ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）活性の阻害
本発明はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のその受容体ｕＰＡＲへの結合を阻害するための方法、および／またはｕＰＡの生物学的活性を阻害するための方法に関する。本発明はさらに、腫瘍の形成または転移、血管形成、例えば腫瘍血管形成を阻害するための方法、およびＣＹＴＬ１アゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに関する。例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）とウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）との相互作用を阻害する方法であって、サイトカイン様１（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドまたはそのアゴニストにｕＰＡおよびｕＰＡＲを含む混合物を接触させることを含む、方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のその受容体ｕＰＡＲへの結合を阻害するための方法、および／またはｕＰＡの生物学的活性を阻害するための方法に関する。本発明はさらに、腫瘍の形成または転移、血管形成、例えば腫瘍血管形成を阻害するための方法、およびＣＹＴＬ１アゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）は如何なる既知の造血系サイトカイン受容体にも構造的に類似していない。これは広範な種類の遊走性の細胞型により発現されるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリング細胞表面タンパク質である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ｕＰＡＲは２つの異なる作用を有しており、即ち、第１にはそれが不活性な前ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（プロ−ｕＰＡ）を運搬して細胞表面プロテアーゼに接近させ、それにより分解されてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）となり、これは細胞表面に係留されて残存し（非特許文献４）、そこでそれはセリンプロテアーゼカスケードを開始し、細胞周囲のタンパク質分解をもたらすことになり（非特許文献５；非特許文献６）；そして第２にそれは細胞外マトリックス成分ビトロネクチンに結合し（非特許文献７）、これが次に細胞表面インテグリンに結合する（非特許文献８）。細胞外マトリックスへの接着とその分解の両方に影響することにより、ｕＰＡのｕＰＡＲへの結合は、ｕＰＡＲ欠損マウスにおける好中球リクルートメントの不全により顕在化される通り、細胞の遊走において重要な役割を果たしている（非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００３】
ｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用の競合的阻害剤の生物学的効果は多くの系において検討されている。ｕＰＡのタンパク質分解的に不活性な突然変異体でトランスフェクトされた腫瘍細胞は腫瘍転移の能力の低減を示しており（非特許文献１１）、ｕＰＡ−ＡＴＦは微小血管内皮細胞による管形成（非特許文献１２）および網膜傷害後の血管形成（非特許文献１３）を阻害する。
【０００４】
ＣＹＴＬ１（サイトカイン様１）は新規の分泌タンパク質を同定して分析するための大規模な研究の一部としてクローニングされており（非特許文献１４）、そして米国特許出願公開２００５００３７４６５において「ＰＲＯ４４２５」として開示されている。これは造血幹先祖細胞の希少なＣＤ３４＋サブセットにおいて高度に発現される転写物の産物であるＣ１７と同一であることがわかっている（非特許文献１５）。ＣＹＴＬ１特異的ｃＤＮＡの原料組織の分析、プロテオーム研究（非特許文献１６）、および大規模な遺伝子発現分析（非特許文献１７；非特許文献１８）によれば軟骨および骨における豊富なＣＹＴＬ１発現が示されている。それと対応して、ヒトにおいてＣＹＴＬ１をコードする遺伝子（ＮＭ＿０１８６５９）は骨と軟骨の発達に関与を示唆されている遺伝子がリッチ化されている領域（４ｐ１６−１５）である染色体４：５，０６７，２１７−５，０７２，０９８にマッピングされている（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。両親媒性の分析によれば４つのα−ヘリックスの存在が示唆されている（非特許文献１５）。ＣＹＴＬ１のサイトカイン様性質は造血系の４つのα−ヘリックス束のサイトカインを連想させるパターンにおけるＣＹＴＬ１鎖中の両親媒性のα−ヘリックスの予測に基づいている（非特許文献２２）。本ファミリーのメンバーは有意な配列の類似性の非存在下に十分に保存されたコア折畳み部を有しており（非特許文献２３）、そしてこのタンパク質の構造は、特殊化された膜貫通受容体のある集団とのそれらの相互作用を指向する傾向がある（非特許文献２４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｅｐｐｅｒら（１９９３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２２（３），６７３−６８４
【非特許文献２】Ｄａｎｏら（１９９９）Ａｐｍｉｓ １０７（１），１２０−１２７
【非特許文献３】Ｇｙｅｔｋｏら、（１９９４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９３（４），１３８０−１３８７
【非特許文献４】Ｃｕｂｅｌｌｉｓら（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１（３４），１５８１９−１５８２２
【非特許文献５】Ｄａｎｏら、（２００５）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ９３（４），６７６−６８１
【非特許文献６】Ｐｌｏｕｇ，Ｍ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ９（１９），１４９９−１５２８
【非特許文献７】Ｗｅｉら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（５１），３２３８０−３２３８８
【非特許文献８】Ｍａｄｓｅｎら（２００７）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７７（５），９２７−９３９
【非特許文献９】Ｒｉｊｎｅｖｅｌｄら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８（７），３５０７−３５１１
【非特許文献１０】Ｇｙｅｔｋｏら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５（３），１５１３−１５１９
【非特許文献１１】Ｃｒｏｗｌｙら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１１），５０２１−５０２５
【非特許文献１２】Ｋｒｏｏｎら（１９９９）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５４（６），１７３１−１７４２
【非特許文献１３】Ｌ Ｇａｔら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（２５），２０９８−２１０３
【非特許文献１４】Ｃｌａｒｋら（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １３（１０），２２６５−２２７０
【非特許文献１５】Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５（３），２８３−２９２（２）
【非特許文献１６】Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎら、（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（４２），４３５１４−４３５２１
【非特許文献１７】Ｋｕｍａｒら（２００１）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ／ＯＡＲＳ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ９（７），６４１−６５３
【非特許文献１８】Ｙａｇｅｒら（２００４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８４（３），５２４−５３５
【非特許文献１９】Ｍａｎｇｉｏｎら（１９９９）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６５（１），１５１−１５７
【非特許文献２０】Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５（１），１−５
【非特許文献２１】Ｓｈｉａｎｇら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８（２），３３５−３４２
【非特許文献２２】Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ １１（１０），３５０−３５４
【非特許文献２３】Ｈｉｌｌら、（２００２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２２（１），２０５−２３３
【非特許文献２４】Ｓｐｒａｎｇ ａｎｄ Ｂａｚａｎ，（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３（６），８１５−８２７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記において考察したとおり、ｕＰＡとその受容体ｕＰＡＲとの間の相互作用は、セリンプロテアーゼカスケードの開始を細胞膜に局在化させること、そして細胞表面受容体と細胞外マトリックスとの間の会合をモジュレートすることの両方により、種々の細胞型の遊走において重要な役割を果たしている。本発明は少なくとも部分的には、ｕＰＡＲ結合に関してｕＰＡと競合するｕＰＡＲに対する追加的なリガンドとしての分泌サイトカイン様タンパク質ＣＹＴＬ１／Ｃ１７の同定に基づいている。
【０００７】
１つの態様において、本発明はサイトカイン様１（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドまたはそのアゴニストにウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）を含む混合物を接触させることを含むｕＰＡとｕＰＡＲとの相互作用を阻害する方法に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストにインビボでウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を発現する細胞を接触させることを含むｕＰＡの生物学的活性を阻害する方法に関する。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳類被験体における腫瘍形成または腫瘍転移を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、哺乳類被験体における血管形成を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１１】
またさらに別の態様において、本発明は（ａ）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびＣＹＴ１またはそのアゴニストを含有する混合物を候補拮抗剤とともにインキュベートすること、および（ｂ）ｕＰＡＲへのｕＰＡまたはそのアゴニストの結合を競合的に阻害する候補拮抗剤の能力を計測すること、を含むウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の拮抗剤のスクリーニングの方法に関する。
【００１２】
全ての態様において、アゴニストは例えば、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド性低分子、またはアゴニストＣＹＴＬ１抗体またはそのフラグメントであってよい。
【００１３】
全ての態様において、ポリペプチドは例えばＣＹＴＬ１変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、例えば配列番号２のＣＹＴＬ１のようなネイティブ配列ＣＹＴＬ１分子の配列と少なくとも約６０％、または６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＣＹＴＬ１変異体であってよい。
【００１４】
全ての態様において、アゴニストＣＹＴＬ１抗体または抗体フラグメントは好ましくはモノクローナルであり、そしてキメラ、ヒト化、またはヒト型であることができる。
【００１５】
全ての態様において、抗体フラグメントは例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００１６】
全ての態様において、哺乳類被験体は好ましくはヒト患者である。
【００１７】
全ての態様において、腫瘍または癌は例えば、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病、例えば、限定しないが、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＣＹＴＬ１のインビボ発現。ＣＹＴＬ１ ｍＲＮＡ発現は（ａ〜ｄ）ホールマウント標本および（ｅ〜ｐ）薄片に対して実施したインサイチュのハイブリダイゼーションにより分析した。全ての組織は特段の記載が無い限りマウスおよび成人より入手した。（ｅ〜ｊ）においては、上パネルは暗視野像であり、下パネルは相当する明視野像である。ａ）第１２日胚の脊椎骨、ｂ）第１３日胚の手掌、ｃ）第１２日胚の気管および肺、ｄ）第１２日胚の肋骨、ｅ）腱鞘（腱（Ｔ）、中足骨（Ｍ））、ｆ）気管、ｇ）肺動脈、ｈ）第１８日胚中足骨、ｉ）表面軟骨層におけるＣＹＴＬ１発現を示す（ｈ）における関節表面のより高い倍率、およびｊ）ヒト気管。白色のバーは１００□ｍを示す。
【図２】軟骨細胞分化の間のＣＹＴＬ１の発現。ＡＴＤＣ５前軟骨細胞をコンフルエントとなるまで生育させ、次にインスリンおよびアスコルビン酸で処置して分化を促進した。記載した時点において、ＲＮＡを採取し、そしてＴａｑＭａｎにより遺伝子発現をアッセイした。記載した結果はＧＡＰＤＨに対して標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）されており、そして観察された最大値に尺度を合わせてある。丸印−コラーゲンＩＩ、三角印−アグレカン、四角印−ＣＹＴＬ１。結果は３つの独立した実験の代表である。
【図３】ＣＩＡにおけるＣＹＴＬ１のダウンレギュレーション。（Ａ）ＩＬ−１βおよびＣＹＴＬ１の発現レベルはＣＩＡプロトコル開始してから種々の日数の後にマウスの関節から抽出したＲＮＡのマイクロアレイ分析により計測した。（Ｂ）ＲＮＡは健常マウスの手掌およびＣＩＡを有するマウスの炎症手掌から抽出した。ＣＹＴＬ１発現はｑＲＴ−ＰＣＲでアッセイし、そしてβ−アクチンに対して標準化した。平均およびＳＥＭ（Ｎ＝５対照／３ＣＩＡ）。（Ｃ）軟骨細胞の分化は１１日間ＡＴＤＣ５細胞において誘導した。次に細胞を０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（黒色バー）または培地単独（白色バー）で２４時間処置した。ＲＮＡを採取しｑＲＴ−ＰＣＲでアッセイし、そしてβ−アクチンで標準化した。４つの独立した実験に由来する標準化したデータの平均およびＳＥＭ。「相対的発現」とは対照と比較した場合の発現である。
【図４】ｕＰＡＲはＣＹＴＬ１に対する受容体である。（Ａ）擬似トランスフェクトされたＣＯＳ細胞およびｕＰＡＲ発現コンストラクトでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞をＣＹＴＬ１−ＡＰまたは対照であるＴＡＣＩ−ＡＰとともにインキュベートし、そして結合したＡＰ活性を染料付着により検出した。（Ｂ）ヒトおよびマウスＣＹＴＬ１−ＡＰを未トランスフェクトのＣＯＳ細胞（白色バー）、またはネズミ（斜線バー）またはヒト（黒色バー）のｕＰＡＲでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞とともにインキュベートした。結合したＰＡ活性を比色酵素アッセイにより計測した。（Ｃ）ｕＰＡＲトランスフェクトした細胞をＣＹＴＬ１−ＡＰおよび記載濃度の精製ＣＹＴＬ１とともにインキュベートした。ＣＹＴＬ１−ＡＰの結合は比色酵素アッセイにより計測し、そしてバックグラウンド（未トランスフェクト細胞）を差し引いた後の精製されたＣＹＴＬ１非存在下に観察された結合のパーセンテージとして表示した。
【図５】ＣＹＴＬ１−ｕＰＡＲ相互作用の表面プラズモン共鳴分析。記載した濃度における精製されたＣＹＴＬ１をＡ）固定化ｕＰＡＲ、Ｂ）対照のフローセル上に注入した。Ｃ）平衡結合分析−ピークｕＰＡＲ依存性応答を注入したＣＹＴＬ１の濃度に対してプロットする。曲線は読み取り値の３つの独立したセットに対するラングミュア方程式の最良フィットを示す。Ｄ）以下に示すもの、即ちｉ）ＣＹＴＬ１（１μｍ）、ｉｉ）ＣＹＴＬ１（１μｍ）＋ヘパリン（１６０μｇ／ｍｌ）、ｉｉｉ）緩衝液単独、およびｉｖ）ヘパリン（１６０μｇ／ｍｌ）を固定化したｕＰＡＲ上に注入した。各条件の３つの独立した調製物の重複応答曲線（対照フローセル差し引き後）を、記載した平衡時の平均の応答とともに示す。
【図６】ＣＹＴＬ１およびｕＰＡは競合してｕＰＡＲに結合する。ＣＹＴＬ１−ＡＰを記載濃度のＡ）ｕＰＡ−ＡＴＦ、Ｂ）プロ−ｕＰＡまたはＣ）ＤＦＰ不活性化ｕＰＡの存在下にｕＰＡＲトランスフェクト細胞と共にインキュベートした。細胞表面結合ＣＹＴＬ１−ＡＰを酵素アッセイにより計測し、そして競合物質非存在下の結合パーセントとして表示した。示された曲線によれば、単一の結合部位に対する可逆的競合が推定される。Ｒ２値は０．９９８、０．９８７および０．８８０である。Ｄ）組み換えヒトｕＰＡＲ（４７７６ＲＵ）をＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップの１つのフローセル中に固定化した。ＣＹＴＬ１（１μｍ）の３つの同一注入を８０μｇ／ｍｌプロ−ｕＰＡの注入の前後、およびプロ−ｕＰＡの解離（洗浄）後に実施した。対照フローセル（ＢＳＡ固定化、５１５７ＲＵ）の差し引き後の平衡応答を各ＣＹＴＬ１注入に関して記載する。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂ：ネイティブ配列のヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびネイティブヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂ：ネイティブ配列のヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびネイティブヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）。
【図８】ＣＹＴＬ１−ＡＰを用いてプローブしたアビジンコーティングプレート上に固定化した酵素的にビオチン化されたｕＰＡＲを示し、結合はＡＰ基質を用いて検出した。ＣＹＴＬ１−ＡＰは他のタンパク質の非存在下でｕＰＡＲに直接結合する。
【図９】ＣＹＴＬ１−ＡＰを用いてプローブしたアビジンコーティングプレート上に固定化した酵素的にビオチン化されたｕＰＡＲを示し、結合はＡＰ基質を用いて検出した。ｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１−ＡＰの結合は抗ｉＰＡＲポリクローナルにより阻害される。
【図１０】ＣＹＴＬ１−ＡＰ融合タンパク質を用いたＢＩＡｃｏｒｅ試験。
【図１１】ＣＹＴＬ１はＰＣ−３細胞によるマトリゲル侵襲を阻害する。
【図１２】ＣＹＴＬ１はｕＰＡ依存性細胞増殖を阻害する。
【図１３】ＣＹＴＬ１の存在下で成育させた軟骨細胞において低減したコラーゲンＩＩ発現が観察される。
【図１４】ＣＹＴＬ１ＫＯマウスは肉視的には正常な軟骨および骨を発達させている。
【図１５】ＣＹＴＬ１ＫＯマウスは正常な骨鉱物質密度を生じている。
【図１６】ＣＹＴＬ１ＫＯマウスは重症度の低い関節炎を有するように観察される。
【図１７】組み換えヒトＣＹＴＬ１に関する精製スキーム。
【図１８】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図１９】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図２０】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図２１】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図２２】マウスＣＹＴＬ１を精製するための精製スキーム。
【図２３】ＣＹＴＬ１結晶回折の結果。
【図２４】補足図１。ＣＹＴＬ１の二次構造の推定およびゲノム構造。ＣＹＴＬ１種の相同体のアライメントを示しており、推定二次構造は下部に示す通りであり、Ｈ：ヘリックス、Ｅ：延長コンホメーション（β−鎖）を示す。「Ｊｎｅｔ Ｒｅｌ」とは各残基における推定に関する信頼性を示す（９＝最良）。３つのヘリックスが容易に推定され、それに伴い、短いα−ヘリックス（僅か４残基のみ信頼性をもって推定）およびβ−鎖がＡＢループ中に、そして短いβ−鎖がＣ−Ｄループ中に在り、これは多くの短鎖サイトカインに特徴的である。注目すべきはＣ末端領域におけるプロリン残基であり、これはα−ヘリックスの形成とは相反する可能性がある。ヒトＣＹＴＬ１のエキソン境界に相当する位置は矢印で示す通りであり、矢印上方の数字はエキソン境界相およびイントロンの長さを示す。４ヘリックスサイトカインファミリーにおいて、エキソン境界は特徴的にはヘリックスＡの後、ヘリックスＢの前、そしてヘリックスＣの後に観察され、全てがゼロ相であり、これはＣＹＴＬ１に関して観察される通りである。
【図２５】補足図２。ＣＹＴＬ１のＡＴＤＣ５細胞への結合。Ａ）材料および方法においてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に関して記載した通り種々の時点においてＡＴＤＣ５細胞をプローブするためにマウスＣＹＴＬ１−ＡＰを用いた。成熟軟骨細胞の形態を有する細胞への融合タンパク質の結合は第４日より観察され、より後期の時点においてはさらに広範化した。Ｂ）ＡＴＤＣ５成熟化の間の種々の時点においてｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現をアッセイした。記載した結果はＧＡＰＤＨに対して標準化されており、そして観察された最大値に尺度を合わせてある。丸印−コラーゲンＩＩ、三角印−ｕＰＡＲ、四角印−ＣＹＴＬ１。
【図２６】表１。ｑＲＴ−ＰＣＲに関するプライマーおよびプローブ。全プローブはＦＡＭレポーター染料およびＴＡＭＲＡクエンチャーで標識した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．定義
特段の記載が無い限り、本明細書で使用する専門技術用語は本発明が属する技術における通常の技術者が一般的に理解するものと同様の意味を有する。例えばＳｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照。本発明の目的のためには以下の用語を下記記載の通り定義する。
【００２０】
「ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子」即ち「ｕ−ＰＡ」という用語は本明細書においては、４３１アミノ酸のヒト前プロｕ−ＰＡ（ＮＰ＿００２６４９；Ｍｏｒｏｉ ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１（１９），５９５６−５９６５（１９７６））および相当する３１３アミノ酸の成熟ヒトポリペプチドを２１アミノ酸シグナル配列を伴うか伴うことなく（Ｒｏｌｄａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９：４６７-４７４）包含するネイティブ配列のｕ−ＰＡポリペプチド、および、オルタナティブスプライシングされた、そして、対立遺伝子の変異体およびアイソフォーム、並びにその可溶性形態のような全ての天然に存在する変異体を包含する非ヒト哺乳類のそのネイティブ配列相同体を指す。
【００２１】
「ＣＹＴＬ１」、「サイトカイン様１」および「ＰＲＯ４４２５」という用語は本明細書においては互換的に使用され、そして種々の原料から、例えばヒト組織型から、または他の原料から単離してよく、または組み換えまたは合成方法により製造してよい。「ＣＹＴＬ１ポリペプチド」または「ＰＲＯ４４２５ポリペプチド」に言及する本明細書における全ての開示内容はポリペプチドの各々を個別に、または総括して指すものとする。例えば調製、精製、誘導体化、対応または対抗する抗体の形成、投与、含有組成物、関連疾患の処置等の記載は、個別に本発明の各ポリペプチドに関する。「ＣＹＴＬ１ポリペプチド」または「ＰＲＯ４４２５ポリペプチド」という用語はまた、本明細書に開示したＣＹＴＬ１／ＰＲＯ４４２５ポリペプチドの変異体を包含する。
【００２２】
「ネイティブ配列ＣＹＴＬ１／ＰＲＯ４４２５ポリペプチド」は天然から誘導された相当するＣＹＴＬ１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのようなネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチドは天然より単離することができ、或いは組み換えまたは合成手段により製造できる。「ネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチド」という用語は特記すれば特定のＣＹＴＬ１ポリペプチドの天然に存在するトランケーションされた、または分泌された形態（例えば細胞外ドメイン配列）、ポリペプチドの天然に存在する変異体型（例えばオルタナティブスプライシング型）および天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。本発明の種々の実施形態において、本明細書に開示したネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチドは添付図面に示す完全長アミノ酸配列を含む成熟または完全長のネイティブ配列ポリペプチドである。開始および終止コドンは図中太字および下線で示す。しかしながら、添付の図７に開示するＣＹＴＬ１ポリペプチドは１により示されるメチオニンで開始するように記載されているが、図７中のアミノ酸の１位より上流または下流の何れかに位置する他のメチオニン残基をＣＹＴＬ１ポリペプチドに関する開始アミノ酸残基として使用してもよいことが考えられ、かつ可能である。
【００２３】
本明細書に開示したＣＹＴＬ１ポリペプチドの「シグナルペプチド」の概ねの位置は図７に示す通りである。しかしながら、留意すべきは、シグナルペプチドのＣ末端境界は、シグナルペプチドのＣ末端境界がその型のアミノ酸配列エレメントを同定するために当該分野で定型的に使用されている基準に従って同定してよい、本発明において当初同定されたシグナルペプチドＣ末端境界の何れかの側において、殆どは約５アミノ酸を超えないが、変動する場合がある（例えばＮｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））。さらにまた、同様に認識されていることとして、一部の場合においては、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、１つより多い分泌物質種をもたらす。シグナルペプチドが本発明において同定されたシグナルペプチドのＣ末端境界の何れかの側において約５アミノ酸を超えない範囲で切断されるこの成熟ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドは本発明の意図するものである。
【００２４】
「ＣＹＴＬ１変異体」は、本明細書に開示した完全長ネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチド配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する上述および後述の通り定義される活性なＣＹＴＬ１ポリペプチド、本明細書に開示したシグナルペプチドを欠いたＣＹＴＬ１ポリペプチド配列、本明細書に開示したシグナルペプチドを伴うか伴わないＣＹＴＬ１ポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書に開示した完全長ＣＹＴＬ１ポリペプチドの何れかの他のフラグメントを意味する。そのようなＣＹＴＬ１ポリペプチド変異体は例えば、完全長ネイティブアミノ酸配列のＮまたはＣ末端においてアミノ酸残基１つ以上が付加または欠失しているＣＹＴＬ１ポリペプチドを包含する。通常は、ＣＹＴＬ１ポリペプチド変異体は、少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％アミノ酸配列同一性および或いは少なくとも約９９％アミノ酸配列同一性を、本明細書に開示した完全長ネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチド配列、本明細書に開示したシグナルペプチドを欠いたＣＹＴＬ１ポリペプチド配列、本明細書に開示したシグナルペプチドを伴うか伴わないＣＹＴＬ１ポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書に開示した完全長ＣＹＴＬ１ポリペプチド配列の何れかの他の特に定義されたフラグメントに対して有することになる。通常は、ＣＹＴＬ１変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、或いは少なくとも約２０アミノ酸長、或いは少なくとも約３０アミノ酸長、或いは少なくとも約４０アミノ酸長、或いは少なくとも約５０アミノ酸長、或いは少なくとも約６０アミノ酸長、或いは少なくとも約７０アミノ酸長、或いは少なくとも約８０アミノ酸長、或いは少なくとも約９０アミノ酸長、或いは少なくとも約１００アミノ酸長、或いは少なくとも約１５０アミノ酸長、或いは少なくとも約２００アミノ酸長、或いは少なくとも約３００アミノ酸長、またはそれより長いものである。
【００２５】
本発明において同定されたＣＹＴＬ１ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインし、そして、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後、そして、如何なる保存的置換も配列同一性の部分として考慮しない場合に、特定のＣＹＴＬ１ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当業者の能力の範囲内の種々の方法において、例えば公に入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを用いて達成できる。当業者であれば比較すべき配列の完全長に渡って最大アライメントを達成するために必要な何れかのアルゴリズムを包含するアライメントを計測するための適切なパラメータを決定できる。しかしながら本発明の目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られ、その場合、ＡＬＩＧＮ−２プログラムに関する完全なソースコードは後に示す表Ｉに記載する通りである。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作であり、そして後に示す表Ｉに記載するソースコードは米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザマニュアルと共にファイルされており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に入手するか、または後に示す表Ｉに記載するソースコードからコンパイルしてよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）のオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄ上の使用のためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。
【００２６】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を使用する状況において、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した％アミノ酸配列同一性（これは言い換えれば、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した特定の％アミノ酸配列同一性を有するか、または含んでいる所定のアミノ酸配列Ａと表現できる）は以下の通り計算される。
【００２７】
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によりそのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、そして式中、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。当然ながら、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの％アミノ酸配列同一性はＢのＡへの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２および３は「ＣＹＴＬ１」と表記されたアミノ酸配列への「比較タンパク質」と表記されたアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性をどのようにして計算するかを示しており、ここで、「ＣＹＴＬ１」は目的の仮説的ＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は目的の「ＣＹＴＬ１」ポリペプチドを比較すべき相手であるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、そして「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示す。
【００２８】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値はＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いてこの直前に記載した段落において説明した通りに得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性の値はまた、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラムを用いて後述する通りに得てもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータの大部分はデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないもの、即ち調節可能なパラメータは、以下の値、即ち：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ割合＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、および採点マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２で設定される。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を使用する場合、％アミノ酸配列同一性の値は（ａ）ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定されたものとしての、ネイティブＣＹＴＬ１ポリペプチドから誘導された配列を有する目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列と目的の比較アミノ酸配列（即ちＣＹＴＬ１変異体ポリペプチドであってよい目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドが比較される相手となる配列）との間のマッチする同一アミノ酸残基の数を（ｂ）目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸残基の総数で割ることにより求められる。例えば、「アミノ酸配列Ｂへの少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」という文言において、アミノ酸配列Ａは目的の比較アミノ酸配列であり、そしてアミノ酸配列Ｂは目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００２９】
パーセントアミノ酸配列同一性はまた、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードしてよく、或いは別様にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄから得てよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２はいくつかの検索パラメータを使用しており、この場合、これらの検索パラメータの全てはデフォルト値、例えばアンマスク＝有り、鎖＝全て、予測発生度＝１０、最小の低複雑度長＝１５／５、多重通過ｅ値＝０．０１、多重通過の定数＝２５、最終ギャップ付きアライメントに関するドロップオフ＝２５および採点マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されている。
【００３０】
アミノ酸配列比較のためにＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用する状況において、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した％アミノ酸配列同一性（これは言い換えれば、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した特定の％アミノ酸配列同一性を有するか、または含んでいる所定のアミノ酸配列Ａと表現できる）は以下の通り計算される。
【００３１】
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは配列アライメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によりそのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、そして式中、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。当然ながら、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの％アミノ酸配列同一性はＢのＡへの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。
【００３２】
「単離された」とは、本明細書に開示した種々のポリペプチドを説明するために用いられる場合、自身の天然の環境の成分から同定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。自身の天然の環境の夾雑成分はポリペプチドに関する診断または治療用途を典型的には妨害する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を包含してよい。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは（１）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度にまで、または（２）クーマシーブルーまたは、好ましくは銀染色を用いた非還元または還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性にまで、精製されることになる。単離されたポリペプチドは、ＣＹＴＬ１ポリペプチドの少なくとも１つの天然の環境の成分が存在しないことから、組み換え細胞内部のインサイチュのポリペプチドを包含する。しかしながら通常は単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製されることになる。
【００３３】
「単離された」ＣＹＴＬ１ポリペプチドをコードする核酸または他のポリペプチドをコードする核酸はポリペプチドをコードする核酸の天然の原料において自身が通常会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定され、そして分離される核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は自身が天然に存在する形態またはセッティングとは異なる。従って単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、自身が天然の細胞中に存在することから特定のポリペプチドをコードする核酸分子からは区別される。しかしながら、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は例えば天然の細胞の場合とは異なる染色体位置に核酸分子があるポリペプチドを通常発現する細胞中に含有されたポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【００３４】
「対照配列」という用語は特定の宿主生物中の作動可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する対照配列は例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００３５】
核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係を有するように位置づけられれば「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されればポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結しており、プロモーターまたはエンハンサーはそれが配列の転写に影響すればコード配列に作動可能に連結しており、或いはリボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置づけられていればコード配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結」とは連結されるべきＤＮＡ配列が近接しており、そして分泌リーダーの場合は、近接し、そして読み相にあることを意味している。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００３６】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者により容易に決定され得、そして一般的にはプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した実験的計算である。一般的に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高温を必要とするのに対し、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般的に、相補鎖がそれらの融点より低値の環境に存在する場合に再アニーリングする変性ＤＮＡの能力に依存している。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高値であるほど、使用できる相対的な温度は高値となる。その結果、より高値の相対的温度は反応条件をよりストリンジェントとする傾向があるのに対し、より低値の温度のそのような傾向は低い。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらに詳細な説明および解説に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照。
【００３７】
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、本明細書において定義される場合は、以下のもの、即ち：（１）洗浄のために低イオン強度および高温を使用、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５＋７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で使用；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストランスルフェートを４２℃で使用し、そして洗浄は４２℃において０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中５５℃、ついで高ストリンジェンシー洗浄を０．１ｘＳＳＣ＋ＥＤＴＡを用いて５５℃で実施、により同定してよい。
【００３８】
「中ストリンジェント条件」はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の通り同定してよく、そして、上記したものよりも低ストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーションの条件（例えば温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を包含する。中ストリンジェント条件の例は２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストランスルフェート、および２０ｍｇ／ｍｌ変性粉砕サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一夜インキュベーション、ついで約３７〜５０℃において１ｘＳＳＣ中フィルター洗浄である。プローブ長等のような要素に適合するために必要に応じて温度、イオン強度などを調節する方法は当業者の知る通りである。
【００３９】
「タグ付けされたエピトープ」という用語は本明細書において使用する場合、「タグポリペプチド」に融合したＣＹＴＬ１ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドはそれに対抗して抗体が形成できるエピトープをもたらすために十分な残基を有するが、なお、自身が融合する相手であるポリペプチドの活性を妨害しない程度に十分短い。タグポリペプチドはさらに抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分独特である。適当なタグポリペプチドは一般的に少なくとも６つのアミノ酸残基、そして通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。
【００４０】
