エタノール測定方法及びエタノール測定用キット
【課題】簡易、迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性があるエタノール測定技術を提供することを目的とする。
【解決手段】エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン、フェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させるエタノール測定方法及び上述したエタノール測定方法をより簡易、迅速に実施するためのエタノール測定キットにより解決する。
【解決手段】エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン、フェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させるエタノール測定方法及び上述したエタノール測定方法をより簡易、迅速に実施するためのエタノール測定キットにより解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低濃度のエタノールを測定するためのエタノール測定方法及びエタノール測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノールの分析は、従来からガスクロマトグラフィー（ＧＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析機器が使用されている。しかしながら、ＧＣは、測定成分をガス化する過程でブレが生じやすいため、低濃度のエタノールを分析する場合は、定量性がなく安定性に欠ける。また、ＨＰＬＣは溶媒を用いるため、低濃度のエタノールがさらに希釈されることになり、やはり定量性がなく安定性に欠ける。
【０００３】
そこで、低濃度アルコール類の定量について、種々の提案がなされている。例えば、特開２００９−１２８１６０号公報には、シクロオレフィンポリマーなどの飽和含水率２質量％以下のマトリックスポリマー中に、ローダミンＢベースなどのアルコールの存在または非存在に応じて可逆的結合変化し、アルコール存在下で発色および／または発光する色素が分散している薄膜からなるアルコールセンサにより、感度でアルコールを測定することができると記載されている（特許文献１）。
【０００４】
特開２００２−２７７３９２号公報には、入射光を波長１８０〜２２０ｎｍ付近で反射光と透過光に分離する波長特性をもち、反射光と透過光のうち波長２００ｎｍを含む光を測定光として選択するように配置され、測定用光路を形成するミラーを備えた微量イソプロピルアルコール測定装置が、そのミラーの波長特性と試料水中の水の吸収とから、微量ＩＰＡの濃度測定に必要な波長域の光を選択的かつ効率良く利用することができると記載されている（特許文献２）。
【０００５】
また、特開平９−１５１８５号公報には、１０〜４０μｍのＦｅ−Ｐｄ合金線に、Ｐｔブラック−Ａｌ2 Ｏ3 又はＰｄＯ−Ａｌ2 Ｏ3 或いはＰｔ・ブラックＰｄＯ−Ａｌ2 Ｏ3 の触媒を電着してなり、メチルアルコール用には１４０〜１６０℃を、また、エチルアルコール用には１５０〜２００℃を設定温度とする接触燃焼式低濃度用アルコールセンサが開示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１２８１６０号公報
【特許文献２】特開２００２−２７７３９２号公報
【特許文献３】特開平９−１５１８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで低濃度のエタノール分析は、分析装置の検出感度を向上させる方向に注力されている傾向にあるが、分析装置を用いてエタノールを分析する場合、サンプル数が多くなればなるほど時間も手間もかかり、例えば土壌からエタノール発酵性酵母をスクリーニングする場合などはサンプル数が膨大な数になるため、作業効率が極めて悪い。また、例えば飲酒運転の検問など屋外でアルコール濃度を測定する場合はその場で結果が判定することができなければならないため、分析装置を用いることはできない。
【０００８】
このような事情から、より簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定する方法の開発が望まれていた。
【０００９】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであり、簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性があるエタノール測定技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アルコールオキシダーゼの作用でエタノールから過酸化水素を生成させ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用でキノン系色素を生成させ、これを比色定量するエタノールの測定方法が、簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性に優れているとの知見を得た。
【００１１】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させる、エタノール測定方法を提供するものである。
【００１２】
