エマルジョン由来（ｅｍｕｌｓｉｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ）粒子
架橋剤によって架橋されたポリマー鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマー鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域とを有するエマルジョン由来粒子。格子上には官能基が配されており、タンパク質または修飾タンパク質はこれらと反応することで、格子に結合され、固定化される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエマルジョン由来粒子に関する。また、本発明は当該粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
固定化酵素を含んだ粒子が通常用いられるのは、バイオ触媒や診断などの用途である。しかしながら、出願人の知る粒子は、充分な酵素固定化を実現するには表面積が足りないという問題を抱えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】欧州特許第０ ５３４ ０５７号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／２９４０６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明が目的とするのは、この問題を少なくとも軽減できる粒子を提供すること、および、タンパク質に対する結合容量が大きくタンパク質を固定化できる粒子の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明の第１の様態として、架橋剤によって架橋されたポリマー鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマー鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有するエマルジョン由来粒子であって、タンパク質または修飾タンパク質と反応することで、当該タンパク質または修飾タンパク質を格子に結合させ、固定化する、というエマルジョン由来粒子を提供する。
【０００６】
「エマルジョン由来」とは、粒子がエマルジョン技術を用いて製造または形成されたことを意味し、当該エマルジョン技術としては、本発明の第２、第３の様態によるエマルジョンベース（emulsion based）の手法がある（ただし、これらに限定はされない）。
「修飾（modified）タンパク質」は、化学的手段（例えばジアルデヒドの追加）によって修飾されたタンパク質、あるいは、遺伝子レベルで（例えばｈｉｓタグを用いて）修飾されたタンパク質を意味する。
【０００７】
従って、本発明の粒子は、鎖状（strand）あるいは繊維状（fiber）のポリマーに、または架橋剤に官能基を含み、タンパク質または修飾タンパク質を官能基と反応させることができる。より具体的には、官能基は、鎖状あるいは繊維状のポリマーに存在しており、タンパク質または修飾タンパク質のポリマーへの結合が、ポリマー上の官能基を変更する形で共有結合、イオン結合、疎水結合、親和結合のうち１または複数で成されるように選択される。
【０００８】
そうして、粒子は、官能基によってポリマーに結合され、それによって固定化されるタンパク質または修飾タンパク質を少なくとも１つ含む。タンパク質については、単一の酵素または酵素の混合物、抗体または抗体の混合物、抗原または抗原の混合物、または、機能的特性または構造的特性を備えた他のタンパク質とすればよい。すなわち、必要に応じて、複数の異なるタンパク質や複数の異なる修飾タンパク質を、粒子内部で固定化できる。タンパク質が酵素である場合、本粒子は、酵素の最適ｐＨを酸性域またはアルカリ性域にシフトすることを可能にする手段を提供する。これは粒子内での酵素の固定化による。
【０００９】
タンパク質または修飾タンパク質をポリマーに共有結合する場合、これは、例えば、エポキシド、アルデヒドをタンパク質または修飾タンパク質のアミン基と相互作用させることで達成される。
タンパク質または修飾タンパク質をポリマーにイオン結合する場合、これは、ポリマー上で正または負に帯電した官能基を、タンパク質または修飾タンパク質上で前記官能基と反対に帯電されたアミノ酸残基とイオン結合させることで達成される。
【００１０】
タンパク質をポリマーに疎水結合する場合、これは、ポリマー上の芳香族アルカンまたは長鎖アルカンの疎水基とタンパク質上の疎水性アミノ酸とが結合することで達成される。
タンパク質をポリマーに親和性結合する場合、これは、二価金属またはアビディンといった親和性タグが、ヒスチジンまたはビオチン化タンパク質を結合することで達成される。
【００１１】
当然のことながら、粒子には、タンパク質のより効率的な結合のために、必要に応じて上記の種類またはカテゴリーの官能基を複数含ませてもよい。
鎖状または繊維状のポリマーは、ホモポリマーとしてよいし、ポリエチレンイミンとしてもよい。
架橋剤は、グルタルアルデヒドまたは他のアルデヒド、エポキシド、あるいは、複数の官能基を有する他の適当な化合物とすればよい。
【００１２】
粒子は、格子の開口領域や空間の内部に捕捉された補助剤を含む。補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択すればよい。適当な酵素または基質を補助剤として粒子に含ませれば、反応に用いる補因子の連続的な再生を達成でき、それによって、反応を平衡状態に到達させたり、あるいは反応を完了させたりすることができる。補助剤として磁鉄鉱または磁性物質を含ませれば、形成液状媒体からの粒子の回収は、磁気分離を用いて速やかに行える。
【００１３】
また、本発明の第２の様態として、第１の液相の液滴が第２の液相内に分散したエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中には溶解したポリマーおよび架橋剤が含まれるという状態で製造する処理と、架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、を特徴とする粒子生成方法を提供する。
【００１４】
第１の液相は水相であり、従って第２の液相は油相となる。よって、エマルジョンは油中水分散型（water（ｗ）-in-oil（ｏ））のエマルジョン（すなわちｗ／ｏエマルジョン）となる。しかし、本発明の別の実施の形態では、エマルジョンを、水中油分散型（oil-in-water（ｏ／ｗ））エマルジョン、水中油分中に水が分散した型（water-in-oil-in-water（ｗ／ｏ／ｗ））のエマルジョン、あるいは、油中水分中に油が分散した型（oil-in-water-in-oil（ｏ／ｗ／ｏ））のエマルジョンとすることもできる。
【００１５】
本エマルジョンは、第１のエマルジョン（水滴で成り、その中にポリマーが溶けて油相で分散した状態で含まれるもの）を、第２のエマルジョン（水滴で成り、その中に架橋剤が溶けて油相で分散した状態で含まれるもの）と混合する方法で形成できる。
また、本発明の第３の様態として、第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第１のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解したポリマーが含まれているという状態で製造する処理と、第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第２のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解した架橋剤が含まれるという状態で、第１のエマルジョンと併せる処理と、架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、を特徴とする粒子生成方法を提供する。
【００１６】
相のうち少なくとも１つは、界面活性剤（detergent、surfactant）を含む。界面活性剤は、両性イオン界面活性剤、中性界面活性剤、荷電界面活性剤またはポリマー界面活性剤から選択すればよい。陰イオン界面活性剤としては、アルキル硫酸塩（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、アルキルエーテル硫酸など）がある。陽イオン界面活性剤としては、セントリモニウムクロリド（centrimonium chloride）がある。非イオン物質の界面活性剤としては、エトキシ化アルキルフェノール（ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルシクロヘキシルエーテル（Triton X100）、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル（ノノキシノール-９）など）がある。両性または両親媒性の界面活性剤としては、デシルベタイン（decyl betaine）がある。ポリマー界面活性剤としては、ソルビトール−（エチレンオキシド）８０、エチレンオキシド−プロピレンオキシド−エチレンオキシドのトリブロックコポリマー（これは、ポロキサマーとしても知られ、Pluronicの商品名でＢＡＳＦ社から入手できるものなどがある）、そして、プロピレンオキシド−エチレンオキシド−プロピレンオキシドのトリブロックコポリマー（メロキサポールとしても知られるもの）がある。
【００１７】
油相の油は、少なくとも原則上は、水と混和しない何らかの適当な有機溶剤、植物油、鉱物油、石炭または原油由来の油相成分（oily component）、または合成油であればよい。しかしながら、鉱物油、パラフィン、溶剤（イソオクタンなど）から選択するのが好ましい。
これまでに述べた通り、ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、架橋剤は、二官能基または多官能基のアルデヒド（グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、デキストランアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、グリオキサールなど）である。他の適当な架橋剤を、ＰＥＩまたは誘導化ＰＥＩ、あるいは他のポリマーに対して使用する場合もある。イソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネート、またはイソチオシアネートを含む）；エポキシド（２-クロロメチルオキシランなど）；無水物；エピクロルヒドリン,１-エチル-３,３-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド；エチルクロロアセテート、または、それに類するものが挙げられる。タンパク質または修飾タンパク質の固定化には未反応の官能基が用いられるので、架橋剤は、ポリマー修飾または架橋後（post cross-linking）修飾のための誘導（derivitization）剤とも見なされるであろう。他のポリマーまたはコポリマーを用いることもでき、そうしてものとしては、ポリビニルアルコール、ナイロン、アルギネート、その他タンパク質（アルブミン、コラーゲン、それに類するもの）、およびそれに類するもの（修飾されたもの、修飾されていないもの）がある。
