説明

エキソソームに結合した目的のポリペプチドの分泌を可能にする新規キメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにその使用

本発明は、膜小胞、特にエキソソームに結合して分泌され得る複数のポリペプチドドメインを含んでなるキメラポリペプチドを提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドならびにエキソソームまたはDNAに基づく免疫原性組成物の産生のための、あるいはタンパク質相互作用をスクリーニングするためのこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。本発明はまた、免疫学において、本発明のポリペプチドを含んでなるエキソソームおよび本発明の免疫原性組成物の特性を利用することに関する。本発明はまた、診断手段として本発明のポリペプチドを含んでなるエキソソームの使用に関する。本発明はまた、機能的な欠損による疾患の予防および/または処置のために、特にタンパク質もしくは核酸を輸送するために、特に酵素の欠損を補うかもしくは埋め合わせるために、または特に標的細胞または臓器における転写もしくは翻訳修飾を誘発するために、本発明の膜小胞およびタンパク質組成物の特性を利用することに関する。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
適当な真核細胞中で発現されるときに、膜小胞、特にエキソソームに結合して分泌され得るキメラポリペプチドであって、以下のドメイン:
(i)目的のペプチドまたはポリペプチド;
(ii)膜内標的ドメインであって、前記膜内標的ドメインと細胞膜もしくは小胞膜との間の固定のための、および/または相互作用のための、1もしくは2以上の分子を介して、本発明のキメラポリペプチドが前記細胞膜もしくは小胞膜に固定されることを可能とする、前記膜内標的ドメイン;並びに
(iii)真核細胞において前記キメラポリペプチドを膜小胞、特にエキソソーム形成小胞へ、および/または前記膜小胞の形成に関与する1または2以上の細胞区画へ差し向けることができる膜タンパク質の細胞質ドメイン(CD)、或いは、前記CDドメインの変異誘導体であって、基準CDドメインの配列の1または2以上の残基の置換、欠失および/または挿入によって規定され、そして前記CDドメインの前記差し向け能力を保存している前記変異誘導体、ここで前記CDドメインまたはその変異誘導体は、少なくとも1つのモチーフYxxLまたはDxxL、およびモチーフPxxPを含み、ここでxは任意の残基を表わし、そしてY、L、D、およびPはそれぞれチロシン、ロイシン、アスパラギン酸、およびプロリン残基を表わす;
を含んでなるか、またはこれらから成ることを特徴とし;そして、
前記キメラポリペプチド内に存在するドメイン、特にドメイン(i)、(ii)、および(iii)は細胞質ドメインまたは核ドメインであり、かつ、前記キメラポリペプチドは小胞体内への取り込まれるためのシグナルペプチドを欠損していると理解される、前記キメラポリペプチド。
【請求項2】
前記膜内標的ドメインが、表在性膜タンパク質のものであるか、あるいは、前記膜内標的ドメインの変異誘導体であって、基準膜内標的ドメインの配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体である、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
【請求項3】
前記ドメイン(i)〜(iii)が、ポリペプチドのN末端部からC末端部に向かって、以下の:(ii)−(i)−(iii)、または(ii)−(iii)−(i)、または(i)のN末端領域−(ii)もしくは(iii)−(iii)もしくは(ii)−(i)のC末端領域の順で連続して配置されている、請求項1または2に記載のキメラポリペプチド。
【請求項4】
前記モチーフPXXPが、モチーフPSAP(配列番号88)またはPTAP(配列番号89)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項5】
前記CDドメインが、2つまたは3つのモチーフYxxL(xは任意の残基を表す)を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項6】
前記CDドメインまたはCDドメインの変異誘導体が、以下の:
・YINL、YSHLおよびDYINLから選択されるモチーフYxxLまたはDYxxLの少なくとも1つ;および/または
・PSAPまたはPTAPから選択されるモチーフPxxPの少なくとも1つ、
を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項7】
前記膜内標的ドメインは、それとの相互作用によって脂質膜に固定されることを可能にする配列、特にコンセンサス、例えば配列FYVE、および/または、脂質、特に脂肪酸、より具体的にはミリスチン酸、パルミチン酸、ゲラニル−ゲラニルまたはファルネシルを介して脂質膜に固定されることを可能にする配列、特にコンセンサス、を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項1〜6のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項8】
ミリスチン酸、パルミチン酸、またはゲラニル−ゲラニルが結合すること、特にミリスチン酸が結合することを可能にするコンセンサス配列が、以下の配列:M−G−X1−X2−X3−S/C(配列中、X1、X2、およびX3は独立して任意の残基を示し、そしてM、SおよびCはそれぞれメチオニン、セリンおよびシステインを示す)を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項7に記載のキメラポリペプチド。
【請求項9】
配列中:
−X1がC、SおよびLから選択され;および/または
−X2がS、I、V、MおよびLから選択され;および/または
−X3がK、Q、H、F、CおよびSから選択される、
請求項8に記載のキメラポリペプチド。
【請求項10】
前記膜内標的ドメインが、複数の塩基性アミノ酸残基、特に残基K、RおよびHから選択される複数の残基、より好ましくは残基KおよびRから選択され、そしてより一層好ましくは残基Kを含んでなる、請求項1〜9のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項11】
前記膜内標的ドメインが:
・Srcファミリーのタンパク質、特にタンパク質Src、Yes、Lyn、Fyn、Lck、Blk、Fgr、HckおよびYrkから選択されるタンパク質に由来するか;または