本発明はまた、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液からなるＡ液及びリン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液からなるＢ液を備えた、エタノール測定用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るエタノール測定方法及びエタノール測定用キットによれば、酵素反応を利用してエタノールを比色定量することができるため、試料中のエタノール濃度が０．００１重量％程度の、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーでは測定困難なほど低濃度の場合でも、正確にエタノールの定性分析及び定量分析を実施することが可能となる。また、大掛かりな装置を必要とせず、エタノール含有試料を添加してから数秒で結果が判明するため、簡易かつ迅速を必要とする検査においても極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態に係るエタノール測定方法の測定原理を説明するための図である。
【図２】吸光度とエタノール濃度との相関性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態に係るエタノール測定方法について説明する。図１は本実施形態に係るエタノール測定方法の測定原理を説明するための図である。エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下で酵素反応させると、過酸化水素と酢酸が生成する。次いで、該過酸化水素、４−アミノアンチピリン、フェノールをペルオキシダーゼの存在下で酵素反応させると、赤色キノン色素が発色する。この発色した赤色キノン色素を比色定量することにより、エタノールを定性的、定量的に測定することができる。
【００１６】
本実施形態のエタノール測定方法を実施する際は、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液（以下、「Ａ液」という）と、リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液（以下、「Ｂ液」という）を調製し、Ａ液とＢ液を混合した溶液にエタノール含有試料を添加して比色定量を行うことができる。
【００１７】
本実施形態において、アルコールオキシダーゼはエタノールを酵素的に分解して過酸化水素を発生させるために使用されるものである。アルコールオキシダーゼは、約９．０Ｕ／ｍｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
【００１８】
本実施形態において、ペルオキシダーゼは過酸化水素を水素受容体として種々の基質の酸化反応を触媒する酵素として使用されるものである。ペルオキシダーゼは、例えば、西洋ワサビ、牛乳、酵母、白血球、赤血球などから得られるものがあるが、西洋ワサビ由来のものが好ましい。ペルオキシダーゼは、約０．０５Ｕ／ｍｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
【００１９】
本実施形態において、４−アミノアンチピリンはフェノールとともに発色試薬として使用されるものである。ペルオキシダーゼは、約０．０５Ｕ／Ｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
【００２０】
Ａ液は、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを上記の範囲で水等に溶解して調製することができる。
【００２１】
本実施形態において、リン酸緩衝液はｐＨ５．５〜８．０、約７０ｍｍｏｌになるように調製することが好ましい。
【００２２】
本実施形態において、フェノールは４−アミノアンチピリンとともに発色試薬として使用されるものである。フェノールは、約５．３ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製することが好ましい。
【００２３】
Ｂ液は、上記リン酸緩衝液中でフェノールが約５．３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することで調製することができる。
【００２４】
上述したＡ液及びＢ液は、エタノールを測定する際に混合され、その混合液にエタノール含有試料を添加する。Ａ液とＢ液の割合はエタノール含有試料中に含まれるエタノール濃度や発色の度合いに応じて適宜設定されるものであるが、例えば重量比で１：５〜５：１の範囲で変更することができる。なお、Ａ液にエタノール含有試料を添加した後にＢ液と混合してもよく、Ｂ液にエタノール含有試料を添加した後にＡ液と混合してもよい。さらに、エタノール含有試料にＡ液とＢ液の混合液を添加してもよく、エタノール含有試料にＡ液を添加した後にＢ液を添加しても、エタノール含有試料にＢ液を添加した後にＡ液を添加してもよい。
【００２５】
エタノール含有試料の添加量はエタノール含有試料中に含まれるエタノール濃度や発色の度合いに応じて適宜設定されるものであるが、例えば、０．０１〜１０００μｌ程度でよい。そして、エタノール含有試料に、酸素、水及びアルコールオキシダーゼが反応して過酸化水素と酢酸が発生し、次いで、該過酸化水素と４−アミノアンチピリン、フェノール及びペルオキシダーゼが反応し、赤色キノン色素が発色する。
【００２６】
なお、エタノール含有試料が赤色又は赤色に近い色を有している場合は、エタノール含有試料を希釈するか、ブランクを準備し、酵素反応前後の発色の差を求めることにより、比色定量が可能である。
【００２７】
本実施形態において「エタノール含有試料」とは、エタノールを測定する気体、液体又は固体のサンプルを意味し、本実施形態のエタノール測定方法の測定対象となるものである。エタノール含有試料は測定対象によりその形態が異なるため特に制限はないが、例えば、アルコール発酵液、唾液、糖液、食品、化粧品などを挙げることができる。
【００２８】
実施形態に係るエタノール測定方法の検出限界は０．００１％（w/w）であり、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーの検出限界である５％（w/w）を大幅に上回るものである。