本発明の目的のための「活性な」または「活性」とは、ネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１の生物学的および／または免疫学的な活性を保持しているＣＹＴＬ１ポリペプチドの型を指し、その場合、「生物学的」活性はネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１により保有される抗原性のエピトープに対抗する抗体の産生を誘導する能力以外のネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１により誘発される生物学的機能（阻害性または促進性の何れか）を指し、そして「免疫学的」活性はネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１により保有される抗原性のエピトープに対抗する抗体の産生を誘導する能力を指す。本発明の目的のためには、好ましい生物学的活性はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に結合し、ｕＰＡＲへのｕＰＡの結合を競合的に阻害し、および／またはｕＰＡの生物学的活性を阻害する能力を包含する。
【００４１】
「ｕＰＡの生物学的活性」という用語は最も広範な意味において使用され、そして限定しないが、ｕＰＡＲに結合する能力、細胞遊走のモジュレーション、細胞膜へのセリンプロテアーゼカスケードの開始の局在化、細胞表面受容体と細胞外マトリックスとの間の会合のモジュレーション、腫瘍転移の媒介への関与、および血管形成活性を包含する。
【００４２】
「アゴニスト」という用語は本明細書においては元も広範な意味において使用される。ＣＹＴＬ１アゴニストは伏在する機序に関わらずネイティブ配列のＣＹＴＬ１により媒介される生物学的活性を模倣する何れかの分子である。本発明の目的のためには生物学的活性は好ましくは上記定義したｕＰＡ生物学的活性を阻害する能力である。ＣＹＴＬ１アゴニストの例は限定しないが、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体、ペプチドおよび非ペプチド性有機低分子を包含する。
【００４３】
「抗体」という用語は本明細書においては、最も広範な意味において使用され、そして特に、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを網羅している。
【００４４】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する場合がある可能な天然に存在する突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらにまた、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を包含するポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体による夾雑を被らずに合成される点において好都合である。「モノクローナル」という修飾語は抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、そして何れかの特定の方法による抗体の産生を要求するものとみなしてはならない。例えば本発明に従って使用するべきモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に報告されたハイブリドーマ法により作成してよく、或いは組み換えＤＮＡ法により作成してよい（例えば米国特許４，８１６，５６７参照）。「モノクローナル抗体」はまた例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離してよい。
【００４５】
抗体は特に、所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種から誘導されるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同であるが、鎖の残余は別の種から誘導されるか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、並びにそのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許４，８１６，５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において目的とされるキメラ抗体は非ヒト霊長類（例えば旧世界猿、類人猿等）およびヒトの定常領域配列から誘導した可変ドメイン抗原結合配列を含む霊長類化抗体を包含する。
【００４６】
「抗体フラグメント」はインタクトな抗体の一部分、好ましくはその抗原結合または可変領域を含むものを含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００４７】
「インタクトな」抗体は抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインはネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクトな抗体は１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００４８】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」型は非ヒト免疫グロブリンから誘導した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は相当する非ヒト残基により置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体はレシピエント抗体中、またはドナー抗体中には存在しない残基を含んでよい。そのような修飾は抗体の性能をさらに精鋭化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の実質的に全てを含むことになり、その場合、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は場合によりやはり免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことになる。さらに詳細な説明はＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照。
【００４９】
「超可変領域」という用語は本明細書において使用する場合、配列において超可変であり、および／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。超可変領域は「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（即ち軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４、５０〜５６、および８９〜９７、および重鎖可変ドメインの残基３１〜３５、５０〜６５、および９５〜１０２；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」に由来する残基（即ち軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２、５０〜５２、および９１〜９６および重鎖可変ドメインの残基２６〜３２、５３〜５５、および９６〜１０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。両方の場合において、可変ドメイン残基は後述においてさらに詳細に考察する通り、上記したＫａｂａｔらに従ってナンバリングされる。「フレームワーク」即ち「ＦＲ」残基は本明細書において定義する通り超可変領域における残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５０】
「親抗体」または「野生型」抗体は本明細書に開示した抗体変異体と比較した場合に１つ以上のアミノ酸配列改変を欠いているアミノ酸配列を含む抗体である。即ち、親抗体は一般的に本明細書に開示した抗体変異体の相当する超可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも１つの超可変領域を有する。親ポリペプチドはネイティブ配列（即ち天然に存在する）抗体（天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する）、または天然に存在する配列の既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失および／または他の改変）を有する抗体を含んでよい。本開示全体に渡って、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」および「親」または「親の」抗体は、互換的に使用される。
【００５１】
本明細書において使用する場合、「抗体変異体」または「変異体抗体」とは、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは抗体変異体は天然には存在しないアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む。そのような変異体は必然的に親抗体と１００％未満の配列の同一性または類似性を有する。好ましい実施形態においては、抗体変異体は親抗体の重鎖または軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満、そして最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列の同一性または類似性のアミノ酸配列を有することになる。抗体変異体は一般的に、１つ以上の自身の超可変領域の中、またはそれに隣接して１つ以上のアミノ酸改変を含むものである。
【００５２】
「アミノ酸改変」とは所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を指す。例示される改変は挿入、置換および欠失を包含する。「アミノ酸置換」は所定のアミノ酸配列における別の異なるアミノ酸残基による既存のアミノ酸残基の置き換えを指す。
【００５３】
「置き換え」アミノ酸残基はアミノ酸配列において別のアミノ酸残基を置き換えるか置換するアミノ酸残基を指す。置き換え残基は天然に存在する、または天然に存在しないアミノ酸残基であってよい。
【００５４】
「アミノ酸挿入」は所定のアミノ酸配列内部への１つ以上のアミノ酸残基の導入を指す。アミノ酸挿入は「ペプチド挿入」を包含し得、この場合は、ペプチド結合で連結された２つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドが所定のアミノ酸配列内部に導入される。アミノ酸挿入にペプチドの挿入が関与する場合、挿入されるペプチドは、天然には存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発により形成してよい。「超可変領域に隣接する」アミノ酸改変とは、超可変領域のＮ末端および／またはＣ末端における１つ以上のアミノ酸残基の導入または置換であって、挿入または置き換えのアミノ酸残基の少なくとも１つが当該超可変領域のＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基とペプチド結合を形成するようなものを指す。
【００５５】
「天然に存在するアミノ酸残基」とはアラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）よりなる群から一般的に選択される遺伝子コードによりコードされるものである。
【００５６】
「天然に存在しないアミノ酸残基」とは本明細書においては、ポリペプチド鎖中で隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる上記列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である。天然に存在しないアミノ酸残基の例はノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンおよび他のアミノ酸残基類縁体、例えばＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されているものを包含する。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を形成するためには、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２（１９８９）および上記したＥｌｌｍａｎらの操作法を使用できる。慨すれば、これらの操作法では天然に存在しないアミノ酸残基を用いてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、ＲＮＡのインビトロの転写および翻訳を行う。
【００５７】
本開示全体に渡り、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１）のナンバリングシステムを参照することとする。これらの解説書において、Ｋａｂａｔは各サブクラスに関する抗体の多くのアミノ酸配列を列挙し、そしてそのサブクラスにおける各残基位置に関して最も一般的に生じているアミノ酸を列挙している。Ｋａｂａｔは列挙された配列における各アミノ酸に残基番号を割り付けるための方法を使用しており、そして残基番号を割り付けるためのこの方法は本分野において標準的なものとなっている。Ｋａｂａｔナンバリングスキームは本明細書において後述する通りである。本発明の目的のために、Ｋａｂａｔの解説書に包含されない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り付けるためには、以下の工程に従う。一般的に、候補配列はＫａｂａｔの何れかの免疫グロブリン配列または何れかのコンセンサス配列とアラインされる。アライメントは手作業によるか、または一般的に受け入れられているコンピュータプログラムを用いてコンピュータにより実施してよく、そのようなプログラムの例はＡｌｉｇｎ２プログラムである。アライメントは大部分のＦａｂ配列にとって共通である一部のアミノ酸残基を用いることにより容易にしてよい。例えば軽鎖および重鎖は各々典型的には、同じ残基番号を有する２つのシステインを有し；ＶＬドメインにおいては２つのシステインは典型的には残基番号２３および８８にあり、そしてＶＨドメインにおいては２つのシステイン残基は典型的には２２および９２と番号付けされている。フレームワーク残基は常時ではないが一般的には概ね同じ数の残基を有するが、ＣＤＲの大きさは変動することになる。例えば自身がアラインされるＫａｂａｔの配列におけるＣＤＲよりも長い候補配列に由来するＣＤＲの場合、典型的には接尾辞を残基番号に付加することにより追加の残基の挿入を示す（例えば図１Ｂの残基１００ａｂｃ参照）。例えば残基３４および３６に関してＫａｂａｔ配列とアラインするが、それらの間に残基３５とアラインすべき残基を有しない候補配列の場合、番号３５は単に残基に割り付けられない。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「高親和性」を有する抗体はナノモル（ｎＭ）範囲かそれより良好なＫＤ、即ち解離定数を有する抗体である。「ナノモル範囲かそれより良好」なＫＤはＸｎＭと表記してよく、ここでＸは約１０未満の数である。
【００５９】
「フィラメント状ファージ」という用語は自身の表面上に非相同ポリペプチドをディスプレイできるウィルス粒子を指し、そして限定しないがｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、およびＭ１３を包含する。フィラメント状ファージはテトラサイクリンのような選択可能なマーカーを含有してよい（例えば「ｆｄ−ｔｅｔ」）。種々のフィラメント状ファージディスプレイ系が当業者に良く知られている（例えばＺａｃｈｅｒら、Ｇｅｎｅ９：１２７−１４０（１９８０），Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；およびＰａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８（１９８８）参照）。
【００６０】
「パニング」という用語は標的に対する高い親和性および特異性を有する抗体のようなファージ担持化合物の同定および単離におけるスクリーニングプロセスの多数回実施を指す。
【００６１】
「処置する」、「処置」および「療法」という用語は本明細書において使用する場合、治癒的療法、予防的療法、および予防療法を指す。連続処置または投与は１日以上の処置における中断を伴わない少なくとも毎日を基準とした処置を指す。間歇処置または投与、または間歇的様式における処置または投与は連続的ではなく、むしろ周期的な性質にある処置を指す。
【００６２】
「哺乳類」という用語は本明細書において使用する場合、哺乳類に分類される何れかの哺乳類、例えばヒト、高等な非ヒト霊長類、げっ歯類、家畜および牧場動物、例えばウシ、ウマ、イヌおよびネコを指す。本発明の好ましい実施形態においては哺乳類はヒトである。
【００６３】
１つ以上の別の治療薬「と組み合わせた」投与は、同時（併用）および何れかの順序の連続投与を包含する。
【００６４】
「有効量」とは有益な、または所望の治療（予防を包含）結果を起こすために十分な量である。有効量は１回以上の投与において投与できる。
【００６５】
本明細書において使用する場合、「細胞」、「細胞系統」および「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、そして全てのそのような表記は子孫を包含する。即ち、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という単語は初期の対象細胞および形質転換の回数に関わらずそれより誘導された培養物を包含する。さらにまた、全ての子孫は意図的または偶発的な突然変異に起因してＤＮＡ含有量において厳密には同一とならない場合がある。「子孫」という用語は元来形質転換された細胞または細胞系統の後の各世代の全ての新生仔を指す。初回形質転換された細胞においてスクリーニングの対象となるものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫が包含される。異なる表記が意図される場合は、それは文脈から明らかになるはずである。
【００６６】
「癌」および「癌性の」という用語は典型的には調節されない細胞の成育を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指す、または説明するものである。癌の例は癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病を包含するがこれらに限定されない。そのような癌のより特定的な例は、限定しないが、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌を包含する。
【００６７】
「制御配列」という用語は特定の宿主生物において作動可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列は例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００６８】
核酸はそれが別の核酸配列と機能的関連性に有るようにおかれた場合に「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、そのポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーターまたはエンハンサーはそれが配列の転写に影響する場合にコード配列に作動可能に連結しており；或いは、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置づけられていればコード配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結」とは連結されるべきＤＮＡ配列が近接しており、そして分泌リーダーの場合は、近接し、そして読み相にあることを意味している。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００６９】
「低分子」とは約１０００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を有するものとして本明細書においては定義される。
【００７０】
「抗血管形成剤」とは血管の発生をブロック、またはある程度まで妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は例えば血管形成を促進することに関与する成長因子または成長因子受容体に結合する低分子または抗体であってよい。本発明において好ましい抗血管形成因子はベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））のような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【００７１】
「抗新生物性組成物」という用語は少なくとも１つの活性な治療薬、例えば「抗癌剤」を含む癌を処置する場合に有用な組成物を指す。治療薬（抗癌剤）の例は、限定しないが例えば、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法において使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌を処置するための他の薬剤、例えば抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）拮抗剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ）、血小板誘導成長因子阻害剤（例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦ受容体の１つ以上に結合する拮抗剤（例えば中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、および他の生物活性および有機化学の薬剤等を包含する。これらの組み合わせもまた本発明に包含される。
【００７２】
本明細書において使用する「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害または防止する、および／または、細胞の破壊を誘発する物質を指す。該用語は放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および毒素、例えば低分子毒素または細菌、カビ、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、およびそのフラグメントおよび／または変異体を包含することを意図している。
【００７３】
「化学療法剤」は癌の処置において有用な化合物である。（登録商標）化学療法剤の例はアルキル化剤、例えばチオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、およびウレドパ；エチレンイミンおよびメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチローロメラミン；ＴＬＫ ２８６（ＴＥＬＣＹＴＡＴＭ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（例えば合成の類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばそのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類縁体）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１）；エレウセロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えばＡｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．編Ｅｎｇｌ．、３３：１８３−１８６（１９９４）参照）およびアントラサイクリン、例えばアナマイシン、ＡＤ３２、アルカルビシン、ダウノルビシン、デキスラゾキサン、ＤＸ−５２−１、エピルビシン、ＧＰＸ−１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ジネミシン、例えばジネミシンＡ、エスペラミシン、ネオカルジノスタチン発色団および関連の発色タンパク質エネジン抗生物質（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシン）、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、およびゾルビシン；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗アドレナール、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタン；葉酸補給剤、例えばフォリン酸（ロイコボリン）；アセグラトン；抗フォレート抗新生物性剤、例えばＡＬＩＭＴＡ７、ＬＹ２３１５１４ペメトレクスド、ジヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤、例えばメトトレキセート、代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびそのプロドラッグ、例えばＵＦＴ、Ｓ−１およびカペシタビン、およびチミジレートシンターゼ阻害剤およびグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸＴＭ、ＴＤＸ）；ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの阻害剤、例えばエニルウラシル；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えばマイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイドおよびタキサン、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏ＾ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金；白金類縁体または白金系類縁体、例えばシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；上記何れかの製薬上許容しうる塩、酸または誘導体；並びに上記２つ以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ、即ちシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの複合療法の略語、およびＦＯＬＦＯＸ、即ち５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いた処置計画の略語を包含する。
【００７４】
この定義に同様に包含されるものは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール；および抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖への関与を示唆されているシグナリング経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；および上記何れかの製薬上許容しうる塩、酸または誘導体を包含する。
【００７５】
「代謝拮抗物質化学療法剤」は代謝産物に構造的には同様であるが生産的な様式では身体により使用され得ない薬剤である。多くの代謝拮抗物質化学療法剤は核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの産生を妨害する。代謝拮抗物質化学療法剤の例は、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡＴＭ）、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、６−チオグアニン、ペメトレクスド、ラルチトレクスド、アラビノシルシトシンＡＲＡ−Ｃシタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、アゾシトシン、デオキシシトシン、ピリミジン、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、クラドラビン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース等を包含する。好ましい代謝拮抗物質化学療法剤はゲムシタビンである。
【００７６】
「ゲムシタビン」即ち「２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（ｂ異性体）」は抗腫瘍活性を示すヌクレオシド類縁体である。ゲムシタビンＨＣｌに関する実験式はＣ９Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ４ Ａ ＨＣｌである。ゲムシタビンＨＣｌは商標ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）の下にＥｌｉ Ｌｉｌｌｙから販売されている。
【００７７】
「白金系化学療法剤」は分子の一体的部分として白金を含有する有機化合物を含む。白金系化学療法剤の例はカルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンを包含する。
【００７８】
「白金系化学療法」とは、場合により１つ以上の他の化学療法剤と組み合わせた１つ以上の白金系化学療法剤を用いた療法を意図する。
【００７９】
ＩＩ．発明を実施するための形態
本発明の実施は特段の記載が無い限り当業者の技量の範囲内の分子生物学（組み換え手法を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学および免疫学の従来の手法を使用することになる。そのような手法は文献、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）において詳細に説明されている。
【００８０】
１．アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体の調製
抗ＣＹＴＬ１抗体は組み換えＤＮＡ技術の手法を包含する当該分野で知られた方法により製造できる。
【００８１】
ｉ）抗原の調製
場合により他の分子にコンジュゲートされた可溶性抗原またはそのフラグメントは抗体を形成するための免疫原として使用できる。膜貫通分子、例えば受容体に関しては、これらのフラグメント（例えば受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として使用できる。或いは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用できる。そのような細胞は天然原料（例えば癌細胞系統）から誘導することができ、或いは膜貫通分子を発現するように組み換え手法により形質転換されている細胞であってよい。抗体を調製するために有用な他の抗原およびその形態は当業者の知る通りである。
【００８２】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は好ましくは該当する抗原およびアジュバントの多数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物中で育成される。２官能性または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、ただし式中ＲおよびＲ１は異なるアルキル基であるもの、を用いて、免疫すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に該当する抗原をコンジュゲートすることが有用である場合がある。
【００８３】
動物は１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれウサギまたはマウスに関する）を３容量のフロイント完全アジュバントと混合し、溶液を多数部位において皮内注射することにより抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対抗して免疫される。１ヵ月後、多数部位における皮下注射によりフロイントの完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５〜１／１０を用いて動物をブーストする。７〜１４日後、動物から出血させ、そして血清の抗体力価をアッセイする。動物は力価が平衡に達するまでブーストする。好ましくは、同じ抗原であるが、異なるタンパク質に、および／または異なる交差結合試薬を介してコンジュゲートされているコンジュゲートで動物をブーストする。コンジュゲートはまた、タンパク質融合物として組み換え細胞培養物中に作成できる。さらにまた、ミョウバンのような凝集剤を適宜使用して免疫応答を増強する。
【００８４】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作成してよく、或いは、組み換えＤＮＡ法（米国特許４，８１６，５６７）により作成してよい。ハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターまたはマカクサルを上記した通り免疫することにより、免疫のために使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生するか産生生産できるリンパ球を生じさせる。或いは、リンパ球はインビトロで免疫してよい。次にリンパ球を適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００８５】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、未融合の親骨髄腫細胞の成育または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する適当な培養培地中に播種して生育させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを包含することになり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成育を防止する。
【００８６】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支援し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。それらのうち、好ましい骨髄腫細胞系統はネズミ骨髄腫系統、例えばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、および、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導したものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００８７】
ハイブリドーマ細胞を成育させている培養培地は抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、またはインビトロの結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、測定される。
【００８８】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは限界希釈操作法によりサブクローニングし、そして標準的な方法により生育させてよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適当な培養培地は例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。さらにまたハイブリドーマ細胞は動物中の腹水腫瘍としてインビボで成育させてよい。
【００８９】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製操作法により培養培地、腹水、または血清から適当に分離される。
【００９０】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて容易に単離して配列決定される（例えばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として供される。単離された後、ＤＮＡは発現ベクター内に入れてよく、そしてこれを次に宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別様には免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を達成できる。抗体の組み換え産生は後述においてより詳細に説明する。
【００９１】
別の実施形態においては、抗体または抗体フラグメントはＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の手法を用いて作成された抗体ファージライブラリから単離できる。
【００９２】
Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）はファージライブラリを用いたそれぞれネズミおよびヒトの抗体の単離を記載している。その後の出版物は鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））並びに極めて大型のファージライブラリを構築するための方策としてのコンビナトリアルな感染およびインビボの組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を記載している。即ち、これらの手法はモノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法の実行可能な代替法である。
【００９３】
ＤＮＡはまた、相同ネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに関するコード配列を代替とすること（米国特許４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））によるか、または、非免疫グロブリンポリペプチドに関するコード配列の全てまたは部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、修飾してよい。
【００９４】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインの代替とされるか、またはそれらは、抗体の１つの抗原複合化部位の可変ドメインの代替とされ、これにより抗原に対する特異性を有する１つの抗原複合化部位および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原複合化部位を含むキメラ２価抗体を作製する。
【００９５】
（ｉｖ）ヒト化およびヒト抗体
ヒト化抗体は非ヒトである原料から自身内に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインから取り出される。ヒト化は本質的にはＷｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の相当する配列に対してげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することにより実施することができる。従って、そのような「ヒト化」抗体は実質的にはインタクトなヒト可変ドメインに満たない部分が非ヒト種由来の相当する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許４，８１６，５６７）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には一部のＣＤＲ残基および可能性として一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
【００９６】
ヒト化抗体を作成する場合に使用するべき軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性を低減するためには極めて重要である。所謂「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知ヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリに対してスクリーニングする。次にげっ歯類のものと最も近似しているヒト配列をヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に対して使用してよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【００９７】
さらにまた、抗原に対する高親和性および他の望ましい生物学的特性を保持して抗体をヒト化することが重要である。この目標を達成するためには、好ましい方法に従って、親およびヒト化配列の３次元モデルを用いて親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによりヒト化抗体を調製する。３次元免疫グロブリンモデルは公的に入手可能であり、そして当業者に良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定の３次元コンホメーション構造を図示して表示できるコンピュータプログラムが使用可能である。これらの表示物の検討により候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能となる。このような方法により、ＦＲ残基を選択し、そして、所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する増大した親和性を達成できるようにレシピエントおよびインポート配列と組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に対して影響を与えることにおいては、直接、そして最も大きく関与している。
【００９８】
或いは、内因性の免疫グロブリンの産生の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーの産生が免疫により可能となるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作成することが、現在可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系統の突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系統突然変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原攻撃時のヒト抗体の産生をもたらすことになる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３５５：２５８（１９９２）を参照。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリから誘導できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９（１９９６））。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の形成を以下にさらに説明する。
【００９９】
（ｖ）抗体フラグメント
種々の手法が抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的にはこれらのフラグメントはインタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されている（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながらこれらのフラグメントは現在では組み換え宿主細胞により直接産生できる。例えば抗体フラグメントは上記考察した抗体ファージライブラリから単離できる。或いはＦａｂ’−ＳＨフラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、そして化学的にカップリングさせることによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成できる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２））。後述する実施例において説明する通り別の実施形態においては、Ｆ（ａｂ’）２はＦ（ａｂ’）２分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別の手順によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。抗体フラグメントの産生のための他の手法は当業者に良く知られている。他の実施形態においては選択される抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５参照。
【０１００】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体はエピトープが通常は異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。そのような分子は通常は２つの異なるエピトープに結合するのみとなる（即ち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）が、三重特異性抗体のような追加的特異性を有する抗体も本明細書において使用する場合にこの表現に包含される。
【０１０１】
二重特異性抗体を作成するための方法は当該分野において知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうち僅か１つのみが正しい二重特異性の構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製はむしろ負担が大きく、そして生成物の収率は低値である。同様の操作法がＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。異なる手順によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原複合化部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は好ましくはヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行う。軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合物の少なくとも１つにおいて存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクター内に挿入し、そして適当な宿主生物内に同時トランスフェクトする。これにより、構築において使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす場合の実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する場合に、大きい柔軟性がもたらされる。しかしながら、等しい比率における少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、または比率が特に重要ではない場合に、１つの発現ベクター中に２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖に関するコード配列を挿入することが可能である。
【０１０２】
