説明

エタノールの製造方法

【課題】酵母を用いて、生産性高くエタノールを製造する方法を提供すること。
【解決手段】ストレス応答転写因子をコードする遺伝子が破壊されてなる酵母の遺伝子破壊株を用いた、エタノールの製造方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エタノールの製造方法に関する。さらに詳しくは、高発酵性酵母を用いた、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等を含むエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
酒類や燃料用のバイオエタノールに含まれているエタノールは、一般に、ブドウ糖などの糖類をサッカロミセス属に属する酵母により発酵させて製造する。
【0003】
したがって、エタノール発酵中の酵母細胞は、高濃度のエタノールにさらされることになる。酵母細胞は、エタノール等の環境ストレスに速やかに応答して遺伝子発現を変化させ、酵母細胞の生命を維持するための分子機構を備えている。このシステムの中心的役割を果たすのが、ストレス応答転写因子Msn2p及びMsn4pである。
【0004】
Msn2p及びMsn4pは互いに相同性を有するジンク・フィンガー型転写因子であり、いずれも熱ショック、酸化ストレス、浸透圧ストレス、エタノールストレス等の様々な環境ストレス下において、細胞質から核内に移行し、様々な遺伝子のプロモーター領域に結合し、下流の遺伝子の転写を活性化するものである。Msn2p及びMsn4pによって発現調節を受ける遺伝子は、炭素代謝関連、タンパク質の保護・分解関連、細胞防御反応関連、細胞内シグナル伝達関連等多岐にわたっており、Msn2p及びMsn4pは、これらの遺伝子の発現を総合的に変化させることによって、環境ストレスに対する耐性に寄与すると考えられている。したがって、これらのストレス応答転写因子の機能が異常になると、ストレス条件下での生命維持に影響が現れ、例えば、非特許文献1では、MSN2/MSN4遺伝子二重破壊株は、様々なストレス条件下での生存率が低下することが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Martinez-Pastor MT, Marchler G, Schuller C, Marchler-Bauer A, Ruis H, Estruch F., EMBO J., 15(9), 2227-35 (1996).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
酵母を用いたエタノール生産において、エタノール生産速度を上げることは、エタノール発酵の生産性を高めるために極めて重要であるが、酵母のストレス応答転写因子に変異を導入することにより改変し、高発酵性を獲得した例は知られていない。
【0007】
本発明の課題は、酵母を用いて、生産性高くエタノールを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、従来の知見から、酵母によるエタノール発酵には正常なストレス応答機構が機能することが必要であると考え、そのことを証明するために、実験室酵母又は清酒酵母のストレス応答転写因子の遺伝子を破壊した形質転換酵母を用いて清酒製造試験又はエタノール製造試験を行い、遺伝子破壊がエタノール発酵に与える影響を解析した。その結果、意外にも、ストレス応答転写因子の遺伝子を破壊した形質転換酵母はいずれも、高い発酵性を示すことが判明した。そこで、本発明者らは、この現象は酵母のエタノール発酵性を改善させるために利用可能であると考え、ストレス応答転写因子の遺伝子の破壊とエタノール発酵についてさらに詳細な研究を行うことにより、本発明を完成するに至った。
【0009】
即ち、本発明の要旨は、
ストレス応答転写因子をコードする遺伝子が破壊されてなる酵母の遺伝子破壊株を用いた、エタノールの製造方法、に関する。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、酵母のエタノール発酵において、速いエタノール生産速度でエタノールを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図1は、親株である実験室酵母X2180−1A、及び遺伝子破壊株(MSN2、MSN4、MSN2/MSN4)を用いて清酒製造を行った際の二酸化炭素発生量を示す図である。白丸印が親株、黒丸印がMSN2遺伝子破壊株、黒三角印がMSN4遺伝子破壊株、黒四角印がMSN2/4遺伝子破壊株のデータを示す。
【図2】図2は、親株である清酒酵母きょうかい7号、及びMSN2遺伝子破壊株を用いて2種類の条件でエタノール製造を行った際の二酸化炭素発生量を示す図である。左が廃糖蜜培地、右がYPD培地での結果を示す。いずれも、白丸印が親株、黒丸印がMSN2遺伝子破壊株のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明のエタノールの製造方法は、酵母を用いてエタノールを製造するものであって、ストレス応答転写因子(例えばMsn2p及びMsn4p)をコードする遺伝子のうち少なくとも1種が破壊されている酵母の遺伝子破壊株を用いることに、一つの特徴を有する。