【００２９】
定性分析を行う場合は、赤色キノン色素の発色の有無を肉眼で観察すればよい。赤色キノン色素の発色が認められた場合は、試料中にエタノールが存在していることを示し、赤色キノン色素の発色が認められない場合は、試料中にエタノールが存在しないことを示す。
【００３０】
定量分析を行う場合は、赤色キノン色素を発色した溶液の吸光度を吸光度計等で測定し、予め作成した検量線と対比することで、エタノール含有量を定量することができる。また、赤色キノン色素を発色した溶液の発色の程度を予め作成した比色表と対比することで、エタノール含有量を定量することもできる。
【００３１】
本実施形態のエタノール測定方法はアルコールオキシダーゼの作用でエタノールから過酸化水素を生成させる工程と、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用でキノン系色素を生成させる工程を有するが、酵素は基質特異性を有しているため、酵素反応の各工程は同一の系で反応を行っても測定結果に影響を及ぼすことはない。もちろん、各工程を別々の系で実施することもできる。
【００３２】
但し、本実施形態のエタノール測定方法は検出感度が高いため、空気中に存在するエタノールがＡ液又はＢ液に溶解して酵素反応を引き起こし、赤色キノン色素を発色する場合がある。そのため、本実施形態のエタノール測定方法は揮発したアルコールが存在しない雰囲気中で実施することが好ましい。
【００３３】
揮発したアルコールが存在する雰囲気中で本実施形態のエタノール測定方法を実施する場合は、前記Ａ液及び／又はＢ液に、さらに界面活性剤を添加することが好ましい。Ａ液及び／又はＢ液に界面活性剤を添加することで、空気中に存在するエタノールが反応系に溶解するのを防止することができるため、より正確にエタノールを測定することが可能となる。
【００３４】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類であることが好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類はソルビタン脂肪酸エステルにポリオキシエチレンを付加したもので、ポリオキシエチレンの付加モル数、ソルビタン脂肪酸エステルの構成脂肪酸種及びエステル化度の組み合わせにより様々な性質を設定することが可能である。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類の具体例としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商標）、Ｔｗｅｅｎ４０（商標）、Ｔｗｅｅｎ６０（商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）等が挙げられる。
【００３５】
界面活性剤の添加量は、Ａ液に添加する場合は、Ａ液に対して０．０００１〜０．１重量％であることが好ましく、Ｂ液に添加する場合は、Ｂ液に対して０．００１〜０．１重量％であることが好ましい。
【００３６】
本発明はまた、上述したエタノール測定方法をより簡易かつ迅速に実施するためのエタノール測定キットを提供するものである。
【００３７】
本実施形態のエタノール測定用キットは、下記のＡ液及びＢ液を備えている。
（Ａ液）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液
（Ｂ液）リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液
【００３８】
Ａ液及びＢ液の組成及び添加量等については先述したエタノール測定方法において使用されるＡ液及びＢ液と同様である。
【００３９】
本実施形態のエタノール測定用キットは、Ａ液及び／又はＢ液に、さらに界面活性剤を含有していることが好ましい。Ａ液及び／又はＢ液に界面活性剤を含有することで、空気中に存在するエタノールが反応系に溶解するのを防止することができるため、より正確にエタノールを測定することが可能となる。界面活性剤の具体例等については先述したエタノール測定方法において使用される界面活性剤と同様である。
【００４０】
本実施形態のエタノール測定用キットは、エタノール濃度に応じて色分けされた比色表を備えていることが好ましい。比色表を用いれば、吸光光度計を使用できない状況下（例えば屋外など）でもエタノール含有量を定量することができる。
【実施例】
【００４１】
１．供試試薬
以下の組成からなるＡ液及びＢ液を調製した。なお、調製後は５℃で保存した。
【００４２】
（１）Ａ液の調製
酵素力価１０００Ｕ/ｍｌのアルコールオキシダーゼ（Pichea pastoris由来、SIGUMA社製）９００μl、酵素力価５０，０００Ｕ/gのペルオキシダーゼ（わさび由来、オリエンタル酵母社製）１ｍｇ、４−アミノアンチピリン１ｍｇを１Ｌ容メスフラスコに入れ、蒸留水で１Ｌになるように定容することにより、Ａ液を調製した。
【００４３】
（２）Ｂ液の調製
リン酸二水素ナトリウム（二水和物）（Sodium Dihydrogen Phosphate, NaH2PO4・2H2O, M.W 156.01（国産化学株式会社製））１０．９５ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸二水素ナトリウム溶液を調製した。また、リン酸水素二ナトリウム（１２水和物）（di- sodium Hydorogen Phosphate, Na2HPO4・12H2O, M.W 358.14（国産化学株式会社製））２５．０ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸水素二ナトリウム溶液を調製した。そして、リン酸二水素ナトリウム溶液：リン酸水素二ナトリウム溶液を４：６の割合で混合しｐＨを７．１に調整し、７０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）を得た。