【００１８】
本方法には、タンパク質（酵素、抗体または抗原、または修飾タンパク質）を粒子内または粒子上に導入する処理が含まれる場合があり、それによって、タンパク質または修飾タンパク質は、上述したように、ポリマー鎖または繊維において、または架橋剤において官能基と反応し、その結果、鎖状または繊維状のポリマーに、または架橋剤に結合されることで固定化される。
【００１９】
本方法は、相の１つに補助剤を加えて、補助剤を粒子の格子の内部に捕捉させる処理を含む場合がある。また、格子へのタンパク質の結合の前または後に補助剤を更に追加する場合がある。上述したように、補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択される。
また、本方法には、粒子を油相から回収する処理が含まれる場合がある。具体的には、粒子の回収は物理的な分離手段（遠心分離や濾過）で実行する。
【００２０】
また、本方法には、回収した粒子の乾燥処理が含まれる場合がある。粒子の乾燥処理としては、アセトン脱水、空気乾燥、噴霧乾燥、そして、好ましいものとして、凍結乾燥または真空乾燥がある。
なお、上述したとおり、本方法は、回収した粒子に乾燥処理に先立って補助剤を加える処理を含む場合があり、そうすると、補助剤は粒子の格子の内部に捕捉されることになる。
【００２１】
回収した粒子の乾燥処理は、タンパク質固定化の前後いずれであっても、タンパク質および粒子の安定化促進の達成、または、天然補因子や修飾補因子といった添加物の捕捉に関して効果がある。乾燥処理によって更に、多点結合によるタンパク質または修飾タンパク質の架橋状態の改善という結果が得られる。そして、これにより、酵素などのタンパク質の安定性が向上することになる。
【００２２】
また、本発明の粒子には多様な用法や用途があると考えられる。例えば、生体触媒用、酵素ベースの生物機能を利用した環境修復、診断に用いられる。また、膜反応器やタンパク質固定化マトリックスといった固体支持体の表面に結合させて表面積を大きくするのに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】例１によるグルタルアルデヒド架橋ＰＥＩポリマー粒子の顕微鏡写真であり、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子（support lattice）または網目主鎖（network backbone）を示す図である。
【図２】例２による、繊維格子に結合するラッカーゼに関して得られた結果を示すグラフであり、ｐＨプロフィール（profile）のシフトに関して結合効率の補正を行った場合の図である。
【図３】各種の油相を用いて製造した粒子の粒径分布（平均粒径）の分析結果を示す図であり、粒子を乾燥させなかった場合（湿った状態）、乾燥させた場合（凍結乾燥を採用）、インライン（in-line）超音波照射（ＵＳ）を伴う場合、超音波照射で前処理した後に測定した場合、について示す図である。
【図４】各種の界面活性剤を用いて製造した粒子の粒径分布の分析結果を示す図であり、そのままの状態で光散乱によって測定した場合と、超音波照射後（ＵＳ後）の分析で求めた場合とを示す図である。
【図５】単一エマルジョンを用いて製造した乾湿両粒子について粒径分布を示す図であり、結果は３回繰り返して行った実験の標準偏差を示しており、そのままの状態での光散乱によって測定した場合と、インライン超音波照射を伴う場合と（「ＵＳと共に」）、サンプルに事前超音波照射した後の分析で求めた場合（ＵＳ後）とを示す図である。
【図６】２０ｍｌの量の鉱物油と２００ｍｌの量の鉱物油とで製造した乾湿両粒子について粒径分布を示す図である。
【図７】潜在的な保護剤としての基質を有する場合と有していない場合とで、粒子に結合された各種酵素の活性度の維持状態を示す図である。
【図８】自由（free）ラッカーゼ結合粒子および乾湿両ラッカーゼ結合粒子に関する温度最適条件を示す図であり、（Ａ）はＰＥＩがｐＨ８で製造された場合、（Ｂ）はＰＥＩがｐＨ１１で製造された場合を示す図である。
【図９】ＰＥＩがｐＨ８、ｐｈ１１で製造された乾湿両方の粒子結合ラッカーゼおよび自由ラッカーゼについてｐＨ安定性（６時間）を示す図である。
【図１０】（Ａ）は、例１４による、後処理していない繊維格子または網目における、固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、ポリエチレンイミン（‘ＰＥＩ’）濃度の変化がｐＨプロフィールのシフトに与える影響を表す図であり、（Ｂ）は、例１４による、後処理していない繊維格子または網目における固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、グルタルアルデヒド濃度の変化がｐＨプロフィールのシフトに与える影響を表す図である。
【図１１】（Ａ）は、グルタルアルデヒド後処理した繊維格子または網目における、固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、ＰＥＩ濃度の変化がｐＨプロフィールのシフトに与える影響を表す図であり、（Ｂ）は、例１４により、グルタルアルデヒド後処理した繊維格子または網目における、固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、グルタルアルデヒド濃度の変化がｐＨプロフィールシフトに与える影響を表す図である。
【図１２】実験Ａ〜Ｆに関する粒子のペルオキシダーゼ活動度について得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ここから、本発明について、後述の実施の形態および添付図面を参照しながら、より詳細に説明する。
（例１：ポリマー鎖／繊維の網目または格子からなる粒子の製造方法）
本方法で形成される油中水分散エマルジョンは、その内部で、ポリアミンポリマー（ポリエチレンイミン)を含むエマルジョンと別の主要なアミン架橋剤（グルタルアルデヒド）とが組み合わされる。２つの試薬が反応して、微細な粒子または粒の形をしたポリマーを形成する。
（使用化学物質）
グルタルアルデヒド（２５％の水溶液）は、Acros Organics社（Geel West Zone 2, Jansen Pharmaceuticalaan 3a, ２４４０ ゲール, ベルギー）から入手した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（５０％の水溶液、カタログ番号Ｐ−３１４３、Ｍｗ７５０，０００およびＭｎ６０，０００）は、Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州 ６３１７８）から取得した。鉱物油（医薬用ホワイトオイル、４８０３１）は、Castrol社（８ ジャンクションアベニュー、パークタウン、２１９３ ヨハネスバーグ、南アフリカ）から購入した。
（粒子の製造方法）
（エマルジョンＡの組成）
・１０ｍｌの鉱物油（油相）
・０.０５ｍｌのノノキシノール−４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのポリエチレンイミン（ポリアミン）、（１０％ｍ／ｖ水溶液）、ｐＨ１１
７００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
（エマルジョンＢの組成）
・１０ｍｌの鉱物油（油相）
・０.０５ｍｌのノノキシノール−４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのグルタルアルデヒド、（２５％ｍ／ｖ、等級（grade）II）
７００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
【００２５】
２つのエマルジョン（Ａ、Ｂ）を組み合わせると、ポリマー架橋反応を生じさせることができた。そして、電磁撹拌器を用いて７００ｒｐｍで３０分〜１時間撹拌することで、エマルジョンの状態は確実に維持された。その後、JA20.1ロータを備えたBeckman-Coulter J2-21MEに入れて１０分間、エマルジョンを３０００ｒｐｍで遠心分離し、形成された粒子を回収した。ペレットは、脱イオン水に再懸濁して１０〜４０ｍｌまで希釈した後、再び遠心分離した。そして、この洗浄工程を更に２回繰り返した。最終的に得られた上澄みは澄んでいた（clear）。そして最終的に残ったペレットは、１０ｍｌのTris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に懸濁した。
（結果）
全てのエマルジョン調製で得られる材料を、遠心分離によって回収し、光学顕微鏡検査によって視覚化した。図１に示すのは格子形成の結果であり、おおよそ球状の粒子が形成されたことを示している。
（ＰＥＩ対グルタルアルデヒドの濃度比が粒子形成に与える影響）
グルタルアルデヒドに対するＰＥＩの比率が粒子形成に与える影響を調査した。サンプルは表１に従って調製した。
【００２６】
乾燥重量の測定は、繊維主鎖格子／支持体の凍結乾燥および重量計測という手順で行った。この実験の結果は表１に示してあり、幅広い反応体の組合せで粒子が形成されることを示している。
表１：繊維ポリマー主鎖の製造評価に使用するＰＥＩおよびグルタルアルデヒドの量
【００２７】
【表１】
（例２：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖へのラッカーゼの結合）
（酵素）
DeniLite（登録商標）（ラッカーゼ）は、Novozymes社（Novozymes A／S、Krogshoejvej ３６、２８８０ バウスベア、デンマーク）から取得した。
（酵素洗浄）
ラッカーゼは、DeniLiteから部分的に精製した。その方法は、２回蒸留した１００ｍｌのＨ２Ｏに５gのDeniLite II Baseを溶かしながら、４℃で１時間、２００ｒｐｍで撹拌するというものであった。懸濁物質は、Beckman-Coulter J2-21ME遠心分離機のJA14ロータを用い、４℃で１時間、１００００ｒｐｍで遠心分離を行って除去した。上澄みを取り除き、１０ｋＤａカットオフ機能を備えたSnakeSkin（登録商標）（Pierce社）透析管を用いて、４℃の水５Ｌを３回交換して透析した。最初の２回の交換までの透析は２時間継続し、最後の透析は１２時間継続した。酵素は、液体窒素の中で凍結させて凍結乾燥した。その後、このラッカーゼは、必要になるまで４℃で保管した。
