エオキシン形成の修飾物質の同定方法
生物システムにおける１４,１５-ＬＴＣ４(エオキシンＣ４；ＥｏｘＣ４)、１４,１５-ＬＴＤ４(エオキシンＤ４；ＥｏｘＤ４)、又は１４,１５-ＬＴＥ４(エオキシンＥ４；ＥｏｘＥ４)の形成を調節する化合物を同定する方法。抗炎症効果を有する化合物を同定する方法で、該方法は生物システムにおける１４,１５-ＬＴＣ４(エオキシンＣ４；ＥｏｘＣ４)、１４,１５-ＬＴＤ４(エオキシンＤ４；ＥｏｘＤ４)、又は１４,１５-ＬＴＥ４(エオキシンＥ４；ＥｏｘＥ４)の形成及び／又は活性に対する効果について化合物を試験することを含む。(ｉ)本発明の方法によって抗炎症又は骨量減少低減化合物を同定し；(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせることを含む抗炎症組成物又は骨量減少低減組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬学的に有用な化合物を同定するための方法に関する。本発明は更に炎症疾患又は炎症全般の治療に有用な化合物を同定するための方法に関する。本発明はまた抗炎症組成物を製造する方法及び薬学的に有用な化合物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
その性質が炎症性である多くの疾患／障害がある。炎症症状の現在の治療法に伴う主な問題の一つは効能の欠如及び／又は副作用(実際のもの又はそのように思われているもの)の発生である。
喘息は、先進工業国の成人人口の６％〜８％で発症している慢性の炎症性疾患である。子供における発生率はさらに高く、殆どの国では１０％に近い。喘息は、１５才以下の子供の入院原因の最も一般的なものである。
喘息の治療法は症状の重症度に基づく。軽度の症例では治療しないか、又はβ-アゴニストの吸入で治療されるのみである。より重症の喘息を患っている患者は、定期的に抗炎症化合物を用いて治療するのが典型的である。
【０００３】
現在の維持療法(主としてコルチコステロイド類の吸入)には、少なくともある程度のリスクがあると思われるため、喘息の治療が不十分な場合がかなりある。これらには、不要な罹患及び死亡に至る、子供の成長遅延及び骨ミネラル密度の損失の危険性が含まれる。ステロイド類の代替法として、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト(LTRas)が開発されている。これらの薬剤は経口的に与えることができるが、吸入されたステロイド類に比べてあまり有効ではなく、通常、気道炎症を満足に抑制できない。
この要因が組み合わさって、喘息の全患者の少なくとも５０％が満足のいく治療を受けていない。
【０００４】
治療が不十分であるという同様のパターンがアレルギー疾患に関連して存在し、多くの一般的症状を治療するのに薬剤を利用できるが、明白な副作用を考慮して使用されていない。鼻炎、結膜炎及び皮膚炎はアレルギー要素を有しうるが、潜在するアレルギーがない場合でも生じる場合がある。実際、このクラスの非アレルギー性症状は、多くの症例で治療が困難である。
【０００５】
慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)は、世界の人口の６％〜８％が罹患している一般的な疾患である。疾患は致死的となりうるおそれがあり、この病気の罹患率及び死亡率はかなりのものである。現在、ＣＯＰＤの経過を変えることができる既知の薬物学的治療法は存在しない。
【０００６】
挙げることのできる他の炎症性疾患には次のものがある：
(ａ)特発性肺線維症(これはＣＯＰＤよりも一般的ではないが、非常に悪い予後を伴う重篤な疾患である。治癒的治療法は存在しない)；
(ｂ)炎症性大腸炎(高罹患率の疾患群。今日、このような疾患では対症療法が利用できるに過ぎない)；及び
(ｃ)関節リウマチ及び骨関節炎(関節のありふれた無能化炎症性疾患。現在では、このような症状への対応に利用できる治癒的治療法は存在せず、また適度に効果的な対症療法のみである)。
【０００７】
炎症はまた痛みの一般的な原因である。炎症痛は多くの理由、例えば感染、手術又は他の外傷により生じるおそれがある。更に、数種の悪性腫瘍は、患者の総体的な症状に加わる炎症要素を有することが知られている。
よって、新規な及び／又は代替の抗炎症治療法が、上述した患者群の全てにとって有益となる。特に、実際の又は知覚される副作用を生じないで喘息のような炎症性疾患を治療できる有効な抗炎症剤に対して真のかつ実質的に満たされていないニーズがある。
【０００８】
哺乳類のリポキシゲナーゼは、アラキドン酸の酸素化を触媒する構造的に関連した酵素のファミリーである。３種類のヒトリポキシゲナーゼが知られており、これらは炭素位置５、１２及び１５１におけるアラキドン酸への分子酸素の挿入を触媒する。よって、酵素は、それぞれ５-、１２-及び１５-リポキシゲナーゼと称されている。
リポキシゲナーゼの作用によって生成されるアラキドン酸の代謝産物は、炎症誘発効果を含む明白な病態生理学的活性を有していることが知られている。
【０００９】
ロイコトリエン生合成における重要な酵素は、２段階反応でアラキドン酸をロイコトリエン(ＬＴ)Ａ４に転換する５-リポキシゲナーゼである。この代謝物は酵素的にロイコトリエンＢ４(ＬＴＢ４)まで加水分解されるか、又はロイコトリエンＣ４(ＬＴＣ４)シンターゼによってグルタチオンとコンジュゲートさせられてＬＴＣ４を形成し、これがついでγグルタミル-トランスペプチダーゼ及びジペプチダーゼの連続的作用によって切断されロイコトリエンＤ４(ＬＴＤ４)とロイコトリエンＥ４(ＬＴＥ４)をそれぞれ生じうる。ＬＴＣ４とその代謝物は炎症誘発剤及び強力な気管支収縮剤２である。これらの代謝産物の作用並びにそれらを形成する生物学的プロセスを阻害する薬剤の開発に多大な努力がなされている。この目的のために開発された薬剤には、５-リポキシゲナーゼインヒビターと、これまでに述べたように、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト(ＬＴＲａｓ)が含まれる。ＦＬＡＰ(Five Lipoxygenase Activating Protein)のインヒビターもまた研究されている。
【００１０】
アラキドン酸を代謝する他のクラスの酵素はシクロオキシゲナーゼ類である。このプロセスにより生成されるアラキドン酸代謝産物には、プロスタグランジン類、トロンボキサン類、及びプロスタサイクリンが含まれ、それらの全てが生理学的及び病態生理学的活性を有している。特に、プロスタグランジンＰＧＥ２は、熱及び痛みをまた誘発する強力な炎症誘発媒介物である。従って、「ＮＳＡＩＤｓ」(非ステロイド性抗炎症剤)及び「コキシブ(coxibs)」(選択的シクロオキシゲナーゼ-２インヒビター)を含む、ＰＧＥ２の生成を阻害する多くの薬剤が開発されている。これらのクラスの化合物は、主として一種又は数種のシクロオキシゲナーゼの阻害を介して作用する。またレセプターアンタゴニストが研究されている。
【００１１】
よって、一般に、アラキドン酸代謝産物の生成を阻止可能な薬剤は、炎症の治療に有用であると思われる。
【００１２】
例えば免疫抑制性患者、例えば化学療法、移植拒絶を防止するための治療を受けている患者又はＡＩＤＳ患者において炎症誘発剤はまた有用でありうる。
５-リポキシゲナーゼに加えて、１２-及び１５-リポキシゲナーゼがまたヒトの体で発現される。
１２-リポキシゲナーゼ(１２-ＬＯ)はヒト血小板中で高度に発現されるがこの酵素の生物学的な役割については殆ど知られていない１。
【００１３】
１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)１型(ヒト１５-ＬＯ：ＥＣ１．１３．１１．３３)は非ヘム鉄を含む７５-ｋＤａのタンパク質である。１５-ＬＯはアラキドン酸(２０：４)のＣ-１５又はリノール酸(１８：２)のＣ-１３に分子酸素を導入して１５Ｓ-ヒドロペルオキシ-５,８,１１-ｃｉｓ-１３-ｔｒａｎｓ-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＰＥＴＥ)又は１３Ｓ-ヒドロペルオキシ-９-ｃｉｓ-１３-ｔｒａｎｓ-オクタデカジエン酸(１３-ＨＰＯＤＥ)をそれぞれ形成する。少量の１２Ｓ-ヒドロペルオキシ-５,８,１４-ｃｉｓ-１０-ｔｒａｎｓ-エイコサテトラエン酸(１２-ＨＰＥＴＥ)がまた１５-ＬＯ酵素によってアラキドン酸から形成される。簡単に述べると、触媒反応は不飽和脂肪酸のｃｉｓ-ｃｉｓ-１,４-ペンタジエン構造(２０：４又は１８：２)のＣ-３における水素除去を含んでおり、炭素ラジカルとＦｅ３＋からＦｅ２＋への鉄の還元を生じる(以下のスキーム１参照)。
【００１４】
ラジカルはＣ-５に移動し、そこで分子酸素と反応してペルオキシ基を形成する。ペルオキシ基による鉄からＦｅ３＋への酸化は、プロトン化されて最終の脂質ヒドロペルオキシドを生じるペルオキシ陰イオンを生じる。
【００１５】
ウサギ酵素１５-ＬＯはクローニングされ結晶化され、基質結合部位が、その基部がＰｈｅ３５３、Ｍｅｔ４１９、Ｉｌｅ４１８及びＩｌｅ５９３の側鎖によって定まる深い疎水性ポケット２２であることが見出されている。脂肪酸基質は(酵素の表面で)Ａｒｇ４０３によって繋留され位置せしめられている。変異原性研究により、疎水性ポケットのサイズの変動が酵素の位置特異性に影響を及ぼすことが立証されている。よって、 １５-ＬＯのポケットの拡大が１２-リポキシゲネーション産物(１２-ＨＰＥＴＥ)の量を増大させた。１５-ＬＯ中の鉄はヒスチジンとＣ末端イソロイシンのカルボキシ基に配位されている。
【００１６】
１５(Ｓ)-ＨＥＴＥへの還元を受けることに加えて、１５(Ｓ)-ＨＰＥＴＥはまた脱水を受けて１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)を生じる。このアリルエポキシドはジヒドロキシ酸８(Ｒ,Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４又は１４(Ｒ,Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４に加水分解されうる１１-１２。また、基質として１５-ＨＰＥＴＥを用いて、１５-ＬＯは二重の二原子酸素付加産物５(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ,８(Ｓ,Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び１４(Ｒ,Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥの形成をまた触媒する。
【００１７】
１５(Ｓ)-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)は遊離脂肪酸を代謝するばかりでなく、膜に存在しているポリエン脂肪酸を攻撃することもできる。該酵素はミトコンドリア膜の崩壊を通して網状赤血球の成熟において重要な役割を担っていることが予想された３。しかしながら、該酵素はケラチノサイトや眼水晶体の成熟のような、細胞の分化においてより一般的な役割を担いうる４。１５-ＬＯは主として網状赤血球、好酸球、皮膚、単球／マクロファージ及び気道上皮において発現される５。インターロイキン-４(ＩＬ-４)及びインターロイキン-１３(ＩＬ-１３)は培養された単球及び上皮細胞における１５-ＬＯの発現を誘導するが６、ある種の細胞への損傷が１５-ＬＯの活性を増加させることが報告されている(Green FA. Transformation of 5-HETE by activated keratinocyte 15-lipoxygenase and the activation mechanism. Lipids 25, 618-623 (1990))。
【００１８】
５-リポキシゲナーゼ及び１２-リポキシゲナーゼとは異なり、１５-ＬＯはウサギ及びヒト細胞においてのみ発現されると思われる１。ヒト１５-ＬＯのマウスオルソログは白血球型の１２-ＬＯであると思われる１。しかしながら、二つの酵素活性の調節はかなり異なっているようである７。
１５-ＬＯは２０年以上も前に発見され、均一になるまで精製される最初の１５-ＬＯはウサギ網状赤血球から取り出された８。該酵素のヒト型は網状赤血球及び上皮細胞からクローニングされており、免疫学的研究から、該酵素は網状赤血球、好酸球及び気道上皮において同一である９。１５-ＬＯの第二の型(２型)はヒト毛根からのｃＤＮＡライブラリーからクローニングされ、続く該酵素の発現とアミノ酸解析により、この１５-ＬＯの２型酵素は先に開示された１５-ＬＯの１型とおよそ４０％同一であることが証明された１０。
【００１９】
１５-ＬＯは、主として抗炎症効果を有していると思われるリポキシンの形成に関与していると思われるが１３、１５-ＬＯ誘導産物の５-オキソ-１５-ヒドロキシ-６,８,１,１３-エイコサテトラエン酸はヒト好酸球に対する強力な走化性剤であると報告されている１４。ヒトにおける１５-ＬＯ経路の生理学的及び病態生理学的役割は十分には特徴付けされていない。
【００２０】
ロイコトリエン類のような生物システム中で生じることが知られているアラキドン酸代謝物に基づいて、多くの異なったアナログが合成されている。例えば１４,１５-ＬＴＣ４のようなＬＴＣ４の合成アナログは気管支収縮を誘導しなかった。Drazen, J.M., Lewis, R. A., Austin, K.F., Toda, M., Brion, F., Marfat, A.及びCorey, E.J.: Contractile activities of structural analogs of leukotrienes C and D: necessity of a hydrophobic region. Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3195-3198 (1981)。
【発明の概要】
【００２１】
我々は炎症誘発効果を有するアラキドン酸代謝物の生物システム中における産生を同定した。該代謝物は１５-リポキシゲナーゼの作用を介して、可溶型グルタチオンＳトランスフェラーゼ及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼの作用を介して形成されうる。該代謝物はエオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４と命名される。我々は、抗炎症化合物及びエオキシンＣ４、Ｄ４及びＥ４形成を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング法を提供する。
【００２２】
我々は、ホジキン細胞株Ｌ１２３６１５が１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)の１型活性を有しており、１５-ＬＯ経路を介してアラキドン酸をエオキシン類に転換することを示す。Ｌ１２３６中におけるエオキシンＣ４、Ｄ４及びＥ４の存在及び形成を明らかにした後、我々は、これらエオキシン類が他のヒト細胞及び組織、特に好中球において形成されるが、また鼻ポリープ組織及び樹状細胞(実施例２)によっても形成されることをまた示す。我々はまた広範囲の細胞型が１５-ＬＯを発現することを示す。興味深いことに、炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患に罹患している患者の細胞、例えばホジキンリンパ腫の患者のリンパ節中のリード・シュテルンベルク細胞、サルコイドーシス患者の肺バイオプシーの類上皮細胞、関節リウマチの滑膜細胞及びアルツハイマー病の患者のニューロン(実施例３)は、コントロール細胞と比較して１５-ＬＯの増大した発現を示した。
【００２３】
これらの新しい代謝物の生合成の立証と、関連する酵素の同定に加えて、エオキシン類の生物学的効果をまた記載する。例えば、実施例６ａには、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４は内皮細胞の透過を引き起こす点でヒスタミンより約１００倍強力であることが示され(炎症のインビトロモデル)、５-ＬＯ経路を通して形成された姉妹代謝物ＬＴＣ４に匹敵する作用強度を示す。例えば、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４はコンフルエントなウシ又はヒト内皮細胞を有するモデル系において１０-７及び１０-８Ｍにて有意な血漿漏出を誘導する。炎症の他のモデルでは、 ＥｏｘＣ４及びＥｏｘＤ４はＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導したが、ＥｏｘＥ４はＩＬ-５で刺激された好酸球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導した。我々はまたエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成を阻止する化合物を実証した。
【００２４】
我々は、それぞれエオキシンＣ４(ＥｏｘＣ４)、エオキシンＤ４(ＥｏｘＤ４)及びエオキシンＥ４(ＥｏｘＥ４)と命名されたエオキシン：１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４、及び１４,１５-ＬＴＥ４と命名されたアラキドン酸からの３種の１５-リポキシゲナーゼ誘導代謝物を同定する。
アラキドン酸からの１５-ＬＯ誘導システイニル含有産物エオキシンＣ４、Ｄ４及びＥ４の形成は真核又は原核細胞において以前には決して記載されていない。
【００２５】
ＲＰ-ＨＰＬＣを使用して代謝物を単離し、代謝物の構造を陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって決定した。エオキシン類は２８２ｎｍで最大ＵＶ吸光度を示すコンジュゲートトリエン構造を有している。我々は、これらの代謝物が、アラキドン酸が１５-ＬＯで触媒された転換により１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４；エオキシンＡ４)になり、これがグルタチオンとコンジュゲートさせられて１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４；エオキシンＣ４)になり、これが続いて１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４；エオキシンＤ４)及び１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４；エオキシンＥ４)まで代謝されることによって形成されると考える。
【００２６】
１４,１５-ＬＴＡ４(エオキシンＡ４)からの１４,１５-ＬＴＤ４(エオキシンＤ４)の形成に関与する酵素は、実施例４において検討されるように、ＬＴＣ４-シンターゼ及び／又は可溶型グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、特にＧＳＴＭ１、及びＧＳＴＰ１であると考えられる。
示唆される経路を以下に示す：
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第一の態様は、生物システムにおけるエオキシンＣ４,エオキシンＤ４,又はエオキシンＥ４の形成を調節する化合物を同定する方法であって、１５-ＬＯ活性又はＧＳＴＭ１-１、ＧＳＴＰ１-１及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法を提供する。
本発明の第二の態様は、炎症調節効果又は骨量減少調節(典型的には骨量減少低減)効果を有する化合物を同定する方法であって、生物システムにおけるエオキシンＣ４,エオキシンＤ４又はエオキシンＥ４の形成及び／又は活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法を提供する。
【００２８】
「形成を調節する」には、エオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成及び／又は活性を阻害又は促進することが含まれる。典型的には、該方法は、ＥｏｘＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成及び／又は活性を阻害するための化合物を同定するために使用しうる。かかる化合物はまた骨量減少低減化合物であると考えられる。該化合物は典型的にはＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性を阻害しうる。
該方法は、あるいは、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性を促進するための化合物を同定するために使用することができる。かかる化合物は炎症誘発性であると考えられる。かかる化合物は典型的にはＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の形成を促進しうる。
【００２９】
本発明の第一の態様の方法は、生物システムにおけるＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成又は活性に対する効果について化合物を試験する工程を更に含みうる。
生物システムは典型的には１５-ＬＯ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(典型的には可溶型グルタチオンＳトランスフェラーゼ、例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１)及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性を含む。
【００３０】
化合物は、以下で更に検討するように、細胞画分又は単離酵素又は酵素群を含む系において試験することができる。あるいは、本発明の第一又は第二の態様の方法は、ホールセルに対する試験化合物の効果を試験することによって実施することができる。例えば、該方法は、エキソビボヒト細胞又は細胞株を使用して実施することができる。例えば、ヒト好酸球又は肥満細胞(例えば実施例８に記載したような、例えば臍帯血由来の肥満細胞)又はＬ１２３６細胞株を使用することができるが、例えば１５-ＬＯ及び／又はＧＳＴのような必要な酵素を発現する(内因性又は組換えの何れでも)ヒト鼻ポリープ組織及び／又は樹状細胞又は任意の他の細胞又は細胞株もまた使用することができる。しかしながら、この種の代謝経路に関与する酵素が同じ位置にある必要はない。様々なアラキドン酸代謝物の形成におけるよく知られた現象は経細胞生合成、つまり最初の酵素工程が一つの細胞型において触媒され、中間体が他の細胞型に搬出されて、そこで第二の酵素工程が実施されるものである。例えばエオキシンＡ４の生合成は一細胞型において生じる一方、エオキシンＡ４からエオキシンＣ４への転換(及び場合によってはエオキシンＣ４からエオキシンＤ４及びエオキシンＥ４への転換も)は第二の細胞型において生じうる。よって、試験は、エオキシン類の生合成のための補完酵素能力を持つ２つの細胞型の同時インキュベーションで実施することもまたできる。
【００３１】
当業者には明らかなように、アッセイ手順の前又はその一部として細胞を刺激し；又は例えば実施例に記載しているように、アッセイにアラキドン酸を提供することが必要である。実施例８において検討するように、ＬＴＣ４、プロスタグランジンＤ２又はＩＬ-５によって好酸球を刺激してＥｏｘＣ４を産生させることができる。１５-ＬＯ-１の発現を誘導するためには例えばＩＬ-４を使用して肥満細胞を刺激し；ついで実施例８で検討するようにアッセイにおいてアラキドン酸を提供することが望ましい場合がある。他の細胞はエオキシン類を放出することができるために刺激を必要としない場合がある。例えば、実施例８において検討されるように、ヒト鼻ポリープ細胞はエオキシン類を自発的に放出することができると考えられる。
【００３２】
当業者には明らかなように、エオキシンＣ４の形成に対する効果が試験されているならば、エオキシンＣ４の代謝物の生合成に関与する現在の酵素(例えばｇ-グルタミル-トランスペプチダーゼ又はジペプチダーゼ)を有していることは必要ではない。同様に、１５-ＬＯ活性に対する効果が試験されている場合、１５-ＬＯ(エオキシンＡ４)の代謝物の生合成に関与する現在の酵素、例えばＬＴＣ４シンターゼ又は可溶型グルタチオンＳトランスフェラーゼ、例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１を有していることは必要ではない。当業者には明らかなように、一又は限られた数の酵素が存在している系と、より多くの酵素(例えばアラキドン酸からのエオキシン合成に関与する酵素の全て、例えば１５-ＬＯ；ＬＴＣ４シンターゼ又は可溶型ＧＳＴ、例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１)が存在する系の双方において化合物を試験することが望ましい場合がある。当業者にはよく知られているように、単一又は限られた酵素系での試験は構造-機能関係を樹立するのに有用でありうる一方；複雑な系での試験は化合物がインビボで有用である可能性があるかどうかを樹立するのに有用でありうる。
【００３３】
上述のように、ある化合物がエオキシンＣ４、エオキシンＤ４又はエオキシンＥ４の形成を阻害することができるかどうかを試験する適切な方法は、実施例７に例証する。しかしながら、別法として、他の細胞株は、それらがエオキシンを生産する酵素的機構を有しているならば使用することができ、細胞型に応じた手順の変更は当業者には明らかである。
エオキシン類は、例えばＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、質量分析法、ＵＶ分光法及び異なった免疫学的方法、例えばＥＩＡ及びＲＩＡによって検出し定量することができる。
【００３４】
現在、上記のように、１５-ＬＯ酵素の２つの型がクローニングされている。２型１５-ＬＯは１型１５-ＬＯとおよそ４０％同一である。１型１５-ＬＯとは異なり、リノール酸は２型１５-ＬＯのための乏しい基質である。現在の知識では、阻害のための好ましい酵素はよって１５-ＬＯの１型であるが、１５-ＬＯの２型を、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成に至る代謝経路における酵素として除外することはできない。
１５-ＬＯの触媒活性は例えば記載されているようにして測定することができる９。該酵素は、当該試験化合物の存在下又は不在下で１５-(ｓ)-ＨＥＴＥへのアラキドン酸(基質)の転換又は１３-ヒドロキシオクタデカジエン酸(１３-ＨＯＤＥ)へのリノール酸(基質)の転換を評価することによってアッセイすることができる。化合物が存在している場合における１５-(Ｓ)-ＨＥＴＥ又は１３-ＨＯＤＥの形成の減少は酵素活性における減少を例証する。そのような化合物は、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成において最初の酵素段階を阻止する。かかる化合物はインビボで抗炎症作用を有していると考えられる。
【００３５】
本発明の第一の態様の一側面では、ヒト１５-ＬＯの触媒活性を試験するためのアッセイは実施例５に記載されているように考えられる。ここに示したアッセイは、ジフェニル-１-ピレニルホスホン(ＤＰＰＰ)をホスフィンオキシドに酸化する脂質ヒドロペルオキシドの能力を利用する。ジフェニル-１-ピレニルホスホンは酸化されるまでは非蛍光化合物である。ＤＰＰＰの酸化は蛍光化合物を生じ、これは温度に感受性がなく、少なくとも６０分間安定である。
【００３６】
本発明の第一の態様の他の側面では、問題の試験化合物の存在下又は不在下で、１５-(Ｓ)-ＨＥＴＥへのアラキドン酸又は１３-ヒドロキシオクタデカジエン酸(１３-ＨＯＤＥ)へのリノール酸(基質)の転換を決定するために細胞可溶化物においてアッセイを実施する。
上記の新規の１５-リポキシゲナーゼで触媒されたアラキドン酸代謝物の形成における重要な酵素の他のものは可溶型ＧＳＴである。実施例４に示すように、ＧＳＴＭ１-１、ＧＳＴＰ１-１及び／又はＬＴＣ４シンターゼはエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成に関与しうる。よって、本発明の第一態様の実施態様では、ＧＳＴＭ１-１、ＧＳＴＰ１-１及び／又はＬＴＣ４シンターゼの触媒活性に対する試験化合物の効果が評価される。ＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１の触媒活性のアッセイは本質的に実施例４に記載されているようにして実施することができる。
【００３７】
本発明の第二の態様の実施態様では、実施例６ａに記載されたもののように、炎症のインビトロモデルにおいてエオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４で誘導した内皮細胞の透過を調節するその能力について試験化合物をアッセイする。かかる試験はまた本発明の第一の態様の方法との関連で実施することもできる。
化合物は、例えば炎症のウサギモデルのように１５-ＬＯが存在している動物又は炎症のエキソビボモデルにおいて又は１５-ＬＯを発現するトランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)において試験することができる。化合物は炎症のヒトエキソビボモデルにおいて、例えばヒト末梢血又はヒト臍帯血について、又はヒト末梢血もしくはヒト臍帯血から単離した細胞について、例えば白血球、例えば好中球、好酸球、樹状細胞又は肥満細胞について試験することができる。かかる試験の例は実施例の例えば実施例６ｂに記載される。該化合物はまた例えばＵＳ２００３／０１７５６８０に記載されているように、幹細胞又は他の骨形成細胞前駆体を骨細胞に分化させる能力について試験することができる。
【００３８】
試験される化合物は、例えば上で検討したように、化合物の構造が１５-ＬＯの基質結合部位と比較され、又はそれに基づいて設計もしくは修飾される構造ベースのスクリーニング法に基づいて選択することができる。出発化合物は最初は１５-ＬＯ酵素活性に対する効果について(例えば実施例５に記載されているアッセイを使用して)スクリーニングすることによって選択することができ；ついで、構造と比較し；例えばエオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４形成に対する効果について更なるモデル化及び／又は合成及び評価によってついで試験することができる更なる化合物を設計するための基礎として使用される。
【００３９】
(例えば実施例５に記載されているような)ＤＰＰＰを使用する１５-ＬＯ活性に対する効果の評価は、分光光度アッセイを使用することができ、直ぐに実施でき、例えば高スループット試験に非常に適したマイクロタイタープレート方式に使用することができることを意味する。アラキドン酸又は１５-ＨＰＥＴＥ又は他のアラキドン酸代謝物を基質として使用する評価は、１５-ＬＯ活性をインビボで調節する化合物の能力を確認するのに有用でありうる。
化合物にはまた当業者によく知られているように他の試験、例えば毒性学又は代謝試験を施すことができる。
【００４０】
本発明は、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の一又は複数の形成又は活性を調節、例えば亢進又は阻害するのに有用な薬剤を同定しようとする際に使用されるスクリーニングアッセイを提供することが理解される。該方法において同定される化合物はそれ自体薬剤として有用であり得、あるいはそれらはより効能のある化合物の設計と合成のためのリード化合物を表しうる。
該化合物は上記の化合物を同定する方法の各々に対して薬物様化合物又は薬物様化合物の開発のためのリード化合物でありうる。上記方法は、当業者によく知られているように、薬学的化合物又は薬物の開発におけるスクリーニングアッセイとして有用でありうることが理解される。
【００４１】
「薬物様化合物」という用語は、当業者によく知られており、医学における使用に適する特性、例えば、医薬品における有効成分としての特性を有する化合物の意味を含んでいてよい。従って、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によるか、それより好ましくはないが、分子生物学又は生化学の技術により合成される分子であってよく、５０００ダルトン未満であってよい小分子であることが好ましい。薬物様化合物は、特定のタンパク質又はタンパク質群との選択的な相互作用の特徴を更に示し、生物利用及び／又は細胞膜を透過可能でありうるが、これらの特徴が必須ではないことは理解されるであろう。
「リード化合物」という用語は、同様に当業者によく知られており、それ自体薬物としての使用に適さない(例えば、その所期の標的に対して弱い効力を示すにすぎず、その作用が非選択的で、不安定で、溶解性に乏しく、合成が困難又は不十分な生物学的利用能を有する)が、その化合物がより望ましい特性を有する他の化合物の設計の出発点を与えるものであるという意味を含みうる。
【００４２】
高スループット操作が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことが理解される。上で検討したように、ＤＰＰＰを使用する酵素アッセイ法を使用することができる。
適切な場合には、炎症又はインビボでのエオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成又は活性を調節しうる化合物を同定することは望ましいであろうことは理解される。よって、本発明の方法で使用される試薬と条件は、例えば１５-ＬＯと基質の間の相互作用が、ヒト１５ーＬＯと天然に生じる基質(例えばアラキドン酸)との間のものに類似するように選択することができることは理解されるであろう。当業者には明らかなように、異なったアッセイ系を用いて化合物を評価することができ、その幾つかにおいてエオキシン形成に関与する特定の酵素に対する効果に対する特異性又はアッセイの簡便性を(例えば単一酵素系を使用して)最適化されうる一方、他のものでは、インビボ関連性を、例えばホールセル中の化合物の効果を評価することによって最適にすることができる。
【００４３】
本発明のスクリーニングアッセイは炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患の治療において有用な化合物の探索に有用である。インビトロ及び／又はインビボスクリーンイングをベースとして選択した化合物を、炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患における抗炎症効果について更に試験することができる。同様に、本発明のスクリーニングアッセイは骨量減少の治療又は防止／骨形成亢進に有用である化合物の探索に有用である。インビトロ及び／又はインビボスクリーニングをベースにして選択された化合物は、骨量減少の患者又はその危険のある患者又は炎症プロセスを含む疾患における骨量減少／骨形成亢進効果について更に試験することができる。
【００４４】
「炎症」という用語は、上で述べたもののような身体外傷、感染、慢性疾患によって誘発されうる局所的又は全身性保護反応、及び／又は外部刺激に対する化学的及び／又は生理学的反応(例えばアレルギー反応の一部として)によって特徴付けられる任意の症状を含むと当業者には理解される。有害な薬剤と傷ついた組織の双方を破壊し、希釈し又は隔離する作用をするあらゆるそのような応答は、例えば発熱、腫れ、痛み、発赤、血管拡張及び／又は血流増加、白血球の罹患領域への侵入、機能喪失及び／又は炎症症状に伴うことが知られている任意の他の徴候に顕れうる。
よって、「炎症」という用語は、任意の炎症性疾患、障害又は症状自体、それを伴う炎症要素を持つ任意の症状、及び／又はとりわけ急性、慢性、潰瘍、特異、アレルギー性及び壊死性炎症、及び当業者に知られている炎症の他の形態を含む、徴候として炎症によって特徴付けられる任意の症状を含むものとまた理解される。よって、その用語はまた本発明の目的に対して、炎症痛及び／又は発熱を含む。
【００４５】
エオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成又は活性を減少させる化合物は炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患を治療するのに有用である。従って、本発明のスクリーニング法は、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、肺線維症、アレルギー性疾患、鼻炎、炎症性腸疾患、潰瘍、炎症性痛覚、発熱、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、脈管炎、膵炎、関節炎、変形性関節炎、関節リウマチ、結膜炎、虹彩炎、強膜炎、ブドウ膜炎、創傷、皮膚炎、湿疹、乾癬、発作、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、高血圧(例えばAnning PB等 (March 2005) Elevated endothelial nitric oxide bioactivity and resistance to angiotensin-dependent hypertension in 12/15-lipoxygenase knockout mice. Am J Pathol. 166(3):653-62を参照)、ホジキンリンパ腫及び他の悪性腫瘍、又は炎症成分を有する任意の他の疾患の治療に有用であり得る化合物を同定するのに有用である。
【００４６】
本発明のスクリーニング法は、またＵＳ２００３／０１７５６８０において検討されているように、例えば骨粗鬆症、骨関節炎、パジェット病又は歯周病に伴う骨量減少の治療又は予防に有用である化合物を同定するのに有用であると考えられる。よって、本発明のスクリーニング法は、患者における骨ミネラル密度の増加、並びに骨折の発生の低減及び／又は治癒において有用であり得る化合物を同定するのにも有用であり得る。
該化合物は上述の症状の治療的及び／又は予防的処置の双方において有用であり得る。
【００４７】
エオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成又は活性を減少させる化合物は、例えば免疫抑制性患者、例えば化学療法又は移植の拒絶を減少させる治療を受けている患者において炎症応答の促進が望ましい場合がある患者を治療するのに有用であると考えられる。例えばＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４は、炎症応答の促進が望ましい患者を治療するのに有用であると考えられる。
【００４８】
従って、本発明の更なる態様は、治療的有効量のＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４を患者に投与することを含む、炎症反応の促進を必要とする患者の治療方法を提供する。本発明の更なる態様は、炎症反応の促進を必要とする患者の治療のための医薬の製造におけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の使用を提供する。
【００４９】
本発明のスクリーニング法を実施する結果として、例えば実施例７に示されるように、典型的にはペプチド又は低分子でありうる化合物が同定される。該化合物は、薬学的使用、例えば患者、例えば動物(典型的には１５-ＬＯを発現する哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ又はサル、好ましくはウサギ又は他の動物(例えばトランスジェニック動物))又はヒトにおけるインビボ治験での使用のために製剤化することができる。
【００５０】
本発明の第三の態様は、抗炎症組成物又は骨量減少低減組成物を製造する方法であって、
(ｉ)本発明の第二の態様の方法によって抗炎症又は骨量減少低減化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法を提供する。
本発明の第四の態様は、エオキシン形成調節組成物を製造する方法であって、
(ｉ)本発明の第一の態様の方法によってエオキシン形成調節化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法を提供する。
【００５１】
該組成物は典型的には有効量の化合物を患者に供給するものである。「有効量」という用語は、治療された患者に治療効果を付与する化合物の量を意味する。効果は客観的(すなわち、ある試験又はマーカーで測定可能)でありうるか、又は主観的(すなわち、患者が効果の顕れを示すか又は効果を感じる)でありうる。