【００４４】
次に、破砕結晶フェノール（Ground Crystals、和光純薬社製）０．５ｇ（５．３ｍｍｏｌ／Ｌ相当）を上記７０ｍｍｏｌリン酸緩衝液に溶解し、１Ｌ容メスフラスコに定容することにより、Ｂ液を調製した。
【００４５】
さらに、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）をＢ液１００ｍｌに対して０．２ｍｌの割合で添加した。
【００４６】
２．エタノールの測定
使用前にＡ液５００μＬとＢ液５００μＬをエッペンドルフチューブに入れて混合した。その際、空気中に揮発しているエタノールの混入に留意した。これに、エタノール含有試料としてエタノール溶液を調製したものをサンプルとして約２０μl採取し、Ａ液とＢ液の混合液が入ったエッペンドルフチューブに添加した。そして、数秒後、発色したサンプルの吸光度（５１５ｎｍ）を吸光度計（日本分光社製）で測定し、相関関数を算出した。結果を図２に示す。
【００４７】
図２は、吸光度とエタノール濃度の標準曲線を示したものである。図２に示すように、エタノール濃度と吸光度（５１５ｎｍ）はｙ＝０．９０１４ｘ＋０．０１３２の直線性があり、吸光度とエタノール濃度は高い相関性を示すことが判明した。
【００４８】
また、界面活性剤の一種であるＴｗｅｅｎ８０（商標）を添加することで、空中に飛散しているエタノールの吸着による発色が起きなくなることも確認した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低濃度のエタノールを測定するためのエタノール測定方法及びエタノール測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノールの分析は、従来からガスクロマトグラフィー（ＧＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析機器が使用されている。しかしながら、ＧＣは、測定成分をガス化する過程でブレが生じやすいため、低濃度のエタノールを分析する場合は、定量性がなく安定性に欠ける。また、ＨＰＬＣは溶媒を用いるため、低濃度のエタノールがさらに希釈されることになり、やはり定量性がなく安定性に欠ける。
【０００３】
そこで、低濃度アルコール類の定量について、種々の提案がなされている。例えば、特開２００９−１２８１６０号公報には、シクロオレフィンポリマーなどの飽和含水率２質量％以下のマトリックスポリマー中に、ローダミンＢベースなどのアルコールの存在または非存在に応じて可逆的結合変化し、アルコール存在下で発色および／または発光する色素が分散している薄膜からなるアルコールセンサにより、感度でアルコールを測定することができると記載されている（特許文献１）。
【０００４】
特開２００２−２７７３９２号公報には、入射光を波長１８０〜２２０ｎｍ付近で反射光と透過光に分離する波長特性をもち、反射光と透過光のうち波長２００ｎｍを含む光を測定光として選択するように配置され、測定用光路を形成するミラーを備えた微量イソプロピルアルコール測定装置が、そのミラーの波長特性と試料水中の水の吸収とから、微量ＩＰＡの濃度測定に必要な波長域の光を選択的かつ効率良く利用することができると記載されている（特許文献２）。
【０００５】
また、特開平９−１５１８５号公報には、１０〜４０μｍのＦｅ−Ｐｄ合金線に、Ｐｔブラック−Ａｌ2 Ｏ3 又はＰｄＯ−Ａｌ2 Ｏ3 或いはＰｔ・ブラックＰｄＯ−Ａｌ2 Ｏ3 の触媒を電着してなり、メチルアルコール用には１４０〜１６０℃を、また、エチルアルコール用には１５０〜２００℃を設定温度とする接触燃焼式低濃度用アルコールセンサが開示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１２８１６０号公報
【特許文献２】特開２００２−２７７３９２号公報
【特許文献３】特開平９−１５１８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで低濃度のエタノール分析は、分析装置の検出感度を向上させる方向に注力されている傾向にあるが、分析装置を用いてエタノールを分析する場合、サンプル数が多くなればなるほど時間も手間もかかり、例えば土壌からエタノール発酵性酵母をスクリーニングする場合などはサンプル数が膨大な数になるため、作業効率が極めて悪い。また、例えば飲酒運転の検問など屋外でアルコール濃度を測定する場合はその場で結果が判定することができなければならないため、分析装置を用いることはできない。
【０００８】
このような事情から、より簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定する方法の開発が望まれていた。
【０００９】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであり、簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性があるエタノール測定技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アルコールオキシダーゼの作用でエタノールから過酸化水素を生成させ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用でキノン系色素を生成させ、これを比色定量するエタノールの測定方法が、簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性に優れているとの知見を得た。
