ウイルス粒子様ナノカプセル
【課題】特定の粒子構造を有するナノカプセルを、生物宿主を用いて高効率、且つ簡便に製造する。
【解決手段】下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル：（１）特定のアミノ酸配列；（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；（３）（１）と異なる特定のアミノ酸配列；（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【解決手段】下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル：（１）特定のアミノ酸配列；（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；（３）（１）と異なる特定のアミノ酸配列；（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子様の形状を有するナノカプセルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＢ型肝炎ウイルス等のようなウイルスエンベロープタンパク質を宿主細胞にて生合成させると、当該タンパク質が宿主細胞から脂質二重膜といった脂質を取り込みつつ、自己凝集してウイルス粒子様のナノカプセルを形成することが既に知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１、２に示すように、ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質を生合成させることで、ウイルス粒子様のナノカプセルが作製できることが知られている。しかしながら、当該ナノカプセルの作製のために用いられる宿主細胞としては、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞等といった真核細胞に限られており、原核細胞を用いてウイルス様の粒子を形成した報告は未だ存在しない。
【０００４】
一方、特許文献３ではＨＢｓＡｇタンパク質のトランケートミュータントを、大腸菌を宿主細胞として用いて生合成させる技術が開示されているが、抗原としてのみ用いられる技術しか開示されておらず、ウイルス粒子様のナノカプセルが製造できるかどうかについては何ら明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０８５２３１号
【特許文献２】特許第４２１２９２１号
【特許文献３】特開２００２−１１２７９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生物宿主を用いて有用物質等を製造する場合、宿主として真核生物由来の細胞を用いるよりも原核生物由来の細胞を用いる方が、遥かに効率が良く、且つ簡便である。特に、タンパク質を主成分とするような有用物質を製造する際には、タンパク質を構成するアミノ酸に種々の変異を施して、機能を改良することが一般的な開発手段であるために、数多くの変異体を作製してその機能を評価するためには、効率が良く、簡便な製造手法が求められる。以上の点から、動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞等の真核生物由来の細胞を宿主として有用物質を製造することは、あまり好ましくない。
【０００７】
一方で、大腸菌などに代表される原核生物は、生産効率やコストの面において、有用物質を生産する宿主生物として非常に優れており、更に簡便な方法が提供できる。しかし複雑な立体構造等を有する有用物質の生産には向いておらず、立体構造を補正するシャペロン等といった特殊なタンパク質の存在下にて生産する方法や、化学的な試薬を用いて正常な立体構造に戻す操作が必要となり、結局のところ原核生物を用いる際に得られる効率の良さを相殺してしまうか、若しくはその効率を余計に悪くしてしまう虞もある。また、原核生物では生産量そのものが極めて低い有用物質も多い。
【０００８】
さらに、結局、有用物質そのものでは機能を十分に発揮できないものが製造されてしまい、特定の機能ドメインのみに限定された有用物質の一部分のみの生産しか実現しない場合もある。
【０００９】
本発明の課題は、特定の粒子構造を有するナノカプセルを、生物宿主を用いて高効率、且つ簡便に製造することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決すべく、出願人は鋭意研究を重ねた結果、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセルが、従来のナノカプセルと同等か、又はそれ以上の効果を有しながらも、従来の製造方法よりも容易で、且つ簡便な方法によって製造できることを見出した。
【００１１】
本発明は、係る知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様の発明を広く包含するものである。
【００１２】
項１ 下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【００１３】
項２ 下記の（５）〜（１０）のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド：
（５）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（６）配列番号３に示される塩基配列；
（７）上記（５）または（６）に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列；
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（９）配列番号４に示される塩基配列；
（１０）上記（５）〜（９）のいずれかに示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【００１４】
項３ 上記項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【００１５】
項４ 上記項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【００１６】
項５ 上記項１に記載のナノカプセルを製造する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のナノカプセルは、従前の大量生産に用いられていた酵母細胞ではなく、大腸菌を宿主細胞として用いて製造することが可能であるために、簡便、迅速、且つ低コストにナノカプセルを製造することが可能である。
【００１８】
従って、本発明のナノカプセルに新たな機能を付与するために、ナノカプセルの構成要素であるタンパク質に変異を施して、有用な機能を有する様々なナノカプセルの開発にかかる時間は、従来に比べて大きく短縮させることが可能となる。
【００１９】
また、本発明のナノカプセルは、従来のウイルス粒子様のナノカプセルとほぼ同等の粒径を有する。そして、本発明のナノカプセルには、従来のウイルス粒子様のナノカプセルと同様に、生体分子を認識するアミノ酸配列からなるペプチドをカプセルの外側に提示することが可能であり、ワクチンとしての利用のみならず、ＤＤＳ、診断薬、イメージング試薬、免疫測定試薬、バイオセンサー試薬等の分野に有用である。
【００２０】
そして、本発明のナノカプセルは、従来のナノカプセルと比較して短いアミノ酸配列からなるタンパク質を構成成分とするために、タンパク質の重量が比較的少ないナノカプセルが提供されるので、従来のナノカプセルと比較して、堅牢な構造を取り難くなる。従って、本発明のナノカプセルは、特に内部に物質を包含させる点において、従来のウイルス粒子様のナノカプセルよりも優れた効果を示す傾向となり、ＤＤＳ等の用途に特に有用である。
【００２１】
さらに、本発明のナノカプセルは、従来のウイルス粒子様のナノカプセルと比較して、抗原性が低いことから人体に投与した際の安全性が高いことが明らかであるため、特にＤＤＳの分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の各種ナノカプセルが有するタンパク質のドメイン等を説明する模式図。
【図２】本発明の各種ナノカプセルが有するタンパク質のアミノ酸配列と、それをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター等を説明する模式図。（A）はｄＨＢｓＡｇを示し、（Ｂ）はｓ＋ｄＨＢｓＡｇを示す。
【図３】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、各種大腸菌株を用いた合成、及び培養条件等を説明する図。
【図４】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、大腸菌を用いて合成させた際の菌体内局在等を説明する図。Ｍはマーカー、Ｔは全菌、Ｐはペリプラズム画分、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｓ＋はＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下での超音波破砕による可溶性画分、Ｉ不溶性画分を示す。
【図５】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、大腸菌を用いて合成させた際の菌体内局在等を説明するグラフ。Ｃは培養上清、Ｐはペリプラズム画分、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｓ＋はＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下での超音波破砕による可溶性画分を示す。
【図６−１】本発明のナノカプセルの精製時における、抗ＦＬＡＧ抗体カラムクロマトグラフィー溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。Ｍはマーカー、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｆは素通り画分、ＩＷはカラムの初回洗浄後画分、ＬＷはカラムの最終洗浄画分を示す。
【図６−２】本発明のナノカプセル精製時の、ゲル濾過カラムクロマトグラムチャートを示す。
【図６−３】本発明のナノカプセル精製時の、ゲル濾過ピーク画分（Ｆｒ．１０）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(CBB染色)、及び各種抗体を用いたウエスタンブロッティング解析を示す。
【図７】本発明のナノカプセルをショ糖密度勾配遠心解析した結果を示す図。黒丸は、ｄＨＢｓＡｇの結果を表し、灰色の領域は従来法で作製したＨＢｓＡｇを表す。グラフの左軸は、全タンパク質中のｄＨＢｓＡｇ又はＨＢｓＡｇタンパク質の重量割合を示す。
【図８】本発明のナノカプセルの電子顕微鏡写真像。（Ａ）は市販の精製ＨＢｓＡｇ粒子（ビークル社製）を示し、（Ｂ）はｄＨＢｓＡｇ粒子を示す。
【図９】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、大腸菌を用いて合成させた際の培養条件、菌体内局在、及び精製条件等を説明する図。（Ａ）培養条件及び菌体内局在を示す。Mはマーカー、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｓ＋はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００存在下での超音波破砕による可溶性画分、Ｉは不溶性画分を示し、ＩＰＴＧは、全菌試料を表す。（Ｂ）精製条件を表す。Ｍはマーカー、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、ＥはＮｉ−カラム溶出画分を示す。
【図１０】本発明のナノカプセルと抗体の結合能等を説明する図。△はｄＢＮＣと抗体との結合を示し、○はｄＢＮＣーＺＺと抗体との結合を示す。
【図１１】本発明のナノカプセルをショ糖密度勾配遠心解析した結果を示す図。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果であり、Ｍはマーカーを示す。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析における２８ｋＤａのバンドを数値化したもの（黒丸）。灰色は従来法で作製したＨＢｓＡｇーＺＺを表す。グラフの左軸は、全タンパク質中の本発明のナノカプセル又はＨＢｓＡｇタンパク質量の割合を示す。
【図１２】本発明のナノカプセルの電子顕微鏡写真像。（Ａ）市販の精製ＨＢｓＡｇ粒子、（Ｂ）ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子。
【図１３−１】本発明のナノカプセルのトリプシン消化実験を説明する模式図。
【図１３−２】本発明のナノカプセルのトリプシン消化実験の結果を示す図。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果、（Ｂ）各種抗体を用いたウエスタンブロッティング解析。
【図１４】本発明のナノカプセルのAFM写真像。（Ａ）ＡＦＭ写真像、（Ｂ）縦断面解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． 「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ等の文献を参照すればよい。
【００２４】
本発明のナノカプセル
本発明のナノカプセルは、下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。
【００２５】
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【００２６】
本発明のナノ粒子には、（１）〜（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のうち、一種のみのタンパク質が含まれていても良く、二種以上のタンパク質が含まれていても良い。例えば、（１）に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を一定の比率で含むナノ粒子は、生体認識分子の提示能に優れることから、特に免疫測定試薬等の分野にて優れた効果を示す傾向にある。
【００２７】
上記（１）〜（４）にて示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、自己凝集することによってウイルス粒子様の形状を形成する性質を有する。このような性質を本明細書では粒子形成能と定義する。
【００２８】
本発明のナノカプセルは、ウイルスエンベロープ様の粒子形状を有する。ウイルス粒子様の形状とは、脂質二重膜によって構成される殻の構造に、上記のタンパク質が包埋される形状である。本発明のナノカプセルは、リポソームといった脂質のみから構成される粒子形状の構造物と比較して、タンパク質が構成成分に含まれるため、リポソームよりも構造安定性が高いという性質を有する。このような形状は、単にウイルス様粒子とも称され、具体的には球状、楕円球状、ラグビーボール状、略球状等とも理解される形状である。
【００２９】
本発明のナノカプセルには、上述のタンパク質以外に、製造する際の使用する宿主細胞に存在する、タンパク質、脂質、核酸等といった成分が含まれる。なお、これらの成分は上述のタンパク質に結合した状態でナノカプセルに含まれていても良い。
【００３０】
本発明のナノカプセルにおける上記タンパク質の含有量は、特に限定はされないが、ナノカプセル１００重量部に対して通常は７５〜重量部９０重量部程度である。
【００３１】
本発明のナノカプセルに含まれる脂質の含有量は、特に限定されないが、ナノカプセル１００重量部に対して通常は１０〜重量部２５重量部程度である。
【００３２】
本発明のナノカプセルの内部は、中空であってもよく、水分、脂質成分、イオン成分等が含まれていてもよい。
【００３３】
本発明のナノカプセルの粒子径は、通常は１０〜２００ｎｍ程度であり、より好ましくは１３〜１００ｎｍ程度、より好ましくは１６〜５０ｎｍ程度であり、最も好ましくは２０〜３０ｎｍ程度である。ここで、粒子径の測定方法は、電子顕微鏡像から、無作為に抽出したナノカプセルの直径を測定し、それらの平均値によって算出したものである。なお、本発明のナノカプセルは、エクストルーダーを用いて、孔径の小さいフィルターを通過させることによって適宜調節することが可能である。
【００３４】
本発明のナノカプセルは、（ａ）及び（ｃ）に上述したように従来のＨＢｓＡｇタンパク質を含むナノカプセルと比較して、アミノ酸配列を大幅に欠失しながらも、粒子形成能を保持している。このようなアミノ酸からなるタンパク質を含む本発明のナノカプセルは、内部に蛍光物質、放射性物質、磁性物質等の標識物質；ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等の核酸；薬剤といったＤＤＳ、生体内でのキャリアー等として送達又は移送させるべき分子を、より高効率に内包させることが可能である。
【００３５】
なお、ここでいう内包とは、ナノカプセルの内部に当該分子の全てが完全に包み込まれている必要はなく、当該分子の一部がナノカプセルの外部に突出していてもよい。
【００３６】
本発明のナノカプセルに、上述した分子を内包させる方法は、特に限定はされないが、脂質融合を利用した方法、エレクトロポーレーション法等が挙げられる。
【００３７】
その他に、本発明のナノカプセルを構成する粒子形成能を有するタンパク質を、界面活性剤やその他手段を用いて粒子構造を破壊し、次いで所望の内包分子と混和した後に、再度、粒子形成させて得られるナノカプセル中に、分子を内包する方法が挙げられる。
【００３８】
上記（１）にて定義する配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ９Ｗ９６６に示されるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（以後、ＨＢｓＡｇと称することがある。）のＳタンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸残基数２２６）に対して、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す変異を施したアミノ酸配列である。
