エシェリキア・コリを用いたメナキノン−７の発酵的製造方法
【課題】エシェリキア・コリを用いてメナキノン−７の製造を可能にする方法を提供する。
【解決手段】バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキア・コリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン−７が発酵されるエシェリキア・コリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする方法によって解決される。
【解決手段】バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキア・コリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン−７が発酵されるエシェリキア・コリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする方法によって解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エシェリキア・コリを用いたメナキノン−７の発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メナキノン−７は、ビタミンＫファミリーに属する。ヒトの栄養でのメナキノンの主要な起源は、腸内生息性の細菌、例えばラクトバシラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）もしくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌である。生化学的には、メナキノンは、特定のグルタミン酸基をカルボキシル化してγ−カルボキシ−グルタミン酸（ＧＬＡ）とすることに関与している。３個のＧＬＡ基を有する有名なタンパク質は、オステオカルシンである。オステオカルシンは、骨芽細胞中で形成され、そして骨中の非コラーゲン性タンパク質の１５〜２０％を成している。ビタミンＫ欠乏は、カルボキシル化されていないオステオカルシンをもたらし、それは血漿中に至り、骨代謝の妨害についての重要な指標である。
【０００３】
論文により、ヒトにおけるメナキノン−７の補充的供給は、骨形成に良い影響を及ぼす一方で、動脈硬化症に対する予防的作用も有することが示されている。
【０００４】
１つの論文により、例えば、ビタミンＫ供給の減少は骨密度の低下と腰骨折の危険性の増加に関連することが示されている（Ｆｅｓｋａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６９：７４−７９）。
【０００５】
他の１つの論文において、メナキノン−７と一緒の栄養補給は、オステオカルシンのγ−カルボキシル化の向上をもたらすことが示されている（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，２００４，ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ ２２：５−１９）。
【０００６】
古典的には、メナキノン−７の製造のためには、当然のように、より高いメナキノン−７の含有率を有するバシラス・サチリス菌株が使用される。この菌株は、アジア地域において納豆の製造のために使用されるため、バシラス・サチリス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）もしくはバシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）（Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：１１６３−１１７０）という名称も有する。従って、メナキノン−７の製造手法は、バシラス・サチリス・ナットウを用いた大豆の発酵と、それに引き続く納豆からのメナキノン−７の単離である。ＥＰ１８０３８２０号Ｂ１は、代替的な製造手法として、メナキノン−７を産生するバシラス・サチリス菌株の工業的発酵を記載している。該菌株は、引き続き直接的に噴霧乾燥され、そしてメナキノン−７含有のバイオマスとして販売できる。
【０００７】
骨粗鬆症及び動脈硬化症に対する予防特性に基づき、ビタミンＫを有する食品がますます売り出されている。該添加剤は、例えばメナキノン−４について記載されるのと同様に、食品に添加できるか、又はメナキノン産生乳酸細菌が直接的に食品に含まれていてよい（ＥＰ１１５３５４８号Ｂ１及びＥＰ２０７６５８５号）。乳酸細菌、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（亜種はクレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）もしくはラクティス（ｌａｃｔｉｓ））又はロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ）は、主に、メナキノン−８及びメナキノン−９を産生する（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８２：１８９７−１９０３）。
【０００８】
それらの細菌は、一般に、種々のイソプレノイド鎖長を有するメナキノンを産生し、そしてこの代謝物によって部分的に分類学的にも区別することができる。バシラス・サチリスは、既に上述したように、主に、メナキノン−７を産生する。
【０００９】
バシラス・サチリスに対して、エシェリキア・コリでは、主に、メナキノン−８とメナキノン−９のメナキノンが見出される（ＣｏｌｌｉｎｓとＪｏｎｅｓ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４５：３１６−３５４）。メナキノン生合成に関与するタンパク質の遺伝子は、エシェリキア・コリでは全てが公知である。出発代謝物であるコリスミ酸（トリプトファン生合成の中間物質）及びイソプレニルピロリン酸（ＩＰＰ）（イソプレノイド生合成の中心的代謝物）から出発して、まず、中間物質である１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトール酸（ＤＨＮＡ）が形成される。それには、酵素のＭｅｎＦ（イソコリスミ酸シンターゼ）、ＭｅｎＤ（２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−１−カルボン酸シンターゼ）、ＭｅｎＣ（Ｏ−スクシニル安息香酸シンターゼ）、ＭｅｎＥ（Ｏ−スクシニル安息香酸ＣｏＡリガーゼ）及びＭｅｎＢ（ナフトエ酸ＣｏＡシンターゼ）が関与している。ｍｅｎＡによってコードされるＤＮＨＡ−プレニルトランスフェラーゼを介して、オクタプレニルピロリン酸単位はＤＨＮＡに移される。その際、ＣＯ2及びピロリン酸が遊離される。デメチルメナキノン（ＤＭＫ）が生ずる。最後の生合成工程で、ＤＭＫは、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性のメチルトランスフェラーゼＵｂｉＥによってメチル化され、それによりメナキノン−８が生ずる。オクタプレニルピロリン酸は、遺伝子ｉｄｉと、ｉｓｐＡと、ｉｓｐＢとによってコードされる３種の酵素を用いてＩＰＰから合成される。第一の合成工程において、ＩＰＰは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼＩｄｉによって異性体化され、引き続きそれは、ＩｓｐＡにより触媒される２段階の反応段階を介して伸長され、Ｃ１５単位となる。全てがオクタプレニルシンターゼＩｓｐＢによって触媒される、更なる４段階の反応段階において、Ｃ４０単位のオクタプレニルピロリン酸が合成される。
【００１０】
細菌のバシラス・サチリスにおいて、メナキノン生合成は同等に進行する。しかしながら、ヘプタプレニル単位をＤＨＮＡに移す主要酵素であるヘプタプレニルトランスフェラーゼは、遺伝的に同定されてもいなければ、生化学的に説明されてもいない。しかしながら、メナキノン−７の製造のための大容量の工業的方法のためには、メナキノン−７生合成遺伝子への遺伝的アクセスは、不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＥＰ１８０３８２０号Ｂ１
【特許文献２】ＥＰ１１５３５４８号Ｂ１
【特許文献３】ＥＰ２０７６５８５号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆｅｓｋａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６９：７４−７９
【非特許文献２】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，２００４，ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ ２２：５−１９
【非特許文献３】Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：１１６３−１１７０
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８２：１８９７−１９０３
【非特許文献５】ＣｏｌｌｉｎｓとＪｏｎｅｓ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４５：３１６−３５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、エシェリキア・コリを用いてメナキノン−７の製造を可能にする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題は、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキア・コリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン−７が発酵されるエシェリキア・コリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする方法によって解決される。