（ラッカーゼの分析評価）
ラッカーゼの分析評価は、ラッカーゼを支持体に結合した後の遠心分離による上澄みと、支持体に固定化されたラッカーゼとを対象に実施し、結合時の活性度の維持状態を測定した。ラッカーゼ試薬は、基質としての１ｍＭのグアヤコールを、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）の中に含むものとした（Jordaan J，Pletschke B，Leukes W（著）、２００４年、（題名）“Purification and partial characterization of a thermostable laccase from an unidentified basidiomycete.”（掲載誌）Enz. Microb. Technol. 34:635-641）。分析評価は、５ ２００Ｍ−１.ｃｍ−１の減衰係数で、４５０ｎｍにおいて３回繰り返して実施した。分析評価の実施には、PowerWave HT Microtitreプレートリーダを用いた。酵素の単位は、１分につき１μｍｏｌの基質を酸化させるのに必要な酵素量を１単位として定めた。
（タンパク質の測定）
タンパク質担持（protein loading）後に、ラッカーゼを基準タンパク質とし、２８０ｎｍでの光吸光を利用して溶液中のタンパク質濃度を測定した。溶液中の残留タンパク質をタンパク質全体から差し引いたものを、結合されたタンパク質と見なした。
（酵素固定化）
室温で３０分間緩やかに揺動して、酵素（ラッカーゼ）（１０ｍｇ.ｍｌ−１溶液で１ｍｌ）を支持体に結合させた。このとき、酵素は、表２に示す乾燥重量を持つ主鎖と結合した。ラッカーゼと結合した粒子は、７００×ｇで５分間遠心分離を行って回収した。固定化された酵素は、５０ｍｌの水で５回洗浄し、上述したような遠心分離を行って回収した。
【００２８】
タンパク質（この場合は酵素であるラッカーゼ）は、緩衝液の形でＰＥＩ-グルタルアルデヒド粒子（誘導化したもの、あるいは、誘導化していないもの）に加えた。粒子は例１で示した形で調製した。粒子をタンパク質と反応させて、上述したように、タンパク質をポリマーに固定化することができた。粒子は、遠心分離による回収から使用時まで、乾燥させないようにした。
【００２９】
様々な形で製造したタンパク質支持体にタンパク質を結合した結果を、下の表２に示す。一方、ラッカーゼ活性度に関する結果は図２に示してある。
（結果）
表２：主鎖支持体へのラッカーゼの結合効率
【００３０】
【表２】
別の実験用セットを表１に示す通りに調製した。しかし、本例での粒子はグルタルアルデヒドで後処理してあり、数字の２で区別している（すなわち、Ａ２−Ｊ２）。調製に続き、上述した方法に従ってラッカーゼを粒子に結合した。ラッカーゼが結合した粒子を、７００×ｇで５分間遠心分離して回収した。
【００３１】
ポリマー支持体に担持された酵素の活性に関する結果を図２に示す。
本調査が示しているのは、繊維格子または網目をタンパク質固定化の支持体として用いた場合、タンパク質結合容量が大きいと同時に、タンパク質の機能活性は保たれる、ということである。
（例３：各種の油を用いたポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖の製造方法）
エマルジョンの油相の違いが与える影響を調査した。粒子の製造にあたって、先ず２種類の異なるエマルジョンＡ，Ｂを調製した。
（エマルジョンＡの組成）
・１０ｍｌの鉱物油、パラフィン油またはイソオクタン（油相）
・０.１ｍｌのノノキシノール-４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのポリエチレンイミン（ポリアミン）、（１０％ｍ／ｖ水溶液）、ｐＨ１１
２５℃において、５００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
（エマルジョンＢの組成）
・上述したのと同じ油相１０ｍｌ
・０.１ｍｌのノノキシノール-４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのグルタルアルデヒド、（２５％ｍ／ｖ、等級II）
２５℃において、５００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
【００３２】
続いて、エマルジョンＡを短時間でエマルジョンＢに加え、更に１時間撹拌した（７００ｒｐｍ）。そして、Sorvall benchtop遠心分離機によって３０００×ｇで１０分間遠心分離した後、１０ｍｌの量の脱イオン水で６回洗浄するという手順で、エマルジョンから粒子を回収した。洗浄後、最終的に得られた粒子を脱イオン水で２０ｍｌに再懸濁し、その半分を凍結乾燥によって乾燥させた。湿潤粒子（wet particle）および乾燥粒子の両方について、粒径分布を分析した（Malvern Mastersizer 2000使用）。凝塊の存在を調査する目的で、粒径の測定を、インライン超音波処理の前後、そして同処理と共に行った。また、凍結乾燥後の回収量を質量で測定した。
（結果）
異なる油相で製造した粒子（各々の総量は２０ｍｌ）の質量での回収量は、鉱物油、パラフィン油、イソオクタンでそれぞれ１１１ｍｇ、９０ｍｇ、７９ｍｇと測定された。異なる油相で製造し、超音波処理を行わなかった湿潤粒子と乾燥粒子とを比較した結果、鉱物油およびパラフィン油のサンプルについては、乾燥後に粒径の平均値が大きくなったことが分かった（図３）。イソオクタンで製造された粒子は、乾燥処理にもかかわらず比較的変化がなかった。インライン超音波処理およびプレ超音波処理（pre-sonication）では、鉱物油およびパラフィン油で製造し乾燥した粒子の粒径分布に大幅な低下が見られた。それは、乾燥処理した粒子には凝塊が生じるが（図３）、超音波処理によって分解することができた、ということを示している。また、鉱物油およびパラフィン油で作られた湿潤粒子の粒径の分析でも、粒子の超音波処理に伴って粒径の平均値が下がることが示されたが、その幅は乾燥した粒子の場合（図３）に比べれば小さい。イソオクタンで製造した粒子は、乾燥処理や超音波処理にかかわりなく、比較的変化がなかった。
【００３３】
結論としては、様々な油相を用いて粒子を製造することが可能である。また、異なる油相を用いること、ならびに乾燥処理や超音波処理などの各種後処理の技術を用いることで、粒径を操作することができる（油相の違いはエマルジョンの液滴サイズに影響すると推測される）。
（例４：各種の界面活性剤を用いたポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖の製造方法）
粒子の合成では、界面活性剤の種類が影響を与える場合がある。これを調査した。
【００３４】
粒子は、ほぼ例３に従って調製したが、油相としては鉱物油のみを用い、界面活性剤の種類を変えた。
（結果）
鉱物油に各種の界面活性剤を用いて製造した粒子（総量２０ｍｌ）の質量での回収量は、ノノキシノール-４、CHAPS、Triton X-100のそれぞれについて、１１１ｍｇ、７２ｍｇ、９２ｍｇと測定された。CHAPSやTriton X100を用いた場合、異なる界面活性剤で製造した粒子を乾燥処理しても、粒径に実際的な差は表れなかった（図４）。ノノキシノール-４を界面活性剤として製造した粒子を乾燥処理すると、粒径は約５０％大きくなった（図４）。さらに、超音波処理後の粒径分析は、テスト対象の全ての界面活性剤で製造した粒子で、そろって粒径が小さくなったことを示した。超音波処理した粒子の粒径を乾燥処理の前後で分析すると、結果は類似したものとなった。
【００３５】
結論としては、様々な界面活性剤を用いて粒子を製造することが可能であった。さらに、粒径は、界面活性剤の種類および後処理によって操作することができた。
（例５：ポリマー架橋剤として各種ポリアルデヒドを用いた粒子合成）
粒子の合成に用いる架橋剤アルデヒドは、様々に変更することができる。架橋剤としては、グルタルアルデヒド、デキストランアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネートが挙げられる。
【００３６】
粒子を作る方法は、以下の点を除けば、例３と同じである。すなわち、ある場合では、グルタルアルデヒドをデキストランアルデヒド（１５ｍｇ／ｍｌのものを１ｍｌ）と置き換えた。また、別の場合では、０.５ｍｌのヘキサメチレンジイソシアネート（２５％ｖ／ｖ）と置き換えた。
５ｍｌの粒子懸濁液に、Tris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に入れた５ｍｇ.ｍｌ−１の精製カンジダアンタークティカリパーゼＢ（CALB）を６ｍｌ加え、２５℃で１時間緩やかに撹拌した。その後、懸濁液を遠心分離し、４℃の緩衝液１０ｍｌを用いて２度洗浄した。それから、懸濁液を遠心分離し、ペレットを１０ｍｌのTris-Cl緩衝液に再懸濁した。そして、ｐ-ニトロフェニルブチラートを使って懸濁液（１０μｌ）を分析評価した。また、比較のために、Tris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に０.５ｍｇ-ｐｅｒ-ｍｌの精製カンジダアンタークティカリパーゼＢを１０μl入れた場合についても分析したが、これには、ｐ-ニトロフェニルブチラートの加水分解に基づく分析評価と、それに続く分光測光法による分析とを用いた（表３）。
（リパーゼ活性の分析評価）
リパーゼの活性により、ｐ-ニトロフェニルエステル（ｐ-ニトロフェニルブチラート（ＰＮＰＢ））はｐ-ニトロフェノールおよびブチル酸へと加水分解された。ｐ-ニトロフェノールの放出によって黄色が生じ、この黄色は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いれば４１０ｎｍで測定される。活性度の測定は３回繰り返した。溶液の調製は以下のように行う。すなわち、溶液Ａは、８ｍｌのプロパン-２-オールに溶けた形で酵素基質を含むものとした。一方、溶液Ｂは、５０ｍＭのTris-緩衝液（ｐＨ８.０）にデオキシコール酸ナトリウム２６７ｍｇを溶かした後に、６６.７ｍｇのアラビアゴムを溶解させたものとした。動的（Kinetic）分析評価を、PowerWave microtitreプレートリーダ（BioTek Instruments社）を用いて２５℃で実行し、上述した溶液の１対１０（Ａ：Ｂ）の混合物２４０μlと固定化リパーゼ懸濁溶液または自由酵素１０μlとを用いた。
（結果）
（表３：各種のアルデヒド架橋剤を用いて作った粒子の比較−CALBの活性度）
【００３７】
【表３】
この方法は最適化されていないが、ある程度の範囲のポリアルデヒド合成物が使用して粒子を生成できることを示している。