【００３９】
（ａ）２〜７７番目のアミノ酸残基の欠失。
（ｂ）７８番目及び７９番目のアルギニン残基の、それぞれセリン残基への置換。
（ｃ）１７３−２２６番目のアミノ酸残基を欠失。
【００４０】
特に、上記の（ｂ）に示すような変異を導入することにより、本発明のタンパク質が宿主細胞内にて効率的に作製され易くなり、ひいては当該タンパク質を含むナノカプセルの形成に有利となる。
【００４１】
上記（２）にて定義する生体分子は特に限定されないが、具体的には表面抗原、レセプター、抗体、サイトカイン、転写因子等の糖タンパク質若しくはタンパク質、又はペプチド若しくは糖ペプチド；ヘパリン、シアルルイスＸ等の糖若しくは糖鎖等が挙げられる。
【００４２】
上記（２）にて定義する生体分子を認識するアミノ酸配列は、特に限定はされないが、例えば生体分子がレセプターであれば、当該レセプターに対して相互作用する各種成長因子等のアミノ酸配列とすればよい。
【００４３】
例えば、生体分子がビオチンであれば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等に代表されるアビジン系タンパク質のアミノ酸配列とすればよい。
【００４４】
例えば、生体分子が糖鎖である場合には、アグルチニン、セレクチン等のレクチンのアミノ酸配列とすればよい。
【００４５】
例えば、生体分子が抗体である場合には、配列番号５に示すＳｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓｕ由来のＰｒｏｔｅｉｎ ＡにおけるイムノグロブリンＧのＦｃドメインに結合する領域に存在するアミノ酸配列であるＺタグのアミノ酸配列とすればよい。なお、ここで言う抗体とは、上述のＦｃドメインを有さないＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２等の構造を有する抗体は含まれない。
【００４６】
例えば、標的生体分子を認識するペプチドあるいはアフィボディーを、ライブラリーから選んで、そのアミノ酸配列を用いてもよい。
【００４７】
上記（２）にて定義する生体分子を認識するアミノ酸配列は、上記（１）に示されるアミノ酸配列の内部、Ｎ末端側、又はＣ末端側のいずれの位置に付加されていてもよいが、当該アミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセルの構造の安定性、又は生体分子を認識するアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはペプチドをナノカプセルの外側に提示させることに鑑みて、Ｃ末端側に付加されることが好ましい。
【００４８】
ここで、「Ｃ末端側」とは、Ｃ末端から１〜５番目程度のアミノ酸残基の位置、又はＣ末端側に０〜１５個程度のアミノ酸配列（いわゆるスペーサー配列）を付加したさらに後ろ側の位置を意味する。なお、「Ｎ末端側」も同様に説明される。
【００４９】
このように、生体分子を認識するアミノ酸配列が、ナノカプセルの外側に提示された上記（２）にて定義するアミノ酸配列としては、配列番号２に示すアミノ酸配列又に示すアミノ酸配列などが挙げられる。
【００５０】
なお、生体分子を認識するアミノ酸配列は一種でも二種以上を組み合わせて付加されていてもよい。
【００５１】
上記（４）にて定義する置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるアミノ酸の数は、（４）に定義するアミノ酸配列からなるタンパク質が、粒子形成能を失わない範囲とすればよく、特には限定されないが、通常は２０個程度以下とすればよく、好ましくは１５個程度以下、より好ましくは１０個程度以下、更に好ましくは５個程度以下であり、最も好ましくは１個である。
【００５２】
なお、置換に関しては、上記（４）にて定義するアミノ酸配列からなるタンパク質が粒子形成能を失わないように、置換対象となるアミノ酸そのものの性質を変化させないような類似アミノ酸の範疇において適宜選択すればよい。ここで、類似アミノ酸とは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ等といった芳香族アミノ酸；Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ等といった脂肪族アミノ酸；Ｇｌｎ、Ａｓｎ等といった極性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ等といった塩基性アミノ酸；Ｇｌｕ、Ａｓｐ等といった酸性アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等といった水酸基を有するアミノ酸；Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ等といった側鎖の小さいアミノ酸等に挙げられる各グループ内のアミノ酸である。例えばＬｅｕは、同じ脂肪族アミノ酸の範疇に含まれる類似アミノ酸であるＩｌｅに置換すればよい。
【００５３】
なお、上述の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなる本発明のタンパク質には、当該タンパク質を精製すること、当該タンパク質を検出すること等を目的として、各種タグポリペプチドが付加されていてもよい。具体的なタグポリペプチドとして、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＧＦＰタグ、Ｚタグ、ストレプタグ等が挙げられる。 これらのタグポリペプチドは、単独で付加されていても、二種以上を組み合わせて付加されていてもよい。なお、上記のタグポリペプチドは、上述した（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列内部に挿入される形で付加されていても、当該アミノ酸配列のＣ末端側に付加されていても、Ｎ末端側に付加されていてもよい。本発明のナノカプセルの構造の安定性、又は当該タグポリペプチドをナノカプセルの外側に提示することに鑑みて、Ｃ末端側に付加されることが好ましい。なお、「Ｎ末端側」、及び「Ｃ末端側」なる用語は、既に定義したとおりである。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは下記の（５）〜（１０）のいずれかに示す塩基配列からなる。
【００５５】
（５）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（６）配列番号３に示される塩基配列。
（７）上記（５）または（６）に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列。
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（９）配列番号４に示される塩基配列。
（１０）上記（５）〜（９）のいずれかに示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【００５６】
上記（５）にて規定する塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を基に、in silico技術を採用することによって塩基配列を決定することができる。in silico技術を用いれば、１つのアミノ酸配列から、そのアミノ酸配列をコードする多数の塩基配列が決定されることになるが、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させる際に用いる宿主細胞に対して適当なコドン頻度を考慮すれば、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする、より好ましい態様の塩基配列を決定することができる。
【００５７】
上記（６）にて規定する配列番号３に示される塩基配列は、上記（５）に示す配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一態様である。
【００５８】
上記（７）にて規定する生体分子、及び生体分子を認識するアミノ酸配列は、上述した本発明のナノカプセルの（２）に定義したものと同様にすればよく、例えば上述したZタグをコードする塩基配列は、配列番号６にて示される。
【００５９】
なお、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列も、上述の（５）にて説明したin silico技術を採用することによって決定できる。そして、当該塩基配列の好ましい態様も、上述のようにコドン頻度を考慮して決定できる。
【００６０】
上記（８）にて規定する塩基配列も上記（５）と同様に、上述の配列番号２に示すアミノ酸配列を基に、in silico技術並びにコドン頻度を考慮して決定することができる。
【００６１】
上記（９）にて規定する配列番号４に示される塩基配列は、上記（８）に示す配列番号２を基に決定した塩基配列の一態様である。
【００６２】
上記（１０）にて定義する置換、欠失、挿入、及び／又は付加される塩基の数は、（１０）に定義する塩基配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質が、粒子形成能を失わない範囲とすればよく、特には限定されないが、通常は３０個以下とすればよく、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下であり、最も好ましくは３個以下である。
【００６３】
なお、置換に関しては、上記（１０）にて定義する塩基配列がコードするアミノ酸配列において、上記（４）にて定義した他の類似アミノ酸となるように塩基配列を置換すればよい。例えば、塩基配列中において、脂肪族アミノ酸の範疇に含まれるＬｅｕを、同じく脂肪族アミノ酸の範疇に含まれる類似アミノ酸であるＩｌｅに置換するように、Ｌｅｕをコードする「ＣＴＴ」なる塩基配列を、「ＡＴＴ」と置換すればよい。
【００６４】
本発明の組換えベクター
本発明の本発明の組換えベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含むものである。組換えベクターとは生物宿主に導入することによって、特定の遺伝子を発現するものであり、本発明においては、上述した本発明のポリヌクレオチドを発現するものである。
【００６５】
上記の生物宿主としては、特に限定はされないが、原核細胞であることが好ましい。具体的には、大腸菌、枯草菌、乳酸菌等が挙げられるが上述した本発明のポリヌクレオチドを効率的に発現させることを勘案すれば、大腸菌であることが好ましい。即ち、本発明の組換えベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含む大腸菌発現用ベクターが好ましい。
【００６６】
具体的な大腸菌発現ベクターは、公知のものを採用すればよく、特に限定はされないが、ＩＰＴＧ、ラムノース等の存在下において、上述した本発明のポリヌクレオチドの発現を誘導することができるベクターを用いることが好ましい。例えば、ｐＥＴベクターシリーズや、ｐＧＥＸベクターシリーズ等を挙げることができる。
【００６７】
本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、上述した本発明の組換えベクターを含むものであり、上述した組換えベクターによって上述の生物宿主が形質転換されたものを意味する。
【００６８】
形質転換する方法は特には限定されず、塩化カルシウム法や塩化ルビジウム法で作成したコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポーレーション法、プロトプラスト法等が挙げられる。
【００６９】
なお、上述の組換えベクターが、ＩＰＴＧによって特定の遺伝子の発現を誘導するものであり、用いる宿主細胞が大腸菌である場合には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子がゲノム中に配置されたＤＥ３株の大腸菌であることが好ましい。
【００７０】
本発明のナノカプセルを製造する方法
本発明のナノカプセルを製造する方法は、以下の３つの工程を含むものである。
（ｉ）上述した本発明の形質転換体を培養する工程、
（ｉｉ）当該形質転換体の培養物の可溶化液を回収する工程、及び
（ｉｉｉ）当該可溶化液からナノカプセルを精製する工程。
【００７１】
上記（ｉ）における、上述した形質転換体の培養方法は、それぞれの形質転換体に適合した公知の培養方法を採用すればよい。例えば、上述のように形質転換体が大腸菌であり、ＩＰＴＧ、ラムノース等による発現誘導を可能とする組換えベクターを保持している場合には、２０℃程度の低温条件下で長時間の培養を行うことが好ましい。
【００７２】
上記（ｉｉ）における、形質転換体の培養物からの可溶化液の回収方法は特に限定されず、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘシリーズ、Ｔｗｅｅｎシリーズ、ＮＰ４０等といった公知の界面活性剤を用いる方法；超音波処理に供する方法；液体窒素等の冷媒を用い、特定の機器を用いて細胞膜、細胞壁等を破砕する凍結融解法；ガラスビーズ法；ザイモリエースなどのような細胞壁を消化する酵素を用いたスフェロプラスト法；高圧化にて処理を行うフレンチプレス法等の公知の可溶化方法を培養物に対して採用した後に、遠心分離処理に供して得られる液相分画を回収すればよい。なお、これらの可溶化方法は、単独であっても、２種類以上を組み合わせて採用しても良い。
【００７３】
上記（ｉｉｉ）における、可溶化液から本発明のナノカプセルを精製する方法は、特に限定されることはなく、公知のタンパク質の精製法を採用すればよい。
【００７４】
例えば、上述の可溶化液を塩化セシウム、スクロース、グリセロール、ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｐｅｒｃｏｌ等の成分を各種濃度又は線形グラジエント濃度勾配にて含有する緩衝液と、超遠心分離処理を採用した密度勾配遠心分離法に供して、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に熱処理を与えて、主に夾雑タンパク質等を変性させて本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に対して硫酸アンモニウム、エタノール酢酸、アセトン等を作用させて、主に夾雑タンパク質を変性させることにより、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に対して硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールを加えて沈殿させる事で、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に対してクロマトグラフィー用いて、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法等が挙げられ、これらの方法は単独で採用しても、二種類以上を組み合わせて採用しても良い。
【００７５】
上述したクロマトグラフィーの具体的な種類は、特に限定されないが、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのクロマトグラフィーは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７６】
本発明の組換えベクターが、上述したタグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が含む場合には、当該タグポリペプチドとの相互作用に基づいたアフィニティカラムを用いることが好ましい。
【００７７】
例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ等のタグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを含む形質転換体から得られた可溶化液より精製する場合、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ｍｙｃ抗体等といった、タグポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を担持するポリマーを担持したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、当該ペプチドを高濃度で含有する緩衝液、又はＧｌｙｓｉｎ−ＨＣｌ緩衝液のような、ｐＨが１〜５程度の酸性緩衝液を用いることが好ましい。
【００７８】
また、本発明のナノカプセルがＭＢＰタグを有する場合には、マルトース等といった糖類を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、糖類を高濃度で含む緩衝液を用いることが好ましい。
【００７９】
さらに、本発明のナノカプセルがＨｉｓタグを有する場合には、Ｎｉ−ＮＴＡといったヒスチジンとキレート結合が可能となる金属化合物を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、イミダゾールを高濃度で含有する緩衝液を用いることが好ましい。
【００８０】
このようなタグポリペプチドは、精製後適当なプロテアーゼで本発明のナノカプセルから切断除去してもよい。
【００８１】
なお、本発明のナノカプセルが、上述した生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を含む場合、当該生体分子を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが有効である。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、当該生体分子を高濃度で含有する緩衝液を用いることが好ましい。
【００８２】
例えば、生体分子がストレプトアビジンのようなアビジン系タンパク質であり、生体分子を認識するアミノ酸がビオチンである場合には、アビジン系のタンパク質を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが有効であり、溶出液としてはビオチンを高濃度で含有する緩衝液を用いる方法が挙げられる。