【0013】
ストレス応答転写因子をコードする遺伝子としては、MSN2及びMSN4が挙げられる。これらの遺伝子は、SGD(Saccharomyces Genome Database)のホームページ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces)に配列が記載されており、かかる配列に基づいて、PCRプライマーを設計して遺伝子破壊や部位特異的変異を行うことができる。例えば、MSN2を破壊するために用いるDNAのプライマーとしては、MSN2−DF(配列表の配列番号1)、MSN4−DR(配列表の配列番号2)、MSN4を破壊するために用いるDNAのプライマーとしては、MSN4−DF(配列表の配列番号3)、MSN4−DR(配列表の配列番号4)等が例示される。
【0014】
本発明における酵母とは、サッカロミセス属に属するエタノール発酵に用いることのできる酵母であって、例えば、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母、パン酵母、及びバイオエタノール酵母が挙げられる。これらの酵母は一種類を単独で用いてもよく、複数種の酵母を用いてもよい。実験室酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属するX2180−1A株が好ましい。清酒酵母としては、サッカロミセス・セレビシエに属するきょうかい7号株が好ましい。
【0015】
本明細書において、「破壊」とは、破壊される遺伝子の機能を喪失させたり、失活させたりするような遺伝子操作のことをいい、目的遺伝子領域の全遺伝子を喪失させる遺伝子操作や正常な機能に必要な部位を欠失又は変異させる遺伝子操作のことをいう。具体的には、ストレス応答転写因子をコードするMSN2又はMSN4遺伝子を全喪失させる遺伝子操作が例示される。かかる遺伝子操作を行う方法としては、特に限定はなく公知の方法を用いることができ、例えば、変異剤処理による突然変異、遺伝子工学を用いた遺伝子破壊、遺伝子工学を用いた部位特異的変異などが挙げられる。これらの遺伝子破壊株の作成方法については、Saccharomyces Genome Deletion Projectのホームページ(http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html)を参考にすることができる。なお、本発明においては、自然突然変異により破壊が生じた遺伝子破壊株も用いることができる。
【0016】
なお、上記遺伝子操作を行う際には、アミノ酸などの栄養要求マーカーや、薬剤に対する耐性マーカーなどを選択マーカーとして使用してもよい。
【0017】
ストレス応答転写因子の遺伝子破壊株の代表株については、X2180−1A msn2、X2180−1A msn4、X2180−1A msn2/4、及びK7 msn2と命名、表示され、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、それぞれ、NITE P−813、NITE P−814、NITE P−815、及びNITE P−816として寄託されている。
【0018】
本発明は、上記で得られた酵母の遺伝子破壊株を用いてエタノールを製造するが、酵母が特定のものである以外は、公知の方法を用いて、エタノールを製造することができる。
【0019】
本発明の製造方法は、例えば、清酒、ビール、ワイン等の酒類やバイオエタノール等の製造に適用することができるが、好ましくは、清酒又はバイオエタノールの製造に適用することができる。
【実施例】
【0020】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら制限されるものではない。
【0021】
実施例1
サッカロミセス・セレビシエX2180−1A株のMSN2遺伝子及びMSN4遺伝子のいずれか1種又は両者を破壊した株を作成し、清酒製造試験を行った。なお、X2180−1A株は、American Type Culture Collection(ATCC)から、ATCC26786として入手可能である。
【0022】
〔遺伝子破壊株の作成〕
X2180−1A株の遺伝子破壊は、マーカー遺伝子としてnat1及びkanMXを用いて行った。まず、nat1を含むプラスミドpAG25(EUROSCARFから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html)を鋳型として、プライマーMSN2−DF(配列表の配列番号1)及びMSN2−DR(配列表の配列番号2)を用いてPCRを行い、マーカーであるnat1の両側に、MSN2のORFに隣接する上流部分及び下流部分のDNA配列を持つDNAを作成した。このDNAを用いてX2180−1A株を形質転換して、ノーセオスリシン含有培地で増殖した酵母を、形質転換体1とした。形質転換体1からゲノムDNAを抽出し、プライマーMSN2−F(配列表の配列番号5)及びMSN2−R(配列表の配列番号6)を用いてPCRを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、MSN2が遺伝子破壊されていることを確認し、これをX2180−1A株のMSN2遺伝子破壊株(X2180−1A msn2)とした。