【００１１】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させる、エタノール測定方法を提供するものである。
【００１２】
本発明はまた、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液からなるＡ液及びリン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液からなるＢ液を備えた、エタノール測定用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るエタノール測定方法及びエタノール測定用キットによれば、酵素反応を利用してエタノールを比色定量することができるため、試料中のエタノール濃度が０．００１重量％程度の、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーでは測定困難なほど低濃度の場合でも、正確にエタノールの定性分析及び定量分析を実施することが可能となる。また、大掛かりな装置を必要とせず、エタノール含有試料を添加してから数秒で結果が判明するため、簡易かつ迅速を必要とする検査においても極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態に係るエタノール測定方法の測定原理を説明するための図である。
【図２】吸光度とエタノール濃度との相関性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態に係るエタノール測定方法について説明する。図１は本実施形態に係るエタノール測定方法の測定原理を説明するための図である。エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下で酵素反応させると、過酸化水素と酢酸が生成する。次いで、該過酸化水素、４−アミノアンチピリン、フェノールをペルオキシダーゼの存在下で酵素反応させると、赤色キノン色素が発色する。この発色した赤色キノン色素を比色定量することにより、エタノールを定性的、定量的に測定することができる。
【００１６】
本実施形態のエタノール測定方法を実施する際は、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液（以下、「Ａ液」という）と、リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液（以下、「Ｂ液」という）を調製し、Ａ液とＢ液を混合した溶液にエタノール含有試料を添加して比色定量を行うことができる。
【００１７】
本実施形態において、アルコールオキシダーゼはエタノールを酵素的に分解して過酸化水素を発生させるために使用されるものである。アルコールオキシダーゼは、約９．０Ｕ／ｍｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
【００１８】
本実施形態において、ペルオキシダーゼは過酸化水素を水素受容体として種々の基質の酸化反応を触媒する酵素として使用されるものである。ペルオキシダーゼは、例えば、西洋ワサビ、牛乳、酵母、白血球、赤血球などから得られるものがあるが、西洋ワサビ由来のものが好ましい。ペルオキシダーゼは、約０．０５Ｕ／ｍｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
【００１９】
本実施形態において、４−アミノアンチピリンはフェノールとともに発色試薬として使用されるものである。ペルオキシダーゼは、約０．０５Ｕ／Ｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
【００２０】
Ａ液は、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを上記の範囲で水等に溶解して調製することができる。
【００２１】
本実施形態において、リン酸緩衝液はｐＨ５．５〜８．０、約７０ｍｍｏｌになるように調製することが好ましい。
【００２２】
本実施形態において、フェノールは４−アミノアンチピリンとともに発色試薬として使用されるものである。フェノールは、約５．３ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製することが好ましい。
【００２３】
Ｂ液は、上記リン酸緩衝液中でフェノールが約５．３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することで調製することができる。
【００２４】
上述したＡ液及びＢ液は、エタノールを測定する際に混合され、その混合液にエタノール含有試料を添加する。Ａ液とＢ液の割合はエタノール含有試料中に含まれるエタノール濃度や発色の度合いに応じて適宜設定されるものであるが、例えば重量比で１：５〜５：１の範囲で変更することができる。なお、Ａ液にエタノール含有試料を添加した後にＢ液と混合してもよく、Ｂ液にエタノール含有試料を添加した後にＡ液と混合してもよい。さらに、エタノール含有試料にＡ液とＢ液の混合液を添加してもよく、エタノール含有試料にＡ液を添加した後にＢ液を添加しても、エタノール含有試料にＢ液を添加した後にＡ液を添加してもよい。
【００２５】
エタノール含有試料の添加量はエタノール含有試料中に含まれるエタノール濃度や発色の度合いに応じて適宜設定されるものであるが、例えば、０．０１〜１０００μｌ程度でよい。そして、エタノール含有試料に、酸素、水及びアルコールオキシダーゼが反応して過酸化水素と酢酸が発生し、次いで、該過酸化水素と４−アミノアンチピリン、フェノール及びペルオキシダーゼが反応し、赤色キノン色素が発色する。
【００２６】
なお、エタノール含有試料が赤色又は赤色に近い色を有している場合は、エタノール含有試料を希釈するか、ブランクを準備し、酵素反応前後の発色の差を求めることにより、比色定量が可能である。