・Srcファミリーのタンパク質、特にタンパク質Src、Yes、Lyn、Fyn、Lck、Blk、Fgr、HckおよびYrkから選択されるタンパク質の膜内標的ドメインの変異誘導体であって、前記膜内標的ドメインの配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている、前記変異誘導体
である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項12】
前記膜内標的ドメインが:
・以下の配列:M−G−x−x−K−S/C−K−x−KおよびM−G−x−x−K−S/C−K−x−K−x−x−x−x−R−R−R(配列中、xは任意の残基を示す)から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成るか;または
・この配列の変異誘導体であって、この配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体から成るか;または
・以下の配列:M−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−RまたはM−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−R−K−S−R−G−P−G−Gを含んでなるか、またはそれらから成るか;または
・前記配列M−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−RまたはM−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−R−K−S−R−G−P−G−Gの変異誘導体であって、この配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体から成る、請求項1〜11のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項13】
2つの連続したドメインを連結する少なくとも1つのリンカーであって、例えば、ペプチドまたはポリペプチドである前記リンカーをさらに含んでなる、請求項1〜12のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項14】
前記CDドメインまたはその変異誘導体が、配列KCLTSRLLKLLRQを欠損しているおよび/または配列PCPを欠損している、請求項1〜13のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項15】
前記CDドメインの前記変異誘導体の配列が、連鎖KCLTSRLLKLLRQを欠損している元のCDドメインの配列と、少なくとも60または70%、特に少なくとも80%、90%、95%の類似性または同一性を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項16】
前記CDドメインまたはその変異誘導体の配列が、以下の配列:
PxxPxxxxxxxxxxxxYxxL;
PxxPxxxxxxxxxxxDYxxL;
PxxPxxYxxxxxxxxxYxxL;
PxxPxxYxxxxxxxxDYxxL;
PxxPExYxxLxPxxPDYxxL;
PxxPxnYxxL;
PxxPxnDYxxL;
PxxPxnYxnYxxL;
PxxPxnYxnDYxxL;
PxxPExnYxxLxnPxxPDYxxL;
PxxPxxxxPxxPxxxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxL;
PxxPxnPxxPxnYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxL;
PxxPxxxxPxxPxxxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLxxxx;および
PxxPxnPxxPxnYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxLxxxx、
(配列中、xおよびxnはそれぞれ任意の残基および任意の1または2以上の残基を表わし、そして配列中、モチーフPxxPのうちの少なくとも1つがモチーフPSAPまたはPTAPである)から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成る、請求項1〜15のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項17】
前記ドメイン(iii)が、レトロウイルス、特にウシ白血病ウイルス(BLV)の膜貫通型タンパク質(TM)のCDドメイン、またはこのドメインの変異誘導体である、請求項1〜16のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項18】
前記CDドメインが、BLVのTMタンパク質のCDドメインであって、配列番号6の配列を有する、請求項1〜17のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項19】
前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、以下の:
・細胞質タンパク質の1もしくは2以上のドメイン、またはこの(これら)ドメインの1もしくは2以上の断片;および/または
・核タンパク質の1もしくは2以上のドメイン、またはこの(これら)ドメインの1もしくは2以上の断片
を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項20】
前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、病原体、病原性物質、抗腫瘍抗原、細胞質抗原、リガンド受容体、特に多数の膜ドメインを有する受容体、例えば、7回膜貫通型ドメインを持つ受容体、サイトカイン受容体またはその断片、毒素または毒素部分、特有の活性を有する化合物、例えば酵素、または例えば核酸に結合するポリペプチドに由来し、前記病原体が、例えば、ウイルス、細菌または寄生虫である、請求項1〜19のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項21】
薬剤として使用される、特に細菌、ウイルス寄生虫の感染、あるいは腫瘍またはその他の病状、例えば、機能的または代謝的な欠陥の予防および/または処置のために薬剤として使用される、請求項1〜20のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項22】
