有する全体積３０μｌ中において各アッセイを行った。ペンシクロビル三リン酸（ＰＣＶ−ＴＰ）感受性を試験するために、過剰（１００μｍｏｌ／Ｌ）のペンシクロビル三リン酸を各ペアーのアッセイの一方に添加して、各試料につき１ペアーのアッセイを行った。３７℃で２時間後、各反応混合物から２０μｌを取り、前以て１０％ ｗ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に浸しておいた２５ｍｍ径のガラス繊維ディスク（Advantex, Tokyo, Japan）にスポットすることにより反応を停止させた。ディスクを乾燥させ、次いで、１０ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム含有１０％ ｗ／ｖ ＴＣＡで洗浄した。最後に、洗浄したディスクを無水エタノールですすぎ、風乾し、放射活性を測定した。ＰＣＶ−ＴＰによるＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害を、対照と比較した場合のＰＣＶ−ＴＰ含有アッセイ混合物中の活性の相違％値として表した。試料の量が限られていたため、酵素活性の標準化または繰り返しアッセイは不可能であった。アッセイ固有のばらつきにもかかわらず、ＰＣＶ−ＴＰに対するＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの感受性の、時間に関連した全般的な低下が明らかであった（表１参照）。
【実施例５】
【００７２】
抗ウイルス療法の効果
抗ウイルス治療ＧＣＶ＋ＰＦＦの開始により、８７日目にはＯＴＬ後のＨＢＶ ＤＮＡレベルは１０００００ｐｇ／ｍｌ以上から１０８００ｐｇ／ｍｌにまで低下した（図２）。ウイルス血症のこの低下は臨床的、生化学的および組織学的改善と関連していた（１２）。ファムシクロビル療法（処置ＧＣＶ）の継続により、３５９日間にわたりＨＢＶ ＤＮＡレベルは２つのピークを伴って変動した。４４６日目の経口ファムシクロビルへの切り替えは、ＨＢＶ ＤＮＡレベルの上昇にも関連していた。このことは、治療の成功というよりはむしろ不十分な投与の結果であった可能性がある（図２のＦＣＶ［Ｉ］）。１日５００ｍｇに用量を増加させた後、ＨＢＶ ＤＮＡが減少した。しかしながら、ＨＢＶ ＤＮＡレベルは時間とともに除々に上昇し、６００日目（ファムシクロビル治療１５４日目）に３０００ｐｇ／ｍｌであったのが８１６日目（ファムシクロビル治療３７０日目）には８８００ｐｇ／ｍｌとなり、１３０２日目（ファムシクロビル治療８５６日目）には２９０００ｐｇ／ｍｌのピークとなり、その後１３２９日目（ファムシクロビル治療８８３日目）には１２０００ｐｇ／ｍｌ付近で安定した。８１６日目から１３２９日目までの治療期間におけるＤＮＡレベルについてのStudent検定により、統計学的に有為な上昇が明らかとなった。同時期に１.５ないし２倍のＡＬＴレベルの上昇があり（図２）、臨床的状態には変化がなかった。
【実施例６】
【００７３】
ヌクレオチド変化
ＨＢＶのＸ遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子を５つの時点（図２）で配列決定した。ほぼ４年間の抗ウイルス療法において、Ｘ遺伝子については治療前の配列に対して変化がなかった。しかしながら、８１６日目および１３２９日目の試料からのポリメラーゼ遺伝子において５個のヌクレオチドの変化が検出された（表１）。これらの変化は別個のＰＣＲにおいて検出され、さらにそのうえ、両鎖の配列決定により変異が検出されたので、ＰＣＲにより生じたエラーの結果である可能性はない。ポリメラーゼ遺伝子におけるヌクレオチド変化は、はじめは治療８１６日後に検出され、その時点で患者はファムシクロビルで３７０日間治療を受けていた。しかしながら、位置１４９８および１５１９における２つのヌクレオチド変化のみが、それぞれＶａｌ５１９−ＬｅｕおよびＬｅｕ５２６−Ｍｅｔのアミノ酸変化を引き起こした。これら２つのヌクレオチド変化は同時に出現した。８１６日目に、異なるヌクレオチド（Ｃ、Ｇ、Ｔ）が位置１４９８において検出された（それらはすべてＶａｌからＬｅｕへの変化を引き起こした）。治療から１３２９日目に、位置１４９８においてチミジンが優勢種となった。治療から８２６および１３２９日目のアミノ酸変化は、ＰＣＶ−ＴＰに対する血清ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの感受性低下と一致していた（表１）。これらのヌクレオチドは、ＯＬＴ後にＨＢＶ感染再発している、ＦＣＶ治療を受けていない６人の患者において見られた。
【００７４】
１３２９日目の試料から、アミノ酸変化を生じさせたヌクレオチド変異を含む領域をクローン化し、配列決定した。３つの亜種が検出された。７５％（２０個のうち１５個）のクローンは１４９８および１５１９における両変異を含んでおり、それらは同時に生じていた。治療前の配列が２０個のうち３個のクローンにおいて検出された。位置５２３のプロリンをロイシンに変化させるヌクレオチド１５１１におけるさらなる変異が２０個のうち２個のクローンにおいて検出された。この変異は２つの主要変異（１４９８（Ｖａｌ５１９−Ｌｅｕ）および１５１９（Ｌｅｕ５２６−Ｍｅｔ））と一緒には検出されず、さらに直接ＰＣＲによっても検出されず、おそらく低頻度であることが示された。６００日目（ＦＣＶ治療１５０日目）の試料からのウイルスＤＮＡもクローン化し、配列決定した。しかしながら、治療前の配列のみが検出された。
【実施例７】
【００７５】
患者Ｂ、ＣおよびＤにおけるヌクレオチド変化