【0023】
次に、kanMXを含むプラスミドpUG6(EUROSCARFから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html)を鋳型として、プライマーMSN4−DF(配列表の配列番号3)及びMSN4−DR(配列表の配列番号4)を用いてPCRを行い、マーカーであるkanMXの両側に、MSN4のORFに隣接する上流部分及び下流部分のDNA配列を持つDNAを作成した。このDNAを用いてX2180−1A株及びMSN2遺伝子破壊株を形質転換して、ジェネティシン含有培地で増殖した酵母を、それぞれ形質転換体2及び3とした。形質転換体2及び3からゲノムDNAを抽出し、プライマーMSN4−F(配列表の配列番号7)及びMSN4−R(配列表の配列番号8)を用いてPCRを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、MSN4が遺伝子破壊されていることを確認し、これらをそれぞれ、X2180−1A株のMSN4遺伝子破壊株(X2180−1A msn4)及びMSN2/MSN4遺伝子二重破壊株(X2180−1A msn2/4)とした。
【0024】
〔清酒の製造〕
親株であるX2180−1Aと、上記で得られたMSN2遺伝子破壊株、MSN4遺伝子破壊株、及びMSN2/MSN4遺伝子二重破壊株を用いて、以下に示す方法で清酒を製造した。
【0025】
掛米80g、麹米20g、水160mL、90%乳酸40μL混合による一段仕込を実施した。掛米として精米歩合70%のアルファー化米、麹米として精白歩合70%の乾燥麹を用いた。各酵母は、YPD培地(酵母エキス1%、ペプトン2%、ブドウ糖2%含有)において一晩振とう培養した後、酵母数が2×107cells/mLになるように仕込時に添加した。発酵温度は15℃とした。仕込試験は各株について3回ずつ繰り返した。仕込後、毎日重量を測定することにより、重量減少分から発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図1に示す。また、仕込後20日目には、遠心分離によって回収した清酒におけるエタノール濃度を測定し、各株について平均エタノール濃度を算出した。また、得られた平均エタノール濃度について、親株における濃度に対する遺伝子破壊株における濃度の有意差検定も同時に行った。なお、エタノール濃度の測定は、アルコール濃度計(理研計器社製アルコメイトAL−3)を用いて行った。
【0026】
いずれの遺伝子破壊株も、親株に比べて二酸化炭素発生量が多く(図1)、エタノール発酵速度が速いこと、また、最終的なエタノール濃度も、親株が15.4±0.2%であるのに対し、MSN2遺伝子破壊株が16.0±0.1%、MSN4遺伝子破壊株が15.7±0.1%、MSN2/MSN4遺伝子二重破壊株が16.0±0.2%と高く、エタノール生産性に優れることが分かった。エタノール濃度について平均値の差の検定を行った結果、いずれの遺伝子破壊株も親株と比較して5%未満の危険率で有意であった。
【0027】
実施例2
サッカロミセス・セレビシエ二倍体清酒酵母きょうかい7号株の2個のMSN2遺伝子を両者共に破壊した株を作成し、清酒製造試験を行った。なお、きょうかい7号株は、財団法人日本醸造協会より入手可能である。
【0028】
〔遺伝子破壊株の作成〕
きょうかい7号株の遺伝子破壊は、マーカー遺伝子としてnat1及びkanMXを用いて行った。きょうかい7号株は二倍体であることから、まず、1コピー目のMSN2遺伝子をnat1をマーカーとして遺伝子破壊した。nat1を含むプラスミドpAG25(EUROSCARFから入手可能http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html)を鋳型として、プライマーMSN2−DF(配列表の配列番号1)及びMSN2−DR(配列表の配列番号2)を用いてPCRを行い、マーカーであるnat1の両側に、MSN2のORFに隣接する上流部分及び下流部分のDNA配列を持つDNAを作成した。このDNAを用いてきょうかい7号株を形質転換して、ノーセオスリシン含有培地で増殖した酵母を、形質転換体4とした。形質転換体4からゲノムDNAを抽出し、プライマーMSN2−F(配列表の配列番号5)及びMSN2−R(配列表の配列番号6)を用いてPCRを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、1コピー目のMSN2が遺伝子破壊されていることを確認した。
【0029】