【００８３】
なお、本発明のナノカプセルを製造する過程では、当該ナノカプセルを構成するタンパク質の分解を抑えるために、低温条件下での操作とすることが好ましく、必要に応じてＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ等のタンパク質分解酵素阻害剤を１種又は２種以上で組み合わせて用いてもよい。
【００８４】
上述のように、本発明のナノカプセルは、上述の本発明の粒子形成能を有するタンパク質が自己凝集することによってウイルス様粒子となり形成されるが、ウイルスエンベロープ様粒子を形成する場は、宿主細胞内、試験管内、培養容器内等といった当該タンパク質の合成の場か、タンパク質合成の終了後の精製、回収、保存等の場であり、特に限定はされない。
【実施例】
【００８５】
１）発現ベクターの構築
Ｃ末端５４残基を欠失させＦＬＡＧ−ｔａｇ配列で置換したＨＢｓＡｇ抗原タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡである、ベクターｐＢＯ７４９（国際公開番号ＷＯ２００５／０４９８２４）を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ＃１５７５（配列番号７）と＃１５５５（配列番号８）とを用いたＰＣＲにより、Ｎ末端７６残基とＣ末端５４残基とを同時に欠失した、配列番号９に示す塩基配列を含む欠失型ＨＢｓＡｇ遺伝子（以後、ｄＨＢｓＡｇと称することがある。）断片を増幅した。
【００８６】
増幅された遺伝子断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理した後、アガロースゲル電気泳動でｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片を単離及び精製した。大腸菌発現用ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理した後、ｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片のＮｄｅＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素消化処理後物と連結し、ｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現用ベクターｐＢＯ１４６５を得た。
【００８７】
構築されたｄＨＢｓＡｇ遺伝子には、Ｃ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇとＨｉｓ６−ｔａｇ配列が融合されている（図１及び図２）。
【００８８】
同様に、ベクターｐＢＯ７４９を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ＃１５５４（配列番号１０）と＃１５５５（配列番号８）とを用いたＰＣＲにより、Ｎ末端７６残基とＣ末端５４残基とを同時に欠失した、配列番号１１に示す塩基配列からなる欠失型ＨＢｓＡｇ遺伝子（以後ｓ+ｄＨＢｓＡｇと称することがある。）断片を増幅した。
【００８９】
増幅された遺伝子断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動でｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片を単離及び精製した。大腸菌発現用ベクターｐＥＴ２２ｂも同様にＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素処理した後、制限酵素処理後のｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片と連結し、ｓ+ｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現用ベクターｐＢＯ１４５８を得た。
【００９０】
なお図２にて示すように、構築されたｓ+ｄＨＢｓＡｇ遺伝子は、上述のｄＨＢｓＡｇ遺伝子と比較すれば、アミノ酸に翻訳された際にＮ末端側のアミノ酸配列のみが異なっている。
【００９１】
２）大腸菌によるｄＨＢｓＡｇの発現
上記のｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現用ベクターｐＢＯ１４６５及びｓ＋ｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現ベクターｐＢＯ１４５８を遺伝子発現用大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）株、Ｃ４１（ＤＥ３）株、Ｃ４３（ＤＥ３）株、並びにＫＲＸに形質転換し、翌日出現したコロニー数十個を、０．５％ｇｌｕｃｏｓｅと終濃度で２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む４ｍＬ若しくは３０ｍＬのＬＢ培地で、３７℃で２〜５時間振盪培養した。
【００９２】
１．５ｍＬ若しくは１２ｍＬの菌懸濁液を、それぞれ終濃度で５００μｇ／ｍｌアンピシリンをする含有５０ｍＬ若しくは４００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、さらに３７℃、２〜５時間振盪培養した。ＯＤ６００が０．８〜１．０になったところでＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように加えた。なお、ＫＲＸ株の場合は、ＩＰＴＧに換えて０．１％のラムノースを添加した。低温培養検討（２０℃で4時間〜一晩培養）時には、ＩＰＴＧ添加前に培養温度を２０℃に下げた。
【００９３】
ＩＰＴＧの添加後、３７℃で４時間若しくは２０℃で一晩（低温培養時）培養した後に菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前と培養終了時における１ｍｌの培養液分の菌体を超純水１００μＬに再懸濁した後、当容量の２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［２０％のｇｌｙｃｅｒｏｌ、４％ＳＤＳ、０．０２％ＢＰＢ、及び１０％の２−ＭＥを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）］を加えて溶解し、９５℃で５分間加熱処理した後の２０μＬ（全菌試料：Ｔとする）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、続いてクマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ染色）を行った。結果を図３に示す。
【００９４】
ｓ+ｄＨＢｓＡｇは、いずれの大腸菌株においてもＩＰＴＧ誘導に基づくバンドの出現は観察されなかったが、ｄＨＢｓＡｇでは図中の矢印の位置に示されるように、全ての大腸菌株においてＩＰＴＧ誘導に基づくバンドの出現は観察された。以上のことから、大腸菌を用いてナノカプセルを構成するタンパク質を生合成するには、そのＮ末端側のアミノ酸配列が重要であることが明らかとなった。
【００９５】
３）ｄＨＢｓＡｇ発現における大腸菌体内の局在
ｄＨＢｓＡｇを発現する大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）株を上記の各種培養条件で培養し、菌体回収時の遠心後の上清を培養上清（Ｃ）とした。１ｍＬの培地による培養にて得られた菌体を、２０％のｓｕｃｒｏｓｅを含む３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を７５ｍＬ用いて再懸濁した。ここに、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１．５μＬ加え、室温条件下で１０分間Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
【００９６】
次いで、１００００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈殿画分を、氷冷した５ｍＭのＭｇＳＯ４に再懸濁し、４℃で１０分間ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。次いで、１００００ｒｐｍ、４℃の条件にて、１０分間遠心し、得られた上清をペリプラズム画分（Ｐ）とした。一方で、得られた沈殿画分を、０．７５ｍＬの氷冷Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［５%のｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］に再懸濁し、終濃度１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＰＭＳＦを加えた。
【００９７】
このサンプルを、２回凍結融解処理に供した後、氷上で３０秒ずつ２回の超音波破砕処理を行った。次いで、１４０００ｒｐｍ、４℃の条件にて、１０分間遠心し、得られた上清画分を可溶性画分（Ｓ−）とした。
【００９８】
一方で、得られた沈殿画分を０．７５ｍＬの氷冷Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、終濃度１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＰＭＳＦを加えた。さらに終濃度が０．５%となるようにＴｒｉｏｔｎＸ−１００を加え、３０秒間の超音波破砕処理を１回行った。次いで、１４０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１０分間遠心し、得られた上清画分を可溶性画分（Ｓ＋）とした。
【００９９】
一方で、得られた沈殿画分を０．７５ｍＬの氷冷Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁したものを不溶性画分（Ｉ）とした。以上の各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、次いでＣＢＢ染色を行った。結果を図４に示す。
【０１００】
図中の矢印の位置に示されるように、ｄＨＢｓＡｇタンパク質はペリプラズム画分（Ｐ）には認められず、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００非存在下並びに存在下の可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）、及び不溶性画分（Ｉ）に分散して認められた。また、３７℃における培養では不溶性画分（Ｉ）へ、２０℃における培養では、可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）により多く局在することが明らかとなった。
【０１０１】
また、培養時に得られた菌体回収時の上清画分（Ｃ）、ペリプラズム画分（Ｐ）、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下、並びに非存在下の可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）を、抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いた酵素免疫測定法（ＩＭｘ−ＨＢｓＡｇ；ダイナボッド社）にて、ＨＢｓＡｇタンパク質を測定した。結果を図５に示す。
【０１０２】
図４にて示される結果と同様に、ＨＢｓＡｇタンパク質はペリプラズム画分（Ｐ）には殆どは局在が認められず、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などのような界面活性剤の存在下並びに非存在下の可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）として抽出できることが明らかとなった。
【０１０３】
４）ｄＨＢｓＡｇタンパク質を含むナノカプセルの精製
引き続いて、ｄＨＢｓＡｇタンパク質を含むナノカプセル（以後、ｄＢＮＣと呼ぶことがある。）の精製を行った。
【０１０４】
ＩＰＴＧによる誘導下（培養温度は３７℃）にてｄＨＢｓＡｇを発現した菌体をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ［１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］に再懸濁し、最終濃度が１ｍＭになるようにＰＭＳＦを加えた。次いで、１分ずつ５回氷上で冷却しながら超音波破砕した。その後、８０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１５分間遠心し上清を可溶性画分（Ｓ−）とした。ここで得られた沈殿を０．１%のＴｗｅｅｎ８０を含むＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、最終濃度が１ｍＭとなるようにＰＭＳＦを加えて、１分ずつ５回氷上で冷却しながら超音波破砕した。超音波破砕後の溶液を同様の条件で遠心して、上清を可溶性画分（Ｓ＋）とした。残った沈澱を超純水に懸濁して不溶性画分（Ｉ）とした。これらの試料（１００μＬの培養液分に相当）に当容量の２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて溶解し、９５℃で５分間加熱処理した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルとした。
【０１０５】
ＴＢＳ［１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］で平衡化した抗ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ （Ｓｉｇｍａ社）カラム（ｂｅｄ量：１ｍＬ）に、上記の可溶性画分（Ｓ−）をインジェクションし、４℃で２時間ｒｏｔａｔｅ後、ゆっくり流し素通り液を回収した。回収した画分を素通り画分（Ｆ）とした。
【０１０６】
次に、０．７５ｍＬのＴＢＳ５００［ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭとした上記ＴＢＳ］でカラムを数回洗浄後（初回の洗浄後画分を（ＩＷ）とし、最終洗浄画分を（ＬＷ）とする。）、０．４ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１ＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）］で８回に分けて溶出した。得られた溶出画分をそれぞれ溶出画分（１）〜（８）とした。
【０１０７】
溶出画分には直ちに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１４μＬ混合して中和し、その後、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いでＣＢＢ染色を行った。結果を図６−１に示す。
【０１０８】
図中の矢印に示すように、抗ＦＬＡＧカラム溶出画分の（２）〜（７）において、ｄＨＢｓＡｇタンパク質のバンドが検出された。これらの溶出液のそれぞれ２ｍＬを、０．１５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；直径１．６ｃｍ×高さ４０ｃｍ；ｂｅｄ量２４ｍＬ）にインジェクションし、０．７５ｍＬを１画分として回収した。
【０１０９】
図６−２に示すように、ＨＢｓＡｇタンパク質は、１０番目の画分にて最も多く溶出されることが明らかとなった。当該画分は６６９ｋＤａの分子量を有するサイログロブリンと同様の位置で流出することが明らかとなった。そして、図６−３に示すように、１０番目の当該溶出ピーク画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により８０％以上の純度でｄＨＢｓＡｇタンパク質を含有することを示した。
【０１１０】
また図６−３に示すようにＨＲＰ標識化抗ＦＬＡＧ抗体（抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ、ＳＩＧＭＡ）、ヤギ由来のビオチン標識化抗ＨＢｓ抗体とウサギ由来のアルカリフォスファターゼ標識化抗ビオチン抗体（ＩＭｘ ＨＢｓＡｇ試薬；ダイナボット）、あるいはＨｉｓＰｒｏｂｅＴＭ−ＨＲＰ結合体（Ｔｈｅｒｍｏ社）を各々用いたウエスタンブロッティングでも検出された事から、目的のｄＨＢｓＡｇバンドである事が確認された。
【０１１１】
以上の結果より、ｄＨＢｓＡｇタンパク質は自己凝集して７００ｋＤａ程度の複合体を形成していることが確認された。
【０１１２】
５）ｄＢＮＣの性状解析
＜Ｓｕｃｒｏｓｅ密度勾配遠心解析＞
１６ｍＬの遠心管（１６ＰＡ ＴＵＢＥ ＡＳＳＹ；ＨＩＴＡＣＨＩ社）に底からスクロース濃度を５０、４０、３０、２０、及び１０重量％含むＢｕｆｆｅｒＡ［６８．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３１．６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５ｍＭの ＥＤＴＡ・２Ｎａ、及び０．８５％のＮａＣｌ］を２．５ｍＬずつ順に重層し、その上に上記４）にて示す可溶性画分（Ｓ−）を２．５ｍＬ重層した後、超遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＰ７０ＭＸＸ；ＨＩＴＡＣＨＩ社）を用いて４℃、２４０００ｒｐｍの条件で１４時間遠心した。
【０１１３】
陽性対照として、Ｃｏｓ７細胞によって一過的に製造されたＨＢｓＡｇ粒子（培養上清から回収したもの）を用いた。また、陰性対照として、２ｍｇのウサギ血清由来のＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、分子量１５０ｋＤａ）をＢｕｆｆｅｒＡで２．５ｍＬに希釈したものを用いた。
【０１１４】
遠心処理の後、あらかじめ重量を測定しておいた１．５ｍＬチューブに１ｍＬずつ回収し、重量を測定して密度を求めた。各画分のＨＢｓＡｇ量をＩＭｘ ＨＢｓＡｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ダイナボット社）を用いて測定した。ウサギ血清由来ＩｇＧの濃度はＵＶ法により測定した。その結果を図６に示す。