患者ＢおよびＣから単離されたＨＢＶにおけるアミノ酸変化を図５に示し、患者Ｄから単離されたＨＢＶにおけるアミノ酸変化を図６に示す。図５において、患者Ａは図３に示した患者と同一患者である。患者Ｂは長期のファムシクロビル治療（８５０日以上）を受けていた。ファムシクロビル治療期間中に選択されたアミノ酸変化を、ＨＢＶ（患者Ｂ）として図５に示す。患者Ｃはファムシクロビルに応答せず、後で３ＴＣ（ラミブジン［６、７］）で治療された。ＦＣＶ治療期間中に患者Ｃから単離されたＨＢＶを、ＨＢＶ（患者Ｃ−ＦＣＶ）として示す。３ＴＣでの治療期間中に発生したすべての３ＴＣ耐性変異をＨＢＶ（患者Ｃ−３ＴＣ）として示す。配列分析により、ＨＢＶポリメラーゼのＣドメイン近くに変異（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ置換）が示されたが、最初はＹＭＤＤモチーフ中には変異は検出されなかった。Ｔｈｒ−Ｓｅｒ置換を含むＨＢＶが単離されてから３２日目（治療後３３３日目）に、ＹＭＤＤモチーフにおけるＭｅｔ５５０からＩｌｅへの変異が検出された。
【実施例８】
【００７６】
エスケイプ変異株
上記方法を用いて、ＨＢＶ変種をエスケイプ変異についてスクリーニングした。これらは、ＨＢＶ表面抗原のごとき表面成分における変異であり、抗体または他の免疫学的試薬に対する表面成分の相互作用活性を低下させる。ＨＢＶゲノムの重複した読み枠があると、単一の変異が複数の表現型に影響しうる。例えば、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ中の変異はＨＢＶ表面抗原に対しても影響しうる。
ＨＢＶ表面抗原中の好ましい変異はアミノ酸１１８から１６９までおよび／または１６９から２０７までにおける例えばＤ１４４ＥまたはＧ１４５Ｒのごときものである。これらに対応するＤＮＡポリメラーゼの変異はＲ／Ｗ４９９Ｅである。
特に好ましいエスケイプ変異株およびヌクレオシドアナログ耐性変異株は、ＤＮＡポリメラーゼおよび表面抗原のアミノ酸配列に対応する、図６に示すヌクレオチド配列を有する。
【００７７】
当業者は、本明細書記載された以外の本発明のバリエーションおよび修飾物もありうることを理解するであろう。本発明はすべてのかかるバリエーションおよび修飾物を包含することが理解されよう。また本発明は、本明細書において個々に、またはまとめて言及し、または示したすべての工程、特徴、組成物および化合物、ならびに２つまたはそれ以上の該工程または特徴のすべての組み合わせを包含する。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、特定の薬剤に対する感受性の低下および／または免疫学的試薬との相互作用活性の低下を示すウイルス変種が提供される。より詳細には、本発明により、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは部分的な耐性および／またはウイルス表面成分に対する抗体との相互作用活性の低下を示すＢ型肝炎ウイルス変種が提供される。本発明により、かかるウイルス変種を検出するためのアッセイが提供され、該アッセイは抗ウイルス療法のモニタリングにおいて有用である。したがって、本発明は、ウイルス性疾患の診断薬および診断キット、ウイルス性疾患のモニタリング用試薬およびキットなどの製造分野ならびにかかる試薬およびキットを用いる研究および医療関連分野において利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、ＤＮＡポリメラーゼまたはその一部をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異がＤＮＡポリメラーゼに対する少なくとも１個のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種。
【請求項１】
ＲＮＡ中間体を経て複製する単離ＤＮＡウイルスの変種であって、ＤＮＡポリメラーゼまたはその一部をコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含み、該変異がＤＮＡポリメラーゼに対する少なくとも１個のアミノ酸付加、置換および／または欠失を生じさせるものである変種。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−５５３２２（Ｐ２０１２−５５３２２Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７６１２１（Ｐ２０１１−２７６１２１）
【出願日】平成２３年１２月１６日（２０１１．１２．１６）
【分割の表示】特願２００８−１４０７５（Ｐ２００８−１４０７５）の分割
【原出願日】平成９年８月１５日（１９９７．８．１５）
【出願人】（５０７４２１４７４）
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｈｅａｌｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月１６日（２０１１．１２．１６）
【分割の表示】特願２００８−１４０７５（Ｐ２００８−１４０７５）の分割
【原出願日】平成９年８月１５日（１９９７．８．１５）
【出願人】（５０７４２１４７４）
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｈｅａｌｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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