【００３８】
本材料は、０.４５μｍフィルタ（Sartorius社）で回収および再利用することができた。５回の再利用を終えて、グルタルアルデヒド粒子は７.０５Ｕ.ｍｌ−１の平均値を示し、活性度は当初の８１％であった。
類似の実験を、蛍光菌（ＰＦＬ：Pseudomonas fluorescens）由来のリパーゼを用いて実施した。酵素活性度の分析評価には、基質として、ブチル酸のｐ-ニトロフェニルエステル（ＰＮＰＢ）とパルミチン酸のそれ（ＰＮＰＰ）とを用いた。
（表４：各種のアルデヒド架橋剤で作られた粒子の比較−PFLの活性度）
【００３９】
【表４】
各種のアルデヒドを用いることで、粒子形成のための効果的な架橋の実現と、タンパク質を粒子に架橋するための官能基の提供との両方が可能となった。架橋剤の選択は、酵素変性の程度や基質および生成物に対する粒子の接触可能性（accessibility）の程度によって、酵素の活性度に影響を与える可能性がある。最適な架橋剤は、酵素および反応基質に基づいて選択すればよい。
（例６：２官能基エポキシド架橋剤を用いた粒子製造）
粒子の合成に使用する架橋剤アルデヒドは、ジエポキシド（例：１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテル）などの他の架橋剤と置き換えることができる。これを（グルタルアルデヒドの代わりに）、５０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、１２.５％ｖ／ｖの薄めていない（neat）０.５ｍｌの溶液の形で、架橋剤エマルジョン（Ｂ）に加え、そして、４０℃で２時間反応させた（例３の場合と同様）。エマルジョンからの粒子の回収には、３０００×ｇの遠心分離（Sorvall RT7 benchtop遠心分離機使用）を１０分間行い、その後、１０ｍｌの量の脱イオン水で６回洗浄した。洗浄後、最終的に得られた粒子を脱イオン水で２０ｍｌに再懸濁した。１２.５％ｖ／ｖまたは２５％ｖ／ｖのエポキシド溶液を用いて上記のやり方で調製したものは、形状の点で最も均一であったのに対し、５０％のエポキシドを薄めずに用いて形成したものは、大きく、しかもばらつきがあった。
【００４０】
タンパク質の結合は、（前出の例に従い）ＣＡＬＢを使って調査した。それを一晩（overnight）透析し、エポキシドベースの粒子（１２.５％ｖ／ｖエポキシド溶液を用いて上述の通り調製したもの）と、緩やかに撹拌しながら1時間反応させた。例５で述べたようにリパーゼ結合粒子を回収および洗浄した後、酵素の活性度を分析評価した。全ての分析評価はＰＮＰＢを基質として実施した。
（結果）
ブタンジオールジグリシジルエーテルを架橋剤として使用した結果、直径が約０.１ｍｍの白色粒子が形成された。しかしながら、この粒子は形状がいくぶん不規則であり、これは、架橋または後続のクリーニングの手順で粒子の凝塊が生じたことを示す。
【００４１】
１２.５％ｖ／ｖエポキシド溶液で製造した粒子を、酵素が存在する状態で一晩インキュベート（incubate）した。これらの粒子は、０.２８Ｕ.ｍｌ−１の活性度を示した。これは、エポキシド架橋剤を用いた粒子の製造が可能であることを示す。
（例７：単一のエマルジョンで製造したポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖）
粒子の形成方法は、必要に応じて調整することができる。例えば、単一のエマルジョンを用いて粒子を形成することもできる。
【００４２】
ポリマーと架橋剤とは、混合チャンバに２重注入を行う装置を用いれば、水相で即座に混合することができる。こうした装置の最も単純な型は、同じポイントで共通のラインに注入を行う２つのシリンジで構成されたものであろう。これは油相への直接注入が可能である。一例として、２０ｍｌの鉱物油に０.２ｍｌのノノキシノール-４を約５分間溶解させ、さらに５００ｒｐｍで電磁撹拌器による撹拌を行う、という設定で評価を行った。一方のシリンジには０.５ｍｌのＰＥＩ（１０％）を入れ、他方には０.５ｍｌのグルタルアルデヒド（２０％、等級II）を入れた。両シリンジを同時に押し込んで、鉱物油に直接注入した。結果として得られたエマルジョンを１時間撹拌し、その後、粒子を例３と同じやり方で回収した。実験は３回繰り返して実施した。粒子は２等分し、その一方は冷凍乾燥し（Virtis使用）、元の量に再懸濁した後、粒径分布についての分析評価を行った（Malvern Mastersizer 2000使用）。サンプルに対し、乾燥後、回収量（質量）に関する分析評価を行った。
（結果）
単一のエマルジョンを用いて製造した粒子の回収量（質量）は１５２±１２ｍｇと算出されたが、その値は、２エマルジョン方式（例３を参照）を用いて得られるものに比べて約１.４倍大きかった。
【００４３】
単一のエマルジョンを用いた粒子形成は可能であり、現行の製造法（図５）を用いて再現可能であった。粒子は、２種のエマルジョンを用いて形成したものに比べ、粒径分布がより広いことが分かった（図５）。単一エマルジョン粒子に関して得られた乾湿の粒径分布は、２エマルジョン実験の場合に得られるもの（図３）に比べ、サイズで、５０〜７０％大きいことが分かった。
（例８：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子の拡大規模での製造）
ここでの目的は、粒子製造の規模を線形的に１０倍に拡大して粒径を評価することであった。別個の２バッチの粒子を、例３で概説した標準的製造方法にほぼ従って調製したが、異なる点として、第２のバッチは必要な構成成分の各々について１０倍の量を含むものとした。両バッチに対しては、規模に応じた形で、例３と同様の粒子回収処理を行った。
（結果）
２０ｍｌ、２００ｍｌの鉱物油量で製造した粒子の回収量は、質量でそれぞれ０.１１１ｇ、１.１１ｇと算出され、ちょうど１０倍の差があった。鉱物油量が２０ｍｌでも２００ｍｌでも粒子を製造することは可能であり、より大きな規模で製造した粒子の粒径は、２０ｍｌの規模で得られるものに比べ、一貫してわずかに小さいだけであった（図６）。興味深い点は、より大きい規模で製造し、超音波処理していない乾燥粒子のサイズが、より小さい規模で製造した乾燥粒子と比べて約５０％小さかったことである（図６）。
【００４４】
回収量（質量）および粒径分析に基づいて言えば、標準的条件での粒子の製造法は、少なくとも１０倍の規模拡大が可能であった。
（例９：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子を用いた広範囲の酵素群の固定化）
ここでの目的は、異なる酵素を粒子主鎖に結合し、それらの結合率（％）と酵素活性度の維持の程度とを算出することであった。
【００４５】
例３に従って製造した粒子を使用した。検査対象の酵素は、ラッカーゼ（Novozymes 51009, ミセリオフトラサーモフィラ）、グルコースオキシダーゼ（Seravac Pty Ltd, アスペルギルスニゲル）、そしてリパーゼ（CALB, Novozymes のカンジダアンタークチカ）であった。各々の実験について、各酵素５ｍｇ（１０ｍｇ.ｍｌ−１で０.５ｍｌ）を１４ｍｇ（２８ｍｇ.ｍｌ−１で０.５ｍｌ）の粒子に結合し、２５℃で２時間緩やかに振盪させた。各サンプルは、Allegra X22R遠心分離機を用いて１０分間遠心分離した（２０００×ｇ）。粒子は、連続して６回洗浄し、各回２ｍｌの脱イオン水を用いた。混ぜ合わせて生じた上澄み部分を分析して、総タンパク質を求めた。個別の酵素結合実験を、各々、潜在的（potential）保護剤として特定の基質を含む場合と含まない場合とで実施した。ラッカーゼの場合、市販の伝達物質Denillite II Assist（Novozymes）を潜在的保護剤とした（１００ｍｇ.ｍｌ−１ （ｐＨ６.８に調整）のものを５０μl）。グルコースオキシダーゼの場合、グルコースを潜在的保護剤とした（１０％ｍ／ｖグルコース一水和物を５０μl）。そして、ＣＡＬＢの場合、２-イソプロピル-５-メチルシクロヘキサール（メントール）の８−ジアステレオ異性体混合物を使用した（５０μl）。粒子は、脱イオン水で２ｍｌに再懸濁した。粒子を分析し、それぞれの酵素の活性度を求めた。全ての分析評価を３回繰り返した。
（総タンパク質）
総タンパク質分析評価は、Bio-Rad Total Protein Assay kit（カタログ番号：500-0006）というキットを用い、個別の酵素を各々基準として用いて実施した。
【００４６】
ラッカーゼの活性度を測定するために、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）に入れた１ｍＭの２,２’-アジノビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）を基質として使用した。溶液の光学濃度は４２０ｎｍで測定した。これらの分析評価は、１８０μlのABTS試薬にサンプル２０μlを加えて実行した。活性度の調査は、PowerWave HT（Biotek Instruments社）を用い、２５℃でインキュベートして、４２０ｎｍで分光測光法によって行った。
（グルコースオキシダーゼ）
グルコースオキシダーゼ（GOX）の活性度は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）によるｏ-ジアニシジンの間接酸化を利用して計測した。分析評価は、Bergmeyer（その他）による方法（１９８８年）に従って実施した。調剤した試薬は以下の通り：（試薬Ａ）ｏ-ジアニシジン-２ＨＣＬ（０.００６％）を含む０.１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）；（試薬Ｂ）Ｄ−グルコースの１０％の水溶液（使用前に１時間変旋光（mutarotate）を生じさせたもの）；（試薬Ｃ）６０Ｕｍｌ−１ＨＲＰ水溶液。試薬Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれを２４：５：１の割合で、グルコースオキシダーゼの分析評価の直前に混合した。反応試薬０.３ｍｌを入れて反応させており、サンプルを１０μl加えることで反応が開始された。反応結果は、２５℃において、４３６ｎｍで動力学的に計測した（Powerwave HT microtitreプレートリーダ使用）。グルコースオキシダーゼの活性度の単位は、２５℃およびｐＨ７で、１分につきに１μmoleのβ-Ｄ-グルコースをＤ-グルコノラクトンとＨ２Ｏ２とに転換するだけの触媒作用を生じる酵素の量を１単位と定めた。
（リパーゼ）