【０１１５】
ｄＨＢｓＡｇタンパク質はＣｏｓ７細胞を用いて作製したＨＢｓＡｇ粒子と同様に６−８番目の画分に沈降ピークを示した。ウサギ由来ＩｇＧの沈降ピークは２番目画分であった。以上の結果から、ｄＨＢｓＡｇタンパク質は自己凝集し、従来のＨＢｓＡｇ粒子と同様に粒子形成していることが示唆された。
【０１１６】
＜電子顕微鏡観察＞
抗ＦＬＡＧ抗体溶出画分について、ネガティブ染色法を用いて透過型電子顕微鏡（ＥＬＥＣＴＲＯＮ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＥ Ｈ−７１００Ｓ；ＨＩＴＡＣＨＩ）観察した。比較対象として野生型ＨＢｓＡｇ粒子（ビークル社製）を用いた。結果を図５に示す。
【０１１７】
ｄＨＢｓＡｇタンパク質は、比較対象に用いた野生型ＨＢｓＡｇ粒子と同様に、ウイルスエンベロープ様ナノ粒子（ｄＢＮＣ）が形成する事が明らかとなった。また、ｄＢＮＣの粒子径は２５±５ｎｍと、比較対象に用いた野生型ＨＢｓＡｇ粒子（２１±２ｎｍ）とほぼ同等の粒子径を有することも明らかとなった。この数値は、電子顕微鏡像から５０個の粒子を選択し、その直径を測定した平均値である。
【０１１８】
＜ｄＢＮＣの抗原性＞
２種の市販のＨＢＶ体外診断用酵素免疫測定法キット（ＩＭｘ ＨＢｓＡｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｂｂｏｔｔ社、及びＥｎｚｙｇｎｏｓｔ ＨＢｓＡｇ ５．０ ｋｉｔ；ＳＩＭＥＮＳ社）を用いて、精製ｄＢＮＣの抗原性を市販のＨＢｓＡｇＳ粒子（ＨＢｓＡｇ−ａｄｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧｅｎＷａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１０−６６３−４５３６２）を標準試料として測定した。表１に結果を示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
ｄＢＮＣの抗原性は、野生型Ｓ粒子と比較してＩＭｘＨＢｓＡｇキットによる測定では１／７、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔキットによる測定では約１／２００に低下していた。
【０１２１】
従って、本発明のｄＢＮＣは、特にＤＤＳとして体内に投与した場合、より安全に用いることができることが明らかとなった。
【０１２２】
６）ＺＺタグ融合ＨＢｓＡｇ欠失体（ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ）発現ベクターの構築
まず、ｄＨＢｓＡｇ遺伝子発現ベクターｐＢＯ１４６５を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ＃３６１（配列番号１２）と、＃１６３３（配列番号１３）とを用いたＰＣＲを行いて遺伝子断片を増幅し、その反応液をフェノール抽出後エタノール沈殿した後、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理を行うことにより、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを含まない約０．３ｋｂのｄＨＢｓＡｇの遺伝子断片を調製した。
【０１２３】
この遺伝子断片と、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理を施したｐＢＯ１４６５ベクターの断片とをＴ４−ｌｉｇａｓｅで連結することにより、Ｃ末端にＨｉｓ６−ｔａｇのみが付いたｄＨＢｓＡｇ遺伝子を発現するベクターｐＢＯ１５０１を構築した。
【０１２４】
一方、１０ｎｇの酵母発現用ベクターｐＧＬＤ−ＺＺ−ｄ５０Ｎ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｂｉｏｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ． Ｋｕｒａｔａ Ｎ， Ｓｈｉｓｈｉｄｏ Ｔ， Ｍｕｒａｏｋａ Ｍ， Ｔａｎａｋａ Ｔ， Ｏｇｉｎｏ Ｃ， Ｆｕｋｕｄａ Ｈ， Ｋｏｎｄｏ Ａ． Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００８ Ｄｅｃ；１４４（６）：７０１−７．）を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ ＃１７３２（配列番号１４）と、＃１７３３（配列番号１５）とをそれぞれ１０ｐｍｏｌ用い、さらにＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ（ＮＥＢ社；１ｕｎｉｔｓ／μＬ）を用いＰＣＲにより、ＺＺｔａｇ遺伝子を増幅した後、７２℃で１４分間アデニン付加反応を行った。
【０１２５】
この増幅ＤＮＡ反応液をフェノール抽出後、エタノール沈澱し、３０μＬの滅菌超純水に再溶解した。これを１．２％アガロースゲル電気泳動で電気泳動後、目的のＺＺ−ｔａｇ遺伝子断片を含むゲル片を切り出した。具体的には、ＱＩＡＥＸII Ｇｅｌ− Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、アガロースゲルから目的ＤＮＡ断片を抽出精製した。このＺＺｔａｇ遺伝子断片とｐＴＡＣ−１ ｖｅｃｔｏｒ（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｓ）をＴ４−ｌｉｇａｓｅで連結することにより、ＺＺｔａｇ遺伝子をｐＴＡＣ−１ベクターにクローニングして、ｐＢＯ１５９４ベクターを作製した。
【０１２６】
得られたｐＢＯ１５９４ベクターをＮｏｔIで制限酵素消化処理し、１．５％アガロースゲル電気泳動した後、ＺＺｔａｇ断片を含むゲル片を切り出した。ＱＩＡＥＸII Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットで、目的となるＺＺｔａｇＤＮＡ断片を抽出精製し、ｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡとした。
【０１２７】
一方、ｐＢＯ１５０１ベクターをＮｏｔIで制限酵素消化処理した後、６５℃で２０分間酵素失活反応させた。このＮｏｔＩによって制限酵素消化処理したｐＢＯ１５０１の断片と、ＮｏｔＩによって制限酵素消化処理したＺＺｔａｇ断片とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて連結することにより、配列番号１６に示す塩基配列を含むｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ遺伝子発現用ベクターｐＢＯ１５９５を構築した。
【０１２８】
このようにして作製したｐＢＯ１５９５ベクターには、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺのＣ末端に検出精製用のＨｉｓ６−ｔａｇ配列が融合されたタンパク質をコードする遺伝子が含まれている。
【０１２９】
７）ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺの大腸菌による発現と精製
上述のｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ発現ベクターｐＢＯ１５９５を、大腸菌株Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）に形質転換した。翌日出現したコロニー数十個について、実施例２と同様の方法で遺伝子の発現及び培養を行い、得られた遺伝子発現菌体について、Ｔｗｅｅｎ８０を含まない緩衝液にて超音波破砕処理によって可溶化して得られる可溶性画分Ｔｗｅｅｎ−（Ｓ−）、Ｔｗｅｅｎ８０を含む緩衝液にて超音波破砕処理によって可溶化して得られる可溶性画分（Ｓ＋）、及び不溶性画分（Ｉ）を調製した。これらの試料（１００μＬの培養液分）に当容量の２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて溶解し、９５℃で５分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、次いでＣＢＢ染色を行った。結果を図９（Ａ）に示す。
【０１３０】
図中の矢印にて示されるように、ＩＰＴＧ誘導下による培養を行った場合に、明瞭なｄＨＢｓＡｇ−ＺＺの発現バンドが見られ、主に可溶性画分（Ｓ−）に局在することが明らかとなった。またこの発現バンドは、ヤギ由来ビオチン標識化抗ＨＢｓＡｇ抗体と、ウサギ由来アルカリフォスファターゼ標識化抗ビオチン抗体、あるいはＨｉｓＰｒｏｂｅＴＭ−ＨＲＰ結合体を各々用いたウエスタンブロッティングでも検出された事から、目的のｄＨＢｓＡｇ−ＺＺバンドである事が確認された。
【０１３１】
この可溶性画分（Ｓ−）を、平衡化緩衝液［０．５ＭのＮａＣｌ、及び３０ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］にて平衡化したＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラムに添加し、室温で５分間ｒｏｔａｔｅ後、ゆっくり流し素通り液を回収した（素通り画分）。次に約１ｍｌの上記平衡化緩衝液で７回、カラムを洗浄した後、イミダゾールの濃度を５００ｍＭに変えた上記平衡化緩衝液を用いて０．１ｍＬずつ１０回溶出させた（Ｎｉ−溶出画分：Ｅ）。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、次いでＣＢＢ染色を行った結果を図９（Ｂ）に示す。
【０１３２】
図中の矢印に示すように、Ｎｉ−カラム溶出画分（Ｅ）において、約７０％を超える高純度のｄＨＢｓＡｇ−ＺＺタンパク質が回収されることが明らかとなった。また、回収されたｄＨＢｓＡｇ−ＺＺタンパク質は、ｄＨＢｓＡｇタンパク質と同様に従来のＨＢｓＡｇタンパク質と比較して、Ｎ末端側を欠失する変異が施されていることから、自己凝集することによってウイルス様の粒子を形成しているものと考えられる。以後、この粒子をｄＢＮＣ−ＺＺと呼ぶことがある。
【０１３３】
また、発現用プラスミドによる大腸菌の形質転換から、高純度ｄＢＮＣ−ＺＺの取得までにかかった時間は約４日以内であり、迅速にＢ型肝炎ウイルス粒子様のナノカプセルを生産できることが明らかとなった。
【０１３４】
７） ｄＢＮＣ−ＺＺ粒子の性状解析
＜抗体認識能＞
ウサギ血清由来のＩｇＧを固相化しスキムミルクでブロッキングしたマイクロウェルプレートに、ＴＢＳで希釈したｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ遺伝子の発現菌体の可溶性画分、及びｄＨＢｓＡｇ遺伝子の発現菌体の可溶性画分を添加し、室温で２時間反応させた。各ウェルを３回洗浄後、標識抗体としてＴＢＳで希釈したウサギ由来ＨＲＰ標識化ＩｇＧを添加して室温で２時間反応させた。各ウェルを６回洗浄後、基質溶液［６ｍｇのｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、１２ｍＬの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、及び１２μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を混合して要事調製したもの］を加えて３０分間反応させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１０に示す。
【０１３５】
ｄＨＢｓＡｇ試料では吸光度の上昇が全く見られなかったが、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ試料では顕著な吸光度の上昇が観察された事から、ｄＢＮＣ−ＺＺ粒子では抗体結合能が維持されたＺＺドメインが多価でその粒子表面に提示されている事が示された。
【０１３６】
＜Ｓｕｃｒｏｓｅ密度勾配遠心解析＞
精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子を、上記５）のｄＨＢｓＡｇナノカプセルの性状解析にて示したｓｕｃｒｏｓｅ密度勾配遠心処理と同様の手法を用いて解析した結果を図１１に示す。比較対象として、酵母細胞を用いて生産した野生型ＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子（ビークル社製）を用いた。
【０１３７】
ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子は、比較対象の野生型ＢＮＣ−ＺＺ粒子と同じ８番目の画分に沈降ピークを示すことが明らかとなった。この結果から、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子も従来のＨＢｓＡｇ粒子や、ｄＨＢｓＡｇと同様に、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺタンパク質が自己凝集することによってウイルス粒子様の形状を有していることが示唆された。
【０１３８】
＜電子顕微鏡観察＞
精製したｄＢＮＣ−ＺＺを電子顕微鏡観察した。観察結果を図１２に示す。
【０１３９】
ｄＢＮＣ−ＺＺは、従来の野生型ＨＢｓＡｇ粒子と同様の表面形状を示す事から、ｄＨＢｓＡｇタンパク質が自己凝集することによって、エンベロープ様ナノ粒子構造形成する事が確認された。また、粒子径は２２±４ｎｍと、比較対象に用いた野生型ＨＢｓＡｇ粒子（２１±２ｎｍ）とほぼ同等の粒子径を有することも明らかとなった。この数値は、電子顕微鏡像から５０個の粒子を選択し、その直径を測定した平均値である。
【０１４０】
＜トリプシン切断実験＞
４．１μｇ／１０μＬの濃度の精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子に、終濃度が１２．５ｎｇ／μＬとなるようにＴＰＣＫ-トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えた後、３７℃で、２０分、２時間若しくは１６時間消化反応を行った。
【０１４１】
反応後の液に５μＬの４×Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５％の２−メルカプトエタノールを含有）を加えて、９５℃で５分処理した後、１５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色で全断片を、そしてＨＲＰ標識化抗ＨｉｓＰｒｏｂｅ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＣ末端Ｈｉｓ-ｔａｇを含む切断断片を、ＨＲＰ標識化抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＮ末端側ＨＢｓＡｇ配列を含む切断断片を、各々検出した。結果を図１３−２に示す。
【０１４２】
（Ａ）及び（Ｂ）において、（１）に示すバンドから、ｄＢＮＣ−ＺＺタンパク質の全長の存在が示唆される。（２）に示すバンドから、図１３−１に示すＢの位置でトリプシン消化され、Ｃ末端側のＨｉｓ−ｔａｇが欠失したタンパク質の存在が示唆される。（３）のバンドから、図１３−１のＣの位置でトリプシン消化され、ＺＺドメインのうち、Ｃ末端側のＺドメインを欠失下タンパク質の存在が示唆される。（４）のバンドから、図１３−１に示すＤの位置でトリプシン消化され２つのＺドメインが欠失したタンパク質の存在が示唆される。
【０１４３】
これらのバンドは、抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いたウエスタンブロッティングによっても確認されるバンドであることが（Ｂ）から明らかであり、本発明のｄＢＮＣ−ＺＺにおいて、Ｃ末端側のＺＺドメイン及びＨｉｓ−ｔａｇは、図１３−１に示すようにウイルス様粒子表面に露出している構造を有しており、即ちＣ末端側のアミノ酸配列がウイルス粒子様構造の外側に提示されていることが明らかとなった。なお、図１３−２の（Ｂ）において（５）にて示されるバンドは、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体によって確認されるバンドであることから、図１３−１のＥの位置でトリプシン消化されたものと考えられる。
【０１４４】
＜ＡＦＭ観察＞
精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子を金属板に固定したマイカ（雲母）に４μｌ添加した後に１５分間乾燥させ、大塚蒸留水（大塚製薬，徳島）により３回洗浄した。再び乾燥させ、この試料を走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＡ４００−ＤＦＭ、ＳＩＩ ＮａｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．；千葉）により観察した。比較対象として、酵母にて作製した野生型ＢＮＣ−ＺＺ粒子を用いた。結果を図１４に示す。
【０１４５】
精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子は、高さが６．７−１５．５ｎｍ程度で、直径は２８．７−５７．４ｎｍ程度であり、酵母で作製した野生型ＢＮＣーＺＺ粒子と類似した大きさであった。
【０１４６】
通常、脂質二重膜の厚さは５ｎｍ程度と考えられることから、１０ｎｍ以上の厚さを示すのは、脂質二重膜が２層以上重なっていると考えられ、ｄＨＢｓＡｇーＺＺ粒子は、従来のＢＮＣ−ＺＺ粒子と同様に、中空球状物の構造を有することが考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子様の形状を有するナノカプセルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＢ型肝炎ウイルス等のようなウイルスエンベロープタンパク質を宿主細胞にて生合成させると、当該タンパク質が宿主細胞から脂質二重膜といった脂質を取り込みつつ、自己凝集してウイルス粒子様のナノカプセルを形成することが既に知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１、２に示すように、ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質を生合成させることで、ウイルス粒子様のナノカプセルが作製できることが知られている。しかしながら、当該ナノカプセルの作製のために用いられる宿主細胞としては、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞等といった真核細胞に限られており、原核細胞を用いてウイルス様の粒子を形成した報告は未だ存在しない。