追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用されることを特徴とし、ここで前記追加のキメラポリペプチドは、適当な真核細胞中で発現されるときに、膜小胞、特にエキソソームと一緒になって分泌され得、かつ、前記追加のキメラポリペプチドが、以下のドメイン:
・目的のペプチドまたはポリペプチド;
・膜貫通型ドメイン;および
・膜タンパク質の細胞質ドメイン(CD)または前記CDドメインの変異誘導体、ここで前記CDドメインまたはその変異誘導体は、請求項1、4〜6、および14〜18のいずれか1項に記載のものである;
を含んでなるか、またはこれらから成り、ここで前記追加のキメラポリペプチドのCDドメインまたは変異誘導体が、請求項1〜22のいずれか1項に記載のキメラポリペプチドのCDドメインまたはCDドメインの変異誘導体と同一であるか、または異なることを特徴とする、請求項21に記載のキメラポリペプチド。
【請求項23】
追加のキメラポリペプチドにおいて、以下のドメインが、ポリペプチド内でN末端部からC末端部に向かって以下の順:目的のペプチドまたはポリペプチド−膜ドメイン−細胞質ドメイン(CD)または変異誘導体、で連続して配置されている、請求項21または22に記載のキメラポリペプチド。
【請求項24】
免疫付与における使用のための、特にインビボで、宿主、特に哺乳動物のヒト、ヒト以外の哺乳動物または鳥類で、目的のペプチドまたはポリペプチドが由来する腫瘍、ウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性応答および/または細胞応答を誘発または促進するためのキメラポリペプチドであって、適当であれば、請求項22または23に記載された追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用される、請求項1〜23のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項25】
請求項1〜24のいずれか1項に記載のキメラポリペプチドおよび/またはこのポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物、そして適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドおよび/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物を含んでなる膜小胞であって、この(これらの)分解産物は、適当であれば、主要組織適合遺伝子複合体I型またはII型の分子と結合する、前記膜小胞。
【請求項26】
エキソソームであることを特徴とする、請求項25に記載の膜小胞。
【請求項27】
追加のキメラポリペプチドの、目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいはこの目的のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも1つの断片が、前記膜小胞の外面に、部分的にまたは完全に曝露される、請求項25または26に記載の膜小胞。
【請求項28】
活性成分が、請求項25〜27のいずれか1項に記載の1もしくは2以上の膜小胞、ならびに適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドおよび/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物を含んでなる、1もしくは2以上の膜小胞、特に1もしくは2以上のエキソソームを含んでなる、治療用組成物。
【請求項29】
(例えば、酵素の追加によって)宿主の標的細胞の処理に使用される、および/または宿主(例えば、腫瘍細胞)中の標的細胞を破壊するために使用される、および/または(例えば、本発明のキメラポリペプチドの、目的のペプチドまたはポリペプチドに結合した核酸を検出することによって)宿主の診断を実施するために使用される、および/または、腫瘍に対する、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫感染に対する予防および/または処置のために使用される、特にインビボで、宿主中で、1または2以上の目的のペプチドまたはポリペプチドが由来する腫瘍、またはウイルス、細菌もしくは寄生虫に対する体液性応答および/または細胞性応答を誘発または促進するために使用される、請求項28に記載の治療用組成物。
【請求項30】
請求項1〜23のいずれか1項に記載のキメラポリペプチドをコードすることを特徴とする、ならびに適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項31】
以下の:
・請求項30に記載のポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成ることを特徴とする核酸、特にDNA;および
・薬学的に許容され得る支持体、希釈剤またはビヒクル;および
・適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成ることを特徴とする核酸、特にDNA
を含んでなる、治療用組成物。
【請求項32】
薬剤としての使用のための、特に細菌、ウイルス、寄生虫の感染、または腫瘍の予防および/または処置に使用される、特にインビボで、宿主、特にヒトまたはヒト以外の哺乳動物、あるいは鳥類で、ドメイン(i)が由来する腫瘍、あるいはウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性応答および/または細胞性応答を誘発または促進するために使用され、適当であれば、薬学的に許容され得る支持体、希釈剤もしくはビヒクルおよび請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成る核酸、特にDNAを含んでなる免疫原性組成物と組み合わせて使用される、請求項31に記載の治療用組成物。
【請求項33】
組換え型のエキソソーム産生細胞、特に免疫系の細胞、より具体的にはマスト細胞、リンパ球、特にTおよびBリンパ球、ならびに樹状細胞、特にランゲルハンス細胞から選択される免疫系の細胞であって:
・前記細胞が、請求項30に記載の1もしくは2以上のポリヌクレオチド、および適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードする1もしくは2以上のポリヌクレオチドと再結合されることを特徴とするか;あるいは
・前記細胞が、請求項25〜27のいずれか1項に記載の膜小胞、ならびに適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドおよび/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物を含んでなる1もしくは2以上の膜小胞、特に1もしくは2以上のエキソソームを吸収することを特徴とする、前記細胞。