リパーゼの活性により、ｐ-ニトロフェニルエステルはｐ-ニトロフェノールおよび脂肪族カルボン酸に加水分解される。ｐ-ニトロフェノールの放出によって黄色が生じ、この黄色はＵＶ／Ｖｉｓ光度計では４１０ｎｍで計測される。２種のｐ-ニトロフェノールエステル（ｐ-ニトロフェニルアセテート（PNPA）およびｐ-ニトロフェニルブチレート（PNPB））を使用し、活性度の測定は３回繰り返した。溶液は以下のように調製した：溶液Ａは、酵素基質（１１.６ｍｇのPNPAまたは２４ｍｇのPNPP）を８ｍｌのプロパン-２-オールに溶かされた状態で含むものであり；一方の溶液Ｂは、２６７ｍｇのデオキシコール酸ナトリウムを含み、これを５０ｍＭのTris-緩衝液（ｐＨ８.０）に溶かした後に、６６.７ｍｇのアラビアゴムを加えたものである。動力学的分析評価を、２５℃で、PowerWave microtitreプレートリーダ（BioTek社）を使って実施し、上述した複数の溶液の混合物２４０μlと球体（sphere）酵素または自由リパーゼの溶液１０μlとを用いた。
（結果）
粒子への結合について検査した全ての酵素で、タンパク質担持の率は３０〜３６％の範囲となった（表５）。
（表５：粒子主鎖支持体への各種酵素の結合効率）
【００４７】
【表５】
（＊）活性部位の保護のため酵素の固定化中に基質を追加した（上述の方法を参照）。
ＰＮＰＡに対するＣＡＬＢの活性度の維持には、メントール基質を含ませることが効果的であり、約３０％高い活性度（８３％）が保たれた（図７）。
【００４８】
ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＣＡＬＢは全て、活性度を保ちながら粒子に結合することに成功した。それは、広範囲のタンパク質を、タンパク質担持が高い状態で、粒子に効果的に結合できることを示す。更に、他の酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼなど）も、粒子に結合することが示された（下の例を参照）。
（例１０：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子；複数の酵素が結合した粒子）
本調査は、複数の酵素を、両酵素に対する活性度を保った状態で粒子主鎖に結合できることを示す意図で行った。グルコースオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼ系とを選択した。
【００４９】
粒子は、例３に従って製造した。調査した酵素は、グルコースオキシダーゼ（Seravac Pty Ltdのアスペルゲルスニゲル）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（Serevac Pty Ltd）であった。一例として、５ｍｇ（１０ｍｇ.ｍｌ−１で０.５ｍｌ）のグルコースオキシダーゼと１０ｍｇ（１０ｍｇ.ｍｌ−１で１ｍｌ）のホースラディッシュペルオキシダーゼとを、２５℃で２時間緩やかに振盪して、２８ｍｇ（２８ｍｇ.ｍｌ−１で１ｍｌ）の粒子主鎖に結合した。各サンプルを、Allegra X22遠心分離機（２００×ｇ）を用い、１０分間遠心分離した。粒子は、連続して６回、各回２ｍｌの脱イオン水を用いて洗浄した。結合後の上澄み部分を、総タンパク質について分析した。粒子の活性度は、例９のグルコースオキシダーゼ用の分析評価方法に従って測定したが、分析評価試薬にホースラディッシュペルオキシダーゼは含まれていない。
（結果）
グルコースオキシダーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼの粒子主鎖への結合は成功し、３μｍｏｌｅ.ｍｉｎ−１の率でグルコースを変換することができた（表６）。このことは、分析評価で検出した活性度と同様、グルコースオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼとが結合され、活性度を維持していたことを示す。すなわち、粒子を用いれば、複数の酵素を、両方の酵素が活性度を保った状態で結合することができる。
（表６：グルコースオキシダーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼの２種酵素粒子に関する結合効率および活性度）
【００５０】
【表６】
（例１１：各種乾燥方法を用いて製造したポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目）
ここでの目的は、粒子を製造した後に、様々な方法（凍結乾燥、真空乾燥、アセトン乾燥など）を用いて粒子を乾燥させることであった。
【００５１】
粒子は、例１で概説した標準的な条件で製造した。そして、洗浄した粒子を、凍結乾燥（Virtis Genesis凍結乾燥機使用）、真空濃縮機（Savant RVT100蒸気収集機を備えたSavant SpeedVac SC110）を用いた真空乾燥、または、アセトンを用いた脱水によって乾燥させ、その後さらに、２５℃で１２時間空気乾燥させた。アセトン乾燥した粒子は、凝塊したため水媒体に再懸濁することができず、そのため、それ以上の考察は行っていない。
【００５２】
しかし、真空乾燥と凍結乾燥とは、粒子を乾燥させる技術として両方とも成功であり、乾燥後の粒子を用いて、広範囲の酵素やタンパク質を付着させることができた（表７）。５ｍｇ ｐｅｒ ｍｌの精製酵素６ｍｌをTris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に入れて、粒子懸濁液５ｍｌに加えた。そして、２５℃で１時間緩やかに撹拌した。懸濁液は、その後遠心分離してから、４℃の緩衝液１０ｍｌを用いて２度洗浄した。さらにその後、懸濁液を遠心分離し、ペレットを１０ｍｌのTris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）で再懸濁した。粒径は、Malvern Mastersizerを用いて測定した。
（結果）
（表７：各種乾燥処置後の平均粒径）
【００５３】
【表７】
本例が示すのは、乾燥処理、特に凍結乾燥した場合、酵素と結合した粒子が大きく凝塊することはない、ということである。
（例１２：様々なｐＨでＰＥＩから調製したポリマー鎖／繊維の支持体網目または格子へのラッカーゼ結合の特性評価）
乾燥処理が、結合後のラッカーゼ結合粒子の特性、酵素の性質に与える影響を判定した。
【００５４】
粒子は、例３で概説した標準の製造方法にほぼ従って製造したが、ｐＨ１１で調製したＰＥＩ（１０％）に加えて、ｐＨ８に調整して調製したものについても評価を行った。さらにラッカーゼを主鎖に固定化し、その方法は例９で述べたものとほぼ同じであるが、以下の点が異なる。すなわち、１ｍｌのラッカーゼ（Novozyme 51004，５０ｍｇ.ｍｌ−１）を６.２５ｍｌの粒子（１６ｍｇ.ｍｌ−１）と反応させた。従って、１００ｍｇの粒子について５０ｍｇのラッカーゼが結合したことになる。ラッカーゼ結合粒子は、脱イオン水１２.５ｍｌで洗浄し、さらに、脱イオン水を用いて２０ｍｌに再懸濁した。粒子は１０ｍｌずつ２等分した。そして、そのサンプルの１つを、回収量（質量）測定のために凍結乾燥し、乾湿両方のラッカーゼ結合粒子の特徴を調査した。乾燥させたサンプルは、脱イオン水で元の量に再懸濁した。全ての分析評価は３回繰り返した。
【００５５】
ラッカーゼの上澄みのサンプルの総タンパク質を、Bio-Rad Total Protein Assay kit（カタログ番号：500-0006）というキットを用い、ラッカーゼをタンパク質の基準として測定した。ラッカーゼの活性度は例９に従って測定した。
（結果）
凍結乾燥によるラッカーゼ結合粒子の乾燥処理では、粒子製造の際にＰＥＩがｐＨ８であった場合の方が、粒子に結合されるラッカーゼタンパク質は多いものの、粒子製造の際にＰＥＩがｐＨ１１であった場合の方が、回収できる量（質量）は大きいことが分かった（表８）。ABTSに対しての活性度を最も高く保つことができたのは、ｐＨ８のＰＥＩを用いて製造し、凍結乾燥しなかった粒子であったが（１６％）、凍結乾燥後の同じサンプルはラッカーゼ活性度を３％しか保持していなかった。注目すべき点として、ｐＨ８のＰＥＩを用いて製造された粒子は乾燥後に再懸濁するのが難しく、そのため凝塊する可能性があるが、凝塊すれば表面対面積（surface to area）の比率が下がり、従って、基質および生成物への分散制約（diffusional constraint）が原因で活性度が下がることになる。ｐＨ１１のＰＥＩを用いて生成された粒子については、活性度に関して同様の影響は観察されなかった（表８）。
【００５６】
表８：凍結乾燥を行う場合と行わない場合とで、ＰＥＩのｐＨ値を様々に変えながら製造したラッカーゼ結合粒子の結合効率および活性度保持の度合
【００５７】
【表８】
この実験が示すのは、粒子はＰＥＩのｐＨを変えて調製することができ、これによって酵素に対する粒子の結合特性が変わる、ということである。
（例１３：ｐＨ８またはｐＨ１１で製造および凍結乾燥し、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子に結合されたラッカーゼの安定性）
ｐＨ８またはｐＨ１１で製造および凍結乾燥され、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子に結合されたラッカーゼの熱安定性およびｐＨ安定性を測定した（ラッカーゼ結合粒子は例１２に記述した形で製造した）。
（温度最適条件）
自由ラッカーゼおよび粒子結合ラッカーゼ（タンパク質担持は均等）の温度最適条件の解析（profile）を、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）に基質として入れた１ｍＭのＡＢＴＳを用いて実行した。ウォーターバス内で、正確な温度に前平衡（pre-equilibrated）しておいた１.９ｍｌの基質に、サンプル（１００μl）を加えた。分析評価は、ペルティエ温度コントローラを備えたＤＵ８００分光光度計（Beckman-Coulter社、４２０ｎｍ）を用いて実施した。分光光度計を対象の温度に設定し、キュベットは、ウォーターバス内の平衡化した試薬を追加する前に、５分間平衡化させた。
（ｐＨ安定性）
自由ラッカーゼおよび粒子結合ラッカーゼ（タンパク質担持は均等）のｐＨ安定化は、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）に入れたＡＢＴＳ（１ｍＭ）を用いて行った。各ラッカーゼサンプルは、ｐＨ２.５、ｐＨ３、ｐＨにおいて、Britton-Robinson汎用緩衝液内でインキュベートした。サンプル（２０μl）を、定期的に取り出し、２５℃でインキュベートすると共に、PowerWave HT（Biotek Instruments社）を用いて４２０ｎｍで分析評価した（２３０μlの分析評価試薬）。６時間の時点での本実験の結果を図９に示す。
（結果）
結果を図８（Ａ）、（Ｂ）、図９に示す。
【００５８】