【０００４】
一方、特許文献３ではＨＢｓＡｇタンパク質のトランケートミュータントを、大腸菌を宿主細胞として用いて生合成させる技術が開示されているが、抗原としてのみ用いられる技術しか開示されておらず、ウイルス粒子様のナノカプセルが製造できるかどうかについては何ら明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０８５２３１号
【特許文献２】特許第４２１２９２１号
【特許文献３】特開２００２−１１２７９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生物宿主を用いて有用物質等を製造する場合、宿主として真核生物由来の細胞を用いるよりも原核生物由来の細胞を用いる方が、遥かに効率が良く、且つ簡便である。特に、タンパク質を主成分とするような有用物質を製造する際には、タンパク質を構成するアミノ酸に種々の変異を施して、機能を改良することが一般的な開発手段であるために、数多くの変異体を作製してその機能を評価するためには、効率が良く、簡便な製造手法が求められる。以上の点から、動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞等の真核生物由来の細胞を宿主として有用物質を製造することは、あまり好ましくない。
【０００７】
一方で、大腸菌などに代表される原核生物は、生産効率やコストの面において、有用物質を生産する宿主生物として非常に優れており、更に簡便な方法が提供できる。しかし複雑な立体構造等を有する有用物質の生産には向いておらず、立体構造を補正するシャペロン等といった特殊なタンパク質の存在下にて生産する方法や、化学的な試薬を用いて正常な立体構造に戻す操作が必要となり、結局のところ原核生物を用いる際に得られる効率の良さを相殺してしまうか、若しくはその効率を余計に悪くしてしまう虞もある。また、原核生物では生産量そのものが極めて低い有用物質も多い。
【０００８】
さらに、結局、有用物質そのものでは機能を十分に発揮できないものが製造されてしまい、特定の機能ドメインのみに限定された有用物質の一部分のみの生産しか実現しない場合もある。
【０００９】
本発明の課題は、特定の粒子構造を有するナノカプセルを、生物宿主を用いて高効率、且つ簡便に製造することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決すべく、出願人は鋭意研究を重ねた結果、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセルが、従来のナノカプセルと同等か、又はそれ以上の効果を有しながらも、従来の製造方法よりも容易で、且つ簡便な方法によって製造できることを見出した。
【００１１】
本発明は、係る知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様の発明を広く包含するものである。
【００１２】
項１ 下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【００１３】
項２ 下記の（５）〜（１０）のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド：
（５）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（６）配列番号３に示される塩基配列；
（７）上記（５）または（６）に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列；
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（９）配列番号４に示される塩基配列；
（１０）上記（５）〜（９）のいずれかに示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【００１４】
項３ 上記項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【００１５】
項４ 上記項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【００１６】
項５ 上記項１に記載のナノカプセルを製造する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のナノカプセルは、従前の大量生産に用いられていた酵母細胞ではなく、大腸菌を宿主細胞として用いて製造することが可能であるために、簡便、迅速、且つ低コストにナノカプセルを製造することが可能である。
【００１８】
従って、本発明のナノカプセルに新たな機能を付与するために、ナノカプセルの構成要素であるタンパク質に変異を施して、有用な機能を有する様々なナノカプセルの開発にかかる時間は、従来に比べて大きく短縮させることが可能となる。
【００１９】
また、本発明のナノカプセルは、従来のウイルス粒子様のナノカプセルとほぼ同等の粒径を有する。そして、本発明のナノカプセルには、従来のウイルス粒子様のナノカプセルと同様に、生体分子を認識するアミノ酸配列からなるペプチドをカプセルの外側に提示することが可能であり、ワクチンとしての利用のみならず、ＤＤＳ、診断薬、イメージング試薬、免疫測定試薬、バイオセンサー試薬等の分野に有用である。
【００２０】
そして、本発明のナノカプセルは、従来のナノカプセルと比較して短いアミノ酸配列からなるタンパク質を構成成分とするために、タンパク質の重量が比較的少ないナノカプセルが提供されるので、従来のナノカプセルと比較して、堅牢な構造を取り難くなる。従って、本発明のナノカプセルは、特に内部に物質を包含させる点において、従来のウイルス粒子様のナノカプセルよりも優れた効果を示す傾向となり、ＤＤＳ等の用途に特に有用である。
【００２１】
さらに、本発明のナノカプセルは、従来のウイルス粒子様のナノカプセルと比較して、抗原性が低いことから人体に投与した際の安全性が高いことが明らかであるため、特にＤＤＳの分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の各種ナノカプセルが有するタンパク質のドメイン等を説明する模式図。
【図２】本発明の各種ナノカプセルが有するタンパク質のアミノ酸配列と、それをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター等を説明する模式図。（A）はｄＨＢｓＡｇを示し、（Ｂ）はｓ＋ｄＨＢｓＡｇを示す。
【図３】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、各種大腸菌株を用いた合成、及び培養条件等を説明する図。
【図４】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、大腸菌を用いて合成させた際の菌体内局在等を説明する図。Ｍはマーカー、Ｔは全菌、Ｐはペリプラズム画分、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｓ＋はＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下での超音波破砕による可溶性画分、Ｉ不溶性画分を示す。
【図５】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、大腸菌を用いて合成させた際の菌体内局在等を説明するグラフ。Ｃは培養上清、Ｐはペリプラズム画分、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｓ＋はＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下での超音波破砕による可溶性画分を示す。
【図６−１】本発明のナノカプセルの精製時における、抗ＦＬＡＧ抗体カラムクロマトグラフィー溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。Ｍはマーカー、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｆは素通り画分、ＩＷはカラムの初回洗浄後画分、ＬＷはカラムの最終洗浄画分を示す。
【図６−２】本発明のナノカプセル精製時の、ゲル濾過カラムクロマトグラムチャートを示す。
【図６−３】本発明のナノカプセル精製時の、ゲル濾過ピーク画分（Ｆｒ．１０）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(CBB染色)、及び各種抗体を用いたウエスタンブロッティング解析を示す。
【図７】本発明のナノカプセルをショ糖密度勾配遠心解析した結果を示す図。黒丸は、ｄＨＢｓＡｇの結果を表し、灰色の領域は従来法で作製したＨＢｓＡｇを表す。グラフの左軸は、全タンパク質中のｄＨＢｓＡｇ又はＨＢｓＡｇタンパク質の重量割合を示す。
【図８】本発明のナノカプセルの電子顕微鏡写真像。（Ａ）は市販の精製ＨＢｓＡｇ粒子（ビークル社製）を示し、（Ｂ）はｄＨＢｓＡｇ粒子を示す。
【図９】本発明のナノカプセルが有するタンパク質を、大腸菌を用いて合成させた際の培養条件、菌体内局在、及び精製条件等を説明する図。（Ａ）培養条件及び菌体内局在を示す。Mはマーカー、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、Ｓ＋はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００存在下での超音波破砕による可溶性画分、Ｉは不溶性画分を示し、ＩＰＴＧは、全菌試料を表す。（Ｂ）精製条件を表す。Ｍはマーカー、Ｓ−は超音波破砕による可溶性画分、ＥはＮｉ−カラム溶出画分を示す。
【図１０】本発明のナノカプセルと抗体の結合能等を説明する図。△はｄＢＮＣと抗体との結合を示し、○はｄＢＮＣーＺＺと抗体との結合を示す。
【図１１】本発明のナノカプセルをショ糖密度勾配遠心解析した結果を示す図。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果であり、Ｍはマーカーを示す。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析における２８ｋＤａのバンドを数値化したもの（黒丸）。灰色は従来法で作製したＨＢｓＡｇーＺＺを表す。グラフの左軸は、全タンパク質中の本発明のナノカプセル又はＨＢｓＡｇタンパク質量の割合を示す。
【図１２】本発明のナノカプセルの電子顕微鏡写真像。（Ａ）市販の精製ＨＢｓＡｇ粒子、（Ｂ）ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子。
【図１３−１】本発明のナノカプセルのトリプシン消化実験を説明する模式図。
【図１３−２】本発明のナノカプセルのトリプシン消化実験の結果を示す図。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果、（Ｂ）各種抗体を用いたウエスタンブロッティング解析。
【図１４】本発明のナノカプセルのAFM写真像。（Ａ）ＡＦＭ写真像、（Ｂ）縦断面解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． 「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ等の文献を参照すればよい。
【００２４】
本発明のナノカプセル
本発明のナノカプセルは、下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。
【００２５】
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【００２６】
本発明のナノ粒子には、（１）〜（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のうち、一種のみのタンパク質が含まれていても良く、二種以上のタンパク質が含まれていても良い。例えば、（１）に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と、（２）に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を一定の比率で含むナノ粒子は、生体認識分子の提示能に優れることから、特に免疫測定試薬等の分野にて優れた効果を示す傾向にある。
【００２７】
上記（１）〜（４）にて示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、自己凝集することによってウイルス粒子様の形状を形成する性質を有する。このような性質を本明細書では粒子形成能と定義する。
【００２８】
本発明のナノカプセルは、ウイルスエンベロープ様の粒子形状を有する。ウイルス粒子様の形状とは、脂質二重膜によって構成される殻の構造に、上記のタンパク質が包埋される形状である。本発明のナノカプセルは、リポソームといった脂質のみから構成される粒子形状の構造物と比較して、タンパク質が構成成分に含まれるため、リポソームよりも構造安定性が高いという性質を有する。このような形状は、単にウイルス様粒子とも称され、具体的には球状、楕円球状、ラグビーボール状、略球状等とも理解される形状である。
【００２９】
本発明のナノカプセルには、上述のタンパク質以外に、製造する際の使用する宿主細胞に存在する、タンパク質、脂質、核酸等といった成分が含まれる。なお、これらの成分は上述のタンパク質に結合した状態でナノカプセルに含まれていても良い。
【００３０】
本発明のナノカプセルにおける上記タンパク質の含有量は、特に限定はされないが、ナノカプセル１００重量部に対して通常は７５〜重量部９０重量部程度である。
【００３１】
本発明のナノカプセルに含まれる脂質の含有量は、特に限定されないが、ナノカプセル１００重量部に対して通常は１０〜重量部２５重量部程度である。
【００３２】
本発明のナノカプセルの内部は、中空であってもよく、水分、脂質成分、イオン成分等が含まれていてもよい。
【００３３】
本発明のナノカプセルの粒子径は、通常は１０〜２００ｎｍ程度であり、より好ましくは１３〜１００ｎｍ程度、より好ましくは１６〜５０ｎｍ程度であり、最も好ましくは２０〜３０ｎｍ程度である。ここで、粒子径の測定方法は、電子顕微鏡像から、無作為に抽出したナノカプセルの直径を測定し、それらの平均値によって算出したものである。なお、本発明のナノカプセルは、エクストルーダーを用いて、孔径の小さいフィルターを通過させることによって適宜調節することが可能である。
【００３４】
本発明のナノカプセルは、（ａ）及び（ｃ）に上述したように従来のＨＢｓＡｇタンパク質を含むナノカプセルと比較して、アミノ酸配列を大幅に欠失しながらも、粒子形成能を保持している。このようなアミノ酸からなるタンパク質を含む本発明のナノカプセルは、内部に蛍光物質、放射性物質、磁性物質等の標識物質；ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等の核酸；薬剤といったＤＤＳ、生体内でのキャリアー等として送達又は移送させるべき分子を、より高効率に内包させることが可能である。
【００３５】
なお、ここでいう内包とは、ナノカプセルの内部に当該分子の全てが完全に包み込まれている必要はなく、当該分子の一部がナノカプセルの外部に突出していてもよい。
【００３６】
本発明のナノカプセルに、上述した分子を内包させる方法は、特に限定はされないが、脂質融合を利用した方法、エレクトロポーレーション法等が挙げられる。
【００３７】
その他に、本発明のナノカプセルを構成する粒子形成能を有するタンパク質を、界面活性剤やその他手段を用いて粒子構造を破壊し、次いで所望の内包分子と混和した後に、再度、粒子形成させて得られるナノカプセル中に、分子を内包する方法が挙げられる。
【００３８】
上記（１）にて定義する配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ９Ｗ９６６に示されるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（以後、ＨＢｓＡｇと称することがある。）のＳタンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸残基数２２６）に対して、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す変異を施したアミノ酸配列である。
【００３９】
（ａ）２〜７７番目のアミノ酸残基の欠失。
（ｂ）７８番目及び７９番目のアルギニン残基の、それぞれセリン残基への置換。
（ｃ）１７３−２２６番目のアミノ酸残基を欠失。
【００４０】
特に、上記の（ｂ）に示すような変異を導入することにより、本発明のタンパク質が宿主細胞内にて効率的に作製され易くなり、ひいては当該タンパク質を含むナノカプセルの形成に有利となる。
【００４１】
上記（２）にて定義する生体分子は特に限定されないが、具体的には表面抗原、レセプター、抗体、サイトカイン、転写因子等の糖タンパク質若しくはタンパク質、又はペプチド若しくは糖ペプチド；ヘパリン、シアルルイスＸ等の糖若しくは糖鎖等が挙げられる。
【００４２】
上記（２）にて定義する生体分子を認識するアミノ酸配列は、特に限定はされないが、例えば生体分子がレセプターであれば、当該レセプターに対して相互作用する各種成長因子等のアミノ酸配列とすればよい。
【００４３】
例えば、生体分子がビオチンであれば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等に代表されるアビジン系タンパク質のアミノ酸配列とすればよい。
【００４４】
例えば、生体分子が糖鎖である場合には、アグルチニン、セレクチン等のレクチンのアミノ酸配列とすればよい。
【００４５】