【００１５】
該エシェリキア・コリ菌株は、好ましくは名称が挙げられた３種の遺伝子の複数の機能的コピーを含む。好ましくは、前記菌株は、名称が挙げられた３種の遺伝子の１〜７００コピーを含む。特に好ましくは、前記菌株は、名称が挙げられた３種の遺伝子の１〜２０コピーを含む。それらの遺伝子は、１種以上のプラスミドに存在してよいが、それらは同様に染色体中に組み込まれていてよい。
【００１６】
従って、本発明は、同様に、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むプラスミドを包含する。かかる産生プラスミドは、メナキノン−７のエシェリキア・コリ中での工業的製造を可能にする。
【００１７】
前記の３種の遺伝子は、以下のように定義される：
前記のバシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子は、好ましくは、配列番号１並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＳサブユニットの機能を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号１並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。
【００１８】
前記のバシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子は、好ましくは、配列番号２並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＴサブユニットの機能を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号２並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。
【００１９】
その際、好ましくは、一方のタンパク質は、ヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＳサブユニットの機能を有するが、それは、配列番号２を有するｈｅｐＴ遺伝子によってコードされるＨｅｐＴタンパク質と一緒に、ヘプタプレニルシンターゼ活性を有するヘテロダイマーを形成する場合であり、前記活性は、配列番号１を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＳと配列番号２を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＴとからのヘテロダイマーの少なくとも１種のヘプタプレニルシンターゼ活性に相当する。
【００２０】
その際、好ましくは、一方のタンパク質は、ヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＴサブユニットの機能を有するが、それは、配列番号１を有するｈｅｐＳ遺伝子によってコードされるＨｅｐＳタンパク質と一緒に、ヘプタプレニルシンターゼ活性を有するヘテロダイマーを形成する場合であり、前記活性は、配列番号２を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＴと配列番号１を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＳとからのヘテロダイマーの少なくとも１種のヘプタプレニルシンターゼ活性に相当する。
【００２１】
バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号３並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号３並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。
【００２２】
エシェリキア・コリにおける本発明によるヘプタプレニルシンターゼ及びヘプタプレニルトランスフェラーゼの機能は、間接的に、生成物であるメナキノン−７を介して特徴付けることができる。それというのも、エシェリキア・コリの野生型菌株は、メナキノン−７を産生しないからである。検出法としては、実施例５に記載されるＨＰＬＣ法を使用することができる。
【００２３】
好ましくは、メナキノン−７の製造のためには、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを１個のプラスミド上でエシェリキア・コリにおいて発現させることが必要となる。
【００２４】
これらの遺伝子の発現は、好ましくは同種もしくは異種のプロモーターによって達成される。異種、という概念は、配列番号１と、配列番号２と、配列番号３によって特徴付けられる遺伝子に対するものである。相応の異種のプロモーターは、例えばエシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ遺伝子のプロモーター又はエシェリキア・コリ由来のｔｕｆＢ遺伝子のプロモーターである。更に、異種のｌａｃ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、λ−プロモーター、ａｒａ−プロモーターもしくはｔｅｔ−プロモーターは当業者に公知である。
【００２５】
好ましくは、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ遺伝子のプロモーターによって達成される。
【００２６】
従って、本発明によるプラスミドは、好ましくは、上述のプロモーターを含む。その際、該プロモーターは、該１つのプラスミド上で、それらが、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を調節するように存在する。
【００２７】
特に好ましくは、該プラスミドは、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子が、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡプロモーターの制御下に存在するオペロン構成を含む。かかる構築物を、図１に例示する。
【００２８】
しかしながら、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の発現のためのプロモーター領域として、これらの遺伝子の天然の（同種の）プロモーター領域を用いてもよい。
【００２９】
バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とが導入されたプラスミドとしては、エシェリキア・コリ内で染色体外で複製され、選択マーカーを含む、全ての使用可能なかつ遺伝子工学的に得られるＤＮＡ分子を使用してよい。ここで、例えばエシェリキア・コリ中での高い細胞内コピー数を有するプラスミド（例えばｐＵＣ系列のプラスミド、ｐＱＥ系列のプラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系列のプラスミド）、エシェリキア・コリ中での中程度のコピー数を有するプラスミド（例えばｐＢＲ系列のプラスミド、ｐＡＣＹＣ系列のプラスミド）又はエシェリキア・コリ中での低いコピー数を有するプラスミド（例えばｐＳＣ１０１もしくはｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）を使用することができる。
【００３０】
好ましくは、エシェリキア・コリ中での中程度のコピー数を有するプラスミド（例えばｐＢＲ系列のプラスミド、ｐＡＣＹＣ系列のプラスミド）が使用される。
【００３１】
特に好ましくは、ｐＡＣＹＣ系列のプラスミドが使用される。
【００３２】
メナキノン−７の産生のためには、本発明によるプラスミドは、エシェリキア・コリ菌株に導入される。
【００３３】
それは、例えば通常の形質転換法、例えばエレクトロポレーションもしくはＣａＣｌ2法などの形質転換法によって行われる。プラスミドを有するクローンは、引き続き抗生物質耐性によって選択される。当業者に公知の選択マーカーは、例えばクロラムフェニコールに対する耐性を取り持つクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンに対する耐性を取り持つネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、テトラサイクリンに対する耐性を取り持つテトラサイクリン排出遺伝子又はアンピシリンとカルベニシリンに対する耐性を取り持つβ−ラクタマーゼ遺伝子である。
【００３４】
本発明によるプラスミドの発現に代えて、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を、エシェリキア・コリ菌株の染色体中にも、既に存在するメナキノン生合成遺伝子に加えて又は該遺伝子の代わりに組み込んでよい。組み込み方法としては、好ましくは、当業者に公知の溶原性バクテリオファージを有する系、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みが用いられる。
【００３５】
従って、また、本発明は、１個の本発明によるプラスミド又は複数の、好ましくはそれぞれ１個ないし５個の、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の染色体コピーを含むエシェリキア・コリ菌株に関する。
【００３６】
本発明によるエシェリキア・コリ菌株を用いたメナキノン−７の産生は、発酵器中で自体公知の方法に従って行われる。
【００３７】
発酵器中でのエシェリキア・コリ菌株の培養は、連続培養として、回分培養として、もしくは好ましくは流加培養として行われる。
【００３８】
炭素源としては、好ましくは、糖、糖アルコールもしくは有機酸が用いられる。特に好ましくは、本発明による方法では、炭素源として、グルコース、ラクトース、サッカロースもしくはグリセリンが使用される。