該組成物は、経口的、静脈内、皮下的、口腔的、経直腸的、皮膚的、経鼻的、経気管的、経気管支的、舌下的、任意の他の非経口経路によって又は吸入を介して、 薬学的に許容可能な投薬形態で投与されることが意図され、又はそのようにして投与されるのに適したものでありうる。該組成物は、例えば経口投与のための錠剤、カプセル剤又はエリキシル剤、直腸投与のための坐薬、非経口又は筋肉内投与のための滅菌液又は懸濁液等々でありうる。該組成物は吸入用のスプレー又は注射用の液体であり得る。かかる組成物は標準的な及び／又は認められている薬学的実務に従って調製することができる。
【００５２】
該組成物はまた(例えばＮＳＡＩＤｓ、コキシブ類、副腎皮質ステロイド類、鎮痛剤、５-リポキシゲナーゼ阻害剤、ＦＬＡＰ阻害剤(５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質)、及びロイコトリエンレセプターアンタゴニスト(ＬＴＲａｓ)、及び／又は炎症の治療に有用な他の治療剤から選択される)ここで定義された炎症の治療に有用な他の治療剤を含みうる。
あるいは、該組成物はまた骨量減少の低減又は骨形成の増加に有用な他の治療剤、例えばビスホスホネート、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプター調節因子(ＳＥＲＭ)、カルシトニン(calcinonin)又はタンパク質同化薬を含みうる。かかる治療剤の例は、例えばＵＳ２００３／０１７５６８０の、例えば段落［００６５］で検討されている。
かかる組合せ製品は他の治療剤との関連で同定された化合物の投与をもたらし、よって、その製剤の少なくとも一つが同定されたものを含み、少なくとも一つが他の治療剤を含む別個の製剤として提供することができ、又は併用調製物(つまり同定された化合物と他の治療剤を含む単一製剤として提供)として提供(つまり製剤化)されうる。
【００５３】
化合物は様々な用量で投与できる。経口、肺及び局所用量は、１日・ｋｇ体重当たり約０．０１(ｍｇ／ｋｇ／日)から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．０１から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．１から約５．０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。例えば、経口投与では、組成物は典型的には約０．０１ｍｇから約５００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇから約１００ｍｇの活性成分を含む。経静脈的には、最も好ましい用量は一定速度の注入の間、約０．００１から約１０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲である。有利には、化合物は単一の一日用量で投与することができ、又は一日の全用量を、毎日２回、３回又は４回の分割量で投与してもよい。
【００５４】
とにかく、医師又は当業者であれば、個々の患者に最も適し、投与経路、治療されるべき症状のタイプと重症度、並びに処置される特定の患者の種、年齢、体重、性別、腎機能、肝機能及び応答によって変わり得る実際の用量を決定することができるであろう。上記の用量は平均的な場合の例である；より高い又は低い用量範囲が有利となる個々の場合ももちろん有り得、それも本発明の範囲内である。例えば実施例７はエオキシン類の形成を阻害可能な化合物が同定される方法を示している。
次に、本発明を次の非限定的な図面及び実施例を参照しながら更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】アラキドン酸(４０μＭ)と共に１０分間インキュベーションした後のＬ１２３６細胞によって形成された２３６ｎｍでのＵＶ吸光度を持つ産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。挿入：それぞれ１５(Ｓ)-ＨＥＴＥ及び１２(Ｓ)-ＨＥＴＥで共溶出した物質のＵＶスペクトル。
【図２ａ】アラキドン酸(４０μＭ)と共に１０分間インキュベーションした後のＬ１２３６細胞によって形成された２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を持つ産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。１-５の数字は合成標準の保持時間に対応する：１)８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；２)８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ；３)８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４,４)８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び５)１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ。
【図２ｂ】ピークＩ-ＩＶ下で溶出する代謝物のＵＶスペクトル。
【図３】ピークＩＩの物質の［Ｍ-Ｈ］-イオンの４００ｅＶ(Ｅｌａｂ)ＣＩＤスペクトル。上方パネル：ＬＴＣ４；中央パネル：ピークＩＩ；下方パネル：合成１４,１５-ＬＴＣ４。
【図４】ピークＩＶの物質の［Ｍ-Ｈ］-イオンの４００ｅＶ(Ｅｌａｂ)ＣＩＤスペクトル。上方パネル：ＬＴＤ４；中央パネル：ピークＩＶ；下方パネル：合成１４,１５-ＬＴＤ４。
【図５】１４,１５-ＬＴＡ４(２μＭ)と共に３０分インキュベートした後にＬ１２３６細胞によって生成された産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。１、３及び５の数は、それぞれ８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４、及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４に対する合成標準の保持時間に対応する。ピークＩ-ＩＶは図２のピークＩ-ＩＶと同じ保持時間及びＵＶスペクトルを有していた。挿入：ピークＶ下で溶出する物質のＵＶスペクトル。
【図６】ピークＶの物質の［Ｍ-Ｈ］-イオンの４００ｅＶ(Ｅｌａｂ)ＣＩＤスペクトル。上方パネル：ＬＴＥ４；中央パネル：ピークＶ；下方パネル：合成１４,１５-ＬＴＥ４。
【図７】１５-ＬＯ経路及び１４,１５-ロイコトリエン類(エオキシン類)の生合成のための示唆された経路の概観。
【図８ａ】アラキドン酸と共になされたＬ１２３６細胞のインキュベーション。ａ)４０μＭのアラキドン酸と共に行ったインキュベーション後の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成の時間経過。
【図８ｂ】アラキドン酸と共になされたＬ１２３６細胞のインキュベーション。ｂ)示されている様々な濃度のアラキドン酸と共に行った５分のインキュベーション後の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成の用量応答曲線。
【図９ａ】アラキドン酸(２０μＭ)と共に５分間なされたインキュベーション後にヒト好酸球細胞によって生成された産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。ａ)形成された産物のＨＰＬＣクロマトグラム。エオキシンＣ４、ＬＴＣ４、８,１５-ＤＨＥＴＥｓ(図２参照)及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥに対する合成標準との共溶出が示されている。
【図９ｂ】アラキドン酸(２０μＭ)と共に５分間なされたインキュベーション後にヒト好酸球細胞によって生成された産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。ｂ)合成エオシンＣ４と共溶出するピーク下の物質のＵＶスペクトル。
【図１０】ａ)エオシンＣ４と共溶出する物質、ｂ)合成エオシンＣ４及びｃ)合成ＬＴＣ４のポジティブイオンＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１１】好酸球を５、１０、２０及び４０μＭのアラキドン酸と共に、ａ)２分、ｂ)５分及びｃ)１０分インキュベートした。２回の別個の実験の平均。
【図１２ａ】切り取ったヒト鼻ポリープを４０μＭのアラキドン酸と共に５分間インキュベートした後にエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物を形成。
【図１２ｂ】合成エオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)と共溶出するピークの物質のＵＶスペクトル。
【図１３ａ】ヒト樹状細胞を４０μＭのアラキドン酸と共に５分間インキュベートした後にエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物を形成。
【図１３ｂ】合成エオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)と共溶出するピークの物質のＵＶスペクトル。
【図１４】免疫染色。ホジキンリンパ腫の患者からのリンパ節における１５-ＬＯの発現。ヒト１５-ＬＯの特異的ペプチド配列に対して産生されたポリクローナル１５-リピキシゲナーゼ抗血清と続いて二次ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いた。リード・シュテルンベルク細胞における強い染色が観察された(図の中央部分の多核細胞)。
【図１５】免疫染色。サルコイドーシスの患者からの肺バイオプシーにおける１５-ＬＯの発現。ヒト１５-ＬＯの特異的ペプチド配列に対して産生されたポリクローナル１５-リピキシゲナーゼ抗血清と続いて二次ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いた。類上皮細胞(肉芽腫)における強い染色が観察された。
【図１６】免疫染色。関節リウマチ患者のＡ)滑膜細胞及びＢ)軟骨細胞、Ｃ)アルツハイマー患者の脳皮質からの錐体細胞、及びＤ)星状細胞腫検体からの星状膠細胞の検体における１５-ＬＯの発現。
【図１７ａ】生成されたＧＳＴＭ１-１によるＡ)エオキシンＡ４(１４,１５-ＬＴＡ４)からエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)への代謝。
【図１７ｂ】生成されたＧＳＴＭ１-１によるＢ)ＬＴＡ４からＬＴＣ４への代謝。
【図１８】様々な可溶型グルタチオンＳ-トランスフェラーゼによるエオキシンＡ４(１４,１５-ＬＴＡ４)からエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)への代謝。
【図１９】好中球の細胞成分分画をＥｏｘＡ４(４０μＭ)と共に５分間インキュベートした後に形成された生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。Ａ)上清及びＢ)膜分画。
【図２０】ＥｏｘＡ４(１０μＭ)(上方パネル)ＬＴＡ４(１０ｍＭ)(中央パネル)又は両方(下方パネル)と共に３７℃で５分間インキュベートした後のヒト好酸球に形成された生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２１】エオキシンＣ４及びＬＴＣ４の形成に対する５-リポキシゲナーゼ阻害剤(ＢＷ７０Ｃ)及びＬＴＣ４シンターゼ阻害剤(ＭＫ８８６)の効果。３７℃で５分間のＡ２３１８７(１μＭ)及びアラキドン酸(１０μＭ)での刺激の前に阻害剤の不在下又は存在下で２分間プレインキュベートした。
【図２２】コンフルエントなウシ内皮細胞(最大効果７０％)を持つモデル系における減少した抵抗として測定した血漿漏出に対するエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)、エオキシンＤ４(１４,１５-ＬＴＤ４)、エオキシンＥ４(１４,１５-ＬＴＥ４)及びＬＴＣ４の効果。
【図２３ａ】ＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ａ．酸素フリーラジカルを生産するように刺激された(塗り潰し記号)又はＧＭ-ＣＳＦ処理された後に刺激された(白抜き記号)精製血液好中球。「ＢＬＸ-２６」はＢＬＸ-９２６を示すために使用する。
【図２３ｂ】ＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｂ：ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)はＧＭ-ＣＳＦ刺激好中球によって酸素フリーラジカルを誘導した。結果は全ラジカル生成を示し、コントロール(刺激細胞)の％として、また平均＋／−標準偏差、ｎ＝１３として表している。
【図２３ｃ】ＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｃ：散乱したプロットは、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)がＧＭ-ＣＳＦ刺激好中球により酸素フリーラジカルを誘導したことを示している。結果は１分当たりのカウント(ＣＰＭ×１０６),ｎ＝１３として測定された全ラジカル生成を示す。線は基準線(ｋ＝１)を示し、その線の上の観測は全て刺激に対するレスポンダーであることを示す。
【図２４ａ】ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ａ．酸素フリーラジカルを生産するように刺激された(塗り潰し記号)又はＩＬ-５処理された後に刺激された(白抜き記号)精製血液好酸球。「ＢＬＸ-２７」はＢＬＸ-９２７を示すために使用する。
【図２４ｂ】ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｂ：刺激及びＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２７)はＩＬ-５刺激好酸球によって酸素フリーラジカルを誘導した。結果は全ラジカル生成を示し、コントロール(刺激細胞)の％として、また平均＋／−標準偏差、ｎ＝６として表している。
【図２４ｃ】ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｃ：散乱したプロットは、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２７)がＩＬ-５刺激好酸球により酸素フリーラジカルを誘導したことを示している。結果は１分当たりのカウント(ＣＰＭ×１０６),ｎ＝６として測定された全ラジカル生成を示す。線は基準線(ｋ＝１)を示し、その線の上の観測は全て刺激に対するレスポンダーであることを示す。
【図２５ａ】実施例７及び図２７及び２８で試験した化合物の構造。
【図２５ｂ】実施例７及び図２７及び２８で試験した化合物の構造。
【図２６】エオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)及びエオキシンＤ４(１４,１５-ＬＴＤ４)の形成に対するロイコトリエン阻害剤ＥＴＹＡの効果。
【図２７ａ】エオキシンＣ４の形成に対する試験化合物の効果。
【図２７ｂ】エオキシンＣ４の形成に対する試験化合物の効果。
【図２８ａ】エオキシンＣ４及び１５-ＨＥＴＥの形成に対する試験化合物の効果の比較。ａ)化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ。
【図２８ｂ】エオキシンＣ４及び１５-ＨＥＴＥの形成に対する試験化合物の効果の比較。ｂ)化合物Ｄ、Ｆ及びＧ。
【図２９】単離されたヒト好酸球における新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の形成。単離された好酸球(１０×１０６細胞)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ)中に再懸濁させ、２分間プレインキュベートした後、３７℃で５分間アラキドン酸(１０μＭ)で刺激した。３容量のメタノールを加えて反応を終結させた。蒸発後、試料を移動相に再懸濁させ、移動相としてＡｃＮ：ＭｅＯＨ：Ｈ２０：ＨＡｃ(２９：１９：７２：０．８体積)ｐＨ５．６を使用するＲＰ-ＨＰＬＣ-ＵＶ系中での分析を行った。
【図３０ａ】新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の液体クロマトグラフィー-質量分析。パネルＡ：合成１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４標準と比較した好酸球により形成された代謝物ＩのＬＣ-ＭＳ／ＭＳスペクトル。上方パネルは、３７℃で５分間のアラキドン酸(１０μＭ)付与後に好酸球に形成された代謝物の６２６．３［Ｍ＋Ｈ］＋の生成物イオンスキャンのスペクトルを示す。中央パネルは合成１４,１５-ＬＴＣ４標準のスペクトルであり、下方パネルは合成ＬＴＣ４標準のスペクトルである。
【図３０ｂ】新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の液体クロマトグラフィー-質量分析。パネルＢ：１４,１５-ＬＴＤ４及びＬＴＤ４合成標準と比較した好酸球により形成された代謝物ＩＩのＬＣ-ＭＳ／ＭＳスペクトル。上方パネルは、３７℃で６０分間好酸球と共にインキュベートした１４,１５-ＬＴＣ４(１０μＭ)から形成された代謝物の４９７．２［Ｍ＋Ｈ］＋の生成物イオンスキャンのスペクトルを示す。中央パネルは合成１４,１５-ＬＴＣ４標準のスペクトルであり、下方パネルは合成ＬＴＣ４標準のスペクトルである。
【図３０ｃ】新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の液体クロマトグラフィー-質量分析。パネルＣ：１４,１５-ＬＴＥ４及びＬＴＥ４合成標準と比較した好酸球により形成された代謝物ＩＩＩのＬＣ-ＭＳ／ＭＳスペクトル。上方パネルは、３７℃で６０分間の好酸球と共にインキュベートした１４,１５-ＬＴＣ４(１０μＭ)から形成された代謝物の４４０．２［Ｍ＋Ｈ］＋の生成物イオンスキャンのスペクトルを示す。中央パネルは合成１４,１５-ＬＴＣ４標準のスペクトルであり、下方パネルは合成ＬＴＣ４標準のスペクトルである。
【図３１】衝突は１４,１５-ロイコトリエン類をシステイニルロイコトリエンから区別する解離断片を誘導した。陽イオンモードのＭＳ／ＭＳ生成物イオンスペクトルにおけるシステイニルロイコトリエン類と１４,１５-ロイコトリエン類の顕著な差はｍ／ｚ１８９及び２０５である。これらの断片イオンの推定起点を示す。
【図３２ａ】１４,１５-ロイコトリエン類によって誘導された血管透過性の変化。パネルＡ：１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４、ＬＴＣ４(１０-８Ｍ)及びヒスタミン(１０-５Ｍ)に応答した内皮細胞障壁機能における急速な変化の解析。分析は内皮細胞単層の各側に電極を配した経内皮電気抵抗(ＴＥＥＲ)の連続的記録によって達成した。このモデルの最大効果は-７０％の抵抗変化である。５回のうち２回の典型的な実験が実証される。各値は３通りの測定の平均値である。
【図３２ｂ】１４,１５-ロイコトリエン類によって誘導された血管透過性の変化。パネルＢ：ＬＴＤ４(１０-８Ｍ)と比較した、１４,１５-ＬＴＤ４(それぞれ１０-８Ｍ及び１０-７Ｍ)によって引き起こされる内皮細胞障壁機能の変化の時間経過。
【図３３】１４,１５-ロイコトリエン類(エオキシン類)の形成に対して提案する代謝経路。
【実施例】
【００５６】
実施例１：１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４、及び１４,１５-ＬＴＥ４(つまりエオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４)の生合成の証明。
材料と方法
合成１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)、１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１０(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)、１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)、１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ),１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ又は１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１１,１３(Ｚ,Ｚ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＥＴＥ)、１２(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１４エイコサテトラエン酸(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｚ)(１２(Ｓ)-ＨＥＴＥ)及び１３(Ｓ)-ヒドロキシオクタデカ-９,１１(Ｚ,Ｅ)-ジエン酸(１３(Ｓ)-ＨＯＤＥ)はＢｉｏｍｏｌｅ社(Plymouth Meeting, USA)から入手した。細胞培養培地RPMI 1640、仔ウシ血清、ペニシリン、ストレプロマイシン及びグルタミンはＧｉｂｃｏ,ＢＲＬから購入した。ＨＰＬＣ溶媒はＲａｔｈｂｕｒｎケミカルズ社 (Walkerburn, United Kingdom)から得た。
【００５７】
Ｌ１２３６細胞株
細胞株Ｌ１２３６は混合細胞性サブタイプのホジキンリンパ腫(ＨＬ)に罹患した患者の末梢血から元々は生産した１５。細胞は３７℃で５％のＣＯ２の雰囲気下で懸濁させて増殖させた。培養培地は、１０％の仔ウシ血清及び２ｍＭのグルタミンを補填した１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０であった。
【００５８】
実験条件及びＨＰＬＣ分析
細胞懸濁液を２００×ｇで５分間、遠心分離し、ペレットをＰＢＳ中に懸濁させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を１０-２０×１０６細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に溶解させた。試料を３７℃で２分間前もって温めた後、アラキドン酸、１４,１５-ＬＴＡ４又は他の示された代謝物を添加し、続いて示された期間、インキュベートした。インキュベーションは３容量の氷冷メタノールの添加により終結させた。沈殿したタンパク質と細胞断片を遠心分離によって除去し、過剰の水とエタノールを減圧下で蒸発させた。残留物をメタノールに溶解させ、ｍ試験管に移し、窒素流下で乾固させた。続いて、残留物を以下に記載するクロマトグラフィー溶剤で再構成させた。試料をオクタデシル逆相カラム(Chromabond, C18, 100mm, Macherey-Nagal, Duren, Germany)に充填し、０．４ｍｌ／分の流量で溶出させた。移動相は、システイニル含有アラキドン酸代謝物及びジヒドロキシ酸又はモノヒドロキシ酸それぞれの分析に対して、アセトニトリル／メタノール／水／酢酸(体積で２８：１８：７２：０．８、ｐＨは３０％ＮａＯＨで５．６に調整)又はメタノール／水／酢酸(体積で７２．５：２７．５：０．０１)であった。溶出した代謝物を、プログラム可能なＷａｔｅｒｓ９９１ダイオードアレイ分光光度計を使用して検出し定量した。
【００５９】
陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析
スペクトルを、記載されたように１６、衝突ガスとしてＸｅを用いて４００ｅＶの実験室フレーム衝突エネルギーでハイブリッド磁気セクター／飛行時間型タンデム機器に記録した。
【００６０】
結果
アラキドン酸と共にＬ１２３６細胞を１０分間インキュベートすると、主要産物が得られ、これを合成１５(Ｓ)-ＨＥＴＥと共に同時にクロマトグラフィーにかけた(図１)。また、合成１２(Ｓ)-ＨＥＴＥと共溶出した２３６ｎｍの最大ＵＶ吸光度のマイナーなピークを観察した。これらのピークの物質のＵＶスペクトルはそれぞれ１５-ＨＥＴＥ及び１２-ＨＥＴＥに対して報告されたスペクトルと一致している。１５-ＨＥＴＥ対１２ＨＥＴＥの比は約９：１であり、これはこれらの産物の１５-ＬＯの１型に触媒された形成と一致している５。これらの結果は、細胞が１５-ＬＯの１型の活性を有しているが５-リポキシゲナーゼ活性を有していないことを証明している。リノール酸は優れた基質であり、Ｌ１２３６細胞はリノール酸を１３-ＨＯＤＥに効率的に代謝したが(データは示さず)、これはこれらの細胞における１５-ＬＯの１型の発現に一致している。超音波処理細胞を抗１５-ＬＯウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロットが続くＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析すると、網状赤血球１５-ＬＯと共遊走した免疫反応性バンドが現れた(データは示さず)。
【００６１】
２３６ｎｍのＵＶを吸収するピークに加えて、約２７０ｎｍの最大ＵＶ吸光度と５-７分の保持時間を持つ多数のピークがクロマトグラムに観察された。アセトニトリルベースの移動相を使用してこれら産物を分離した。図２ａはアラキドン酸と共に１０分のインキュベーションを行った後に形成された生成物の典型的なＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。コンジュゲートトリエンスペクトルと２７２ｎｍに最大ＵＶ吸光度を含む５つのピーク(１-５)が観察された。これらのピークはそれぞれ８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ；８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥの合成標準に対応する溶出時間を有していた。これら生成物のパターンはアラキドン酸と共にインキュベートしたヒト気道上皮について報告されたものと殆ど同一であった17。しかしながら、クロマトグラム中の２つの更なる主要なピークはまたコンジュゲートトリエンスペクトルを有していたが、２８２ｎｍ(ＩＩ及びＩＶ)に最大ＵＶ吸光度を有していた(図２ｂ)。溶出物質を集め、陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって分析した。図３はピークＩＩ(中央パネル)からの物質の[Ｍ-Ｈ]イオンの衝突解離(ＣＩＤ)スペクトルを示す。質量スペクトルは、ＬＴＣ４に見出されなかったイオンｍ／ｚ３０６の存在を除いて、６２４に分子イオンを持ち、ＬＴＣ４(上方パネル)と殆ど同一であった。これらの細胞における観察された１５-ＬＯ活性に鑑みると、質量スペクトルは、代謝物が１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)であることを示している。生成物が確かに１４,１５-ＬＴＣ４であったことを確認するために、合成１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸を調製した。この合成代謝物の質量スペクトル(図３、下方パネル)はピークＩＩの物質のスペクトルと同一であった。他の主要な代謝物ピークＩＶの［Ｍ-Ｈ］-イオンの対応するＣＩＤスペクトルを図４に示す。この質量スペクトルは、ＬＴＤ４に見出されなかったイオン２５０及び２５１の存在を除いて、同じ分子イオンｍ／ｚ４９５を持つＬＴＤ４のスペクトルと非常に類似しており、代謝物が１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)であることを示している。合成１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸の[Ｍ-Ｈ]-イオンの対応するＣＩＤスペクトルは代謝物ＩＶのスペクトルとまた同一であった(図４、下方パネル)。更に、合成１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４はＲＰ-ＨＰＬＣでそれぞれ代謝物ＩＩ及びＩＶと正確に共溶出した。合成１４,１５-ＬＴＣ４と共に細胞をインキュベートすると１４,１５-ＬＴＤ４が形成された(データは示さず)。また、コンジュゲートトリエンスペクトルと２７８ｎｍに最大ＵＶ吸光度を持つ二つの他のマイナーなピークが観察された(図２ａ及びｂ、ピークＩ及びＩＩＩ)。ピークＩＩＩの物質を陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって分析した。この代謝物のＣＩＤスペクトルは１４,１５-ＬＴＤ４のＣＩＤスペクトルと同一であった(データは示さず)。この代謝物の正確な構造は確認されなかった。しかしながら、この代謝物のＣＩＤスペクトル及びＵＶプロファイルは、スペクトルが１４,１５-ＬＴＤ４のスペクトルと比較して４ｎｍ低色素的にシフトしているので、オールトランストリエン構造と一致している。従って、ピークＩＩＩの物質はおそらくは８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＤ４である。ピークＩの物質は質量スペクトルを得るには不十分であったが、８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＤ４の形成に沿って、該代謝物は８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＣ４である可能性が非常に高い。更に、細胞を合成１４,１５-ＬＴＣ４又は１４,１５-ＬＴＤ４と共にインキュベートするとそれぞれ代謝物Ｉ及びＩＩＩが形成され、これは、親１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４から想定されたオールトランストリエンが形成されたことを裏付けている(データは示さず)。
【００６２】
１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成機構及び二重結合構造を解明するために、細胞を２μＭの合成１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,ＥＥ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)と共に３０分インキュベートした。図５は細胞によって産生された生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。２７２ｎｍに最大ＵＶ吸光度とコンジュゲートトリエンスペクトルを有する３つのピークが観察された(ピーク１、３及び５)。これらの生成物はまた細胞をアラキドン酸と共にインキュベートしたときにも形成され(図２ａ)、生成物をそれぞれ合成８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４と同時にクロマトグラフィーにかけた。コンジュゲートトリエンスペクトルと２８２ｎｍに最大ＵＶ吸光度を持つ３つのピークが観察された(ピークＩＩ、ＩＶ及びＶ)。代謝物ＩＩ及びＩＶは、ＨＰＬＣでそれぞれ合成１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４と同一の保持時間を有しており、これらの代謝物が１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４であったことを裏付けている。ピークＶの物質はコンジュゲートトリエンを含み、２８２ｎｍに最大吸光度を有していた。この代謝物は、細胞をアラキドン酸と共にインキュベートしたときは(図２ａ)、二重二原子酸素添加産物８,１５-ＤＨＥＴＥとのＨＰＬＣでの共溶出のために、検出されなかった。この後者の生成物は１４,１５-ＬＴＡ４からは形成されないので、代謝物ＶはＨＰＬＣクロマトグラムで可視でき、二重二原子酸素添加産物の後ろに隠れてはいない。細胞を合成１４,１５-ＬＴＤ４と共にインキュベートしたとくに代謝物Ｖがまた形成された(データは示さず)。合成１４,１５-ＬＴＤ４と共に細胞をインキュベートした後に形成されたピークＶの物質を陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって分析した。図６は、ピークＶの物質の質量スペクトルが合成１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)のスペクトルと同一であったことを示している。代謝物ＶはまたＨＰＬＣで合成１４,１５-ＬＴＥ４と同じ保持時間を有していた。また、より少量の８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＣ４(ピークＩ)及び８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＤ４(ピークＩＩＩ)が１４,１５-ＬＴＡ４と共にインキュベートした後に細胞によって生産された。
【００６３】
１５-ＬＯ経路及び１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４の生合成のための示唆された経路の概観を図７に示す。
アラキドン酸(４０μＭ)と共になされたインキュベーション後の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成の時間経過を図８ａに示す。実質的な量の１４,１５-ＬＴＣ４、３７ｐｍｏｌ／１０６細胞が、アラキドン酸と共に３０秒インキュベートした後に既に１０×１０６細胞によって生産された。１４,１５-ＬＴＣ４の最大レベルが５分のインキュベーション後に観察され、その後１４,１５-ＬＴＣ４のレベルは時間と共に減少した。測定可能な量の１４,１５-ＬＴＤ４がアラキドン酸と共にインキュベートした２分後に観察され、レベルは時間と共に増加し、３０分後に最大レベルに達した。８,１５-ＤＨＥＴＥはこのＨＰＬＣ系において１４,１５-ＬＴＥ４と同時にクロマトグラフィーにかけたので、この実験において１４,１５-ＬＴＥ４のレベルを測定することができなかった。アラキドン酸からの１４,１５-ロイコトリエン類の形成についての用量応答曲線は、有意な量の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４が５μＭのアラキドン酸濃度で既に形成されたことを示している(５分のインキュベーション時間；図８ｂ)。これらの代謝物のレベルはアラキドン酸濃度と共に増加し、４０μＭのアラキドン酸においてプラトーに達した。
１４,１５-ＬＴＣ４；１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４はそれぞれエオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４と命名した。
【００６４】
実施例２：他の細胞及び組織におけるエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)の生合成の証明
材料と方法
ヒト好酸球の単離
静脈血(１００ｍｌ)を、健常な志願者又は好酸球増加症候群(ＨＥＳ)を含む好酸球増加症、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)及びある種の炎症疾患の患者からから採血した。４００×Ｇで１５分間、最初の遠心分離を実施した。上相を捨て下相を集め、室温で３０分間、Ｄｅｘｔｒａｎ(商標)沈降を施した。沈降後、白血球細胞を含む上相を４００×Ｇで１０分間、一回遠心分離した。ペレットを溶解バッファーに懸濁させ、室温で３０分インキュベートして混入した赤血球を除去した。インキュベーション後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(商標)を用いて密度勾配遠心分離を実施した。好中球と好酸球を含む多形核(ＰＭＮ)画分を集め、磁気細胞分離(ＭＡＣＳ)を施した。好酸球は、磁気ミクロビーズに結合させたＣＤ１６抗体を使用するネガティブ選択によって単離した。純度は、形態学的検査とメイ・グリューネバルト-ギムザ溶液での染色によって確認した。純度は常に９５％を越えていることが見出された。
【００６５】
細胞のインキュベーション
単離された好酸球(５−１０×１０６／試料)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ／試料)に再懸濁させ、３７℃でイオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)、アラキドン酸(５、１０、２０又は４０μＭ)又は双方で２、５又は１０分、刺激する前に３７℃で２分間、プレインキュベートした。反応を３容量のメタノールの添加により終結させた。
【００６６】
１５-リポキシゲナーゼ生成物の分析
細胞片及びタンパク質を除去するために、遠心分離を実施した。上清を減圧下で蒸発させ、残留物をメタノールに溶解させ、試験管に移した。ついで、試料を窒素流下で蒸発乾固させ、最後に２００μｌの移動相(アセトニトリル：メタノール：Ｈ２Ｏ：酢酸、２９：１９：７２：０．８、ｐＨは５．６にＮＨ３で調整)に再懸濁させた。抽出された試料に、記載されたようにして逆相ＨＰＬＣ系での分析を施した。簡単に述べると、試料をオクタデシル逆相カラム(Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ Ｃ１８,Ｍａｃｈｅｒｅｙ-Ｎａｇｅｌ,Ｄｕｒｅｎ,Ｇｅｒｍａｎｙ)に充填し、溶出流量は１．２ｍｌ／分であった。溶出した化合物を、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【００６７】
質量分析
質量分析を実施例１に記載されるようにして実施した。
結果
ヒト好酸球中でのエオキシンＣ４の生合成
ＨＰＬＣによって分析した場合、コンジュゲートトリエンスペクトルを持つ一つのピーク(最大吸光度２８２ｎｍ)がアラキドン酸と共に行ったインキュベーション後に観察された(図９ａ及びｂ)。生成物を合成１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(ＥｏｘＣ４)と共にクロマトグラフィーにかけた。得られた生成物の同一性を確保するために、タンデム質量分析を実施した。代謝物のＭＳ／ＭＳスペクトルはＥｏｘＣ４のものと本質的に同一であった(図１０)。ホジキン細胞株Ｌ１２３６に対して示された生成物プロファイルとは異なり、好酸球は直ぐにはＥｏｘＣ４をＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４に転換しなかった。
【００６８】
１５-リポキシゲナーゼの発現に加えて、好酸球はまた５-リポキシゲナーゼを発現し、これがロイコトリエン類を生成する。用量応答実験を、ＥｏｘＣ４生成の実験条件を最適化するために実施した。またＥｏｘＣ４及びＬＴＣ４の形成の時間経過を調べた(図１１)。しかしながら、エオキシンＤ４もエオキシンＥ４も５分のインキュベーション後に検出されなかった。
総括すると、該結果は、好酸球が外因性アラキドン酸をＥｏｘＣ４に直ぐに転換させることを証明している。
【００６９】
ヒト鼻ポリープ組織におけるエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)の生合成
気道上皮源は鼻ポリープの外科検体である。切り取ったヒト鼻ポリープをアラキドン酸(４０μＭ)と共に５分間インキュベートすると、１４,１５-ＬＴＣ４及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物が形成された(図１２ａ)。合成１４,１５-ＬＴＣ４と共に共溶出した物質のＵＶスペクトルは特徴的なトリエンスペクトルを示した(図１２ｂ)。
【００７０】
ヒト樹状細胞におけるエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)の生合成