この手順の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１つのアームにおいて第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および別のアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を与える）を有している。この非対称の構造は、二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を可能とすることから、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性の化合物の分離を容易にする。この手順はＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の形成はさらに詳細には例えばＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照。
【０１０３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されている別の手順に従えば、抗体分子の対の間の界面は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大限とするように操作できる。好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法においては、第１の抗体分子の界面に由来する１つ以上の小型アミノ酸側鎖をより大型の側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置き換える。大型側鎖と同一または同様のサイズの代償分の「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより第２の抗体分子の界面上に形成される。これによりホモ二量体のような他の望ましくない最終生成物を超えてヘテロ二量体の収率を増大させるための機序が与えられる。
【０１０４】
二重特異性抗体は交差結合または「ヘテロコンジュゲート」抗体を包含する。例えばヘテロコンジュゲートにおける抗体の１つをアビジンに、もう１つをビオチンにカップリングできる。そのような抗体は例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングするため（米国特許４，６７６，９８０）およびＨＩＶ感染症の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は何れかの好都合な交差結合法を用いて作製してよい。適当な交差結合剤は当該分野で良く知られており、そして多くの交差結合手法と共に米国特許４，６７６，９８０に開示されている。
【０１０５】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を形成するための手法もまた、文献に記載されている。例えば二重特異性抗体は化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）はインタクトな抗体をタンパク質分解的に切断することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する操作法を記載している。これらのフラグメントをジチオール錯化剤（ｄｉｔｈｉｏｌ ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｇｅｎｔ）である亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元することにより近接したジチオールを安定化させ、そして分子内のジスルフィド形成を防止する。次に形成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次にＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方をメルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合することにより二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用できる。
【０１０６】
Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントはまたＥ．ｃｏｌｉから直接回収することができ、そして化学的にカップリングすることにより二重特異性抗体を形成できる。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから別個に分泌させ、そしてインビトロの指向的化学カップリングに付すことにより二重特異性抗体を形成している。
【０１０７】
組み換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作成して単離するための種々の手法もまた記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチド（ｐｅｐｂｄｅｓ）を遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結している。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元することにより単量体を形成し、そして次に再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成している。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）の記載している「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替的な機序を与えている。フラグメントは同じ鎖上の２ドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは別のフラグメントの相補なＶＬおよびＶＨドメインと強制的に対形成させられ、これにより２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを形成するための別の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照。
【０１０８】
２より多い結合価を有する抗体もまた意図される。例えば三重特異性抗体を調製できる。Ｔｕｆｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１）。
【０１０９】
（ｖｉｉ）エフェクター機能の操作
抗体の有効性を増強するように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてよい。このようにして形成されたホモ二量体抗体は向上した内在化能力および／または増大した補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する場合がある。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）において記載される通りヘテロ２官能性交差結合剤を用いて調製してよい。或いは、抗体は二重のＦｃ領域を有するように操作することができ、そしてこれにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有する場合がある。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）を参照。
【０１１０】
（ｖｉｉｉ）抗体サルベージ受容体結合エピトープ融合物
本発明の特定の実施形態においては、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクトな抗体よりもむしろ抗体フラグメントを使用することが望ましい場合がある。そのような場合、抗体フラグメントはその血清中半減期を増大させるために修飾することが望ましい場合がある。これは例えば抗体フラグメント内へのサルベージ受容体結合エピトープの取り込みにより達成してよい（例えば抗体フラグメント内の適切な領域の突然変異により、或いは、エピトープをペプチドタグ内に取り込ませ、次にこれを、例えばＤＮＡまたはペプチド合成により、抗体フラグメントに何れかの末端または中央部において融合する）。
【０１１１】
サルベージ受容体結合エピトープは好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来するアミノ酸残基の何れか１つ以上が抗体フラグメントの類似の位置に転移する領域を構築する。さらに好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来する残基３つ以上が転移する。なおさらに好ましくは、エピトープはＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（例えばＩｇＧのもの）から取り出し、そして、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、またはＶＨ領域、または１つより多くのそのような領域に転移させる。或いは、エピトープをＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出し、そして抗体フラグメントのＣＬ領域またはＶＬ領域、または両方に転移させる。
【０１１２】
（ｉｘ）抗体の他の共有結合的修飾
抗体の共有結合的修飾は本発明の範囲内に包含される。それらは適宜、化学合成によるか、または酵素的または化学的な抗体切断により行ってよい。抗体の共有結合的修飾の他の型は、選択された側鎖またはＮまたはＣ末端残基と反応できる有機の誘導体化剤に抗体のターゲティングされたアミノ酸残基を反応させることにより分子内に導入される。共有結合的修飾の例は参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５３４，６１５に記載されている。抗体の共有結合的修飾の好ましい型は米国特許４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２または４，１７９，３３７に記載されている様式において、種々の非タンパク質性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つに抗体を連結させることを含む。
【０１１３】
（ｘ）合成抗体ファージライブラリからの抗体の形成
好ましい実施形態においては、本発明はユニークなファージディスプレイの手順を用いて新規な抗体を形成および選択するための方法を提供する。該手順においては、単一のフレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの形成、可変ドメイン内部の十分な多様性の設計、多様化された可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原をターゲティングするための高親和性を有する候補抗体の選択、および選択された抗体の単離を行う。
【０１１４】
ファージディスプレイの方法の詳細は例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００３年１２月１１日に公開されたＷＯ０３／１０２１５７に記載されている。
【０１１５】
１つの態様において、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲにおいて溶媒接触性および／または高多様性の位置を突然変異させることにより形成できる。ＣＤＲの一部または全てを本明細書に記載した方法を用いて突然変異させることができる。一部の実施形態においては、多様な抗体ライブラリは、単一のライブラリを形成するためにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３における位置を突然変異させることによるか、または単一のライブラリを形成するためにＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３における位置を突然変異させることによるか、または単一のライブラリを形成するためにＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３における位置を突然変異させることにより形成することが好ましい場合がある。
【０１１６】
抗体可変ドメインのライブラリは例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の溶媒接触性および／または高多様性の位置において突然変異を有するように形成できる。別のライブラリはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３において突然変異を有するように形成できる。これらのライブラリはまた、所望の親和性を有するバインダーを形成するために相互に組み合わせて使用できる。例えば標的抗原への結合のための重鎖ライブラリの選択を１回以上行った後、軽鎖ライブラリを重鎖バインダーの集団内に入れ換え、選択回数をさらに重ねることによりバインダーの親和性を増大させることができる。
【０１１７】
好ましくは、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域において変異体アミノ酸により元のアミノ酸を置換することによりライブラリを形成する。得られたライブラリは複数の抗体配列を含有することができ、そこにおいては配列の多様性は重鎖配列のＣＤＲＨ３領域に主に存在する。
【０１１８】
１つの態様において、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、またはヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列との関連で形成される。好ましくはライブラリはＤＶＫコドンセットによりコードされるアミノ酸による重鎖の少なくとも残基９５〜１００ａの置換により形成され、その場合、ＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各々に対して変異体アミノ酸のセットをコードするために使用される。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドのセットの例は配列（ＤＶＫ）７を含む。一部の実施形態においては、ライブラリはＤＶＫおよびＮＮＫコドンセットの両方でコードされたアミノ酸による残基９５〜１００ａの置換により形成する。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドのセットの例は配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）を含む。別の実施形態においては、ライブラリはＤＶＫおよびＮＮＫコドンセットの両方でコードされたアミノ酸による少なくとも残基９５〜１００ａの置換により形成する。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドのセットの例は配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）を含む。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例は配列（ＮＮＫ）６を含む。適当なオリゴヌクレオチド配列の他の例は本明細書に記載する基準に従って当業者が決定できる。
【０１１９】
別の実施形態においては、異なるＣＤＲＨ３設計を利用することにより高親和性バインダーを単離し、そして種々のエピトープに対するバインダーを単離する。このライブラリにおいて形成されるＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１〜１３アミノ酸であるが、これとは異なる長さも形成することができる。Ｈ３の多様性はＮＮＫ、ＤＶＫおよびＮＶＫコドンセット、並びにＮおよび／またはＣ末端におけるより限定された多様性を使用することにより拡張できる。
【０１２０】
多様性はまた、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２において形成することもできる。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の多様性の設計は以前の設計よりも天然の多様性により緊密にマッチしている多様性に着目した変更を伴って記載した天然の抗体レパートリーを模倣するためのターゲティングの方策に従う。
【０１２１】
ＣＤＲＨ３における多様性に関しては、異なる長さのＨ３を有するように多数のライブラリを別個に構築し、そして次に、抗原をターゲティングするためのバインダーを求める選別のために組み合わせることができる。多数のライブラリをプールし、そして明細書中前述および後述する固体支持体選択および溶液分類方法を用いて分類することができる。マルチソーティングの方策を使用してよい。例えば１つの変法では固体に結合した標的に対する分類を行い、その後、融合ポリペプチド上に存在する場合があるタグ（例えば抗ｇＤタグ）に対する分類を行い、そしてその後、固体に結合した標的に対する別の分類を行う。或いは、ライブラリを固体表面に結合した標的に対して先ず分類することができ、次に溶出したバインダーを標的抗原の漸減濃度における溶液相結合を用いて分類する。異なる分類方法の組み合わせを利用することは高度に発現される配列のみの選択の最小限化を可能にし、そして、多くの異なる高親和性クローンの選択を可能にする。
【０１２２】
標的抗原に対する高親和性バインダーをライブラリから単離できる。Ｈ１／Ｈ２領域における限定された多様性は縮重性を約１０４〜１０５倍低下させ、そしてより高値のＨ３多様性を可能にすれば、より高親和性のバインダーが得られる。ＣＤＲＨ３における異なる型の多様性を有するライブラリを利用することにより（例えばＤＶＫまたはＮＶＴを利用することにより）、標的抗原の異なるエピトープに結合する場合があるバインダーの単離が可能となる。
【０１２３】
上記した通りプールされたライブラリから単離されたバインダーのうち、親和性は軽鎖において限定された多様性をもたらすことによりさらに向上する場合があることが発見された。本実施形態において軽鎖の多様性は以下の通り、即ちＣＤＲＬ１において：アミノ酸位置２８はＲＤＴによりコードされ；アミノ酸位置２９はＲＫＴによりコードされ；アミノ酸位置３０はＲＶＷによりコードされ；アミノ酸位置３１はＡＮＷによりコードされ；アミノ酸位置３２はＴＨＴによりコードされ；場合により、アミノ酸位置３３はＣＴＧによりコードされ；ＣＤＲＬ２において：アミノ酸位置５０はＫＢＧによりコードされ；アミノ酸位置５３はＡＶＣによりコードされ；そして場合により、アミノ酸位置５５はＧＭＡによりコードされ；ＣＤＲＬ３において：アミノ酸位置９１はＴＭＴまたはＳＲＴまたは両方によりコードされ；アミノ酸位置９２はＤＭＣによりコードされ；アミノ酸位置９３はＲＶＴによりコードされ；アミノ酸位置９４はＮＨＴによりコードされ；そしてアミノ酸位置９６はＴＷＴまたはＹＫＧまたは両方によりコードされるように、形成される。
【０１２４】
別の実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３領域における多様性を有するライブラリを形成する。本実施形態においてＣＤＲＨ３における多様性は種々の長さのＨ３領域を用いて、そして主にコドンセットＸＹＺおよびＮＮＫまたはＮＮＳを用いて形成する。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを用いて形成してプールすることができ、或いはオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。本実施形態のライブラリは固体に結合した標的に対抗して分類できる。多数の分類から単離されたクローンはＥＬＩＳＡアッセイを用いて特異性および親和性に関してスクリーニングできる。特異性に関しては、クローンは所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対抗してスクリーニングできる。次に標的抗原に対するこのようなバインダーを溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合アッセイにおいて親和性に関してスクリーニングできる。高親和性のバインダーは上記した通り調製したＸＹＺコドンセットを利用してライブラリから単離できる。これらのバインダーは細胞培養物中において高収率で抗体または抗原結合フラグメントとして容易に製造できる。
【０１２５】
一部の実施形態においては、ＣＤＲＨ３領域における長さにおいてより大きい多様性を有するライブラリを形成することが望ましい場合がある。例えば約７〜１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を有するライブラリを形成することが望ましい場合がある。
【０１２６】
これらの実施形態のライブラリから単離された高親和性バインダーは高収率で細菌および真核生物細胞の培養物中において容易に製造される。ベクターはｇＤタグ、ウィルス被膜タンパク質成分配列のような配列を容易に除去するように、および／または、高収率で完全長抗体または抗原結合フラグメントの産生を可能にする定常領域配列において付加するために設計できる。
【０１２７】
ＣＤＲＨ３において突然変異を有するライブラリは他のＣＤＲ、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２の変異体型を含有するライブラリと組み合わせることができる。即ち、例えば、１つの実施形態において、ＣＤＲＨ３ライブラリを、所定のコドンセットを用いて２８、２９、３０、３１、および／または３２位において変異体アミノ酸を有するヒト化４Ｄ５抗体配列との関連で形成されたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせる。別の実施形態においては、ＣＤＲＨ３への突然変異を有するライブラリは、変異体ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。１つの実施形態において、ＣＤＲＨ１ライブラリは２８、３０、３１、３２および３３位において変異体アミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５配列を有するように形成される。ＣＤＲＨ２ライブラリは所定のコドンセットを用いて５０、５２、５３、５４、５６および５８位において変異体アミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５配列を有するように形成される。
【０１２８】
（ｘｉ）抗体突然変異体
抗体突然変異を形成するためには、１つ以上のアミノ酸改変（例えば置換）を親抗体の１つ以上の超可変領域に導入する。或いは、または追加的に、フレームワーク領域残基の１つ以上の改変（例えば置換）を親抗体に導入してよく、その場合、これらは第２の哺乳類種に由来する抗原に対する抗体突然変異体の結合親和性の向上をもたらす。修飾すべきフレームワーク領域の残基の例は、直接抗原に非共有結合的に結合し（Ａｍｉｔら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲのコンホメーションに相互作用／影響し（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に関与する（ＥＰ２３９ ４００Ｂ１）ものを包含する。特定の実施形態においては、１つ以上のそのようなフレームワーク領域残基の修飾は第２の哺乳類種に由来する抗原に対する抗体の結合親和性の増強をもたらす。例えば、約１〜約５フレームワーク残基を本発明の本実施形態において改変してよい。場合により、これは、超可変領域の残基の何れも改変されていない場合であっても、前臨床治験における使用のために適する抗体突然変異体をもたらすためには十分である場合がある。しかしながら通常は、抗体突然変異体は追加的な超可変領域の改変を含むことになる。
【０１２９】
改変される超可変領域残基は、特に親抗体の元の結合親和性がランダムに産生された抗体突然変異体が容易にスクリーニングされ得るようなものである場合には、ランダムに変更してよい。
【０１３０】
そのような抗体突然変異体を形成するための１つの有用な操作法は「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。ここでは１つ以上の超可変領域残基をアラニンまたはポリアラニン残基により置き換えることにより第２の哺乳類種に由来する抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。次に置換に対して機能的感受性を示している超可変領域残基を、置換部位において、またはそれに対して追加の、または他の突然変異を導入することにより純化する。即ち、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異の性質自体は予め決定されている必要はない。この方法で産生したａｌａ突然変異体を本明細書に記載する通りそれらの生物学的活性に関してスクリーニングする。
【０１３１】
通常は「好ましい置換」の見出しの下に以下に示すもののような保存的置換により開始する。そのような置換が生物学的活性（例えば結合親和性）の変化をもたらす場合、次に、以下の表において「例示される置換」と命名されている、またはアミノ酸クラスを参照して後述においてさらに説明する通り、より実質的な変化を導入し、そして生成物をスクリーニングする。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
抗体の生物学的特性におけるより実質的な修飾は以下、即ち：（ａ）例えばシートまたはヘリックス型のコンホメーションとしての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対する自身の作用において有意に異なっている置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は共通の側鎖の特性、即ち：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および、
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
に基づいて群に分割される。
【０１３４】
非保存的置換はこれらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを包含することになる。
【０１３５】
別の実施形態においては、修飾のために選択される部位はファージディスプレイを用いてアフィニティー成熟化される（上記参照）。
【０１３６】
アミノ酸配列突然変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られる種々の方法により調製される。これらの方法は限定しないがオリゴヌクレオチド媒介（または部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびより早期に調製された突然変異体または親抗体の非突然変異体型のカセット突然変異誘発を包含する。突然変異体を作成するための好ましい方法は部位指向性突然変異誘発である（例えばＫｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８参照）。
【０１３７】
特定の実施形態においては、抗体突然変異体は単一の超可変領域残基が置換されているのみとなる。他の実施形態においては、親抗体の１つ以上の超可変領域残基が置換されることになり、例えば約２〜約１０超可変領域置換となる。
【０１３８】
通常は、向上した生物学的特性を有する抗体突然変異体は親抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。この配列に関する同一性または類似性は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列をアラインし、そして必要に応じてギャップを導入した後に、親抗体残基と同一（即ち同じ残基）または類似（即ち共通の側鎖特性に基づいた同じ群に由来するアミノ酸残基、上記参照）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして本明細書においては定義される。可変ドメインの外部の抗体配列内へのＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、欠失、または挿入の何れも、配列の同一性または類似性に影響するものとみなされない。
【０１３９】
抗体突然変異体の産生の後、親抗体と比較した場合のその分子の生物学的活性を測定する。上記した通り、ここでは抗体の結合親和性および／または他の生物学的活性の測定を行ってよい。本発明の好ましい実施形態においては、抗体突然変異体のパネルを調製し、そして抗原またはそのフラグメントに対する結合親和性に関してスクリーニングする。この初回スクリーニングから選択された１つ以上の抗体突然変異体を、場合により１つ以上の別の生物学的活性アッセイに付すことにより、増強された結合親和性を有する抗体突然変異体が実際に、例えば前臨床試験のために有用であることを確認する。
【０１４０】
このようにして選択された抗体突然変異体は、多くの場合抗体の意図する用途に応じてさらに修飾に付してよい。そのような修飾では、アミノ酸配列をさらに改変し、非相同ポリペプチドに融合し、および／または後述の通り操作する共有結合的修飾を行ってよい。アミノ酸配列改変に関しては、例示される修飾は上記の通り操作される。例えば抗体突然変異体の適切なコンホメーションの維持に関与する何れかのシステイン残基もまた、一般的にはセリンで置換することにより、分子の酸化安定性を向上させ、そして異常な交差結合を防止してよい。逆に、システインの結合を抗体に付加することによりその安定性を向上させてよい（特に抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。別の型のアミノ酸突然変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体中に観察される１つ以上の炭水化物部分を欠失させることにより、および／または、抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することにより、達成してよい。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ連結またはＯ連結の何れかである。Ｎ連結はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の連結を指す。Ｘがプロリン以外の何れかのアミノ酸であるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的連結のための認識配列である。即ち、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列の何れかの存在は、潜在的なグリコシル部位を生じさせる。Ｏ連結グリコシル化は糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンでもよいヒドロキシアミノ酸への連結を指す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列をそれが上記トリペプチド配列のうち１つ以上を含有するように改変することにより、好都合に達成される（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）。改変はまた、元の抗体の配列に対する１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換により行ってもよい（Ｏ連結グリコシル化部位の場合）。
【０１４１】
同じ型の操作法および改変を用いることによりネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチドのアゴニストとして作用するＣＹＴＬ１変異体を作成できる。
【０１４２】
（ｘｉｉ）抗体および他のポリペプチドの組み換え産生
抗体の組み換え産生のためには、それをコードする核酸を単離し、そして後のクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター内に挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分は一般的に、限定しないが、以下のもの、即ちシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５３４，６１５記載）のうちの１つ以上を包含する。
【０１４３】
本発明におけるベクター中でのＤＮＡのクローニングまたは発現のための適当な宿主細胞は、上記した原核生物、酵母、または他の高等な真核生物の細胞である。この目的のための適当な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性の生物、例えば腸内細菌科、例えばエシェリシア、例えばＥ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・チフィムリウム、セラチア、例えばセラチア・マルセスカンス、およびシゲラ、並びにバチルス、例えばＢ．サブチルスおよびＢ．リチェニホルミス（例えば１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．リチェニホルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えばＰ．アエルギノーサ、およびストレプトマイセスを包含する。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）も適している。これらの例は限定的なものではなく、例示に過ぎない。
【０１４４】
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば糸状カビまたは酵母も抗体をコードするベクターのための適当なクローニングまたは発現の宿主である。サッカロマイセス・セレビシアエ、即ち一般的にはパン酵母が、下等な真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら多くの他の属、種、および系統が本発明において一般的に入手可能であり、そして有用であり、例えばスキゾサッカロマイセス・ポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ．ラクチス、Ｋ．フラジリス（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウイケラミ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス、およびＫ．マルキシアヌス；ヤロウイニア（ＥＰ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；および糸状カビ、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム、およびアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニヅランスおよびＡ．ナイジャーが挙げられる。
【０１４５】
グリコシル化抗体の発現のための適当な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例は植物および昆虫の細胞を包含する。多くのバキュロウィルス菌株および変異体およびスポドプテラ・フルギペルダ（イモムシ）、アエデス・アエギプチ（カ）、アエデス・アルボピクツス（カ）、ドロソフィリア・メラノガスター（ミバエ）、およびボンビックス・モリのような宿主に由来する相当する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス菌株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体およびボンビックス・モリＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に入手可能であり、そしてそのようなウィルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってここでウィルスとして使用してよい。綿、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用できる。
【０１４６】
しかしながら、脊椎動物細胞の場合が最も興味深く、そして培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の増殖が定型的な操作法となっている。有用な哺乳類宿主細胞系統の例は、ＳＶ４０で形質転換したサル腎ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎系統（懸濁培養物中での生育のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０１４７】
宿主細胞は抗体産生のための上記した発現またはクローニングベクターで形質転換され、そして、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切であるように修飾された従来の栄養培地中で培養される。
【０１４８】
本発明の抗体の産生のために使用される宿主細胞は種々の培地中で培養してよい。市販されている培地、例えばＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコの変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞を培養するために適している。さらにまた、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；または５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許３０，９８５に記載されている培地のいずれかを宿主細胞のための培養培地として使用してよい。これらの培地の何れにも、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ）、微量元素（マイクロモル範囲の再終濃度において通常は存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充してよい。何れかの他の必要な補充物もまた、当業者に知られる適切な濃度において包含させてよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されていたものであり、そして当業者の知る通りである。
【０１４９】
組み換え手法を使用する場合、抗体はペリプラズム空間内に細胞内で産生されるか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１工程として、宿主細胞または溶解細胞の何れかである粒状破砕物を例えば遠心分離または限外濾過により除去する。抗体を培地中に分泌させる場合、そのような発現系に由来する上澄みは一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを上記した工程の何れかに包含させることによりタンパク質分解を阻害してよく、そして抗生物質を包含させることにより有害な夾雑体の生育を防止してよい。
【０１５０】
細胞から調製した抗体組成物は例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適当性は抗体中に存在する何れかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存している。プロテインＡはヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいた抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスアイソタイプに対して、そしてヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．，５：１５６７−１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドを連結するマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも使用される。機械的に安定なマトリックス、例えば制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンはアガロースを用いて達成できるよりも高速な流量および短いプロセシング時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上のクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）の上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿もまた回収すべき抗体に応じて使用される。
【０１５１】
他の組み換えポリペプチド、例えばＣＹＴＬ１およびＣＹＴＬ１変異体は同様の操作法により製造できる。
【０１５２】
２．アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体または他のＣＹＴＬ１アゴニストを得るためのスクリーニング
ＣＹＴＬ１のアゴニスト抗体および他のアゴニストは伝統的（競合的）結合アッセイまたは活性アッセイにおいて同定できる。
【０１５３】
ＣＹＴＬ１アゴニストを得るためのスクリーニングアッセイはｕＰＡＲと結合または複合体形成するか、または別様にＣＹＴＬ１とｕＰＡＲとの相互作用を妨害し、そしてｕＰＡＲへのｕＰＡの結合を競合的に阻害できる化合物を同定するために設計してよい。本明細書に記載するスクリーニングアッセイは化学ライブラリの高スループットスクリーニングに適したアッセイを包含し、低分子薬剤候補を同定するために特に適するものとなっている。一般的に、結合アッセイおよび活性アッセイが与えられる。
【０１５４】
アッセイは種々のフォーマット、例えば限定しないが、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞系アッセイにおいて実施することができ、これらは当該分野で良く特徴付けられている。
【０１５５】
全てのアッセイは、それらが候補ＣＹＴＬ１アゴニストをｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＣＹＴＬ１に、これら２成分が相互作用を起こすために十分な条件下および時間に渡り接触させることを必要とする点において共通である。結合アッセイにおいては、相互作用は結合であり、そして形成された複合体を単離するか、または反応混合物中で検出することができる。特定の実施形態においては、ｕＰＡまたはｕＰＡＲポリペプチドまたは候補アゴニストの何れかを固相上、例えばマイクロプレート上に、共有結合または非共有結合的な連結により固定化する。アッセイはアンカリングされた成分を含有するコーティングされた表面のような固定化成分に、検出可能な標識で標識されていてよい非固定化成分を添加することにより実施する。反応が終了した時点で、非反応成分を例えば洗浄により除去し、そして固体表面上にアンカリングされた複合体を検出する。元来固定化されていない成分が検出可能な標識を担持している場合は、表面上に固定化された標識の検出は複合体化が起こったことを示している。元来固定化されていない成分が標識を担持していない場合は、複合体化は例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識された抗体を用いて検出できる。
【０１５６】
好ましくは、ＣＹＴＬ１拮抗剤を、それらがｕＰＡの生物学的活性を阻害する能力、例えば腫瘍の形成または転移を媒介するか、または血管形成、例えば限定しないが腫瘍の血管形成を誘導または支援するｕＰＡの能力に基づいて、同定するか、または追加的に試験する。
【０１５７】
当然ながら、本明細書において特に考察しているスクリーニングアッセイは例示に過ぎない。スクリーニングされる拮抗剤候補（例えばポリペプチド、ペプチド、非ペプチド有機低分子、核酸等）の型に応じて選択できる種々の他のアッセイは当業者に良く知られており、そして、本発明の目的のために等しく適当である。
【０１５８】
３．医薬組成物
ＣＹＴＬ１およびＣＹＴＬ１アゴニスト、例えばアゴニストＣＹＴＬ１抗体は、ｕＰＡの産生または機能に関連する種々の障害、例えば種々のタイプの腫瘍または癌、例えば腫瘍または癌の転移、および望ましくない血管形成、例えば限定しないが、腫瘍および癌の血管形成を特徴とする疾患および障害の処置のために、医薬組成物の形態において投与できる。
【０１５９】
抗体フラグメントを使用する場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害性のフラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学合成および／または組み換えＤＮＡ技術による産生が可能である。例えばＭａｒａｓｃｏらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照。
【０１６０】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション手法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に封入してよい。そのような手法は上記したＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
【０１６１】
インビボの投与のために使用されることになる製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
【０１６２】
除放性調製物を調製してよい。除放性調製物の適当な例は抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、このマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。除放性マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日間よりも長い期間に渡り分子を放出できるのに対し、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセル化された抗生物質が長時間身体内に残存する場合、それらは３７℃において水分に曝露される結果として変性または凝集を起こし、その結果生物学的活性の損失および免疫原性変化の可能性が生じる場合がある。関与する機序に応じて安定化のための合理的な方策を講じることができる。例えば凝集の機序がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されれば、安定化は、スルフィドリル残基を修飾すること、酸性の溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を調節すること、適切な添加剤を使用すること、および特定の重合体マトリックス組成物を開発することにより、達成してよい。
【０１６３】
本発明における製剤はまた、処置すべき特定の適応症のために必要に応じて１つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含有してよい。そのような分子は意図する目的のために有効な量において組み合わせて適宜存在させるか、或いは別個に製剤化し、そして同時に、または何れかの順序において連続して投与してよい。
【０１６４】
例えば、本発明のＣＹＴＬ１およびＣＹＴＬ１アゴニストは１つ以上の追加的治療薬、例えば抗血管形成剤、抗新生物性組成物、化学療法剤および／または細胞毒性剤と組み合わせて投与してよい。
【０１６５】
以下の実施例は説明目的のみのために提示しており、そして如何様にも本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１６６】