【００３９】
炭素源の含有率が、発酵中に発酵器内で０．１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの範囲で保持されることが保証される形態で、炭素源を計量供給することが好ましい。特に、０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲が好ましい。
【００４０】
窒素源としては、本発明による方法では、好ましくはアンモニア、アンモニウム塩もしくはタンパク質加水分解物が使用される。ｐＨ調節のための矯正剤（Ｋｏｒｒｅｋｔｕｒｍｉｔｔｅｌ）としてアンモニアを使用する場合には、発酵の間に、規則的に、この窒素源を後計量供給する。
【００４１】
更なる培地添加剤としては、リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄といった元素の塩を添加してよく、微量に（すなわちμＭ濃度で）モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛、銅及びニッケルといった元素の塩を添加してよい。
【００４２】
更に、有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えばＬ−ロイシン、Ｄ／Ｌ−メチオニン）及びビタミン（ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２）を培地に添加してよい。
【００４３】
複合栄養源としては、例えば酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉もしくは麦芽エキスを使用してよい。
【００４４】
エシェリキア・コリのためのインキュベート温度は、好ましくは２８〜３７℃であり、特に３０〜３２℃のインキュベート温度が好ましい。
【００４５】
発酵培地のｐＨ値は、発酵の間に、好ましくは５．０〜８．５のｐＨ範囲にあり、特に７．０のｐＨ範囲が好ましい。
【００４６】
エシェリキア・コリ菌株のインキュベートは、好気的な、嫌気的なもしくは微好気的な培養条件下で、１６時間〜１５０時間の時間にわたり、かつその都度の菌株に最適な増殖温度の範囲で行われる。特に、４８時間〜９６時間の培養時間が好ましい。
【００４７】
発酵は、好ましくは、好気的なもしくは微好気的な増殖条件下で実施される。
【００４８】
培地からのメナキノン−７の分離は、当業者に公知の方法、例えば培地を遠心分離して細胞を分離し、引き続きバイオマスからメナキノン−７を抽出すること、クロマトグラフィーによる精製、生成物の濃縮、配合（Ｆｏｒｍｕｌｉｅｒｕｎｇ）もしくは錯化（Ｋｏｍｐｌｅｘｉｅｒｕｎｇ）などの方法に従って行うことができる。
【００４９】
本発明による方法で産生されるメナキノン−７の検出及び定量化は、例えばＨＰＬＣ法によって行われる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明によるオペロン構築物を図示するものである。
【図２】図２は、メナキノン−７の製造に適したプラスミドｐＫＧ８２を図示するものである。
【００５１】
以下の実施例を用いて、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００５２】
実施例１： プラスミドｐＫＧ８２の構築
ａ） ｈｅｐＳ遺伝子の増幅：
バシラス・サチリス（ＤＳＭ１０８８）由来のｈｅｐＳ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラス・サチリス菌株ＤＳＭ１０８８の染色体ＤＮＡが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＳ−ｆｏｒ（配列番号４）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＳ−ｒｅｖ（配列番号５）を使用した。ＰＣＲで得られる、７８３塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラム（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｓｓａｅｕｌｃｈｅｎ）を用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５３】
ｂ） ｈｅｐＴ遺伝子の増幅：
バシラス・サチリス（ＤＳＭ１０８８）由来のｈｅｐＴ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラス・サチリス菌株ＤＳＭ１０８８の染色体ＤＮＡが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＴ−ｆｏｒ（配列番号６）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＴ−ｒｅｖ（配列番号７）を使用した。ＰＣＲで得られる、１０７５塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５４】
ｃ） 推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅：
バシラス・サチリス（ＤＳＭ１０８８）由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラス・サチリス菌株ＤＳＭ１０８８の染色体ＤＮＡが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｐＨＰＴＧ−ｆｏｒ（配列番号８）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｐＨＰＴＧ−ｒｅｖ（配列番号９）を使用した。
【００５５】
ＰＣＲで得られる、９６６塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５６】
ｄ） エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡプロモーターの増幅：
エシェリキア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）由来のｇａｐＡプロモーターを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型として、エシェリキア・コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の染色体ＤＮＡを用いた。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｇａｐＡ−ｆｏｒ（配列番号１０）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｇａｐＡ−ｒｅｖ（配列番号１１）を使用した。ＰＣＲで得られる、３１９塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５７】
ｅ） 遺伝子ｈｅｐＳと、ｈｅｐＴと、推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の、ｇａｐＡプロモーターの制御下での、プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨへのクローニング：
前記のａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）からのＤＮＡ断片を、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（ロシュ、マンハイム）でのライゲーションバッチの前に、以下の制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ、マンハイム）によって切断した：
（Ｉ）： 前記のａ）からの断片を、ＳａｃＩ及びＡｐａＩで切断
（ＩＩ）： 前記のｂ）からの断片を、ＡｐａＩ及びＢｆｒＩで切断
（ＩＩＩ）： 前記のｃ）からの断片を、ＢｆｒＩ及びＢｇｌＩＩで切断
（ＩＶ）： 前記のｄ）からの断片を、ＢｇｌＩＩ及びＰａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルトアムマイン）で切断
クローニングベクターｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（ＤＳＭ１０１７２）を、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ（ロシュ、マンハイム）及びＰａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルトアムマイン）で切断し、引き続き精製を行った後に、前記の（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）からの切断された断片と、１つのライゲーションバッチでライゲーションした（図１を参照）。こうして得られたプラスミドを、サンガーによる配列決定によって、正確な同一性に基づき調査した。完成したメナキノン−７−産生プラスミドは、ｐＫＧ８２と呼称した（図２を参照）。
【００５８】
メナキノン−７の産生に使用したプラスミドｐＫＧ８２は、２００９年１１月２７日にＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、Ｄ−３８１４２ ブラウンシュヴァイク）でＤＳＭ２３１５９の番号でブタペスト条約に従って寄託した。
【００５９】
実施例２： メナキノン−７−産生菌株の製造
実施例１に記載されるプラスミドｐＫＧ８２を、ＣａＣｌ2法によってエシェリキア・コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の形質転換のために使用した。２０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを有するＬＢアガープレート上で選択した後に、該プラスミドを形質転換体から再単離し、制限エンドヌクレアーゼで切断し、そして調査した。この菌株を、Ｗ３１１０／ｐＫＧ８２と呼称し、それはメナキノン−７の産生に適している。