成長因子とインターロイキン-４の存在下でのバフィーコート細胞(白血球)の分離と培養によって樹状細胞を得た。単離細胞は樹状細胞の特徴的な機能と形態を示した。これらの細胞をアラキドン酸(４０μＭ)と共に５分間インキュベートすると、主として８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥの形成に至ったが、有意な量の１４,１５-ＬＴＣ４も形成された(図１３ａ)。１４,１５-ＬＴＣ４の同定はまたＵＶ分光法に基づいた(図１３ｂ)。
【００７１】
実施例３：１５-ＬＯを発現する細胞の同定
気道呼吸器上皮、好酸球、肥満細胞、及びマクロファージにおける先に記載された１５-ＬＯ発現に加えて、本発明者等は、(ヒト１５-ＬＯに対して産生された抗体を使用して)数種の正常なまた病理組織における１５-ＬＯの発現を証明した。１５-ＬＯはホジキンリンパ腫(ＨＬ)の患者からのリンパ節において発現することが見出された。ＨＬの１３／１５例において、１５-ＬＯの発現がリード・シュテルンベルク細胞において検出された(図１４)。非ホジキンリンパ腫の何れの例でも染色はなかった。サルコイドーシスの患者からのバイオプシーは、類上皮細胞(肉芽腫)における１５-ＬＯの強い染色を裏付けた。結果は、全ての類上皮細胞が１５-ＬＯを発現することを示唆している。類上皮細胞はクローン病、ＴＢＣ及び数タイプの血管炎の患者の肉芽腫において見出される。１５-ＬＯを発現することが見出された他の細胞型は、関節リウマチ患者からの滑膜細胞(図１６ａ)及び軟骨細胞(図１６ｂ)、アルツハイマー患者の脳皮質からの錐体細胞(図１６ｃ)、及び星状細胞腫検体からの星状膠細胞(図１６ｄ)(正常組織ではない)を含んでいた。
総括すると、該結果は、１５-ＬＯと、この経路を通して形成された代謝物がこれらの疾患の病態生理に関与していることを示している。
【００７２】
実施例４：Ｌ１２３６細胞においてエオキシンＡ４(１４,１５-ＬＴＡ４)をエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)に転換する酵素の同定
方法
細胞培養
細胞培養は実施例１に記載されているようにして実施した。
ヒト好酸球の単離
ヒト好酸球の単離は実施例２に記載されているようにして実施した。
ＲＴ-ＰＣＲ分析
好酸球からのｍＲＮＡの単離と続くＲＴ-ＰＣＲ分析を標準的な方法によって実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩ(ＭＧＳＴＩ)、ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩＩ(ＭＧＳＴＩＩ)、ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩＩＩ(ＭＧＳＴＩＩＩ)及びβ-アクチン(陽性コントロール)
相補的であった。
【００７３】
細胞のインキュベーション
単離された好酸球(５-１０×１０６／試料)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ／試料)に再懸濁させ、３７℃で５分間、ＥｏｘＡ４(１０μＭ)、ＬＴＡ４(１０μＭ)又は双方で刺激する前に３７℃で２分間、プレインキュベートした。あるいは、阻害剤の研究では、好酸球を、イオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)及びアラキドン酸(４０μＭ)で３７℃で５分間刺激する前にＢＷ７０Ｃ(１μＭ)又はＭＫ８８６(１０μＭ)の存在下で３７℃で２分間、プレインキュベートした。反応はメタノール３容量の添加によって終結させた。代謝物は、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【００７４】
酵素研究
ＥｏｘＡ４からＥｏｘＣ４への転換におけるグルタチオントランスフェラーゼの可能な関連を探究するために、組換え酵素(１μｇ)をＥｏｘＡ４(１００μＭ)及びグルタチオン(５ｍＭ)と共に３７℃で５分間インキュベートした。反応を１容量の停止液(ＡｃＮ：ＭｅＯＨ：ＨＡｃ,体積５０：５０：１)の添加により終結させ、ＥｏｘＣ４を、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【００７５】
結果
ホジキン細胞株Ｌ１２３６においてＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換する酵素の単離、精製及び特徴付け
Ｌ１２３６細胞を標準的な手順によって細胞成分分画し、酵素活性を含む細胞質画分をグルタチオンセファロースカラムに充填した。結合物質をグルタチオンバッファー勾配によって溶出させた。溶出された画分を酵素活性について試験し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで実施した。２８ｋＤのおよそのＭｗを持つ一つの単一バンドを得た。アミノ酸解析(ＰＡＣ)、ｃＤＮＡ配列解析及びＢＬＡＳＴ検索により、得られたバンドの同定は可溶型グルタチオントランスフェラーゼＭ１ｂ-１ｂ(ＧＳＴＭ１ｂ-１ｂ)であった。組換えＧＳＴＭ１ｂ-１ｂはＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換したが、同一条件下ではＬＴＡ４をＬＴＣ４に代謝しなかった(図１７Ａ及びＢ)。
【００７６】
ヒト可溶型グルタチオントランスフェラーゼファミリーのスクリーニング
ＧＳＴＭ１ｂ-１ｂはヒト可溶型グルタチオントランスフェラーゼファミリーのメンバーであるので１９、ＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４へ転換する可溶型グルタチオントランスフェラーゼの能力を調べた。ＧＳＴＭ１ｂ-１ｂに加えて、ＧＳＴＰ１-１の二つのアイソフォーム(Ｖａｌ１０５及びＩｌｅ１０５)がＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換する大きな能力をまた有していたことが証明された(図１８)。
【００７７】
好酸球におけるＥｏｘＣ４シンターゼ活性の局在化
可溶型グルタチオントランスフェラーゼが好酸球におけるＥｏｘＣ４形成に関与するかどうかを調べるために、単離されたヒト好酸球の細胞成分分画を調製し、ＥｏｘＡ４と共にインキュベートした。Ｌ１２３６とは異なり、ＥｏｘＣ４シンターゼ活性は好中球の膜画分に殆ど完全に局在化した(図１９)。
【００７８】
好酸球における「酵素Ｘ」の特徴付け
好酸球中のＥｏｘＣ４シンターゼ活性は膜画分にあったので、本発明者等はこの点における膜結合性グルタチオントランスフェラーゼの関与を調べた。
ＭＡＰＥＧ(エイコサノイド及びグルタチオン代謝における膜結合型タンパク質(Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism))スーパーファミリー２１のメンバーはＬＴＣ４シンターゼ、ＦＬＡＰ(５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質)、ＰＧＥシンターゼ、ＭＧＳＴＩ(ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩ)、ＭＧＳＴＩＩ及びＭＧＳＴＩＩＩ(３)である。ＰＣＲ解析は、好酸球はＭＧＳＴＩＩ及びＭＧＳＴＩＩＩをコードするｍＲＮＡを有する一方、ＭＧＳＴＩをコードするｍＲＮＡは観察されなかったことを明らかにした。先の研究から、好酸球がＦＬＡＰとＬＴＣ４シンターゼを有していることは知られている。
【００７９】
ＥｏｘＡ４及びグルタチオンと共にＭＡＰＥＧファミリーメンバーをインキュベートすることにより、ＬＴＣ４シンターゼだけがＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換する能力を有していることが示された(データは示さず)。
ＬＴＣ４シンターゼは伝統的にＬＴＡ４からグルタチオン含有ロイコトリエン(ＬＴ)Ｃ４を生合成する際の重要な酵素であることが知られている。ＬＴＡ４は５-リポキシゲナーゼ経路を介して合成される。好酸球は５-リポキシゲナーゼ及び１５-リポキシゲナーゼ活性を共に有しており、ＬＴＣ４シンターゼがＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４へ転換することができる唯一のＭＡＰＥＧファミリーメンバーであるという結果は、ＬＴＣ４シンターゼが二重の活性：ＬＴＣ４及びＥｏｘＣ４合成を備えていることを示唆している。ＬＴＣ４シンターゼがＥｏｘＣ４形成においてもまた重要な酵素であるという仮説を試験するために、単離した好酸球をＥｏｘＡ４(１０μＭ)、ＬＴＡ４(１０μＭ)、又は双方と共に３７℃で５分間インキュベートした(図２０)。
【００８０】
好酸球をＥｏｘＡ４と共にインキュベーションするとＥｏｘＣ４が生合成される一方、好酸球をＬＴＡ４と共にインキュベーションするとＬＴＣ４を生じる。細胞を双方の基質と共にインキュベートすると、ＬＴＣ４とＥｏｘＣ４がおよそ９：１の比で生産された。これはこれらの基質に対するＬＴＣ４シンターゼの過去に報告された親和性と一致している２０。
ＬＴＣ４シンターゼがまた好酸球においてＥｏｘＣ４シンターゼとしてまた作用するという知見を更に裏付けるために、発明者等は阻害研究を実施した。
【００８１】
ＢＷ７０Ｃは５-リポキシゲナーゼ阻害剤で、ＭＫ８８６はＦＬＡＰ阻害剤であり、これらは高い(１０μＭ)濃度で使用される場合、ＬＴＣ４シンターゼをまたブロックする(図２１)。ＢＷ７０Ｃの存在下でのプレインキュベーションがＬＴＣ４ピークを完全に消滅させ、ＭＫ８８６の存在下でのプレインキュベーションがまたＥｏｘＣ４合成を阻止した。これらの結果は、ＬＴＣ４シンターゼが好酸球中でのＥｏｘＣ４形成における重要な酵素であることを更に裏付けている。
【００８２】
実施例５：ヒト１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)によって形成される脂質ヒドロペルオキシドの検出のためのアッセイ
ここに記載されたアッセイは、ジフェニル-１-ピレニルホスホン(ＤＰＰＰ)をホスフィンオキシドに酸化する脂質ヒドロペルオキシドの能力を利用する(以下のスキームを参照のこと)。ジフェニル-１-ピレニルホスホンは酸化されるまでは非蛍光化合物である。ＤＰＰＰの酸化は蛍光化合物を生じ、これは温度に感受性がなく、少なくとも６０分間安定である。
【００８３】
【００８４】
材料
ジフェニル-１-ピレニルホスホン(ＤＰＰＰ)(Ｄ-７８９４)はMolecular Probesから購入している。コール酸はSigmaから、リノール酸はBiomolから、ＰＢＳはGibco Life Technologiesから購入している。蛍光はMolecular Devices製の二重走査型マイクロプレート分光蛍光光度計Spectramax Geminiを用いて測定する。Spectramax Gemini分光蛍光光度計はキセノンランプと二つのホログラフィック回折格子モノクロメータを使用する。３８４ウェルまでのマイクロプレートを分光蛍光光度計と共に使用することができる。蛍光の検出は、ウェル中の試料の深さ全体に亘ってウェルの上面から達成される。
【００８５】
全ての試薬は、フルオロフォア(ＤＰＰＰ)及び基質、リノール酸を除いてそのまま使用できる濃度で提供される。ＤＰＰＰは粉末として提供され、-２０℃で保存されなければならず、光から十分に保護されなければならない。リノール酸はエタノール中の１００ｍＭ原液として供給される。酵素調製物は凍結アリコートとして提供される。
【００８６】
酵素はバキュロウイルスを使用して発現され、スポドプテラ・フルギペルダ細胞(Ｓｆ９)から部分的に精製され、トリス-ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、７５ｍＭのＮａＣｌ及び５％グリセロールで送達される。精製された酵素は-７０℃で少なくとも５ヶ月まで安定である。３回までの凍結解凍サイクルは酵素活性に影響を与えないと思われる。しかしながら、酵素の凍結解凍サイクルは、必ずしも必要ではないなら、避けなければならない。酵素を凍結し実験の直前でＰＢＳに希釈する。希釈した酵素は同じ日中に使用されなければならない。
【００８７】
ＤＰＰＰ(粉末)を、０．２５ｍＭの最終濃度までエタノール及び２-ブタノール(１：１の比)に溶解させた。この溶液をボルテックスして混合し、続いて＋４℃で超音波水浴で１０秒間超音波処理してＤＰＰＰを完全に溶解させた。この溶液は実験が実施される日には新鮮でなければならない。該溶液は遮光されなければならない。
【００８８】
脂質ヒドロペルオキシド検出のためのジフェニル-１-ピレニルホスフィン法
アッセイは室温(２０-２２℃)で９６ウェルの全て黒のプレートで実施される。各ウェルは、５００μＭのコール酸と１５-ＬＯ酵素(プレミックス)を補填したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)からなる４５μｌを含む。阻害剤(１μｌ)又はビヒクル(ＤＭＳＯ)を、基質である５μｌの１ｍＭリノール酸の添加の５-１５分前に添加する。ついで、プレートを室温で２０分間インキュベートする。酵素反応を５０μｌのメタノールの添加によって終結させる。プレートは、脂質ヒドロペルオキシドの有意な損失なしに６０分までの間、室温で保存することができる。５０μｌの２５μＭ ＤＰＰＰ溶液を加え、プレートを室温でインキュベートする。３０-６０分後、蛍光は、３５５ｎｍの励起波長と３８０ｎｍの発光波長を使用して読み取ることができる。
水溶液中でのＤＰＰＰの低い自動酸化のため、ブランクの一つは酵素反応のものと同じ比でバッファー、メタノール及びＤＰＰＰを含まなければならない。
【００８９】
実施例６：エオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４(１４,１５-ＬＴＣ４、１４-１５-ＬＴＤ４、１４-１５-ＬＴＥ４)の生物学的効果の証明
実施例６ａ：内皮細胞障壁機能の評価
材料と方法
内皮細胞アッセイ
ウシ大動脈内皮細胞(ＢＡＥＣ)及びヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を単離しウシ血清又はヒト血清と共に培養した。第一から第五継代のＢＡＥＣ又はＨＵＶＥＣを、短時間(２分)のトリプシン-ＥＤＴＡ処理(０．２５％のトリプシン／０．０１％のＥＤＴＡ)によって剥離させ、３．０μｍの孔径のポリカーボネートフィルター(Tissue Culture inserts, 10mm; NUNC, Roskilde, Denmark)上又は目視検査のために０．２μｍの孔径のAnopore無機膜(濡れると透明)に再び蒔いた。細胞分化を促進させ、ＥＣの付着を向上させるために、フィルターを５０μｌのＢｉｏｍａｔｒｉｘ Ｉ(１６７μｇ／ｍｌ)で前処理し、空気乾燥させた。ＥＣをフィルター当たり２×１０５細胞の密度で播種し、空気中に５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で培養培地中でインキュベートした。透明な０．２μｍの孔径のフィルターで単層に亘る電気抵抗を測定し、毎日顕微鏡で観察して評価して、ＥＣをコンフルエントな単層になるまで増殖させた。これらの実験条件下で播種後７日で最大の抵抗が得られ、ついでその日にＥＣ単層を実験に使用した。
【００９０】
ＥＣ障壁機能の測定
様々なアラキドン酸代謝物に応答した内皮細胞(ＥＣ)障壁機能の迅速な変化を、ＥＣ単層の各側の電極での経内皮電気抵抗(ＴＥＥＲ)の連続的記録によって分析した１８。ＴＥＥＲの測定では、ＥＣを有するフィルターインサートを、繰り返し測定の間に互いのかつフィルターインサートに対しての電極の正確な位置決めを達成するように変更された抵抗測定チャンバー(Endohm-12, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)に移した。チャンバー(下方コンパートメント)及びフィルターインサート(上方コンパートメント)にそれぞれ２ｍｌ及び４００μｌの培養培地を満たした。全ての測定は細胞培養インキュベーター中に配した装置で３７℃にて行った。電気抵抗の直接の読みが抵抗チャンバーの電極に接続したオーム計(Evom, World Precision Instruments, Sarasota, FL, US)によって与えられた。個々のＥＣ単層の電気抵抗は、ＥＣの播種前に測定したBiomatrixでコートされた対応する裸のフィルターの抵抗を減算することによって得られた。よって、ＴＥＥＲ値はＥＣ単層の抵抗を表し、隣接する内皮細胞間の密着結合の発生に依存する。
【００９１】
結果
１４,１５-システイニル-含有ロイコトリエン類(エオキシン類)の生物学的効果
血管透過性の増加は炎症のマーカーであり、システイニル含有ロイコトリエン類がヒスタミンとブラジキニンと同じ形で特異的血漿漏出を引き起こすことであることはよく知られている。５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有ロイコトリエン類とは異なり、ＥｏｘＣ４とその代謝物はモルモット肺実質性条片又は回腸への収縮効果を有していないように思われる。ＥｏｘＣ４とその代謝物ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の血漿漏出を引き起こす能力を探索するために、内皮細胞障壁機能における迅速な変化を登録するためのモデル系を構築した。発明者等は、３種の１４,１５-システイニル含有ロイコトリエン類が全て血管透過性を増大させたことを見出した。化合物の１０-７及び１０-８Ｍの濃度はＴＥＥＲの有意な変化を誘導した。比較すると、ＥｏｘＣ４、Ｄ４及びＥ４は最も強力な５-リポキシゲナーゼ誘導ロイコトリエン類より約５倍から１０倍弱かったがこの点ではヒスタミンより１００倍以上強かった(図２２)。
【００９２】
実施例６ｂ：白血球の酸化的代謝に対するエオキシン類の効果
好中球及び好酸球による酸化的代謝は様々な薬剤、例えば酢酸ミリスチン酸ホルボール(ＰＭＡ)、血小板活性化因子(ＰＡＦ)、血清処理ザイモサン(ＳＴＺ)、免疫グロブリン又はロイコトリエン類(ＬＴＢ４)によって、またサイトカイン、例えばＩＬ-５及びＧＭ-ＣＳＦによって誘導できる。薬物刺激(プライミング)は、細胞を活性化しないで、刺激に対する細胞の増加した応答性をもたらすプロセスを意味する。細胞の薬物刺激状態を生じる機構はなお不確かであるが、造血性サイトカインＩＬ-３、ＩＬ-５及びＧＭ-ＣＳＦは好酸球と好中球をインビトロで薬物刺激することが知られている。しかしながら、ＩＬ-５だけはヒト血液好酸球の選択的活性化因子であることが示されており、ＩＬ-３及びＧＭ-ＣＳＦは好酸球と好中球の双方に作用しうる。
【００９３】
材料と方法
好中球及び好酸球顆粒球を、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配及び磁気細胞分離システム(ＭＡＣＳ)を使用して末梢全血から精製した。
顆粒球にＩＬ-５(１０．５ｎｇ／ｍＬ)又はＧＭ-ＣＳＦ(１０．５ｎｇ／ｍＬ)の何れかで３７℃で３０分薬物刺激を与え、続いてＩＬ-５(１００ｎｇ／ｍＬ)、ＧＭ-ＣＳＦ(１００ｎｇ／ｍＬ)、ＬＴＢ４(１０-７Ｍ)又はエオキシン(１０-８-１０-６Ｍで刺激した。酸化的代謝をルシゲニン増強化学発光(ＣＬ)アッセイによって測定した。
使用した試験化合物はＥｏｘＣ４(ＢＬＸ-９２５)、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)、ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)であった。
【００９４】
結果
非薬物刺激好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝
精製した好中球を、好中球に対する異なったエオキシン類の刺激効果との比較のために、酸化的代謝の二つの既知の活性化因子であるサイトカインＧＭ-ＣＳＦ及びＬＴＢ４を用いて刺激した。双方の活性化因子が非薬物刺激好中球による酸素フリーラジカル生成を誘導したが、何れのエオキシン類も非薬物刺激血液好中球による酸素フリーラジカル生成を誘導しなかった。
【００９５】
一つの代表的な実験を示す動態曲線(図２３ａ)は、非薬物刺激細胞と比較した場合のサイトカイン薬物刺激細胞の刺激後の向上したラジカル生成を示している。この向上したラジカル生成は、異なったドナーの全結果を平均値として示している図２３ｂに示されるように用量依存パターンを示した。我々は異なった血液ドナー間でＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)に対する強い個々の用量応答性を経験したので、全ての個々のデータをプロットしＳｃａｔｔｅｒプロットで示した(図２３ｃ)。このようにすることによって、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)が、異なったドナーに対して異なった最適な用量で、用量依存的な形で薬物刺激細胞によるラジカル生成を誘導したことが明らかになった。１３の内、７-１０の検体がＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)に対するレスポンダーであった。
類似のパターンがまたＥｏｘＣ４(ＢＬＸ-９２５)に対して見られた。この化合物は用量依存的な形でＧＭ-ＣＳＦ薬物刺激好中球によるラジカル生成を誘導した(１３の内、７-８の検体がＥｏｘＣ４に対するレスポンダーであった；データは示さず)。
【００９６】
非薬物刺激好酸球によるエオキシン誘導酸化的代謝
３種全てのエオキシン類が非薬物刺激好酸球による酸素フリーラジカルの少量の生成を誘導した。しかしながら、酸素フリーラジカルの生成量は、好酸球による酸化的代謝の他の既知の活性化因子、この場合は好酸球特異的サイトカインＩＬ-５と比較した場合にかなり少ない(図２４ａ)。
ＩＬ-５薬物刺激好酸球によるエオキシン誘導酸化的代謝
ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-２７と命名)は、図２４に示されるように、ＩＬ-５薬物刺激好酸球によるラジカル生成の広い用量関連誘導を示し、該エオキシンが試験したものの中で好酸球による酸化的代謝の最良の誘導因子であるかも知れないことを示している。６の検体の内、３がＥｏｘＥ４に対してレスポンダーであった。
結論
ＥｏｘＣ４(ＢＬＸ-９２５)及びＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)はＧＭ-ＣＳＦ薬物刺激好中球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導したが、ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)はＩＬ-５薬物刺激好酸球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導した。
【００９７】
実施例７：エオキシンＣ４の形成に対する１５-ＬＯ阻害の効果
ホジキン細胞株Ｌ１２３６をアラキドン酸(４０μＭ)で５分間刺激した。Ｌ１２３６細胞はアラキドン酸をＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物を効果的に転換した。
材料と方法
細胞インキュベーション
ホジキン細胞株Ｌ１２３６(１０×１０６細胞／試料)を１ｍｌのＰＢＳバッファーに懸濁させ、試験物質(１、１０又は５０μＭ)の添加前に３７℃で２分予め温めた。試験物質と共に５分間プレインキュベートした後、アラキドン酸(４０μＭ)を加えた。インキュベーションを２分後に１容量のメタノールを添加して停止させた。各試験物質濃度は二組をインキュベートした。
【００９８】
固相抽出
細胞及び細胞片を試料から遠心分離(２６００ｒｐｍ、６分)によって除去した。上清を水で希釈し、ついで洗浄し平衡にした抽出カートリッジOasis HLB １ｃｃ １０ｍｇ(Waters, Sweden)に移した。代謝物をメタノールで溶出させ、ＨＰＬＣ系に注入する前に水で希釈した。
ＨＰＬＣ分析
ＲＰ-ＨＰＬＣをNova Pak Ｃ１８カラム(２．１×１５０ｍｍ, Waters AB, Sweden)で実施した。最初の移動相は、０．４ｍｌ／分の流量での１００％Ａ(０．０５％(８．７ｍＭ)酢酸、ｐＨをアンモニウムで５．６に調整)からなる。線形勾配を５分後に２０分の３６％Ｂ(６０：４０のアセトニトリル：メタノール)まで開始した。ついで、移動相は、更に２０分は６４：３６のＡ：Ｂの均一濃度に維持された。カラム流出液はダイオードアレイ検出(PDA 996, Waters AB, Sweden)を使用してモニターし、ＵＶスペクトルを２００-３４０ｎｍの間で獲得した。
【００９９】
試験化合物
図２５はＥｏｘＣ４の形成を阻害した様々な化合物の構造を示している。幾つかのものはＷＯ２００４／０８０９９９に記載されている。１-フェニルチオカルバモイル-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸(２-クロロフェニル)-アミド(化合物Ａ)は実施例４７に記載されている。ピラゾール-１,３-ジカルボン酸１-(ベンゾ［１,３］ジオキソール-５-イルアミド)３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルアミド(化合物Ｂ)は実施例６４に記載されている。６-｛［３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルカルバモイル)ピラゾール-１-カルボニル］-アミノ｝-ヘキサン酸エチルエステル(化合物Ｃ)は実施例６５に記載されている。ピラゾール-１,３-ジカルボン酸３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルアミド)１-ペンチル-アミド(化合物Ｄ)は実施例６６に記載されている。ピラゾール-１,３-ジカルボン酸３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルアミド)１-ブチルアミド(化合物Ｅ)はＷＯ２００４／０８０９９９(イソシアン酸ブチルがイソシアン酸ペンチルの代わりに用いられている特に実施例６６を参照)に記載の方法と同様にして調製される。
【０１００】
Ｎ'-(２-(エトキシイミノ)-１-フェニルエチリデン)ベンゾヒドラジド(化合物Ｆ)は次のようにして調製することができる：
(ａ)安息香酸(２-ヒドロキシイミノ-１-フェニルエチリデン)ヒドラジド
安息香酸ヒドラジド(１から１．２当量)をアルコール性溶媒(例えばＥｔＯＨ又はＭｅＯＨ)に溶解させた。２滴の酸(例えば濃硫酸又は氷酢酸)を加えた後、２-イソニトロソアセトフェノン(１当量)を滴下して加えた。反応混合物を(例えば上昇温度(例えば５０-８５℃)で)撹拌した後、濾過によって形成された固形物を集め、場合によっては(例えばＥｔＯＨ／水からの)粗物質を再結晶して副題化合物を得た。
【０１０１】
(ｂ)Ｎ'-(２-(エトキシイミノ)-１-フェニルエチリデン)ベンゾヒドラジド
ジメチルスルホキシド中の安息香酸(２-ヒドロキシイミノ-１-フェニルエチリデン)ヒドラジド(１当量；上の工程(ａ)を参照)及びＫＯＨ(１から１．２当量)の溶液に臭化エチル(少なくとも１当量)を加えた。反応は所定の期間(例えば６日)上昇温度(例えば４５℃)で撹拌した。水を加え、混合物をジクロロメタンで抽出した。組み合わせた有機相をＮａＯＨ(２Ｍ)と水で洗浄した。有機相を乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、真空で蒸発させ、場合によっては再結晶化させて(例えばＥｔＯＨ／水から)表題化合物を得た。
【０１０２】
３-クロロ-Ｎ'-(２-(ヒドロキシイミノ)-１-(３-クロロフェニル)エチリデン)ベンゾヒドラジド(化合物Ｇ)は次のようにして調製することができる：
(ａ)２-(３-クロロフェニル)-２-オキソアセトアルデヒドオキシム
亜硝酸イソアミル(１．８３ｇ、１５．６ｍｍｏｌ)を氷冷エタノール性ナトリウムエトキシド(０．９Ｍ、１８．３ｍＬ、１６．５ｍｍｏｌ)に溶解させた。冷却された液に３-クロロアセトフェノン(１４．９ｍｍｏｌ)を滴下して加え、反応を室温に達するようにし、撹拌を１６時間続けた。反応の過程で形成された固形物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、水に溶解させ、水溶液を氷酢酸で酸性化した。得られた結晶性固形物を濾過し、ＥｔＯＨ／水から再結晶化して副題化合物を得た。
【０１０３】
(ｂ)３-クロロ-Ｎ'-(２-(ヒドロキシイミノ)-１-(３-クロロフェニル)エチリデン)ベンゾヒドラジド
３-クロロ安息香酸ヒドラジド(１から１．２当量)をＥｔＯＨに溶解し、それに２滴の濃硫酸と２-(３-クロロフェニル)-２-オキソアセトアルデヒドオキシム(１当量；上の工程(ａ)を参照)を加えた。反応を一晩５０℃に加熱し、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、ＥｔＯＨ／水から再結晶化して表題化合物を得た。
【０１０４】
結果
ヒト細胞株Ｌ１２３６におけるＥｏｘＣ４形成の阻害
１０-４−４Ｍの濃度のエイコサテトラエン酸(ＥＴＹＡ)は、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４(図２６)及び他の１５-ＬＯ誘導生成物を完全に阻止した。これらの生成物の形成はまた１０-５-５ＭのＥＴＹＡの存在下で減少した。これらの結果は、リポキシゲナーゼ阻害剤ＥＴＹＡがＥｏｘＣ４及びその代謝物の形成を阻止できることを示している。
ＥｏｘＣ４及び１５-ＨＥＴＥの形成に対する化合物の効果
Ｌ１２３６細胞を２分間、示された物質(１μＭ)と共にプレインキュベートされ、続いて５分間、アラキドン酸(１２．５μＭ)と共にインキュベートした。インキュベーションと抽出は上に記載されているようにして実施された。全ての試験化合物(図２５に記載のもの)はＥｏｘＣ４の形成を阻害した(図２７)。また、阻害剤は同様の度合いでＥｏｘＣ４及び１５-ＨＥＴＥの合成を阻止した(図２８)。
【０１０５】
実施例８：ヒト好酸球及び肥満細胞において１５-リポキシゲナーゼ-１経路を介して生産された炎症誘発性アラキドン酸代謝物の同定
略語
ＣＢＭＣ 臍帯血肥満細胞
ＥＣ 内皮細胞
ＥＩＡ エンザイムイムノアッセイ
ＨＥＴＥ ヒドロキシルエイコサテトラエン酸
ＨＰＬＣ 高速エキタイクロマトグラフィー
ＩＬ インターロイキン
ＬＯ リポキシゲナーゼ
ＬＴ ロイコトリエン
ＭＳ 質量分析法
ＰＧ プロスタグランジン
【０１０６】
ヒト好酸球は豊富な量の１５-リポキシゲナーゼ-１(１５-ＬＯ-１)を含んでいる。しかしながら、ヒトにおける１５-ＬＯ-１の生物学的役割は不確かである。アラキドン酸と共に５分間好酸球をインキュベーションすると、２８２ｎｍで最大吸光度を有しロイコトリエン(ＬＴ)Ｃ４よりもＲＰ-ＨＰＬＣでの保持時間が短い主要生成物の形成に至る。陽イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法での分析によって未知の好酸球代謝物を１４,１５-ＬＴＣ４と同定した。この化合物は好酸球中において１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に代謝されうる。また臍帯血由来肥満細胞及び外科的に除去された鼻ポリープは１４,１５-ＬＴＣ４を生産した。好酸球をアラキドン酸と共にインキュベーションするとＬＴＣ４よりも１４,１５-ロイコトリエンＣ４の生産の方が優勢になる一方、カルシウムイオノフォアでの刺激では専らＬＴＣ４が形成された。１４,１５-システイニル含有ロイコトリエン類は、炎症の特徴であるインビトロでの内皮細胞(ＥＣ)単層の血管透過性の増大を誘導することができる。このモデル系において、１４,１５-ロイコトリエン類はＬＴＣ４及びＬＴＤ４と殆ど同じく強力であったがヒスタミンより１００倍強かった。好酸球は、ＬＴＣ４、プロスタグランジンＤ２又はインターロイキン-５での刺激後に１４,１５-ＬＴＣ４を生産し、これは、１４,１５-ＬＴＣ４がアラキドン酸の内因性プールから合成され得ることを証明している。総括すると、本報告は、特にヒト好酸球とまたヒト肥満細胞及び鼻ポリープにおける炎症誘発性１４,１５-ロイコトリエン類の形成を記載する。好酸球はこれらの新たに特徴付けた代謝物の豊富な供給源であるので、５-リポキシゲナーゼ誘導ロイコトリエン類との混同を避けるために、我々はそれぞれ１４,１５-ロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４の代わりにエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４という名称を示唆する。
【０１０７】
序
哺乳動物のリポキシゲナーゼは、喘息及び他の炎症疾患の病因に関係がある構造的に関連した脂質過酸化酵素のファミリーに属する。５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)はロイコトリエン合成における重要な酵素であり、この酵素はアラキドン酸のロイコトリエン(ＬＴ)Ａ４への転換を触媒する。この化合物は酵素的にＬＴＢ４まで加水分解されるか又はグルタチオンとコンジュゲートされてＬＴＣ４を形成し、これが次にＬＴＤ４及びＬＴＥ４まで代謝されうる。ロイコトリエンＣ４とその代謝物は炎症誘発性薬剤及び強力な気管支収縮剤である(１)。５-ＬＯとは異なり、ヒト１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ-１)の生物学的機能についてはあまり知られていない。ヒト気道内皮細胞、好酸球及び肥満細胞及び樹状細胞のサブセットは高い量の１５-ＬＯ-１を構成的に発現する(２-６)。ヒト１５-ＬＯの第二の形態もまた存在し、これは１５-ＬＯ-２と命名される(７)。この酵素と１５-ＬＯ-１の間のアミノ酸類似性は４０％だけである(３)。インターロイキン(ＩＬ)-４及び／又はＩＬ-１３は培養された上皮細胞、単球及び肥満細胞における１５-ＬＯ-１の発現を誘導し(４,８,９)、よってこれらのサイトカインはインビボでの１５-ＬＯ-１発現の重要な生理学的／病態生理学的調節因子として作用しうる。
１５-リポキシゲナーゼ-１は気管支喘息の病因に関与していることが示唆されている。１５-ＬＯ-１の量は、コントロール患者と比較して喘息又は慢性気管支炎の患者の気管支粘膜下層において有意に増加している。１５-リポキシゲナーゼ-１はアラキドン酸を１５-ヒドロキシ-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＥＴＥ)に転換し、これはインビボ並びにインビトロでの様々な細胞及び組織における１５-ＬＯ活性のマーカーとして使用されている。ヒト気管上皮細胞、切り出したヒト気管支及びヒト肺ホモジネートは主としてアラキドン酸を１５-ＨＥＴＥに転換する。喘息患者からの肺検体は非喘息患者の検体よりも多くの１５-ＨＥＴＥを生産し(１２-１４)、１５-ＨＥＴＥはアトピー性及び非アトピー性喘息患者からの刺激されたヒト肺組織における主なアラキドン酸代謝物であった(１５)。増加した量の１５-ＨＥＴＥは、抗原曝露アトピー性喘息患者の気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬＦ)(１６)、喘息患者の痰試料(１７)及び健常なコントロール患者からの鼻分泌物(１８)に見出された。持続性気道好酸球増加症の深刻な喘息患者は健常な被験者又は好酸球増加症のない喘息患者と比較してＢＡＬＦ中の高いレベルの１５-ＨＥＴＥを有している(１４)。１５-ＨＥＴＥのレベルは基底下(sub-basement)厚と相関することが見出され、１５-ＬＯが気道リモデリングに関連しているかも知れないことを示している(１４)。
【０１０８】
１５-ＬＯ経路を介して生産される最も豊富なアラキドン酸代謝物は１５(Ｓ)-ＨＥＴＥ)であり、これは１５(Ｓ)-ヒドロペルオキシ-エイコサテトラエン酸(１５(Ｓ)-ＨＰＥＴＥ)から形成される。１５-ＨＥＴＥへの還元を受けることに加えて、１５-ＨＰＥＴＥはまた脱水を受けて１４,１５-エポキシ-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)を形成する(１９,２０)。他の１５-リポキシゲナーゼ生成物の５-オキソ-１５-ヒドロキシ-６,８,１１,１３-エイコサテトラエン酸はヒト好酸球に対する強力な走化性剤であると報告されている(２１)。しかしながら、１５-ＬＯ-１はリポキシン類及びレゾルビン類(resolvins)の形成に関与しうるので、１５-ＬＯ生成物は炎症疾患において保護的役割を有しうるという証拠がまたある(２２)。総括すると、ヒトにおける１５-ＬＯ経路の生理学的及び病態生理学的役割は確かではない。
【０１０９】
この報告では、我々は、１４,１５-ロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４の形成及びヒトにおいて１５-ＬＯ-１に対して炎症誘発性役割を示す生物学的効果を記載する。好酸球はこれらの新たに特徴付けられた代謝物のかかる豊富な供給源であるので、５-リポキシゲナーゼ誘導ロイコトリエン類との混同を避けるために、我々はそれぞれ１４,１５-ロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４の代わりにエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４という名称を示唆する。
【０１１０】
結果
単離されたヒト好酸球における新規な１５-リポキシゲナーゼ生成物の形成
単離されたヒト好酸球をアラキドン酸と共に５分間インキュベートしておよそ９：１の比で１５(Ｓ)-ＨＥＴＥ及び１２(Ｓ)-ＨＥＴＥが形成され(データは示さず)、これは１５-ＬＯ-１の活性と一致している(２)。約２７０ｎｍに最大ＵＶ吸光度を持ち５-７分の間の保持時間を有する多くのピークが同じクロマトグラムで観察された。これらのより極性の代謝物をよりよく分離するために、アセトニトリルベースの移動ＨＰＬＣ相を使用した。コンジュゲートトリエンスペクトルと２７２ｎｍでの最大吸光度を含む５つのピークが同定された(図２９)。これらの５つのピークの物質の保持時間は、二重酸素添加生成物８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ、１４,１５-オキシド-ロイコトリエンＡ４から誘導された２つの８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４及び８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４(１９,２０)及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥの保持時間に対応した。形成された生成物のパターンは、アラキドン酸と共にインキュベートされたヒト気道上皮細胞に対して報告されているものと同様であった(５)。コンジュゲートしたトリエンであるが２８２ｎｍに最大の特徴的なＵＶスペクトルを持つ少量のロイコトリエン(ＬＴ)Ｃ４がまた観察された。これらのよく知られたアラキドン酸誘導代謝物に加えて、コンジュゲートされたトリエンスペクトルを有し、２８２ｎｍに最大ＵＶ吸光度を有するより極性の主要な代謝物(代謝物１)がクロマトグラムに観察された(インサート,図２９)。
【０１１１】
ＬＣ-ＭＳ／ＭＳによる代謝物１の同定
代謝物１を更に分析するために、外因性アラキドン酸と共にインキュベートしたヒト好酸球の試料に、陽イオンエレクトロスプレータンデム質量分析を使用するＬＣ-ＭＳ／ＭＳによる分析を施した。得られたイオンスキャンスペクトルはＬＴＣ４のスペクトル中にも存在する数個の断片を含んでいた(図３０Ａ)。好酸球における既知の高い１５-ＬＯ活性と併せてこの知見は、代謝物１が１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)でありうることを示している。この仮説を確認するために、合成１４,１５-ＬＴＣ４を調製し(Biomol Inc, USA)、代謝物１から得られた衝突誘導解離スペクトルを、合成１４,１５-ＬＴＣ４に対して得られたスペクトルと比較した(図３０Ａ)。試料を、プロトン化された１４,１５-ＬＴＣ４と等価な６２６．２ｍ／ｚでの生成物イオンスキャンで分析した。クロマトグラムは標準１４,１５-ＬＴＣ４と同じ保持時間のピークを含んでおり、質量スペクトルを比較すると、合成１４,１５-ＬＴＣ４と同一であった。
【０１１２】
ヒト好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４の代謝