本明細書において引用する全ての特許および参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１６７】
材料および方法
材料−組み換えヒトｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびｕＰＡ−ＡＴＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）より入手した。Ｐｒｏ−ｕＰＡはＣｏｒｔｅｘ Ｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＬｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より入手した。ブタ粘膜由来の低分子量ヘパリンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【０１６８】
インサイチュハイブリダイゼーション−薄膜切片のインサイチュハイブリダイゼーションのために、ＰＣＲプライマーを設計し、ＮＭ＿００１０８１１０６［５’−ＣＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＡＡ−３’（配列番号４）］のｎｔ．１１１−５６０から伸長するマウスＣＹＴＬ１の４４９ｂｐのフラグメント、またはＮＭ＿０１８６５９［５’−ＴＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣ−３’（配列番号５）および５’−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣ−３’（配列番号６）］のｎｔ．９４−５２５から伸長するヒトＣＹＴＬ１の４３１ｂｐのフラグメントを増幅した。プライマーは２７ヌクレオチドのＴ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードする伸長部を包含することにより、増幅産物からのそれぞれセンスまたはアンチセンスプローブのインビトロの転写を可能とした。
【０１６９】
ホルマリン固定パラフィン包埋５μｍ切片を脱パラフィン処理し、３７℃で３０分間４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で脱タンパク質処理し、そして以前に報告されている通りインサイチュハイブリダイゼーション用にさらに処理した（Ｊｕｂｂら（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２６，２５５−２６４）。３３Ｐ−ＵＴＰ標識のセンスおよびアンチセンスのプローブを一夜５５℃において切片にハイブリダイズさせた。未ハイブリダイズのプローブはＲＮａｓｅ処理およびストリンジェントな洗浄により除去した。スライドガラスを段階濃度エタノールで脱水し、ＮＴＢ核トラックエマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）中に浸積し、４℃で４週間露光し、次に現像し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで逆染色した。
【０１７０】
ＡＴＤＣ５細胞成熟アッセイ−ＡＴＤＣ５細胞はＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌｂａｎｋ，Ｊａｐａｎより入手し、そして、５％ウシ胎児血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＨａｍのＦ１２培地の５０：５０混合物中に維持した。細胞を１２穴プレートの各ウェル当たり１０５個の細胞となるように播種し、コンフルエントとなるまで生育させ、次に１０μｇ／ｍｌ組み換えウシインスリンおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸で処理することにより軟骨細胞分化を誘導した。成熟化中、種々の時点において、ＲＮＡを３連のウェルから採取した。第１１日に、一部の細胞を０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで処理し、そしてさらに２４時間の後ＲＮＡを採取した。
【０１７１】
コラーゲン誘導関節炎−７〜８週齢の雄性ＤＢＡ／１ＪマウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅガイドラインに従って維持した。全ての実験操作法はＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されている。コラーゲン誘導関節炎は第０日および第２１日に完全フロイントアジュバント中のウシＩＩ型コラーゲンの注射により標準的プロトコル（Ｂａｒｃｋら（２００４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ５０（１０），３３７７−３３８６）に従って誘導した。全ＲＮＡは臨床疾患のある手掌から、そして健常ＤＢＡ／１Ｊ対照マウスの手掌から抽出した。
【０１７２】
ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓデータ−市販のデータベースＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてコラーゲン誘導関節炎の間の遺伝子発現のクエリを行った。試料は製造元（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコルに従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ ＧｅｎｅＣｈｉｐ上で分析した。
【０１７３】
ＣＹＴＬ１の発現および精製−ミツバチメリチンシグナルペプチドと共にＦａｓｔＢａｃバキュロウィルス系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて昆虫細胞中にＮ末端ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＹＴＬ１を発現させた。タンパク質はＮｉ＋＋−セファロース６ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で精製した。タグは組み換えエンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で切断し、そしてタグおよび酵素をＮｉ＋＋−セファロースおよびＥＫａｐｔｕｒｅアガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて枯渇させた。ＣＹＴＬ１はさらに塩勾配溶離によりヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｈｉｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）から精製し、次にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて３ｋＤａのＭＷカットオフで濃縮した。濾過のフロースルーは表面プラズモン共鳴および細胞系アッセイにおける緩衝液対照として使用するために温存しておいた。
【０１７４】
発現クローニング−ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ系ベクター中に約１４，０００の完全長ヒトｃＤＮＡを含有する発現ライブラリをＯｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓｌ）；ＴＡＣＩ−ＡＰおよびヒトおよびネズミＣＹＴＬ１−ＡＰをｐＲＫ５系ベクターを用いて一過性トランスフェクションにより２９３細胞中で発現させた。細胞馴化培地を酵素活性に関してアッセイし、そして必要に応じて希釈することにより活性を等しくした。２４穴プレート中のＣＯＳ細胞をＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて発現コンストラクトのプール物でトランスフェクトした。４８時間後、接着細胞を洗浄し、次に０．１％ＢＳＡを添加したＣＹＴＬ１−ＡＰまたはＴＡＣＩ−ＡＰを含有する細胞馴化培地を用いて室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、結合した融合タンパク質を１０％中性緩衝ホルマリンと共にインキュベートすることにより表面に交差結合させた。９０分間６５℃でプレートをインキュベートすることにより内因性のアルカリホスファターゼを不活性化し、次にウエスタンブルー安定化基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてアルカリホスファターゼの活性を検出した。
【０１７５】
ｕＰＡの不活性化−室温で２時間１０ｍＭジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）で処理することによりｕＰＡのプロテアーゼ活性を非可逆的に阻害した。過剰なＤＦＰは十分な透析により除去した。完全な不活性化はｕＰＡ基質Ｓ−２４４４（ｄｉａＰｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＯＨ）を用いることにより確認した。
【０１７６】
細胞表面結合アッセイ−図の説明に示す通りＣＯＳまたはＣＨＯ細胞を完全長のヒトまたはマウスｕＰＡＲをコードする発現ベクターでトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクション体を２４穴プレートに移した。さらに２４時間の後、細胞を洗浄し、次に「発現クローニング」の下に詳述したとおりＣＹＴＬ１−ＡＰを含有する細胞馴化培地を用いてプローブした。結合アルカリホスファターゼ活性の定量のために、ＢｌｕｅＰｈｏｓ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を検出試薬として使用した。競合アッセイのためには記載濃度のプロ−ｕＰＡ、ｕＰＡ−ＡＴＦ、ＤＦＰ−ｕＰＡまたは精製されたＣＹＴＬ１を、ｕＰＡＲトランスフェクト細胞とのインキュベーションの直前にＣＹＴＬ１−ＡＰ細胞馴化培地に添加した。
【０１７７】
ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）−全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて抽出し、光学密度により定量し、そしてＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写した。形成したｃＤＮＡを７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプローブを用いて２連でアッセイした。増幅されたシグナルを記載の通りβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨのものに対して標準化した。プライマーおよびプローブは表１に列挙する通りである。
【０１７８】
表面プラズモン共鳴−表面プラズモン共鳴実験は１０μｌ／分の流量においてＨＢＳ−Ｐ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤）を用いてＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により実施した。組み換えヒトｕＰＡＲを標準的なアミンカップリング化学を用いてＣＭ５センサーチップ上に固定化した。慨すれば、新しく混合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩の８分間注入により表面を活性化し、ｕＰＡＲを１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中２０μｇ／ｍｌで注入し、そして未反応のエステルを１Ｍエタノールアミンでクエンチした。空のフローセルおよびカップリングしたＢＳＡを有するフローセルを対照として使用した。平衡結合分析のために種々の濃度の精製ＣＹＴＬ１および等価な希釈度の緩衝液を全フローセルに渡って注入した。緩衝液単独への応答をＣＹＴＬ１応答から差し引き、そして平衡時のピーク応答を記録した。希釈および計測は３回実施した。ＢＩＡＥｖａｌソフトウエア（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いてラングミュアの方程式を使用して平衡結合データをフィットさせた。ＣＹＴＬ１とプロ−ｕＰＡとの間の競合を示すために、飽和濃度のプロ−ｕＰＡの注入の前、および直後に、ｕＰＡＲカップリングフローセルにＣＹＴＬ１を注入した。
【０１７９】
二次構造予測−ＣＹＴＬ１種相同体はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＴ検索によりＥＳＴおよびゲノム配列から同定し、そしてＣｌｕｓｔａｌＸを用いてアラインした。ＪＰｒｅｄウエブサイトを介したＪｎｅｔニューラルネットワーク系アルゴリズム（３３）への入力として多数種アライメントを使用することにより、二次構造予測を生じさせた。ソース配列：ヒトＮＭ０１８６５９，ＡＹ３５９１０１；チンパンジー（パン・トログロダイト）ゲノム予測：ＧｅｎＳｃａｎのｃｈｒ４＿２．３；マカクサル（リーサス・マカク、マカラ・マラッタ）ゲノム予測：Ｇｅｎｓｃａｎのｃｈｒ５．４．０００．ａ；ウシ（ボス・タウルス）ＢＥ６８３３２９、ＢＥ６８３３２８、ＢＥ６８３３２７；マウスＮＭ＿００１０８１１０６；ラットＣＫ４７６５２９、ＣＫ３６３５９１、ＣＫ３５９５３６；ポッサム（モノデルフィス・ドメスチカ）ゲノム予測：ＧｅｎＳｃａｎのｃ＿６１９．３４；ニワトリ（ガルス・ガルス）ＢＸ９３１２９７、アフリカツメガエル（ラビス）ＥＢ４７４５４３、ＥＢ４７４０６８、ＥＣ２７７０３１；Ｐ．オリブ（バスタード・ハリブー、パラリクチス・オリバセウス）ＣＸ２８５７７７、ＣＸ２８５６８７；ハリブー（ヒポグロスス・ヒポグロスス）ＥＢ０３６６３５；フグ（ラブライプス）ＢＬＡＴにより同定されたゲノム配列−ｃｈｒＵｎ：１８９、１５９、９７５〜１８９、１６０、９５７；メダカ（オリジアス・ラチプス）ＡＵ２４１６９６、ＡＵ２４１４５９、ＡＵ１７７７６８；サケ（サルモ・サラー）ＥＧ８４７１９４、ＥＧ８３３０３７、ＥＧ８０２５５５；マス（オンコラインクス・ミキス）ＢＸ８８９７７７、ＢＸ８６６０１０；キュウリウオ−オスメルス・モルダックスＥＬ５５１７５；ミノウ（ピメファレス・プロメラス）ＤＴ３０９３８２、ＤＴ３４７７０９、ＤＴ１０６９６２；ゼブラフィッシュ（ゼブラフィッシュ、ダニオ・レリオ）ＥＥ２１４３５９、ＥＥ２１３１９８、ＥＢ９５７４９５；ゼブラフィッシュ２（ダニオレリオ−第２のＣＹＴＬ１相同体）ＡＬ９１３０３３、ＥＨ４６６９４６、ＥＨ４４１０４２、ＡＬ９１３０３４。
【０１８０】
結果
ＣＹＴＬ１のインビボの発現−ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションによれば軟骨原基に相当する段階において肋骨、脊椎および長骨を包含するマウス胚中の発生中の骨格エレメントの種々のものにおけるＣＹＴＬ１の発現が明らかになっている（図１）。薄膜切片のインサイチュハイブリダイゼーションによれば、主に軟骨におけるＣＹＴＬ１の発現が明らかにされており、関節軟骨の表面層において特に高値の発現がある。ＣＹＴＬ１発現はまた、気管の軟骨輪においても観察されている。高レベルの発現は腱と骨との間の接触部位の周囲における腱鞘において観察されている。ＣＹＴＬ１発現は発生中の長骨の肥大性の軟骨細胞中、そしてさらに、動脈（静脈では観察されない）内皮細胞中にも観察され、第１７日胚において大動脈中に先ず検出され、そして成体マウスにおいては筋肉動脈全体に渡って拡張している。
【０１８１】
軟骨細胞成熟化の間のＣＹＴＬ１の発現の過程をクローンマウス前軟骨細胞系統ＡＴＤＣ５を用いて検討した（図２）。ＡＴＤＣ５細胞はインスリンに応答して分化し、遺伝子発現における十分特性化された変化を有している。ＣＹＴＬ１は未分化細胞において検出可能ではなかったが、分化の開始後は、ＣＹＴＬ１発現は第４日までには検出され、早期軟骨細胞マーカーコラーゲンＩＩの発現を伴っていた。ＣＹＴＬ１発現は第１２日まで増大し続け、成熟軟骨細胞のマーカーであるアグレカンの増大した発現を伴っていた。
【０１８２】
発現のモジュレーション−多くのサイトカインが炎症において重要な調節の役割を果たしている（Ｈｅｉｎｒｉｃｈら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７４（Ｐｔ１），１−２０）ため、本発明者らは実験的関節炎疾患のマウスモデルの経過の間のＣＹＴＬ１発現を調べた。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルから得られたマイクロアレイデータは、マウス関節中のＣＹＴＬ１の発現は疾患においてダウンレギュレートされ、臨床評点および炎症サイトカイン、特にＩＬ−１βの産生のピークと一致していることを示している（図３ａ）。別の実験においてマウスの手掌から抽出されたＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によればＣＩＡにおけるＣＹＴＬ１発現のダウンレギュレーションが確認された（図３ｂ）。ＩＬ−１βはＣＩＡの進行において重要な役割を果たし（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｏ．（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９８，２０７−２１６）、軟骨破壊に必須のメディエーターであり（Ｚｗｅｒｉｎａら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４（２８），１１７４２−１１７４７）、そして軟骨細胞に対して直接作用することにより数種の軟骨細胞成熟化関連の遺伝子のダウンレギュレーションを誘導する（ＬｅＦｅｂｖｒｅら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ １０５２（３），３６６−３７８）。ＣＩＡにおけるＣＹＴＬ１のダウンレギュレーションがＩＬ−１βの直接の作用により説明できるかどうかを試験するために、本発明者らは分化したＡＴＤＣ５軟骨細胞をＩＬ−１βに曝露し、そしてｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現をアッセイした。本発明者らは０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βに応答したＣＹＴＬ１発現の１０分の１への低減を観察した（図３ｃ）。逆に、ｕＰＡＲ発現はＩＬ−１β処置によりアップレギュレートされた。
【０１８３】
受容体の同定−ＣＹＴＬ１はより早期には数種の両親媒性のα−ヘリックスの二次構造の予測に基づいて４ヘリックスサイトカインとして説明されていた（Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５（３），２８３−２９２）。より詳細な折畳みの分析のために、本発明者らはまず、ＧｅｎＢＡＮＫの網羅的ＰｓｉＢＬＡＳＴクエリにより全ての既知のＣＹＴＬ１オーソログの進化的に多様な収集物を作成し（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７），３３８９−３４０２）、配列をＣｌｕｓｔａｌＸとアラインし（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（２４），４８７６−４８８２）、そして次にＰｓｉＰＲＥＤとＪＮｅｔアルゴリズムの両方を使用することにより（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２（２），１９５−２０２；Ｃｕｆｆ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４０（３），５０２−５１１）、正確な二次構造の予測を発生させた（補足図１）。短鎖サイトカインのヘリックスＡ〜Ｃに合致する長さと間隔を有する３つのα−ヘリックス（Ｒｏｚｗａｒｓｋｉら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（３），１５９−１７３）が高い信頼性で予測され、それと共に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−１３のような短鎖サイトカインにおいて観察されるようなα−ヘリックスおよび２つの短いβ−鎖の追加的な単一ターンが伴っている。ＣＹＴＬ１と４ヘリックスサイトカインファミリーとの間の関連性はそのゲノム機構の分析により強化される。４ヘリックスサイトカインは構造的特徴と比較してエキソン境界のステレオタイプの位置付けを示しており、全接合部が第０相にあり、これはＣＹＴＬ１により共有されている特性である。しかしながら、その予測された二次構造においては、ＣＹＴＬ１は、第４番目、即ちＤヘリックスが非存在であるか、極度にトランケーションされているそのＣ末端領域におけるヘリックスサイトカインパターンから劇的に逸脱している。このヘリックスはヘリックスサイトカインのそれらの高親和性受容体への結合のために必須であるため（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ ２６７（５１９６），３８３−３８６；Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｊ．，およびＧａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６８，１０７−１４６）、これは、ＣＹＴＬ１が恐らくは無関連の受容体ファミリーにとって欠如している受容体結合の相違した様式を採用している可能性を示唆していた。
【０１８４】
本発明者らは、発現クローニングの手順を用いてＣＹＴＬ１の受容体に関する偏りのない検索を実施した。ＣＹＴＬ１−アルカリホスファターゼ融合タンパク質（ＣＹＴＬ１−ＡＰ）を用いて、完全長のヒトクローンのライブラリに由来するプールされた発現コンストラクトでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞をプローブした。本発明者らはＣＹＴＬ１−ＡＰに結合する能力を細胞に付与する単一のプールを同定し、次にこのプールを構成している個々のクローンをスクリーニングすることにより原因となる単一のクローンを同定した（図４ａ）。このクローンの配列決定によりそれがｕＰＡＲをコードしていることが判明した。ｕＰＡＲの発現は、酵素活性により計測した場合、ＣＹＴＬ１−ＡＰと等しい濃度で使用した対照アルカリホスファターゼ融合タンパク質ＴＡＣＩ−ＡＰ（膜貫通活性化因子カルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド相互作用物質）に対して結合をもたらさなかった。同様の結果がＣＨＯ細胞に対して観察された。ｕＰＡＲに構造的に関連しているＣ４．４Ａの発現はＣＹＴＬ１−ＡＰに結合する能力をもたらさなかった（データ示さず）。ネズミｕＰＡＲでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はマウスＣＹＴＬ１−ＡＰ融合タンパク質に結合することができ（図４ｂ）、ＣＹＴＬ１とｕＰＡＲとの間の相互作用の進化論的保存を示していた。種間交差性の結合は殆ど、或いは全く観察されなかった。
【０１８５】
過剰量の精製されたＣＹＴＬ１は濃度依存的な態様においてｕＰＡＲトランスフェクト細胞へのＣＹＴＬ１−ＡＰの結合を阻害することができた（図４ｃ）。相同競合を推定すれば、３つの独立した実験で得られた細胞表面におけるｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の親和性は約１．５μＭ±０．５μＭ（ＳＥＭ）である。
【０１８６】
ｕＰＡＲは多くの細胞表面および細胞外のタンパク質、例えばｕＰＡ、αｖおよびβ１インテグリン、ビトロネクチン、ｕＰＡＲ−関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ／エンド１８０）およびＩＧＦ−ＩＩＲ（Ｐｌｏｕｇ，Ｍ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ９（１９），１４９９−１５２８）と相互作用することがわかっている。ＣＹＴＬ１がｕＰＡＲと直接、そしてアクセサリータンパク質を必要とすることなく相互作用するかどうかを調べるために、本発明者らはＢＩＡｃｏｒｅ３０００を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実施した。精製されたＣＹＴＬ１は固定化されたｕＰＡＲに特異的に結合した（図５）。同様の結合は哺乳類細胞および細菌において発現されたＣＹＴＬ１でも観察された（データ示さず）。相互作用の速度論的動態は極めて急速であり、そして正確に定量することはできなかった。平衡結合の計測値は固定化ｕＰＡＲ上、および、対照フローセル上に種々の濃度のＣＹＴＬ１を注入することにより得た（図５ｃ）。単一部位結合に関するラングミュアの方程式はデータに良好にフィットし、１．１μＭ±０．０６μＭのＣＹＴＬ１とｕＰＡＲとの相互作用に関する親和性定数の計測値が得られた。固定化されたｕＰＡＲの密度を５倍範囲に渡って変動させても親和性の相違は観察されなかった。
【０１８７】
グリコサミノグリカンは数種のサイトカインのそれらの受容体への結合に大きく影響することが知られている。本発明者らによるＣＹＴＬ１タンパク質の精製はＣＹＴＬ１とヘパリンとの間の相互作用を利用しており、そのため本発明者らはこの相互作用をさらに特性化することを試みた。ＣＹＴＬ１およびヘパリンを単独および組み合わせて、固定化されたｕＰＡＲ上に注入した（図５ｄ）。ヘパリンおよびＣＹＴＬ１単独では各々、一過性の結合を示し（８８ＲＵおよび１１２ＲＵ）；ＣＹＴＬ１とヘパリンを共に注入した場合、超相加的作用（３５３ＲＵ）が観察され、ヘパリンがＣＹＴＬ１のｕＰＡＲへの結合を増強していることが示された。
【０１８８】
競合的結合−ｕＰＡＲはｕＰＡに対する細胞表面受容体である。ｕＰＡＲへの結合に関してＣＹＴＬ１がｕＰＡと競合するかどうか明らかにするため、ｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞を種々の濃度のタンパク質分解的に不活性なプロ酵素（プロ−ｕＰＡ）、受容体結合アミノ末端フラグメント（ｕＰＡ−ＡＴＦ）またはジイソプロピルフルオロホスフェートで処理することにより不活性化された完全長ｕＰＡ（ＤＦＰ−ｕＰＡ）の存在下でＣＹＴＬ１ＡＰと共にインキュベートした。ｕＰＡの３形態全てがｕＰＡＲ発現細胞の表面への結合に関してＣＹＴＬ１−ＡＰと競合し（図６ａ〜ｃ）、結合の５０％阻害は競合物質１０ｎＭ〜４０ｎＭで達成された。この競合が追加のタンパク質の非存在下、および嵩高のアルカリホスファターゼタグの非存在下で起こるかどうかを試験するために、ＳＰＲ分析を再度使用した（図６ｄ）。ＣＹＴＬ１を固定化ｕＰＡＲ上に注入し、２８２応答単位（ＲＵ）の結合を生じさせるようにした。次にプロ−ｕＰＡを高濃度で注入することにより５０％超の受容体占有状態を達成した。ＣＹＴＬ１の２回目の注入は大きく減衰した結合（９５Ｒ）をもたらし、プロ−ｕＰＡによる受容体占有がＣＹＴＬ１への結合のために使用できる受容体の量を低減したことを示していた。低ｐＨによるｕＰＡＲからのプロ−ｕＰＡの解離の後、ＣＹＴＬ１に結合する能力は回復した。
【０１８９】
考察
ＣＹＴＬ１は軟骨細胞および動脈内皮細胞により主に組織限定的様式において産生される分泌タンパク質である。その予測二次構造およびゲノム機構において、ＣＹＴＬ１は４α−ヘリックス造血性サイトカインに部分的類似性を保有している。僅かな例外を除き、このタンパク質ファミリーの全メンバーは、フィブロネクチン３型（Ｆｎ３）様のサイトカイン結合モジュールの保存された対により区別できる細胞表面受容体の進化論的に保存されたファミリーに結合する（Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（１８），６９３４−６９３８）。これらの受容体はそれらの細胞内伸長部を介してＪＡＫファミリーのタンパク質チロシンキナーゼおよびＳＴＡＴ転写因子と会合し、これを介して、細胞外リガンド結合により駆動される受容体オリゴマー化の後にシグナルがトリガーされる。この原理の３つの例外であるＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＦｌｔ３Ｌは、第２のクラスのＰＤＧＦＲ様受容体について「欠損」しており、これは自身のリガンドを免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインに結合させ、そして細胞質チロシンキナーゼドメインを介してシグナルを発生するものである。ＣＹＴＬ１に関する受容体のスクリーニングにおいては従来サイトカイン受容体は同定されていない。同定された受容体であるｕＰＡＲは上記ファミリーの何れにも構造的に無関連であり、そしてむしろ、ＧＰＩアンカーにより原形質膜に結合されているヘビ神経毒中に構造的に初めて同定されたドメインである３つのＬｙ６−ｕＰＡＲ（ＬＵ）様モジュール（Ｐｌｏｕｇ，Ｍ．，ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，Ｖ．（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３４９（２），１６３−１６８；Ｂａｒｉｎｋａら（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６３（２），４８２−４９５；Ｌｌｉｎａｓら（２００５）Ｅｍｂｏ Ｊ ２４（９），１６５５−１６６３）で大部分が構成されている。４ヘリックスサイトカインとＬＵモジュラータンパク質との間では、これらのドメインの折畳み関連物はＴＧＦ−βに対するシグナリング受容体のサイトカイン結合セグメント、アクチビンおよび骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）を含む（Ｇｙｅｔｋｏら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３（４），１３８０−１３８７）にも関わらず、相互作用は報告されていない。ＣＹＴＬ１が実際に４ヘリックスサイトカインであれば、これはＬＵ折畳み型に関する相互作用の全く新規なクラスとなる。
【０１９０】
サイトカインは典型的には一連の受容体に逐次的に結合して細胞内ホスホリル化のカスケードをトリガーする高親和性のシグナリング複合体を形成することによりそれらの機能を呈する。しかしなお、ｕＰＡＲがＣＹＴＬ１に対する真のシグナリング受容体であるかどうか、または、それがＣＹＴＬ１結合タンパク質としてより正確に説明されるかどうかは不明である。細胞内および膜貫通ドメインを欠いているため、ｕＰＡＲの単独の作用はシグナリング受容体としては機能できない。しかしながら、多くのシグナリング経路がｕＰＡＲのライゲーションの後に活性化されることがわかっており、タンパク質キナーゼＳｒｃ、ＪＡＫ−１、Ｈｃｋ、ＦＡＫおよびＥＲＫ１／２の活性化が報告されている（Ｗｅｂｂら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５２（４），７４１−７５２；Ｔａｎｇら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３（２９），１８２６８−１８２７２；Ｒｅｓｎａｔｉら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１５（７），１５７２−１５８２；Ｄｕｍｌｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（１），３１５−３２１）。シグナルトランスダクションの機序は、インテグリンに関する役割が強く示唆されているものの、なお不明である。ｕＰＡＲとインテグリンα３β１との間の直接でｕＰＡ依存性の相互作用（Ｗｅｉら（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２（１０），２９７５−２９８６）が間接的相互作用を有するものとして示されており、その場合、ビトロネクチンはｕＰＡ依存的な様式でｕＰＡＲに結合し、そして次にインテグリンをライゲーションする（Ｍａｄｓｅｎら（２００７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７７（５），９２７−９３９）。ｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の結合は、ＣＹＴＬ１が他の膜貫通鎖にｕＰＡＲを架橋できれば、或いは、それがインテグリンまたは他のシグナリング分子とのｕＰＡＲの相互作用を局所的に調節すれば、同様の様式で細胞内シグナルトランスダクションをもたらす可能性がある。
【０１９１】
本発明者らは、ＣＹＴＬ１がプロ−ｕＰＡ、ｕＰＡ−ＡＴＦおよびＤＦＰ−不活性化ｕＰＡと競合しながらｕＰＡＲに結合することを明らかにしている。従ってＣＹＴＬ１はｕＰＡＲとのｕＰＡの相互作用の拮抗剤として機能できる。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用はプロ−ｕＰＡを切断して成熟ｕＰＡを形成するヘプシンおよびマトリプターゼのような細胞表面活性化因子にプロ−ｕＰＡを接触させる作用を有する。ｕＰＡＲへの結合はまた、成熟ｕＰＡの活性を増強する。ｕＰＡＲの結合に関して競合することにより、ＣＹＴＬ１は細胞関連ｕＰＡ活性を低減すると考えられる。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用の競合的阻害剤の生物学的効果は多くの系において検討されている。ｕＰＡのタンパク質分解的に不活性化された突然変異体の型によりトランスフェクトされた腫瘍細胞は低減した転移能力を示し（Ｃｒｏｗｌｙら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１１），５０２１−５０２５）、ｕＰＡ−ＡＴＦは微小血管内皮細胞による管形成（Ｃｒｏｏｎら（１９９９）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５４（６），１７３１−１７４２）および網膜損傷後の血管形成（Ｌｅ Ｇａｔら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（２５），２０９８−２１０３）を阻害する。ｕＰＡと競合しながらｕＰＡＲに結合することにより、軟骨誘導ＣＹＴＬ１は同様の効果を媒介する場合があり、ｕＰＡＲ発現細胞が侵襲する能力を低減し、そして軟骨の一体性を維持することを支援する。
【０１９２】
健常な関節においてはｕＰＡＲの発現は殆どないが；関節炎の間は、浸潤白血球がｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方を発現し、そして軟骨細胞および滑膜細胞の両方が炎症性サイトカインに応答してｕＰＡＲを発現し（Ｂｕｓｓｏら（１９９７）Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５６（９），５５０−５５７；Ｇｕｉｄｕｃｃｉら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２３（３），３６４−３７２；Ｓｃｈｗａｂら（２００１）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１５（４），３１７−３２３）、そして軟骨の破壊的な血管新生がｕＰＡＲ発現内皮細胞が侵襲するに従い発生する。ｕＰＡＲ拮抗剤の潜在的な効果はコラーゲン誘導関節炎を有するマウスへのｕＰＡ−ＡＴＦの全身送達により明らかにされており、これは疾患の発生率および重症度、および軟骨血管新生の程度を低減している（Ａｐｐａｒａｉｌｌｙら（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（３），１９２−２００）。炎症の非存在下においては、ＣＹＴＬ１は関節軟骨において強力に発現されるが、その発現は炎症シグナルに応答して劇的に低減される。ｕＰＡ拮抗剤活性のこの消失は細胞侵襲および細胞外マトリックスのリモデリングを促進する場合がある。現在実施中のＣＹＴＬ１遺伝子欠損トランスジェニックマウスの表現型分析がインビボの役割の明確化に役立つはずである。
【０１９３】
骨ホメオスタシスにおけるｕＰＡＲの役割は、ｕＰＡＲ欠損マウスの研究を介して最近明らかにされた（Ｆｕｒｌａｎら（２００７）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２２（９），１３８７−１３９６）。ｕＰＡＲ発現の非存在下において、骨鉱物質密度は上昇し、そして骨容量は低減している。増強された骨芽細胞活性および骨表面への破骨細胞接着の不全がこの表現型を説明していると考えられる。これは軟骨におけるＣＹＴＬ１の発現が隣接する骨におけるマトリックスリモデリングに影響する機序となっている。
【０１９４】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析により定量した場合のｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の結合は中間的な親和性、即ち約１μＭを有する。これはサイトカインのそれらの細胞表面受容体に対する親和性の典型的な範囲より有意に低値である。なお同定されていないＣＹＴＬ１に対する共受容体が存在する可能性があり、それはシグナルトランスダクションの機序を与えることに加えて、細胞表面におけるｕＰＡＲに対するＣＹＴＬ１の親和性を増大させ、これによりそれをより強力なｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用拮抗剤とする可能性がある。共受容体の非存在下においても、ＣＹＴＬ１はｕＰＡと効果的に競合するために十分高い局所濃度に到達することも想像される。大規模遺伝子発現試験（Ｋｕｍａｒら（２００１）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ／ＯＡＲＳ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ９（７），６４１−６５３）から得られたデータの慎重な分析によれば、ＣＹＴＬ１はｍＲＮＡレベルで豊富に表われ、その傾向は他の如何なるサイトカインよりも高いことがわかった。このことはＣＹＴＬ１が銀染色２Ｄゲル中で容易に検出される関節軟骨のプロテオーム分析（Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎら（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（４２），４３５１４−４３５２１）においてタンパク質レベルで当てはまると考えられる。ＣＹＴＬ１とヘパリンとの間の相互作用はＣＹＴＬ１の局所濃度がブーストされると考えられる機序となっている。ヘパリンが生理学的結合相手である可能性は低いが、軟骨の豊富な高度硫酸化グリコサミノグリカンはＣＹＴＬ１に結合してそれを発現部位の近傍に局在化させる可能性がある。さらにまた、ヘパリンにより達成されたｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の結合の強化は、細胞外マトリックスまたは細胞表面の何れかにおけるグリコサミノグリカンがｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の親和性を増強している可能性があることを示唆している。
【０１９５】
本明細書の作成の間、ＣＹＴＬ１の別の研究が発表された（Ｋｉｍら（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ．ＰＭＩＤ：１７６４４８１４）。著者らはＣＹＴＬ１が間葉細胞の軟骨細胞への分化を促進することを発見している。本発明者らは軟骨細胞に分化しているＡＴＤＣ５細胞へのＣＹＴＬ１ＡＰの結合を観察しており（補足図２ａ）、そして本発明者らはｑＲＴ−ＰＣＲによるこれらの細胞によるｕＰＡＲの発現を示している（補足図２ｂ）。
【０１９６】
ＣＹＴＬ１の分子作用が４ヘリックスサイトカインファミリーのメンバーとして非典型的であるとすれば、ＣＹＴＬ１が真にこのファミリーのメンバーであるかどうかという疑問は未解決のままであり、そして構造的特性化なくしては解答が得られないことになる。ファミリーの多くのメンバーが多面発現性であり、異なる細胞コンパートメントにおいて極めて異なる機能的役割を果たしていることに留意すべきである。例えばレプチンは全身的には脂質代謝の調節物質として、そして局所的には造血（Ｗａｕｔｅｒｓら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１４３（３），２９３−３１１）および調節性Ｔ細胞発生（Ｄｅ Ｒｏｓａら（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６（２），２４１−２５５）を調節するという両方の作用を有している。同様に、ＣＤ３４＋造血先祖細胞により発現されるＣＹＴＬ１はより多くの従来のサイトカイン様機能を保持しているが、軟骨および血管壁においては極めて異なる機能を採用している可能性もある。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のその受容体ｕＰＡＲへの結合を阻害するための方法、および／またはｕＰＡの生物学的活性を阻害するための方法に関する。本発明はさらに、腫瘍の形成または転移、血管形成、例えば腫瘍血管形成を阻害するための方法、およびＣＹＴＬ１アゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）は如何なる既知の造血系サイトカイン受容体にも構造的に類似していない。これは広範な種類の遊走性の細胞型により発現されるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリング細胞表面タンパク質である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ｕＰＡＲは２つの異なる作用を有しており、即ち、第１にはそれが不活性な前ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（プロ−ｕＰＡ）を運搬して細胞表面プロテアーゼに接近させ、それにより分解されてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）となり、これは細胞表面に係留されて残存し（非特許文献４）、そこでそれはセリンプロテアーゼカスケードを開始し、細胞周囲のタンパク質分解をもたらすことになり（非特許文献５；非特許文献６）；そして第２にそれは細胞外マトリックス成分ビトロネクチンに結合し（非特許文献７）、これが次に細胞表面インテグリンに結合する（非特許文献８）。細胞外マトリックスへの接着とその分解の両方に影響することにより、ｕＰＡのｕＰＡＲへの結合は、ｕＰＡＲ欠損マウスにおける好中球リクルートメントの不全により顕在化される通り、細胞の遊走において重要な役割を果たしている（非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００３】
ｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用の競合的阻害剤の生物学的効果は多くの系において検討されている。ｕＰＡのタンパク質分解的に不活性な突然変異体でトランスフェクトされた腫瘍細胞は腫瘍転移の能力の低減を示しており（非特許文献１１）、ｕＰＡ−ＡＴＦは微小血管内皮細胞による管形成（非特許文献１２）および網膜傷害後の血管形成（非特許文献１３）を阻害する。
【０００４】
ＣＹＴＬ１（サイトカイン様１）は新規の分泌タンパク質を同定して分析するための大規模な研究の一部としてクローニングされており（非特許文献１４）、そして米国特許出願公開２００５００３７４６５において「ＰＲＯ４４２５」として開示されている。これは造血幹先祖細胞の希少なＣＤ３４＋サブセットにおいて高度に発現される転写物の産物であるＣ１７と同一であることがわかっている（非特許文献１５）。ＣＹＴＬ１特異的ｃＤＮＡの原料組織の分析、プロテオーム研究（非特許文献１６）、および大規模な遺伝子発現分析（非特許文献１７；非特許文献１８）によれば軟骨および骨における豊富なＣＹＴＬ１発現が示されている。それと対応して、ヒトにおいてＣＹＴＬ１をコードする遺伝子（ＮＭ＿０１８６５９）は骨と軟骨の発達に関与を示唆されている遺伝子がリッチ化されている領域（４ｐ１６−１５）である染色体４：５，０６７，２１７−５，０７２，０９８にマッピングされている（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。両親媒性の分析によれば４つのα−ヘリックスの存在が示唆されている（非特許文献１５）。ＣＹＴＬ１のサイトカイン様性質は造血系の４つのα−ヘリックス束のサイトカインを連想させるパターンにおけるＣＹＴＬ１鎖中の両親媒性のα−ヘリックスの予測に基づいている（非特許文献２２）。本ファミリーのメンバーは有意な配列の類似性の非存在下に十分に保存されたコア折畳み部を有しており（非特許文献２３）、そしてこのタンパク質の構造は、特殊化された膜貫通受容体のある集団とのそれらの相互作用を指向する傾向がある（非特許文献２４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｅｐｐｅｒら（１９９３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２２（３），６７３−６８４
【非特許文献２】Ｄａｎｏら（１９９９）Ａｐｍｉｓ １０７（１），１２０−１２７
【非特許文献３】Ｇｙｅｔｋｏら、（１９９４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９３（４），１３８０−１３８７
【非特許文献４】Ｃｕｂｅｌｌｉｓら（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１（３４），１５８１９−１５８２２
【非特許文献５】Ｄａｎｏら、（２００５）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ９３（４），６７６−６８１
【非特許文献６】Ｐｌｏｕｇ，Ｍ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ９（１９），１４９９−１５２８
【非特許文献７】Ｗｅｉら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（５１），３２３８０−３２３８８
【非特許文献８】Ｍａｄｓｅｎら（２００７）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７７（５），９２７−９３９
【非特許文献９】Ｒｉｊｎｅｖｅｌｄら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８（７），３５０７−３５１１
【非特許文献１０】Ｇｙｅｔｋｏら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５（３），１５１３−１５１９
【非特許文献１１】Ｃｒｏｗｌｙら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１１），５０２１−５０２５
【非特許文献１２】Ｋｒｏｏｎら（１９９９）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５４（６），１７３１−１７４２
【非特許文献１３】Ｌ Ｇａｔら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（２５），２０９８−２１０３
【非特許文献１４】Ｃｌａｒｋら（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １３（１０），２２６５−２２７０
【非特許文献１５】Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５（３），２８３−２９２（２）