例えば、生体分子が抗体である場合には、配列番号５に示すＳｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓｕ由来のＰｒｏｔｅｉｎ ＡにおけるイムノグロブリンＧのＦｃドメインに結合する領域に存在するアミノ酸配列であるＺタグのアミノ酸配列とすればよい。なお、ここで言う抗体とは、上述のＦｃドメインを有さないＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２等の構造を有する抗体は含まれない。
【００４６】
例えば、標的生体分子を認識するペプチドあるいはアフィボディーを、ライブラリーから選んで、そのアミノ酸配列を用いてもよい。
【００４７】
上記（２）にて定義する生体分子を認識するアミノ酸配列は、上記（１）に示されるアミノ酸配列の内部、Ｎ末端側、又はＣ末端側のいずれの位置に付加されていてもよいが、当該アミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセルの構造の安定性、又は生体分子を認識するアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはペプチドをナノカプセルの外側に提示させることに鑑みて、Ｃ末端側に付加されることが好ましい。
【００４８】
ここで、「Ｃ末端側」とは、Ｃ末端から１〜５番目程度のアミノ酸残基の位置、又はＣ末端側に０〜１５個程度のアミノ酸配列（いわゆるスペーサー配列）を付加したさらに後ろ側の位置を意味する。なお、「Ｎ末端側」も同様に説明される。
【００４９】
このように、生体分子を認識するアミノ酸配列が、ナノカプセルの外側に提示された上記（２）にて定義するアミノ酸配列としては、配列番号２に示すアミノ酸配列又に示すアミノ酸配列などが挙げられる。
【００５０】
なお、生体分子を認識するアミノ酸配列は一種でも二種以上を組み合わせて付加されていてもよい。
【００５１】
上記（４）にて定義する置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるアミノ酸の数は、（４）に定義するアミノ酸配列からなるタンパク質が、粒子形成能を失わない範囲とすればよく、特には限定されないが、通常は２０個程度以下とすればよく、好ましくは１５個程度以下、より好ましくは１０個程度以下、更に好ましくは５個程度以下であり、最も好ましくは１個である。
【００５２】
なお、置換に関しては、上記（４）にて定義するアミノ酸配列からなるタンパク質が粒子形成能を失わないように、置換対象となるアミノ酸そのものの性質を変化させないような類似アミノ酸の範疇において適宜選択すればよい。ここで、類似アミノ酸とは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ等といった芳香族アミノ酸；Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ等といった脂肪族アミノ酸；Ｇｌｎ、Ａｓｎ等といった極性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ等といった塩基性アミノ酸；Ｇｌｕ、Ａｓｐ等といった酸性アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等といった水酸基を有するアミノ酸；Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ等といった側鎖の小さいアミノ酸等に挙げられる各グループ内のアミノ酸である。例えばＬｅｕは、同じ脂肪族アミノ酸の範疇に含まれる類似アミノ酸であるＩｌｅに置換すればよい。
【００５３】
なお、上述の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなる本発明のタンパク質には、当該タンパク質を精製すること、当該タンパク質を検出すること等を目的として、各種タグポリペプチドが付加されていてもよい。具体的なタグポリペプチドとして、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＧＦＰタグ、Ｚタグ、ストレプタグ等が挙げられる。 これらのタグポリペプチドは、単独で付加されていても、二種以上を組み合わせて付加されていてもよい。なお、上記のタグポリペプチドは、上述した（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列内部に挿入される形で付加されていても、当該アミノ酸配列のＣ末端側に付加されていても、Ｎ末端側に付加されていてもよい。本発明のナノカプセルの構造の安定性、又は当該タグポリペプチドをナノカプセルの外側に提示することに鑑みて、Ｃ末端側に付加されることが好ましい。なお、「Ｎ末端側」、及び「Ｃ末端側」なる用語は、既に定義したとおりである。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは下記の（５）〜（１０）のいずれかに示す塩基配列からなる。
【００５５】
（５）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（６）配列番号３に示される塩基配列。
（７）上記（５）または（６）に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列。
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（９）配列番号４に示される塩基配列。
（１０）上記（５）〜（９）のいずれかに示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【００５６】
上記（５）にて規定する塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を基に、in silico技術を採用することによって塩基配列を決定することができる。in silico技術を用いれば、１つのアミノ酸配列から、そのアミノ酸配列をコードする多数の塩基配列が決定されることになるが、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させる際に用いる宿主細胞に対して適当なコドン頻度を考慮すれば、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする、より好ましい態様の塩基配列を決定することができる。
【００５７】
上記（６）にて規定する配列番号３に示される塩基配列は、上記（５）に示す配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一態様である。
【００５８】
上記（７）にて規定する生体分子、及び生体分子を認識するアミノ酸配列は、上述した本発明のナノカプセルの（２）に定義したものと同様にすればよく、例えば上述したZタグをコードする塩基配列は、配列番号６にて示される。
【００５９】
なお、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列も、上述の（５）にて説明したin silico技術を採用することによって決定できる。そして、当該塩基配列の好ましい態様も、上述のようにコドン頻度を考慮して決定できる。
【００６０】
上記（８）にて規定する塩基配列も上記（５）と同様に、上述の配列番号２に示すアミノ酸配列を基に、in silico技術並びにコドン頻度を考慮して決定することができる。
【００６１】
上記（９）にて規定する配列番号４に示される塩基配列は、上記（８）に示す配列番号２を基に決定した塩基配列の一態様である。
【００６２】
上記（１０）にて定義する置換、欠失、挿入、及び／又は付加される塩基の数は、（１０）に定義する塩基配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質が、粒子形成能を失わない範囲とすればよく、特には限定されないが、通常は３０個以下とすればよく、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下であり、最も好ましくは３個以下である。
【００６３】
なお、置換に関しては、上記（１０）にて定義する塩基配列がコードするアミノ酸配列において、上記（４）にて定義した他の類似アミノ酸となるように塩基配列を置換すればよい。例えば、塩基配列中において、脂肪族アミノ酸の範疇に含まれるＬｅｕを、同じく脂肪族アミノ酸の範疇に含まれる類似アミノ酸であるＩｌｅに置換するように、Ｌｅｕをコードする「ＣＴＴ」なる塩基配列を、「ＡＴＴ」と置換すればよい。
【００６４】
本発明の組換えベクター
本発明の本発明の組換えベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含むものである。組換えベクターとは生物宿主に導入することによって、特定の遺伝子を発現するものであり、本発明においては、上述した本発明のポリヌクレオチドを発現するものである。
【００６５】
上記の生物宿主としては、特に限定はされないが、原核細胞であることが好ましい。具体的には、大腸菌、枯草菌、乳酸菌等が挙げられるが上述した本発明のポリヌクレオチドを効率的に発現させることを勘案すれば、大腸菌であることが好ましい。即ち、本発明の組換えベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含む大腸菌発現用ベクターが好ましい。
【００６６】
具体的な大腸菌発現ベクターは、公知のものを採用すればよく、特に限定はされないが、ＩＰＴＧ、ラムノース等の存在下において、上述した本発明のポリヌクレオチドの発現を誘導することができるベクターを用いることが好ましい。例えば、ｐＥＴベクターシリーズや、ｐＧＥＸベクターシリーズ等を挙げることができる。
【００６７】
本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、上述した本発明の組換えベクターを含むものであり、上述した組換えベクターによって上述の生物宿主が形質転換されたものを意味する。
【００６８】
形質転換する方法は特には限定されず、塩化カルシウム法や塩化ルビジウム法で作成したコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポーレーション法、プロトプラスト法等が挙げられる。
【００６９】
なお、上述の組換えベクターが、ＩＰＴＧによって特定の遺伝子の発現を誘導するものであり、用いる宿主細胞が大腸菌である場合には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子がゲノム中に配置されたＤＥ３株の大腸菌であることが好ましい。
【００７０】
本発明のナノカプセルを製造する方法
本発明のナノカプセルを製造する方法は、以下の３つの工程を含むものである。
（ｉ）上述した本発明の形質転換体を培養する工程、
（ｉｉ）当該形質転換体の培養物の可溶化液を回収する工程、及び
（ｉｉｉ）当該可溶化液からナノカプセルを精製する工程。
【００７１】
上記（ｉ）における、上述した形質転換体の培養方法は、それぞれの形質転換体に適合した公知の培養方法を採用すればよい。例えば、上述のように形質転換体が大腸菌であり、ＩＰＴＧ、ラムノース等による発現誘導を可能とする組換えベクターを保持している場合には、２０℃程度の低温条件下で長時間の培養を行うことが好ましい。
【００７２】
上記（ｉｉ）における、形質転換体の培養物からの可溶化液の回収方法は特に限定されず、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘシリーズ、Ｔｗｅｅｎシリーズ、ＮＰ４０等といった公知の界面活性剤を用いる方法；超音波処理に供する方法；液体窒素等の冷媒を用い、特定の機器を用いて細胞膜、細胞壁等を破砕する凍結融解法；ガラスビーズ法；ザイモリエースなどのような細胞壁を消化する酵素を用いたスフェロプラスト法；高圧化にて処理を行うフレンチプレス法等の公知の可溶化方法を培養物に対して採用した後に、遠心分離処理に供して得られる液相分画を回収すればよい。なお、これらの可溶化方法は、単独であっても、２種類以上を組み合わせて採用しても良い。
【００７３】
上記（ｉｉｉ）における、可溶化液から本発明のナノカプセルを精製する方法は、特に限定されることはなく、公知のタンパク質の精製法を採用すればよい。
【００７４】
例えば、上述の可溶化液を塩化セシウム、スクロース、グリセロール、ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｐｅｒｃｏｌ等の成分を各種濃度又は線形グラジエント濃度勾配にて含有する緩衝液と、超遠心分離処理を採用した密度勾配遠心分離法に供して、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に熱処理を与えて、主に夾雑タンパク質等を変性させて本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に対して硫酸アンモニウム、エタノール酢酸、アセトン等を作用させて、主に夾雑タンパク質を変性させることにより、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に対して硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールを加えて沈殿させる事で、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法；上述の可溶化液に対してクロマトグラフィー用いて、本発明のナノカプセル以外の成分を除去する方法等が挙げられ、これらの方法は単独で採用しても、二種類以上を組み合わせて採用しても良い。
【００７５】
上述したクロマトグラフィーの具体的な種類は、特に限定されないが、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのクロマトグラフィーは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７６】
本発明の組換えベクターが、上述したタグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が含む場合には、当該タグポリペプチドとの相互作用に基づいたアフィニティカラムを用いることが好ましい。
【００７７】
例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ等のタグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを含む形質転換体から得られた可溶化液より精製する場合、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ｍｙｃ抗体等といった、タグポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を担持するポリマーを担持したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、当該ペプチドを高濃度で含有する緩衝液、又はＧｌｙｓｉｎ−ＨＣｌ緩衝液のような、ｐＨが１〜５程度の酸性緩衝液を用いることが好ましい。
【００７８】
また、本発明のナノカプセルがＭＢＰタグを有する場合には、マルトース等といった糖類を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、糖類を高濃度で含む緩衝液を用いることが好ましい。
【００７９】
さらに、本発明のナノカプセルがＨｉｓタグを有する場合には、Ｎｉ−ＮＴＡといったヒスチジンとキレート結合が可能となる金属化合物を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが好ましい。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、イミダゾールを高濃度で含有する緩衝液を用いることが好ましい。
【００８０】
このようなタグポリペプチドは、精製後適当なプロテアーゼで本発明のナノカプセルから切断除去してもよい。
【００８１】
なお、本発明のナノカプセルが、上述した生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を含む場合、当該生体分子を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが有効である。このようなアフィニティクロマトグラフィーを用いる場合の溶出液としては、当該生体分子を高濃度で含有する緩衝液を用いることが好ましい。
【００８２】
例えば、生体分子がストレプトアビジンのようなアビジン系タンパク質であり、生体分子を認識するアミノ酸がビオチンである場合には、アビジン系のタンパク質を担持するポリマーを採用したアフィニティクロマトグラフィーを用いることが有効であり、溶出液としてはビオチンを高濃度で含有する緩衝液を用いる方法が挙げられる。
【００８３】
なお、本発明のナノカプセルを製造する過程では、当該ナノカプセルを構成するタンパク質の分解を抑えるために、低温条件下での操作とすることが好ましく、必要に応じてＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ等のタンパク質分解酵素阻害剤を１種又は２種以上で組み合わせて用いてもよい。
【００８４】
上述のように、本発明のナノカプセルは、上述の本発明の粒子形成能を有するタンパク質が自己凝集することによってウイルス様粒子となり形成されるが、ウイルスエンベロープ様粒子を形成する場は、宿主細胞内、試験管内、培養容器内等といった当該タンパク質の合成の場か、タンパク質合成の終了後の精製、回収、保存等の場であり、特に限定はされない。
【実施例】
【００８５】
１）発現ベクターの構築
Ｃ末端５４残基を欠失させＦＬＡＧ−ｔａｇ配列で置換したＨＢｓＡｇ抗原タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡである、ベクターｐＢＯ７４９（国際公開番号ＷＯ２００５／０４９８２４）を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ＃１５７５（配列番号７）と＃１５５５（配列番号８）とを用いたＰＣＲにより、Ｎ末端７６残基とＣ末端５４残基とを同時に欠失した、配列番号９に示す塩基配列を含む欠失型ＨＢｓＡｇ遺伝子（以後、ｄＨＢｓＡｇと称することがある。）断片を増幅した。
【００８６】