【００６０】
実施例３： 発酵のためのメナキノン−７−産生菌株の第一の前培養（一日培養（Ｔａｇｅｓｋｕｌｔｕｒ））
グルコースを有する２０ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌのグルコース；オートクレーブ済み）を、滅菌１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中でテトラサイクリン×ＨＣｌと混合した（テトラサイクリン×ＨＣｌの最終濃度：１５ｍｇ／Ｌ；テトラサイクリン×ＨＣｌのストック溶液：５０％のエタノール中で１０ｍｇ／ｍＬ 濾過滅菌済み）。
【００６１】
白金耳（Ｉｍｐｆｏｅｓｅ）を用いて、生産菌株の細胞を、前記アガープレートから、最大でも薄い混濁が確認できるまでだけ取り除いた。前培養は、８時間にわたり、３２℃で（菌株Ｗ３１１０及びＷ３１１０／ｐＫＧ８２）あるいは３０℃で（菌株ＤＳＭ１０８８）、かつ１５０ｒｐｍで培養した。
【００６２】
実施例４： 発酵のためのメナキノン−７−産生菌株の第二の前培養（一晩培養（Ｕｅｂｅｒｎａｃｈｔｋｕｌｔｕｒ））
第二の前培養（一晩培養）は、２Ｌの発酵器中で、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（メルズンゲン、ドイツ）社のＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）−Ｂ−ＤＣＵ機器を用いて行った。実施例３からの２０ｍＬのＬＢ前培養を、２５ｇ／Ｌのグルコース、０．０１５ｇ／Ｌのチアミン×ＨＣｌ、０．０１５ｇ／Ｌのテトラサイクリン×ＨＣｌ、３ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、０．６ｇ／ＬのＤ／Ｌ−メチオニン、３０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、Ｌｅｓｔｒｅｍ、Ｆｒａｎｋｒｅｉｃｈ）、０．０３ｇ／ＬのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＮａ2ＭＯ4×２Ｈ2Ｏ、２．５ｇ／ＬのＨ3ＢＯ3、０．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ、０．３ｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ3×２Ｈ2Ｏ及び１．７ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4から成る産生培地９８０ｍＬの接種のために用いた。培地成分は、滅菌的に２Ｌの発酵器中に装入した。１７時間の培養の間に、温度は、３２℃（菌株Ｗ３１１０及びＷ３１１０／ｐＫＧ８２）もしくは３０℃（菌株ＤＳＭ１０８８）に保持し、同様にｐＨ値は、７．０に矯正剤（２５％のアンモニア）によって一定に保持した。抑泡剤としては、Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ、ハンブルク）を、１：６の希釈で滅菌水中で使用した。培養を、無菌の圧縮空気を用いて５容量／容量／分で通気して、４００ｒｐｍの撹拌機回転数をもって撹拌した。５０％の値にまで酸素飽和を下げた後に、回転数は、発酵器の制御ユニットを介して、５０％の酸素飽和を得るために、１５００ｒｐｍの値にまで高めた。酸素飽和は、４００ｒｐｍで１００％の飽和に校正されたｐＯ2−プローブで測定した。発酵器中のグルコース含有率が約５ｇ／Ｌにまで低下したら、５６％（質量／容量）のグルコース溶液の供給を行った。グルコース供給は、６〜１２ｍＬ／ｈの流速で行った。その際、発酵器中のグルコース濃度は、０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌで一定に保持した。グルコース測定は、アナライザーＹＳＩ ７１００ ＭＢＳ（ＹＳＩ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ、オハイオ、ＵＳＡ）をもって行った。
【００６３】
実施例５： メナキノン−７の発酵的製造
メナキノン−７の製造は、前記発酵器中で、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（メルズンゲン、ドイツ）社のＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）−Ｂ−ＤＣＵ機器を用いて行った。主要発酵器に、一晩培養からの１００ｍＬの培養（実施例４を参照）を接種した。発酵条件は、実施例４からの前発酵器の条件に相応した。発酵時間は、９６時間であった。メナキノン−７の測定は、Ｓｕｖａｒｎａ他（２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８０，第１０巻，第２７８２頁〜第２７８７頁）に記載されるように行った。サンプル採取は、それぞれ２４時間後、４８時間後、７２時間後、そして９６時間後に行った。
【００６４】
該キノン類の分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ社（ベーブリンゲン、ドイツ）のＨＰＬＣ ＨＰ １２００で実施した。分離カラムとして、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（アシャッフェンブルク、ドイツ）のＬｕｎａ Ｃ１８（２） ＲＰ−ＨＰＬＣカラム ５μ（１００ｍｍ×４．６ｍｍ）を用いた。サンプルは、イソプロパノール−アセトニトリル（１：３［容量／容量］）を用いて、温度４０℃及び流速０．７ｍＬ／分で定組成溶離させた。キノン類は、ＵＶデテクターを用いて、２０７ｎｍ及び２８０ｎｍの波長で検出した。
【００６５】
第１表は、種々の菌株で得られたメナキノン−７の達成された含有率を示している。
【００６６】
第１表：
【表１】
【００６７】
ＢＴＭ＝生体乾燥重量
[1]＝菌株の顕著な発泡に基づき、空気流を、培養８時間後に１容量／容量／分に、かつ撹拌回転速度を、４００ｒｐｍに制限せねばならなかった。
【００６８】
[2]＝発酵を７２時間後に終えた。
【００６９】
[3]＝検出できず
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エシェリキア・コリを用いたメナキノン−７の発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メナキノン−７は、ビタミンＫファミリーに属する。ヒトの栄養でのメナキノンの主要な起源は、腸内生息性の細菌、例えばラクトバシラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）もしくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌である。生化学的には、メナキノンは、特定のグルタミン酸基をカルボキシル化してγ−カルボキシ−グルタミン酸（ＧＬＡ）とすることに関与している。３個のＧＬＡ基を有する有名なタンパク質は、オステオカルシンである。オステオカルシンは、骨芽細胞中で形成され、そして骨中の非コラーゲン性タンパク質の１５〜２０％を成している。ビタミンＫ欠乏は、カルボキシル化されていないオステオカルシンをもたらし、それは血漿中に至り、骨代謝の妨害についての重要な指標である。
【０００３】
論文により、ヒトにおけるメナキノン−７の補充的供給は、骨形成に良い影響を及ぼす一方で、動脈硬化症に対する予防的作用も有することが示されている。
【０００４】
１つの論文により、例えば、ビタミンＫ供給の減少は骨密度の低下と腰骨折の危険性の増加に関連することが示されている（Ｆｅｓｋａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６９：７４−７９）。
【０００５】
他の１つの論文において、メナキノン−７と一緒の栄養補給は、オステオカルシンのγ−カルボキシル化の向上をもたらすことが示されている（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，２００４，ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ ２２：５−１９）。
【０００６】
古典的には、メナキノン−７の製造のためには、当然のように、より高いメナキノン−７の含有率を有するバシラス・サチリス菌株が使用される。この菌株は、アジア地域において納豆の製造のために使用されるため、バシラス・サチリス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）もしくはバシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）（Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：１１６３−１１７０）という名称も有する。従って、メナキノン−７の製造手法は、バシラス・サチリス・ナットウを用いた大豆の発酵と、それに引き続く納豆からのメナキノン−７の単離である。ＥＰ１８０３８２０号Ｂ１は、代替的な製造手法として、メナキノン−７を産生するバシラス・サチリス菌株の工業的発酵を記載している。該菌株は、引き続き直接的に噴霧乾燥され、そしてメナキノン−７含有のバイオマスとして販売できる。
【０００７】