【非特許文献１６】Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎら、（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（４２），４３５１４−４３５２１
【非特許文献１７】Ｋｕｍａｒら（２００１）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ／ＯＡＲＳ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ９（７），６４１−６５３
【非特許文献１８】Ｙａｇｅｒら（２００４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８４（３），５２４−５３５
【非特許文献１９】Ｍａｎｇｉｏｎら（１９９９）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６５（１），１５１−１５７
【非特許文献２０】Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５（１），１−５
【非特許文献２１】Ｓｈｉａｎｇら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８（２），３３５−３４２
【非特許文献２２】Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ １１（１０），３５０−３５４
【非特許文献２３】Ｈｉｌｌら、（２００２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２２（１），２０５−２３３
【非特許文献２４】Ｓｐｒａｎｇ ａｎｄ Ｂａｚａｎ，（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３（６），８１５−８２７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記において考察したとおり、ｕＰＡとその受容体ｕＰＡＲとの間の相互作用は、セリンプロテアーゼカスケードの開始を細胞膜に局在化させること、そして細胞表面受容体と細胞外マトリックスとの間の会合をモジュレートすることの両方により、種々の細胞型の遊走において重要な役割を果たしている。本発明は少なくとも部分的には、ｕＰＡＲ結合に関してｕＰＡと競合するｕＰＡＲに対する追加的なリガンドとしての分泌サイトカイン様タンパク質ＣＹＴＬ１／Ｃ１７の同定に基づいている。
【０００７】
１つの態様において、本発明はサイトカイン様１（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドまたはそのアゴニストにウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）を含む混合物を接触させることを含むｕＰＡとｕＰＡＲとの相互作用を阻害する方法に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストにインビボでウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を発現する細胞を接触させることを含むｕＰＡの生物学的活性を阻害する方法に関する。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳類被験体における腫瘍形成または腫瘍転移を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、哺乳類被験体における血管形成を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む方法に関する。
【００１１】
またさらに別の態様において、本発明は（ａ）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびＣＹＴ１またはそのアゴニストを含有する混合物を候補拮抗剤とともにインキュベートすること、および（ｂ）ｕＰＡＲへのｕＰＡまたはそのアゴニストの結合を競合的に阻害する候補拮抗剤の能力を計測すること、を含むウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の拮抗剤のスクリーニングの方法に関する。
【００１２】
全ての態様において、アゴニストは例えば、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド性低分子、またはアゴニストＣＹＴＬ１抗体またはそのフラグメントであってよい。
【００１３】
全ての態様において、ポリペプチドは例えばＣＹＴＬ１変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、例えば配列番号２のＣＹＴＬ１のようなネイティブ配列ＣＹＴＬ１分子の配列と少なくとも約６０％、または６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＣＹＴＬ１変異体であってよい。
【００１４】
全ての態様において、アゴニストＣＹＴＬ１抗体または抗体フラグメントは好ましくはモノクローナルであり、そしてキメラ、ヒト化、またはヒト型であることができる。
【００１５】
全ての態様において、抗体フラグメントは例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００１６】
全ての態様において、哺乳類被験体は好ましくはヒト患者である。
【００１７】
全ての態様において、腫瘍または癌は例えば、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病、例えば、限定しないが、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＣＹＴＬ１のインビボ発現。ＣＹＴＬ１ ｍＲＮＡ発現は（ａ〜ｄ）ホールマウント標本および（ｅ〜ｐ）薄片に対して実施したインサイチュのハイブリダイゼーションにより分析した。全ての組織は特段の記載が無い限りマウスおよび成人より入手した。（ｅ〜ｊ）においては、上パネルは暗視野像であり、下パネルは相当する明視野像である。ａ）第１２日胚の脊椎骨、ｂ）第１３日胚の手掌、ｃ）第１２日胚の気管および肺、ｄ）第１２日胚の肋骨、ｅ）腱鞘（腱（Ｔ）、中足骨（Ｍ））、ｆ）気管、ｇ）肺動脈、ｈ）第１８日胚中足骨、ｉ）表面軟骨層におけるＣＹＴＬ１発現を示す（ｈ）における関節表面のより高い倍率、およびｊ）ヒト気管。白色のバーは１００□ｍを示す。
【図２】軟骨細胞分化の間のＣＹＴＬ１の発現。ＡＴＤＣ５前軟骨細胞をコンフルエントとなるまで生育させ、次にインスリンおよびアスコルビン酸で処置して分化を促進した。記載した時点において、ＲＮＡを採取し、そしてＴａｑＭａｎにより遺伝子発現をアッセイした。記載した結果はＧＡＰＤＨに対して標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）されており、そして観察された最大値に尺度を合わせてある。丸印−コラーゲンＩＩ、三角印−アグレカン、四角印−ＣＹＴＬ１。結果は３つの独立した実験の代表である。
【図３】ＣＩＡにおけるＣＹＴＬ１のダウンレギュレーション。（Ａ）ＩＬ−１βおよびＣＹＴＬ１の発現レベルはＣＩＡプロトコル開始してから種々の日数の後にマウスの関節から抽出したＲＮＡのマイクロアレイ分析により計測した。（Ｂ）ＲＮＡは健常マウスの手掌およびＣＩＡを有するマウスの炎症手掌から抽出した。ＣＹＴＬ１発現はｑＲＴ−ＰＣＲでアッセイし、そしてβ−アクチンに対して標準化した。平均およびＳＥＭ（Ｎ＝５対照／３ＣＩＡ）。（Ｃ）軟骨細胞の分化は１１日間ＡＴＤＣ５細胞において誘導した。次に細胞を０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（黒色バー）または培地単独（白色バー）で２４時間処置した。ＲＮＡを採取しｑＲＴ−ＰＣＲでアッセイし、そしてβ−アクチンで標準化した。４つの独立した実験に由来する標準化したデータの平均およびＳＥＭ。「相対的発現」とは対照と比較した場合の発現である。
【図４】ｕＰＡＲはＣＹＴＬ１に対する受容体である。（Ａ）擬似トランスフェクトされたＣＯＳ細胞およびｕＰＡＲ発現コンストラクトでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞をＣＹＴＬ１−ＡＰまたは対照であるＴＡＣＩ−ＡＰとともにインキュベートし、そして結合したＡＰ活性を染料付着により検出した。（Ｂ）ヒトおよびマウスＣＹＴＬ１−ＡＰを未トランスフェクトのＣＯＳ細胞（白色バー）、またはネズミ（斜線バー）またはヒト（黒色バー）のｕＰＡＲでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞とともにインキュベートした。結合したＰＡ活性を比色酵素アッセイにより計測した。（Ｃ）ｕＰＡＲトランスフェクトした細胞をＣＹＴＬ１−ＡＰおよび記載濃度の精製ＣＹＴＬ１とともにインキュベートした。ＣＹＴＬ１−ＡＰの結合は比色酵素アッセイにより計測し、そしてバックグラウンド（未トランスフェクト細胞）を差し引いた後の精製されたＣＹＴＬ１非存在下に観察された結合のパーセンテージとして表示した。
【図５】ＣＹＴＬ１−ｕＰＡＲ相互作用の表面プラズモン共鳴分析。記載した濃度における精製されたＣＹＴＬ１をＡ）固定化ｕＰＡＲ、Ｂ）対照のフローセル上に注入した。Ｃ）平衡結合分析−ピークｕＰＡＲ依存性応答を注入したＣＹＴＬ１の濃度に対してプロットする。曲線は読み取り値の３つの独立したセットに対するラングミュア方程式の最良フィットを示す。Ｄ）以下に示すもの、即ちｉ）ＣＹＴＬ１（１μｍ）、ｉｉ）ＣＹＴＬ１（１μｍ）＋ヘパリン（１６０μｇ／ｍｌ）、ｉｉｉ）緩衝液単独、およびｉｖ）ヘパリン（１６０μｇ／ｍｌ）を固定化したｕＰＡＲ上に注入した。各条件の３つの独立した調製物の重複応答曲線（対照フローセル差し引き後）を、記載した平衡時の平均の応答とともに示す。
【図６】ＣＹＴＬ１およびｕＰＡは競合してｕＰＡＲに結合する。ＣＹＴＬ１−ＡＰを記載濃度のＡ）ｕＰＡ−ＡＴＦ、Ｂ）プロ−ｕＰＡまたはＣ）ＤＦＰ不活性化ｕＰＡの存在下にｕＰＡＲトランスフェクト細胞と共にインキュベートした。細胞表面結合ＣＹＴＬ１−ＡＰを酵素アッセイにより計測し、そして競合物質非存在下の結合パーセントとして表示した。示された曲線によれば、単一の結合部位に対する可逆的競合が推定される。Ｒ２値は０．９９８、０．９８７および０．８８０である。Ｄ）組み換えヒトｕＰＡＲ（４７７６ＲＵ）をＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップの１つのフローセル中に固定化した。ＣＹＴＬ１（１μｍ）の３つの同一注入を８０μｇ／ｍｌプロ−ｕＰＡの注入の前後、およびプロ−ｕＰＡの解離（洗浄）後に実施した。対照フローセル（ＢＳＡ固定化、５１５７ＲＵ）の差し引き後の平衡応答を各ＣＹＴＬ１注入に関して記載する。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂ：ネイティブ配列のヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびネイティブヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂ：ネイティブ配列のヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびネイティブヒトＰＲＯ４４２５（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）。
【図８】ＣＹＴＬ１−ＡＰを用いてプローブしたアビジンコーティングプレート上に固定化した酵素的にビオチン化されたｕＰＡＲを示し、結合はＡＰ基質を用いて検出した。ＣＹＴＬ１−ＡＰは他のタンパク質の非存在下でｕＰＡＲに直接結合する。
【図９】ＣＹＴＬ１−ＡＰを用いてプローブしたアビジンコーティングプレート上に固定化した酵素的にビオチン化されたｕＰＡＲを示し、結合はＡＰ基質を用いて検出した。ｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１−ＡＰの結合は抗ｉＰＡＲポリクローナルにより阻害される。
【図１０】ＣＹＴＬ１−ＡＰ融合タンパク質を用いたＢＩＡｃｏｒｅ試験。
【図１１】ＣＹＴＬ１はＰＣ−３細胞によるマトリゲル侵襲を阻害する。
【図１２】ＣＹＴＬ１はｕＰＡ依存性細胞増殖を阻害する。
【図１３】ＣＹＴＬ１の存在下で成育させた軟骨細胞において低減したコラーゲンＩＩ発現が観察される。
【図１４】ＣＹＴＬ１ＫＯマウスは肉視的には正常な軟骨および骨を発達させている。
【図１５】ＣＹＴＬ１ＫＯマウスは正常な骨鉱物質密度を生じている。
【図１６】ＣＹＴＬ１ＫＯマウスは重症度の低い関節炎を有するように観察される。
【図１７】組み換えヒトＣＹＴＬ１に関する精製スキーム。
【図１８】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図１９】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図２０】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図２１】ＣＹＴＬ１の安定性を最適化するためのスクリーニング緩衝液。
【図２２】マウスＣＹＴＬ１を精製するための精製スキーム。
【図２３】ＣＹＴＬ１結晶回折の結果。
【図２４】補足図１。ＣＹＴＬ１の二次構造の推定およびゲノム構造。ＣＹＴＬ１種の相同体のアライメントを示しており、推定二次構造は下部に示す通りであり、Ｈ：ヘリックス、Ｅ：延長コンホメーション（β−鎖）を示す。「Ｊｎｅｔ Ｒｅｌ」とは各残基における推定に関する信頼性を示す（９＝最良）。３つのヘリックスが容易に推定され、それに伴い、短いα−ヘリックス（僅か４残基のみ信頼性をもって推定）およびβ−鎖がＡＢループ中に、そして短いβ−鎖がＣ−Ｄループ中に在り、これは多くの短鎖サイトカインに特徴的である。注目すべきはＣ末端領域におけるプロリン残基であり、これはα−ヘリックスの形成とは相反する可能性がある。ヒトＣＹＴＬ１のエキソン境界に相当する位置は矢印で示す通りであり、矢印上方の数字はエキソン境界相およびイントロンの長さを示す。４ヘリックスサイトカインファミリーにおいて、エキソン境界は特徴的にはヘリックスＡの後、ヘリックスＢの前、そしてヘリックスＣの後に観察され、全てがゼロ相であり、これはＣＹＴＬ１に関して観察される通りである。
【図２５】補足図２。ＣＹＴＬ１のＡＴＤＣ５細胞への結合。Ａ）材料および方法においてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に関して記載した通り種々の時点においてＡＴＤＣ５細胞をプローブするためにマウスＣＹＴＬ１−ＡＰを用いた。成熟軟骨細胞の形態を有する細胞への融合タンパク質の結合は第４日より観察され、より後期の時点においてはさらに広範化した。Ｂ）ＡＴＤＣ５成熟化の間の種々の時点においてｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現をアッセイした。記載した結果はＧＡＰＤＨに対して標準化されており、そして観察された最大値に尺度を合わせてある。丸印−コラーゲンＩＩ、三角印−ｕＰＡＲ、四角印−ＣＹＴＬ１。
【図２６】表１。ｑＲＴ−ＰＣＲに関するプライマーおよびプローブ。全プローブはＦＡＭレポーター染料およびＴＡＭＲＡクエンチャーで標識した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．定義
特段の記載が無い限り、本明細書で使用する専門技術用語は本発明が属する技術における通常の技術者が一般的に理解するものと同様の意味を有する。例えばＳｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照。本発明の目的のためには以下の用語を下記記載の通り定義する。
【００２０】
「ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子」即ち「ｕ−ＰＡ」という用語は本明細書においては、４３１アミノ酸のヒト前プロｕ−ＰＡ（ＮＰ＿００２６４９；Ｍｏｒｏｉ ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１（１９），５９５６−５９６５（１９７６））および相当する３１３アミノ酸の成熟ヒトポリペプチドを２１アミノ酸シグナル配列を伴うか伴うことなく（Ｒｏｌｄａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９：４６７-４７４）包含するネイティブ配列のｕ−ＰＡポリペプチド、および、オルタナティブスプライシングされた、そして、対立遺伝子の変異体およびアイソフォーム、並びにその可溶性形態のような全ての天然に存在する変異体を包含する非ヒト哺乳類のそのネイティブ配列相同体を指す。
【００２１】
「ＣＹＴＬ１」、「サイトカイン様１」および「ＰＲＯ４４２５」という用語は本明細書においては互換的に使用され、そして種々の原料から、例えばヒト組織型から、または他の原料から単離してよく、または組み換えまたは合成方法により製造してよい。「ＣＹＴＬ１ポリペプチド」または「ＰＲＯ４４２５ポリペプチド」に言及する本明細書における全ての開示内容はポリペプチドの各々を個別に、または総括して指すものとする。例えば調製、精製、誘導体化、対応または対抗する抗体の形成、投与、含有組成物、関連疾患の処置等の記載は、個別に本発明の各ポリペプチドに関する。「ＣＹＴＬ１ポリペプチド」または「ＰＲＯ４４２５ポリペプチド」という用語はまた、本明細書に開示したＣＹＴＬ１／ＰＲＯ４４２５ポリペプチドの変異体を包含する。
【００２２】
「ネイティブ配列ＣＹＴＬ１／ＰＲＯ４４２５ポリペプチド」は天然から誘導された相当するＣＹＴＬ１ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのようなネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチドは天然より単離することができ、或いは組み換えまたは合成手段により製造できる。「ネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチド」という用語は特記すれば特定のＣＹＴＬ１ポリペプチドの天然に存在するトランケーションされた、または分泌された形態（例えば細胞外ドメイン配列）、ポリペプチドの天然に存在する変異体型（例えばオルタナティブスプライシング型）および天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。本発明の種々の実施形態において、本明細書に開示したネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチドは添付図面に示す完全長アミノ酸配列を含む成熟または完全長のネイティブ配列ポリペプチドである。開始および終止コドンは図中太字および下線で示す。しかしながら、添付の図７に開示するＣＹＴＬ１ポリペプチドは１により示されるメチオニンで開始するように記載されているが、図７中のアミノ酸の１位より上流または下流の何れかに位置する他のメチオニン残基をＣＹＴＬ１ポリペプチドに関する開始アミノ酸残基として使用してもよいことが考えられ、かつ可能である。
【００２３】
本明細書に開示したＣＹＴＬ１ポリペプチドの「シグナルペプチド」の概ねの位置は図７に示す通りである。しかしながら、留意すべきは、シグナルペプチドのＣ末端境界は、シグナルペプチドのＣ末端境界がその型のアミノ酸配列エレメントを同定するために当該分野で定型的に使用されている基準に従って同定してよい、本発明において当初同定されたシグナルペプチドＣ末端境界の何れかの側において、殆どは約５アミノ酸を超えないが、変動する場合がある（例えばＮｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））。さらにまた、同様に認識されていることとして、一部の場合においては、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、１つより多い分泌物質種をもたらす。シグナルペプチドが本発明において同定されたシグナルペプチドのＣ末端境界の何れかの側において約５アミノ酸を超えない範囲で切断されるこの成熟ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドは本発明の意図するものである。
【００２４】
「ＣＹＴＬ１変異体」は、本明細書に開示した完全長ネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチド配列と少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する上述および後述の通り定義される活性なＣＹＴＬ１ポリペプチド、本明細書に開示したシグナルペプチドを欠いたＣＹＴＬ１ポリペプチド配列、本明細書に開示したシグナルペプチドを伴うか伴わないＣＹＴＬ１ポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書に開示した完全長ＣＹＴＬ１ポリペプチドの何れかの他のフラグメントを意味する。そのようなＣＹＴＬ１ポリペプチド変異体は例えば、完全長ネイティブアミノ酸配列のＮまたはＣ末端においてアミノ酸残基１つ以上が付加または欠失しているＣＹＴＬ１ポリペプチドを包含する。通常は、ＣＹＴＬ１ポリペプチド変異体は、少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８２％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８３％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８４％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８６％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８７％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８８％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８９％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９１％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９２％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９３％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９４％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９６％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９７％アミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９８％アミノ酸配列同一性および或いは少なくとも約９９％アミノ酸配列同一性を、本明細書に開示した完全長ネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチド配列、本明細書に開示したシグナルペプチドを欠いたＣＹＴＬ１ポリペプチド配列、本明細書に開示したシグナルペプチドを伴うか伴わないＣＹＴＬ１ポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書に開示した完全長ＣＹＴＬ１ポリペプチド配列の何れかの他の特に定義されたフラグメントに対して有することになる。通常は、ＣＹＴＬ１変異体ポリペプチドは少なくとも約１０アミノ酸長、或いは少なくとも約２０アミノ酸長、或いは少なくとも約３０アミノ酸長、或いは少なくとも約４０アミノ酸長、或いは少なくとも約５０アミノ酸長、或いは少なくとも約６０アミノ酸長、或いは少なくとも約７０アミノ酸長、或いは少なくとも約８０アミノ酸長、或いは少なくとも約９０アミノ酸長、或いは少なくとも約１００アミノ酸長、或いは少なくとも約１５０アミノ酸長、或いは少なくとも約２００アミノ酸長、或いは少なくとも約３００アミノ酸長、またはそれより長いものである。
【００２５】
本発明において同定されたＣＹＴＬ１ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインし、そして、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後、そして、如何なる保存的置換も配列同一性の部分として考慮しない場合に、特定のＣＹＴＬ１ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当業者の能力の範囲内の種々の方法において、例えば公に入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを用いて達成できる。当業者であれば比較すべき配列の完全長に渡って最大アライメントを達成するために必要な何れかのアルゴリズムを包含するアライメントを計測するための適切なパラメータを決定できる。しかしながら本発明の目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られ、その場合、ＡＬＩＧＮ−２プログラムに関する完全なソースコードは後に示す表Ｉに記載する通りである。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作であり、そして後に示す表Ｉに記載するソースコードは米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザマニュアルと共にファイルされており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に入手するか、または後に示す表Ｉに記載するソースコードからコンパイルしてよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）のオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄ上の使用のためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。
【００２６】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を使用する状況において、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した％アミノ酸配列同一性（これは言い換えれば、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した特定の％アミノ酸配列同一性を有するか、または含んでいる所定のアミノ酸配列Ａと表現できる）は以下の通り計算される。
【００２７】
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によりそのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、そして式中、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。当然ながら、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの％アミノ酸配列同一性はＢのＡへの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２および３は「ＣＹＴＬ１」と表記されたアミノ酸配列への「比較タンパク質」と表記されたアミノ酸配列の％アミノ酸配列同一性をどのようにして計算するかを示しており、ここで、「ＣＹＴＬ１」は目的の仮説的ＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は目的の「ＣＹＴＬ１」ポリペプチドを比較すべき相手であるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、そして「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示す。
【００２８】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値はＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いてこの直前に記載した段落において説明した通りに得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性の値はまた、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラムを用いて後述する通りに得てもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータの大部分はデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないもの、即ち調節可能なパラメータは、以下の値、即ち：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ割合＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、および採点マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２で設定される。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を使用する場合、％アミノ酸配列同一性の値は（ａ）ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定されたものとしての、ネイティブＣＹＴＬ１ポリペプチドから誘導された配列を有する目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列と目的の比較アミノ酸配列（即ちＣＹＴＬ１変異体ポリペプチドであってよい目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドが比較される相手となる配列）との間のマッチする同一アミノ酸残基の数を（ｂ）目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸残基の総数で割ることにより求められる。例えば、「アミノ酸配列Ｂへの少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」という文言において、アミノ酸配列Ａは目的の比較アミノ酸配列であり、そしてアミノ酸配列Ｂは目的のＣＹＴＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００２９】
パーセントアミノ酸配列同一性はまた、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードしてよく、或いは別様にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄから得てよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２はいくつかの検索パラメータを使用しており、この場合、これらの検索パラメータの全てはデフォルト値、例えばアンマスク＝有り、鎖＝全て、予測発生度＝１０、最小の低複雑度長＝１５／５、多重通過ｅ値＝０．０１、多重通過の定数＝２５、最終ギャップ付きアライメントに関するドロップオフ＝２５および採点マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されている。
【００３０】
アミノ酸配列比較のためにＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用する状況において、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した％アミノ酸配列同一性（これは言い換えれば、所定のアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの、またはＢに対抗した特定の％アミノ酸配列同一性を有するか、または含んでいる所定のアミノ酸配列Ａと表現できる）は以下の通り計算される。
【００３１】
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは配列アライメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によりそのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて同一マッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、そして式中、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。当然ながら、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの％アミノ酸配列同一性はＢのＡへの％アミノ酸配列同一性と等しくならない。
【００３２】
「単離された」とは、本明細書に開示した種々のポリペプチドを説明するために用いられる場合、自身の天然の環境の成分から同定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。自身の天然の環境の夾雑成分はポリペプチドに関する診断または治療用途を典型的には妨害する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を包含してよい。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは（１）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度にまで、または（２）クーマシーブルーまたは、好ましくは銀染色を用いた非還元または還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性にまで、精製されることになる。単離されたポリペプチドは、ＣＹＴＬ１ポリペプチドの少なくとも１つの天然の環境の成分が存在しないことから、組み換え細胞内部のインサイチュのポリペプチドを包含する。しかしながら通常は単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製されることになる。
【００３３】
「単離された」ＣＹＴＬ１ポリペプチドをコードする核酸または他のポリペプチドをコードする核酸はポリペプチドをコードする核酸の天然の原料において自身が通常会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定され、そして分離される核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は自身が天然に存在する形態またはセッティングとは異なる。従って単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、自身が天然の細胞中に存在することから特定のポリペプチドをコードする核酸分子からは区別される。しかしながら、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は例えば天然の細胞の場合とは異なる染色体位置に核酸分子があるポリペプチドを通常発現する細胞中に含有されたポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【００３４】
「対照配列」という用語は特定の宿主生物中の作動可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する対照配列は例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００３５】
核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係を有するように位置づけられれば「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されればポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結しており、プロモーターまたはエンハンサーはそれが配列の転写に影響すればコード配列に作動可能に連結しており、或いはリボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置づけられていればコード配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結」とは連結されるべきＤＮＡ配列が近接しており、そして分泌リーダーの場合は、近接し、そして読み相にあることを意味している。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００３６】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者により容易に決定され得、そして一般的にはプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した実験的計算である。一般的に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高温を必要とするのに対し、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般的に、相補鎖がそれらの融点より低値の環境に存在する場合に再アニーリングする変性ＤＮＡの能力に依存している。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高値であるほど、使用できる相対的な温度は高値となる。その結果、より高値の相対的温度は反応条件をよりストリンジェントとする傾向があるのに対し、より低値の温度のそのような傾向は低い。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらに詳細な説明および解説に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照。
【００３７】
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、本明細書において定義される場合は、以下のもの、即ち：（１）洗浄のために低イオン強度および高温を使用、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５＋７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で使用；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストランスルフェートを４２℃で使用し、そして洗浄は４２℃において０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド中５５℃、ついで高ストリンジェンシー洗浄を０．１ｘＳＳＣ＋ＥＤＴＡを用いて５５℃で実施、により同定してよい。
【００３８】
「中ストリンジェント条件」はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の通り同定してよく、そして、上記したものよりも低ストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーションの条件（例えば温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を包含する。中ストリンジェント条件の例は２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストランスルフェート、および２０ｍｇ／ｍｌ変性粉砕サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一夜インキュベーション、ついで約３７〜５０℃において１ｘＳＳＣ中フィルター洗浄である。プローブ長等のような要素に適合するために必要に応じて温度、イオン強度などを調節する方法は当業者の知る通りである。
【００３９】
「タグ付けされたエピトープ」という用語は本明細書において使用する場合、「タグポリペプチド」に融合したＣＹＴＬ１ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドはそれに対抗して抗体が形成できるエピトープをもたらすために十分な残基を有するが、なお、自身が融合する相手であるポリペプチドの活性を妨害しない程度に十分短い。タグポリペプチドはさらに抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分独特である。適当なタグポリペプチドは一般的に少なくとも６つのアミノ酸残基、そして通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。
【００４０】
本発明の目的のための「活性な」または「活性」とは、ネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１の生物学的および／または免疫学的な活性を保持しているＣＹＴＬ１ポリペプチドの型を指し、その場合、「生物学的」活性はネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１により保有される抗原性のエピトープに対抗する抗体の産生を誘導する能力以外のネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１により誘発される生物学的機能（阻害性または促進性の何れか）を指し、そして「免疫学的」活性はネイティブまたは天然に存在するＣＹＴＬ１により保有される抗原性のエピトープに対抗する抗体の産生を誘導する能力を指す。本発明の目的のためには、好ましい生物学的活性はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に結合し、ｕＰＡＲへのｕＰＡの結合を競合的に阻害し、および／またはｕＰＡの生物学的活性を阻害する能力を包含する。
【００４１】
「ｕＰＡの生物学的活性」という用語は最も広範な意味において使用され、そして限定しないが、ｕＰＡＲに結合する能力、細胞遊走のモジュレーション、細胞膜へのセリンプロテアーゼカスケードの開始の局在化、細胞表面受容体と細胞外マトリックスとの間の会合のモジュレーション、腫瘍転移の媒介への関与、および血管形成活性を包含する。
【００４２】
「アゴニスト」という用語は本明細書においては元も広範な意味において使用される。ＣＹＴＬ１アゴニストは伏在する機序に関わらずネイティブ配列のＣＹＴＬ１により媒介される生物学的活性を模倣する何れかの分子である。本発明の目的のためには生物学的活性は好ましくは上記定義したｕＰＡ生物学的活性を阻害する能力である。ＣＹＴＬ１アゴニストの例は限定しないが、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体、ペプチドおよび非ペプチド性有機低分子を包含する。
【００４３】
「抗体」という用語は本明細書においては、最も広範な意味において使用され、そして特に、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを網羅している。
【００４４】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する場合がある可能な天然に存在する突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらにまた、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を包含するポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体による夾雑を被らずに合成される点において好都合である。「モノクローナル」という修飾語は抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、そして何れかの特定の方法による抗体の産生を要求するものとみなしてはならない。例えば本発明に従って使用するべきモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に報告されたハイブリドーマ法により作成してよく、或いは組み換えＤＮＡ法により作成してよい（例えば米国特許４，８１６，５６７参照）。「モノクローナル抗体」はまた例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離してよい。
【００４５】
抗体は特に、所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種から誘導されるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同であるが、鎖の残余は別の種から誘導されるか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、並びにそのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許４，８１６，５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において目的とされるキメラ抗体は非ヒト霊長類（例えば旧世界猿、類人猿等）およびヒトの定常領域配列から誘導した可変ドメイン抗原結合配列を含む霊長類化抗体を包含する。
【００４６】
「抗体フラグメント」はインタクトな抗体の一部分、好ましくはその抗原結合または可変領域を含むものを含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００４７】
「インタクトな」抗体は抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインはネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクトな抗体は１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００４８】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」型は非ヒト免疫グロブリンから誘導した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は相当する非ヒト残基により置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体はレシピエント抗体中、またはドナー抗体中には存在しない残基を含んでよい。そのような修飾は抗体の性能をさらに精鋭化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の実質的に全てを含むことになり、その場合、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は場合によりやはり免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことになる。さらに詳細な説明はＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照。
【００４９】