次に、2コピー目のMSN2をkanMXをマーカーとして遺伝子破壊した。kanMXを含むプラスミドpUG6(EUROSCARFから入手可能、http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html)を鋳型として、プライマーMSN2−DF(配列表の配列番号1)及びMSN2−DR(配列表の配列番号2)を用いてPCRを行い、マーカーであるkanMXの両側に、MSN2のORFに隣接する上流部分及び下流部分のDNA配列を持つDNAを作成した。このDNAを用いて、上記で得られた形質転換体4を形質転換して、ジェネティシン含有培地で増殖した酵母を形質転換体5とした。形質転換体5からゲノムDNAを抽出し、プライマーMSN2−F(配列表の配列番号5)及びMSN2−R(配列表の配列番号6)を用いてPCRを行い、得られた産物のサイズを測定することによって、2コピー分のMSN2が遺伝子破壊されていることを確認し、これを、きょうかい7号株のMSN2遺伝子破壊株(K7 msn2)とした。
【0030】
〔エタノールの製造〕
親株であるきょうかい7号株と、上記で得られたMSN2遺伝子破壊株を用いて、以下に示す方法でエタノールを製造した。
【0031】
廃糖蜜培地(ケーンモラセス原液を蒸留水にてBrix25%に調整後、0.025%硫酸アンモニウムを添加したもの)及び高濃度ブドウ糖含有YPD培地(酵母エキス1%、ペプトン2%、ブドウ糖20%含有)を用いたエタノール発酵試験を実施した。各酵母は、YPD培地(酵母エキス1%、ペプトン2%、ブドウ糖2%含有)において一晩振とう培養した後、酵母数が2×106cells/mLになるように両培地に添加し、72時間静置培養した。発酵温度は30℃とした。発酵試験は各株について3回以上繰り返した。培養開始後、発酵モニター装置(アトー株式会社製ファーモグラフII)を用いて発酵に伴う二酸化炭素発生量を求め、各株について平均二酸化炭素発生量を算出した。結果を図2に示す。
【0032】
MSN2遺伝子破壊株は、廃糖蜜培地及びYPD培地のいずれの条件においても、親株に比べて二酸化炭素発生量が多く(図2)、エタノール発酵速度が速く、エタノール生産性に優れることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0033】
本発明の製造方法は、清酒、ビール、ワイン、焼酎等の酒類や、バイオエタノール等を含むエタノールの製造に好適に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【0034】
配列表の配列番号1は、MSN2破壊用DNA作成用プライマーである。
配列表の配列番号2は、MSN2破壊用DNA作成用プライマーである。
配列表の配列番号3は、MSN4破壊用DNA作成用プライマーである。
配列表の配列番号4は、MSN4破壊用DNA作成用プライマーである。
配列表の配列番号5は、MSN2増幅用プライマーである。
配列表の配列番号6は、MSN2増幅用プライマーである。
配列表の配列番号7は、MSN4増幅用プライマーである。
配列表の配列番号8は、MSN4増幅用プライマーである。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
ストレス応答転写因子をコードする遺伝子が破壊されてなる酵母の遺伝子破壊株を用いた、エタノールの製造方法。
【請求項2】
ストレス応答転写因子がMsn2p及び/又はMsn4pである、請求項1記載の製造方法。
【請求項3】
酵母が、実験室酵母、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、焼酎酵母、パン酵母及びバイオエタノール酵母からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1又は2に記載の製造方法。
【請求項4】
実験室酵母がX2180−1A株である、請求項3に記載の製造方法。
【請求項5】
清酒酵母がきょうかい7号株である、請求項3に記載の製造方法。
【請求項6】
エタノールが清酒又はバイオエタノールである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。

【図1】
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【図2】
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【公開番号】特開2011−120486(P2011−120486A)
【公開日】平成23年6月23日(2011.6.23)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−278555(P2009−278555)
【出願日】平成21年12月8日(2009.12.8)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り 〔発行者〕 酵母遺伝学フォーラム 〔刊行物名〕 Yeast Genetics and Molecular Biology News JAPAN No.42 〔発行日〕 平成21年6月30日 〔刊行物等〕 〔発行者〕 社団法人日本生物工学会 〔刊行物名〕 第61回 日本生物工学会大会 講演要旨集 〔発行日〕 2009年8月25日
【出願人】(301025634)独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【Fターム(参考)】