骨粗鬆症及び動脈硬化症に対する予防特性に基づき、ビタミンＫを有する食品がますます売り出されている。該添加剤は、例えばメナキノン−４について記載されるのと同様に、食品に添加できるか、又はメナキノン産生乳酸細菌が直接的に食品に含まれていてよい（ＥＰ１１５３５４８号Ｂ１及びＥＰ２０７６５８５号）。乳酸細菌、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（亜種はクレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）もしくはラクティス（ｌａｃｔｉｓ））又はロイコノストック・ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ）は、主に、メナキノン−８及びメナキノン−９を産生する（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８２：１８９７−１９０３）。
【０００８】
それらの細菌は、一般に、種々のイソプレノイド鎖長を有するメナキノンを産生し、そしてこの代謝物によって部分的に分類学的にも区別することができる。バシラス・サチリスは、既に上述したように、主に、メナキノン−７を産生する。
【０００９】
バシラス・サチリスに対して、エシェリキア・コリでは、主に、メナキノン−８とメナキノン−９のメナキノンが見出される（ＣｏｌｌｉｎｓとＪｏｎｅｓ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４５：３１６−３５４）。メナキノン生合成に関与するタンパク質の遺伝子は、エシェリキア・コリでは全てが公知である。出発代謝物であるコリスミ酸（トリプトファン生合成の中間物質）及びイソプレニルピロリン酸（ＩＰＰ）（イソプレノイド生合成の中心的代謝物）から出発して、まず、中間物質である１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトール酸（ＤＨＮＡ）が形成される。それには、酵素のＭｅｎＦ（イソコリスミ酸シンターゼ）、ＭｅｎＤ（２−スクシニル−６−ヒドロキシ−２，４−シクロヘキサジエン−１−カルボン酸シンターゼ）、ＭｅｎＣ（Ｏ−スクシニル安息香酸シンターゼ）、ＭｅｎＥ（Ｏ−スクシニル安息香酸ＣｏＡリガーゼ）及びＭｅｎＢ（ナフトエ酸ＣｏＡシンターゼ）が関与している。ｍｅｎＡによってコードされるＤＮＨＡ−プレニルトランスフェラーゼを介して、オクタプレニルピロリン酸単位はＤＨＮＡに移される。その際、ＣＯ2及びピロリン酸が遊離される。デメチルメナキノン（ＤＭＫ）が生ずる。最後の生合成工程で、ＤＭＫは、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性のメチルトランスフェラーゼＵｂｉＥによってメチル化され、それによりメナキノン−８が生ずる。オクタプレニルピロリン酸は、遺伝子ｉｄｉと、ｉｓｐＡと、ｉｓｐＢとによってコードされる３種の酵素を用いてＩＰＰから合成される。第一の合成工程において、ＩＰＰは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼＩｄｉによって異性体化され、引き続きそれは、ＩｓｐＡにより触媒される２段階の反応段階を介して伸長され、Ｃ１５単位となる。全てがオクタプレニルシンターゼＩｓｐＢによって触媒される、更なる４段階の反応段階において、Ｃ４０単位のオクタプレニルピロリン酸が合成される。
【００１０】
細菌のバシラス・サチリスにおいて、メナキノン生合成は同等に進行する。しかしながら、ヘプタプレニル単位をＤＨＮＡに移す主要酵素であるヘプタプレニルトランスフェラーゼは、遺伝的に同定されてもいなければ、生化学的に説明されてもいない。しかしながら、メナキノン−７の製造のための大容量の工業的方法のためには、メナキノン−７生合成遺伝子への遺伝的アクセスは、不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＥＰ１８０３８２０号Ｂ１
【特許文献２】ＥＰ１１５３５４８号Ｂ１
【特許文献３】ＥＰ２０７６５８５号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆｅｓｋａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６９：７４−７９
【非特許文献２】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，２００４，ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ ２２：５−１９
【非特許文献３】Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：１１６３−１１７０
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８２：１８９７−１９０３
【非特許文献５】ＣｏｌｌｉｎｓとＪｏｎｅｓ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４５：３１６−３５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、エシェリキア・コリを用いてメナキノン−７の製造を可能にする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題は、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキア・コリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン−７が発酵されるエシェリキア・コリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする方法によって解決される。
【００１５】
該エシェリキア・コリ菌株は、好ましくは名称が挙げられた３種の遺伝子の複数の機能的コピーを含む。好ましくは、前記菌株は、名称が挙げられた３種の遺伝子の１〜７００コピーを含む。特に好ましくは、前記菌株は、名称が挙げられた３種の遺伝子の１〜２０コピーを含む。それらの遺伝子は、１種以上のプラスミドに存在してよいが、それらは同様に染色体中に組み込まれていてよい。
【００１６】
従って、本発明は、同様に、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むプラスミドを包含する。かかる産生プラスミドは、メナキノン−７のエシェリキア・コリ中での工業的製造を可能にする。
【００１７】
前記の３種の遺伝子は、以下のように定義される：
前記のバシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子は、好ましくは、配列番号１並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＳサブユニットの機能を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号１並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。
【００１８】
前記のバシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子は、好ましくは、配列番号２並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＴサブユニットの機能を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号２並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。
【００１９】
その際、好ましくは、一方のタンパク質は、ヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＳサブユニットの機能を有するが、それは、配列番号２を有するｈｅｐＴ遺伝子によってコードされるＨｅｐＴタンパク質と一緒に、ヘプタプレニルシンターゼ活性を有するヘテロダイマーを形成する場合であり、前記活性は、配列番号１を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＳと配列番号２を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＴとからのヘテロダイマーの少なくとも１種のヘプタプレニルシンターゼ活性に相当する。
【００２０】
その際、好ましくは、一方のタンパク質は、ヘプタプレニルシンターゼ中のＨｅｐＴサブユニットの機能を有するが、それは、配列番号１を有するｈｅｐＳ遺伝子によってコードされるＨｅｐＳタンパク質と一緒に、ヘプタプレニルシンターゼ活性を有するヘテロダイマーを形成する場合であり、前記活性は、配列番号２を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＴと配列番号１を有する遺伝子によってコードされるＨｅｐＳとからのヘテロダイマーの少なくとも１種のヘプタプレニルシンターゼ活性に相当する。
【００２１】
バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号３並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号３並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。
【００２２】
エシェリキア・コリにおける本発明によるヘプタプレニルシンターゼ及びヘプタプレニルトランスフェラーゼの機能は、間接的に、生成物であるメナキノン−７を介して特徴付けることができる。それというのも、エシェリキア・コリの野生型菌株は、メナキノン−７を産生しないからである。検出法としては、実施例５に記載されるＨＰＬＣ法を使用することができる。
【００２３】
好ましくは、メナキノン−７の製造のためには、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを１個のプラスミド上でエシェリキア・コリにおいて発現させることが必要となる。
【００２４】