「超可変領域」という用語は本明細書において使用する場合、配列において超可変であり、および／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。超可変領域は「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（即ち軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４、５０〜５６、および８９〜９７、および重鎖可変ドメインの残基３１〜３５、５０〜６５、および９５〜１０２；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」に由来する残基（即ち軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２、５０〜５２、および９１〜９６および重鎖可変ドメインの残基２６〜３２、５３〜５５、および９６〜１０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。両方の場合において、可変ドメイン残基は後述においてさらに詳細に考察する通り、上記したＫａｂａｔらに従ってナンバリングされる。「フレームワーク」即ち「ＦＲ」残基は本明細書において定義する通り超可変領域における残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５０】
「親抗体」または「野生型」抗体は本明細書に開示した抗体変異体と比較した場合に１つ以上のアミノ酸配列改変を欠いているアミノ酸配列を含む抗体である。即ち、親抗体は一般的に本明細書に開示した抗体変異体の相当する超可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも１つの超可変領域を有する。親ポリペプチドはネイティブ配列（即ち天然に存在する）抗体（天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する）、または天然に存在する配列の既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失および／または他の改変）を有する抗体を含んでよい。本開示全体に渡って、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」および「親」または「親の」抗体は、互換的に使用される。
【００５１】
本明細書において使用する場合、「抗体変異体」または「変異体抗体」とは、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは抗体変異体は天然には存在しないアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む。そのような変異体は必然的に親抗体と１００％未満の配列の同一性または類似性を有する。好ましい実施形態においては、抗体変異体は親抗体の重鎖または軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満、そして最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列の同一性または類似性のアミノ酸配列を有することになる。抗体変異体は一般的に、１つ以上の自身の超可変領域の中、またはそれに隣接して１つ以上のアミノ酸改変を含むものである。
【００５２】
「アミノ酸改変」とは所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を指す。例示される改変は挿入、置換および欠失を包含する。「アミノ酸置換」は所定のアミノ酸配列における別の異なるアミノ酸残基による既存のアミノ酸残基の置き換えを指す。
【００５３】
「置き換え」アミノ酸残基はアミノ酸配列において別のアミノ酸残基を置き換えるか置換するアミノ酸残基を指す。置き換え残基は天然に存在する、または天然に存在しないアミノ酸残基であってよい。
【００５４】
「アミノ酸挿入」は所定のアミノ酸配列内部への１つ以上のアミノ酸残基の導入を指す。アミノ酸挿入は「ペプチド挿入」を包含し得、この場合は、ペプチド結合で連結された２つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドが所定のアミノ酸配列内部に導入される。アミノ酸挿入にペプチドの挿入が関与する場合、挿入されるペプチドは、天然には存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発により形成してよい。「超可変領域に隣接する」アミノ酸改変とは、超可変領域のＮ末端および／またはＣ末端における１つ以上のアミノ酸残基の導入または置換であって、挿入または置き換えのアミノ酸残基の少なくとも１つが当該超可変領域のＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基とペプチド結合を形成するようなものを指す。
【００５５】
「天然に存在するアミノ酸残基」とはアラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）よりなる群から一般的に選択される遺伝子コードによりコードされるものである。
【００５６】
「天然に存在しないアミノ酸残基」とは本明細書においては、ポリペプチド鎖中で隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる上記列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である。天然に存在しないアミノ酸残基の例はノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンおよび他のアミノ酸残基類縁体、例えばＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されているものを包含する。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を形成するためには、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２（１９８９）および上記したＥｌｌｍａｎらの操作法を使用できる。慨すれば、これらの操作法では天然に存在しないアミノ酸残基を用いてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、ＲＮＡのインビトロの転写および翻訳を行う。
【００５７】
本開示全体に渡り、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１）のナンバリングシステムを参照することとする。これらの解説書において、Ｋａｂａｔは各サブクラスに関する抗体の多くのアミノ酸配列を列挙し、そしてそのサブクラスにおける各残基位置に関して最も一般的に生じているアミノ酸を列挙している。Ｋａｂａｔは列挙された配列における各アミノ酸に残基番号を割り付けるための方法を使用しており、そして残基番号を割り付けるためのこの方法は本分野において標準的なものとなっている。Ｋａｂａｔナンバリングスキームは本明細書において後述する通りである。本発明の目的のために、Ｋａｂａｔの解説書に包含されない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り付けるためには、以下の工程に従う。一般的に、候補配列はＫａｂａｔの何れかの免疫グロブリン配列または何れかのコンセンサス配列とアラインされる。アライメントは手作業によるか、または一般的に受け入れられているコンピュータプログラムを用いてコンピュータにより実施してよく、そのようなプログラムの例はＡｌｉｇｎ２プログラムである。アライメントは大部分のＦａｂ配列にとって共通である一部のアミノ酸残基を用いることにより容易にしてよい。例えば軽鎖および重鎖は各々典型的には、同じ残基番号を有する２つのシステインを有し；ＶＬドメインにおいては２つのシステインは典型的には残基番号２３および８８にあり、そしてＶＨドメインにおいては２つのシステイン残基は典型的には２２および９２と番号付けされている。フレームワーク残基は常時ではないが一般的には概ね同じ数の残基を有するが、ＣＤＲの大きさは変動することになる。例えば自身がアラインされるＫａｂａｔの配列におけるＣＤＲよりも長い候補配列に由来するＣＤＲの場合、典型的には接尾辞を残基番号に付加することにより追加の残基の挿入を示す（例えば図１Ｂの残基１００ａｂｃ参照）。例えば残基３４および３６に関してＫａｂａｔ配列とアラインするが、それらの間に残基３５とアラインすべき残基を有しない候補配列の場合、番号３５は単に残基に割り付けられない。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「高親和性」を有する抗体はナノモル（ｎＭ）範囲かそれより良好なＫＤ、即ち解離定数を有する抗体である。「ナノモル範囲かそれより良好」なＫＤはＸｎＭと表記してよく、ここでＸは約１０未満の数である。
【００５９】
「フィラメント状ファージ」という用語は自身の表面上に非相同ポリペプチドをディスプレイできるウィルス粒子を指し、そして限定しないがｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、およびＭ１３を包含する。フィラメント状ファージはテトラサイクリンのような選択可能なマーカーを含有してよい（例えば「ｆｄ−ｔｅｔ」）。種々のフィラメント状ファージディスプレイ系が当業者に良く知られている（例えばＺａｃｈｅｒら、Ｇｅｎｅ９：１２７−１４０（１９８０），Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；およびＰａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８（１９８８）参照）。
【００６０】
「パニング」という用語は標的に対する高い親和性および特異性を有する抗体のようなファージ担持化合物の同定および単離におけるスクリーニングプロセスの多数回実施を指す。
【００６１】
「処置する」、「処置」および「療法」という用語は本明細書において使用する場合、治癒的療法、予防的療法、および予防療法を指す。連続処置または投与は１日以上の処置における中断を伴わない少なくとも毎日を基準とした処置を指す。間歇処置または投与、または間歇的様式における処置または投与は連続的ではなく、むしろ周期的な性質にある処置を指す。
【００６２】
「哺乳類」という用語は本明細書において使用する場合、哺乳類に分類される何れかの哺乳類、例えばヒト、高等な非ヒト霊長類、げっ歯類、家畜および牧場動物、例えばウシ、ウマ、イヌおよびネコを指す。本発明の好ましい実施形態においては哺乳類はヒトである。
【００６３】
１つ以上の別の治療薬「と組み合わせた」投与は、同時（併用）および何れかの順序の連続投与を包含する。
【００６４】
「有効量」とは有益な、または所望の治療（予防を包含）結果を起こすために十分な量である。有効量は１回以上の投与において投与できる。
【００６５】
本明細書において使用する場合、「細胞」、「細胞系統」および「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、そして全てのそのような表記は子孫を包含する。即ち、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という単語は初期の対象細胞および形質転換の回数に関わらずそれより誘導された培養物を包含する。さらにまた、全ての子孫は意図的または偶発的な突然変異に起因してＤＮＡ含有量において厳密には同一とならない場合がある。「子孫」という用語は元来形質転換された細胞または細胞系統の後の各世代の全ての新生仔を指す。初回形質転換された細胞においてスクリーニングの対象となるものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫が包含される。異なる表記が意図される場合は、それは文脈から明らかになるはずである。
【００６６】
「癌」および「癌性の」という用語は典型的には調節されない細胞の成育を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指す、または説明するものである。癌の例は癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病を包含するがこれらに限定されない。そのような癌のより特定的な例は、限定しないが、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌を包含する。
【００６７】
「制御配列」という用語は特定の宿主生物において作動可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列は例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００６８】
核酸はそれが別の核酸配列と機能的関連性に有るようにおかれた場合に「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、そのポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーターまたはエンハンサーはそれが配列の転写に影響する場合にコード配列に作動可能に連結しており；或いは、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置づけられていればコード配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結」とは連結されるべきＤＮＡ配列が近接しており、そして分泌リーダーの場合は、近接し、そして読み相にあることを意味している。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００６９】
「低分子」とは約１０００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を有するものとして本明細書においては定義される。
【００７０】
「抗血管形成剤」とは血管の発生をブロック、またはある程度まで妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は例えば血管形成を促進することに関与する成長因子または成長因子受容体に結合する低分子または抗体であってよい。本発明において好ましい抗血管形成因子はベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））のような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【００７１】
「抗新生物性組成物」という用語は少なくとも１つの活性な治療薬、例えば「抗癌剤」を含む癌を処置する場合に有用な組成物を指す。治療薬（抗癌剤）の例は、限定しないが例えば、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法において使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌を処置するための他の薬剤、例えば抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）拮抗剤（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ）、血小板誘導成長因子阻害剤（例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦ受容体の１つ以上に結合する拮抗剤（例えば中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、および他の生物活性および有機化学の薬剤等を包含する。これらの組み合わせもまた本発明に包含される。
【００７２】
本明細書において使用する「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害または防止する、および／または、細胞の破壊を誘発する物質を指す。該用語は放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および毒素、例えば低分子毒素または細菌、カビ、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、およびそのフラグメントおよび／または変異体を包含することを意図している。
【００７３】
「化学療法剤」は癌の処置において有用な化合物である。（登録商標）化学療法剤の例はアルキル化剤、例えばチオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、およびウレドパ；エチレンイミンおよびメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチローロメラミン；ＴＬＫ ２８６（ＴＥＬＣＹＴＡＴＭ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（例えば合成の類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばそのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類縁体）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１）；エレウセロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えばＡｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．編Ｅｎｇｌ．、３３：１８３−１８６（１９９４）参照）およびアントラサイクリン、例えばアナマイシン、ＡＤ３２、アルカルビシン、ダウノルビシン、デキスラゾキサン、ＤＸ−５２−１、エピルビシン、ＧＰＸ−１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ジネミシン、例えばジネミシンＡ、エスペラミシン、ネオカルジノスタチン発色団および関連の発色タンパク質エネジン抗生物質（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシン）、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、およびゾルビシン；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗アドレナール、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタン；葉酸補給剤、例えばフォリン酸（ロイコボリン）；アセグラトン；抗フォレート抗新生物性剤、例えばＡＬＩＭＴＡ７、ＬＹ２３１５１４ペメトレクスド、ジヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤、例えばメトトレキセート、代謝拮抗剤、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびそのプロドラッグ、例えばＵＦＴ、Ｓ−１およびカペシタビン、およびチミジレートシンターゼ阻害剤およびグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸＴＭ、ＴＤＸ）；ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの阻害剤、例えばエニルウラシル；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド、例えばマイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイドおよびタキサン、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏ＾ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金；白金類縁体または白金系類縁体、例えばシスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；上記何れかの製薬上許容しうる塩、酸または誘導体；並びに上記２つ以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ、即ちシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの複合療法の略語、およびＦＯＬＦＯＸ、即ち５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いた処置計画の略語を包含する。
【００７４】
この定義に同様に包含されるものは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール；および抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖への関与を示唆されているシグナリング経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；および上記何れかの製薬上許容しうる塩、酸または誘導体を包含する。
【００７５】
「代謝拮抗物質化学療法剤」は代謝産物に構造的には同様であるが生産的な様式では身体により使用され得ない薬剤である。多くの代謝拮抗物質化学療法剤は核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの産生を妨害する。代謝拮抗物質化学療法剤の例は、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡＴＭ）、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、６−チオグアニン、ペメトレクスド、ラルチトレクスド、アラビノシルシトシンＡＲＡ−Ｃシタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、アゾシトシン、デオキシシトシン、ピリミジン、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、クラドラビン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース等を包含する。好ましい代謝拮抗物質化学療法剤はゲムシタビンである。
【００７６】
「ゲムシタビン」即ち「２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（ｂ異性体）」は抗腫瘍活性を示すヌクレオシド類縁体である。ゲムシタビンＨＣｌに関する実験式はＣ９Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ４ Ａ ＨＣｌである。ゲムシタビンＨＣｌは商標ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）の下にＥｌｉ Ｌｉｌｌｙから販売されている。
【００７７】
「白金系化学療法剤」は分子の一体的部分として白金を含有する有機化合物を含む。白金系化学療法剤の例はカルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンを包含する。
【００７８】
「白金系化学療法」とは、場合により１つ以上の他の化学療法剤と組み合わせた１つ以上の白金系化学療法剤を用いた療法を意図する。
【００７９】
ＩＩ．発明を実施するための形態
本発明の実施は特段の記載が無い限り当業者の技量の範囲内の分子生物学（組み換え手法を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学および免疫学の従来の手法を使用することになる。そのような手法は文献、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）において詳細に説明されている。
【００８０】
１．アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体の調製
抗ＣＹＴＬ１抗体は組み換えＤＮＡ技術の手法を包含する当該分野で知られた方法により製造できる。
【００８１】
ｉ）抗原の調製
場合により他の分子にコンジュゲートされた可溶性抗原またはそのフラグメントは抗体を形成するための免疫原として使用できる。膜貫通分子、例えば受容体に関しては、これらのフラグメント（例えば受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として使用できる。或いは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用できる。そのような細胞は天然原料（例えば癌細胞系統）から誘導することができ、或いは膜貫通分子を発現するように組み換え手法により形質転換されている細胞であってよい。抗体を調製するために有用な他の抗原およびその形態は当業者の知る通りである。
【００８２】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は好ましくは該当する抗原およびアジュバントの多数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物中で育成される。２官能性または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、ただし式中ＲおよびＲ１は異なるアルキル基であるもの、を用いて、免疫すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に該当する抗原をコンジュゲートすることが有用である場合がある。
【００８３】
動物は１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれウサギまたはマウスに関する）を３容量のフロイント完全アジュバントと混合し、溶液を多数部位において皮内注射することにより抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対抗して免疫される。１ヵ月後、多数部位における皮下注射によりフロイントの完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５〜１／１０を用いて動物をブーストする。７〜１４日後、動物から出血させ、そして血清の抗体力価をアッセイする。動物は力価が平衡に達するまでブーストする。好ましくは、同じ抗原であるが、異なるタンパク質に、および／または異なる交差結合試薬を介してコンジュゲートされているコンジュゲートで動物をブーストする。コンジュゲートはまた、タンパク質融合物として組み換え細胞培養物中に作成できる。さらにまた、ミョウバンのような凝集剤を適宜使用して免疫応答を増強する。
【００８４】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作成してよく、或いは、組み換えＤＮＡ法（米国特許４，８１６，５６７）により作成してよい。ハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターまたはマカクサルを上記した通り免疫することにより、免疫のために使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生するか産生生産できるリンパ球を生じさせる。或いは、リンパ球はインビトロで免疫してよい。次にリンパ球を適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００８５】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、未融合の親骨髄腫細胞の成育または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する適当な培養培地中に播種して生育させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを包含することになり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成育を防止する。
【００８６】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支援し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。それらのうち、好ましい骨髄腫細胞系統はネズミ骨髄腫系統、例えばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、および、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導したものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００８７】
ハイブリドーマ細胞を成育させている培養培地は抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、またはインビトロの結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、測定される。
【００８８】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは限界希釈操作法によりサブクローニングし、そして標準的な方法により生育させてよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適当な培養培地は例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。さらにまたハイブリドーマ細胞は動物中の腹水腫瘍としてインビボで成育させてよい。
【００８９】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製操作法により培養培地、腹水、または血清から適当に分離される。
【００９０】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて容易に単離して配列決定される（例えばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として供される。単離された後、ＤＮＡは発現ベクター内に入れてよく、そしてこれを次に宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別様には免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を達成できる。抗体の組み換え産生は後述においてより詳細に説明する。
【００９１】
別の実施形態においては、抗体または抗体フラグメントはＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の手法を用いて作成された抗体ファージライブラリから単離できる。
【００９２】
Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）はファージライブラリを用いたそれぞれネズミおよびヒトの抗体の単離を記載している。その後の出版物は鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））並びに極めて大型のファージライブラリを構築するための方策としてのコンビナトリアルな感染およびインビボの組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を記載している。即ち、これらの手法はモノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法の実行可能な代替法である。
【００９３】
ＤＮＡはまた、相同ネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに関するコード配列を代替とすること（米国特許４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））によるか、または、非免疫グロブリンポリペプチドに関するコード配列の全てまたは部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、修飾してよい。
【００９４】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインの代替とされるか、またはそれらは、抗体の１つの抗原複合化部位の可変ドメインの代替とされ、これにより抗原に対する特異性を有する１つの抗原複合化部位および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原複合化部位を含むキメラ２価抗体を作製する。
【００９５】
（ｉｖ）ヒト化およびヒト抗体
ヒト化抗体は非ヒトである原料から自身内に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインから取り出される。ヒト化は本質的にはＷｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の相当する配列に対してげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することにより実施することができる。従って、そのような「ヒト化」抗体は実質的にはインタクトなヒト可変ドメインに満たない部分が非ヒト種由来の相当する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許４，８１６，５６７）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には一部のＣＤＲ残基および可能性として一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
【００９６】
ヒト化抗体を作成する場合に使用するべき軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性を低減するためには極めて重要である。所謂「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知ヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリに対してスクリーニングする。次にげっ歯類のものと最も近似しているヒト配列をヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に対して使用してよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【００９７】
さらにまた、抗原に対する高親和性および他の望ましい生物学的特性を保持して抗体をヒト化することが重要である。この目標を達成するためには、好ましい方法に従って、親およびヒト化配列の３次元モデルを用いて親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによりヒト化抗体を調製する。３次元免疫グロブリンモデルは公的に入手可能であり、そして当業者に良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定の３次元コンホメーション構造を図示して表示できるコンピュータプログラムが使用可能である。これらの表示物の検討により候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能となる。このような方法により、ＦＲ残基を選択し、そして、所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する増大した親和性を達成できるようにレシピエントおよびインポート配列と組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に対して影響を与えることにおいては、直接、そして最も大きく関与している。
【００９８】
或いは、内因性の免疫グロブリンの産生の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーの産生が免疫により可能となるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作成することが、現在可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系統の突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系統突然変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原攻撃時のヒト抗体の産生をもたらすことになる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３５５：２５８（１９９２）を参照。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリから誘導できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９（１９９６））。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の形成を以下にさらに説明する。
【００９９】
（ｖ）抗体フラグメント
種々の手法が抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的にはこれらのフラグメントはインタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されている（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながらこれらのフラグメントは現在では組み換え宿主細胞により直接産生できる。例えば抗体フラグメントは上記考察した抗体ファージライブラリから単離できる。或いはＦａｂ’−ＳＨフラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、そして化学的にカップリングさせることによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成できる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２））。後述する実施例において説明する通り別の実施形態においては、Ｆ（ａｂ’）２はＦ（ａｂ’）２分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別の手順によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。抗体フラグメントの産生のための他の手法は当業者に良く知られている。他の実施形態においては選択される抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５参照。
【０１００】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体はエピトープが通常は異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。そのような分子は通常は２つの異なるエピトープに結合するのみとなる（即ち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）が、三重特異性抗体のような追加的特異性を有する抗体も本明細書において使用する場合にこの表現に包含される。
【０１０１】
二重特異性抗体を作成するための方法は当該分野において知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうち僅か１つのみが正しい二重特異性の構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製はむしろ負担が大きく、そして生成物の収率は低値である。同様の操作法がＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。異なる手順によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原複合化部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は好ましくはヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行う。軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合物の少なくとも１つにおいて存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクター内に挿入し、そして適当な宿主生物内に同時トランスフェクトする。これにより、構築において使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす場合の実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する場合に、大きい柔軟性がもたらされる。しかしながら、等しい比率における少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、または比率が特に重要ではない場合に、１つの発現ベクター中に２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖に関するコード配列を挿入することが可能である。
【０１０２】
この手順の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１つのアームにおいて第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および別のアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を与える）を有している。この非対称の構造は、二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を可能とすることから、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性の化合物の分離を容易にする。この手順はＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の形成はさらに詳細には例えばＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照。
【０１０３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されている別の手順に従えば、抗体分子の対の間の界面は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大限とするように操作できる。好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法においては、第１の抗体分子の界面に由来する１つ以上の小型アミノ酸側鎖をより大型の側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置き換える。大型側鎖と同一または同様のサイズの代償分の「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより第２の抗体分子の界面上に形成される。これによりホモ二量体のような他の望ましくない最終生成物を超えてヘテロ二量体の収率を増大させるための機序が与えられる。
【０１０４】
二重特異性抗体は交差結合または「ヘテロコンジュゲート」抗体を包含する。例えばヘテロコンジュゲートにおける抗体の１つをアビジンに、もう１つをビオチンにカップリングできる。そのような抗体は例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングするため（米国特許４，６７６，９８０）およびＨＩＶ感染症の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は何れかの好都合な交差結合法を用いて作製してよい。適当な交差結合剤は当該分野で良く知られており、そして多くの交差結合手法と共に米国特許４，６７６，９８０に開示されている。
【０１０５】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を形成するための手法もまた、文献に記載されている。例えば二重特異性抗体は化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）はインタクトな抗体をタンパク質分解的に切断することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する操作法を記載している。これらのフラグメントをジチオール錯化剤（ｄｉｔｈｉｏｌ ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｇｅｎｔ）である亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元することにより近接したジチオールを安定化させ、そして分子内のジスルフィド形成を防止する。次に形成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次にＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方をメルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合することにより二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用できる。
【０１０６】
Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントはまたＥ．ｃｏｌｉから直接回収することができ、そして化学的にカップリングすることにより二重特異性抗体を形成できる。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから別個に分泌させ、そしてインビトロの指向的化学カップリングに付すことにより二重特異性抗体を形成している。
【０１０７】
組み換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作成して単離するための種々の手法もまた記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチド（ｐｅｐｂｄｅｓ）を遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結している。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元することにより単量体を形成し、そして次に再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成している。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）の記載している「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替的な機序を与えている。フラグメントは同じ鎖上の２ドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは別のフラグメントの相補なＶＬおよびＶＨドメインと強制的に対形成させられ、これにより２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを形成するための別の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照。
【０１０８】
２より多い結合価を有する抗体もまた意図される。例えば三重特異性抗体を調製できる。Ｔｕｆｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１）。
【０１０９】
（ｖｉｉ）エフェクター機能の操作