増幅された遺伝子断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理した後、アガロースゲル電気泳動でｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片を単離及び精製した。大腸菌発現用ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理した後、ｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片のＮｄｅＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素消化処理後物と連結し、ｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現用ベクターｐＢＯ１４６５を得た。
【００８７】
構築されたｄＨＢｓＡｇ遺伝子には、Ｃ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇとＨｉｓ６−ｔａｇ配列が融合されている（図１及び図２）。
【００８８】
同様に、ベクターｐＢＯ７４９を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ＃１５５４（配列番号１０）と＃１５５５（配列番号８）とを用いたＰＣＲにより、Ｎ末端７６残基とＣ末端５４残基とを同時に欠失した、配列番号１１に示す塩基配列からなる欠失型ＨＢｓＡｇ遺伝子（以後ｓ+ｄＨＢｓＡｇと称することがある。）断片を増幅した。
【００８９】
増幅された遺伝子断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動でｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片を単離及び精製した。大腸菌発現用ベクターｐＥＴ２２ｂも同様にＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素処理した後、制限酵素処理後のｄＨＢｓＡｇ遺伝子断片と連結し、ｓ+ｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現用ベクターｐＢＯ１４５８を得た。
【００９０】
なお図２にて示すように、構築されたｓ+ｄＨＢｓＡｇ遺伝子は、上述のｄＨＢｓＡｇ遺伝子と比較すれば、アミノ酸に翻訳された際にＮ末端側のアミノ酸配列のみが異なっている。
【００９１】
２）大腸菌によるｄＨＢｓＡｇの発現
上記のｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現用ベクターｐＢＯ１４６５及びｓ＋ｄＨＢｓＡｇ大腸菌発現ベクターｐＢＯ１４５８を遺伝子発現用大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）株、Ｃ４１（ＤＥ３）株、Ｃ４３（ＤＥ３）株、並びにＫＲＸに形質転換し、翌日出現したコロニー数十個を、０．５％ｇｌｕｃｏｓｅと終濃度で２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む４ｍＬ若しくは３０ｍＬのＬＢ培地で、３７℃で２〜５時間振盪培養した。
【００９２】
１．５ｍＬ若しくは１２ｍＬの菌懸濁液を、それぞれ終濃度で５００μｇ／ｍｌアンピシリンをする含有５０ｍＬ若しくは４００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、さらに３７℃、２〜５時間振盪培養した。ＯＤ６００が０．８〜１．０になったところでＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように加えた。なお、ＫＲＸ株の場合は、ＩＰＴＧに換えて０．１％のラムノースを添加した。低温培養検討（２０℃で4時間〜一晩培養）時には、ＩＰＴＧ添加前に培養温度を２０℃に下げた。
【００９３】
ＩＰＴＧの添加後、３７℃で４時間若しくは２０℃で一晩（低温培養時）培養した後に菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前と培養終了時における１ｍｌの培養液分の菌体を超純水１００μＬに再懸濁した後、当容量の２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［２０％のｇｌｙｃｅｒｏｌ、４％ＳＤＳ、０．０２％ＢＰＢ、及び１０％の２−ＭＥを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）］を加えて溶解し、９５℃で５分間加熱処理した後の２０μＬ（全菌試料：Ｔとする）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、続いてクマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ染色）を行った。結果を図３に示す。
【００９４】
ｓ+ｄＨＢｓＡｇは、いずれの大腸菌株においてもＩＰＴＧ誘導に基づくバンドの出現は観察されなかったが、ｄＨＢｓＡｇでは図中の矢印の位置に示されるように、全ての大腸菌株においてＩＰＴＧ誘導に基づくバンドの出現は観察された。以上のことから、大腸菌を用いてナノカプセルを構成するタンパク質を生合成するには、そのＮ末端側のアミノ酸配列が重要であることが明らかとなった。
【００９５】
３）ｄＨＢｓＡｇ発現における大腸菌体内の局在
ｄＨＢｓＡｇを発現する大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）株を上記の各種培養条件で培養し、菌体回収時の遠心後の上清を培養上清（Ｃ）とした。１ｍＬの培地による培養にて得られた菌体を、２０％のｓｕｃｒｏｓｅを含む３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を７５ｍＬ用いて再懸濁した。ここに、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１．５μＬ加え、室温条件下で１０分間Ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。
【００９６】
次いで、１００００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈殿画分を、氷冷した５ｍＭのＭｇＳＯ４に再懸濁し、４℃で１０分間ｖｏｒｔｅｘ処理を行った。次いで、１００００ｒｐｍ、４℃の条件にて、１０分間遠心し、得られた上清をペリプラズム画分（Ｐ）とした。一方で、得られた沈殿画分を、０．７５ｍＬの氷冷Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［５%のｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］に再懸濁し、終濃度１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＰＭＳＦを加えた。
【００９７】
このサンプルを、２回凍結融解処理に供した後、氷上で３０秒ずつ２回の超音波破砕処理を行った。次いで、１４０００ｒｐｍ、４℃の条件にて、１０分間遠心し、得られた上清画分を可溶性画分（Ｓ−）とした。
【００９８】
一方で、得られた沈殿画分を０．７５ｍＬの氷冷Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、終濃度１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＰＭＳＦを加えた。さらに終濃度が０．５%となるようにＴｒｉｏｔｎＸ−１００を加え、３０秒間の超音波破砕処理を１回行った。次いで、１４０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１０分間遠心し、得られた上清画分を可溶性画分（Ｓ＋）とした。
【００９９】
一方で、得られた沈殿画分を０．７５ｍＬの氷冷Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁したものを不溶性画分（Ｉ）とした。以上の各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、次いでＣＢＢ染色を行った。結果を図４に示す。
【０１００】
図中の矢印の位置に示されるように、ｄＨＢｓＡｇタンパク質はペリプラズム画分（Ｐ）には認められず、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００非存在下並びに存在下の可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）、及び不溶性画分（Ｉ）に分散して認められた。また、３７℃における培養では不溶性画分（Ｉ）へ、２０℃における培養では、可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）により多く局在することが明らかとなった。
【０１０１】
また、培養時に得られた菌体回収時の上清画分（Ｃ）、ペリプラズム画分（Ｐ）、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下、並びに非存在下の可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）を、抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いた酵素免疫測定法（ＩＭｘ−ＨＢｓＡｇ；ダイナボッド社）にて、ＨＢｓＡｇタンパク質を測定した。結果を図５に示す。
【０１０２】
図４にて示される結果と同様に、ＨＢｓＡｇタンパク質はペリプラズム画分（Ｐ）には殆どは局在が認められず、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などのような界面活性剤の存在下並びに非存在下の可溶性画分（Ｓ−並びにＳ＋）として抽出できることが明らかとなった。
【０１０３】
４）ｄＨＢｓＡｇタンパク質を含むナノカプセルの精製
引き続いて、ｄＨＢｓＡｇタンパク質を含むナノカプセル（以後、ｄＢＮＣと呼ぶことがある。）の精製を行った。
【０１０４】
ＩＰＴＧによる誘導下（培養温度は３７℃）にてｄＨＢｓＡｇを発現した菌体をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ［１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］に再懸濁し、最終濃度が１ｍＭになるようにＰＭＳＦを加えた。次いで、１分ずつ５回氷上で冷却しながら超音波破砕した。その後、８０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１５分間遠心し上清を可溶性画分（Ｓ−）とした。ここで得られた沈殿を０．１%のＴｗｅｅｎ８０を含むＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、最終濃度が１ｍＭとなるようにＰＭＳＦを加えて、１分ずつ５回氷上で冷却しながら超音波破砕した。超音波破砕後の溶液を同様の条件で遠心して、上清を可溶性画分（Ｓ＋）とした。残った沈澱を超純水に懸濁して不溶性画分（Ｉ）とした。これらの試料（１００μＬの培養液分に相当）に当容量の２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて溶解し、９５℃で５分間加熱処理した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルとした。
【０１０５】
ＴＢＳ［１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］で平衡化した抗ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ （Ｓｉｇｍａ社）カラム（ｂｅｄ量：１ｍＬ）に、上記の可溶性画分（Ｓ−）をインジェクションし、４℃で２時間ｒｏｔａｔｅ後、ゆっくり流し素通り液を回収した。回収した画分を素通り画分（Ｆ）とした。
【０１０６】
次に、０．７５ｍＬのＴＢＳ５００［ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭとした上記ＴＢＳ］でカラムを数回洗浄後（初回の洗浄後画分を（ＩＷ）とし、最終洗浄画分を（ＬＷ）とする。）、０．４ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１ＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）］で８回に分けて溶出した。得られた溶出画分をそれぞれ溶出画分（１）〜（８）とした。
【０１０７】
溶出画分には直ちに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１４μＬ混合して中和し、その後、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いでＣＢＢ染色を行った。結果を図６−１に示す。
【０１０８】
図中の矢印に示すように、抗ＦＬＡＧカラム溶出画分の（２）〜（７）において、ｄＨＢｓＡｇタンパク質のバンドが検出された。これらの溶出液のそれぞれ２ｍＬを、０．１５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；直径１．６ｃｍ×高さ４０ｃｍ；ｂｅｄ量２４ｍＬ）にインジェクションし、０．７５ｍＬを１画分として回収した。
【０１０９】
図６−２に示すように、ＨＢｓＡｇタンパク質は、１０番目の画分にて最も多く溶出されることが明らかとなった。当該画分は６６９ｋＤａの分子量を有するサイログロブリンと同様の位置で流出することが明らかとなった。そして、図６−３に示すように、１０番目の当該溶出ピーク画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により８０％以上の純度でｄＨＢｓＡｇタンパク質を含有することを示した。
【０１１０】
また図６−３に示すようにＨＲＰ標識化抗ＦＬＡＧ抗体（抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＣＯＮＪＵＧＡＴＥ、ＳＩＧＭＡ）、ヤギ由来のビオチン標識化抗ＨＢｓ抗体とウサギ由来のアルカリフォスファターゼ標識化抗ビオチン抗体（ＩＭｘ ＨＢｓＡｇ試薬；ダイナボット）、あるいはＨｉｓＰｒｏｂｅＴＭ−ＨＲＰ結合体（Ｔｈｅｒｍｏ社）を各々用いたウエスタンブロッティングでも検出された事から、目的のｄＨＢｓＡｇバンドである事が確認された。
【０１１１】
以上の結果より、ｄＨＢｓＡｇタンパク質は自己凝集して７００ｋＤａ程度の複合体を形成していることが確認された。
【０１１２】
５）ｄＢＮＣの性状解析
＜Ｓｕｃｒｏｓｅ密度勾配遠心解析＞
１６ｍＬの遠心管（１６ＰＡ ＴＵＢＥ ＡＳＳＹ；ＨＩＴＡＣＨＩ社）に底からスクロース濃度を５０、４０、３０、２０、及び１０重量％含むＢｕｆｆｅｒＡ［６８．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３１．６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５ｍＭの ＥＤＴＡ・２Ｎａ、及び０．８５％のＮａＣｌ］を２．５ｍＬずつ順に重層し、その上に上記４）にて示す可溶性画分（Ｓ−）を２．５ｍＬ重層した後、超遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＰ７０ＭＸＸ；ＨＩＴＡＣＨＩ社）を用いて４℃、２４０００ｒｐｍの条件で１４時間遠心した。
【０１１３】
陽性対照として、Ｃｏｓ７細胞によって一過的に製造されたＨＢｓＡｇ粒子（培養上清から回収したもの）を用いた。また、陰性対照として、２ｍｇのウサギ血清由来のＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、分子量１５０ｋＤａ）をＢｕｆｆｅｒＡで２．５ｍＬに希釈したものを用いた。
【０１１４】
遠心処理の後、あらかじめ重量を測定しておいた１．５ｍＬチューブに１ｍＬずつ回収し、重量を測定して密度を求めた。各画分のＨＢｓＡｇ量をＩＭｘ ＨＢｓＡｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ダイナボット社）を用いて測定した。ウサギ血清由来ＩｇＧの濃度はＵＶ法により測定した。その結果を図６に示す。
【０１１５】
ｄＨＢｓＡｇタンパク質はＣｏｓ７細胞を用いて作製したＨＢｓＡｇ粒子と同様に６−８番目の画分に沈降ピークを示した。ウサギ由来ＩｇＧの沈降ピークは２番目画分であった。以上の結果から、ｄＨＢｓＡｇタンパク質は自己凝集し、従来のＨＢｓＡｇ粒子と同様に粒子形成していることが示唆された。
【０１１６】
＜電子顕微鏡観察＞
抗ＦＬＡＧ抗体溶出画分について、ネガティブ染色法を用いて透過型電子顕微鏡（ＥＬＥＣＴＲＯＮ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＥ Ｈ−７１００Ｓ；ＨＩＴＡＣＨＩ）観察した。比較対象として野生型ＨＢｓＡｇ粒子（ビークル社製）を用いた。結果を図５に示す。
【０１１７】
ｄＨＢｓＡｇタンパク質は、比較対象に用いた野生型ＨＢｓＡｇ粒子と同様に、ウイルスエンベロープ様ナノ粒子（ｄＢＮＣ）が形成する事が明らかとなった。また、ｄＢＮＣの粒子径は２５±５ｎｍと、比較対象に用いた野生型ＨＢｓＡｇ粒子（２１±２ｎｍ）とほぼ同等の粒子径を有することも明らかとなった。この数値は、電子顕微鏡像から５０個の粒子を選択し、その直径を測定した平均値である。
【０１１８】
＜ｄＢＮＣの抗原性＞
２種の市販のＨＢＶ体外診断用酵素免疫測定法キット（ＩＭｘ ＨＢｓＡｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｂｂｏｔｔ社、及びＥｎｚｙｇｎｏｓｔ ＨＢｓＡｇ ５．０ ｋｉｔ；ＳＩＭＥＮＳ社）を用いて、精製ｄＢＮＣの抗原性を市販のＨＢｓＡｇＳ粒子（ＨＢｓＡｇ−ａｄｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧｅｎＷａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１０−６６３−４５３６２）を標準試料として測定した。表１に結果を示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