好酸球が１４,１５-ＬＴＣ４を１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に代謝し得るかどうかを分析するために、好酸球を、３７℃で６０分間、合成１４,１５-ＬＴＣ４又は１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)と共にインキュベートした。形成された代謝物を、１４,１５-ＬＴＤ４に対しては４９７．２ｍ／ｚ、１４,１５-ＬＴＥ４に対しては４４０．２ｍ／ｚの生成物イオンスキャンで分析した。１４,１５-ＬＴＣ４から形成された生成物(代謝物２)の保持時間と質量スペクトルは合成１４,１５-ＬＴＤ４と同一であり(図３０Ｂ)、１４,１５-ＬＴＤ４とのインキュベーション後に形成された生成物(代謝物３)は合成１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)と同一の保持時間と質量スペクトルを有していた(図３０Ｃ)。３７℃での６０分のインキュベーションの間、１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の非酵素的代謝はなかった(データは示さず)。
基本的には、１４,１５-ロイコトリエン類と対応する５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル-ロイコトリエン類の生成物イオン質量スペクトルは殆ど同一である。しかしながら、１４,１５-ロイコトリエン類は２０５ｍ／ｚで断片を形成する一方、５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル-ロイコトリエン類における対応する断片は１８９ｍ／ｚにおいてである(図３１)。これらの衝突誘導解離生成物は、おそらくは、システイニル基が位置しており、１４,１５-ロイコトリエン類では炭素１４、ロイコトリエン類に対しては炭素６である炭素の隣での切断によって形成される。
【０１１３】
好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４とＬＴＣ４の形成間の比較
ヒト好酸球は豊富な量の１５-リポキシゲナーゼ及び５-リポキシゲナーゼ双方を含んでいる。１５-リポキシゲナーゼ及び５-リポキシゲナーゼ経路が最も活性である条件を調べるために、好酸球をアラキドン酸又はカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の何れか、又は双方と共にインキュベートした。細胞を３７℃で５分間インキュベートし、ＲＰ-ＨＰＬＣを用いて１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４の量を分析した。インキュベーションの５分後では好酸球には１４,１５-ＬＴＣ４又はＬＴＣ４の代謝は殆どない(データは示さず)。従って、これらの代謝物の測定は、それぞれ１５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有１４,１５-ロイコトリエン類及び５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有ロイコトリエン類の全形成を反映していると考えられる。外因性アラキドン酸との好酸球のインキュベーションにより１４,１５-ＬＴＣ４が優先的に形成されたが、ＬＴＣ４もまた幾つかのインキュベーションで形成された(表１)。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７の細胞の活性化はＬＴＣ４の形成を専ら誘導したが、イオノフォアＡ２３１８７及びアラキドン酸双方での好酸球の刺激により１４,１５-ＬＴＣ４とＬＴＣ４の双方が形成された。同様の量のこれらの代謝物が幾つかのインキュベーションで生産されたが、ＬＴＣ４のレベルは、ある試料では更に高かった。総括すると、アラキドン酸と共に細胞をインキュベートすると、１４,１５-ＬＴＣ４の形成が優勢になり、細胞のカルシウム活性化は５-ＬＯをトリガーし、５-ＬＯ誘導ロイコトリエン類の形成を強く優勢にする。
【０１１４】
表１：好酸球中における１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４の生合成。好酸球を健常なドナー又は患者から単離した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ)に懸濁させ、３７℃で５分間、アラキドン酸(１０μＭ)、イオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)又は双方と共にインキュベートし、ついで上清を逆相ＨＰＬＣ分析にかけた。１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４の相対量をｐｍｏｌ／１０７好酸球として計算した。
【０１１５】
１４,１５-ロイコトリエン類の生物学的効果
血漿漏出に至る血管透過性の増加は炎症の特徴であり、システイニル含有ロイコトリエン類がヒスタミン及びブラジキニンと同様な形でこの効果に寄与しうることはよく知られている(２３)。１４,１５-ＬＴＣ４とその代謝物１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４が血管透過性における改変を誘導する能力を探究するために、ヒト内皮細胞(ＥＣ)単層を通しての電気抵抗変化に基づく確立されたインビトロ透過性アッセイを使用した。このモデルにおける最大刺激で誘導されたＥＣ抵抗変化はおよそ-７０％の低下に達する。用量応答曲線は、ヒスタミンの最大効果がこのモデル系において１０-５Ｍで得られたことを示している(データは示さず)。全ての１４,１５-ロイコトリエン類がＥＣ単層透過性において最大の増加を誘導することができた(図３２Ａ)。ＬＴＣ４及びＬＴＤ４より些か強力ではないが、１４,１５-ロイコトリエン類はこの点でヒスタミンより約１００倍強力であった(図３２Ａ)。１４,１５-ＬＴＤ４は１０-７ＭでＥＣ透過性の最大増加を誘導したが、ＥＣ透過性の有意な増加がまた１０-８Ｍで観察された(図３２Ｂ)。１４,１５-ロイコトリエン類及びＬＴＤ４に応答したＥＣ透過性の変化の動態は、ヒスタミン及びＬＴＣ４のような直接的に作用するアゴニストに対して観察されたパターンに類似している(図３２Ｂ)(２４)。他方ではＬＴＢ４はＥＣ障壁機能に影響を及ぼすために顆粒球の存在を必要とし、ＬＴＢ４の効果はこのモデル系では観察されなかった。
【０１１６】
好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４生合成のレセプター媒介活性化
１４,１５-ＬＴＣ４形成の可能なレセプター媒介活性化を、アレルゲン誘導肥満細胞メディエーターＬＴＣ４及びプロスタグランジン(ＰＧ)Ｄ２並びに強力な好酸球活性化因子であるＩＬ-５を使用することによって調べた。単離された好酸球(１０×１０６／試料)を３７℃で５分間、ＬＴＣ４(１μＭ)、ＰＧＤ２(１μＭ)又はＩＬ-５(１０ｎｇ／ｍｌ)と共にインキュベートした。ロイコトリエンＣ４、ＰＧＤ２及びＩＬ-５は全て５分のインキュベーション後に好酸球からの１４,１５-ＬＴＣ４の放出を誘導した(表２)。これらの結果はレセプター媒介メカニズムを介した好酸球におけるアラキドン酸の内因性プールからの１４,１５-ＬＴＣ４の形成を実証している。
【０１１７】
表２：好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４生合成のレセプター媒介活性化。健常な志願者又は好酸球増加症と診断された患者から単離されたヒト好酸球を１ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、ＬＴＣ４(１μＭ)、ＰＧＤ２(１μＭ)又はＩＬ-５(１０ｎｇ／ｍｌ)の存在下で３７℃で５分間インキュベートした。コントロール、ＬＴＣ４、及びＰＧＤ２、ｎ＝４。ＩＬ-５、ｎ＝２。１４,１５-ＬＴＣ４の量はＥＩＡによって分析した。
【０１１８】
臍帯血誘導肥満細胞(ＣＢＭＣＭＮＣ)における１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の生合成
肥満細胞は喘息の病態生理学において重要な役割を担っている。最近、我々は、インターロイキン(ＩＬ-４)がヒト臍帯血誘導肥満細胞においてインビトロで１５-ＬＯ-１の発現を誘導し、肥満細胞がインビボで１５-ＬＯ-１を発現することを報告した(４)。従って、肥満細胞が１４,１５-ロイコトリエン類を生産できるかを調べることは興味深かった。ＩＬ-４で薬物刺激された肥満細胞をアラキドン酸(１０μＭ)と共に５分間インキュベートした。上清を集め、１４,１５-ＬＴＣ４に対してＥＩＡを使用して分析した。これらの条件下で、ヒト肥満細胞は０．８＋／−０．６ｐｍｏｌ／１０６細胞(ｎ＝３)を放出し、アラキドン酸刺激の後に、免疫反応性の１４,１５-ＬＴＣ４を合成し放出する能力を示している。
【０１１９】
１４,１５-ＬＴＣ４の同一性は更にＬＣ-ＭＳ／ＭＳ単一反応モニタリングＳＲＭで証明された。よって、アラキドン酸と共にインキュベートした肥満細胞が、１４,１５-ＬＴＣ４のＳＲＭ遷移に対するものと同じ保持時間と典型的な断片パターンを有する代謝物を生じた(データは示さず)。また、肥満細胞試料を特異的１４,１５-ＬＴＤ４ ＳＲＭ法で分析して、４,１５-ＬＴＣ４が細胞によって更に代謝されるかどうかを調べた。確かに、合成１４,１５-ＬＴＤ４と同一の断片化パターンと保持時間を有する代謝物が証明された。総括すると、肥満細胞は１４,１５-ＬＴＣ４と１４,１５-ＬＴＤ４の双方を生産する能力を有している。
【０１２０】
ヒト鼻ポリープにとる１４,１５-ＬＴＣ４の自然の放出
鼻ポリープ症は、好酸球のような炎症細胞による組織浸潤からなる多因子性疾患である(２５)。１４,１５-ＬＴＣ４がヒト鼻ポリープによって合成されうるかを調べるために、無傷の外科的に除去した鼻ポリープを洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭＩＮＩ(登録商標))及びインドメタシンを含むＰＢＳ中で３７℃で５又は３０分、インキュベートした。ついで、インキュベーション培地を、１４,１５-ＬＴＣ４に対してＥＩＡを使用して分析した。その結果は、鼻ポリープが自然に１４,１５-ＬＴＣ４(それぞれ５及び３０分のインキュベーション後に、１０．１±０．００７及び７．１８±１．１８ｐｍｏｌの１４,１５-ＬＴＣ４／ｇポリープ組織(ｎ＝２))を放出することを裏付けている。経時的な１４,１５-ＬＴＣ４の減少レベルは１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４への更なる代謝のためであり、これは１４,１５-ＬＴＣ４に対して産生された抗体によっては検出されない(１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に対して１％未満の交差反応性、材料と方法を参照)。
【０１２１】
エオキシン類-１４,１５-ロイコトリエン類に対して示唆された新規な名前
ロイコトリエンという名前は、５-リポキシゲナーゼ生成物に伝統的に関連している。アラキドン酸において１４,１５-エポキシドを介して形成される１５-リポキシゲナーゼ代謝物に対する機能的名前は、それは５-リポキシゲナーゼ経路を介して形成されないが、１４,１５-ロイコトリエンであった。好酸球はこの報告において記載された新規な１５-リポキシゲナーゼ生成物に対するリッチな供給源であるので、５-ＬＯ誘導生成物との混同を避けるために、我々は、それぞれ１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４の代わりに、エオキシン(Ｅｏｘ)Ｃ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４という名を示唆する(図３３)。
【０１２２】
検討
ヒト気道上皮細胞及び好酸球は高い量の１５-ＬＯ-１を発現する(３,５,６)。また、ヒト肥満細胞、マクロファージ及び樹状細胞は１５-ＬＯ-１を発現する(２６＋Gullilsson)。この研究分野での多くの研究にかかわらず、赤血球新生の間の酵素の機能を除いて、この酵素の生物学的役割は不確かである(２,３)。本報告では、我々は、ヒト好酸球、特に臍帯血誘導肥満細胞及び鼻ポリープがアラキドン酸を１５-ＬＯ-１経路を介して、コンジュゲートされたトリエンスペクトルと２８２ｎｍでの最大ＵＶ吸光度を有する代謝物に転換させる能力を有していることを記載する(図２９)。好酸球及び肥満細胞において形成されたこれらの代謝物の構造は陽イオンタンデム質量分析法及びＲＰ-ＨＰＬＣ／ＵＶ-分光法によって決定し、合成１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４と同一であることが見出された(図３０及び３１)。好酸球は主として１４,１５-ＬＴＣ４を生産し、それぞれ合成１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４と共にこれらの細胞のインキュベーションによって証明されるように、この代謝物は更に１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に代謝されうる。合成１４,１５-ＬＴＣ４は様々な生物システムにおいて研究され(例えば、Drazen等(1981) Proc Natl Acad Sci 78, 3195-3198を参照)、１４,１５-ＬＴＡ４は上皮細胞及び好酸球において形成されることは先に見出されているけれども(例えば文献３２を参照)、システイニル含有１４,１５-ロイコトリエン類の生合成がヒト細胞及び組織中でアラキドン酸から生じることは決して証明されていない。
【０１２３】
外因的なアラキドン酸と共に好酸球をインキュベーションすると、１４,１５-ＬＴＣ４の生成がＬＴＣ４より優性になり(表１)、代わりにカルシウムイオノフォアで細胞内カルシウムレベルが増加すると、５-ＬＯを誘導し、ただＬＴＣ４だけを生産する。よって、５-ＬＯ及び１５-ＬＯロイコトリエンの生産の調節は異なり、排出される主要な代謝物にどの代謝物がなるかは刺激に依存する。この点で、１４,１５-ロイコトリエン経路はプロスタグランジン経路に似ており、遊離のアラキドン酸が利用できる場合に直ぐに生じ、カルシウム流に独立している。
【０１２４】
５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有ロイコトリエン類とは異なり、１４,１５-ＬＴＣ４とその代謝物はモルモット肺実質性条片又は回腸への収縮効果を有していないように思われる(２７)。しかしながら、我々は、ここで、コンフルエントなヒト内皮細胞を持つモデル系において、３種全ての１４,１５-ロイコトリエン類が炎症のマーカーである血管漏出を増加させたことを立証する。１４,１５-ロイコトリエン類は１０-７及び１０-８Ｍで増大したＥＣ透過性を誘導し、システイニル含有ロイコトリエン類と殆ど同じほど強力で、この点ではヒスタミンより１００倍以上強かった(図３２)。この研究では、我々は、内皮細胞障壁機能のメディエーター誘導混乱の解析のためにインビトロモデル系を使用した。ＴＥＥＲの連続的測定により、ＥＣ透過性の急速な変化の検出が可能になり、培養された内皮細胞単層の障壁能力の感度のよい指標であることが過去に示されている(２４,２８)。ヒスタミンやシステイニルロイコトリエン類のような炎症メディエーターの透過性増大活性は以前から知られている。これらのメディエーターは、細胞内Ｃａ２＋移動及び細胞骨格再配置の惹起を通してＥＣ障壁機能にその効果を作用させ(２９)、傍細胞 間隙形成及び亢進された巨大分子透過性を生じる。同様に、１４,１５-ロイコトリエン類は同様な方法で血管透過性の増加を刺激する。
【０１２５】
ＬＴＣ４、ＰＧＤ２及びＩＬ-５でのヒト好酸球のレセプター媒介活性化がまた１４,１５-ロイコトリエン類の生産と放出を惹起した(表２)。よって、１４,１５-ロイコトリエン類は好酸球中のアラキドン酸の内因性プールから製造することができる。ＬＴＣ４及びＰＧＤ２は、共にアラキドン酸誘導化合物であり、抗原投与時に肥満細胞によって合成され放出されることが知られており、活性化された肥満細胞は、１４,１５-ロイコトリエン類自体の生産に加えて、好酸球におけるこれらの生成物の生合成を刺激することができる。ＬＴＣ４及びＰＧＤ２に加えて、ＩＬ-５は１４,１５-ＬＴＣ４の内因性生合成を活性化することができる。ＩＬ-５は、その生産、活性化及び組織補充を含む好酸球の幾つかの側面を調節することに決定的に関与したサイトカインである。
【０１２６】
鼻ポリープ形成の原因は知られていないが、アラキドン酸代謝物は、特にアスピリン過敏症副鼻腔炎／喘息徴候を持つ患者において、病因において重要であると思われる。鼻ポリープ症の主要な特徴は活性化された好酸球の蓄積であると考えられ、これは組織内の炎症性細胞の２８％までを占める(３０)。従って、インビトロでインキュベートされたヒト鼻ポリープが１４,１５-ロイコトリエン類を生産し放出するかどうかを調べることは興味深かった。確かに、１４,１５-ＬＴＣ４は鼻ポリープによってインキュベーション培地中に自然に放出された。活性化された好酸球は鼻ポリープ中の１４,１５-ＬＴＣ４の主要なソースであると思われる。しかしながら、気道内皮細胞は、これらの細胞は多量の１５-ＬＯを含んでいることが知られているので、所定の役割を担っていることは除外できない(文献２-６を参照)。
好酸球はこれらの新規代謝物のリッチな供給源であるので、我々は、５-ＬＯ経路を介して生産された化合物との混同を避けるために、１４,１５-ロイコトリエンの代わりにエオキシンなる名前を示唆する。よって、１４,１５-ロイコトリエンＡ４、Ｃ４、Ｄ４及びＥ４はそれぞれエオキシン(Ｅｏｘ)Ａ４、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４で置き換えられる(図３３)。エオキシン類はヒト細胞においてアラキドン酸から生産されることは決して報告されていない。しかしながら、ヒト好塩基球は外因性１４,１５-ロイコトリエンＡ４を１４,１５-ロイコトリエンＣ４に転換することが先に見出されている(３３)。
【０１２７】
総括すると、この報告は、好酸球及び肥満細胞によって生産される新規な炎症誘発性のアラキドン酸代謝物の形成、並びにこれらの代謝物の生合成に対する様々な生理学的トリガーの同定を記載する。よって、炎症性気道中の活性化された肥満細胞とＴｈ２細胞がＬＴＣ４、ＰＧＤ２及びＩＬ-５を排出し、これが近くの好酸球を誘導してエオキシン類を生産させ放出し、血漿漏出を生じるということができる。更に、アレルギー性炎症に加えて、遊離のアラキドン酸が高量で存在する非アレルギー性炎症においてもまた、エオキシン生産が起こり、炎症プロセスに寄与することが推測できる。
多くの報告が、コントロール被験者と比較して喘息患者の気道組織における１５-ＬＯ-１の増加した量と活性を実証している。健常な喫煙者は、特に慢性気管支炎の喫煙者の場合、気管支バイオプシー中での増加した１５-ＬＯ-１の発現を示している。この点で、我々は、１５-ＬＯ-１経路が好酸球及び肥満細胞において炎症誘発性の１４,１５-ロイコトリエン類(エオキシン類)を生産することができることを示しており、１５-ＬＯ-１の阻害がヒトにおける喘息及び鼻炎の治療のための魅力的な標的であり得ることを示している。
【０１２８】
材料と方法
バキュテナー(登録商標)採血管はベクトン・ディキンソン(Rutherford, NJ)から得た。モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１６抗体にコンジュゲートされた常磁性ミクロビーズ、磁気スタンド及びＬＳ＋磁気分離カラムはMiltenyi Biotec(Bergisch Gladbach, Germany)から得た。組換えヒト(ｒｈ)ＩＬ-４はIn Vitro Sweden AB(Sweden)から購入した。１４,１５-ＬＴＣ４ ＥＩＡキットはCayman Chemical(Ann Arbor, MI)から購入した。イオノフォアＡ２３１８７はCalbiochem-Boehring(La Jolla, CA)から購入した。インドメタシンはSigma-Aldrichから購入した。全ての溶媒はＨＰＬＣグレードであった。アラキドン酸はNu-Chek prepから購入した。合成１４,１５-エポキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)、１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)、１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)、１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ)、１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ又は１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１１,１３(Ｚ,Ｚ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＥＴＥ)、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４及びＬＴＥ４は、Biomol Inc (Plymouth Meeting, USA)から購入した。
【０１２９】
ヒト好酸球の単離
静脈血(１００ｍｌ)を、健常な志願者又は好酸球増加症候群(ＨＥＳ)を含む好酸球増加症、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)及びある種の炎症疾患の患者からから採血した。４００×ｇで１５分間の最初の遠心分離を実施した。上相を捨て下相を集め、２０℃で３０分間、Ｄｅｘｔｒａｎ(商標)沈降を施した。沈降後、白血球細胞を含む上相を４００×ｇで１０分間、一回遠心分離した。ペレットを溶解バッファー(１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＴＲＩＳ-ＨＣｌ、ｐＨ７．４)に懸濁させ、室温で３０分インキュベートして混入した赤血球を除去した。インキュベーション後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(商標)を用いて密度勾配遠心分離を実施した。好中球と好酸球を含む多形核(ＰＭＮ)画分を集め、磁気細胞分離(ＭＡＣＳ)を施した。好酸球は、磁気ミクロビーズ(登録商標)に結合させたＣＤ１６抗体を使用するネガティブ選択によって単離した。純度は、形態学的検査とメイ・グリューネバルト-ギムザ溶液での染色によって確認した。純度は常に９５％を越えていることが見出された。
臍帯血誘導肥満細胞(ＣＢＭＣＭＮＣ)の調製及びポリープの単離
臍帯血誘導肥満細胞(ＣＢＭＣＭＮＣ)を記載されたようにして樹立した(４)。ポリープは外科的に除去し、４℃で最大１時間、ＰＢＳ中に維持した。ポリープを回りの組織から分離し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋なしのＰＢＳで洗浄した。洗浄した濡れたポリープの重さは０．７-１ｇであった。
【０１３０】
細胞インキュベーション
好酸球
単離された好酸球(１−２０×１０６／試料)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ／試料)に再懸濁させ、３７℃で示された時間の間、イオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)／アラキドン酸(１又は１０μＭ)／Ａ２３１８７プラスアラキドン酸／ＰＧＤ２(１μＭ)／ＬＴＣ４(１μＭ)／ＩＬ-５(１０ｎｇ／ｍｌ)／１４,１５-ＬＴＣ４(１０μＭ)又は１４,１５-ＬＴＤ４(１０μＭ)又は双方で２、５又は１０分、刺激する前に３７℃で２分間(インドメタシンの存在下又は不在下で、１μＭ)、プレインキュベートした。インキュベーションは１容量のメタノールの添加によって終結させた(ＲＰ-ＨＰＬＣによる分析のため)。エンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)による続く分析のために、反応を、１２００×ｇ、５分の遠心分離前に０℃で急速冷却して終結させた。上清を凍結管に移し、分析するまで-７０℃で保存した。
【０１３１】
肥満細胞
インキュベーション前に、ＣＢＭＣ細胞にＩＬ-４(１０ｎｇ／ｍｌ)を用いて４日間薬物刺激を施した。機械的な除去及びＰＢＳでの洗浄後に、細胞をＰＢＳに再懸濁させ、インドメタシン(１μＭ)と共に又はそれなしで３７℃で２分間プレインキュベートした。ＣＢＭＣ細胞を続いて３７℃でアラキドン酸と共に示された期間の間、インキュベートした。インキュベーションは１容量のメタノールの添加によって(ＬＣ-ＭＳ分析)又は０℃に急速冷却することによって終結させ、続いてＥＩＡによって分析した。
ヒト鼻ポリープ
洗浄したヒトの無傷のポリープを、１ｍｌの全容量中にＰＢＳ、プロテアーゼ阻害剤(Complete MINI(登録商標))及びインドメタシン(１μＭ)を含む清浄な試験管中に移した。試料を３７℃でそれぞれ５分及び３０分、インキュベートした。反応を０℃に急速冷却することによって終結させ、続いて１２００×ｇ、５分、遠心分離した。上清を凍結管に移し、ＥＩＡによる分析まで-７０℃で保存した。
【０１３２】
１５-リポキシゲナーゼ生成物の分析
逆相-高速液体クロマトグラフィー-ＵＶ(ＲＰ-ＨＰＬＣ-ＵＶ)
細胞片及びタンパク質を除去するために、１２００×ｇで５分間、遠心分離を実施した。上清を減圧下で蒸発させ、残留物をメタノールに溶解させ、試験管に移した。ついで、試料を窒素流下で蒸発乾固させ、最後に２００μｌの移動相(ロイコトリエン類及び１４,１５-ロイコトリエン類の分析に対してはアセトニトリル：メタノール：Ｈ２Ｏ：酢酸、２９：１９：７２：０．８、ｐＨは５．６にＮＨ３で調整、及びモノヒドロキシ酸の分析に対してはメタノール：水：トリフルオロ酢酸、７０：３０：０．００７)に再懸濁させた。抽出された試料に、記載されたようにして逆相ＨＰＬＣ系での分析を施した。簡単に述べると、試料をオクタデシル逆相カラム(Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ １８Ｃ,Ｍａｃｈｅｒｅｙ-Ｎａｇｅｌ,Ｄｕｒｅｎ,Ｇｅｒｍａｎｙ)に充填し、溶出流量は１．２ｍｌ／分であった。溶出した化合物を、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【０１３３】
液体クロマトグラフィー-質量分析解析(ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ)
インキュベーションの終結後、試料を遠心分離し(１４００×ｇ、６分)、上清を水で希釈して最大２５％のメタノールを含ませ、洗浄及び平衡抽出カートリッジＯａｓｉｓ ＨＬＢ １ｃｃ １０ｍｇ(Waters AB, Sweden)に移した。カラムを水で洗浄し、２００μｌのメタノールで溶出させて代謝物を回収した。
液体クロマトグラフィー-質量分析はＴＳＱ・Ｑｕａｎｔｕｍ・Ｕｌｔｒａトリプル四極子質量分析計に連結したＳｕｒｖｅｙｏｒ・ＭＳ(Thermo Electron Corporation, Sweden)で実施した。注入前に１容量の水を試料に加えた。逆相ＬＣは、４００μｌ／分に一定に保たれた流量でＺｏｒｂａｘ・Ｅｃｌｉｐｓｅ・Ｐｌｕｓ３．５μＭ・Ｃ１８カラム２．１×５０ｍｍ(ChromTech, Sweden)を用いて実施した。移動相Ａは水中２％のアセトニトリルと０．１％の酢酸からなり、移動相Ｂは水中８０％のアセトニトリルと０．１％の酢酸から構成されている。使用した全ての水はＭｉｌｌｉＱグレードであった。９０％のＡで１．５分、均一濃度で開始して、１００％のＢに達する６．５分の線形勾配を続けた。該系を１００％のＢで４分洗浄し、ついで９０％のＡで４分間平衡にした。１４,１５-ロイコトリエン類を約０．５分、ロイコトリエン類からクロマトグラフィー的に分離した。質量分析計はポジティブモードでエレクトロスプレー大気圧イオン化源を使用して操作した。スプレー電圧は４５００Ｖに設定し、キャピラリー温度は３７５℃であり、シース及び補助ガスはそれぞれ４０及び５(任意単位)で最適であった。スキマーオフセットは１０Ｖで、チューブレンズは１２１Ｖであった。
【０１３４】
好酸球代謝物に対するＬＣ-ＭＳ／ＭＳ
ＬＣ-ＭＳ／ＭＳを使用して、プロトン化１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４の生成物イオンスキャンを実施した。６２６．２ｍ／ｚの１４,１５-ＬＴＣ４を２２ｅＶの衝突エネルギーで断片化し、４９７．２ｍ／ｚの１４,１５-ＬＴＤ４及び４４０．２ｍ／ｚの１４,１５-ＬＴＥ４は共に１８ｅＶで断片化した。
肥満細胞代謝物に対するＬＣ-ＭＳ／ＭＳ
１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４は単一反応モニタリングＳＲＭによって検出した。ＳＲＭスキャンで使用された遷移は、１４,１５-ＬＴＣ４に対して６２６ｍ／ｚ→２７９ｍ／ｚ、１４,１５-ＬＴＤ４に対して４９７ｍ／ｚ→２０５ｍ／ｚであり、双方とも２０ｅＶの衝突エネルギーであった。１４,１５-ＬＴＣ４に対して選択される遷移はまたＬＴＣ４に対して存在していたが、これらの化合物はクロマトグラフィー的にはおよそ０．５分で分離した。４９７ｍ／ｚ→２０５ｍ／ｚの遷移は１４,１５-ＬＴＤ４に対して特異的であり、よってＬＴＤ４には適用できなかった。
【０１３５】
１４,１５-ＬＴＣ４に対するエンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)の特徴付け
１４,１５-ＬＴＣ４に対するエンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)は少量の１４,１５-ＬＴＣ４を定量するためにCayman Chemical (Ann Arbor, MI)によって開発された。この方法は、１４,１５-ＬＴＣ４の定量においてＲＰ-ＨＰＬＣよりおよそ千倍感度が良かった。ＥＩＡ交差反応性は製造者によって決定された。１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に対する交差反応性はそれぞれ０．９％及び０．０４％であった。ロイコトリエンＣ４、ロイコトリエンＤ４、ロイコトリエンＥ４、アラキドン酸、１２-ＨＥＴＥ、１５-ＨＥＴＥ、５(Ｓ),６(Ｓ)-ジＨＥＴＥ、５(Ｓ),１５(Ｓ)-ジＨＥＴＥ、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジＨＥＴＥ及び１４,１５-ジＨＥＴＥの交差反応性は０．０１％未満であった。
上清をＥＩＡバッファーで希釈し、分析を製造者のプロトコルに従って実施した。ＥＩＡ定量からの光学密度(ＯＤ)を用いて次の関係に従って％Ｂ／Ｂ０を計算した：
％Ｂ／Ｂ０＝(試料ＯＤ-NSB ＯＤ)／(ゼロ標準ＯＤ-NSB ＯＤ)×１００
７．８-１０００ｐｇ／ｍｌ(０．０１２-１．６ｐｍｏｌ／ｍｌ)１４,１５-ＬＴＣ４の範囲の標準曲線を作成し、試料中の１４,１５-ＬＴＣ４の濃度を決定するために使用した。
【０１３６】
内皮細胞障壁機能の評価
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (ＨＵＶＥＣ)を単離し、過去に記載されているようにして培養した。細胞を３μｍの孔径のポリカーボネートフィルター(Tissue Culture inserts, 10 mm; NUNC, Roskilde, Denmark)に２×１０５細胞の密度で播種し、コンフルエントな単層まで増殖させた。内皮細胞(ＥＣ)単層の障壁機能に変化を誘導するアラキドン酸代謝物の能力は、経内皮電気抵抗(ＴＥＥＲ)の連続的記録によって分析した。ＴＥＥＲの測定では、ＥＣを有するフィルターインサートを、繰り返し測定の間に互いのかつフィルターインサートに対しての電極の正確な位置決めを達成するように変更された抵抗測定チャンバー(Endohm-12, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)に移した。チャンバー(下方コンパートメント)及びフィルターインサート(上方コンパートメント)にそれぞれ２ｍｌ及び４００μｌの培養培地を満たした。全ての測定は細胞培養インキュベーター中に配した装置で３７℃にて行った。個々のＥＣ単層の電気抵抗は、ＥＣの播種前に測定したBiomatrixでコートされた対応する裸のフィルターの抵抗を減算することによって得られた。よって、ＴＥＥＲ値はＥＣ単層だけの抵抗を表す。
【０１３７】
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【０１３８】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は薬学的に有用な化合物を同定するための方法に関する。本発明は更に炎症疾患又は炎症全般の治療に有用な化合物を同定するための方法に関する。本発明はまた抗炎症組成物を製造する方法及び薬学的に有用な化合物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
その性質が炎症性である多くの疾患／障害がある。炎症症状の現在の治療法に伴う主な問題の一つは効能の欠如及び／又は副作用(実際のもの又はそのように思われているもの)の発生である。
喘息は、先進工業国の成人人口の６％〜８％で発症している慢性の炎症性疾患である。子供における発生率はさらに高く、殆どの国では１０％に近い。喘息は、１５才以下の子供の入院原因の最も一般的なものである。
喘息の治療法は症状の重症度に基づく。軽度の症例では治療しないか、又はβ-アゴニストの吸入で治療されるのみである。より重症の喘息を患っている患者は、定期的に抗炎症化合物を用いて治療するのが典型的である。
【０００３】
現在の維持療法(主としてコルチコステロイド類の吸入)には、少なくともある程度のリスクがあると思われるため、喘息の治療が不十分な場合がかなりある。これらには、不要な罹患及び死亡に至る、子供の成長遅延及び骨ミネラル密度の損失の危険性が含まれる。ステロイド類の代替法として、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト(LTRas)が開発されている。これらの薬剤は経口的に与えることができるが、吸入されたステロイド類に比べてあまり有効ではなく、通常、気道炎症を満足に抑制できない。
この要因が組み合わさって、喘息の全患者の少なくとも５０％が満足のいく治療を受けていない。
【０００４】
治療が不十分であるという同様のパターンがアレルギー疾患に関連して存在し、多くの一般的症状を治療するのに薬剤を利用できるが、明白な副作用を考慮して使用されていない。鼻炎、結膜炎及び皮膚炎はアレルギー要素を有しうるが、潜在するアレルギーがない場合でも生じる場合がある。実際、このクラスの非アレルギー性症状は、多くの症例で治療が困難である。
【０００５】
慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)は、世界の人口の６％〜８％が罹患している一般的な疾患である。疾患は致死的となりうるおそれがあり、この病気の罹患率及び死亡率はかなりのものである。現在、ＣＯＰＤの経過を変えることができる既知の薬物学的治療法は存在しない。
【０００６】
挙げることのできる他の炎症性疾患には次のものがある：
(ａ)特発性肺線維症(これはＣＯＰＤよりも一般的ではないが、非常に悪い予後を伴う重篤な疾患である。治癒的治療法は存在しない)；
(ｂ)炎症性大腸炎(高罹患率の疾患群。今日、このような疾患では対症療法が利用できるに過ぎない)；及び
(ｃ)関節リウマチ及び骨関節炎(関節のありふれた無能化炎症性疾患。現在では、このような症状への対応に利用できる治癒的治療法は存在せず、また適度に効果的な対症療法のみである)。
【０００７】
炎症はまた痛みの一般的な原因である。炎症痛は多くの理由、例えば感染、手術又は他の外傷により生じるおそれがある。更に、数種の悪性腫瘍は、患者の総体的な症状に加わる炎症要素を有することが知られている。
よって、新規な及び／又は代替の抗炎症治療法が、上述した患者群の全てにとって有益となる。特に、実際の又は知覚される副作用を生じないで喘息のような炎症性疾患を治療できる有効な抗炎症剤に対して真のかつ実質的に満たされていないニーズがある。
【０００８】
哺乳類のリポキシゲナーゼは、アラキドン酸の酸素化を触媒する構造的に関連した酵素のファミリーである。３種類のヒトリポキシゲナーゼが知られており、これらは炭素位置５、１２及び１５１におけるアラキドン酸への分子酸素の挿入を触媒する。よって、酵素は、それぞれ５-、１２-及び１５-リポキシゲナーゼと称されている。
リポキシゲナーゼの作用によって生成されるアラキドン酸の代謝産物は、炎症誘発効果を含む明白な病態生理学的活性を有していることが知られている。
【０００９】
ロイコトリエン生合成における重要な酵素は、２段階反応でアラキドン酸をロイコトリエン(ＬＴ)Ａ４に転換する５-リポキシゲナーゼである。この代謝物は酵素的にロイコトリエンＢ４(ＬＴＢ４)まで加水分解されるか、又はロイコトリエンＣ４(ＬＴＣ４)シンターゼによってグルタチオンとコンジュゲートさせられてＬＴＣ４を形成し、これがついでγグルタミル-トランスペプチダーゼ及びジペプチダーゼの連続的作用によって切断されロイコトリエンＤ４(ＬＴＤ４)とロイコトリエンＥ４(ＬＴＥ４)をそれぞれ生じうる。ＬＴＣ４とその代謝物は炎症誘発剤及び強力な気管支収縮剤２である。これらの代謝産物の作用並びにそれらを形成する生物学的プロセスを阻害する薬剤の開発に多大な努力がなされている。この目的のために開発された薬剤には、５-リポキシゲナーゼインヒビターと、これまでに述べたように、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト(ＬＴＲａｓ)が含まれる。ＦＬＡＰ(Five Lipoxygenase Activating Protein)のインヒビターもまた研究されている。
【００１０】
アラキドン酸を代謝する他のクラスの酵素はシクロオキシゲナーゼ類である。このプロセスにより生成されるアラキドン酸代謝産物には、プロスタグランジン類、トロンボキサン類、及びプロスタサイクリンが含まれ、それらの全てが生理学的及び病態生理学的活性を有している。特に、プロスタグランジンＰＧＥ２は、熱及び痛みをまた誘発する強力な炎症誘発媒介物である。従って、「ＮＳＡＩＤｓ」(非ステロイド性抗炎症剤)及び「コキシブ(coxibs)」(選択的シクロオキシゲナーゼ-２インヒビター)を含む、ＰＧＥ２の生成を阻害する多くの薬剤が開発されている。これらのクラスの化合物は、主として一種又は数種のシクロオキシゲナーゼの阻害を介して作用する。またレセプターアンタゴニストが研究されている。
【００１１】
よって、一般に、アラキドン酸代謝産物の生成を阻止可能な薬剤は、炎症の治療に有用であると思われる。
【００１２】
例えば免疫抑制性患者、例えば化学療法、移植拒絶を防止するための治療を受けている患者又はＡＩＤＳ患者において炎症誘発剤はまた有用でありうる。
５-リポキシゲナーゼに加えて、１２-及び１５-リポキシゲナーゼがまたヒトの体で発現される。
１２-リポキシゲナーゼ(１２-ＬＯ)はヒト血小板中で高度に発現されるがこの酵素の生物学的な役割については殆ど知られていない１。
【００１３】
１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)１型(ヒト１５-ＬＯ：ＥＣ１．１３．１１．３３)は非ヘム鉄を含む７５-ｋＤａのタンパク質である。１５-ＬＯはアラキドン酸(２０：４)のＣ-１５又はリノール酸(１８：２)のＣ-１３に分子酸素を導入して１５Ｓ-ヒドロペルオキシ-５,８,１１-ｃｉｓ-１３-ｔｒａｎｓ-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＰＥＴＥ)又は１３Ｓ-ヒドロペルオキシ-９-ｃｉｓ-１３-ｔｒａｎｓ-オクタデカジエン酸(１３-ＨＰＯＤＥ)をそれぞれ形成する。少量の１２Ｓ-ヒドロペルオキシ-５,８,１４-ｃｉｓ-１０-ｔｒａｎｓ-エイコサテトラエン酸(１２-ＨＰＥＴＥ)がまた１５-ＬＯ酵素によってアラキドン酸から形成される。簡単に述べると、触媒反応は不飽和脂肪酸のｃｉｓ-ｃｉｓ-１,４-ペンタジエン構造(２０：４又は１８：２)のＣ-３における水素除去を含んでおり、炭素ラジカルとＦｅ３＋からＦｅ２＋への鉄の還元を生じる(以下のスキーム１参照)。