抗体の有効性を増強するように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてよい。このようにして形成されたホモ二量体抗体は向上した内在化能力および／または増大した補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する場合がある。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）において記載される通りヘテロ２官能性交差結合剤を用いて調製してよい。或いは、抗体は二重のＦｃ領域を有するように操作することができ、そしてこれにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有する場合がある。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）を参照。
【０１１０】
（ｖｉｉｉ）抗体サルベージ受容体結合エピトープ融合物
本発明の特定の実施形態においては、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクトな抗体よりもむしろ抗体フラグメントを使用することが望ましい場合がある。そのような場合、抗体フラグメントはその血清中半減期を増大させるために修飾することが望ましい場合がある。これは例えば抗体フラグメント内へのサルベージ受容体結合エピトープの取り込みにより達成してよい（例えば抗体フラグメント内の適切な領域の突然変異により、或いは、エピトープをペプチドタグ内に取り込ませ、次にこれを、例えばＤＮＡまたはペプチド合成により、抗体フラグメントに何れかの末端または中央部において融合する）。
【０１１１】
サルベージ受容体結合エピトープは好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来するアミノ酸残基の何れか１つ以上が抗体フラグメントの類似の位置に転移する領域を構築する。さらに好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループに由来する残基３つ以上が転移する。なおさらに好ましくは、エピトープはＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（例えばＩｇＧのもの）から取り出し、そして、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、またはＶＨ領域、または１つより多くのそのような領域に転移させる。或いは、エピトープをＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出し、そして抗体フラグメントのＣＬ領域またはＶＬ領域、または両方に転移させる。
【０１１２】
（ｉｘ）抗体の他の共有結合的修飾
抗体の共有結合的修飾は本発明の範囲内に包含される。それらは適宜、化学合成によるか、または酵素的または化学的な抗体切断により行ってよい。抗体の共有結合的修飾の他の型は、選択された側鎖またはＮまたはＣ末端残基と反応できる有機の誘導体化剤に抗体のターゲティングされたアミノ酸残基を反応させることにより分子内に導入される。共有結合的修飾の例は参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５３４，６１５に記載されている。抗体の共有結合的修飾の好ましい型は米国特許４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２または４，１７９，３３７に記載されている様式において、種々の非タンパク質性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つに抗体を連結させることを含む。
【０１１３】
（ｘ）合成抗体ファージライブラリからの抗体の形成
好ましい実施形態においては、本発明はユニークなファージディスプレイの手順を用いて新規な抗体を形成および選択するための方法を提供する。該手順においては、単一のフレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの形成、可変ドメイン内部の十分な多様性の設計、多様化された可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原をターゲティングするための高親和性を有する候補抗体の選択、および選択された抗体の単離を行う。
【０１１４】
ファージディスプレイの方法の詳細は例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００３年１２月１１日に公開されたＷＯ０３／１０２１５７に記載されている。
【０１１５】
１つの態様において、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲにおいて溶媒接触性および／または高多様性の位置を突然変異させることにより形成できる。ＣＤＲの一部または全てを本明細書に記載した方法を用いて突然変異させることができる。一部の実施形態においては、多様な抗体ライブラリは、単一のライブラリを形成するためにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３における位置を突然変異させることによるか、または単一のライブラリを形成するためにＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３における位置を突然変異させることによるか、または単一のライブラリを形成するためにＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３における位置を突然変異させることにより形成することが好ましい場合がある。
【０１１６】
抗体可変ドメインのライブラリは例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の溶媒接触性および／または高多様性の位置において突然変異を有するように形成できる。別のライブラリはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３において突然変異を有するように形成できる。これらのライブラリはまた、所望の親和性を有するバインダーを形成するために相互に組み合わせて使用できる。例えば標的抗原への結合のための重鎖ライブラリの選択を１回以上行った後、軽鎖ライブラリを重鎖バインダーの集団内に入れ換え、選択回数をさらに重ねることによりバインダーの親和性を増大させることができる。
【０１１７】
好ましくは、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域において変異体アミノ酸により元のアミノ酸を置換することによりライブラリを形成する。得られたライブラリは複数の抗体配列を含有することができ、そこにおいては配列の多様性は重鎖配列のＣＤＲＨ３領域に主に存在する。
【０１１８】
１つの態様において、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、またはヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列との関連で形成される。好ましくはライブラリはＤＶＫコドンセットによりコードされるアミノ酸による重鎖の少なくとも残基９５〜１００ａの置換により形成され、その場合、ＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各々に対して変異体アミノ酸のセットをコードするために使用される。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドのセットの例は配列（ＤＶＫ）７を含む。一部の実施形態においては、ライブラリはＤＶＫおよびＮＮＫコドンセットの両方でコードされたアミノ酸による残基９５〜１００ａの置換により形成する。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドのセットの例は配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）を含む。別の実施形態においては、ライブラリはＤＶＫおよびＮＮＫコドンセットの両方でコードされたアミノ酸による少なくとも残基９５〜１００ａの置換により形成する。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドのセットの例は配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）を含む。これらの置換を形成するために有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例は配列（ＮＮＫ）６を含む。適当なオリゴヌクレオチド配列の他の例は本明細書に記載する基準に従って当業者が決定できる。
【０１１９】
別の実施形態においては、異なるＣＤＲＨ３設計を利用することにより高親和性バインダーを単離し、そして種々のエピトープに対するバインダーを単離する。このライブラリにおいて形成されるＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１〜１３アミノ酸であるが、これとは異なる長さも形成することができる。Ｈ３の多様性はＮＮＫ、ＤＶＫおよびＮＶＫコドンセット、並びにＮおよび／またはＣ末端におけるより限定された多様性を使用することにより拡張できる。
【０１２０】
多様性はまた、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２において形成することもできる。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の多様性の設計は以前の設計よりも天然の多様性により緊密にマッチしている多様性に着目した変更を伴って記載した天然の抗体レパートリーを模倣するためのターゲティングの方策に従う。
【０１２１】
ＣＤＲＨ３における多様性に関しては、異なる長さのＨ３を有するように多数のライブラリを別個に構築し、そして次に、抗原をターゲティングするためのバインダーを求める選別のために組み合わせることができる。多数のライブラリをプールし、そして明細書中前述および後述する固体支持体選択および溶液分類方法を用いて分類することができる。マルチソーティングの方策を使用してよい。例えば１つの変法では固体に結合した標的に対する分類を行い、その後、融合ポリペプチド上に存在する場合があるタグ（例えば抗ｇＤタグ）に対する分類を行い、そしてその後、固体に結合した標的に対する別の分類を行う。或いは、ライブラリを固体表面に結合した標的に対して先ず分類することができ、次に溶出したバインダーを標的抗原の漸減濃度における溶液相結合を用いて分類する。異なる分類方法の組み合わせを利用することは高度に発現される配列のみの選択の最小限化を可能にし、そして、多くの異なる高親和性クローンの選択を可能にする。
【０１２２】
標的抗原に対する高親和性バインダーをライブラリから単離できる。Ｈ１／Ｈ２領域における限定された多様性は縮重性を約１０４〜１０５倍低下させ、そしてより高値のＨ３多様性を可能にすれば、より高親和性のバインダーが得られる。ＣＤＲＨ３における異なる型の多様性を有するライブラリを利用することにより（例えばＤＶＫまたはＮＶＴを利用することにより）、標的抗原の異なるエピトープに結合する場合があるバインダーの単離が可能となる。
【０１２３】
上記した通りプールされたライブラリから単離されたバインダーのうち、親和性は軽鎖において限定された多様性をもたらすことによりさらに向上する場合があることが発見された。本実施形態において軽鎖の多様性は以下の通り、即ちＣＤＲＬ１において：アミノ酸位置２８はＲＤＴによりコードされ；アミノ酸位置２９はＲＫＴによりコードされ；アミノ酸位置３０はＲＶＷによりコードされ；アミノ酸位置３１はＡＮＷによりコードされ；アミノ酸位置３２はＴＨＴによりコードされ；場合により、アミノ酸位置３３はＣＴＧによりコードされ；ＣＤＲＬ２において：アミノ酸位置５０はＫＢＧによりコードされ；アミノ酸位置５３はＡＶＣによりコードされ；そして場合により、アミノ酸位置５５はＧＭＡによりコードされ；ＣＤＲＬ３において：アミノ酸位置９１はＴＭＴまたはＳＲＴまたは両方によりコードされ；アミノ酸位置９２はＤＭＣによりコードされ；アミノ酸位置９３はＲＶＴによりコードされ；アミノ酸位置９４はＮＨＴによりコードされ；そしてアミノ酸位置９６はＴＷＴまたはＹＫＧまたは両方によりコードされるように、形成される。
【０１２４】
別の実施形態においては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３領域における多様性を有するライブラリを形成する。本実施形態においてＣＤＲＨ３における多様性は種々の長さのＨ３領域を用いて、そして主にコドンセットＸＹＺおよびＮＮＫまたはＮＮＳを用いて形成する。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを用いて形成してプールすることができ、或いはオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。本実施形態のライブラリは固体に結合した標的に対抗して分類できる。多数の分類から単離されたクローンはＥＬＩＳＡアッセイを用いて特異性および親和性に関してスクリーニングできる。特異性に関しては、クローンは所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対抗してスクリーニングできる。次に標的抗原に対するこのようなバインダーを溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合アッセイにおいて親和性に関してスクリーニングできる。高親和性のバインダーは上記した通り調製したＸＹＺコドンセットを利用してライブラリから単離できる。これらのバインダーは細胞培養物中において高収率で抗体または抗原結合フラグメントとして容易に製造できる。
【０１２５】
一部の実施形態においては、ＣＤＲＨ３領域における長さにおいてより大きい多様性を有するライブラリを形成することが望ましい場合がある。例えば約７〜１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を有するライブラリを形成することが望ましい場合がある。
【０１２６】
これらの実施形態のライブラリから単離された高親和性バインダーは高収率で細菌および真核生物細胞の培養物中において容易に製造される。ベクターはｇＤタグ、ウィルス被膜タンパク質成分配列のような配列を容易に除去するように、および／または、高収率で完全長抗体または抗原結合フラグメントの産生を可能にする定常領域配列において付加するために設計できる。
【０１２７】
ＣＤＲＨ３において突然変異を有するライブラリは他のＣＤＲ、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２の変異体型を含有するライブラリと組み合わせることができる。即ち、例えば、１つの実施形態において、ＣＤＲＨ３ライブラリを、所定のコドンセットを用いて２８、２９、３０、３１、および／または３２位において変異体アミノ酸を有するヒト化４Ｄ５抗体配列との関連で形成されたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせる。別の実施形態においては、ＣＤＲＨ３への突然変異を有するライブラリは、変異体ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。１つの実施形態において、ＣＤＲＨ１ライブラリは２８、３０、３１、３２および３３位において変異体アミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５配列を有するように形成される。ＣＤＲＨ２ライブラリは所定のコドンセットを用いて５０、５２、５３、５４、５６および５８位において変異体アミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５配列を有するように形成される。
【０１２８】
（ｘｉ）抗体突然変異体
抗体突然変異を形成するためには、１つ以上のアミノ酸改変（例えば置換）を親抗体の１つ以上の超可変領域に導入する。或いは、または追加的に、フレームワーク領域残基の１つ以上の改変（例えば置換）を親抗体に導入してよく、その場合、これらは第２の哺乳類種に由来する抗原に対する抗体突然変異体の結合親和性の向上をもたらす。修飾すべきフレームワーク領域の残基の例は、直接抗原に非共有結合的に結合し（Ａｍｉｔら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３）；ＣＤＲのコンホメーションに相互作用／影響し（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）；および／またはＶＬ−ＶＨ界面に関与する（ＥＰ２３９ ４００Ｂ１）ものを包含する。特定の実施形態においては、１つ以上のそのようなフレームワーク領域残基の修飾は第２の哺乳類種に由来する抗原に対する抗体の結合親和性の増強をもたらす。例えば、約１〜約５フレームワーク残基を本発明の本実施形態において改変してよい。場合により、これは、超可変領域の残基の何れも改変されていない場合であっても、前臨床治験における使用のために適する抗体突然変異体をもたらすためには十分である場合がある。しかしながら通常は、抗体突然変異体は追加的な超可変領域の改変を含むことになる。
【０１２９】
改変される超可変領域残基は、特に親抗体の元の結合親和性がランダムに産生された抗体突然変異体が容易にスクリーニングされ得るようなものである場合には、ランダムに変更してよい。
【０１３０】
そのような抗体突然変異体を形成するための１つの有用な操作法は「アラニンスキャニング突然変異誘発」と称されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。ここでは１つ以上の超可変領域残基をアラニンまたはポリアラニン残基により置き換えることにより第２の哺乳類種に由来する抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。次に置換に対して機能的感受性を示している超可変領域残基を、置換部位において、またはそれに対して追加の、または他の突然変異を導入することにより純化する。即ち、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異の性質自体は予め決定されている必要はない。この方法で産生したａｌａ突然変異体を本明細書に記載する通りそれらの生物学的活性に関してスクリーニングする。
【０１３１】
通常は「好ましい置換」の見出しの下に以下に示すもののような保存的置換により開始する。そのような置換が生物学的活性（例えば結合親和性）の変化をもたらす場合、次に、以下の表において「例示される置換」と命名されている、またはアミノ酸クラスを参照して後述においてさらに説明する通り、より実質的な変化を導入し、そして生成物をスクリーニングする。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
抗体の生物学的特性におけるより実質的な修飾は以下、即ち：（ａ）例えばシートまたはヘリックス型のコンホメーションとしての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対する自身の作用において有意に異なっている置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は共通の側鎖の特性、即ち：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および、
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
に基づいて群に分割される。
【０１３４】
非保存的置換はこれらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを包含することになる。
【０１３５】
別の実施形態においては、修飾のために選択される部位はファージディスプレイを用いてアフィニティー成熟化される（上記参照）。
【０１３６】
アミノ酸配列突然変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られる種々の方法により調製される。これらの方法は限定しないがオリゴヌクレオチド媒介（または部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびより早期に調製された突然変異体または親抗体の非突然変異体型のカセット突然変異誘発を包含する。突然変異体を作成するための好ましい方法は部位指向性突然変異誘発である（例えばＫｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８参照）。
【０１３７】
特定の実施形態においては、抗体突然変異体は単一の超可変領域残基が置換されているのみとなる。他の実施形態においては、親抗体の１つ以上の超可変領域残基が置換されることになり、例えば約２〜約１０超可変領域置換となる。
【０１３８】
通常は、向上した生物学的特性を有する抗体突然変異体は親抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。この配列に関する同一性または類似性は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列をアラインし、そして必要に応じてギャップを導入した後に、親抗体残基と同一（即ち同じ残基）または類似（即ち共通の側鎖特性に基づいた同じ群に由来するアミノ酸残基、上記参照）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして本明細書においては定義される。可変ドメインの外部の抗体配列内へのＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、欠失、または挿入の何れも、配列の同一性または類似性に影響するものとみなされない。
【０１３９】
抗体突然変異体の産生の後、親抗体と比較した場合のその分子の生物学的活性を測定する。上記した通り、ここでは抗体の結合親和性および／または他の生物学的活性の測定を行ってよい。本発明の好ましい実施形態においては、抗体突然変異体のパネルを調製し、そして抗原またはそのフラグメントに対する結合親和性に関してスクリーニングする。この初回スクリーニングから選択された１つ以上の抗体突然変異体を、場合により１つ以上の別の生物学的活性アッセイに付すことにより、増強された結合親和性を有する抗体突然変異体が実際に、例えば前臨床試験のために有用であることを確認する。
【０１４０】
このようにして選択された抗体突然変異体は、多くの場合抗体の意図する用途に応じてさらに修飾に付してよい。そのような修飾では、アミノ酸配列をさらに改変し、非相同ポリペプチドに融合し、および／または後述の通り操作する共有結合的修飾を行ってよい。アミノ酸配列改変に関しては、例示される修飾は上記の通り操作される。例えば抗体突然変異体の適切なコンホメーションの維持に関与する何れかのシステイン残基もまた、一般的にはセリンで置換することにより、分子の酸化安定性を向上させ、そして異常な交差結合を防止してよい。逆に、システインの結合を抗体に付加することによりその安定性を向上させてよい（特に抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。別の型のアミノ酸突然変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは、抗体中に観察される１つ以上の炭水化物部分を欠失させることにより、および／または、抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することにより、達成してよい。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ連結またはＯ連結の何れかである。Ｎ連結はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の連結を指す。Ｘがプロリン以外の何れかのアミノ酸であるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的連結のための認識配列である。即ち、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列の何れかの存在は、潜在的なグリコシル部位を生じさせる。Ｏ連結グリコシル化は糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンでもよいヒドロキシアミノ酸への連結を指す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列をそれが上記トリペプチド配列のうち１つ以上を含有するように改変することにより、好都合に達成される（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）。改変はまた、元の抗体の配列に対する１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換により行ってもよい（Ｏ連結グリコシル化部位の場合）。
【０１４１】
同じ型の操作法および改変を用いることによりネイティブ配列ＣＹＴＬ１ポリペプチドのアゴニストとして作用するＣＹＴＬ１変異体を作成できる。
【０１４２】
（ｘｉｉ）抗体および他のポリペプチドの組み換え産生
抗体の組み換え産生のためには、それをコードする核酸を単離し、そして後のクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター内に挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分は一般的に、限定しないが、以下のもの、即ちシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５３４，６１５記載）のうちの１つ以上を包含する。
【０１４３】
本発明におけるベクター中でのＤＮＡのクローニングまたは発現のための適当な宿主細胞は、上記した原核生物、酵母、または他の高等な真核生物の細胞である。この目的のための適当な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性の生物、例えば腸内細菌科、例えばエシェリシア、例えばＥ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・チフィムリウム、セラチア、例えばセラチア・マルセスカンス、およびシゲラ、並びにバチルス、例えばＢ．サブチルスおよびＢ．リチェニホルミス（例えば１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．リチェニホルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えばＰ．アエルギノーサ、およびストレプトマイセスを包含する。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）も適している。これらの例は限定的なものではなく、例示に過ぎない。
【０１４４】
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば糸状カビまたは酵母も抗体をコードするベクターのための適当なクローニングまたは発現の宿主である。サッカロマイセス・セレビシアエ、即ち一般的にはパン酵母が、下等な真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら多くの他の属、種、および系統が本発明において一般的に入手可能であり、そして有用であり、例えばスキゾサッカロマイセス・ポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ．ラクチス、Ｋ．フラジリス（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウイケラミ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス、およびＫ．マルキシアヌス；ヤロウイニア（ＥＰ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；および糸状カビ、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム、およびアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニヅランスおよびＡ．ナイジャーが挙げられる。
【０１４５】
グリコシル化抗体の発現のための適当な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例は植物および昆虫の細胞を包含する。多くのバキュロウィルス菌株および変異体およびスポドプテラ・フルギペルダ（イモムシ）、アエデス・アエギプチ（カ）、アエデス・アルボピクツス（カ）、ドロソフィリア・メラノガスター（ミバエ）、およびボンビックス・モリのような宿主に由来する相当する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス菌株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体およびボンビックス・モリＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に入手可能であり、そしてそのようなウィルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってここでウィルスとして使用してよい。綿、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた宿主として利用できる。
【０１４６】
しかしながら、脊椎動物細胞の場合が最も興味深く、そして培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の増殖が定型的な操作法となっている。有用な哺乳類宿主細胞系統の例は、ＳＶ４０で形質転換したサル腎ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎系統（懸濁培養物中での生育のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０１４７】
宿主細胞は抗体産生のための上記した発現またはクローニングベクターで形質転換され、そして、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切であるように修飾された従来の栄養培地中で培養される。
【０１４８】
本発明の抗体の産生のために使用される宿主細胞は種々の培地中で培養してよい。市販されている培地、例えばＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコの変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞を培養するために適している。さらにまた、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；または５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許３０，９８５に記載されている培地のいずれかを宿主細胞のための培養培地として使用してよい。これらの培地の何れにも、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ）、微量元素（マイクロモル範囲の再終濃度において通常は存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充してよい。何れかの他の必要な補充物もまた、当業者に知られる適切な濃度において包含させてよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されていたものであり、そして当業者の知る通りである。
【０１４９】
組み換え手法を使用する場合、抗体はペリプラズム空間内に細胞内で産生されるか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１工程として、宿主細胞または溶解細胞の何れかである粒状破砕物を例えば遠心分離または限外濾過により除去する。抗体を培地中に分泌させる場合、そのような発現系に由来する上澄みは一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを上記した工程の何れかに包含させることによりタンパク質分解を阻害してよく、そして抗生物質を包含させることにより有害な夾雑体の生育を防止してよい。
【０１５０】
細胞から調製した抗体組成物は例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適当性は抗体中に存在する何れかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存している。プロテインＡはヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいた抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスアイソタイプに対して、そしてヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．，５：１５６７−１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドを連結するマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも使用される。機械的に安定なマトリックス、例えば制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンはアガロースを用いて達成できるよりも高速な流量および短いプロセシング時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上のクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）の上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿もまた回収すべき抗体に応じて使用される。
【０１５１】
他の組み換えポリペプチド、例えばＣＹＴＬ１およびＣＹＴＬ１変異体は同様の操作法により製造できる。
【０１５２】
２．アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体または他のＣＹＴＬ１アゴニストを得るためのスクリーニング
ＣＹＴＬ１のアゴニスト抗体および他のアゴニストは伝統的（競合的）結合アッセイまたは活性アッセイにおいて同定できる。
【０１５３】
ＣＹＴＬ１アゴニストを得るためのスクリーニングアッセイはｕＰＡＲと結合または複合体形成するか、または別様にＣＹＴＬ１とｕＰＡＲとの相互作用を妨害し、そしてｕＰＡＲへのｕＰＡの結合を競合的に阻害できる化合物を同定するために設計してよい。本明細書に記載するスクリーニングアッセイは化学ライブラリの高スループットスクリーニングに適したアッセイを包含し、低分子薬剤候補を同定するために特に適するものとなっている。一般的に、結合アッセイおよび活性アッセイが与えられる。
【０１５４】
アッセイは種々のフォーマット、例えば限定しないが、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞系アッセイにおいて実施することができ、これらは当該分野で良く特徴付けられている。
【０１５５】
全てのアッセイは、それらが候補ＣＹＴＬ１アゴニストをｕＰＡ、ｕＰＡＲおよびＣＹＴＬ１に、これら２成分が相互作用を起こすために十分な条件下および時間に渡り接触させることを必要とする点において共通である。結合アッセイにおいては、相互作用は結合であり、そして形成された複合体を単離するか、または反応混合物中で検出することができる。特定の実施形態においては、ｕＰＡまたはｕＰＡＲポリペプチドまたは候補アゴニストの何れかを固相上、例えばマイクロプレート上に、共有結合または非共有結合的な連結により固定化する。アッセイはアンカリングされた成分を含有するコーティングされた表面のような固定化成分に、検出可能な標識で標識されていてよい非固定化成分を添加することにより実施する。反応が終了した時点で、非反応成分を例えば洗浄により除去し、そして固体表面上にアンカリングされた複合体を検出する。元来固定化されていない成分が検出可能な標識を担持している場合は、表面上に固定化された標識の検出は複合体化が起こったことを示している。元来固定化されていない成分が標識を担持していない場合は、複合体化は例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識された抗体を用いて検出できる。
【０１５６】
好ましくは、ＣＹＴＬ１拮抗剤を、それらがｕＰＡの生物学的活性を阻害する能力、例えば腫瘍の形成または転移を媒介するか、または血管形成、例えば限定しないが腫瘍の血管形成を誘導または支援するｕＰＡの能力に基づいて、同定するか、または追加的に試験する。
【０１５７】
当然ながら、本明細書において特に考察しているスクリーニングアッセイは例示に過ぎない。スクリーニングされる拮抗剤候補（例えばポリペプチド、ペプチド、非ペプチド有機低分子、核酸等）の型に応じて選択できる種々の他のアッセイは当業者に良く知られており、そして、本発明の目的のために等しく適当である。
【０１５８】
３．医薬組成物
ＣＹＴＬ１およびＣＹＴＬ１アゴニスト、例えばアゴニストＣＹＴＬ１抗体は、ｕＰＡの産生または機能に関連する種々の障害、例えば種々のタイプの腫瘍または癌、例えば腫瘍または癌の転移、および望ましくない血管形成、例えば限定しないが、腫瘍および癌の血管形成を特徴とする疾患および障害の処置のために、医薬組成物の形態において投与できる。
【０１５９】
抗体フラグメントを使用する場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害性のフラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは化学合成および／または組み換えＤＮＡ技術による産生が可能である。例えばＭａｒａｓｃｏらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照。
【０１６０】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション手法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に封入してよい。そのような手法は上記したＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
【０１６１】
インビボの投与のために使用されることになる製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
【０１６２】
除放性調製物を調製してよい。除放性調製物の適当な例は抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、このマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。除放性マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日間よりも長い期間に渡り分子を放出できるのに対し、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセル化された抗生物質が長時間身体内に残存する場合、それらは３７℃において水分に曝露される結果として変性または凝集を起こし、その結果生物学的活性の損失および免疫原性変化の可能性が生じる場合がある。関与する機序に応じて安定化のための合理的な方策を講じることができる。例えば凝集の機序がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されれば、安定化は、スルフィドリル残基を修飾すること、酸性の溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を調節すること、適切な添加剤を使用すること、および特定の重合体マトリックス組成物を開発することにより、達成してよい。
【０１６３】
本発明における製剤はまた、処置すべき特定の適応症のために必要に応じて１つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含有してよい。そのような分子は意図する目的のために有効な量において組み合わせて適宜存在させるか、或いは別個に製剤化し、そして同時に、または何れかの順序において連続して投与してよい。
【０１６４】
例えば、本発明のＣＹＴＬ１およびＣＹＴＬ１アゴニストは１つ以上の追加的治療薬、例えば抗血管形成剤、抗新生物性組成物、化学療法剤および／または細胞毒性剤と組み合わせて投与してよい。
【０１６５】
以下の実施例は説明目的のみのために提示しており、そして如何様にも本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１６６】
本明細書において引用する全ての特許および参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１６７】
材料および方法
材料−組み換えヒトｕＰＡＲ、ｕＰＡおよびｕＰＡ−ＡＴＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）より入手した。Ｐｒｏ−ｕＰＡはＣｏｒｔｅｘ Ｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＬｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より入手した。ブタ粘膜由来の低分子量ヘパリンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【０１６８】
インサイチュハイブリダイゼーション−薄膜切片のインサイチュハイブリダイゼーションのために、ＰＣＲプライマーを設計し、ＮＭ＿００１０８１１０６［５’−ＣＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＡＡ−３’（配列番号４）］のｎｔ．１１１−５６０から伸長するマウスＣＹＴＬ１の４４９ｂｐのフラグメント、またはＮＭ＿０１８６５９［５’−ＴＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣ−３’（配列番号５）および５’−ＣＣＴＧＴＧＡＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣ−３’（配列番号６）］のｎｔ．９４−５２５から伸長するヒトＣＹＴＬ１の４３１ｂｐのフラグメントを増幅した。プライマーは２７ヌクレオチドのＴ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードする伸長部を包含することにより、増幅産物からのそれぞれセンスまたはアンチセンスプローブのインビトロの転写を可能とした。
【０１６９】
ホルマリン固定パラフィン包埋５μｍ切片を脱パラフィン処理し、３７℃で３０分間４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で脱タンパク質処理し、そして以前に報告されている通りインサイチュハイブリダイゼーション用にさらに処理した（Ｊｕｂｂら（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２６，２５５−２６４）。３３Ｐ−ＵＴＰ標識のセンスおよびアンチセンスのプローブを一夜５５℃において切片にハイブリダイズさせた。未ハイブリダイズのプローブはＲＮａｓｅ処理およびストリンジェントな洗浄により除去した。スライドガラスを段階濃度エタノールで脱水し、ＮＴＢ核トラックエマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）中に浸積し、４℃で４週間露光し、次に現像し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで逆染色した。
【０１７０】
ＡＴＤＣ５細胞成熟アッセイ−ＡＴＤＣ５細胞はＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌｂａｎｋ，Ｊａｐａｎより入手し、そして、５％ウシ胎児血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＨａｍのＦ１２培地の５０：５０混合物中に維持した。細胞を１２穴プレートの各ウェル当たり１０５個の細胞となるように播種し、コンフルエントとなるまで生育させ、次に１０μｇ／ｍｌ組み換えウシインスリンおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸で処理することにより軟骨細胞分化を誘導した。成熟化中、種々の時点において、ＲＮＡを３連のウェルから採取した。第１１日に、一部の細胞を０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで処理し、そしてさらに２４時間の後ＲＮＡを採取した。
【０１７１】
コラーゲン誘導関節炎−７〜８週齢の雄性ＤＢＡ／１ＪマウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅガイドラインに従って維持した。全ての実験操作法はＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されている。コラーゲン誘導関節炎は第０日および第２１日に完全フロイントアジュバント中のウシＩＩ型コラーゲンの注射により標準的プロトコル（Ｂａｒｃｋら（２００４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ５０（１０），３３７７−３３８６）に従って誘導した。全ＲＮＡは臨床疾患のある手掌から、そして健常ＤＢＡ／１Ｊ対照マウスの手掌から抽出した。
【０１７２】
ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓデータ−市販のデータベースＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてコラーゲン誘導関節炎の間の遺伝子発現のクエリを行った。試料は製造元（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコルに従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ ＧｅｎｅＣｈｉｐ上で分析した。
【０１７３】
ＣＹＴＬ１の発現および精製−ミツバチメリチンシグナルペプチドと共にＦａｓｔＢａｃバキュロウィルス系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて昆虫細胞中にＮ末端ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＹＴＬ１を発現させた。タンパク質はＮｉ＋＋−セファロース６ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で精製した。タグは組み換えエンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で切断し、そしてタグおよび酵素をＮｉ＋＋−セファロースおよびＥＫａｐｔｕｒｅアガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて枯渇させた。ＣＹＴＬ１はさらに塩勾配溶離によりヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｈｉｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）から精製し、次にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて３ｋＤａのＭＷカットオフで濃縮した。濾過のフロースルーは表面プラズモン共鳴および細胞系アッセイにおける緩衝液対照として使用するために温存しておいた。