ｄＢＮＣの抗原性は、野生型Ｓ粒子と比較してＩＭｘＨＢｓＡｇキットによる測定では１／７、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔキットによる測定では約１／２００に低下していた。
【０１２１】
従って、本発明のｄＢＮＣは、特にＤＤＳとして体内に投与した場合、より安全に用いることができることが明らかとなった。
【０１２２】
６）ＺＺタグ融合ＨＢｓＡｇ欠失体（ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ）発現ベクターの構築
まず、ｄＨＢｓＡｇ遺伝子発現ベクターｐＢＯ１４６５を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ＃３６１（配列番号１２）と、＃１６３３（配列番号１３）とを用いたＰＣＲを行いて遺伝子断片を増幅し、その反応液をフェノール抽出後エタノール沈殿した後、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理を行うことにより、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを含まない約０．３ｋｂのｄＨＢｓＡｇの遺伝子断片を調製した。
【０１２３】
この遺伝子断片と、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化処理を施したｐＢＯ１４６５ベクターの断片とをＴ４−ｌｉｇａｓｅで連結することにより、Ｃ末端にＨｉｓ６−ｔａｇのみが付いたｄＨＢｓＡｇ遺伝子を発現するベクターｐＢＯ１５０１を構築した。
【０１２４】
一方、１０ｎｇの酵母発現用ベクターｐＧＬＤ−ＺＺ−ｄ５０Ｎ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｂｉｏｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ． Ｋｕｒａｔａ Ｎ， Ｓｈｉｓｈｉｄｏ Ｔ， Ｍｕｒａｏｋａ Ｍ， Ｔａｎａｋａ Ｔ， Ｏｇｉｎｏ Ｃ， Ｆｕｋｕｄａ Ｈ， Ｋｏｎｄｏ Ａ． Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００８ Ｄｅｃ；１４４（６）：７０１−７．）を鋳型とし、ｐｒｉｍｅｒ ＃１７３２（配列番号１４）と、＃１７３３（配列番号１５）とをそれぞれ１０ｐｍｏｌ用い、さらにＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ（ＮＥＢ社；１ｕｎｉｔｓ／μＬ）を用いＰＣＲにより、ＺＺｔａｇ遺伝子を増幅した後、７２℃で１４分間アデニン付加反応を行った。
【０１２５】
この増幅ＤＮＡ反応液をフェノール抽出後、エタノール沈澱し、３０μＬの滅菌超純水に再溶解した。これを１．２％アガロースゲル電気泳動で電気泳動後、目的のＺＺ−ｔａｇ遺伝子断片を含むゲル片を切り出した。具体的には、ＱＩＡＥＸII Ｇｅｌ− Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、アガロースゲルから目的ＤＮＡ断片を抽出精製した。このＺＺｔａｇ遺伝子断片とｐＴＡＣ−１ ｖｅｃｔｏｒ（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｓ）をＴ４−ｌｉｇａｓｅで連結することにより、ＺＺｔａｇ遺伝子をｐＴＡＣ−１ベクターにクローニングして、ｐＢＯ１５９４ベクターを作製した。
【０１２６】
得られたｐＢＯ１５９４ベクターをＮｏｔIで制限酵素消化処理し、１．５％アガロースゲル電気泳動した後、ＺＺｔａｇ断片を含むゲル片を切り出した。ＱＩＡＥＸII Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットで、目的となるＺＺｔａｇＤＮＡ断片を抽出精製し、ｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡとした。
【０１２７】
一方、ｐＢＯ１５０１ベクターをＮｏｔIで制限酵素消化処理した後、６５℃で２０分間酵素失活反応させた。このＮｏｔＩによって制限酵素消化処理したｐＢＯ１５０１の断片と、ＮｏｔＩによって制限酵素消化処理したＺＺｔａｇ断片とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて連結することにより、配列番号１６に示す塩基配列を含むｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ遺伝子発現用ベクターｐＢＯ１５９５を構築した。
【０１２８】
このようにして作製したｐＢＯ１５９５ベクターには、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺのＣ末端に検出精製用のＨｉｓ６−ｔａｇ配列が融合されたタンパク質をコードする遺伝子が含まれている。
【０１２９】
７）ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺの大腸菌による発現と精製
上述のｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ発現ベクターｐＢＯ１５９５を、大腸菌株Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）に形質転換した。翌日出現したコロニー数十個について、実施例２と同様の方法で遺伝子の発現及び培養を行い、得られた遺伝子発現菌体について、Ｔｗｅｅｎ８０を含まない緩衝液にて超音波破砕処理によって可溶化して得られる可溶性画分Ｔｗｅｅｎ−（Ｓ−）、Ｔｗｅｅｎ８０を含む緩衝液にて超音波破砕処理によって可溶化して得られる可溶性画分（Ｓ＋）、及び不溶性画分（Ｉ）を調製した。これらの試料（１００μＬの培養液分）に当容量の２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて溶解し、９５℃で５分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、次いでＣＢＢ染色を行った。結果を図９（Ａ）に示す。
【０１３０】
図中の矢印にて示されるように、ＩＰＴＧ誘導下による培養を行った場合に、明瞭なｄＨＢｓＡｇ−ＺＺの発現バンドが見られ、主に可溶性画分（Ｓ−）に局在することが明らかとなった。またこの発現バンドは、ヤギ由来ビオチン標識化抗ＨＢｓＡｇ抗体と、ウサギ由来アルカリフォスファターゼ標識化抗ビオチン抗体、あるいはＨｉｓＰｒｏｂｅＴＭ−ＨＲＰ結合体を各々用いたウエスタンブロッティングでも検出された事から、目的のｄＨＢｓＡｇ−ＺＺバンドである事が確認された。
【０１３１】
この可溶性画分（Ｓ−）を、平衡化緩衝液［０．５ＭのＮａＣｌ、及び３０ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］にて平衡化したＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラムに添加し、室温で５分間ｒｏｔａｔｅ後、ゆっくり流し素通り液を回収した（素通り画分）。次に約１ｍｌの上記平衡化緩衝液で７回、カラムを洗浄した後、イミダゾールの濃度を５００ｍＭに変えた上記平衡化緩衝液を用いて０．１ｍＬずつ１０回溶出させた（Ｎｉ−溶出画分：Ｅ）。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に供し、次いでＣＢＢ染色を行った結果を図９（Ｂ）に示す。
【０１３２】
図中の矢印に示すように、Ｎｉ−カラム溶出画分（Ｅ）において、約７０％を超える高純度のｄＨＢｓＡｇ−ＺＺタンパク質が回収されることが明らかとなった。また、回収されたｄＨＢｓＡｇ−ＺＺタンパク質は、ｄＨＢｓＡｇタンパク質と同様に従来のＨＢｓＡｇタンパク質と比較して、Ｎ末端側を欠失する変異が施されていることから、自己凝集することによってウイルス様の粒子を形成しているものと考えられる。以後、この粒子をｄＢＮＣ−ＺＺと呼ぶことがある。
【０１３３】
また、発現用プラスミドによる大腸菌の形質転換から、高純度ｄＢＮＣ−ＺＺの取得までにかかった時間は約４日以内であり、迅速にＢ型肝炎ウイルス粒子様のナノカプセルを生産できることが明らかとなった。
【０１３４】
７） ｄＢＮＣ−ＺＺ粒子の性状解析
＜抗体認識能＞
ウサギ血清由来のＩｇＧを固相化しスキムミルクでブロッキングしたマイクロウェルプレートに、ＴＢＳで希釈したｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ遺伝子の発現菌体の可溶性画分、及びｄＨＢｓＡｇ遺伝子の発現菌体の可溶性画分を添加し、室温で２時間反応させた。各ウェルを３回洗浄後、標識抗体としてＴＢＳで希釈したウサギ由来ＨＲＰ標識化ＩｇＧを添加して室温で２時間反応させた。各ウェルを６回洗浄後、基質溶液［６ｍｇのｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、１２ｍＬの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、及び１２μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を混合して要事調製したもの］を加えて３０分間反応させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１０に示す。
【０１３５】
ｄＨＢｓＡｇ試料では吸光度の上昇が全く見られなかったが、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ試料では顕著な吸光度の上昇が観察された事から、ｄＢＮＣ−ＺＺ粒子では抗体結合能が維持されたＺＺドメインが多価でその粒子表面に提示されている事が示された。
【０１３６】
＜Ｓｕｃｒｏｓｅ密度勾配遠心解析＞
精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子を、上記５）のｄＨＢｓＡｇナノカプセルの性状解析にて示したｓｕｃｒｏｓｅ密度勾配遠心処理と同様の手法を用いて解析した結果を図１１に示す。比較対象として、酵母細胞を用いて生産した野生型ＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子（ビークル社製）を用いた。
【０１３７】
ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子は、比較対象の野生型ＢＮＣ−ＺＺ粒子と同じ８番目の画分に沈降ピークを示すことが明らかとなった。この結果から、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子も従来のＨＢｓＡｇ粒子や、ｄＨＢｓＡｇと同様に、ｄＨＢｓＡｇ−ＺＺタンパク質が自己凝集することによってウイルス粒子様の形状を有していることが示唆された。
【０１３８】
＜電子顕微鏡観察＞
精製したｄＢＮＣ−ＺＺを電子顕微鏡観察した。観察結果を図１２に示す。
【０１３９】
ｄＢＮＣ−ＺＺは、従来の野生型ＨＢｓＡｇ粒子と同様の表面形状を示す事から、ｄＨＢｓＡｇタンパク質が自己凝集することによって、エンベロープ様ナノ粒子構造形成する事が確認された。また、粒子径は２２±４ｎｍと、比較対象に用いた野生型ＨＢｓＡｇ粒子（２１±２ｎｍ）とほぼ同等の粒子径を有することも明らかとなった。この数値は、電子顕微鏡像から５０個の粒子を選択し、その直径を測定した平均値である。
【０１４０】
＜トリプシン切断実験＞
４．１μｇ／１０μＬの濃度の精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子に、終濃度が１２．５ｎｇ／μＬとなるようにＴＰＣＫ-トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えた後、３７℃で、２０分、２時間若しくは１６時間消化反応を行った。
【０１４１】
反応後の液に５μＬの４×Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５％の２−メルカプトエタノールを含有）を加えて、９５℃で５分処理した後、１５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色で全断片を、そしてＨＲＰ標識化抗ＨｉｓＰｒｏｂｅ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＣ末端Ｈｉｓ-ｔａｇを含む切断断片を、ＨＲＰ標識化抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＮ末端側ＨＢｓＡｇ配列を含む切断断片を、各々検出した。結果を図１３−２に示す。
【０１４２】
（Ａ）及び（Ｂ）において、（１）に示すバンドから、ｄＢＮＣ−ＺＺタンパク質の全長の存在が示唆される。（２）に示すバンドから、図１３−１に示すＢの位置でトリプシン消化され、Ｃ末端側のＨｉｓ−ｔａｇが欠失したタンパク質の存在が示唆される。（３）のバンドから、図１３−１のＣの位置でトリプシン消化され、ＺＺドメインのうち、Ｃ末端側のＺドメインを欠失下タンパク質の存在が示唆される。（４）のバンドから、図１３−１に示すＤの位置でトリプシン消化され２つのＺドメインが欠失したタンパク質の存在が示唆される。
【０１４３】
これらのバンドは、抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いたウエスタンブロッティングによっても確認されるバンドであることが（Ｂ）から明らかであり、本発明のｄＢＮＣ−ＺＺにおいて、Ｃ末端側のＺＺドメイン及びＨｉｓ−ｔａｇは、図１３−１に示すようにウイルス様粒子表面に露出している構造を有しており、即ちＣ末端側のアミノ酸配列がウイルス粒子様構造の外側に提示されていることが明らかとなった。なお、図１３−２の（Ｂ）において（５）にて示されるバンドは、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体によって確認されるバンドであることから、図１３−１のＥの位置でトリプシン消化されたものと考えられる。
【０１４４】
＜ＡＦＭ観察＞
精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子を金属板に固定したマイカ（雲母）に４μｌ添加した後に１５分間乾燥させ、大塚蒸留水（大塚製薬，徳島）により３回洗浄した。再び乾燥させ、この試料を走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＡ４００−ＤＦＭ、ＳＩＩ ＮａｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．；千葉）により観察した。比較対象として、酵母にて作製した野生型ＢＮＣ−ＺＺ粒子を用いた。結果を図１４に示す。
【０１４５】
精製したｄＢＮＣ−ＺＺ粒子は、高さが６．７−１５．５ｎｍ程度で、直径は２８．７−５７．４ｎｍ程度であり、酵母で作製した野生型ＢＮＣーＺＺ粒子と類似した大きさであった。
【０１４６】
通常、脂質二重膜の厚さは５ｎｍ程度と考えられることから、１０ｎｍ以上の厚さを示すのは、脂質二重膜が２層以上重なっていると考えられ、ｄＨＢｓＡｇーＺＺ粒子は、従来のＢＮＣ−ＺＺ粒子と同様に、中空球状物の構造を有することが考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
下記の（５）〜（１０）のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド：
（５）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（６）配列番号３に示される塩基配列；
（７）上記（５）または（６）に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列；
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（９）配列番号４に示される塩基配列；
（１０）上記（５）〜（９）のいずれかに示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項１に記載のナノカプセルを製造する方法。
【請求項１】
下記の（１）〜（４）のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）上記（１）に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
下記の（５）〜（１０）のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド：
（５）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（６）配列番号３に示される塩基配列；
（７）上記（５）または（６）に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列；
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（９）配列番号４に示される塩基配列；
（１０）上記（５）〜（９）のいずれかに示される塩基配列において、１個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された塩基配列。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項１に記載のナノカプセルを製造する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【公開番号】特開２０１３−２１９９９（Ｐ２０１３−２１９９９Ａ）
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６２５９６（Ｐ２０１１−１６２５９６）
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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