粒子結合ラッカーゼと自由（固定化されていない）ラッカーゼとは両方とも、７０℃で活性度が最高になった（図８）。しかし、粒子結合ラッカーゼは、９０℃では、自由ラッカーゼ（活性度０％）と比較して熱安定性の向上（活性度５５〜６５％）を示した（分析評価用サンプルの調製に要する時間で）。また、乾燥粒子を使用した場合も小幅な向上が見られ、乾燥による効果があることを示唆している。これは、水が除去されるにつれて、形成されるタンパク質−粒子連結が多くなることによるかもしれない。これによってタンパク質または酵素の複数点（multi-point）共有結合が増加するが、それは、熱安定性の向上などの形で安定性を高めることが知られている [“Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques”、Mateo, C, Palomo, J. M., Fernandez-Lorente, G., Guisan, J. M., Fernandez-Lafuente, R.（著）、２００７年、（誌名）“Enzyme and Microbial Technology 40(6)”、ページ1451-1463]。
【００５９】
また、ラッカーゼ結合粒子および自由酵素のｐＨ安定性を、ｐＨ２.５、ｐＨ３、ｐＨ６で測定した。ｐＨ２.５およびｐＨ３では、ラッカーゼ結合粒子のサンプル全てが、８０〜１１０％の活性度を保ったが、自由酵素は、それぞれのｐＨで活性度を約４０〜７０％失っていた（図９）。すなわち、固定化によってｐＨ安定性は向上する。自由酵素を含むサンプルの全ては、６時間後にｐＨ６で安定していた。
【００６０】
従って、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子の粒子に酵素を固定化することにより、ｐＨの両極での安定性を更に高めることができる。
（例１４：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子への固定化に伴う酵素最適ｐＨのシフト）
酵素は活性に最適のｐＨを有する。いくつかの場合、酵素の最適ｐＨは、他の反応にとっての最適ｐＨと一致しない。たとえば、酵素基質／反応物は別のｐＨ値で最も溶解しやすい、という場合がある。もう１つの例として、複数の酵素を複数ステップのワンポット（one-pot）反応に用いる場合、それらの最適ｐＨは一致しないことがある。それゆえ、固定化処理中に酵素の最適ｐＨを変化させることができれば、これによって経済的および技術的な効果が得られるだろう。そこで、ラッカーゼの最適ｐＨを、粒子上に固定化する場合と固定化しない場合とで測定した。
（酵素分析評価）
ラッカーゼ試薬は、５０ｍＭのBritton-Robinson汎用緩衝液の中に１ｍＭのグアヤコールを含んでおり、当該緩衝液は目標とするｐＨ値に調整してあった（Davies TJ, Banks CE, Nuthakki B, Rusling JF, France RR, Wadhawana JD, Compton RG（著）、２００２年。（題名）“Surfactant-free emulsion electrosynthesis via power ultrasound: electrocatalytic formation of carbon-carbon bonds”、（誌名）Green Chem. 4:570-577）。汎用緩衝液を用いたのは、同じ緩衝液系が存在すること、そして広範囲のｐＨにわたって効果的に緩衝できることを確実にするためである。分析評価は、５ ２００Ｍ−１.ｃｍ−１の吸光係数で、４５０ｎｍにおいて３回繰り返した。自由酵素ならびに支持体網目または格子の粒子に固定化されたラッカーゼについて、ｐＨ値プロフィールを実験で測定した。分析評価の実施には、PowerWave HT Microtitreプレートリーダを用いた。酵素の単位については、１分につき１μmolの基質を酸化させるのに必要な酵素の量を１単位とした。
（ｐＨ値プロフィールのシフト）
ｐＨプロフィールのシフトは固定化処理中に起こることは公知であるため、繊維格子または網目主鎖支持体に結合されたラッカーゼについて、ｐＨプロフィールを測定した。粒子は例３に従って作った。グルタルアルデヒドおよびＰＥＩの濃度の変化が最適ｐＨのシフトに与える影響についても、グルタルアルデヒド後処置（例２、Ａ２−Ｊ２）の影響と同様に調査した。
（結果）
結果を図１０（Ａ）、（Ｂ）、図１１（Ａ）、（Ｂ）に示す。
【００６１】
ｐＨ値プロフィールのシフトの全体的な傾向は、中性から弱アルカリｐＨに向かっている。本例が示すのは、酵素のｐＨプロフィールが、粒子への固定化によってシフトするということである。
（例１５：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ網目または支持体格子の官能性）
粒子主鎖の官能性を変えることで、タンパク質の疎水性結合、イオン結合、そして親和性をベースとした結合を示すものにすることができる。
【００６２】
粒子は、０.１ｍｌのノノキシノール-４と０.５ｍｌのポリエチレンイミン溶液（ｐＨ１１）とを含む鉱物油１０ｍｌのエマルジョンと、０.１ｍｌのノノキシノール-４と０.５ｍｌのグルタルアルデヒド（Sigma 等級II）とを含む鉱物油１０ｍｌのエマルジョンとを混合することで製造した。混合前に、両エマルジョンを５００ｒｐｍで３０分間揺動した。そして、一緒にしたエマルジョンを５００ｒｐｍで３０分間揺動した。これにより、装飾されていない粒子が得られ、それを上述したように遠心分離処理で回収した。
（イオン結合）
イオン性基は、上記の修飾されていない粒子で生成され、その方法は、グルタルアルデヒドを用いて官能化し（２５％の水溶液２００μl、２０ｍｌの脱イオン水で３回洗浄）、その後、エチレンジアミン（０.３３Ｍを１ｍｌ）を用いた処理を行うことで、自由なアルデヒド残基と反応させる（定期的にひっくり返しながら室温で１時間）、というものであった。粒子は、充分な量の脱イオン水で繰り返し洗浄し、２０００×ｇで１０分間遠心分離を行って回収した。ラッカーゼ（２.５ｍｇ）を５ｍｇの修飾された粒子と、充分な混合が確実に行われるように定期的にひっくり返しながら、４℃で３０分間インキュベートした。イオン結合を促進するために、１.０ＭのNaClを（対イオンとして）ラッカーゼ結合粒子に加え、ひっくり返して５分間混合した。粒子は、上述したのと同様に遠心分離によって回収し、活性度を測定した。
（疎水性結合）
修飾されていない粒子（５ｍｇ）をエポキシオクタン（０.１ｍｌ）と共に２５℃で４時間インキュベートするやり方で、疎水基を粒子に追加した。その後、これらを充分な量の水で繰り返し洗浄し、上述したように遠心分離によって回収した。疎水結合されたタンパク質（蛍光菌リパーゼ、５ｍｇ）は、界面活性剤（１％、デオキシコレート）の追加によって取り出すことができた。２８０ｎｍでのタンパク質吸光度を測るやり方で測定を行った。
（親和性結合）
タンパク質の親和性結合については例１７に示す。
（結果）
（イオン結合）
修飾された粒子には、追加したラッカーゼの４５％が結合された（Bio-Rad protein assay dye reagent method（５００-０００６）によって求めた値、メーカ側の記録による）。この４５％のラッカーゼのうち７６.９％は、対イオンとして塩（１.０Ｍ、NaCl）を追加することで取り出すことができた。これに対し、修飾されていない粒子はラッカーゼの１４％としか結合せず、塩溶液によって取り出せたのは、その５２.６％だけであった。
（疎水性結合）
修飾された粒子にタンパク質を結合した。修飾された粒子に結合されたタンパク質の約２８％は、デオキシコレートを追加することで取り出されたが、これは、結合された酵素のうちの疎水性結合部分である。
【００６３】
本例が示すのは、粒子マトリックスの官能性を変更することで、粒子マトリックスへのタンパク質結合の別メカニズムを実現できる、ということである。
（例１６：化学伝達物質および補因子の共捕捉（co-entrapment））
補因子（または修飾された補因子や化学伝達物質）を含ませることで、架橋後、酵素と補因子との共補足が可能になる。処理条件を選択することにより、反応体（例:酵素基質、共基質、生成物、共生成物）などの小分子の出入りを許す一方で補因子を保持するよう、粒子の多孔度を決めることができる。
【００６４】
アミノ酸デヒドロゲナーゼ（AADH）、ギ酸塩デヒドロゲナーゼ（凍結乾燥したもの）は、Biocatalytics社（米国）から購入した。PEG20000-NADHは、Julich Fine Chemicals社（ドイツ）から取得した。鉱物油は、Castrol社（ドイツ）から取得した。ノノキシノール-４は、ICI社（英国）から取得した。グルタルアルデヒド（Glut）（２５％水溶液）は、Acros Organics社（ベルギー）から取得した。ギ酸は、Merck社（ドイツ）から取得した。エチレンジアミン（EDA）、ポリエチレンイミン（PEI）、３-メチル-２-オキソ酪酸（２-ケトバリン）、ＤＬ-バリン、NADHそしてNAD＋は、Sigma Aldrich社から取得した。
【００６５】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をグルタルアルデヒドと架橋することで、ポリマー粒子を製造した。ポリエチレンイミンの油中水エマルジョンは、予め溶かした状態の２００μlのノノキシノール-４を含む鉱物油４０ｍｌに１０％のＰＥＩを８００μl乳化する方法で調製した（５００ｒｐｍで撹拌する２０ｍｍの電磁撹拌器を用い、１００ｍｌビーカー内で２０分間電磁撹拌した）。第２の油中水エマルジョンも同様に、２０％のグルタルアルデヒド溶液を用いて調製した。２つのエマルジョンは、高速（７００ｒｐｍ）で撹拌しているポリエチレンイミンエマルジョンにグルタルアルデヒドエマルジョンを加えるやり方で混合した。これにより、連続的な撹拌で３０分間反応させることができた。
【００６６】
ポリマー粒子は、２０００×ｇで１０分間の遠心分離を行って回収した（Sorvall, RT7）。そのポリマー粒子を４５ｍｌの脱イオン水で４回洗浄した。洗浄作業の間に、先に述べた例と同様の遠心分離によって回収を実行した。そして、生成物は、１０ｍｌに再懸濁した。この溶液（１ｍｌ）をエッペンドルフチューブに等分して、以降の実験に使用した。
【００６７】
１０ｍｇ.ｍｌ−１を含んだ各タンパク質（ギ酸塩デヒドロゲナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ）のタンパク質溶液を調製した。その後、これら２つの溶液（各溶液２００μl）を混合し、ポリマー材料とインキュベートした。この溶液は、逆さまにして混合し、緩やかに揺動しながら３０分間反応させた。固定化酵素を含む粒子を、後述の方法を用いて、活性度測定のために分析評価した。
【００６８】