【０１７４】
発現クローニング−ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ系ベクター中に約１４，０００の完全長ヒトｃＤＮＡを含有する発現ライブラリをＯｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓｌ）；ＴＡＣＩ−ＡＰおよびヒトおよびネズミＣＹＴＬ１−ＡＰをｐＲＫ５系ベクターを用いて一過性トランスフェクションにより２９３細胞中で発現させた。細胞馴化培地を酵素活性に関してアッセイし、そして必要に応じて希釈することにより活性を等しくした。２４穴プレート中のＣＯＳ細胞をＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて発現コンストラクトのプール物でトランスフェクトした。４８時間後、接着細胞を洗浄し、次に０．１％ＢＳＡを添加したＣＹＴＬ１−ＡＰまたはＴＡＣＩ−ＡＰを含有する細胞馴化培地を用いて室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、結合した融合タンパク質を１０％中性緩衝ホルマリンと共にインキュベートすることにより表面に交差結合させた。９０分間６５℃でプレートをインキュベートすることにより内因性のアルカリホスファターゼを不活性化し、次にウエスタンブルー安定化基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてアルカリホスファターゼの活性を検出した。
【０１７５】
ｕＰＡの不活性化−室温で２時間１０ｍＭジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）で処理することによりｕＰＡのプロテアーゼ活性を非可逆的に阻害した。過剰なＤＦＰは十分な透析により除去した。完全な不活性化はｕＰＡ基質Ｓ−２４４４（ｄｉａＰｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＯＨ）を用いることにより確認した。
【０１７６】
細胞表面結合アッセイ−図の説明に示す通りＣＯＳまたはＣＨＯ細胞を完全長のヒトまたはマウスｕＰＡＲをコードする発現ベクターでトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクション体を２４穴プレートに移した。さらに２４時間の後、細胞を洗浄し、次に「発現クローニング」の下に詳述したとおりＣＹＴＬ１−ＡＰを含有する細胞馴化培地を用いてプローブした。結合アルカリホスファターゼ活性の定量のために、ＢｌｕｅＰｈｏｓ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を検出試薬として使用した。競合アッセイのためには記載濃度のプロ−ｕＰＡ、ｕＰＡ−ＡＴＦ、ＤＦＰ−ｕＰＡまたは精製されたＣＹＴＬ１を、ｕＰＡＲトランスフェクト細胞とのインキュベーションの直前にＣＹＴＬ１−ＡＰ細胞馴化培地に添加した。
【０１７７】
ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）−全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて抽出し、光学密度により定量し、そしてＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写した。形成したｃＤＮＡを７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプローブを用いて２連でアッセイした。増幅されたシグナルを記載の通りβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨのものに対して標準化した。プライマーおよびプローブは表１に列挙する通りである。
【０１７８】
表面プラズモン共鳴−表面プラズモン共鳴実験は１０μｌ／分の流量においてＨＢＳ−Ｐ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤）を用いてＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により実施した。組み換えヒトｕＰＡＲを標準的なアミンカップリング化学を用いてＣＭ５センサーチップ上に固定化した。慨すれば、新しく混合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩の８分間注入により表面を活性化し、ｕＰＡＲを１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中２０μｇ／ｍｌで注入し、そして未反応のエステルを１Ｍエタノールアミンでクエンチした。空のフローセルおよびカップリングしたＢＳＡを有するフローセルを対照として使用した。平衡結合分析のために種々の濃度の精製ＣＹＴＬ１および等価な希釈度の緩衝液を全フローセルに渡って注入した。緩衝液単独への応答をＣＹＴＬ１応答から差し引き、そして平衡時のピーク応答を記録した。希釈および計測は３回実施した。ＢＩＡＥｖａｌソフトウエア（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いてラングミュアの方程式を使用して平衡結合データをフィットさせた。ＣＹＴＬ１とプロ−ｕＰＡとの間の競合を示すために、飽和濃度のプロ−ｕＰＡの注入の前、および直後に、ｕＰＡＲカップリングフローセルにＣＹＴＬ１を注入した。
【０１７９】
二次構造予測−ＣＹＴＬ１種相同体はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＴ検索によりＥＳＴおよびゲノム配列から同定し、そしてＣｌｕｓｔａｌＸを用いてアラインした。ＪＰｒｅｄウエブサイトを介したＪｎｅｔニューラルネットワーク系アルゴリズム（３３）への入力として多数種アライメントを使用することにより、二次構造予測を生じさせた。ソース配列：ヒトＮＭ０１８６５９，ＡＹ３５９１０１；チンパンジー（パン・トログロダイト）ゲノム予測：ＧｅｎＳｃａｎのｃｈｒ４＿２．３；マカクサル（リーサス・マカク、マカラ・マラッタ）ゲノム予測：Ｇｅｎｓｃａｎのｃｈｒ５．４．０００．ａ；ウシ（ボス・タウルス）ＢＥ６８３３２９、ＢＥ６８３３２８、ＢＥ６８３３２７；マウスＮＭ＿００１０８１１０６；ラットＣＫ４７６５２９、ＣＫ３６３５９１、ＣＫ３５９５３６；ポッサム（モノデルフィス・ドメスチカ）ゲノム予測：ＧｅｎＳｃａｎのｃ＿６１９．３４；ニワトリ（ガルス・ガルス）ＢＸ９３１２９７、アフリカツメガエル（ラビス）ＥＢ４７４５４３、ＥＢ４７４０６８、ＥＣ２７７０３１；Ｐ．オリブ（バスタード・ハリブー、パラリクチス・オリバセウス）ＣＸ２８５７７７、ＣＸ２８５６８７；ハリブー（ヒポグロスス・ヒポグロスス）ＥＢ０３６６３５；フグ（ラブライプス）ＢＬＡＴにより同定されたゲノム配列−ｃｈｒＵｎ：１８９、１５９、９７５〜１８９、１６０、９５７；メダカ（オリジアス・ラチプス）ＡＵ２４１６９６、ＡＵ２４１４５９、ＡＵ１７７７６８；サケ（サルモ・サラー）ＥＧ８４７１９４、ＥＧ８３３０３７、ＥＧ８０２５５５；マス（オンコラインクス・ミキス）ＢＸ８８９７７７、ＢＸ８６６０１０；キュウリウオ−オスメルス・モルダックスＥＬ５５１７５；ミノウ（ピメファレス・プロメラス）ＤＴ３０９３８２、ＤＴ３４７７０９、ＤＴ１０６９６２；ゼブラフィッシュ（ゼブラフィッシュ、ダニオ・レリオ）ＥＥ２１４３５９、ＥＥ２１３１９８、ＥＢ９５７４９５；ゼブラフィッシュ２（ダニオレリオ−第２のＣＹＴＬ１相同体）ＡＬ９１３０３３、ＥＨ４６６９４６、ＥＨ４４１０４２、ＡＬ９１３０３４。
【０１８０】
結果
ＣＹＴＬ１のインビボの発現−ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションによれば軟骨原基に相当する段階において肋骨、脊椎および長骨を包含するマウス胚中の発生中の骨格エレメントの種々のものにおけるＣＹＴＬ１の発現が明らかになっている（図１）。薄膜切片のインサイチュハイブリダイゼーションによれば、主に軟骨におけるＣＹＴＬ１の発現が明らかにされており、関節軟骨の表面層において特に高値の発現がある。ＣＹＴＬ１発現はまた、気管の軟骨輪においても観察されている。高レベルの発現は腱と骨との間の接触部位の周囲における腱鞘において観察されている。ＣＹＴＬ１発現は発生中の長骨の肥大性の軟骨細胞中、そしてさらに、動脈（静脈では観察されない）内皮細胞中にも観察され、第１７日胚において大動脈中に先ず検出され、そして成体マウスにおいては筋肉動脈全体に渡って拡張している。
【０１８１】
軟骨細胞成熟化の間のＣＹＴＬ１の発現の過程をクローンマウス前軟骨細胞系統ＡＴＤＣ５を用いて検討した（図２）。ＡＴＤＣ５細胞はインスリンに応答して分化し、遺伝子発現における十分特性化された変化を有している。ＣＹＴＬ１は未分化細胞において検出可能ではなかったが、分化の開始後は、ＣＹＴＬ１発現は第４日までには検出され、早期軟骨細胞マーカーコラーゲンＩＩの発現を伴っていた。ＣＹＴＬ１発現は第１２日まで増大し続け、成熟軟骨細胞のマーカーであるアグレカンの増大した発現を伴っていた。
【０１８２】
発現のモジュレーション−多くのサイトカインが炎症において重要な調節の役割を果たしている（Ｈｅｉｎｒｉｃｈら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７４（Ｐｔ１），１−２０）ため、本発明者らは実験的関節炎疾患のマウスモデルの経過の間のＣＹＴＬ１発現を調べた。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルから得られたマイクロアレイデータは、マウス関節中のＣＹＴＬ１の発現は疾患においてダウンレギュレートされ、臨床評点および炎症サイトカイン、特にＩＬ−１βの産生のピークと一致していることを示している（図３ａ）。別の実験においてマウスの手掌から抽出されたＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によればＣＩＡにおけるＣＹＴＬ１発現のダウンレギュレーションが確認された（図３ｂ）。ＩＬ−１βはＣＩＡの進行において重要な役割を果たし（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｏ．（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９８，２０７−２１６）、軟骨破壊に必須のメディエーターであり（Ｚｗｅｒｉｎａら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４（２８），１１７４２−１１７４７）、そして軟骨細胞に対して直接作用することにより数種の軟骨細胞成熟化関連の遺伝子のダウンレギュレーションを誘導する（ＬｅＦｅｂｖｒｅら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ １０５２（３），３６６−３７８）。ＣＩＡにおけるＣＹＴＬ１のダウンレギュレーションがＩＬ−１βの直接の作用により説明できるかどうかを試験するために、本発明者らは分化したＡＴＤＣ５軟骨細胞をＩＬ−１βに曝露し、そしてｑＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現をアッセイした。本発明者らは０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βに応答したＣＹＴＬ１発現の１０分の１への低減を観察した（図３ｃ）。逆に、ｕＰＡＲ発現はＩＬ−１β処置によりアップレギュレートされた。
【０１８３】
受容体の同定−ＣＹＴＬ１はより早期には数種の両親媒性のα−ヘリックスの二次構造の予測に基づいて４ヘリックスサイトカインとして説明されていた（Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５（３），２８３−２９２）。より詳細な折畳みの分析のために、本発明者らはまず、ＧｅｎＢＡＮＫの網羅的ＰｓｉＢＬＡＳＴクエリにより全ての既知のＣＹＴＬ１オーソログの進化的に多様な収集物を作成し（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７），３３８９−３４０２）、配列をＣｌｕｓｔａｌＸとアラインし（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（２４），４８７６−４８８２）、そして次にＰｓｉＰＲＥＤとＪＮｅｔアルゴリズムの両方を使用することにより（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９２（２），１９５−２０２；Ｃｕｆｆ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４０（３），５０２−５１１）、正確な二次構造の予測を発生させた（補足図１）。短鎖サイトカインのヘリックスＡ〜Ｃに合致する長さと間隔を有する３つのα−ヘリックス（Ｒｏｚｗａｒｓｋｉら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（３），１５９−１７３）が高い信頼性で予測され、それと共に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−１３のような短鎖サイトカインにおいて観察されるようなα−ヘリックスおよび２つの短いβ−鎖の追加的な単一ターンが伴っている。ＣＹＴＬ１と４ヘリックスサイトカインファミリーとの間の関連性はそのゲノム機構の分析により強化される。４ヘリックスサイトカインは構造的特徴と比較してエキソン境界のステレオタイプの位置付けを示しており、全接合部が第０相にあり、これはＣＹＴＬ１により共有されている特性である。しかしながら、その予測された二次構造においては、ＣＹＴＬ１は、第４番目、即ちＤヘリックスが非存在であるか、極度にトランケーションされているそのＣ末端領域におけるヘリックスサイトカインパターンから劇的に逸脱している。このヘリックスはヘリックスサイトカインのそれらの高親和性受容体への結合のために必須であるため（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ ２６７（５１９６），３８３−３８６；Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｊ．，およびＧａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６８，１０７−１４６）、これは、ＣＹＴＬ１が恐らくは無関連の受容体ファミリーにとって欠如している受容体結合の相違した様式を採用している可能性を示唆していた。
【０１８４】
本発明者らは、発現クローニングの手順を用いてＣＹＴＬ１の受容体に関する偏りのない検索を実施した。ＣＹＴＬ１−アルカリホスファターゼ融合タンパク質（ＣＹＴＬ１−ＡＰ）を用いて、完全長のヒトクローンのライブラリに由来するプールされた発現コンストラクトでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞をプローブした。本発明者らはＣＹＴＬ１−ＡＰに結合する能力を細胞に付与する単一のプールを同定し、次にこのプールを構成している個々のクローンをスクリーニングすることにより原因となる単一のクローンを同定した（図４ａ）。このクローンの配列決定によりそれがｕＰＡＲをコードしていることが判明した。ｕＰＡＲの発現は、酵素活性により計測した場合、ＣＹＴＬ１−ＡＰと等しい濃度で使用した対照アルカリホスファターゼ融合タンパク質ＴＡＣＩ−ＡＰ（膜貫通活性化因子カルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド相互作用物質）に対して結合をもたらさなかった。同様の結果がＣＨＯ細胞に対して観察された。ｕＰＡＲに構造的に関連しているＣ４．４Ａの発現はＣＹＴＬ１−ＡＰに結合する能力をもたらさなかった（データ示さず）。ネズミｕＰＡＲでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はマウスＣＹＴＬ１−ＡＰ融合タンパク質に結合することができ（図４ｂ）、ＣＹＴＬ１とｕＰＡＲとの間の相互作用の進化論的保存を示していた。種間交差性の結合は殆ど、或いは全く観察されなかった。
【０１８５】
過剰量の精製されたＣＹＴＬ１は濃度依存的な態様においてｕＰＡＲトランスフェクト細胞へのＣＹＴＬ１−ＡＰの結合を阻害することができた（図４ｃ）。相同競合を推定すれば、３つの独立した実験で得られた細胞表面におけるｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の親和性は約１．５μＭ±０．５μＭ（ＳＥＭ）である。
【０１８６】
ｕＰＡＲは多くの細胞表面および細胞外のタンパク質、例えばｕＰＡ、αｖおよびβ１インテグリン、ビトロネクチン、ｕＰＡＲ−関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ／エンド１８０）およびＩＧＦ−ＩＩＲ（Ｐｌｏｕｇ，Ｍ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ９（１９），１４９９−１５２８）と相互作用することがわかっている。ＣＹＴＬ１がｕＰＡＲと直接、そしてアクセサリータンパク質を必要とすることなく相互作用するかどうかを調べるために、本発明者らはＢＩＡｃｏｒｅ３０００を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実施した。精製されたＣＹＴＬ１は固定化されたｕＰＡＲに特異的に結合した（図５）。同様の結合は哺乳類細胞および細菌において発現されたＣＹＴＬ１でも観察された（データ示さず）。相互作用の速度論的動態は極めて急速であり、そして正確に定量することはできなかった。平衡結合の計測値は固定化ｕＰＡＲ上、および、対照フローセル上に種々の濃度のＣＹＴＬ１を注入することにより得た（図５ｃ）。単一部位結合に関するラングミュアの方程式はデータに良好にフィットし、１．１μＭ±０．０６μＭのＣＹＴＬ１とｕＰＡＲとの相互作用に関する親和性定数の計測値が得られた。固定化されたｕＰＡＲの密度を５倍範囲に渡って変動させても親和性の相違は観察されなかった。
【０１８７】
グリコサミノグリカンは数種のサイトカインのそれらの受容体への結合に大きく影響することが知られている。本発明者らによるＣＹＴＬ１タンパク質の精製はＣＹＴＬ１とヘパリンとの間の相互作用を利用しており、そのため本発明者らはこの相互作用をさらに特性化することを試みた。ＣＹＴＬ１およびヘパリンを単独および組み合わせて、固定化されたｕＰＡＲ上に注入した（図５ｄ）。ヘパリンおよびＣＹＴＬ１単独では各々、一過性の結合を示し（８８ＲＵおよび１１２ＲＵ）；ＣＹＴＬ１とヘパリンを共に注入した場合、超相加的作用（３５３ＲＵ）が観察され、ヘパリンがＣＹＴＬ１のｕＰＡＲへの結合を増強していることが示された。
【０１８８】
競合的結合−ｕＰＡＲはｕＰＡに対する細胞表面受容体である。ｕＰＡＲへの結合に関してＣＹＴＬ１がｕＰＡと競合するかどうか明らかにするため、ｕＰＡＲでトランスフェクトした細胞を種々の濃度のタンパク質分解的に不活性なプロ酵素（プロ−ｕＰＡ）、受容体結合アミノ末端フラグメント（ｕＰＡ−ＡＴＦ）またはジイソプロピルフルオロホスフェートで処理することにより不活性化された完全長ｕＰＡ（ＤＦＰ−ｕＰＡ）の存在下でＣＹＴＬ１ＡＰと共にインキュベートした。ｕＰＡの３形態全てがｕＰＡＲ発現細胞の表面への結合に関してＣＹＴＬ１−ＡＰと競合し（図６ａ〜ｃ）、結合の５０％阻害は競合物質１０ｎＭ〜４０ｎＭで達成された。この競合が追加のタンパク質の非存在下、および嵩高のアルカリホスファターゼタグの非存在下で起こるかどうかを試験するために、ＳＰＲ分析を再度使用した（図６ｄ）。ＣＹＴＬ１を固定化ｕＰＡＲ上に注入し、２８２応答単位（ＲＵ）の結合を生じさせるようにした。次にプロ−ｕＰＡを高濃度で注入することにより５０％超の受容体占有状態を達成した。ＣＹＴＬ１の２回目の注入は大きく減衰した結合（９５Ｒ）をもたらし、プロ−ｕＰＡによる受容体占有がＣＹＴＬ１への結合のために使用できる受容体の量を低減したことを示していた。低ｐＨによるｕＰＡＲからのプロ−ｕＰＡの解離の後、ＣＹＴＬ１に結合する能力は回復した。
【０１８９】
考察
ＣＹＴＬ１は軟骨細胞および動脈内皮細胞により主に組織限定的様式において産生される分泌タンパク質である。その予測二次構造およびゲノム機構において、ＣＹＴＬ１は４α−ヘリックス造血性サイトカインに部分的類似性を保有している。僅かな例外を除き、このタンパク質ファミリーの全メンバーは、フィブロネクチン３型（Ｆｎ３）様のサイトカイン結合モジュールの保存された対により区別できる細胞表面受容体の進化論的に保存されたファミリーに結合する（Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（１８），６９３４−６９３８）。これらの受容体はそれらの細胞内伸長部を介してＪＡＫファミリーのタンパク質チロシンキナーゼおよびＳＴＡＴ転写因子と会合し、これを介して、細胞外リガンド結合により駆動される受容体オリゴマー化の後にシグナルがトリガーされる。この原理の３つの例外であるＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦおよびＦｌｔ３Ｌは、第２のクラスのＰＤＧＦＲ様受容体について「欠損」しており、これは自身のリガンドを免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインに結合させ、そして細胞質チロシンキナーゼドメインを介してシグナルを発生するものである。ＣＹＴＬ１に関する受容体のスクリーニングにおいては従来サイトカイン受容体は同定されていない。同定された受容体であるｕＰＡＲは上記ファミリーの何れにも構造的に無関連であり、そしてむしろ、ＧＰＩアンカーにより原形質膜に結合されているヘビ神経毒中に構造的に初めて同定されたドメインである３つのＬｙ６−ｕＰＡＲ（ＬＵ）様モジュール（Ｐｌｏｕｇ，Ｍ．，ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，Ｖ．（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３４９（２），１６３−１６８；Ｂａｒｉｎｋａら（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６３（２），４８２−４９５；Ｌｌｉｎａｓら（２００５）Ｅｍｂｏ Ｊ ２４（９），１６５５−１６６３）で大部分が構成されている。４ヘリックスサイトカインとＬＵモジュラータンパク質との間では、これらのドメインの折畳み関連物はＴＧＦ−βに対するシグナリング受容体のサイトカイン結合セグメント、アクチビンおよび骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）を含む（Ｇｙｅｔｋｏら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３（４），１３８０−１３８７）にも関わらず、相互作用は報告されていない。ＣＹＴＬ１が実際に４ヘリックスサイトカインであれば、これはＬＵ折畳み型に関する相互作用の全く新規なクラスとなる。
【０１９０】
サイトカインは典型的には一連の受容体に逐次的に結合して細胞内ホスホリル化のカスケードをトリガーする高親和性のシグナリング複合体を形成することによりそれらの機能を呈する。しかしなお、ｕＰＡＲがＣＹＴＬ１に対する真のシグナリング受容体であるかどうか、または、それがＣＹＴＬ１結合タンパク質としてより正確に説明されるかどうかは不明である。細胞内および膜貫通ドメインを欠いているため、ｕＰＡＲの単独の作用はシグナリング受容体としては機能できない。しかしながら、多くのシグナリング経路がｕＰＡＲのライゲーションの後に活性化されることがわかっており、タンパク質キナーゼＳｒｃ、ＪＡＫ−１、Ｈｃｋ、ＦＡＫおよびＥＲＫ１／２の活性化が報告されている（Ｗｅｂｂら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５２（４），７４１−７５２；Ｔａｎｇら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３（２９），１８２６８−１８２７２；Ｒｅｓｎａｔｉら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１５（７），１５７２−１５８２；Ｄｕｍｌｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（１），３１５−３２１）。シグナルトランスダクションの機序は、インテグリンに関する役割が強く示唆されているものの、なお不明である。ｕＰＡＲとインテグリンα３β１との間の直接でｕＰＡ依存性の相互作用（Ｗｅｉら（２００１）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １２（１０），２９７５−２９８６）が間接的相互作用を有するものとして示されており、その場合、ビトロネクチンはｕＰＡ依存的な様式でｕＰＡＲに結合し、そして次にインテグリンをライゲーションする（Ｍａｄｓｅｎら（２００７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７７（５），９２７−９３９）。ｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の結合は、ＣＹＴＬ１が他の膜貫通鎖にｕＰＡＲを架橋できれば、或いは、それがインテグリンまたは他のシグナリング分子とのｕＰＡＲの相互作用を局所的に調節すれば、同様の様式で細胞内シグナルトランスダクションをもたらす可能性がある。
【０１９１】
本発明者らは、ＣＹＴＬ１がプロ−ｕＰＡ、ｕＰＡ−ＡＴＦおよびＤＦＰ−不活性化ｕＰＡと競合しながらｕＰＡＲに結合することを明らかにしている。従ってＣＹＴＬ１はｕＰＡＲとのｕＰＡの相互作用の拮抗剤として機能できる。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用はプロ−ｕＰＡを切断して成熟ｕＰＡを形成するヘプシンおよびマトリプターゼのような細胞表面活性化因子にプロ−ｕＰＡを接触させる作用を有する。ｕＰＡＲへの結合はまた、成熟ｕＰＡの活性を増強する。ｕＰＡＲの結合に関して競合することにより、ＣＹＴＬ１は細胞関連ｕＰＡ活性を低減すると考えられる。ｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用の競合的阻害剤の生物学的効果は多くの系において検討されている。ｕＰＡのタンパク質分解的に不活性化された突然変異体の型によりトランスフェクトされた腫瘍細胞は低減した転移能力を示し（Ｃｒｏｗｌｙら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１１），５０２１−５０２５）、ｕＰＡ−ＡＴＦは微小血管内皮細胞による管形成（Ｃｒｏｏｎら（１９９９）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５４（６），１７３１−１７４２）および網膜損傷後の血管形成（Ｌｅ Ｇａｔら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（２５），２０９８−２１０３）を阻害する。ｕＰＡと競合しながらｕＰＡＲに結合することにより、軟骨誘導ＣＹＴＬ１は同様の効果を媒介する場合があり、ｕＰＡＲ発現細胞が侵襲する能力を低減し、そして軟骨の一体性を維持することを支援する。
【０１９２】
健常な関節においてはｕＰＡＲの発現は殆どないが；関節炎の間は、浸潤白血球がｕＰＡおよびｕＰＡＲの両方を発現し、そして軟骨細胞および滑膜細胞の両方が炎症性サイトカインに応答してｕＰＡＲを発現し（Ｂｕｓｓｏら（１９９７）Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５６（９），５５０−５５７；Ｇｕｉｄｕｃｃｉら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２３（３），３６４−３７２；Ｓｃｈｗａｂら（２００１）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１５（４），３１７−３２３）、そして軟骨の破壊的な血管新生がｕＰＡＲ発現内皮細胞が侵襲するに従い発生する。ｕＰＡＲ拮抗剤の潜在的な効果はコラーゲン誘導関節炎を有するマウスへのｕＰＡ−ＡＴＦの全身送達により明らかにされており、これは疾患の発生率および重症度、および軟骨血管新生の程度を低減している（Ａｐｐａｒａｉｌｌｙら（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（３），１９２−２００）。炎症の非存在下においては、ＣＹＴＬ１は関節軟骨において強力に発現されるが、その発現は炎症シグナルに応答して劇的に低減される。ｕＰＡ拮抗剤活性のこの消失は細胞侵襲および細胞外マトリックスのリモデリングを促進する場合がある。現在実施中のＣＹＴＬ１遺伝子欠損トランスジェニックマウスの表現型分析がインビボの役割の明確化に役立つはずである。
【０１９３】
骨ホメオスタシスにおけるｕＰＡＲの役割は、ｕＰＡＲ欠損マウスの研究を介して最近明らかにされた（Ｆｕｒｌａｎら（２００７）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２２（９），１３８７−１３９６）。ｕＰＡＲ発現の非存在下において、骨鉱物質密度は上昇し、そして骨容量は低減している。増強された骨芽細胞活性および骨表面への破骨細胞接着の不全がこの表現型を説明していると考えられる。これは軟骨におけるＣＹＴＬ１の発現が隣接する骨におけるマトリックスリモデリングに影響する機序となっている。
【０１９４】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析により定量した場合のｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の結合は中間的な親和性、即ち約１μＭを有する。これはサイトカインのそれらの細胞表面受容体に対する親和性の典型的な範囲より有意に低値である。なお同定されていないＣＹＴＬ１に対する共受容体が存在する可能性があり、それはシグナルトランスダクションの機序を与えることに加えて、細胞表面におけるｕＰＡＲに対するＣＹＴＬ１の親和性を増大させ、これによりそれをより強力なｕＰＡ−ｕＰＡＲ相互作用拮抗剤とする可能性がある。共受容体の非存在下においても、ＣＹＴＬ１はｕＰＡと効果的に競合するために十分高い局所濃度に到達することも想像される。大規模遺伝子発現試験（Ｋｕｍａｒら（２００１）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ／ＯＡＲＳ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ９（７），６４１−６５３）から得られたデータの慎重な分析によれば、ＣＹＴＬ１はｍＲＮＡレベルで豊富に表われ、その傾向は他の如何なるサイトカインよりも高いことがわかった。このことはＣＹＴＬ１が銀染色２Ｄゲル中で容易に検出される関節軟骨のプロテオーム分析（Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎら（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９（４２），４３５１４−４３５２１）においてタンパク質レベルで当てはまると考えられる。ＣＹＴＬ１とヘパリンとの間の相互作用はＣＹＴＬ１の局所濃度がブーストされると考えられる機序となっている。ヘパリンが生理学的結合相手である可能性は低いが、軟骨の豊富な高度硫酸化グリコサミノグリカンはＣＹＴＬ１に結合してそれを発現部位の近傍に局在化させる可能性がある。さらにまた、ヘパリンにより達成されたｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の結合の強化は、細胞外マトリックスまたは細胞表面の何れかにおけるグリコサミノグリカンがｕＰＡＲへのＣＹＴＬ１の親和性を増強している可能性があることを示唆している。
【０１９５】
本明細書の作成の間、ＣＹＴＬ１の別の研究が発表された（Ｋｉｍら（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｉｎ ｐｒｅｓｓ．ＰＭＩＤ：１７６４４８１４）。著者らはＣＹＴＬ１が間葉細胞の軟骨細胞への分化を促進することを発見している。本発明者らは軟骨細胞に分化しているＡＴＤＣ５細胞へのＣＹＴＬ１ＡＰの結合を観察しており（補足図２ａ）、そして本発明者らはｑＲＴ−ＰＣＲによるこれらの細胞によるｕＰＡＲの発現を示している（補足図２ｂ）。
【０１９６】
ＣＹＴＬ１の分子作用が４ヘリックスサイトカインファミリーのメンバーとして非典型的であるとすれば、ＣＹＴＬ１が真にこのファミリーのメンバーであるかどうかという疑問は未解決のままであり、そして構造的特性化なくしては解答が得られないことになる。ファミリーの多くのメンバーが多面発現性であり、異なる細胞コンパートメントにおいて極めて異なる機能的役割を果たしていることに留意すべきである。例えばレプチンは全身的には脂質代謝の調節物質として、そして局所的には造血（Ｗａｕｔｅｒｓら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１４３（３），２９３−３１１）および調節性Ｔ細胞発生（Ｄｅ Ｒｏｓａら（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６（２），２４１−２５５）を調節するという両方の作用を有している。同様に、ＣＤ３４＋造血先祖細胞により発現されるＣＹＴＬ１はより多くの従来のサイトカイン様機能を保持しているが、軟骨および血管壁においては極めて異なる機能を採用している可能性もある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）とウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）との相互作用を阻害する方法であって、サイトカイン様１（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドまたはそのアゴニストにｕＰＡおよびｕＰＡＲを含む混合物を接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記接触がインビトロで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記接触がインビボで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記混合物がｕＰＡおよびｕＰＡＲを発現する細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が癌細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記癌が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記癌が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の生物学的活性を阻害する方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストにインビボでウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびｕＰＡを発現する細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項１０】
前記細胞が癌細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が内皮細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
哺乳類被験体における腫瘍形成または腫瘍転移を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記哺乳類被験体がヒト患者である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が癌である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約７０％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８５％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９９％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１ポリペプチドの天然に存在する変異体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
前記アゴニストが抗ＣＹＴＬ１抗体またはそのフラグメントである、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体よりなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類被験体における血管形成を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記哺乳類被験体がヒト患者である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記血管形成が腫瘍血管形成である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約７０％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８５％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９９％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１ポリペプチドの天然に存在する変異体である、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
前記アゴニストが抗ＣＹＴＬ１抗体またはそのフラグメントである、請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記モノクローナル抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体よりなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の拮抗剤のスクリーニングの方法であって、（ａ）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを含有する混合物を候補拮抗剤とともにインキュベートすること、および（ｂ）該ｕＰＡＲへの該ｕＰＡまたはそのアゴニストの結合を競合的に阻害する該候補拮抗剤の能力を計測すること、を含む、方法。
【請求項５０】
哺乳類被験体における網膜血管新生を低減する方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５１】
哺乳類被験体における関節炎の発生率または重症度を低減する方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）とウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）との相互作用を阻害する方法であって、サイトカイン様１（ＣＹＴＬ１）ポリペプチドまたはそのアゴニストにｕＰＡおよびｕＰＡＲを含む混合物を接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記接触がインビトロで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記接触がインビボで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記混合物がｕＰＡおよびｕＰＡＲを発現する細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が癌細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記癌が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記癌が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の生物学的活性を阻害する方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストにインビボでウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびｕＰＡを発現する細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項１０】
前記細胞が癌細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が内皮細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
哺乳類被験体における腫瘍形成または腫瘍転移を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記哺乳類被験体がヒト患者である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が癌である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約７０％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８５％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９９％の同一性を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１ポリペプチドの天然に存在する変異体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
前記アゴニストが抗ＣＹＴＬ１抗体またはそのフラグメントである、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体よりなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類被験体における血管形成を阻害するための方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記哺乳類被験体がヒト患者である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記血管形成が腫瘍血管形成である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍が癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病よりなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍が乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、および種々のタイプの頭頚部癌よりなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記アゴニストがＣＹＴＬ１フラグメント、ＣＹＴＬ１アミノ酸変異体、アゴニスト抗ＣＹＴＬ１抗体およびそのフラグメント、ｕＰＡＲに結合できる、ペプチドおよび非ペプチド性低分子よりなる群から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約７０％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約８５％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９０％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１のアミノ酸配列に少なくとも約９９％の同一性を有する、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＹＴＬ１変異体が配列番号２のＣＹＴＬ１ポリペプチドの天然に存在する変異体である、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
前記アゴニストが抗ＣＹＴＬ１抗体またはそのフラグメントである、請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記モノクローナル抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体よりなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の拮抗剤のスクリーニングの方法であって、（ａ）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）およびＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを含有する混合物を候補拮抗剤とともにインキュベートすること、および（ｂ）該ｕＰＡＲへの該ｕＰＡまたはそのアゴニストの結合を競合的に阻害する該候補拮抗剤の能力を計測すること、を含む、方法。
【請求項５０】
哺乳類被験体における網膜血管新生を低減する方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５１】
哺乳類被験体における関節炎の発生率または重症度を低減する方法であって、有効量のＣＹＴＬ１またはそのアゴニストを該被験体に投与することを含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２１】
【図２３】
【図２５】
【図２６】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図２０】
【図２２】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２１】
【図２３】
【図２５】
【図２６】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図２０】
【図２２】
【図２４】
【公表番号】特表２０１１−５０３５３１（Ｐ２０１１−５０３５３１Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１２５４（Ｐ２０１０−５３１２５４）
【出願日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１０１８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５６１３
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１０１８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５６１３
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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