【００１４】
ラジカルはＣ-５に移動し、そこで分子酸素と反応してペルオキシ基を形成する。ペルオキシ基による鉄からＦｅ３＋への酸化は、プロトン化されて最終の脂質ヒドロペルオキシドを生じるペルオキシ陰イオンを生じる。
【００１５】
ウサギ酵素１５-ＬＯはクローニングされ結晶化され、基質結合部位が、その基部がＰｈｅ３５３、Ｍｅｔ４１９、Ｉｌｅ４１８及びＩｌｅ５９３の側鎖によって定まる深い疎水性ポケット２２であることが見出されている。脂肪酸基質は(酵素の表面で)Ａｒｇ４０３によって繋留され位置せしめられている。変異原性研究により、疎水性ポケットのサイズの変動が酵素の位置特異性に影響を及ぼすことが立証されている。よって、 １５-ＬＯのポケットの拡大が１２-リポキシゲネーション産物(１２-ＨＰＥＴＥ)の量を増大させた。１５-ＬＯ中の鉄はヒスチジンとＣ末端イソロイシンのカルボキシ基に配位されている。
【００１６】
１５(Ｓ)-ＨＥＴＥへの還元を受けることに加えて、１５(Ｓ)-ＨＰＥＴＥはまた脱水を受けて１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)を生じる。このアリルエポキシドはジヒドロキシ酸８(Ｒ,Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４又は１４(Ｒ,Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４に加水分解されうる１１-１２。また、基質として１５-ＨＰＥＴＥを用いて、１５-ＬＯは二重の二原子酸素付加産物５(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ,８(Ｓ,Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び１４(Ｒ,Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥの形成をまた触媒する。
【００１７】
１５(Ｓ)-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)は遊離脂肪酸を代謝するばかりでなく、膜に存在しているポリエン脂肪酸を攻撃することもできる。該酵素はミトコンドリア膜の崩壊を通して網状赤血球の成熟において重要な役割を担っていることが予想された３。しかしながら、該酵素はケラチノサイトや眼水晶体の成熟のような、細胞の分化においてより一般的な役割を担いうる４。１５-ＬＯは主として網状赤血球、好酸球、皮膚、単球／マクロファージ及び気道上皮において発現される５。インターロイキン-４(ＩＬ-４)及びインターロイキン-１３(ＩＬ-１３)は培養された単球及び上皮細胞における１５-ＬＯの発現を誘導するが６、ある種の細胞への損傷が１５-ＬＯの活性を増加させることが報告されている(Green FA. Transformation of 5-HETE by activated keratinocyte 15-lipoxygenase and the activation mechanism. Lipids 25, 618-623 (1990))。
【００１８】
５-リポキシゲナーゼ及び１２-リポキシゲナーゼとは異なり、１５-ＬＯはウサギ及びヒト細胞においてのみ発現されると思われる１。ヒト１５-ＬＯのマウスオルソログは白血球型の１２-ＬＯであると思われる１。しかしながら、二つの酵素活性の調節はかなり異なっているようである７。
１５-ＬＯは２０年以上も前に発見され、均一になるまで精製される最初の１５-ＬＯはウサギ網状赤血球から取り出された８。該酵素のヒト型は網状赤血球及び上皮細胞からクローニングされており、免疫学的研究から、該酵素は網状赤血球、好酸球及び気道上皮において同一である９。１５-ＬＯの第二の型(２型)はヒト毛根からのｃＤＮＡライブラリーからクローニングされ、続く該酵素の発現とアミノ酸解析により、この１５-ＬＯの２型酵素は先に開示された１５-ＬＯの１型とおよそ４０％同一であることが証明された１０。
【００１９】
１５-ＬＯは、主として抗炎症効果を有していると思われるリポキシンの形成に関与していると思われるが１３、１５-ＬＯ誘導産物の５-オキソ-１５-ヒドロキシ-６,８,１,１３-エイコサテトラエン酸はヒト好酸球に対する強力な走化性剤であると報告されている１４。ヒトにおける１５-ＬＯ経路の生理学的及び病態生理学的役割は十分には特徴付けされていない。
【００２０】
ロイコトリエン類のような生物システム中で生じることが知られているアラキドン酸代謝物に基づいて、多くの異なったアナログが合成されている。例えば１４,１５-ＬＴＣ４のようなＬＴＣ４の合成アナログは気管支収縮を誘導しなかった。Drazen, J.M., Lewis, R. A., Austin, K.F., Toda, M., Brion, F., Marfat, A.及びCorey, E.J.: Contractile activities of structural analogs of leukotrienes C and D: necessity of a hydrophobic region. Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3195-3198 (1981)。
【発明の概要】
【００２１】
我々は炎症誘発効果を有するアラキドン酸代謝物の生物システム中における産生を同定した。該代謝物は１５-リポキシゲナーゼの作用を介して、可溶型グルタチオンＳトランスフェラーゼ及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼの作用を介して形成されうる。該代謝物はエオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４と命名される。我々は、抗炎症化合物及びエオキシンＣ４、Ｄ４及びＥ４形成を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング法を提供する。
【００２２】
我々は、ホジキン細胞株Ｌ１２３６１５が１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)の１型活性を有しており、１５-ＬＯ経路を介してアラキドン酸をエオキシン類に転換することを示す。Ｌ１２３６中におけるエオキシンＣ４、Ｄ４及びＥ４の存在及び形成を明らかにした後、我々は、これらエオキシン類が他のヒト細胞及び組織、特に好中球において形成されるが、また鼻ポリープ組織及び樹状細胞(実施例２)によっても形成されることをまた示す。我々はまた広範囲の細胞型が１５-ＬＯを発現することを示す。興味深いことに、炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患に罹患している患者の細胞、例えばホジキンリンパ腫の患者のリンパ節中のリード・シュテルンベルク細胞、サルコイドーシス患者の肺バイオプシーの類上皮細胞、関節リウマチの滑膜細胞及びアルツハイマー病の患者のニューロン(実施例３)は、コントロール細胞と比較して１５-ＬＯの増大した発現を示した。
【００２３】
これらの新しい代謝物の生合成の立証と、関連する酵素の同定に加えて、エオキシン類の生物学的効果をまた記載する。例えば、実施例６ａには、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４は内皮細胞の透過を引き起こす点でヒスタミンより約１００倍強力であることが示され(炎症のインビトロモデル)、５-ＬＯ経路を通して形成された姉妹代謝物ＬＴＣ４に匹敵する作用強度を示す。例えば、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４はコンフルエントなウシ又はヒト内皮細胞を有するモデル系において１０-７及び１０-８Ｍにて有意な血漿漏出を誘導する。炎症の他のモデルでは、 ＥｏｘＣ４及びＥｏｘＤ４はＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導したが、ＥｏｘＥ４はＩＬ-５で刺激された好酸球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導した。我々はまたエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成を阻止する化合物を実証した。
【００２４】
我々は、それぞれエオキシンＣ４(ＥｏｘＣ４)、エオキシンＤ４(ＥｏｘＤ４)及びエオキシンＥ４(ＥｏｘＥ４)と命名されたエオキシン：１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４、及び１４,１５-ＬＴＥ４と命名されたアラキドン酸からの３種の１５-リポキシゲナーゼ誘導代謝物を同定する。
アラキドン酸からの１５-ＬＯ誘導システイニル含有産物エオキシンＣ４、Ｄ４及びＥ４の形成は真核又は原核細胞において以前には決して記載されていない。
【００２５】
ＲＰ-ＨＰＬＣを使用して代謝物を単離し、代謝物の構造を陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって決定した。エオキシン類は２８２ｎｍで最大ＵＶ吸光度を示すコンジュゲートトリエン構造を有している。我々は、これらの代謝物が、アラキドン酸が１５-ＬＯで触媒された転換により１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４；エオキシンＡ４)になり、これがグルタチオンとコンジュゲートさせられて１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４；エオキシンＣ４)になり、これが続いて１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４；エオキシンＤ４)及び１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４；エオキシンＥ４)まで代謝されることによって形成されると考える。
【００２６】
１４,１５-ＬＴＡ４(エオキシンＡ４)からの１４,１５-ＬＴＤ４(エオキシンＤ４)の形成に関与する酵素は、実施例４において検討されるように、ＬＴＣ４-シンターゼ及び／又は可溶型グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、特にＧＳＴＭ１、及びＧＳＴＰ１であると考えられる。
示唆される経路を以下に示す：
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第一の態様は、生物システムにおけるエオキシンＣ４,エオキシンＤ４,又はエオキシンＥ４の形成を調節する化合物を同定する方法であって、１５-ＬＯ活性又はＧＳＴＭ１-１、ＧＳＴＰ１-１及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法を提供する。
本発明の第二の態様は、炎症調節効果又は骨量減少調節(典型的には骨量減少低減)効果を有する化合物を同定する方法であって、生物システムにおけるエオキシンＣ４,エオキシンＤ４又はエオキシンＥ４の形成及び／又は活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法を提供する。
【００２８】
「形成を調節する」には、エオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成及び／又は活性を阻害又は促進することが含まれる。典型的には、該方法は、ＥｏｘＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成及び／又は活性を阻害するための化合物を同定するために使用しうる。かかる化合物はまた骨量減少低減化合物であると考えられる。該化合物は典型的にはＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性を阻害しうる。
該方法は、あるいは、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性を促進するための化合物を同定するために使用することができる。かかる化合物は炎症誘発性であると考えられる。かかる化合物は典型的にはＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の形成を促進しうる。
【００２９】
本発明の第一の態様の方法は、生物システムにおけるＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成又は活性に対する効果について化合物を試験する工程を更に含みうる。
生物システムは典型的には１５-ＬＯ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(典型的には可溶型グルタチオンＳトランスフェラーゼ、例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１)及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性を含む。
【００３０】
化合物は、以下で更に検討するように、細胞画分又は単離酵素又は酵素群を含む系において試験することができる。あるいは、本発明の第一又は第二の態様の方法は、ホールセルに対する試験化合物の効果を試験することによって実施することができる。例えば、該方法は、エキソビボヒト細胞又は細胞株を使用して実施することができる。例えば、ヒト好酸球又は肥満細胞(例えば実施例８に記載したような、例えば臍帯血由来の肥満細胞)又はＬ１２３６細胞株を使用することができるが、例えば１５-ＬＯ及び／又はＧＳＴのような必要な酵素を発現する(内因性又は組換えの何れでも)ヒト鼻ポリープ組織及び／又は樹状細胞又は任意の他の細胞又は細胞株もまた使用することができる。しかしながら、この種の代謝経路に関与する酵素が同じ位置にある必要はない。様々なアラキドン酸代謝物の形成におけるよく知られた現象は経細胞生合成、つまり最初の酵素工程が一つの細胞型において触媒され、中間体が他の細胞型に搬出されて、そこで第二の酵素工程が実施されるものである。例えばエオキシンＡ４の生合成は一細胞型において生じる一方、エオキシンＡ４からエオキシンＣ４への転換(及び場合によってはエオキシンＣ４からエオキシンＤ４及びエオキシンＥ４への転換も)は第二の細胞型において生じうる。よって、試験は、エオキシン類の生合成のための補完酵素能力を持つ２つの細胞型の同時インキュベーションで実施することもまたできる。
【００３１】
当業者には明らかなように、アッセイ手順の前又はその一部として細胞を刺激し；又は例えば実施例に記載しているように、アッセイにアラキドン酸を提供することが必要である。実施例８において検討するように、ＬＴＣ４、プロスタグランジンＤ２又はＩＬ-５によって好酸球を刺激してＥｏｘＣ４を産生させることができる。１５-ＬＯ-１の発現を誘導するためには例えばＩＬ-４を使用して肥満細胞を刺激し；ついで実施例８で検討するようにアッセイにおいてアラキドン酸を提供することが望ましい場合がある。他の細胞はエオキシン類を放出することができるために刺激を必要としない場合がある。例えば、実施例８において検討されるように、ヒト鼻ポリープ細胞はエオキシン類を自発的に放出することができると考えられる。
【００３２】
当業者には明らかなように、エオキシンＣ４の形成に対する効果が試験されているならば、エオキシンＣ４の代謝物の生合成に関与する現在の酵素(例えばｇ-グルタミル-トランスペプチダーゼ又はジペプチダーゼ)を有していることは必要ではない。同様に、１５-ＬＯ活性に対する効果が試験されている場合、１５-ＬＯ(エオキシンＡ４)の代謝物の生合成に関与する現在の酵素、例えばＬＴＣ４シンターゼ又は可溶型グルタチオンＳトランスフェラーゼ、例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１を有していることは必要ではない。当業者には明らかなように、一又は限られた数の酵素が存在している系と、より多くの酵素(例えばアラキドン酸からのエオキシン合成に関与する酵素の全て、例えば１５-ＬＯ；ＬＴＣ４シンターゼ又は可溶型ＧＳＴ、例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１)が存在する系の双方において化合物を試験することが望ましい場合がある。当業者にはよく知られているように、単一又は限られた酵素系での試験は構造-機能関係を樹立するのに有用でありうる一方；複雑な系での試験は化合物がインビボで有用である可能性があるかどうかを樹立するのに有用でありうる。
【００３３】
上述のように、ある化合物がエオキシンＣ４、エオキシンＤ４又はエオキシンＥ４の形成を阻害することができるかどうかを試験する適切な方法は、実施例７に例証する。しかしながら、別法として、他の細胞株は、それらがエオキシンを生産する酵素的機構を有しているならば使用することができ、細胞型に応じた手順の変更は当業者には明らかである。
エオキシン類は、例えばＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、質量分析法、ＵＶ分光法及び異なった免疫学的方法、例えばＥＩＡ及びＲＩＡによって検出し定量することができる。
【００３４】
現在、上記のように、１５-ＬＯ酵素の２つの型がクローニングされている。２型１５-ＬＯは１型１５-ＬＯとおよそ４０％同一である。１型１５-ＬＯとは異なり、リノール酸は２型１５-ＬＯのための乏しい基質である。現在の知識では、阻害のための好ましい酵素はよって１５-ＬＯの１型であるが、１５-ＬＯの２型を、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成に至る代謝経路における酵素として除外することはできない。
１５-ＬＯの触媒活性は例えば記載されているようにして測定することができる９。該酵素は、当該試験化合物の存在下又は不在下で１５-(ｓ)-ＨＥＴＥへのアラキドン酸(基質)の転換又は１３-ヒドロキシオクタデカジエン酸(１３-ＨＯＤＥ)へのリノール酸(基質)の転換を評価することによってアッセイすることができる。化合物が存在している場合における１５-(Ｓ)-ＨＥＴＥ又は１３-ＨＯＤＥの形成の減少は酵素活性における減少を例証する。そのような化合物は、エオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成において最初の酵素段階を阻止する。かかる化合物はインビボで抗炎症作用を有していると考えられる。
【００３５】
本発明の第一の態様の一側面では、ヒト１５-ＬＯの触媒活性を試験するためのアッセイは実施例５に記載されているように考えられる。ここに示したアッセイは、ジフェニル-１-ピレニルホスホン(ＤＰＰＰ)をホスフィンオキシドに酸化する脂質ヒドロペルオキシドの能力を利用する。ジフェニル-１-ピレニルホスホンは酸化されるまでは非蛍光化合物である。ＤＰＰＰの酸化は蛍光化合物を生じ、これは温度に感受性がなく、少なくとも６０分間安定である。
【００３６】
本発明の第一の態様の他の側面では、問題の試験化合物の存在下又は不在下で、１５-(Ｓ)-ＨＥＴＥへのアラキドン酸又は１３-ヒドロキシオクタデカジエン酸(１３-ＨＯＤＥ)へのリノール酸(基質)の転換を決定するために細胞可溶化物においてアッセイを実施する。
上記の新規の１５-リポキシゲナーゼで触媒されたアラキドン酸代謝物の形成における重要な酵素の他のものは可溶型ＧＳＴである。実施例４に示すように、ＧＳＴＭ１-１、ＧＳＴＰ１-１及び／又はＬＴＣ４シンターゼはエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４の形成に関与しうる。よって、本発明の第一態様の実施態様では、ＧＳＴＭ１-１、ＧＳＴＰ１-１及び／又はＬＴＣ４シンターゼの触媒活性に対する試験化合物の効果が評価される。ＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１の触媒活性のアッセイは本質的に実施例４に記載されているようにして実施することができる。
【００３７】
本発明の第二の態様の実施態様では、実施例６ａに記載されたもののように、炎症のインビトロモデルにおいてエオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４で誘導した内皮細胞の透過を調節するその能力について試験化合物をアッセイする。かかる試験はまた本発明の第一の態様の方法との関連で実施することもできる。
化合物は、例えば炎症のウサギモデルのように１５-ＬＯが存在している動物又は炎症のエキソビボモデルにおいて又は１５-ＬＯを発現するトランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)において試験することができる。化合物は炎症のヒトエキソビボモデルにおいて、例えばヒト末梢血又はヒト臍帯血について、又はヒト末梢血もしくはヒト臍帯血から単離した細胞について、例えば白血球、例えば好中球、好酸球、樹状細胞又は肥満細胞について試験することができる。かかる試験の例は実施例の例えば実施例６ｂに記載される。該化合物はまた例えばＵＳ２００３／０１７５６８０に記載されているように、幹細胞又は他の骨形成細胞前駆体を骨細胞に分化させる能力について試験することができる。
【００３８】
試験される化合物は、例えば上で検討したように、化合物の構造が１５-ＬＯの基質結合部位と比較され、又はそれに基づいて設計もしくは修飾される構造ベースのスクリーニング法に基づいて選択することができる。出発化合物は最初は１５-ＬＯ酵素活性に対する効果について(例えば実施例５に記載されているアッセイを使用して)スクリーニングすることによって選択することができ；ついで、構造と比較し；例えばエオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４形成に対する効果について更なるモデル化及び／又は合成及び評価によってついで試験することができる更なる化合物を設計するための基礎として使用される。
【００３９】
(例えば実施例５に記載されているような)ＤＰＰＰを使用する１５-ＬＯ活性に対する効果の評価は、分光光度アッセイを使用することができ、直ぐに実施でき、例えば高スループット試験に非常に適したマイクロタイタープレート方式に使用することができることを意味する。アラキドン酸又は１５-ＨＰＥＴＥ又は他のアラキドン酸代謝物を基質として使用する評価は、１５-ＬＯ活性をインビボで調節する化合物の能力を確認するのに有用でありうる。
化合物にはまた当業者によく知られているように他の試験、例えば毒性学又は代謝試験を施すことができる。
【００４０】
本発明は、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の一又は複数の形成又は活性を調節、例えば亢進又は阻害するのに有用な薬剤を同定しようとする際に使用されるスクリーニングアッセイを提供することが理解される。該方法において同定される化合物はそれ自体薬剤として有用であり得、あるいはそれらはより効能のある化合物の設計と合成のためのリード化合物を表しうる。
該化合物は上記の化合物を同定する方法の各々に対して薬物様化合物又は薬物様化合物の開発のためのリード化合物でありうる。上記方法は、当業者によく知られているように、薬学的化合物又は薬物の開発におけるスクリーニングアッセイとして有用でありうることが理解される。
【００４１】
「薬物様化合物」という用語は、当業者によく知られており、医学における使用に適する特性、例えば、医薬品における有効成分としての特性を有する化合物の意味を含んでいてよい。従って、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によるか、それより好ましくはないが、分子生物学又は生化学の技術により合成される分子であってよく、５０００ダルトン未満であってよい小分子であることが好ましい。薬物様化合物は、特定のタンパク質又はタンパク質群との選択的な相互作用の特徴を更に示し、生物利用及び／又は細胞膜を透過可能でありうるが、これらの特徴が必須ではないことは理解されるであろう。
「リード化合物」という用語は、同様に当業者によく知られており、それ自体薬物としての使用に適さない(例えば、その所期の標的に対して弱い効力を示すにすぎず、その作用が非選択的で、不安定で、溶解性に乏しく、合成が困難又は不十分な生物学的利用能を有する)が、その化合物がより望ましい特性を有する他の化合物の設計の出発点を与えるものであるという意味を含みうる。
【００４２】
高スループット操作が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことが理解される。上で検討したように、ＤＰＰＰを使用する酵素アッセイ法を使用することができる。
適切な場合には、炎症又はインビボでのエオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成又は活性を調節しうる化合物を同定することは望ましいであろうことは理解される。よって、本発明の方法で使用される試薬と条件は、例えば１５-ＬＯと基質の間の相互作用が、ヒト１５ーＬＯと天然に生じる基質(例えばアラキドン酸)との間のものに類似するように選択することができることは理解されるであろう。当業者には明らかなように、異なったアッセイ系を用いて化合物を評価することができ、その幾つかにおいてエオキシン形成に関与する特定の酵素に対する効果に対する特異性又はアッセイの簡便性を(例えば単一酵素系を使用して)最適化されうる一方、他のものでは、インビボ関連性を、例えばホールセル中の化合物の効果を評価することによって最適にすることができる。
【００４３】
本発明のスクリーニングアッセイは炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患の治療において有用な化合物の探索に有用である。インビトロ及び／又はインビボスクリーンイングをベースとして選択した化合物を、炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患における抗炎症効果について更に試験することができる。同様に、本発明のスクリーニングアッセイは骨量減少の治療又は防止／骨形成亢進に有用である化合物の探索に有用である。インビトロ及び／又はインビボスクリーニングをベースにして選択された化合物は、骨量減少の患者又はその危険のある患者又は炎症プロセスを含む疾患における骨量減少／骨形成亢進効果について更に試験することができる。
【００４４】
「炎症」という用語は、上で述べたもののような身体外傷、感染、慢性疾患によって誘発されうる局所的又は全身性保護反応、及び／又は外部刺激に対する化学的及び／又は生理学的反応(例えばアレルギー反応の一部として)によって特徴付けられる任意の症状を含むと当業者には理解される。有害な薬剤と傷ついた組織の双方を破壊し、希釈し又は隔離する作用をするあらゆるそのような応答は、例えば発熱、腫れ、痛み、発赤、血管拡張及び／又は血流増加、白血球の罹患領域への侵入、機能喪失及び／又は炎症症状に伴うことが知られている任意の他の徴候に顕れうる。
よって、「炎症」という用語は、任意の炎症性疾患、障害又は症状自体、それを伴う炎症要素を持つ任意の症状、及び／又はとりわけ急性、慢性、潰瘍、特異、アレルギー性及び壊死性炎症、及び当業者に知られている炎症の他の形態を含む、徴候として炎症によって特徴付けられる任意の症状を含むものとまた理解される。よって、その用語はまた本発明の目的に対して、炎症痛及び／又は発熱を含む。
【００４５】
エオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成又は活性を減少させる化合物は炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患を治療するのに有用である。従って、本発明のスクリーニング法は、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、肺線維症、アレルギー性疾患、鼻炎、炎症性腸疾患、潰瘍、炎症性痛覚、発熱、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、脈管炎、膵炎、関節炎、変形性関節炎、関節リウマチ、結膜炎、虹彩炎、強膜炎、ブドウ膜炎、創傷、皮膚炎、湿疹、乾癬、発作、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、高血圧(例えばAnning PB等 (March 2005) Elevated endothelial nitric oxide bioactivity and resistance to angiotensin-dependent hypertension in 12/15-lipoxygenase knockout mice. Am J Pathol. 166(3):653-62を参照)、ホジキンリンパ腫及び他の悪性腫瘍、又は炎症成分を有する任意の他の疾患の治療に有用であり得る化合物を同定するのに有用である。
【００４６】
本発明のスクリーニング法は、またＵＳ２００３／０１７５６８０において検討されているように、例えば骨粗鬆症、骨関節炎、パジェット病又は歯周病に伴う骨量減少の治療又は予防に有用である化合物を同定するのに有用であると考えられる。よって、本発明のスクリーニング法は、患者における骨ミネラル密度の増加、並びに骨折の発生の低減及び／又は治癒において有用であり得る化合物を同定するのにも有用であり得る。
該化合物は上述の症状の治療的及び／又は予防的処置の双方において有用であり得る。
【００４７】
エオキシンＣ４、Ｄ４又はＥ４の形成又は活性を減少させる化合物は、例えば免疫抑制性患者、例えば化学療法又は移植の拒絶を減少させる治療を受けている患者において炎症応答の促進が望ましい場合がある患者を治療するのに有用であると考えられる。例えばＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４は、炎症応答の促進が望ましい患者を治療するのに有用であると考えられる。
【００４８】
従って、本発明の更なる態様は、治療的有効量のＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４を患者に投与することを含む、炎症反応の促進を必要とする患者の治療方法を提供する。本発明の更なる態様は、炎症反応の促進を必要とする患者の治療のための医薬の製造におけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の使用を提供する。
【００４９】
本発明のスクリーニング法を実施する結果として、例えば実施例７に示されるように、典型的にはペプチド又は低分子でありうる化合物が同定される。該化合物は、薬学的使用、例えば患者、例えば動物(典型的には１５-ＬＯを発現する哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ又はサル、好ましくはウサギ又は他の動物(例えばトランスジェニック動物))又はヒトにおけるインビボ治験での使用のために製剤化することができる。
【００５０】
本発明の第三の態様は、抗炎症組成物又は骨量減少低減組成物を製造する方法であって、
(ｉ)本発明の第二の態様の方法によって抗炎症又は骨量減少低減化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法を提供する。
本発明の第四の態様は、エオキシン形成調節組成物を製造する方法であって、
(ｉ)本発明の第一の態様の方法によってエオキシン形成調節化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法を提供する。
【００５１】
該組成物は典型的には有効量の化合物を患者に供給するものである。「有効量」という用語は、治療された患者に治療効果を付与する化合物の量を意味する。効果は客観的(すなわち、ある試験又はマーカーで測定可能)でありうるか、又は主観的(すなわち、患者が効果の顕れを示すか又は効果を感じる)でありうる。
該組成物は、経口的、静脈内、皮下的、口腔的、経直腸的、皮膚的、経鼻的、経気管的、経気管支的、舌下的、任意の他の非経口経路によって又は吸入を介して、 薬学的に許容可能な投薬形態で投与されることが意図され、又はそのようにして投与されるのに適したものでありうる。該組成物は、例えば経口投与のための錠剤、カプセル剤又はエリキシル剤、直腸投与のための坐薬、非経口又は筋肉内投与のための滅菌液又は懸濁液等々でありうる。該組成物は吸入用のスプレー又は注射用の液体であり得る。かかる組成物は標準的な及び／又は認められている薬学的実務に従って調製することができる。
【００５２】
該組成物はまた(例えばＮＳＡＩＤｓ、コキシブ類、副腎皮質ステロイド類、鎮痛剤、５-リポキシゲナーゼ阻害剤、ＦＬＡＰ阻害剤(５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質)、及びロイコトリエンレセプターアンタゴニスト(ＬＴＲａｓ)、及び／又は炎症の治療に有用な他の治療剤から選択される)ここで定義された炎症の治療に有用な他の治療剤を含みうる。
あるいは、該組成物はまた骨量減少の低減又は骨形成の増加に有用な他の治療剤、例えばビスホスホネート、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプター調節因子(ＳＥＲＭ)、カルシトニン(calcinonin)又はタンパク質同化薬を含みうる。かかる治療剤の例は、例えばＵＳ２００３／０１７５６８０の、例えば段落［００６５］で検討されている。
かかる組合せ製品は他の治療剤との関連で同定された化合物の投与をもたらし、よって、その製剤の少なくとも一つが同定されたものを含み、少なくとも一つが他の治療剤を含む別個の製剤として提供することができ、又は併用調製物(つまり同定された化合物と他の治療剤を含む単一製剤として提供)として提供(つまり製剤化)されうる。
【００５３】
化合物は様々な用量で投与できる。経口、肺及び局所用量は、１日・ｋｇ体重当たり約０．０１(ｍｇ／ｋｇ／日)から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．０１から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．１から約５．０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。例えば、経口投与では、組成物は典型的には約０．０１ｍｇから約５００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇから約１００ｍｇの活性成分を含む。経静脈的には、最も好ましい用量は一定速度の注入の間、約０．００１から約１０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲である。有利には、化合物は単一の一日用量で投与することができ、又は一日の全用量を、毎日２回、３回又は４回の分割量で投与してもよい。
【００５４】
とにかく、医師又は当業者であれば、個々の患者に最も適し、投与経路、治療されるべき症状のタイプと重症度、並びに処置される特定の患者の種、年齢、体重、性別、腎機能、肝機能及び応答によって変わり得る実際の用量を決定することができるであろう。上記の用量は平均的な場合の例である；より高い又は低い用量範囲が有利となる個々の場合ももちろん有り得、それも本発明の範囲内である。例えば実施例７はエオキシン類の形成を阻害可能な化合物が同定される方法を示している。
次に、本発明を次の非限定的な図面及び実施例を参照しながら更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】アラキドン酸(４０μＭ)と共に１０分間インキュベーションした後のＬ１２３６細胞によって形成された２３６ｎｍでのＵＶ吸光度を持つ産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。挿入：それぞれ１５(Ｓ)-ＨＥＴＥ及び１２(Ｓ)-ＨＥＴＥで共溶出した物質のＵＶスペクトル。
【図２ａ】アラキドン酸(４０μＭ)と共に１０分間インキュベーションした後のＬ１２３６細胞によって形成された２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を持つ産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。１-５の数字は合成標準の保持時間に対応する：１)８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；２)８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ；３)８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４,４)８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び５)１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ。
【図２ｂ】ピークＩ-ＩＶ下で溶出する代謝物のＵＶスペクトル。
【図３】ピークＩＩの物質の［Ｍ-Ｈ］-イオンの４００ｅＶ(Ｅｌａｂ)ＣＩＤスペクトル。上方パネル：ＬＴＣ４；中央パネル：ピークＩＩ；下方パネル：合成１４,１５-ＬＴＣ４。
【図４】ピークＩＶの物質の［Ｍ-Ｈ］-イオンの４００ｅＶ(Ｅｌａｂ)ＣＩＤスペクトル。上方パネル：ＬＴＤ４；中央パネル：ピークＩＶ；下方パネル：合成１４,１５-ＬＴＤ４。
【図５】１４,１５-ＬＴＡ４(２μＭ)と共に３０分インキュベートした後にＬ１２３６細胞によって生成された産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。１、３及び５の数は、それぞれ８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４、及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４に対する合成標準の保持時間に対応する。ピークＩ-ＩＶは図２のピークＩ-ＩＶと同じ保持時間及びＵＶスペクトルを有していた。挿入：ピークＶ下で溶出する物質のＵＶスペクトル。
【図６】ピークＶの物質の［Ｍ-Ｈ］-イオンの４００ｅＶ(Ｅｌａｂ)ＣＩＤスペクトル。上方パネル：ＬＴＥ４；中央パネル：ピークＶ；下方パネル：合成１４,１５-ＬＴＥ４。
【図７】１５-ＬＯ経路及び１４,１５-ロイコトリエン類(エオキシン類)の生合成のための示唆された経路の概観。
【図８ａ】アラキドン酸と共になされたＬ１２３６細胞のインキュベーション。ａ)４０μＭのアラキドン酸と共に行ったインキュベーション後の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成の時間経過。
【図８ｂ】アラキドン酸と共になされたＬ１２３６細胞のインキュベーション。ｂ)示されている様々な濃度のアラキドン酸と共に行った５分のインキュベーション後の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成の用量応答曲線。
【図９ａ】アラキドン酸(２０μＭ)と共に５分間なされたインキュベーション後にヒト好酸球細胞によって生成された産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。ａ)形成された産物のＨＰＬＣクロマトグラム。エオキシンＣ４、ＬＴＣ４、８,１５-ＤＨＥＴＥｓ(図２参照)及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥに対する合成標準との共溶出が示されている。
【図９ｂ】アラキドン酸(２０μＭ)と共に５分間なされたインキュベーション後にヒト好酸球細胞によって生成された産物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラム。ｂ)合成エオシンＣ４と共溶出するピーク下の物質のＵＶスペクトル。
【図１０】ａ)エオシンＣ４と共溶出する物質、ｂ)合成エオシンＣ４及びｃ)合成ＬＴＣ４のポジティブイオンＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１１】好酸球を５、１０、２０及び４０μＭのアラキドン酸と共に、ａ)２分、ｂ)５分及びｃ)１０分インキュベートした。２回の別個の実験の平均。