粒子は、脱イオン水で洗浄し、上述したやり方で回収した。粒子は、１００μlの PEG20000-NADH（ドイツ、ユーリッヒのJulich Fine Chemicals社から取得）と混合し、緩やかに揺動しながら室温で２時間インキュベートした。その後、この溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥による生成物を、２ｍｌの水で２回洗浄し、遠心分離によって回収した。それから、粒子を、１００ｍｇのリジンを含んだ１００ｍＭのTris-Cl緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌに再懸濁して、粒子上の余剰のアルデヒド官能基を抑制（quench）し、室温で１時間インキュベートした。そして、粒子を２ｍｌのTris-Cl緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８.０）で５回洗浄した。その後、このサンプルに対しては、１ｍｌの再利用試薬を用い、再利用能力に関する検査をした。サンプルは、サイクルとサイクルとの合間に２ｍｌ量の水で３回洗浄した。そしてサンプルを分析したが、これは、後述するやり方でアミノ酸ＴＬＣとＨＰＬＣとからバリンを製造するためである。
【００６９】
これらの粒子を反応させ、再利用して、後続の反応のための新しい反応媒体とした。
（試薬の再利用）
バリン生成を目的としたPEG-20000-NADHの再利用のための試薬は、５０ｍＭのギ酸塩（ナトリウムギ酸塩１Ｍ株（stock）から出たもの、ｐＨ８.０）、５０ｍＭのTris-Cl緩衝液（ｐＨ８.０）、５０ｍＭの酒石酸アンモニウム、そして１０ｍＭの２-ケトバリンから成るものとした。この試薬の組成を、PEG NADHが再利用された場合に確実にバリンのみが生成されるように公式化（formulated）した。
（分析法）
アミノ酸ＴＬＣを、Ｆ２５４シリカゲルプレート（Merck社）で実施した。使用した移動相は、氷酢酸に対してエタノール９：１であった。アミノ酸（バリン）は、アセトン中にニンヒドリン２％の溶液を用いて染色した。バリン（Ｒｆ０.４９）とアンモニア（Ｒｆ０.３１）とが適当に分離したことが明らかに見て取れるまで、プレートを１２０℃で加熱した。
【００７０】
ＨＰＬＣは、アミノ酸の測定のために、ＯＰＡ誘導化法（ｏ-フタルアルデヒド試薬）を用いて実行した。サンプルは、インライン誘導化した。また、バリン標準（valine standards）を含めた。
（結果）
反応および再利用は、ＴＬＣデータによれば成功であり、連続的な粒子触媒反応の全てについてバリンスポット（valine spot）が形成された。６回の連続的な１６時間反応サイクルのそれぞれにおいて、粒子として、１０ｍＭのケトバリンを４８、３５、５９、４３、３３、２９％のいずれかの割合でバリンに変換したものを用いた。これによって肯定的なＴＬＣ結果が確認され、ＨＰＬＣ ＯＰＡ法を用いて定量化できた。
【００７１】
この例が示すのは、酵素粒子マトリックスでの補因子の捕捉によって、酵素は補因子を利用して官能基を維持でき、そして、捕捉された補因子は再利用できる、ということである。
（例１７：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子を有する粒子による抗体の結合）
本例で示すのは、粒子への抗体や抗原の結合である。抗体や抗原が結合された場合には、固定化された抗体または抗原を介したタンパク質の親和性結合に対する粒子の適合性が示される。さらに、診断用途（例：ELISA）に対する粒子の信頼性が示される。
【００７２】
ポリエチレンイミン（Ｐ３１４３；５０％水溶液）、等級IIのグルタルアルデヒド（Ｇ６２５７；２５％水溶液）、鉱物油（Ｍ８４１０）、抗原マウスインターロイキン２（Ｉ０５２３−２０ＵＧ；ＳＬ０６０９２）、そして、Streptomyces avidinii由来のマーカー酵素ストレプトアビジン−ペロキシダーゼ（Ｓ５５１２−２５０ＵＧ；ＳＬ０５１８１）は、Sigma-Aldrich社から取得した。主要な抗体であるラットアンチマウス（rat anti-mouse）インターロイキン２（ＩＬ−２）ＭＡＢ（Ｉ７６６３−２７Ｋ１； Ｌ６０８０８０１）と、補助的な抗体であるラットアンチマウスインターロイキン２（ＩＬ−２）ビオチンＭＡＢ（Ｉ７６６３−２７Ｍ５；Ｌ６０８０８０３）とは、USBiologicals社から取得した。塩化ナトリウム（Ｓ７６５３）、二塩基のリン酸ナトリウム（Ｓ０８７６）、一塩基のリン酸ナトリウム（Ｓ０７５７）、過酸化水素（２１６７６−３）、ツイン２０（Ｐ９４１６）、そして塩酸（Ｈ１７５８）は、Signa Aldrich社から取得した。２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンズチアゾリン-６-スルホン酸）（１０１０２９４６００１）はRoche社から取得した。
（粒子の調製）
架橋ポリエチレンイミン粒子は、例２（サンプルＧ）に従って調製した。試薬に対して唯一行った調整は、ポリエチレンイミン溶液を１０％に希薄する前にＨＣＩでｐＨ９にしたことである。実験は４倍に直接拡大して行った。従って、乳化した反応体それぞれ８００μlと共に溶解したＮＰ４を２００μl含んだ２０ｍｌの鉱物油が必要であった。結果として生じる架橋ポリエチレンイミン粒子を、５０ｍｌの脱イオン水で６回洗浄し、洗浄と洗浄との合間に５０００×ｇで５分間遠心分離する、というやり方で鉱物油から回収した。粒子ペレットは、その後、脱イオン水で１０ｍｌの量に再懸濁し、実験Ａ〜Ｆに５００μlずつ使用した。
（タンパク質の固定化）
各実験には、下の表９に示すように文字を割り当てた。各種のタンパク質の追加は、表９で実験の下側の欄に示す手順で実行した。各実験について、第１のタンパク質成分の固定化は、１０分毎にサンプルを逆さまにして充分な混合が行われることを確実にしつつ、４℃の脱イオン水で１時間かけて実施した（表９の順次追加ステップの１）。粒子は、１ｍｌの脱イオン水で３回洗浄し、上述したやり方で回収した。
【００７３】
それに続くタンパク質結合、タンパク質処理（表９の第２列から第５列の処理）は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（結合緩衝液）を含んだ１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６.８）で実施した。この結合は、充分な混合を確実にするために５分ごとにひっくり返しながら、３７℃で３０分間実行した。タンパク質結合が終わる度に、サンプルは、１０分間緩やかに揺動させながら（IKA Vortex Genius使用、設定２）、ツイン２０を０.０５％含んだ１ｍｌの結合緩衝液で２回洗浄し、非特異的なタンパク質相互作用を抑制した。順次行うステップの合間々々に、５０００×ｇで５分間遠心分離を行って粒子を回収した。タンパク質処理の各ステップ（表９）に関して追加したタンパク質の量は、以下の通りである。アルブミンは５ｍｇ；ラットアンチマウスインターロイキン２ＭＡＢ（A-IL２-MA）は５０μg；ラットアンチマウスＩＬ２ＭＡＢビオチン（B-A-IL２-MA）は２５μg；インターロイキン２（IL-２）は２ｕｇ；ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（strep-perox）は１０μg。これらの量のタンパク質を１ｍｌの結合緩衝液で調製した。
（表９：実験Ａ〜Ｆのタンパク質結合の手順）
【００７４】
【表９】
（分析評価）
ペルオキシダーゼ分析評価試薬は、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６.８）に、２ｍＭのＡＢＴＳと２ｍＭの過酸化水素とを含んで成るものとした。分析評価値は３回繰り返して測定し、１ウェル（well）につき２００μlの試薬と５０μlの粒子懸濁液とを用い、３０℃において、Powerwave HT マイクロプレート分光光度計（Biotek Instruments社）で４２０ｎｍの値を計測した。
（結果）
抗原に対する抗体の結合は、実験Ｂ（図１２）で評価した。この実験では、粒子表面への主要な抗体（A-IL２-MA）の結合、それに続く抗原（IL-２）の結合、粒子への補助的な抗体（B-A-IL２-MA）およびストレプトアビジン−ペロキシダーゼの結合について、結合が成功したと解釈しうる肯定的な反応が示された。これは、マイクロプレートのウェルなどの表面で実行されるsandwich-ELISAに類似している。実験Ｃは、抗原が粒子の表面に結合され、その後、抗体結合のための認識要素（recognition element）として用いられることを示す。これらの実験は、各種の対照例（control）と比較して見た場合、粒子を抗体または抗原の結合に用いることが可能であることを示している。
【００７５】
実験Ａは、主要な抗体が固定化された状態の粒子に対し、補助的な抗体（B-A-IL2-MA）またはストレプトアビジンペルオキシダーゼが非特異結合することを示すための対照例である。Ｂと比較して反応が低いことは、粒子に対する補助的な抗体の結合を抗原（IL-２）が強化することを示す。実験Ｄ，Ｅは、アルブミンを抑制処理(quenching)した後の粒子に対し、主要な抗体（A-IL２-MA）や補助的な抗体（B-A-IL2-MA）が非特異性結合することを示すための対照例である。実験Ｆは、非処理の架橋ポリエチレンイミン粒子に関するものであり、分析評価の対照用に用いた。
【００７６】
本例は、粒子が、抗原または抗体にとって適当な固定化支持体であることを示す。更に強調しておきたい点は、抗原に対して抗体が、抗体に対して抗原が、それぞれ親和相互作用によって固定化されることである。従って、本例は、親和クロマトグラフィおよび診断法（酵素結合免疫吸着検査法など）に、当該支持体が適用できることを示している。
（例１８：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子の粒子への磁鉄鉱の組み入れ）
化学伝達物質および補因子を粒子に含ませる処理についてはすでに示した。本例では、粒子に磁性粒子を含ませる処理について示す。
（粒子の調製）
粒子は、上記の例１７に従って調製し、各エマルジョンについて鉱物油が２５ｍｌになるよう線形的に数値を大きくした。乳化の前に、１０％のポリエチレンイミン溶液（ｐＨ９.０）に磁鉄鉱（２５０ｍｇ）を含ませた。架橋したポリエチレンイミン粒子を、５０ｍｌの量の脱イオン水で６回洗浄し、洗浄ステップの合間に、５０００×ｇで５分間遠心分離して鉱物油から回収した。続いて、粒子ペレットを脱イオン水で１０ｍｌの量に再懸濁し、５００μlのエチレンジアミンと３０分間反応させることで、陰イオン交換のために官能化した。次いで、球体を、５０ｍｌに３等分した脱イオン水で洗浄し、上述したように遠心分離を行って回収した。最終的に得られたペレットは、脱イオン水で１０ｍｌに再懸濁し、後述するアルブミン結合実験に使用した。粒子の乾燥重量は、１０ｍｌの粒子懸濁液を１ｍｌずつに等分したものを凍結乾燥および重量測定するやり方で、３回繰り返して測定した。