これらの遺伝子の発現は、好ましくは同種もしくは異種のプロモーターによって達成される。異種、という概念は、配列番号１と、配列番号２と、配列番号３によって特徴付けられる遺伝子に対するものである。相応の異種のプロモーターは、例えばエシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ遺伝子のプロモーター又はエシェリキア・コリ由来のｔｕｆＢ遺伝子のプロモーターである。更に、異種のｌａｃ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、λ−プロモーター、ａｒａ−プロモーターもしくはｔｅｔ−プロモーターは当業者に公知である。
【００２５】
好ましくは、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ遺伝子のプロモーターによって達成される。
【００２６】
従って、本発明によるプラスミドは、好ましくは、上述のプロモーターを含む。その際、該プロモーターは、該１つのプラスミド上で、それらが、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を調節するように存在する。
【００２７】
特に好ましくは、該プラスミドは、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子が、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡプロモーターの制御下に存在するオペロン構成を含む。かかる構築物を、図１に例示する。
【００２８】
しかしながら、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の発現のためのプロモーター領域として、これらの遺伝子の天然の（同種の）プロモーター領域を用いてもよい。
【００２９】
バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とが導入されたプラスミドとしては、エシェリキア・コリ内で染色体外で複製され、選択マーカーを含む、全ての使用可能なかつ遺伝子工学的に得られるＤＮＡ分子を使用してよい。ここで、例えばエシェリキア・コリ中での高い細胞内コピー数を有するプラスミド（例えばｐＵＣ系列のプラスミド、ｐＱＥ系列のプラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系列のプラスミド）、エシェリキア・コリ中での中程度のコピー数を有するプラスミド（例えばｐＢＲ系列のプラスミド、ｐＡＣＹＣ系列のプラスミド）又はエシェリキア・コリ中での低いコピー数を有するプラスミド（例えばｐＳＣ１０１もしくはｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）を使用することができる。
【００３０】
好ましくは、エシェリキア・コリ中での中程度のコピー数を有するプラスミド（例えばｐＢＲ系列のプラスミド、ｐＡＣＹＣ系列のプラスミド）が使用される。
【００３１】
特に好ましくは、ｐＡＣＹＣ系列のプラスミドが使用される。
【００３２】
メナキノン−７の産生のためには、本発明によるプラスミドは、エシェリキア・コリ菌株に導入される。
【００３３】
それは、例えば通常の形質転換法、例えばエレクトロポレーションもしくはＣａＣｌ2法などの形質転換法によって行われる。プラスミドを有するクローンは、引き続き抗生物質耐性によって選択される。当業者に公知の選択マーカーは、例えばクロラムフェニコールに対する耐性を取り持つクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンに対する耐性を取り持つネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、テトラサイクリンに対する耐性を取り持つテトラサイクリン排出遺伝子又はアンピシリンとカルベニシリンに対する耐性を取り持つβ−ラクタマーゼ遺伝子である。
【００３４】
本発明によるプラスミドの発現に代えて、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を、エシェリキア・コリ菌株の染色体中にも、既に存在するメナキノン生合成遺伝子に加えて又は該遺伝子の代わりに組み込んでよい。組み込み方法としては、好ましくは、当業者に公知の溶原性バクテリオファージを有する系、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みが用いられる。
【００３５】
従って、また、本発明は、１個の本発明によるプラスミド又は複数の、好ましくはそれぞれ１個ないし５個の、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の染色体コピーを含むエシェリキア・コリ菌株に関する。
【００３６】
本発明によるエシェリキア・コリ菌株を用いたメナキノン−７の産生は、発酵器中で自体公知の方法に従って行われる。
【００３７】
発酵器中でのエシェリキア・コリ菌株の培養は、連続培養として、回分培養として、もしくは好ましくは流加培養として行われる。
【００３８】
炭素源としては、好ましくは、糖、糖アルコールもしくは有機酸が用いられる。特に好ましくは、本発明による方法では、炭素源として、グルコース、ラクトース、サッカロースもしくはグリセリンが使用される。
【００３９】
炭素源の含有率が、発酵中に発酵器内で０．１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの範囲で保持されることが保証される形態で、炭素源を計量供給することが好ましい。特に、０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲が好ましい。
【００４０】
窒素源としては、本発明による方法では、好ましくはアンモニア、アンモニウム塩もしくはタンパク質加水分解物が使用される。ｐＨ調節のための矯正剤（Ｋｏｒｒｅｋｔｕｒｍｉｔｔｅｌ）としてアンモニアを使用する場合には、発酵の間に、規則的に、この窒素源を後計量供給する。
【００４１】
更なる培地添加剤としては、リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄といった元素の塩を添加してよく、微量に（すなわちμＭ濃度で）モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛、銅及びニッケルといった元素の塩を添加してよい。
【００４２】
更に、有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えばＬ−ロイシン、Ｄ／Ｌ−メチオニン）及びビタミン（ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２）を培地に添加してよい。
【００４３】
複合栄養源としては、例えば酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉もしくは麦芽エキスを使用してよい。
【００４４】
エシェリキア・コリのためのインキュベート温度は、好ましくは２８〜３７℃であり、特に３０〜３２℃のインキュベート温度が好ましい。
【００４５】
発酵培地のｐＨ値は、発酵の間に、好ましくは５．０〜８．５のｐＨ範囲にあり、特に７．０のｐＨ範囲が好ましい。
【００４６】
エシェリキア・コリ菌株のインキュベートは、好気的な、嫌気的なもしくは微好気的な培養条件下で、１６時間〜１５０時間の時間にわたり、かつその都度の菌株に最適な増殖温度の範囲で行われる。特に、４８時間〜９６時間の培養時間が好ましい。
【００４７】
発酵は、好ましくは、好気的なもしくは微好気的な増殖条件下で実施される。
【００４８】
培地からのメナキノン−７の分離は、当業者に公知の方法、例えば培地を遠心分離して細胞を分離し、引き続きバイオマスからメナキノン−７を抽出すること、クロマトグラフィーによる精製、生成物の濃縮、配合（Ｆｏｒｍｕｌｉｅｒｕｎｇ）もしくは錯化（Ｋｏｍｐｌｅｘｉｅｒｕｎｇ）などの方法に従って行うことができる。
【００４９】
本発明による方法で産生されるメナキノン−７の検出及び定量化は、例えばＨＰＬＣ法によって行われる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明によるオペロン構築物を図示するものである。
【図２】図２は、メナキノン−７の製造に適したプラスミドｐＫＧ８２を図示するものである。
【００５１】
以下の実施例を用いて、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００５２】
実施例１： プラスミドｐＫＧ８２の構築
ａ） ｈｅｐＳ遺伝子の増幅：
バシラス・サチリス（ＤＳＭ１０８８）由来のｈｅｐＳ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラス・サチリス菌株ＤＳＭ１０８８の染色体ＤＮＡが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＳ−ｆｏｒ（配列番号４）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＳ−ｒｅｖ（配列番号５）を使用した。ＰＣＲで得られる、７８３塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラム（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｓｓａｅｕｌｃｈｅｎ）を用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５３】
ｂ） ｈｅｐＴ遺伝子の増幅：
バシラス・サチリス（ＤＳＭ１０８８）由来のｈｅｐＴ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラス・サチリス菌株ＤＳＭ１０８８の染色体ＤＮＡが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＴ−ｆｏｒ（配列番号６）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｈｅｐＴ−ｒｅｖ（配列番号７）を使用した。ＰＣＲで得られる、１０７５塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５４】