【図１２ａ】切り取ったヒト鼻ポリープを４０μＭのアラキドン酸と共に５分間インキュベートした後にエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物を形成。
【図１２ｂ】合成エオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)と共溶出するピークの物質のＵＶスペクトル。
【図１３ａ】ヒト樹状細胞を４０μＭのアラキドン酸と共に５分間インキュベートした後にエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物を形成。
【図１３ｂ】合成エオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)と共溶出するピークの物質のＵＶスペクトル。
【図１４】免疫染色。ホジキンリンパ腫の患者からのリンパ節における１５-ＬＯの発現。ヒト１５-ＬＯの特異的ペプチド配列に対して産生されたポリクローナル１５-リピキシゲナーゼ抗血清と続いて二次ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いた。リード・シュテルンベルク細胞における強い染色が観察された(図の中央部分の多核細胞)。
【図１５】免疫染色。サルコイドーシスの患者からの肺バイオプシーにおける１５-ＬＯの発現。ヒト１５-ＬＯの特異的ペプチド配列に対して産生されたポリクローナル１５-リピキシゲナーゼ抗血清と続いて二次ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いた。類上皮細胞(肉芽腫)における強い染色が観察された。
【図１６】免疫染色。関節リウマチ患者のＡ)滑膜細胞及びＢ)軟骨細胞、Ｃ)アルツハイマー患者の脳皮質からの錐体細胞、及びＤ)星状細胞腫検体からの星状膠細胞の検体における１５-ＬＯの発現。
【図１７ａ】生成されたＧＳＴＭ１-１によるＡ)エオキシンＡ４(１４,１５-ＬＴＡ４)からエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)への代謝。
【図１７ｂ】生成されたＧＳＴＭ１-１によるＢ)ＬＴＡ４からＬＴＣ４への代謝。
【図１８】様々な可溶型グルタチオンＳ-トランスフェラーゼによるエオキシンＡ４(１４,１５-ＬＴＡ４)からエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)への代謝。
【図１９】好中球の細胞成分分画をＥｏｘＡ４(４０μＭ)と共に５分間インキュベートした後に形成された生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。Ａ)上清及びＢ)膜分画。
【図２０】ＥｏｘＡ４(１０μＭ)(上方パネル)ＬＴＡ４(１０ｍＭ)(中央パネル)又は両方(下方パネル)と共に３７℃で５分間インキュベートした後のヒト好酸球に形成された生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２１】エオキシンＣ４及びＬＴＣ４の形成に対する５-リポキシゲナーゼ阻害剤(ＢＷ７０Ｃ)及びＬＴＣ４シンターゼ阻害剤(ＭＫ８８６)の効果。３７℃で５分間のＡ２３１８７(１μＭ)及びアラキドン酸(１０μＭ)での刺激の前に阻害剤の不在下又は存在下で２分間プレインキュベートした。
【図２２】コンフルエントなウシ内皮細胞(最大効果７０％)を持つモデル系における減少した抵抗として測定した血漿漏出に対するエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)、エオキシンＤ４(１４,１５-ＬＴＤ４)、エオキシンＥ４(１４,１５-ＬＴＥ４)及びＬＴＣ４の効果。
【図２３ａ】ＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ａ．酸素フリーラジカルを生産するように刺激された(塗り潰し記号)又はＧＭ-ＣＳＦ処理された後に刺激された(白抜き記号)精製血液好中球。「ＢＬＸ-２６」はＢＬＸ-９２６を示すために使用する。
【図２３ｂ】ＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｂ：ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)はＧＭ-ＣＳＦ刺激好中球によって酸素フリーラジカルを誘導した。結果は全ラジカル生成を示し、コントロール(刺激細胞)の％として、また平均＋／−標準偏差、ｎ＝１３として表している。
【図２３ｃ】ＧＭ-ＣＳＦで刺激された好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｃ：散乱したプロットは、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)がＧＭ-ＣＳＦ刺激好中球により酸素フリーラジカルを誘導したことを示している。結果は１分当たりのカウント(ＣＰＭ×１０６),ｎ＝１３として測定された全ラジカル生成を示す。線は基準線(ｋ＝１)を示し、その線の上の観測は全て刺激に対するレスポンダーであることを示す。
【図２４ａ】ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ａ．酸素フリーラジカルを生産するように刺激された(塗り潰し記号)又はＩＬ-５処理された後に刺激された(白抜き記号)精製血液好酸球。「ＢＬＸ-２７」はＢＬＸ-９２７を示すために使用する。
【図２４ｂ】ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｂ：刺激及びＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２７)はＩＬ-５刺激好酸球によって酸素フリーラジカルを誘導した。結果は全ラジカル生成を示し、コントロール(刺激細胞)の％として、また平均＋／−標準偏差、ｎ＝６として表している。
【図２４ｃ】ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)。測定されたパラメータを示す動的化学発光曲線。ｃ：散乱したプロットは、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２７)がＩＬ-５刺激好酸球により酸素フリーラジカルを誘導したことを示している。結果は１分当たりのカウント(ＣＰＭ×１０６),ｎ＝６として測定された全ラジカル生成を示す。線は基準線(ｋ＝１)を示し、その線の上の観測は全て刺激に対するレスポンダーであることを示す。
【図２５ａ】実施例７及び図２７及び２８で試験した化合物の構造。
【図２５ｂ】実施例７及び図２７及び２８で試験した化合物の構造。
【図２６】エオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)及びエオキシンＤ４(１４,１５-ＬＴＤ４)の形成に対するロイコトリエン阻害剤ＥＴＹＡの効果。
【図２７ａ】エオキシンＣ４の形成に対する試験化合物の効果。
【図２７ｂ】エオキシンＣ４の形成に対する試験化合物の効果。
【図２８ａ】エオキシンＣ４及び１５-ＨＥＴＥの形成に対する試験化合物の効果の比較。ａ)化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ。
【図２８ｂ】エオキシンＣ４及び１５-ＨＥＴＥの形成に対する試験化合物の効果の比較。ｂ)化合物Ｄ、Ｆ及びＧ。
【図２９】単離されたヒト好酸球における新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の形成。単離された好酸球(１０×１０６細胞)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ)中に再懸濁させ、２分間プレインキュベートした後、３７℃で５分間アラキドン酸(１０μＭ)で刺激した。３容量のメタノールを加えて反応を終結させた。蒸発後、試料を移動相に再懸濁させ、移動相としてＡｃＮ：ＭｅＯＨ：Ｈ２０：ＨＡｃ(２９：１９：７２：０．８体積)ｐＨ５．６を使用するＲＰ-ＨＰＬＣ-ＵＶ系中での分析を行った。
【図３０ａ】新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の液体クロマトグラフィー-質量分析。パネルＡ：合成１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４標準と比較した好酸球により形成された代謝物ＩのＬＣ-ＭＳ／ＭＳスペクトル。上方パネルは、３７℃で５分間のアラキドン酸(１０μＭ)付与後に好酸球に形成された代謝物の６２６．３［Ｍ＋Ｈ］＋の生成物イオンスキャンのスペクトルを示す。中央パネルは合成１４,１５-ＬＴＣ４標準のスペクトルであり、下方パネルは合成ＬＴＣ４標準のスペクトルである。
【図３０ｂ】新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の液体クロマトグラフィー-質量分析。パネルＢ：１４,１５-ＬＴＤ４及びＬＴＤ４合成標準と比較した好酸球により形成された代謝物ＩＩのＬＣ-ＭＳ／ＭＳスペクトル。上方パネルは、３７℃で６０分間好酸球と共にインキュベートした１４,１５-ＬＴＣ４(１０μＭ)から形成された代謝物の４９７．２［Ｍ＋Ｈ］＋の生成物イオンスキャンのスペクトルを示す。中央パネルは合成１４,１５-ＬＴＣ４標準のスペクトルであり、下方パネルは合成ＬＴＣ４標準のスペクトルである。
【図３０ｃ】新規な１５-リポキシゲナーゼ産物の液体クロマトグラフィー-質量分析。パネルＣ：１４,１５-ＬＴＥ４及びＬＴＥ４合成標準と比較した好酸球により形成された代謝物ＩＩＩのＬＣ-ＭＳ／ＭＳスペクトル。上方パネルは、３７℃で６０分間の好酸球と共にインキュベートした１４,１５-ＬＴＣ４(１０μＭ)から形成された代謝物の４４０．２［Ｍ＋Ｈ］＋の生成物イオンスキャンのスペクトルを示す。中央パネルは合成１４,１５-ＬＴＣ４標準のスペクトルであり、下方パネルは合成ＬＴＣ４標準のスペクトルである。
【図３１】衝突は１４,１５-ロイコトリエン類をシステイニルロイコトリエンから区別する解離断片を誘導した。陽イオンモードのＭＳ／ＭＳ生成物イオンスペクトルにおけるシステイニルロイコトリエン類と１４,１５-ロイコトリエン類の顕著な差はｍ／ｚ１８９及び２０５である。これらの断片イオンの推定起点を示す。
【図３２ａ】１４,１５-ロイコトリエン類によって誘導された血管透過性の変化。パネルＡ：１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４、ＬＴＣ４(１０-８Ｍ)及びヒスタミン(１０-５Ｍ)に応答した内皮細胞障壁機能における急速な変化の解析。分析は内皮細胞単層の各側に電極を配した経内皮電気抵抗(ＴＥＥＲ)の連続的記録によって達成した。このモデルの最大効果は-７０％の抵抗変化である。５回のうち２回の典型的な実験が実証される。各値は３通りの測定の平均値である。
【図３２ｂ】１４,１５-ロイコトリエン類によって誘導された血管透過性の変化。パネルＢ：ＬＴＤ４(１０-８Ｍ)と比較した、１４,１５-ＬＴＤ４(それぞれ１０-８Ｍ及び１０-７Ｍ)によって引き起こされる内皮細胞障壁機能の変化の時間経過。
【図３３】１４,１５-ロイコトリエン類(エオキシン類)の形成に対して提案する代謝経路。
【実施例】
【００５６】
実施例１：１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４、及び１４,１５-ＬＴＥ４(つまりエオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４)の生合成の証明。
材料と方法
合成１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)、１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１０(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)、１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)、１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ),１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ又は１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１１,１３(Ｚ,Ｚ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＥＴＥ)、１２(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１４エイコサテトラエン酸(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｚ)(１２(Ｓ)-ＨＥＴＥ)及び１３(Ｓ)-ヒドロキシオクタデカ-９,１１(Ｚ,Ｅ)-ジエン酸(１３(Ｓ)-ＨＯＤＥ)はＢｉｏｍｏｌｅ社(Plymouth Meeting, USA)から入手した。細胞培養培地RPMI 1640、仔ウシ血清、ペニシリン、ストレプロマイシン及びグルタミンはＧｉｂｃｏ,ＢＲＬから購入した。ＨＰＬＣ溶媒はＲａｔｈｂｕｒｎケミカルズ社 (Walkerburn, United Kingdom)から得た。
【００５７】
Ｌ１２３６細胞株
細胞株Ｌ１２３６は混合細胞性サブタイプのホジキンリンパ腫(ＨＬ)に罹患した患者の末梢血から元々は生産した１５。細胞は３７℃で５％のＣＯ２の雰囲気下で懸濁させて増殖させた。培養培地は、１０％の仔ウシ血清及び２ｍＭのグルタミンを補填した１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０であった。
【００５８】
実験条件及びＨＰＬＣ分析
細胞懸濁液を２００×ｇで５分間、遠心分離し、ペレットをＰＢＳ中に懸濁させた。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を１０-２０×１０６細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に溶解させた。試料を３７℃で２分間前もって温めた後、アラキドン酸、１４,１５-ＬＴＡ４又は他の示された代謝物を添加し、続いて示された期間、インキュベートした。インキュベーションは３容量の氷冷メタノールの添加により終結させた。沈殿したタンパク質と細胞断片を遠心分離によって除去し、過剰の水とエタノールを減圧下で蒸発させた。残留物をメタノールに溶解させ、ｍ試験管に移し、窒素流下で乾固させた。続いて、残留物を以下に記載するクロマトグラフィー溶剤で再構成させた。試料をオクタデシル逆相カラム(Chromabond, C18, 100mm, Macherey-Nagal, Duren, Germany)に充填し、０．４ｍｌ／分の流量で溶出させた。移動相は、システイニル含有アラキドン酸代謝物及びジヒドロキシ酸又はモノヒドロキシ酸それぞれの分析に対して、アセトニトリル／メタノール／水／酢酸(体積で２８：１８：７２：０．８、ｐＨは３０％ＮａＯＨで５．６に調整)又はメタノール／水／酢酸(体積で７２．５：２７．５：０．０１)であった。溶出した代謝物を、プログラム可能なＷａｔｅｒｓ９９１ダイオードアレイ分光光度計を使用して検出し定量した。
【００５９】
陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析
スペクトルを、記載されたように１６、衝突ガスとしてＸｅを用いて４００ｅＶの実験室フレーム衝突エネルギーでハイブリッド磁気セクター／飛行時間型タンデム機器に記録した。
【００６０】
結果
アラキドン酸と共にＬ１２３６細胞を１０分間インキュベートすると、主要産物が得られ、これを合成１５(Ｓ)-ＨＥＴＥと共に同時にクロマトグラフィーにかけた(図１)。また、合成１２(Ｓ)-ＨＥＴＥと共溶出した２３６ｎｍの最大ＵＶ吸光度のマイナーなピークを観察した。これらのピークの物質のＵＶスペクトルはそれぞれ１５-ＨＥＴＥ及び１２-ＨＥＴＥに対して報告されたスペクトルと一致している。１５-ＨＥＴＥ対１２ＨＥＴＥの比は約９：１であり、これはこれらの産物の１５-ＬＯの１型に触媒された形成と一致している５。これらの結果は、細胞が１５-ＬＯの１型の活性を有しているが５-リポキシゲナーゼ活性を有していないことを証明している。リノール酸は優れた基質であり、Ｌ１２３６細胞はリノール酸を１３-ＨＯＤＥに効率的に代謝したが(データは示さず)、これはこれらの細胞における１５-ＬＯの１型の発現に一致している。超音波処理細胞を抗１５-ＬＯウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロットが続くＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析すると、網状赤血球１５-ＬＯと共遊走した免疫反応性バンドが現れた(データは示さず)。
【００６１】
２３６ｎｍのＵＶを吸収するピークに加えて、約２７０ｎｍの最大ＵＶ吸光度と５-７分の保持時間を持つ多数のピークがクロマトグラムに観察された。アセトニトリルベースの移動相を使用してこれら産物を分離した。図２ａはアラキドン酸と共に１０分のインキュベーションを行った後に形成された生成物の典型的なＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。コンジュゲートトリエンスペクトルと２７２ｎｍに最大ＵＶ吸光度を含む５つのピーク(１-５)が観察された。これらのピークはそれぞれ８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ；８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥの合成標準に対応する溶出時間を有していた。これら生成物のパターンはアラキドン酸と共にインキュベートしたヒト気道上皮について報告されたものと殆ど同一であった17。しかしながら、クロマトグラム中の２つの更なる主要なピークはまたコンジュゲートトリエンスペクトルを有していたが、２８２ｎｍ(ＩＩ及びＩＶ)に最大ＵＶ吸光度を有していた(図２ｂ)。溶出物質を集め、陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって分析した。図３はピークＩＩ(中央パネル)からの物質の[Ｍ-Ｈ]イオンの衝突解離(ＣＩＤ)スペクトルを示す。質量スペクトルは、ＬＴＣ４に見出されなかったイオンｍ／ｚ３０６の存在を除いて、６２４に分子イオンを持ち、ＬＴＣ４(上方パネル)と殆ど同一であった。これらの細胞における観察された１５-ＬＯ活性に鑑みると、質量スペクトルは、代謝物が１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)であることを示している。生成物が確かに１４,１５-ＬＴＣ４であったことを確認するために、合成１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸を調製した。この合成代謝物の質量スペクトル(図３、下方パネル)はピークＩＩの物質のスペクトルと同一であった。他の主要な代謝物ピークＩＶの［Ｍ-Ｈ］-イオンの対応するＣＩＤスペクトルを図４に示す。この質量スペクトルは、ＬＴＤ４に見出されなかったイオン２５０及び２５１の存在を除いて、同じ分子イオンｍ／ｚ４９５を持つＬＴＤ４のスペクトルと非常に類似しており、代謝物が１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)であることを示している。合成１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸の[Ｍ-Ｈ]-イオンの対応するＣＩＤスペクトルは代謝物ＩＶのスペクトルとまた同一であった(図４、下方パネル)。更に、合成１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４はＲＰ-ＨＰＬＣでそれぞれ代謝物ＩＩ及びＩＶと正確に共溶出した。合成１４,１５-ＬＴＣ４と共に細胞をインキュベートすると１４,１５-ＬＴＤ４が形成された(データは示さず)。また、コンジュゲートトリエンスペクトルと２７８ｎｍに最大ＵＶ吸光度を持つ二つの他のマイナーなピークが観察された(図２ａ及びｂ、ピークＩ及びＩＩＩ)。ピークＩＩＩの物質を陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって分析した。この代謝物のＣＩＤスペクトルは１４,１５-ＬＴＤ４のＣＩＤスペクトルと同一であった(データは示さず)。この代謝物の正確な構造は確認されなかった。しかしながら、この代謝物のＣＩＤスペクトル及びＵＶプロファイルは、スペクトルが１４,１５-ＬＴＤ４のスペクトルと比較して４ｎｍ低色素的にシフトしているので、オールトランストリエン構造と一致している。従って、ピークＩＩＩの物質はおそらくは８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＤ４である。ピークＩの物質は質量スペクトルを得るには不十分であったが、８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＤ４の形成に沿って、該代謝物は８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＣ４である可能性が非常に高い。更に、細胞を合成１４,１５-ＬＴＣ４又は１４,１５-ＬＴＤ４と共にインキュベートするとそれぞれ代謝物Ｉ及びＩＩＩが形成され、これは、親１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４から想定されたオールトランストリエンが形成されたことを裏付けている(データは示さず)。
【００６２】
１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成機構及び二重結合構造を解明するために、細胞を２μＭの合成１４,１５-オキシド-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,ＥＥ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)と共に３０分インキュベートした。図５は細胞によって産生された生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。２７２ｎｍに最大ＵＶ吸光度とコンジュゲートトリエンスペクトルを有する３つのピークが観察された(ピーク１、３及び５)。これらの生成物はまた細胞をアラキドン酸と共にインキュベートしたときにも形成され(図２ａ)、生成物をそれぞれ合成８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４；８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４と同時にクロマトグラフィーにかけた。コンジュゲートトリエンスペクトルと２８２ｎｍに最大ＵＶ吸光度を持つ３つのピークが観察された(ピークＩＩ、ＩＶ及びＶ)。代謝物ＩＩ及びＩＶは、ＨＰＬＣでそれぞれ合成１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４と同一の保持時間を有しており、これらの代謝物が１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４であったことを裏付けている。ピークＶの物質はコンジュゲートトリエンを含み、２８２ｎｍに最大吸光度を有していた。この代謝物は、細胞をアラキドン酸と共にインキュベートしたときは(図２ａ)、二重二原子酸素添加産物８,１５-ＤＨＥＴＥとのＨＰＬＣでの共溶出のために、検出されなかった。この後者の生成物は１４,１５-ＬＴＡ４からは形成されないので、代謝物ＶはＨＰＬＣクロマトグラムで可視でき、二重二原子酸素添加産物の後ろに隠れてはいない。細胞を合成１４,１５-ＬＴＤ４と共にインキュベートしたとくに代謝物Ｖがまた形成された(データは示さず)。合成１４,１５-ＬＴＤ４と共に細胞をインキュベートした後に形成されたピークＶの物質を陰イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法によって分析した。図６は、ピークＶの物質の質量スペクトルが合成１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)のスペクトルと同一であったことを示している。代謝物ＶはまたＨＰＬＣで合成１４,１５-ＬＴＥ４と同じ保持時間を有していた。また、より少量の８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＣ４(ピークＩ)及び８-ｔｒａｎｓ-１４,１５-ＬＴＤ４(ピークＩＩＩ)が１４,１５-ＬＴＡ４と共にインキュベートした後に細胞によって生産された。
【００６３】
１５-ＬＯ経路及び１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４の生合成のための示唆された経路の概観を図７に示す。
アラキドン酸(４０μＭ)と共になされたインキュベーション後の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の形成の時間経過を図８ａに示す。実質的な量の１４,１５-ＬＴＣ４、３７ｐｍｏｌ／１０６細胞が、アラキドン酸と共に３０秒インキュベートした後に既に１０×１０６細胞によって生産された。１４,１５-ＬＴＣ４の最大レベルが５分のインキュベーション後に観察され、その後１４,１５-ＬＴＣ４のレベルは時間と共に減少した。測定可能な量の１４,１５-ＬＴＤ４がアラキドン酸と共にインキュベートした２分後に観察され、レベルは時間と共に増加し、３０分後に最大レベルに達した。８,１５-ＤＨＥＴＥはこのＨＰＬＣ系において１４,１５-ＬＴＥ４と同時にクロマトグラフィーにかけたので、この実験において１４,１５-ＬＴＥ４のレベルを測定することができなかった。アラキドン酸からの１４,１５-ロイコトリエン類の形成についての用量応答曲線は、有意な量の１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４が５μＭのアラキドン酸濃度で既に形成されたことを示している(５分のインキュベーション時間；図８ｂ)。これらの代謝物のレベルはアラキドン酸濃度と共に増加し、４０μＭのアラキドン酸においてプラトーに達した。
１４,１５-ＬＴＣ４；１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４はそれぞれエオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４と命名した。
【００６４】
実施例２：他の細胞及び組織におけるエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)の生合成の証明
材料と方法
ヒト好酸球の単離
静脈血(１００ｍｌ)を、健常な志願者又は好酸球増加症候群(ＨＥＳ)を含む好酸球増加症、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)及びある種の炎症疾患の患者からから採血した。４００×Ｇで１５分間、最初の遠心分離を実施した。上相を捨て下相を集め、室温で３０分間、Ｄｅｘｔｒａｎ(商標)沈降を施した。沈降後、白血球細胞を含む上相を４００×Ｇで１０分間、一回遠心分離した。ペレットを溶解バッファーに懸濁させ、室温で３０分インキュベートして混入した赤血球を除去した。インキュベーション後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(商標)を用いて密度勾配遠心分離を実施した。好中球と好酸球を含む多形核(ＰＭＮ)画分を集め、磁気細胞分離(ＭＡＣＳ)を施した。好酸球は、磁気ミクロビーズに結合させたＣＤ１６抗体を使用するネガティブ選択によって単離した。純度は、形態学的検査とメイ・グリューネバルト-ギムザ溶液での染色によって確認した。純度は常に９５％を越えていることが見出された。
【００６５】
細胞のインキュベーション
単離された好酸球(５−１０×１０６／試料)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ／試料)に再懸濁させ、３７℃でイオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)、アラキドン酸(５、１０、２０又は４０μＭ)又は双方で２、５又は１０分、刺激する前に３７℃で２分間、プレインキュベートした。反応を３容量のメタノールの添加により終結させた。
【００６６】
１５-リポキシゲナーゼ生成物の分析
細胞片及びタンパク質を除去するために、遠心分離を実施した。上清を減圧下で蒸発させ、残留物をメタノールに溶解させ、試験管に移した。ついで、試料を窒素流下で蒸発乾固させ、最後に２００μｌの移動相(アセトニトリル：メタノール：Ｈ２Ｏ：酢酸、２９：１９：７２：０．８、ｐＨは５．６にＮＨ３で調整)に再懸濁させた。抽出された試料に、記載されたようにして逆相ＨＰＬＣ系での分析を施した。簡単に述べると、試料をオクタデシル逆相カラム(Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ Ｃ１８,Ｍａｃｈｅｒｅｙ-Ｎａｇｅｌ,Ｄｕｒｅｎ,Ｇｅｒｍａｎｙ)に充填し、溶出流量は１．２ｍｌ／分であった。溶出した化合物を、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【００６７】
質量分析
質量分析を実施例１に記載されるようにして実施した。
結果
ヒト好酸球中でのエオキシンＣ４の生合成
ＨＰＬＣによって分析した場合、コンジュゲートトリエンスペクトルを持つ一つのピーク(最大吸光度２８２ｎｍ)がアラキドン酸と共に行ったインキュベーション後に観察された(図９ａ及びｂ)。生成物を合成１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(ＥｏｘＣ４)と共にクロマトグラフィーにかけた。得られた生成物の同一性を確保するために、タンデム質量分析を実施した。代謝物のＭＳ／ＭＳスペクトルはＥｏｘＣ４のものと本質的に同一であった(図１０)。ホジキン細胞株Ｌ１２３６に対して示された生成物プロファイルとは異なり、好酸球は直ぐにはＥｏｘＣ４をＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４に転換しなかった。
【００６８】
１５-リポキシゲナーゼの発現に加えて、好酸球はまた５-リポキシゲナーゼを発現し、これがロイコトリエン類を生成する。用量応答実験を、ＥｏｘＣ４生成の実験条件を最適化するために実施した。またＥｏｘＣ４及びＬＴＣ４の形成の時間経過を調べた(図１１)。しかしながら、エオキシンＤ４もエオキシンＥ４も５分のインキュベーション後に検出されなかった。
総括すると、該結果は、好酸球が外因性アラキドン酸をＥｏｘＣ４に直ぐに転換させることを証明している。
【００６９】
ヒト鼻ポリープ組織におけるエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)の生合成
気道上皮源は鼻ポリープの外科検体である。切り取ったヒト鼻ポリープをアラキドン酸(４０μＭ)と共に５分間インキュベートすると、１４,１５-ＬＴＣ４及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物が形成された(図１２ａ)。合成１４,１５-ＬＴＣ４と共に共溶出した物質のＵＶスペクトルは特徴的なトリエンスペクトルを示した(図１２ｂ)。
【００７０】
ヒト樹状細胞におけるエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)の生合成
成長因子とインターロイキン-４の存在下でのバフィーコート細胞(白血球)の分離と培養によって樹状細胞を得た。単離細胞は樹状細胞の特徴的な機能と形態を示した。これらの細胞をアラキドン酸(４０μＭ)と共に５分間インキュベートすると、主として８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥの形成に至ったが、有意な量の１４,１５-ＬＴＣ４も形成された(図１３ａ)。１４,１５-ＬＴＣ４の同定はまたＵＶ分光法に基づいた(図１３ｂ)。
【００７１】
実施例３：１５-ＬＯを発現する細胞の同定
気道呼吸器上皮、好酸球、肥満細胞、及びマクロファージにおける先に記載された１５-ＬＯ発現に加えて、本発明者等は、(ヒト１５-ＬＯに対して産生された抗体を使用して)数種の正常なまた病理組織における１５-ＬＯの発現を証明した。１５-ＬＯはホジキンリンパ腫(ＨＬ)の患者からのリンパ節において発現することが見出された。ＨＬの１３／１５例において、１５-ＬＯの発現がリード・シュテルンベルク細胞において検出された(図１４)。非ホジキンリンパ腫の何れの例でも染色はなかった。サルコイドーシスの患者からのバイオプシーは、類上皮細胞(肉芽腫)における１５-ＬＯの強い染色を裏付けた。結果は、全ての類上皮細胞が１５-ＬＯを発現することを示唆している。類上皮細胞はクローン病、ＴＢＣ及び数タイプの血管炎の患者の肉芽腫において見出される。１５-ＬＯを発現することが見出された他の細胞型は、関節リウマチ患者からの滑膜細胞(図１６ａ)及び軟骨細胞(図１６ｂ)、アルツハイマー患者の脳皮質からの錐体細胞(図１６ｃ)、及び星状細胞腫検体からの星状膠細胞(図１６ｄ)(正常組織ではない)を含んでいた。
総括すると、該結果は、１５-ＬＯと、この経路を通して形成された代謝物がこれらの疾患の病態生理に関与していることを示している。
【００７２】
実施例４：Ｌ１２３６細胞においてエオキシンＡ４(１４,１５-ＬＴＡ４)をエオキシンＣ４(１４,１５-ＬＴＣ４)に転換する酵素の同定
方法
細胞培養
細胞培養は実施例１に記載されているようにして実施した。
ヒト好酸球の単離
ヒト好酸球の単離は実施例２に記載されているようにして実施した。
ＲＴ-ＰＣＲ分析
好酸球からのｍＲＮＡの単離と続くＲＴ-ＰＣＲ分析を標準的な方法によって実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩ(ＭＧＳＴＩ)、ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩＩ(ＭＧＳＴＩＩ)、ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩＩＩ(ＭＧＳＴＩＩＩ)及びβ-アクチン(陽性コントロール)
相補的であった。
【００７３】
細胞のインキュベーション
単離された好酸球(５-１０×１０６／試料)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ／試料)に再懸濁させ、３７℃で５分間、ＥｏｘＡ４(１０μＭ)、ＬＴＡ４(１０μＭ)又は双方で刺激する前に３７℃で２分間、プレインキュベートした。あるいは、阻害剤の研究では、好酸球を、イオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)及びアラキドン酸(４０μＭ)で３７℃で５分間刺激する前にＢＷ７０Ｃ(１μＭ)又はＭＫ８８６(１０μＭ)の存在下で３７℃で２分間、プレインキュベートした。反応はメタノール３容量の添加によって終結させた。代謝物は、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【００７４】
酵素研究
ＥｏｘＡ４からＥｏｘＣ４への転換におけるグルタチオントランスフェラーゼの可能な関連を探究するために、組換え酵素(１μｇ)をＥｏｘＡ４(１００μＭ)及びグルタチオン(５ｍＭ)と共に３７℃で５分間インキュベートした。反応を１容量の停止液(ＡｃＮ：ＭｅＯＨ：ＨＡｃ,体積５０：５０：１)の添加により終結させ、ＥｏｘＣ４を、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【００７５】
結果
ホジキン細胞株Ｌ１２３６においてＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換する酵素の単離、精製及び特徴付け
Ｌ１２３６細胞を標準的な手順によって細胞成分分画し、酵素活性を含む細胞質画分をグルタチオンセファロースカラムに充填した。結合物質をグルタチオンバッファー勾配によって溶出させた。溶出された画分を酵素活性について試験し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで実施した。２８ｋＤのおよそのＭｗを持つ一つの単一バンドを得た。アミノ酸解析(ＰＡＣ)、ｃＤＮＡ配列解析及びＢＬＡＳＴ検索により、得られたバンドの同定は可溶型グルタチオントランスフェラーゼＭ１ｂ-１ｂ(ＧＳＴＭ１ｂ-１ｂ)であった。組換えＧＳＴＭ１ｂ-１ｂはＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換したが、同一条件下ではＬＴＡ４をＬＴＣ４に代謝しなかった(図１７Ａ及びＢ)。
【００７６】
ヒト可溶型グルタチオントランスフェラーゼファミリーのスクリーニング
ＧＳＴＭ１ｂ-１ｂはヒト可溶型グルタチオントランスフェラーゼファミリーのメンバーであるので１９、ＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４へ転換する可溶型グルタチオントランスフェラーゼの能力を調べた。ＧＳＴＭ１ｂ-１ｂに加えて、ＧＳＴＰ１-１の二つのアイソフォーム(Ｖａｌ１０５及びＩｌｅ１０５)がＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換する大きな能力をまた有していたことが証明された(図１８)。
【００７７】
好酸球におけるＥｏｘＣ４シンターゼ活性の局在化
可溶型グルタチオントランスフェラーゼが好酸球におけるＥｏｘＣ４形成に関与するかどうかを調べるために、単離されたヒト好酸球の細胞成分分画を調製し、ＥｏｘＡ４と共にインキュベートした。Ｌ１２３６とは異なり、ＥｏｘＣ４シンターゼ活性は好中球の膜画分に殆ど完全に局在化した(図１９)。
【００７８】
好酸球における「酵素Ｘ」の特徴付け
好酸球中のＥｏｘＣ４シンターゼ活性は膜画分にあったので、本発明者等はこの点における膜結合性グルタチオントランスフェラーゼの関与を調べた。
ＭＡＰＥＧ(エイコサノイド及びグルタチオン代謝における膜結合型タンパク質(Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism))スーパーファミリー２１のメンバーはＬＴＣ４シンターゼ、ＦＬＡＰ(５-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質)、ＰＧＥシンターゼ、ＭＧＳＴＩ(ミクロソームグルタチオントランスフェラーゼＩ)、ＭＧＳＴＩＩ及びＭＧＳＴＩＩＩ(３)である。ＰＣＲ解析は、好酸球はＭＧＳＴＩＩ及びＭＧＳＴＩＩＩをコードするｍＲＮＡを有する一方、ＭＧＳＴＩをコードするｍＲＮＡは観察されなかったことを明らかにした。先の研究から、好酸球がＦＬＡＰとＬＴＣ４シンターゼを有していることは知られている。
【００７９】
ＥｏｘＡ４及びグルタチオンと共にＭＡＰＥＧファミリーメンバーをインキュベートすることにより、ＬＴＣ４シンターゼだけがＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４に転換する能力を有していることが示された(データは示さず)。
ＬＴＣ４シンターゼは伝統的にＬＴＡ４からグルタチオン含有ロイコトリエン(ＬＴ)Ｃ４を生合成する際の重要な酵素であることが知られている。ＬＴＡ４は５-リポキシゲナーゼ経路を介して合成される。好酸球は５-リポキシゲナーゼ及び１５-リポキシゲナーゼ活性を共に有しており、ＬＴＣ４シンターゼがＥｏｘＡ４をＥｏｘＣ４へ転換することができる唯一のＭＡＰＥＧファミリーメンバーであるという結果は、ＬＴＣ４シンターゼが二重の活性：ＬＴＣ４及びＥｏｘＣ４合成を備えていることを示唆している。ＬＴＣ４シンターゼがＥｏｘＣ４形成においてもまた重要な酵素であるという仮説を試験するために、単離した好酸球をＥｏｘＡ４(１０μＭ)、ＬＴＡ４(１０μＭ)、又は双方と共に３７℃で５分間インキュベートした(図２０)。
【００８０】