【００２７】
本実施形態において「エタノール含有試料」とは、エタノールを測定する気体、液体又は固体のサンプルを意味し、本実施形態のエタノール測定方法の測定対象となるものである。エタノール含有試料は測定対象によりその形態が異なるため特に制限はないが、例えば、アルコール発酵液、唾液、糖液、食品、化粧品などを挙げることができる。
【００２８】
実施形態に係るエタノール測定方法の検出限界は０．００１％（w/w）であり、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーの検出限界である５％（w/w）を大幅に上回るものである。
【００２９】
定性分析を行う場合は、赤色キノン色素の発色の有無を肉眼で観察すればよい。赤色キノン色素の発色が認められた場合は、試料中にエタノールが存在していることを示し、赤色キノン色素の発色が認められない場合は、試料中にエタノールが存在しないことを示す。
【００３０】
定量分析を行う場合は、赤色キノン色素を発色した溶液の吸光度を吸光度計等で測定し、予め作成した検量線と対比することで、エタノール含有量を定量することができる。また、赤色キノン色素を発色した溶液の発色の程度を予め作成した比色表と対比することで、エタノール含有量を定量することもできる。
【００３１】
本実施形態のエタノール測定方法はアルコールオキシダーゼの作用でエタノールから過酸化水素を生成させる工程と、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用でキノン系色素を生成させる工程を有するが、酵素は基質特異性を有しているため、酵素反応の各工程は同一の系で反応を行っても測定結果に影響を及ぼすことはない。もちろん、各工程を別々の系で実施することもできる。
【００３２】
但し、本実施形態のエタノール測定方法は検出感度が高いため、空気中に存在するエタノールがＡ液又はＢ液に溶解して酵素反応を引き起こし、赤色キノン色素を発色する場合がある。そのため、本実施形態のエタノール測定方法は揮発したアルコールが存在しない雰囲気中で実施することが好ましい。
【００３３】
揮発したアルコールが存在する雰囲気中で本実施形態のエタノール測定方法を実施する場合は、前記Ａ液及び／又はＢ液に、さらに界面活性剤を添加することが好ましい。Ａ液及び／又はＢ液に界面活性剤を添加することで、空気中に存在するエタノールが反応系に溶解するのを防止することができるため、より正確にエタノールを測定することが可能となる。
【００３４】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類であることが好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類はソルビタン脂肪酸エステルにポリオキシエチレンを付加したもので、ポリオキシエチレンの付加モル数、ソルビタン脂肪酸エステルの構成脂肪酸種及びエステル化度の組み合わせにより様々な性質を設定することが可能である。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類の具体例としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商標）、Ｔｗｅｅｎ４０（商標）、Ｔｗｅｅｎ６０（商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）等が挙げられる。
【００３５】
界面活性剤の添加量は、Ａ液に添加する場合は、Ａ液に対して０．０００１〜０．１重量％であることが好ましく、Ｂ液に添加する場合は、Ｂ液に対して０．００１〜０．１重量％であることが好ましい。
【００３６】
本発明はまた、上述したエタノール測定方法をより簡易かつ迅速に実施するためのエタノール測定キットを提供するものである。
【００３７】
本実施形態のエタノール測定用キットは、下記のＡ液及びＢ液を備えている。
（Ａ液）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液
（Ｂ液）リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液
【００３８】
Ａ液及びＢ液の組成及び添加量等については先述したエタノール測定方法において使用されるＡ液及びＢ液と同様である。
【００３９】
本実施形態のエタノール測定用キットは、Ａ液及び／又はＢ液に、さらに界面活性剤を含有していることが好ましい。Ａ液及び／又はＢ液に界面活性剤を含有することで、空気中に存在するエタノールが反応系に溶解するのを防止することができるため、より正確にエタノールを測定することが可能となる。界面活性剤の具体例等については先述したエタノール測定方法において使用される界面活性剤と同様である。
【００４０】
本実施形態のエタノール測定用キットは、エタノール濃度に応じて色分けされた比色表を備えていることが好ましい。比色表を用いれば、吸光光度計を使用できない状況下（例えば屋外など）でもエタノール含有量を定量することができる。
【実施例】
【００４１】
１．供試試薬
以下の組成からなるＡ液及びＢ液を調製した。なお、調製後は５℃で保存した。
【００４２】
（１）Ａ液の調製
酵素力価１０００Ｕ/ｍｌのアルコールオキシダーゼ（Pichea pastoris由来、SIGUMA社製）９００μl、酵素力価５０，０００Ｕ/gのペルオキシダーゼ（わさび由来、オリエンタル酵母社製）１ｍｇ、４−アミノアンチピリン１ｍｇを１Ｌ容メスフラスコに入れ、蒸留水で１Ｌになるように定容することにより、Ａ液を調製した。
【００４３】
（２）Ｂ液の調製