ｃ） 推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅：
バシラス・サチリス（ＤＳＭ１０８８）由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラス・サチリス菌株ＤＳＭ１０８８の染色体ＤＮＡが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｐＨＰＴＧ−ｆｏｒ（配列番号８）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｐＨＰＴＧ−ｒｅｖ（配列番号９）を使用した。
【００５５】
ＰＣＲで得られる、９６６塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５６】
ｄ） エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡプロモーターの増幅：
エシェリキア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）由来のｇａｐＡプロモーターを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ、マンハイム）を使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型として、エシェリキア・コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の染色体ＤＮＡを用いた。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｇａｐＡ−ｆｏｒ（配列番号１０）及びＭ７−Ｏｐｅｒｏｎ−ｇａｐＡ−ｒｅｖ（配列番号１１）を使用した。ＰＣＲで得られる、３１９塩基対の長さを有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）のＤＮＡ吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５７】
ｅ） 遺伝子ｈｅｐＳと、ｈｅｐＴと、推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の、ｇａｐＡプロモーターの制御下での、プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨへのクローニング：
前記のａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）からのＤＮＡ断片を、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（ロシュ、マンハイム）でのライゲーションバッチの前に、以下の制限エンドヌクレアーゼ（ロシュ、マンハイム）によって切断した：
（Ｉ）： 前記のａ）からの断片を、ＳａｃＩ及びＡｐａＩで切断
（ＩＩ）： 前記のｂ）からの断片を、ＡｐａＩ及びＢｆｒＩで切断
（ＩＩＩ）： 前記のｃ）からの断片を、ＢｆｒＩ及びＢｇｌＩＩで切断
（ＩＶ）： 前記のｄ）からの断片を、ＢｇｌＩＩ及びＰａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルトアムマイン）で切断
クローニングベクターｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（ＤＳＭ１０１７２）を、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ（ロシュ、マンハイム）及びＰａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、フランクフルトアムマイン）で切断し、引き続き精製を行った後に、前記の（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）からの切断された断片と、１つのライゲーションバッチでライゲーションした（図１を参照）。こうして得られたプラスミドを、サンガーによる配列決定によって、正確な同一性に基づき調査した。完成したメナキノン−７−産生プラスミドは、ｐＫＧ８２と呼称した（図２を参照）。
【００５８】
メナキノン−７の産生に使用したプラスミドｐＫＧ８２は、２００９年１１月２７日にＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、Ｄ−３８１４２ ブラウンシュヴァイク）でＤＳＭ２３１５９の番号でブタペスト条約に従って寄託した。
【００５９】
実施例２： メナキノン−７−産生菌株の製造
実施例１に記載されるプラスミドｐＫＧ８２を、ＣａＣｌ2法によってエシェリキア・コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の形質転換のために使用した。２０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを有するＬＢアガープレート上で選択した後に、該プラスミドを形質転換体から再単離し、制限エンドヌクレアーゼで切断し、そして調査した。この菌株を、Ｗ３１１０／ｐＫＧ８２と呼称し、それはメナキノン−７の産生に適している。
【００６０】
実施例３： 発酵のためのメナキノン−７−産生菌株の第一の前培養（一日培養（Ｔａｇｅｓｋｕｌｔｕｒ））
グルコースを有する２０ｍＬのＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌのグルコース；オートクレーブ済み）を、滅菌１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中でテトラサイクリン×ＨＣｌと混合した（テトラサイクリン×ＨＣｌの最終濃度：１５ｍｇ／Ｌ；テトラサイクリン×ＨＣｌのストック溶液：５０％のエタノール中で１０ｍｇ／ｍＬ 濾過滅菌済み）。
【００６１】
白金耳（Ｉｍｐｆｏｅｓｅ）を用いて、生産菌株の細胞を、前記アガープレートから、最大でも薄い混濁が確認できるまでだけ取り除いた。前培養は、８時間にわたり、３２℃で（菌株Ｗ３１１０及びＷ３１１０／ｐＫＧ８２）あるいは３０℃で（菌株ＤＳＭ１０８８）、かつ１５０ｒｐｍで培養した。
【００６２】
実施例４： 発酵のためのメナキノン−７−産生菌株の第二の前培養（一晩培養（Ｕｅｂｅｒｎａｃｈｔｋｕｌｔｕｒ））
第二の前培養（一晩培養）は、２Ｌの発酵器中で、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（メルズンゲン、ドイツ）社のＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）−Ｂ−ＤＣＵ機器を用いて行った。実施例３からの２０ｍＬのＬＢ前培養を、２５ｇ／Ｌのグルコース、０．０１５ｇ／Ｌのチアミン×ＨＣｌ、０．０１５ｇ／Ｌのテトラサイクリン×ＨＣｌ、３ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．９ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、０．６ｇ／ＬのＤ／Ｌ−メチオニン、３０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、Ｌｅｓｔｒｅｍ、Ｆｒａｎｋｒｅｉｃｈ）、０．０３ｇ／ＬのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＮａ2ＭＯ4×２Ｈ2Ｏ、２．５ｇ／ＬのＨ3ＢＯ3、０．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ、０．３ｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ3×２Ｈ2Ｏ及び１．７ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4から成る産生培地９８０ｍＬの接種のために用いた。培地成分は、滅菌的に２Ｌの発酵器中に装入した。１７時間の培養の間に、温度は、３２℃（菌株Ｗ３１１０及びＷ３１１０／ｐＫＧ８２）もしくは３０℃（菌株ＤＳＭ１０８８）に保持し、同様にｐＨ値は、７．０に矯正剤（２５％のアンモニア）によって一定に保持した。抑泡剤としては、Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ、ハンブルク）を、１：６の希釈で滅菌水中で使用した。培養を、無菌の圧縮空気を用いて５容量／容量／分で通気して、４００ｒｐｍの撹拌機回転数をもって撹拌した。５０％の値にまで酸素飽和を下げた後に、回転数は、発酵器の制御ユニットを介して、５０％の酸素飽和を得るために、１５００ｒｐｍの値にまで高めた。酸素飽和は、４００ｒｐｍで１００％の飽和に校正されたｐＯ2−プローブで測定した。発酵器中のグルコース含有率が約５ｇ／Ｌにまで低下したら、５６％（質量／容量）のグルコース溶液の供給を行った。グルコース供給は、６〜１２ｍＬ／ｈの流速で行った。その際、発酵器中のグルコース濃度は、０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌで一定に保持した。グルコース測定は、アナライザーＹＳＩ ７１００ ＭＢＳ（ＹＳＩ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ、オハイオ、ＵＳＡ）をもって行った。
【００６３】
実施例５： メナキノン−７の発酵的製造