好酸球をＥｏｘＡ４と共にインキュベーションするとＥｏｘＣ４が生合成される一方、好酸球をＬＴＡ４と共にインキュベーションするとＬＴＣ４を生じる。細胞を双方の基質と共にインキュベートすると、ＬＴＣ４とＥｏｘＣ４がおよそ９：１の比で生産された。これはこれらの基質に対するＬＴＣ４シンターゼの過去に報告された親和性と一致している２０。
ＬＴＣ４シンターゼがまた好酸球においてＥｏｘＣ４シンターゼとしてまた作用するという知見を更に裏付けるために、発明者等は阻害研究を実施した。
【００８１】
ＢＷ７０Ｃは５-リポキシゲナーゼ阻害剤で、ＭＫ８８６はＦＬＡＰ阻害剤であり、これらは高い(１０μＭ)濃度で使用される場合、ＬＴＣ４シンターゼをまたブロックする(図２１)。ＢＷ７０Ｃの存在下でのプレインキュベーションがＬＴＣ４ピークを完全に消滅させ、ＭＫ８８６の存在下でのプレインキュベーションがまたＥｏｘＣ４合成を阻止した。これらの結果は、ＬＴＣ４シンターゼが好酸球中でのＥｏｘＣ４形成における重要な酵素であることを更に裏付けている。
【００８２】
実施例５：ヒト１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)によって形成される脂質ヒドロペルオキシドの検出のためのアッセイ
ここに記載されたアッセイは、ジフェニル-１-ピレニルホスホン(ＤＰＰＰ)をホスフィンオキシドに酸化する脂質ヒドロペルオキシドの能力を利用する(以下のスキームを参照のこと)。ジフェニル-１-ピレニルホスホンは酸化されるまでは非蛍光化合物である。ＤＰＰＰの酸化は蛍光化合物を生じ、これは温度に感受性がなく、少なくとも６０分間安定である。
【００８３】
【００８４】
材料
ジフェニル-１-ピレニルホスホン(ＤＰＰＰ)(Ｄ-７８９４)はMolecular Probesから購入している。コール酸はSigmaから、リノール酸はBiomolから、ＰＢＳはGibco Life Technologiesから購入している。蛍光はMolecular Devices製の二重走査型マイクロプレート分光蛍光光度計Spectramax Geminiを用いて測定する。Spectramax Gemini分光蛍光光度計はキセノンランプと二つのホログラフィック回折格子モノクロメータを使用する。３８４ウェルまでのマイクロプレートを分光蛍光光度計と共に使用することができる。蛍光の検出は、ウェル中の試料の深さ全体に亘ってウェルの上面から達成される。
【００８５】
全ての試薬は、フルオロフォア(ＤＰＰＰ)及び基質、リノール酸を除いてそのまま使用できる濃度で提供される。ＤＰＰＰは粉末として提供され、-２０℃で保存されなければならず、光から十分に保護されなければならない。リノール酸はエタノール中の１００ｍＭ原液として供給される。酵素調製物は凍結アリコートとして提供される。
【００８６】
酵素はバキュロウイルスを使用して発現され、スポドプテラ・フルギペルダ細胞(Ｓｆ９)から部分的に精製され、トリス-ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、７５ｍＭのＮａＣｌ及び５％グリセロールで送達される。精製された酵素は-７０℃で少なくとも５ヶ月まで安定である。３回までの凍結解凍サイクルは酵素活性に影響を与えないと思われる。しかしながら、酵素の凍結解凍サイクルは、必ずしも必要ではないなら、避けなければならない。酵素を凍結し実験の直前でＰＢＳに希釈する。希釈した酵素は同じ日中に使用されなければならない。
【００８７】
ＤＰＰＰ(粉末)を、０．２５ｍＭの最終濃度までエタノール及び２-ブタノール(１：１の比)に溶解させた。この溶液をボルテックスして混合し、続いて＋４℃で超音波水浴で１０秒間超音波処理してＤＰＰＰを完全に溶解させた。この溶液は実験が実施される日には新鮮でなければならない。該溶液は遮光されなければならない。
【００８８】
脂質ヒドロペルオキシド検出のためのジフェニル-１-ピレニルホスフィン法
アッセイは室温(２０-２２℃)で９６ウェルの全て黒のプレートで実施される。各ウェルは、５００μＭのコール酸と１５-ＬＯ酵素(プレミックス)を補填したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)からなる４５μｌを含む。阻害剤(１μｌ)又はビヒクル(ＤＭＳＯ)を、基質である５μｌの１ｍＭリノール酸の添加の５-１５分前に添加する。ついで、プレートを室温で２０分間インキュベートする。酵素反応を５０μｌのメタノールの添加によって終結させる。プレートは、脂質ヒドロペルオキシドの有意な損失なしに６０分までの間、室温で保存することができる。５０μｌの２５μＭ ＤＰＰＰ溶液を加え、プレートを室温でインキュベートする。３０-６０分後、蛍光は、３５５ｎｍの励起波長と３８０ｎｍの発光波長を使用して読み取ることができる。
水溶液中でのＤＰＰＰの低い自動酸化のため、ブランクの一つは酵素反応のものと同じ比でバッファー、メタノール及びＤＰＰＰを含まなければならない。
【００８９】
実施例６：エオキシンＣ４、エオキシンＤ４及びエオキシンＥ４(１４,１５-ＬＴＣ４、１４-１５-ＬＴＤ４、１４-１５-ＬＴＥ４)の生物学的効果の証明
実施例６ａ：内皮細胞障壁機能の評価
材料と方法
内皮細胞アッセイ
ウシ大動脈内皮細胞(ＢＡＥＣ)及びヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を単離しウシ血清又はヒト血清と共に培養した。第一から第五継代のＢＡＥＣ又はＨＵＶＥＣを、短時間(２分)のトリプシン-ＥＤＴＡ処理(０．２５％のトリプシン／０．０１％のＥＤＴＡ)によって剥離させ、３．０μｍの孔径のポリカーボネートフィルター(Tissue Culture inserts, 10mm; NUNC, Roskilde, Denmark)上又は目視検査のために０．２μｍの孔径のAnopore無機膜(濡れると透明)に再び蒔いた。細胞分化を促進させ、ＥＣの付着を向上させるために、フィルターを５０μｌのＢｉｏｍａｔｒｉｘ Ｉ(１６７μｇ／ｍｌ)で前処理し、空気乾燥させた。ＥＣをフィルター当たり２×１０５細胞の密度で播種し、空気中に５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で培養培地中でインキュベートした。透明な０．２μｍの孔径のフィルターで単層に亘る電気抵抗を測定し、毎日顕微鏡で観察して評価して、ＥＣをコンフルエントな単層になるまで増殖させた。これらの実験条件下で播種後７日で最大の抵抗が得られ、ついでその日にＥＣ単層を実験に使用した。
【００９０】
ＥＣ障壁機能の測定
様々なアラキドン酸代謝物に応答した内皮細胞(ＥＣ)障壁機能の迅速な変化を、ＥＣ単層の各側の電極での経内皮電気抵抗(ＴＥＥＲ)の連続的記録によって分析した１８。ＴＥＥＲの測定では、ＥＣを有するフィルターインサートを、繰り返し測定の間に互いのかつフィルターインサートに対しての電極の正確な位置決めを達成するように変更された抵抗測定チャンバー(Endohm-12, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)に移した。チャンバー(下方コンパートメント)及びフィルターインサート(上方コンパートメント)にそれぞれ２ｍｌ及び４００μｌの培養培地を満たした。全ての測定は細胞培養インキュベーター中に配した装置で３７℃にて行った。電気抵抗の直接の読みが抵抗チャンバーの電極に接続したオーム計(Evom, World Precision Instruments, Sarasota, FL, US)によって与えられた。個々のＥＣ単層の電気抵抗は、ＥＣの播種前に測定したBiomatrixでコートされた対応する裸のフィルターの抵抗を減算することによって得られた。よって、ＴＥＥＲ値はＥＣ単層の抵抗を表し、隣接する内皮細胞間の密着結合の発生に依存する。
【００９１】
結果
１４,１５-システイニル-含有ロイコトリエン類(エオキシン類)の生物学的効果
血管透過性の増加は炎症のマーカーであり、システイニル含有ロイコトリエン類がヒスタミンとブラジキニンと同じ形で特異的血漿漏出を引き起こすことであることはよく知られている。５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有ロイコトリエン類とは異なり、ＥｏｘＣ４とその代謝物はモルモット肺実質性条片又は回腸への収縮効果を有していないように思われる。ＥｏｘＣ４とその代謝物ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４の血漿漏出を引き起こす能力を探索するために、内皮細胞障壁機能における迅速な変化を登録するためのモデル系を構築した。発明者等は、３種の１４,１５-システイニル含有ロイコトリエン類が全て血管透過性を増大させたことを見出した。化合物の１０-７及び１０-８Ｍの濃度はＴＥＥＲの有意な変化を誘導した。比較すると、ＥｏｘＣ４、Ｄ４及びＥ４は最も強力な５-リポキシゲナーゼ誘導ロイコトリエン類より約５倍から１０倍弱かったがこの点ではヒスタミンより１００倍以上強かった(図２２)。
【００９２】
実施例６ｂ：白血球の酸化的代謝に対するエオキシン類の効果
好中球及び好酸球による酸化的代謝は様々な薬剤、例えば酢酸ミリスチン酸ホルボール(ＰＭＡ)、血小板活性化因子(ＰＡＦ)、血清処理ザイモサン(ＳＴＺ)、免疫グロブリン又はロイコトリエン類(ＬＴＢ４)によって、またサイトカイン、例えばＩＬ-５及びＧＭ-ＣＳＦによって誘導できる。薬物刺激(プライミング)は、細胞を活性化しないで、刺激に対する細胞の増加した応答性をもたらすプロセスを意味する。細胞の薬物刺激状態を生じる機構はなお不確かであるが、造血性サイトカインＩＬ-３、ＩＬ-５及びＧＭ-ＣＳＦは好酸球と好中球をインビトロで薬物刺激することが知られている。しかしながら、ＩＬ-５だけはヒト血液好酸球の選択的活性化因子であることが示されており、ＩＬ-３及びＧＭ-ＣＳＦは好酸球と好中球の双方に作用しうる。
【００９３】
材料と方法
好中球及び好酸球顆粒球を、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配及び磁気細胞分離システム(ＭＡＣＳ)を使用して末梢全血から精製した。
顆粒球にＩＬ-５(１０．５ｎｇ／ｍＬ)又はＧＭ-ＣＳＦ(１０．５ｎｇ／ｍＬ)の何れかで３７℃で３０分薬物刺激を与え、続いてＩＬ-５(１００ｎｇ／ｍＬ)、ＧＭ-ＣＳＦ(１００ｎｇ／ｍＬ)、ＬＴＢ４(１０-７Ｍ)又はエオキシン(１０-８-１０-６Ｍで刺激した。酸化的代謝をルシゲニン増強化学発光(ＣＬ)アッセイによって測定した。
使用した試験化合物はＥｏｘＣ４(ＢＬＸ-９２５)、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)、ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)であった。
【００９４】
結果
非薬物刺激好中球によるエオキシン誘導酸化的代謝
精製した好中球を、好中球に対する異なったエオキシン類の刺激効果との比較のために、酸化的代謝の二つの既知の活性化因子であるサイトカインＧＭ-ＣＳＦ及びＬＴＢ４を用いて刺激した。双方の活性化因子が非薬物刺激好中球による酸素フリーラジカル生成を誘導したが、何れのエオキシン類も非薬物刺激血液好中球による酸素フリーラジカル生成を誘導しなかった。
【００９５】
一つの代表的な実験を示す動態曲線(図２３ａ)は、非薬物刺激細胞と比較した場合のサイトカイン薬物刺激細胞の刺激後の向上したラジカル生成を示している。この向上したラジカル生成は、異なったドナーの全結果を平均値として示している図２３ｂに示されるように用量依存パターンを示した。我々は異なった血液ドナー間でＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)に対する強い個々の用量応答性を経験したので、全ての個々のデータをプロットしＳｃａｔｔｅｒプロットで示した(図２３ｃ)。このようにすることによって、ＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)が、異なったドナーに対して異なった最適な用量で、用量依存的な形で薬物刺激細胞によるラジカル生成を誘導したことが明らかになった。１３の内、７-１０の検体がＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)に対するレスポンダーであった。
類似のパターンがまたＥｏｘＣ４(ＢＬＸ-９２５)に対して見られた。この化合物は用量依存的な形でＧＭ-ＣＳＦ薬物刺激好中球によるラジカル生成を誘導した(１３の内、７-８の検体がＥｏｘＣ４に対するレスポンダーであった；データは示さず)。
【００９６】
非薬物刺激好酸球によるエオキシン誘導酸化的代謝
３種全てのエオキシン類が非薬物刺激好酸球による酸素フリーラジカルの少量の生成を誘導した。しかしながら、酸素フリーラジカルの生成量は、好酸球による酸化的代謝の他の既知の活性化因子、この場合は好酸球特異的サイトカインＩＬ-５と比較した場合にかなり少ない(図２４ａ)。
ＩＬ-５薬物刺激好酸球によるエオキシン誘導酸化的代謝
ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-２７と命名)は、図２４に示されるように、ＩＬ-５薬物刺激好酸球によるラジカル生成の広い用量関連誘導を示し、該エオキシンが試験したものの中で好酸球による酸化的代謝の最良の誘導因子であるかも知れないことを示している。６の検体の内、３がＥｏｘＥ４に対してレスポンダーであった。
結論
ＥｏｘＣ４(ＢＬＸ-９２５)及びＥｏｘＤ４(ＢＬＸ-９２６)はＧＭ-ＣＳＦ薬物刺激好中球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導したが、ＥｏｘＥ４(ＢＬＸ-９２７)はＩＬ-５薬物刺激好酸球による酸素フリーラジカル生成を主に誘導した。
【００９７】
実施例７：エオキシンＣ４の形成に対する１５-ＬＯ阻害の効果
ホジキン細胞株Ｌ１２３６をアラキドン酸(４０μＭ)で５分間刺激した。Ｌ１２３６細胞はアラキドン酸をＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及び一連の８,１５-ＤＨＥＴＥ及び１４,１５-ＤＨＥＴＥ代謝物を効果的に転換した。
材料と方法
細胞インキュベーション
ホジキン細胞株Ｌ１２３６(１０×１０６細胞／試料)を１ｍｌのＰＢＳバッファーに懸濁させ、試験物質(１、１０又は５０μＭ)の添加前に３７℃で２分予め温めた。試験物質と共に５分間プレインキュベートした後、アラキドン酸(４０μＭ)を加えた。インキュベーションを２分後に１容量のメタノールを添加して停止させた。各試験物質濃度は二組をインキュベートした。
【００９８】
固相抽出
細胞及び細胞片を試料から遠心分離(２６００ｒｐｍ、６分)によって除去した。上清を水で希釈し、ついで洗浄し平衡にした抽出カートリッジOasis HLB １ｃｃ １０ｍｇ(Waters, Sweden)に移した。代謝物をメタノールで溶出させ、ＨＰＬＣ系に注入する前に水で希釈した。
ＨＰＬＣ分析
ＲＰ-ＨＰＬＣをNova Pak Ｃ１８カラム(２．１×１５０ｍｍ, Waters AB, Sweden)で実施した。最初の移動相は、０．４ｍｌ／分の流量での１００％Ａ(０．０５％(８．７ｍＭ)酢酸、ｐＨをアンモニウムで５．６に調整)からなる。線形勾配を５分後に２０分の３６％Ｂ(６０：４０のアセトニトリル：メタノール)まで開始した。ついで、移動相は、更に２０分は６４：３６のＡ：Ｂの均一濃度に維持された。カラム流出液はダイオードアレイ検出(PDA 996, Waters AB, Sweden)を使用してモニターし、ＵＶスペクトルを２００-３４０ｎｍの間で獲得した。
【００９９】
試験化合物
図２５はＥｏｘＣ４の形成を阻害した様々な化合物の構造を示している。幾つかのものはＷＯ２００４／０８０９９９に記載されている。１-フェニルチオカルバモイル-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸(２-クロロフェニル)-アミド(化合物Ａ)は実施例４７に記載されている。ピラゾール-１,３-ジカルボン酸１-(ベンゾ［１,３］ジオキソール-５-イルアミド)３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルアミド(化合物Ｂ)は実施例６４に記載されている。６-｛［３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルカルバモイル)ピラゾール-１-カルボニル］-アミノ｝-ヘキサン酸エチルエステル(化合物Ｃ)は実施例６５に記載されている。ピラゾール-１,３-ジカルボン酸３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルアミド)１-ペンチル-アミド(化合物Ｄ)は実施例６６に記載されている。ピラゾール-１,３-ジカルボン酸３-(２-クロロ-４-フルオロフェニルアミド)１-ブチルアミド(化合物Ｅ)はＷＯ２００４／０８０９９９(イソシアン酸ブチルがイソシアン酸ペンチルの代わりに用いられている特に実施例６６を参照)に記載の方法と同様にして調製される。
【０１００】
Ｎ'-(２-(エトキシイミノ)-１-フェニルエチリデン)ベンゾヒドラジド(化合物Ｆ)は次のようにして調製することができる：
(ａ)安息香酸(２-ヒドロキシイミノ-１-フェニルエチリデン)ヒドラジド
安息香酸ヒドラジド(１から１．２当量)をアルコール性溶媒(例えばＥｔＯＨ又はＭｅＯＨ)に溶解させた。２滴の酸(例えば濃硫酸又は氷酢酸)を加えた後、２-イソニトロソアセトフェノン(１当量)を滴下して加えた。反応混合物を(例えば上昇温度(例えば５０-８５℃)で)撹拌した後、濾過によって形成された固形物を集め、場合によっては(例えばＥｔＯＨ／水からの)粗物質を再結晶して副題化合物を得た。
【０１０１】
(ｂ)Ｎ'-(２-(エトキシイミノ)-１-フェニルエチリデン)ベンゾヒドラジド
ジメチルスルホキシド中の安息香酸(２-ヒドロキシイミノ-１-フェニルエチリデン)ヒドラジド(１当量；上の工程(ａ)を参照)及びＫＯＨ(１から１．２当量)の溶液に臭化エチル(少なくとも１当量)を加えた。反応は所定の期間(例えば６日)上昇温度(例えば４５℃)で撹拌した。水を加え、混合物をジクロロメタンで抽出した。組み合わせた有機相をＮａＯＨ(２Ｍ)と水で洗浄した。有機相を乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、真空で蒸発させ、場合によっては再結晶化させて(例えばＥｔＯＨ／水から)表題化合物を得た。
【０１０２】
３-クロロ-Ｎ'-(２-(ヒドロキシイミノ)-１-(３-クロロフェニル)エチリデン)ベンゾヒドラジド(化合物Ｇ)は次のようにして調製することができる：
(ａ)２-(３-クロロフェニル)-２-オキソアセトアルデヒドオキシム
亜硝酸イソアミル(１．８３ｇ、１５．６ｍｍｏｌ)を氷冷エタノール性ナトリウムエトキシド(０．９Ｍ、１８．３ｍＬ、１６．５ｍｍｏｌ)に溶解させた。冷却された液に３-クロロアセトフェノン(１４．９ｍｍｏｌ)を滴下して加え、反応を室温に達するようにし、撹拌を１６時間続けた。反応の過程で形成された固形物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、水に溶解させ、水溶液を氷酢酸で酸性化した。得られた結晶性固形物を濾過し、ＥｔＯＨ／水から再結晶化して副題化合物を得た。
【０１０３】
(ｂ)３-クロロ-Ｎ'-(２-(ヒドロキシイミノ)-１-(３-クロロフェニル)エチリデン)ベンゾヒドラジド
３-クロロ安息香酸ヒドラジド(１から１．２当量)をＥｔＯＨに溶解し、それに２滴の濃硫酸と２-(３-クロロフェニル)-２-オキソアセトアルデヒドオキシム(１当量；上の工程(ａ)を参照)を加えた。反応を一晩５０℃に加熱し、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、ＥｔＯＨ／水から再結晶化して表題化合物を得た。
【０１０４】
結果
ヒト細胞株Ｌ１２３６におけるＥｏｘＣ４形成の阻害
１０-４−４Ｍの濃度のエイコサテトラエン酸(ＥＴＹＡ)は、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４(図２６)及び他の１５-ＬＯ誘導生成物を完全に阻止した。これらの生成物の形成はまた１０-５-５ＭのＥＴＹＡの存在下で減少した。これらの結果は、リポキシゲナーゼ阻害剤ＥＴＹＡがＥｏｘＣ４及びその代謝物の形成を阻止できることを示している。
ＥｏｘＣ４及び１５-ＨＥＴＥの形成に対する化合物の効果
Ｌ１２３６細胞を２分間、示された物質(１μＭ)と共にプレインキュベートされ、続いて５分間、アラキドン酸(１２．５μＭ)と共にインキュベートした。インキュベーションと抽出は上に記載されているようにして実施された。全ての試験化合物(図２５に記載のもの)はＥｏｘＣ４の形成を阻害した(図２７)。また、阻害剤は同様の度合いでＥｏｘＣ４及び１５-ＨＥＴＥの合成を阻止した(図２８)。
【０１０５】
実施例８：ヒト好酸球及び肥満細胞において１５-リポキシゲナーゼ-１経路を介して生産された炎症誘発性アラキドン酸代謝物の同定
略語
ＣＢＭＣ 臍帯血肥満細胞
ＥＣ 内皮細胞
ＥＩＡ エンザイムイムノアッセイ
ＨＥＴＥ ヒドロキシルエイコサテトラエン酸
ＨＰＬＣ 高速エキタイクロマトグラフィー
ＩＬ インターロイキン
ＬＯ リポキシゲナーゼ
ＬＴ ロイコトリエン
ＭＳ 質量分析法
ＰＧ プロスタグランジン
【０１０６】
ヒト好酸球は豊富な量の１５-リポキシゲナーゼ-１(１５-ＬＯ-１)を含んでいる。しかしながら、ヒトにおける１５-ＬＯ-１の生物学的役割は不確かである。アラキドン酸と共に５分間好酸球をインキュベーションすると、２８２ｎｍで最大吸光度を有しロイコトリエン(ＬＴ)Ｃ４よりもＲＰ-ＨＰＬＣでの保持時間が短い主要生成物の形成に至る。陽イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法での分析によって未知の好酸球代謝物を１４,１５-ＬＴＣ４と同定した。この化合物は好酸球中において１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に代謝されうる。また臍帯血由来肥満細胞及び外科的に除去された鼻ポリープは１４,１５-ＬＴＣ４を生産した。好酸球をアラキドン酸と共にインキュベーションするとＬＴＣ４よりも１４,１５-ロイコトリエンＣ４の生産の方が優勢になる一方、カルシウムイオノフォアでの刺激では専らＬＴＣ４が形成された。１４,１５-システイニル含有ロイコトリエン類は、炎症の特徴であるインビトロでの内皮細胞(ＥＣ)単層の血管透過性の増大を誘導することができる。このモデル系において、１４,１５-ロイコトリエン類はＬＴＣ４及びＬＴＤ４と殆ど同じく強力であったがヒスタミンより１００倍強かった。好酸球は、ＬＴＣ４、プロスタグランジンＤ２又はインターロイキン-５での刺激後に１４,１５-ＬＴＣ４を生産し、これは、１４,１５-ＬＴＣ４がアラキドン酸の内因性プールから合成され得ることを証明している。総括すると、本報告は、特にヒト好酸球とまたヒト肥満細胞及び鼻ポリープにおける炎症誘発性１４,１５-ロイコトリエン類の形成を記載する。好酸球はこれらの新たに特徴付けた代謝物の豊富な供給源であるので、５-リポキシゲナーゼ誘導ロイコトリエン類との混同を避けるために、我々はそれぞれ１４,１５-ロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４の代わりにエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４という名称を示唆する。
【０１０７】
序
哺乳動物のリポキシゲナーゼは、喘息及び他の炎症疾患の病因に関係がある構造的に関連した脂質過酸化酵素のファミリーに属する。５-リポキシゲナーゼ(５-ＬＯ)はロイコトリエン合成における重要な酵素であり、この酵素はアラキドン酸のロイコトリエン(ＬＴ)Ａ４への転換を触媒する。この化合物は酵素的にＬＴＢ４まで加水分解されるか又はグルタチオンとコンジュゲートされてＬＴＣ４を形成し、これが次にＬＴＤ４及びＬＴＥ４まで代謝されうる。ロイコトリエンＣ４とその代謝物は炎症誘発性薬剤及び強力な気管支収縮剤である(１)。５-ＬＯとは異なり、ヒト１５-リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ-１)の生物学的機能についてはあまり知られていない。ヒト気道内皮細胞、好酸球及び肥満細胞及び樹状細胞のサブセットは高い量の１５-ＬＯ-１を構成的に発現する(２-６)。ヒト１５-ＬＯの第二の形態もまた存在し、これは１５-ＬＯ-２と命名される(７)。この酵素と１５-ＬＯ-１の間のアミノ酸類似性は４０％だけである(３)。インターロイキン(ＩＬ)-４及び／又はＩＬ-１３は培養された上皮細胞、単球及び肥満細胞における１５-ＬＯ-１の発現を誘導し(４,８,９)、よってこれらのサイトカインはインビボでの１５-ＬＯ-１発現の重要な生理学的／病態生理学的調節因子として作用しうる。
１５-リポキシゲナーゼ-１は気管支喘息の病因に関与していることが示唆されている。１５-ＬＯ-１の量は、コントロール患者と比較して喘息又は慢性気管支炎の患者の気管支粘膜下層において有意に増加している。１５-リポキシゲナーゼ-１はアラキドン酸を１５-ヒドロキシ-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＥＴＥ)に転換し、これはインビボ並びにインビトロでの様々な細胞及び組織における１５-ＬＯ活性のマーカーとして使用されている。ヒト気管上皮細胞、切り出したヒト気管支及びヒト肺ホモジネートは主としてアラキドン酸を１５-ＨＥＴＥに転換する。喘息患者からの肺検体は非喘息患者の検体よりも多くの１５-ＨＥＴＥを生産し(１２-１４)、１５-ＨＥＴＥはアトピー性及び非アトピー性喘息患者からの刺激されたヒト肺組織における主なアラキドン酸代謝物であった(１５)。増加した量の１５-ＨＥＴＥは、抗原曝露アトピー性喘息患者の気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬＦ)(１６)、喘息患者の痰試料(１７)及び健常なコントロール患者からの鼻分泌物(１８)に見出された。持続性気道好酸球増加症の深刻な喘息患者は健常な被験者又は好酸球増加症のない喘息患者と比較してＢＡＬＦ中の高いレベルの１５-ＨＥＴＥを有している(１４)。１５-ＨＥＴＥのレベルは基底下(sub-basement)厚と相関することが見出され、１５-ＬＯが気道リモデリングに関連しているかも知れないことを示している(１４)。
【０１０８】
１５-ＬＯ経路を介して生産される最も豊富なアラキドン酸代謝物は１５(Ｓ)-ＨＥＴＥ)であり、これは１５(Ｓ)-ヒドロペルオキシ-エイコサテトラエン酸(１５(Ｓ)-ＨＰＥＴＥ)から形成される。１５-ＨＥＴＥへの還元を受けることに加えて、１５-ＨＰＥＴＥはまた脱水を受けて１４,１５-エポキシ-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)を形成する(１９,２０)。他の１５-リポキシゲナーゼ生成物の５-オキソ-１５-ヒドロキシ-６,８,１１,１３-エイコサテトラエン酸はヒト好酸球に対する強力な走化性剤であると報告されている(２１)。しかしながら、１５-ＬＯ-１はリポキシン類及びレゾルビン類(resolvins)の形成に関与しうるので、１５-ＬＯ生成物は炎症疾患において保護的役割を有しうるという証拠がまたある(２２)。総括すると、ヒトにおける１５-ＬＯ経路の生理学的及び病態生理学的役割は確かではない。
【０１０９】
この報告では、我々は、１４,１５-ロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４の形成及びヒトにおいて１５-ＬＯ-１に対して炎症誘発性役割を示す生物学的効果を記載する。好酸球はこれらの新たに特徴付けられた代謝物のかかる豊富な供給源であるので、５-リポキシゲナーゼ誘導ロイコトリエン類との混同を避けるために、我々はそれぞれ１４,１５-ロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４の代わりにエオキシン類Ｃ４、Ｄ４及びＥ４という名称を示唆する。
【０１１０】
結果
単離されたヒト好酸球における新規な１５-リポキシゲナーゼ生成物の形成
単離されたヒト好酸球をアラキドン酸と共に５分間インキュベートしておよそ９：１の比で１５(Ｓ)-ＨＥＴＥ及び１２(Ｓ)-ＨＥＴＥが形成され(データは示さず)、これは１５-ＬＯ-１の活性と一致している(２)。約２７０ｎｍに最大ＵＶ吸光度を持ち５-７分の間の保持時間を有する多くのピークが同じクロマトグラムで観察された。これらのより極性の代謝物をよりよく分離するために、アセトニトリルベースの移動ＨＰＬＣ相を使用した。コンジュゲートトリエンスペクトルと２７２ｎｍでの最大吸光度を含む５つのピークが同定された(図２９)。これらの５つのピークの物質の保持時間は、二重酸素添加生成物８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ及び８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ、１４,１５-オキシド-ロイコトリエンＡ４から誘導された２つの８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４及び８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４(１９,２０)及び１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥの保持時間に対応した。形成された生成物のパターンは、アラキドン酸と共にインキュベートされたヒト気道上皮細胞に対して報告されているものと同様であった(５)。コンジュゲートしたトリエンであるが２８２ｎｍに最大の特徴的なＵＶスペクトルを持つ少量のロイコトリエン(ＬＴ)Ｃ４がまた観察された。これらのよく知られたアラキドン酸誘導代謝物に加えて、コンジュゲートされたトリエンスペクトルを有し、２８２ｎｍに最大ＵＶ吸光度を有するより極性の主要な代謝物(代謝物１)がクロマトグラムに観察された(インサート,図２９)。
【０１１１】
ＬＣ-ＭＳ／ＭＳによる代謝物１の同定
代謝物１を更に分析するために、外因性アラキドン酸と共にインキュベートしたヒト好酸球の試料に、陽イオンエレクトロスプレータンデム質量分析を使用するＬＣ-ＭＳ／ＭＳによる分析を施した。得られたイオンスキャンスペクトルはＬＴＣ４のスペクトル中にも存在する数個の断片を含んでいた(図３０Ａ)。好酸球における既知の高い１５-ＬＯ活性と併せてこの知見は、代謝物１が１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)でありうることを示している。この仮説を確認するために、合成１４,１５-ＬＴＣ４を調製し(Biomol Inc, USA)、代謝物１から得られた衝突誘導解離スペクトルを、合成１４,１５-ＬＴＣ４に対して得られたスペクトルと比較した(図３０Ａ)。試料を、プロトン化された１４,１５-ＬＴＣ４と等価な６２６．２ｍ／ｚでの生成物イオンスキャンで分析した。クロマトグラムは標準１４,１５-ＬＴＣ４と同じ保持時間のピークを含んでおり、質量スペクトルを比較すると、合成１４,１５-ＬＴＣ４と同一であった。
【０１１２】
ヒト好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４の代謝
好酸球が１４,１５-ＬＴＣ４を１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に代謝し得るかどうかを分析するために、好酸球を、３７℃で６０分間、合成１４,１５-ＬＴＣ４又は１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)と共にインキュベートした。形成された代謝物を、１４,１５-ＬＴＤ４に対しては４９７．２ｍ／ｚ、１４,１５-ＬＴＥ４に対しては４４０．２ｍ／ｚの生成物イオンスキャンで分析した。１４,１５-ＬＴＣ４から形成された生成物(代謝物２)の保持時間と質量スペクトルは合成１４,１５-ＬＴＤ４と同一であり(図３０Ｂ)、１４,１５-ＬＴＤ４とのインキュベーション後に形成された生成物(代謝物３)は合成１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)と同一の保持時間と質量スペクトルを有していた(図３０Ｃ)。３７℃での６０分のインキュベーションの間、１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の非酵素的代謝はなかった(データは示さず)。
基本的には、１４,１５-ロイコトリエン類と対応する５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル-ロイコトリエン類の生成物イオン質量スペクトルは殆ど同一である。しかしながら、１４,１５-ロイコトリエン類は２０５ｍ／ｚで断片を形成する一方、５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル-ロイコトリエン類における対応する断片は１８９ｍ／ｚにおいてである(図３１)。これらの衝突誘導解離生成物は、おそらくは、システイニル基が位置しており、１４,１５-ロイコトリエン類では炭素１４、ロイコトリエン類に対しては炭素６である炭素の隣での切断によって形成される。
【０１１３】
好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４とＬＴＣ４の形成間の比較
ヒト好酸球は豊富な量の１５-リポキシゲナーゼ及び５-リポキシゲナーゼ双方を含んでいる。１５-リポキシゲナーゼ及び５-リポキシゲナーゼ経路が最も活性である条件を調べるために、好酸球をアラキドン酸又はカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の何れか、又は双方と共にインキュベートした。細胞を３７℃で５分間インキュベートし、ＲＰ-ＨＰＬＣを用いて１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４の量を分析した。インキュベーションの５分後では好酸球には１４,１５-ＬＴＣ４又はＬＴＣ４の代謝は殆どない(データは示さず)。従って、これらの代謝物の測定は、それぞれ１５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有１４,１５-ロイコトリエン類及び５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有ロイコトリエン類の全形成を反映していると考えられる。外因性アラキドン酸との好酸球のインキュベーションにより１４,１５-ＬＴＣ４が優先的に形成されたが、ＬＴＣ４もまた幾つかのインキュベーションで形成された(表１)。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７の細胞の活性化はＬＴＣ４の形成を専ら誘導したが、イオノフォアＡ２３１８７及びアラキドン酸双方での好酸球の刺激により１４,１５-ＬＴＣ４とＬＴＣ４の双方が形成された。同様の量のこれらの代謝物が幾つかのインキュベーションで生産されたが、ＬＴＣ４のレベルは、ある試料では更に高かった。総括すると、アラキドン酸と共に細胞をインキュベートすると、１４,１５-ＬＴＣ４の形成が優勢になり、細胞のカルシウム活性化は５-ＬＯをトリガーし、５-ＬＯ誘導ロイコトリエン類の形成を強く優勢にする。
【０１１４】
表１：好酸球中における１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４の生合成。好酸球を健常なドナー又は患者から単離した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ)に懸濁させ、３７℃で５分間、アラキドン酸(１０μＭ)、イオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)又は双方と共にインキュベートし、ついで上清を逆相ＨＰＬＣ分析にかけた。１４,１５-ＬＴＣ４及びＬＴＣ４の相対量をｐｍｏｌ／１０７好酸球として計算した。
【０１１５】
１４,１５-ロイコトリエン類の生物学的効果
血漿漏出に至る血管透過性の増加は炎症の特徴であり、システイニル含有ロイコトリエン類がヒスタミン及びブラジキニンと同様な形でこの効果に寄与しうることはよく知られている(２３)。１４,１５-ＬＴＣ４とその代謝物１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４が血管透過性における改変を誘導する能力を探究するために、ヒト内皮細胞(ＥＣ)単層を通しての電気抵抗変化に基づく確立されたインビトロ透過性アッセイを使用した。このモデルにおける最大刺激で誘導されたＥＣ抵抗変化はおよそ-７０％の低下に達する。用量応答曲線は、ヒスタミンの最大効果がこのモデル系において１０-５Ｍで得られたことを示している(データは示さず)。全ての１４,１５-ロイコトリエン類がＥＣ単層透過性において最大の増加を誘導することができた(図３２Ａ)。ＬＴＣ４及びＬＴＤ４より些か強力ではないが、１４,１５-ロイコトリエン類はこの点でヒスタミンより約１００倍強力であった(図３２Ａ)。１４,１５-ＬＴＤ４は１０-７ＭでＥＣ透過性の最大増加を誘導したが、ＥＣ透過性の有意な増加がまた１０-８Ｍで観察された(図３２Ｂ)。１４,１５-ロイコトリエン類及びＬＴＤ４に応答したＥＣ透過性の変化の動態は、ヒスタミン及びＬＴＣ４のような直接的に作用するアゴニストに対して観察されたパターンに類似している(図３２Ｂ)(２４)。他方ではＬＴＢ４はＥＣ障壁機能に影響を及ぼすために顆粒球の存在を必要とし、ＬＴＢ４の効果はこのモデル系では観察されなかった。
【０１１６】
好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４生合成のレセプター媒介活性化
１４,１５-ＬＴＣ４形成の可能なレセプター媒介活性化を、アレルゲン誘導肥満細胞メディエーターＬＴＣ４及びプロスタグランジン(ＰＧ)Ｄ２並びに強力な好酸球活性化因子であるＩＬ-５を使用することによって調べた。単離された好酸球(１０×１０６／試料)を３７℃で５分間、ＬＴＣ４(１μＭ)、ＰＧＤ２(１μＭ)又はＩＬ-５(１０ｎｇ／ｍｌ)と共にインキュベートした。ロイコトリエンＣ４、ＰＧＤ２及びＩＬ-５は全て５分のインキュベーション後に好酸球からの１４,１５-ＬＴＣ４の放出を誘導した(表２)。これらの結果はレセプター媒介メカニズムを介した好酸球におけるアラキドン酸の内因性プールからの１４,１５-ＬＴＣ４の形成を実証している。
【０１１７】
表２：好酸球における１４,１５-ＬＴＣ４生合成のレセプター媒介活性化。健常な志願者又は好酸球増加症と診断された患者から単離されたヒト好酸球を１ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、ＬＴＣ４(１μＭ)、ＰＧＤ２(１μＭ)又はＩＬ-５(１０ｎｇ／ｍｌ)の存在下で３７℃で５分間インキュベートした。コントロール、ＬＴＣ４、及びＰＧＤ２、ｎ＝４。ＩＬ-５、ｎ＝２。１４,１５-ＬＴＣ４の量はＥＩＡによって分析した。
【０１１８】
臍帯血誘導肥満細胞(ＣＢＭＣＭＮＣ)における１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４の生合成
肥満細胞は喘息の病態生理学において重要な役割を担っている。最近、我々は、インターロイキン(ＩＬ-４)がヒト臍帯血誘導肥満細胞においてインビトロで１５-ＬＯ-１の発現を誘導し、肥満細胞がインビボで１５-ＬＯ-１を発現することを報告した(４)。従って、肥満細胞が１４,１５-ロイコトリエン類を生産できるかを調べることは興味深かった。ＩＬ-４で薬物刺激された肥満細胞をアラキドン酸(１０μＭ)と共に５分間インキュベートした。上清を集め、１４,１５-ＬＴＣ４に対してＥＩＡを使用して分析した。これらの条件下で、ヒト肥満細胞は０．８＋／−０．６ｐｍｏｌ／１０６細胞(ｎ＝３)を放出し、アラキドン酸刺激の後に、免疫反応性の１４,１５-ＬＴＣ４を合成し放出する能力を示している。
【０１１９】
１４,１５-ＬＴＣ４の同一性は更にＬＣ-ＭＳ／ＭＳ単一反応モニタリングＳＲＭで証明された。よって、アラキドン酸と共にインキュベートした肥満細胞が、１４,１５-ＬＴＣ４のＳＲＭ遷移に対するものと同じ保持時間と典型的な断片パターンを有する代謝物を生じた(データは示さず)。また、肥満細胞試料を特異的１４,１５-ＬＴＤ４ ＳＲＭ法で分析して、４,１５-ＬＴＣ４が細胞によって更に代謝されるかどうかを調べた。確かに、合成１４,１５-ＬＴＤ４と同一の断片化パターンと保持時間を有する代謝物が証明された。総括すると、肥満細胞は１４,１５-ＬＴＣ４と１４,１５-ＬＴＤ４の双方を生産する能力を有している。