リン酸二水素ナトリウム（二水和物）（Sodium Dihydrogen Phosphate, NaH2PO4・2H2O, M.W 156.01（国産化学株式会社製））１０．９５ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸二水素ナトリウム溶液を調製した。また、リン酸水素二ナトリウム（１２水和物）（di- sodium Hydorogen Phosphate, Na2HPO4・12H2O, M.W 358.14（国産化学株式会社製））２５．０ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸水素二ナトリウム溶液を調製した。そして、リン酸二水素ナトリウム溶液：リン酸水素二ナトリウム溶液を４：６の割合で混合しｐＨを７．１に調整し、７０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）を得た。
【００４４】
次に、破砕結晶フェノール（Ground Crystals、和光純薬社製）０．５ｇ（５．３ｍｍｏｌ／Ｌ相当）を上記７０ｍｍｏｌリン酸緩衝液に溶解し、１Ｌ容メスフラスコに定容することにより、Ｂ液を調製した。
【００４５】
さらに、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）をＢ液１００ｍｌに対して０．２ｍｌの割合で添加した。
【００４６】
２．エタノールの測定
使用前にＡ液５００μＬとＢ液５００μＬをエッペンドルフチューブに入れて混合した。その際、空気中に揮発しているエタノールの混入に留意した。これに、エタノール含有試料としてエタノール溶液を調製したものをサンプルとして約２０μl採取し、Ａ液とＢ液の混合液が入ったエッペンドルフチューブに添加した。そして、数秒後、発色したサンプルの吸光度（５１５ｎｍ）を吸光度計（日本分光社製）で測定し、相関関数を算出した。結果を図２に示す。
【００４７】
図２は、吸光度とエタノール濃度の標準曲線を示したものである。図２に示すように、エタノール濃度と吸光度（５１５ｎｍ）はｙ＝０．９０１４ｘ＋０．０１３２の直線性があり、吸光度とエタノール濃度は高い相関性を示すことが判明した。
【００４８】
また、界面活性剤の一種であるＴｗｅｅｎ８０（商標）を添加することで、空中に飛散しているエタノールの吸着による発色が起きなくなることも確認した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、
該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させる、
エタノール測定方法。
【請求項２】
前記エタノール含有試料を酵素反応させる前に、界面活性剤を添加する、請求項１に記載のエタノール測定方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である、請求項２に記載のエタノール測定方法。
【請求項４】
下記Ａ液及びＢ液を備えた、エタノール測定用キット。
（Ａ液）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液
（Ｂ液）リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液
【請求項５】
前記Ａ液及び／又は前記Ｂ液が、界面活性剤を含有する、請求項４に記載のエタノール測定用キット。
【請求項６】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である、請求項５に記載のエタノール測定用キット。
【請求項７】
さらに、エタノール濃度に応じて色分けされた比色表を備えた、請求項４〜６のいずれか１項に記載のエタノール測定用キット。
【請求項１】
エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、
該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させる、
エタノール測定方法。
【請求項２】
前記エタノール含有試料を酵素反応させる前に、界面活性剤を添加する、請求項１に記載のエタノール測定方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である、請求項２に記載のエタノール測定方法。
【請求項４】
下記Ａ液及びＢ液を備えた、エタノール測定用キット。
（Ａ液）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液
（Ｂ液）リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液
【請求項５】
前記Ａ液及び／又は前記Ｂ液が、界面活性剤を含有する、請求項４に記載のエタノール測定用キット。
【請求項６】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である、請求項５に記載のエタノール測定用キット。
【請求項７】
さらに、エタノール濃度に応じて色分けされた比色表を備えた、請求項４〜６のいずれか１項に記載のエタノール測定用キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１４２２２３（Ｐ２０１０−１４２２２３Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【公開請求】
【出願番号】特願２００９−２８３８０６（Ｐ２００９−２８３８０６）
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８３８０６（Ｐ２００９−２８３８０６）
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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