メナキノン−７の製造は、前記発酵器中で、Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（メルズンゲン、ドイツ）社のＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）−Ｂ−ＤＣＵ機器を用いて行った。主要発酵器に、一晩培養からの１００ｍＬの培養（実施例４を参照）を接種した。発酵条件は、実施例４からの前発酵器の条件に相応した。発酵時間は、９６時間であった。メナキノン−７の測定は、Ｓｕｖａｒｎａ他（２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８０，第１０巻，第２７８２頁〜第２７８７頁）に記載されるように行った。サンプル採取は、それぞれ２４時間後、４８時間後、７２時間後、そして９６時間後に行った。
【００６４】
該キノン類の分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ社（ベーブリンゲン、ドイツ）のＨＰＬＣ ＨＰ １２００で実施した。分離カラムとして、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（アシャッフェンブルク、ドイツ）のＬｕｎａ Ｃ１８（２） ＲＰ−ＨＰＬＣカラム ５μ（１００ｍｍ×４．６ｍｍ）を用いた。サンプルは、イソプロパノール−アセトニトリル（１：３［容量／容量］）を用いて、温度４０℃及び流速０．７ｍＬ／分で定組成溶離させた。キノン類は、ＵＶデテクターを用いて、２０７ｎｍ及び２８０ｎｍの波長で検出した。
【００６５】
第１表は、種々の菌株で得られたメナキノン−７の達成された含有率を示している。
【００６６】
第１表：
【表１】
【００６７】
ＢＴＭ＝生体乾燥重量
[1]＝菌株の顕著な発泡に基づき、空気流を、培養８時間後に１容量／容量／分に、かつ撹拌回転速度を、４００ｒｐｍに制限せねばならなかった。
【００６８】
[2]＝発酵を７２時間後に終えた。
【００６９】
[3]＝検出できず
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メナキノン−７の製造方法において、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキア・コリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン−７が発酵されるエシェリキア・コリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする、メナキノン−７の製造方法。
【請求項２】
メナキノン−７をエシェリキア・コリを用いて工業的に製造するためのメナキノン−７−産生プラスミドであって、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むことを特徴とする、メナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項３】
同種もしくは異種のプロモーターを含むことを特徴とする、請求項２に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項４】
異種のプロモーターが、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ遺伝子のプロモーター又はエシェリキア・コリ由来のｔｕｆＢ遺伝子のプロモーター又はｌａｃ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、λ−プロモーター、ａｒａ−プロモーターもしくはｔｅｔ−プロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項５】
バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とが、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ−プロモーターの制御下に存在するオペロン構築物を含むことを特徴とする、請求項２から４までのいずれか１項に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項６】
プラスミドとして、エシェリキア・コリ内で染色体外で複製でき、かつ選択マーカーを含むＤＮＡ分子が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項７】
エシェリキア・コリ内で高い細胞内コピー数を有するプラスミド又はエシェリキア・コリ内で中程度のコピー数を有するプラスミド又はエシェリキア・コリ内で低いコピー数を有するプラスミドが使用されることを特徴とする、請求項６に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項８】
請求項２から７までのいずれか１項に記載のプラスミドを含むか、又はバシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の複数の染色体コピーを含む、エシェリキア・コリ菌株。
【請求項９】
発酵の後に、発酵培地を遠心分離して細胞を分離し、引き続きメナキノン−７を細胞から抽出することによりメナキノン−７を分離し、メナキノン−７をクロマトグラフィーにより精製し、濃縮、配合もしくは錯化を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
メナキノン−７の製造方法において、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキア・コリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン−７が発酵されるエシェリキア・コリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする、メナキノン−７の製造方法。
【請求項２】
メナキノン−７をエシェリキア・コリを用いて工業的に製造するためのメナキノン−７−産生プラスミドであって、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むことを特徴とする、メナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項３】
同種もしくは異種のプロモーターを含むことを特徴とする、請求項２に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項４】
異種のプロモーターが、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ遺伝子のプロモーター又はエシェリキア・コリ由来のｔｕｆＢ遺伝子のプロモーター又はｌａｃ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、λ−プロモーター、ａｒａ−プロモーターもしくはｔｅｔ−プロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項５】
バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とが、エシェリキア・コリ由来のｇａｐＡ−プロモーターの制御下に存在するオペロン構築物を含むことを特徴とする、請求項２から４までのいずれか１項に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項６】
プラスミドとして、エシェリキア・コリ内で染色体外で複製でき、かつ選択マーカーを含むＤＮＡ分子が使用されることを特徴とする、請求項２から５までのいずれか１項に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項７】
エシェリキア・コリ内で高い細胞内コピー数を有するプラスミド又はエシェリキア・コリ内で中程度のコピー数を有するプラスミド又はエシェリキア・コリ内で低いコピー数を有するプラスミドが使用されることを特徴とする、請求項６に記載のメナキノン−７−産生プラスミド。
【請求項８】
請求項２から７までのいずれか１項に記載のプラスミドを含むか、又はバシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＳ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来のｈｅｐＴ遺伝子と、バシラス・サチリスＤＳＭ１０８８由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の複数の染色体コピーを含む、エシェリキア・コリ菌株。
【請求項９】
発酵の後に、発酵培地を遠心分離して細胞を分離し、引き続きメナキノン−７を細胞から抽出することによりメナキノン−７を分離し、メナキノン−７をクロマトグラフィーにより精製し、濃縮、配合もしくは錯化を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１６０８０３（Ｐ２０１１−１６０８０３Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２８３２４（Ｐ２０１１−２８３２４）
【出願日】平成２３年２月１４日（２０１１．２．１４）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１４日（２０１１．２．１４）
【出願人】（３９０００８９６９）ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト (417)
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ−Ｓｅｉｄｅｌ−Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ−８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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