【０１２０】
ヒト鼻ポリープにとる１４,１５-ＬＴＣ４の自然の放出
鼻ポリープ症は、好酸球のような炎症細胞による組織浸潤からなる多因子性疾患である(２５)。１４,１５-ＬＴＣ４がヒト鼻ポリープによって合成されうるかを調べるために、無傷の外科的に除去した鼻ポリープを洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭＩＮＩ(登録商標))及びインドメタシンを含むＰＢＳ中で３７℃で５又は３０分、インキュベートした。ついで、インキュベーション培地を、１４,１５-ＬＴＣ４に対してＥＩＡを使用して分析した。その結果は、鼻ポリープが自然に１４,１５-ＬＴＣ４(それぞれ５及び３０分のインキュベーション後に、１０．１±０．００７及び７．１８±１．１８ｐｍｏｌの１４,１５-ＬＴＣ４／ｇポリープ組織(ｎ＝２))を放出することを裏付けている。経時的な１４,１５-ＬＴＣ４の減少レベルは１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４への更なる代謝のためであり、これは１４,１５-ＬＴＣ４に対して産生された抗体によっては検出されない(１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に対して１％未満の交差反応性、材料と方法を参照)。
【０１２１】
エオキシン類-１４,１５-ロイコトリエン類に対して示唆された新規な名前
ロイコトリエンという名前は、５-リポキシゲナーゼ生成物に伝統的に関連している。アラキドン酸において１４,１５-エポキシドを介して形成される１５-リポキシゲナーゼ代謝物に対する機能的名前は、それは５-リポキシゲナーゼ経路を介して形成されないが、１４,１５-ロイコトリエンであった。好酸球はこの報告において記載された新規な１５-リポキシゲナーゼ生成物に対するリッチな供給源であるので、５-ＬＯ誘導生成物との混同を避けるために、我々は、それぞれ１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４の代わりに、エオキシン(Ｅｏｘ)Ｃ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４という名を示唆する(図３３)。
【０１２２】
検討
ヒト気道上皮細胞及び好酸球は高い量の１５-ＬＯ-１を発現する(３,５,６)。また、ヒト肥満細胞、マクロファージ及び樹状細胞は１５-ＬＯ-１を発現する(２６＋Gullilsson)。この研究分野での多くの研究にかかわらず、赤血球新生の間の酵素の機能を除いて、この酵素の生物学的役割は不確かである(２,３)。本報告では、我々は、ヒト好酸球、特に臍帯血誘導肥満細胞及び鼻ポリープがアラキドン酸を１５-ＬＯ-１経路を介して、コンジュゲートされたトリエンスペクトルと２８２ｎｍでの最大ＵＶ吸光度を有する代謝物に転換させる能力を有していることを記載する(図２９)。好酸球及び肥満細胞において形成されたこれらの代謝物の構造は陽イオンタンデム質量分析法及びＲＰ-ＨＰＬＣ／ＵＶ-分光法によって決定し、合成１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４と同一であることが見出された(図３０及び３１)。好酸球は主として１４,１５-ＬＴＣ４を生産し、それぞれ合成１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４と共にこれらの細胞のインキュベーションによって証明されるように、この代謝物は更に１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に代謝されうる。合成１４,１５-ＬＴＣ４は様々な生物システムにおいて研究され(例えば、Drazen等(1981) Proc Natl Acad Sci 78, 3195-3198を参照)、１４,１５-ＬＴＡ４は上皮細胞及び好酸球において形成されることは先に見出されているけれども(例えば文献３２を参照)、システイニル含有１４,１５-ロイコトリエン類の生合成がヒト細胞及び組織中でアラキドン酸から生じることは決して証明されていない。
【０１２３】
外因的なアラキドン酸と共に好酸球をインキュベーションすると、１４,１５-ＬＴＣ４の生成がＬＴＣ４より優性になり(表１)、代わりにカルシウムイオノフォアで細胞内カルシウムレベルが増加すると、５-ＬＯを誘導し、ただＬＴＣ４だけを生産する。よって、５-ＬＯ及び１５-ＬＯロイコトリエンの生産の調節は異なり、排出される主要な代謝物にどの代謝物がなるかは刺激に依存する。この点で、１４,１５-ロイコトリエン経路はプロスタグランジン経路に似ており、遊離のアラキドン酸が利用できる場合に直ぐに生じ、カルシウム流に独立している。
【０１２４】
５-リポキシゲナーゼ誘導システイニル含有ロイコトリエン類とは異なり、１４,１５-ＬＴＣ４とその代謝物はモルモット肺実質性条片又は回腸への収縮効果を有していないように思われる(２７)。しかしながら、我々は、ここで、コンフルエントなヒト内皮細胞を持つモデル系において、３種全ての１４,１５-ロイコトリエン類が炎症のマーカーである血管漏出を増加させたことを立証する。１４,１５-ロイコトリエン類は１０-７及び１０-８Ｍで増大したＥＣ透過性を誘導し、システイニル含有ロイコトリエン類と殆ど同じほど強力で、この点ではヒスタミンより１００倍以上強かった(図３２)。この研究では、我々は、内皮細胞障壁機能のメディエーター誘導混乱の解析のためにインビトロモデル系を使用した。ＴＥＥＲの連続的測定により、ＥＣ透過性の急速な変化の検出が可能になり、培養された内皮細胞単層の障壁能力の感度のよい指標であることが過去に示されている(２４,２８)。ヒスタミンやシステイニルロイコトリエン類のような炎症メディエーターの透過性増大活性は以前から知られている。これらのメディエーターは、細胞内Ｃａ２＋移動及び細胞骨格再配置の惹起を通してＥＣ障壁機能にその効果を作用させ(２９)、傍細胞 間隙形成及び亢進された巨大分子透過性を生じる。同様に、１４,１５-ロイコトリエン類は同様な方法で血管透過性の増加を刺激する。
【０１２５】
ＬＴＣ４、ＰＧＤ２及びＩＬ-５でのヒト好酸球のレセプター媒介活性化がまた１４,１５-ロイコトリエン類の生産と放出を惹起した(表２)。よって、１４,１５-ロイコトリエン類は好酸球中のアラキドン酸の内因性プールから製造することができる。ＬＴＣ４及びＰＧＤ２は、共にアラキドン酸誘導化合物であり、抗原投与時に肥満細胞によって合成され放出されることが知られており、活性化された肥満細胞は、１４,１５-ロイコトリエン類自体の生産に加えて、好酸球におけるこれらの生成物の生合成を刺激することができる。ＬＴＣ４及びＰＧＤ２に加えて、ＩＬ-５は１４,１５-ＬＴＣ４の内因性生合成を活性化することができる。ＩＬ-５は、その生産、活性化及び組織補充を含む好酸球の幾つかの側面を調節することに決定的に関与したサイトカインである。
【０１２６】
鼻ポリープ形成の原因は知られていないが、アラキドン酸代謝物は、特にアスピリン過敏症副鼻腔炎／喘息徴候を持つ患者において、病因において重要であると思われる。鼻ポリープ症の主要な特徴は活性化された好酸球の蓄積であると考えられ、これは組織内の炎症性細胞の２８％までを占める(３０)。従って、インビトロでインキュベートされたヒト鼻ポリープが１４,１５-ロイコトリエン類を生産し放出するかどうかを調べることは興味深かった。確かに、１４,１５-ＬＴＣ４は鼻ポリープによってインキュベーション培地中に自然に放出された。活性化された好酸球は鼻ポリープ中の１４,１５-ＬＴＣ４の主要なソースであると思われる。しかしながら、気道内皮細胞は、これらの細胞は多量の１５-ＬＯを含んでいることが知られているので、所定の役割を担っていることは除外できない(文献２-６を参照)。
好酸球はこれらの新規代謝物のリッチな供給源であるので、我々は、５-ＬＯ経路を介して生産された化合物との混同を避けるために、１４,１５-ロイコトリエンの代わりにエオキシンなる名前を示唆する。よって、１４,１５-ロイコトリエンＡ４、Ｃ４、Ｄ４及びＥ４はそれぞれエオキシン(Ｅｏｘ)Ａ４、ＥｏｘＣ４、ＥｏｘＤ４及びＥｏｘＥ４で置き換えられる(図３３)。エオキシン類はヒト細胞においてアラキドン酸から生産されることは決して報告されていない。しかしながら、ヒト好塩基球は外因性１４,１５-ロイコトリエンＡ４を１４,１５-ロイコトリエンＣ４に転換することが先に見出されている(３３)。
【０１２７】
総括すると、この報告は、好酸球及び肥満細胞によって生産される新規な炎症誘発性のアラキドン酸代謝物の形成、並びにこれらの代謝物の生合成に対する様々な生理学的トリガーの同定を記載する。よって、炎症性気道中の活性化された肥満細胞とＴｈ２細胞がＬＴＣ４、ＰＧＤ２及びＩＬ-５を排出し、これが近くの好酸球を誘導してエオキシン類を生産させ放出し、血漿漏出を生じるということができる。更に、アレルギー性炎症に加えて、遊離のアラキドン酸が高量で存在する非アレルギー性炎症においてもまた、エオキシン生産が起こり、炎症プロセスに寄与することが推測できる。
多くの報告が、コントロール被験者と比較して喘息患者の気道組織における１５-ＬＯ-１の増加した量と活性を実証している。健常な喫煙者は、特に慢性気管支炎の喫煙者の場合、気管支バイオプシー中での増加した１５-ＬＯ-１の発現を示している。この点で、我々は、１５-ＬＯ-１経路が好酸球及び肥満細胞において炎症誘発性の１４,１５-ロイコトリエン類(エオキシン類)を生産することができることを示しており、１５-ＬＯ-１の阻害がヒトにおける喘息及び鼻炎の治療のための魅力的な標的であり得ることを示している。
【０１２８】
材料と方法
バキュテナー(登録商標)採血管はベクトン・ディキンソン(Rutherford, NJ)から得た。モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１６抗体にコンジュゲートされた常磁性ミクロビーズ、磁気スタンド及びＬＳ＋磁気分離カラムはMiltenyi Biotec(Bergisch Gladbach, Germany)から得た。組換えヒト(ｒｈ)ＩＬ-４はIn Vitro Sweden AB(Sweden)から購入した。１４,１５-ＬＴＣ４ ＥＩＡキットはCayman Chemical(Ann Arbor, MI)から購入した。イオノフォアＡ２３１８７はCalbiochem-Boehring(La Jolla, CA)から購入した。インドメタシンはSigma-Aldrichから購入した。全ての溶媒はＨＰＬＣグレードであった。アラキドン酸はNu-Chek prepから購入した。合成１４,１５-エポキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＡ４)、１４(Ｒ)-グルタチオニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＣ４)、１４(Ｒ)-システイニル-グリシル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＤ４)、１４(Ｒ)-システイニル-１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４,１５-ＬＴＥ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ)、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｓ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、８(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,９,１１,１３(Ｚ,Ｅ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(８(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ)、１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ジヒドロキシ-５,８,１０,１２(Ｚ,Ｚ,Ｅ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＤＨＥＴＥ又は１４(Ｒ),１５(Ｓ)-ＬＴＢ４)、１５(Ｓ)-ヒドロキシ-５,８,１１,１３(Ｚ,Ｚ,Ｚ,Ｅ)-エイコサテトラエン酸(１５-ＨＥＴＥ)、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４及びＬＴＥ４は、Biomol Inc (Plymouth Meeting, USA)から購入した。
【０１２９】
ヒト好酸球の単離
静脈血(１００ｍｌ)を、健常な志願者又は好酸球増加症候群(ＨＥＳ)を含む好酸球増加症、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)及びある種の炎症疾患の患者からから採血した。４００×ｇで１５分間の最初の遠心分離を実施した。上相を捨て下相を集め、２０℃で３０分間、Ｄｅｘｔｒａｎ(商標)沈降を施した。沈降後、白血球細胞を含む上相を４００×ｇで１０分間、一回遠心分離した。ペレットを溶解バッファー(１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＴＲＩＳ-ＨＣｌ、ｐＨ７．４)に懸濁させ、室温で３０分インキュベートして混入した赤血球を除去した。インキュベーション後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(商標)を用いて密度勾配遠心分離を実施した。好中球と好酸球を含む多形核(ＰＭＮ)画分を集め、磁気細胞分離(ＭＡＣＳ)を施した。好酸球は、磁気ミクロビーズ(登録商標)に結合させたＣＤ１６抗体を使用するネガティブ選択によって単離した。純度は、形態学的検査とメイ・グリューネバルト-ギムザ溶液での染色によって確認した。純度は常に９５％を越えていることが見出された。
臍帯血誘導肥満細胞(ＣＢＭＣＭＮＣ)の調製及びポリープの単離
臍帯血誘導肥満細胞(ＣＢＭＣＭＮＣ)を記載されたようにして樹立した(４)。ポリープは外科的に除去し、４℃で最大１時間、ＰＢＳ中に維持した。ポリープを回りの組織から分離し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋なしのＰＢＳで洗浄した。洗浄した濡れたポリープの重さは０．７-１ｇであった。
【０１３０】
細胞インキュベーション
好酸球
単離された好酸球(１−２０×１０６／試料)をリン酸緩衝生理食塩水(１ｍｌ／試料)に再懸濁させ、３７℃で示された時間の間、イオノフォアＡ２３１８７(１μＭ)／アラキドン酸(１又は１０μＭ)／Ａ２３１８７プラスアラキドン酸／ＰＧＤ２(１μＭ)／ＬＴＣ４(１μＭ)／ＩＬ-５(１０ｎｇ／ｍｌ)／１４,１５-ＬＴＣ４(１０μＭ)又は１４,１５-ＬＴＤ４(１０μＭ)又は双方で２、５又は１０分、刺激する前に３７℃で２分間(インドメタシンの存在下又は不在下で、１μＭ)、プレインキュベートした。インキュベーションは１容量のメタノールの添加によって終結させた(ＲＰ-ＨＰＬＣによる分析のため)。エンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)による続く分析のために、反応を、１２００×ｇ、５分の遠心分離前に０℃で急速冷却して終結させた。上清を凍結管に移し、分析するまで-７０℃で保存した。
【０１３１】
肥満細胞
インキュベーション前に、ＣＢＭＣ細胞にＩＬ-４(１０ｎｇ／ｍｌ)を用いて４日間薬物刺激を施した。機械的な除去及びＰＢＳでの洗浄後に、細胞をＰＢＳに再懸濁させ、インドメタシン(１μＭ)と共に又はそれなしで３７℃で２分間プレインキュベートした。ＣＢＭＣ細胞を続いて３７℃でアラキドン酸と共に示された期間の間、インキュベートした。インキュベーションは１容量のメタノールの添加によって(ＬＣ-ＭＳ分析)又は０℃に急速冷却することによって終結させ、続いてＥＩＡによって分析した。
ヒト鼻ポリープ
洗浄したヒトの無傷のポリープを、１ｍｌの全容量中にＰＢＳ、プロテアーゼ阻害剤(Complete MINI(登録商標))及びインドメタシン(１μＭ)を含む清浄な試験管中に移した。試料を３７℃でそれぞれ５分及び３０分、インキュベートした。反応を０℃に急速冷却することによって終結させ、続いて１２００×ｇ、５分、遠心分離した。上清を凍結管に移し、ＥＩＡによる分析まで-７０℃で保存した。
【０１３２】
１５-リポキシゲナーゼ生成物の分析
逆相-高速液体クロマトグラフィー-ＵＶ(ＲＰ-ＨＰＬＣ-ＵＶ)
細胞片及びタンパク質を除去するために、１２００×ｇで５分間、遠心分離を実施した。上清を減圧下で蒸発させ、残留物をメタノールに溶解させ、試験管に移した。ついで、試料を窒素流下で蒸発乾固させ、最後に２００μｌの移動相(ロイコトリエン類及び１４,１５-ロイコトリエン類の分析に対してはアセトニトリル：メタノール：Ｈ２Ｏ：酢酸、２９：１９：７２：０．８、ｐＨは５．６にＮＨ３で調整、及びモノヒドロキシ酸の分析に対してはメタノール：水：トリフルオロ酢酸、７０：３０：０．００７)に再懸濁させた。抽出された試料に、記載されたようにして逆相ＨＰＬＣ系での分析を施した。簡単に述べると、試料をオクタデシル逆相カラム(Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄ １８Ｃ,Ｍａｃｈｅｒｅｙ-Ｎａｇｅｌ,Ｄｕｒｅｎ,Ｇｅｒｍａｎｙ)に充填し、溶出流量は１．２ｍｌ／分であった。溶出した化合物を、Ｗａｔｅｒｓ１９９６ＨＰＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ分光光度計を利用して検出し定量した。
【０１３３】
液体クロマトグラフィー-質量分析解析(ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ)
インキュベーションの終結後、試料を遠心分離し(１４００×ｇ、６分)、上清を水で希釈して最大２５％のメタノールを含ませ、洗浄及び平衡抽出カートリッジＯａｓｉｓ ＨＬＢ １ｃｃ １０ｍｇ(Waters AB, Sweden)に移した。カラムを水で洗浄し、２００μｌのメタノールで溶出させて代謝物を回収した。
液体クロマトグラフィー-質量分析はＴＳＱ・Ｑｕａｎｔｕｍ・Ｕｌｔｒａトリプル四極子質量分析計に連結したＳｕｒｖｅｙｏｒ・ＭＳ(Thermo Electron Corporation, Sweden)で実施した。注入前に１容量の水を試料に加えた。逆相ＬＣは、４００μｌ／分に一定に保たれた流量でＺｏｒｂａｘ・Ｅｃｌｉｐｓｅ・Ｐｌｕｓ３．５μＭ・Ｃ１８カラム２．１×５０ｍｍ(ChromTech, Sweden)を用いて実施した。移動相Ａは水中２％のアセトニトリルと０．１％の酢酸からなり、移動相Ｂは水中８０％のアセトニトリルと０．１％の酢酸から構成されている。使用した全ての水はＭｉｌｌｉＱグレードであった。９０％のＡで１．５分、均一濃度で開始して、１００％のＢに達する６．５分の線形勾配を続けた。該系を１００％のＢで４分洗浄し、ついで９０％のＡで４分間平衡にした。１４,１５-ロイコトリエン類を約０．５分、ロイコトリエン類からクロマトグラフィー的に分離した。質量分析計はポジティブモードでエレクトロスプレー大気圧イオン化源を使用して操作した。スプレー電圧は４５００Ｖに設定し、キャピラリー温度は３７５℃であり、シース及び補助ガスはそれぞれ４０及び５(任意単位)で最適であった。スキマーオフセットは１０Ｖで、チューブレンズは１２１Ｖであった。
【０１３４】
好酸球代謝物に対するＬＣ-ＭＳ／ＭＳ
ＬＣ-ＭＳ／ＭＳを使用して、プロトン化１４,１５-ＬＴＣ４、１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４の生成物イオンスキャンを実施した。６２６．２ｍ／ｚの１４,１５-ＬＴＣ４を２２ｅＶの衝突エネルギーで断片化し、４９７．２ｍ／ｚの１４,１５-ＬＴＤ４及び４４０．２ｍ／ｚの１４,１５-ＬＴＥ４は共に１８ｅＶで断片化した。
肥満細胞代謝物に対するＬＣ-ＭＳ／ＭＳ
１４,１５-ＬＴＣ４及び１４,１５-ＬＴＤ４は単一反応モニタリングＳＲＭによって検出した。ＳＲＭスキャンで使用された遷移は、１４,１５-ＬＴＣ４に対して６２６ｍ／ｚ→２７９ｍ／ｚ、１４,１５-ＬＴＤ４に対して４９７ｍ／ｚ→２０５ｍ／ｚであり、双方とも２０ｅＶの衝突エネルギーであった。１４,１５-ＬＴＣ４に対して選択される遷移はまたＬＴＣ４に対して存在していたが、これらの化合物はクロマトグラフィー的にはおよそ０．５分で分離した。４９７ｍ／ｚ→２０５ｍ／ｚの遷移は１４,１５-ＬＴＤ４に対して特異的であり、よってＬＴＤ４には適用できなかった。
【０１３５】
１４,１５-ＬＴＣ４に対するエンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)の特徴付け
１４,１５-ＬＴＣ４に対するエンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)は少量の１４,１５-ＬＴＣ４を定量するためにCayman Chemical (Ann Arbor, MI)によって開発された。この方法は、１４,１５-ＬＴＣ４の定量においてＲＰ-ＨＰＬＣよりおよそ千倍感度が良かった。ＥＩＡ交差反応性は製造者によって決定された。１４,１５-ＬＴＤ４及び１４,１５-ＬＴＥ４に対する交差反応性はそれぞれ０．９％及び０．０４％であった。ロイコトリエンＣ４、ロイコトリエンＤ４、ロイコトリエンＥ４、アラキドン酸、１２-ＨＥＴＥ、１５-ＨＥＴＥ、５(Ｓ),６(Ｓ)-ジＨＥＴＥ、５(Ｓ),１５(Ｓ)-ジＨＥＴＥ、８(Ｓ),１５(Ｓ)-ジＨＥＴＥ及び１４,１５-ジＨＥＴＥの交差反応性は０．０１％未満であった。
上清をＥＩＡバッファーで希釈し、分析を製造者のプロトコルに従って実施した。ＥＩＡ定量からの光学密度(ＯＤ)を用いて次の関係に従って％Ｂ／Ｂ０を計算した：
％Ｂ／Ｂ０＝(試料ＯＤ-NSB ＯＤ)／(ゼロ標準ＯＤ-NSB ＯＤ)×１００
７．８-１０００ｐｇ／ｍｌ(０．０１２-１．６ｐｍｏｌ／ｍｌ)１４,１５-ＬＴＣ４の範囲の標準曲線を作成し、試料中の１４,１５-ＬＴＣ４の濃度を決定するために使用した。
【０１３６】
内皮細胞障壁機能の評価
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (ＨＵＶＥＣ)を単離し、過去に記載されているようにして培養した。細胞を３μｍの孔径のポリカーボネートフィルター(Tissue Culture inserts, 10 mm; NUNC, Roskilde, Denmark)に２×１０５細胞の密度で播種し、コンフルエントな単層まで増殖させた。内皮細胞(ＥＣ)単層の障壁機能に変化を誘導するアラキドン酸代謝物の能力は、経内皮電気抵抗(ＴＥＥＲ)の連続的記録によって分析した。ＴＥＥＲの測定では、ＥＣを有するフィルターインサートを、繰り返し測定の間に互いのかつフィルターインサートに対しての電極の正確な位置決めを達成するように変更された抵抗測定チャンバー(Endohm-12, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)に移した。チャンバー(下方コンパートメント)及びフィルターインサート(上方コンパートメント)にそれぞれ２ｍｌ及び４００μｌの培養培地を満たした。全ての測定は細胞培養インキュベーター中に配した装置で３７℃にて行った。個々のＥＣ単層の電気抵抗は、ＥＣの播種前に測定したBiomatrixでコートされた対応する裸のフィルターの抵抗を減算することによって得られた。よって、ＴＥＥＲ値はＥＣ単層だけの抵抗を表す。
【０１３７】
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【０１３８】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物システムにおける１４,１５-ＬＴＣ４(エオキシンＣ４；ＥｏｘＣ４)、１４,１５-ＬＴＤ４(エオキシンＤ４；ＥｏｘＤ４)、又は１４,１５-ＬＴＥ４(エオキシンＥ４；ＥｏｘＥ４)の形成を調節する化合物を同定する方法であって、１５リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)活性又はグルタチオンＳトランスフェラーゼＭ１-１(ＧＳＴＭ１-１),グルタチオンＳトランスフェラーゼＰ１-１(ＧＳＴＰ１-１)及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法。
【請求項２】
炎症調節効果又は骨量減少調節効果を有する化合物を同定する方法であって、生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法。
【請求項３】
該方法は、抗炎症効果又は骨量減少低減効果を有する化合物を同定するためのものであり、生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性に対する阻害効果について化合物を試験することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成又は活性に対する効果について化合物を試験する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物システムが、１５-ＬＯ,グルタチオンＳトランスフェラーゼ(例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１)及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性を含む請求項２から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
化合物を、細胞画分又は単離酵素を含む系において試験する請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物を、細胞を含む系において試験する請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物を、細胞培養を含む系において試験する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞がＬ１２３６細胞又は一次好酸球白血球又は肥満細胞である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞をアラキドン酸で刺激し又はアラキドン酸と共にインキュベートする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
化合物を、組織又は器官を含む系において試験する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
化合物を、動物を含む系において試験する請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
化合物を、炎症のインビトロモデルにおいて内皮細胞のエオキシン誘導透過に対する阻害効果；又は白血球によるエオキシン誘導酸素フリーラジカル生成について試験する請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
化合物を、炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患における抗炎症効果について更に試験する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
炎症疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、肺線維症、アレルギー性疾患、鼻炎、炎症性腸疾患、潰瘍、炎症性痛覚、発熱、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、脈管炎、膵炎、関節炎、変形性関節炎、関節リウマチ、結膜炎、虹彩炎、強膜炎、ブドウ膜炎、創傷、皮膚炎、湿疹、乾癬、発作、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、高血圧、ホジキンリンパ腫又は他の悪性腫瘍である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化合物を、骨粗鬆症、骨関節炎、多発性骨髄腫、パジェット病又は歯周病における骨量減少低減効果について更に試験する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗炎症組成物を製造する方法であって、
(ｉ)請求項２又は請求項２に従属する請求項３から１５の何れか一項に記載の方法によって抗炎症化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法。
【請求項１８】
エオキシン形成調節組成物を製造する方法であって、
(ｉ)請求項１又は請求項１に従属する請求項３から１６の何れか一項に記載の方法によってエオキシン形成調節化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法。
【請求項１９】
組成物を、炎症の治療に有用な更なる治療剤と組み合わせる工程を更に含む請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
骨量減少低減組成物を製造する方法であって、
(ｉ)請求項２又は請求項２に従属する請求項３から１６の何れか一項に記載の方法によって骨量減少低減化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法。
【請求項２１】
組成物を、骨量減少の治療に有用な更なる治療剤と組み合わせる工程を更に含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
炎症調節効果又は骨量減少調節効果を有する化合物を同定するため、又は生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４,又はＥｏｘＥ４の形成を調節する化合物を同定するための方法における、Ｌ１２３６細胞又は細胞培養物、あるいは１５リポキシゲナーゼと、グルタチオンＳトランスフェラーゼＭ１-１(ＧＳＴＭ１-１),グルタチオンＳトランスフェラーゼＰ１-１(ＧＳＴＰ１-１)及びロイコトリエンＣ４シンターゼの少なくとも一つを発現する他の細胞の使用。
【請求項２３】
治療的有効量のＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４を患者に投与することを含む、炎症反応の促進を必要とする患者の治療方法。
【請求項２４】
炎症反応の促進を必要とする患者の治療のための医薬の製造におけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の使用。
【請求項２５】
医薬に使用するためのＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４。
【請求項１】
生物システムにおける１４,１５-ＬＴＣ４(エオキシンＣ４；ＥｏｘＣ４)、１４,１５-ＬＴＤ４(エオキシンＤ４；ＥｏｘＤ４)、又は１４,１５-ＬＴＥ４(エオキシンＥ４；ＥｏｘＥ４)の形成を調節する化合物を同定する方法であって、１５リポキシゲナーゼ(１５-ＬＯ)活性又はグルタチオンＳトランスフェラーゼＭ１-１(ＧＳＴＭ１-１),グルタチオンＳトランスフェラーゼＰ１-１(ＧＳＴＰ１-１)及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法。
【請求項２】
炎症調節効果又は骨量減少調節効果を有する化合物を同定する方法であって、生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性に対する効果について化合物を試験することを含む方法。
【請求項３】
該方法は、抗炎症効果又は骨量減少低減効果を有する化合物を同定するためのものであり、生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成及び／又は活性に対する阻害効果について化合物を試験することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の形成又は活性に対する効果について化合物を試験する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物システムが、１５-ＬＯ,グルタチオンＳトランスフェラーゼ(例えばＧＳＴＭ１-１又はＧＳＴＰ１-１)及び／又はロイコトリエンＣ４シンターゼ活性を含む請求項２から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
化合物を、細胞画分又は単離酵素を含む系において試験する請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物を、細胞を含む系において試験する請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物を、細胞培養を含む系において試験する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞がＬ１２３６細胞又は一次好酸球白血球又は肥満細胞である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞をアラキドン酸で刺激し又はアラキドン酸と共にインキュベートする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
化合物を、組織又は器官を含む系において試験する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
化合物を、動物を含む系において試験する請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
化合物を、炎症のインビトロモデルにおいて内皮細胞のエオキシン誘導透過に対する阻害効果；又は白血球によるエオキシン誘導酸素フリーラジカル生成について試験する請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
化合物を、炎症疾患又は炎症プロセスを含む疾患における抗炎症効果について更に試験する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
炎症疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、肺線維症、アレルギー性疾患、鼻炎、炎症性腸疾患、潰瘍、炎症性痛覚、発熱、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、脈管炎、膵炎、関節炎、変形性関節炎、関節リウマチ、結膜炎、虹彩炎、強膜炎、ブドウ膜炎、創傷、皮膚炎、湿疹、乾癬、発作、糖尿病、自己免疫疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、高血圧、ホジキンリンパ腫又は他の悪性腫瘍である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化合物を、骨粗鬆症、骨関節炎、多発性骨髄腫、パジェット病又は歯周病における骨量減少低減効果について更に試験する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗炎症組成物を製造する方法であって、
(ｉ)請求項２又は請求項２に従属する請求項３から１５の何れか一項に記載の方法によって抗炎症化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法。
【請求項１８】
エオキシン形成調節組成物を製造する方法であって、
(ｉ)請求項１又は請求項１に従属する請求項３から１６の何れか一項に記載の方法によってエオキシン形成調節化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法。
【請求項１９】
組成物を、炎症の治療に有用な更なる治療剤と組み合わせる工程を更に含む請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
骨量減少低減組成物を製造する方法であって、
(ｉ)請求項２又は請求項２に従属する請求項３から１６の何れか一項に記載の方法によって骨量減少低減化合物を同定し；
(ｉｉ)該化合物を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせる
ことを含む方法。
【請求項２１】
組成物を、骨量減少の治療に有用な更なる治療剤と組み合わせる工程を更に含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
炎症調節効果又は骨量減少調節効果を有する化合物を同定するため、又は生物システムにおけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４,又はＥｏｘＥ４の形成を調節する化合物を同定するための方法における、Ｌ１２３６細胞又は細胞培養物、あるいは１５リポキシゲナーゼと、グルタチオンＳトランスフェラーゼＭ１-１(ＧＳＴＭ１-１),グルタチオンＳトランスフェラーゼＰ１-１(ＧＳＴＰ１-１)及びロイコトリエンＣ４シンターゼの少なくとも一つを発現する他の細胞の使用。
【請求項２３】
治療的有効量のＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４を患者に投与することを含む、炎症反応の促進を必要とする患者の治療方法。
【請求項２４】
炎症反応の促進を必要とする患者の治療のための医薬の製造におけるＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４の使用。
【請求項２５】
医薬に使用するためのＥｏｘＣ４,ＥｏｘＤ４又はＥｏｘＥ４。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３ａ】
【図２３ｂ】
【図２３ｃ】
【図２４ａ】
【図２４ｂ】
【図２４ｃ】
【図２５ａ】
【図２５ｂ】
【図２６】
【図２７ａ】
【図２７ｂ】
【図２８ａ】
【図２８ｂ】
【図２９】
【図３０ａ】
【図３０ｂ】
【図３０ｃ】
【図３１】
【図３２ａ】
【図３２ｂ】
【図３２ｃ】
【図３３】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３ａ】
【図２３ｂ】
【図２３ｃ】
【図２４ａ】
【図２４ｂ】
【図２４ｃ】
【図２５ａ】
【図２５ｂ】
【図２６】
【図２７ａ】
【図２７ｂ】
【図２８ａ】
【図２８ｂ】
【図２９】
【図３０ａ】
【図３０ｂ】
【図３０ｃ】
【図３１】
【図３２ａ】
【図３２ｂ】
【図３２ｃ】
【図３３】
【公表番号】特表２００９−５４０８５６（Ｐ２００９−５４０８５６Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１７３９１（Ｐ２００９−５１７３９１）
【出願日】平成１９年６月２７日（２００７．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００２３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００１０７９
【国際公開日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【出願人】（５０５３４７５５８）バイオリポックス エービー (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２７日（２００７．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００２３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００１０７９
【国際公開日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【出願人】（５０５３４７５５８）バイオリポックス エービー (26)
【Ｆターム（参考）】
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