【請求項34】
前記目的のペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドの断片、あるいは請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチド、および/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物と相互作用することができる特定のパートナーのインビトロでの検出のための、請求項27に記載の1もしくは2以上の膜小胞の使用。
【請求項35】
目的のペプチドまたはポリペプチドおよび/またはこの目的のペプチドまたはポリペプチドの分解産物を含んでなる、膜小胞、特にエキソソームのインビトロでの産生方法であって、適当であれば、この分解産物は主要組織適合遺伝子複合体の分子に結合され、以下のステップ:
a)請求項30に記載の1もしくは2以上のポリヌクレオチドであって、前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを、エキソソーム産生細胞、特に293T細胞、または免疫系の細胞、より具体的にはマスト細胞、リンパ球、特にTおよびBリンパ球、ならびに樹状細胞、特にランゲルハンス細胞から選択される免疫系の細胞へ導入し、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドおよび/またはこのポリペプチドの分解産物を含んでなる、請求項25〜27のいずれか1項に記載の1もしくは2以上の膜小胞とエキソソーム産生細胞とを接触させ;
b)前記エキソソーム産生細胞を培養し;
c)前記エキソソーム産生細胞によって産生される膜小胞、特にエキソソームを回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項36】
ステップa)とb)の間に中間ステップをさらに含んでなり、この間にエキソソームの分泌を誘発および/または増加するために、あるいは特定の細胞タンパク質、例えば、タンパク質ICAMに関してエキソソーム組成物で特異性を誘発するために、細胞が選択および/または刺激されることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
【請求項37】
膜小胞、特にエキソソームの表面で発現される目的の1もしくは2以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするポリクローナル血清を調製するための方法であって、以下のステップ:
a)請求項25〜27のいずれか1項に記載の膜小胞、請求項28、29または31のいずれか1項に記載の組成物、または請求項30に記載のポリヌクレオチドを、アジュバントと結合させてまたは結合させずに、ヒト以外の動物へ、適当であれば繰り返し投与し;そして
b)1または2以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができる、形成された抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項38】
膜小胞、特にエキソソーム内またはその表面に発現される1もしくは2以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を調製するための方法であって、以下のステップ:
a)請求項25〜27のいずれか1項に記載の膜小胞、請求項28、29または31のいずれか1項に記載の組成物、あるいは請求項30に記載のポリヌクレオチドを、適当であればアジュバントと組み合わせて投与された、および適当であれば繰り返し投与がなされた、(ヒトまたはヒト以外の)宿主、例えばBalb/cマウスから得られる脾臓細胞を、ミエローマ細胞と融合し;
b)抗体の産生が可能な条件下でハイブリドーマを培養および選択し;
c)1または2以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項39】
目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と相互作用する分子をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、以下のステップ:
a)請求項27に記載の膜小胞を、前記目的のペプチドまたはポリペプチドと相互作用することができる1もしくは2以上の分子と接触させ;
b)前記目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と、前記1または2以上の分子との間の任意の相互作用を検出すること
を含んでなる、前記方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6A】
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【図6B】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31A】
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【図31B】
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【図32−1】
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【図32−2】
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【図33】
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【図34】
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【公表番号】特表2013−505713(P2013−505713A)
【公表日】平成25年2月21日(2013.2.21)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−530319(P2012−530319)
【出願日】平成22年9月23日(2010.9.23)
【国際出願番号】PCT/FR2010/052006
【国際公開番号】WO2011/036416
【国際公開日】平成23年3月31日(2011.3.31)
【出願人】(501089863)サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク(セエヌエールエス) (173)
【出願人】(510251453)ユニベルシテ モンペリエ 2 スイヤーンス エ テクニーク (3)
【Fターム(参考)】