（タンパク質の結合および定量化）
上記の等分した懸濁液から得た粒子を、磁気スタンド（Magnetic Separation Stand （Promega社; Z5332))で磁気分離して回収し、液体は除去した。その粒子を２ｍｌのTris-Cl緩衝液（ｐＨ７.４）（５０ｍＭ）で２回洗浄して平衡化した。そして、粒子にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えて、最終的な濃度を２０ｍｇ.ｍｌ-１とした。タンパク質のイオン結合を、室温において３０分間、回転混合することで生じさせた。混合物は磁気スタンド内に配置して、磁化された樹脂を反応管の側壁に保持させた状態で、サンプルからの液体が除去されるようにした。樹脂は、５０ｍＭの Tris-Cl（ｐＨ７.４）１ｍｌ で５回洗浄し、前述した磁気保持器（retainer）によって回収した。５０ｍＭ のTris-Cl（ｐＨ７.４）に入れた１ＭのNaCl５００μlを２回追加することで、イオン結合されたＢＳＡを樹脂から抽出した。
（タンパク質定量化）
溶出した分のタンパク質は、メーカの指示に従って、Qubit Fluorometer（Invitrogen社）で、Quant-iT分析評価を用いて定量化した（表１０）。
（結果）
（表１０：磁鉄鉱含有粒子へのアルブミンの結合（３回分データの平均））
【００７７】
【表１０】
この結果が示すのは、磁鉄鉱を粒子に取り込めば、粒子の磁気特性を利用して粒子を懸濁液から効果的に分離できる、ということである。更に、上記の結果は、本支持体が効率の良いイオン交換樹脂として使用できることを示している。ここで提示する例では、アミン（エチレンジアミン）などの正荷電分子で粒子マトリックスを修飾することで、粒子を陰イオン交換樹脂として使用することができる。また、カルボキシル含有分子などの負荷電分子を用いれば、陽イオン交換樹脂としての使用が可能である。
【００７８】
本例は更に、格子内に磁性粒子を含ませる方式の別の回収方法の例を提供する。その方法では、磁場の利用によって粒子を引きつけることができる。
本発明の粒子は、架橋剤によって架橋されたポリマー鎖または繊維の格子と、隣接して繊維を囲む格子間の開口領域または空間とを有する。言い換えると、本発明が提供するのは、繊維相互貫入網目粒子であり、好ましい構成として、グルタルアルデヒド架橋したポリエチレンイミンから構成または製造されている。この粒子は、酵素固定化マトリックスとして利用できる。
【００７９】
粒子は、本発明の第２、第３の様態によるエマルジョンベースのテクノロジーまたは技術を用いて製造するのが好ましい。エマルジョンベースのテクノロジーを用いれば、粒子のサイズに関する制御（例えば、粒子における体積と表面積との比率）や所定の粒径分布を実現できる利点があると共に、粒子を単一ステップで合成できるという効果もある。本粒子は、固定化に利用できる表面積が大きくなるため、大小の基質の生体触媒にも利用できる（ただし、それに限定はされない）。この酵素固定化マトリックスは、固定化効率が高く、固定後の酵素の活性度も高く保たれる。
【００８０】
樹枝状粒子の繊維の性質として、酵素の結合に役立つ内部表面積が大きくなる。また、酵素サブユニットごとの利用可能な結合点の数が大きいため、タンパク質の安定化は、主鎖支持体の材料（例えば、ＰＥＩそれ自体）と比較した場合、大幅に改善する可能性がある。これを、ゆるい格子または網目と組み合わせた場合、生体触媒付加後の重量に対する活性度の比率を高めることができるが、それは、固定化に有用な露出表面積が大きいこと、そして、大小の基質について分散制約が限られていることによる。更に、粒径の制御によって、基質の分散制約をより小さくすることができる(それが本固定化マトリックスの障害となる場合)。
【００８１】
粒子の調製方法には、同相で架橋剤が存在する場合、存在しない場合について、主鎖支持体または格子を乳化する処理が含まれる。上述の２エマルジョンシステムを製造に用いるのが望ましい。架橋剤が第１のエマルジョンに含まれない場合、架橋剤は、油相に溶かしてもよいし、前記架橋剤を含んだ第２のエマルジョンを混合する形で取り込んでもよい。
【００８２】
好ましい製造方法には、エマルジョンの中で主鎖ポリマー（ポリエチレンイミン）を別個に乳化する処理が含まれるが、その場合は、第２のエマルジョンに少なくとも２官能基の架橋化学物質（グルタルアルデヒド）を入れておく。ポリマーと架橋剤との間の自然反応の結果、繊維の格子または網目が生じるが、この場合、余剰のアルデヒド官能基が含まれている。続いて、その余剰のアルデヒド官能基を用いて、アミンアルデヒド交差反応性を介したタンパク質の格子または支持体への自然発生的な共有結合連結が実現される。このアルデヒドの官能基については更に、別の化合物と連結すること、あるいは、疎水性などの他の特性をもたらすことにすれば、より広い範囲のタンパク質（例：疎水性タンパク質）の結合にまで用途を拡大するものと推測される。
【００８３】
マトリックスにタンパク質を固定化することにより、酵素の溶媒安定性、熱安定性、ｐＨ安定性は高まる。こうした安定は、樹枝状支持体へのタンパク質固定化の後で支持体を乾燥させれば、更に強化される。この乾燥処理によって、交差反応性を有する化学官能基が近接する状況が少なくなるので、その結果、「タンパク質−主鎖」および「主鎖−主鎖」の更なる自然発生的な化学結合（chemical coupling）が引き起こされると考えられる。さらに、乾燥処理の間に添加物がマトリックスに捕捉されるが、これは、孔サイズの制御や、機能分子または補助剤の捕捉に役立つ可能性がある。本発明の粒子であれば、タンパク質担持を高めることができる（すなわち、小さな粒子体積に対して比較的大量のタンパク質を担持することができる）。
【技術分野】
【０００１】
本発明はエマルジョン由来粒子に関する。また、本発明は当該粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
固定化酵素を含んだ粒子が通常用いられるのは、バイオ触媒や診断などの用途である。しかしながら、出願人の知る粒子は、充分な酵素固定化を実現するには表面積が足りないという問題を抱えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】欧州特許第０ ５３４ ０５７号明細書
【特許文献２】国際公開第０２／２９４０６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明が目的とするのは、この問題を少なくとも軽減できる粒子を提供すること、および、タンパク質に対する結合容量が大きくタンパク質を固定化できる粒子の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明の第１の様態として、架橋剤によって架橋されたポリマー鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマー鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有するエマルジョン由来粒子であって、タンパク質または修飾タンパク質と反応することで、当該タンパク質または修飾タンパク質を格子に結合させ、固定化する、というエマルジョン由来粒子を提供する。
【０００６】
「エマルジョン由来」とは、粒子がエマルジョン技術を用いて製造または形成されたことを意味し、当該エマルジョン技術としては、本発明の第２、第３の様態によるエマルジョンベース（emulsion based）の手法がある（ただし、これらに限定はされない）。
「修飾（modified）タンパク質」は、化学的手段（例えばジアルデヒドの追加）によって修飾されたタンパク質、あるいは、遺伝子レベルで（例えばｈｉｓタグを用いて）修飾されたタンパク質を意味する。
【０００７】
従って、本発明の粒子は、鎖状（strand）あるいは繊維状（fiber）のポリマーに、または架橋剤に官能基を含み、タンパク質または修飾タンパク質を官能基と反応させることができる。より具体的には、官能基は、鎖状あるいは繊維状のポリマーに存在しており、タンパク質または修飾タンパク質のポリマーへの結合が、ポリマー上の官能基を変更する形で共有結合、イオン結合、疎水結合、親和結合のうち１または複数で成されるように選択される。
【０００８】
そうして、粒子は、官能基によってポリマーに結合され、それによって固定化されるタンパク質または修飾タンパク質を少なくとも１つ含む。タンパク質については、単一の酵素または酵素の混合物、抗体または抗体の混合物、抗原または抗原の混合物、または、機能的特性または構造的特性を備えた他のタンパク質とすればよい。すなわち、必要に応じて、複数の異なるタンパク質や複数の異なる修飾タンパク質を、粒子内部で固定化できる。タンパク質が酵素である場合、本粒子は、酵素の最適ｐＨを酸性域またはアルカリ性域にシフトすることを可能にする手段を提供する。これは粒子内での酵素の固定化による。
【０００９】
タンパク質または修飾タンパク質をポリマーに共有結合する場合、これは、例えば、エポキシド、アルデヒドをタンパク質または修飾タンパク質のアミン基と相互作用させることで達成される。
タンパク質または修飾タンパク質をポリマーにイオン結合する場合、これは、ポリマー上で正または負に帯電した官能基を、タンパク質または修飾タンパク質上で前記官能基と反対に帯電されたアミノ酸残基とイオン結合させることで達成される。
【００１０】
タンパク質をポリマーに疎水結合する場合、これは、ポリマー上の芳香族アルカンまたは長鎖アルカンの疎水基とタンパク質上の疎水性アミノ酸とが結合することで達成される。
タンパク質をポリマーに親和性結合する場合、これは、二価金属またはアビディンといった親和性タグが、ヒスチジンまたはビオチン化タンパク質を結合することで達成される。
【００１１】
当然のことながら、粒子には、タンパク質のより効率的な結合のために、必要に応じて上記の種類またはカテゴリーの官能基を複数含ませてもよい。
鎖状または繊維状のポリマーは、ホモポリマーとしてよいし、ポリエチレンイミンとしてもよい。
架橋剤は、グルタルアルデヒドまたは他のアルデヒド、エポキシド、あるいは、複数の官能基を有する他の適当な化合物とすればよい。
【００１２】
粒子は、格子の開口領域や空間の内部に捕捉された補助剤を含む。補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択すればよい。適当な酵素または基質を補助剤として粒子に含ませれば、反応に用いる補因子の連続的な再生を達成でき、それによって、反応を平衡状態に到達させたり、あるいは反応を完了させたりすることができる。補助剤として磁鉄鉱または磁性物質を含ませれば、形成液状媒体からの粒子の回収は、磁気分離を用いて速やかに行える。
【００１３】
また、本発明の第２の様態として、第１の液相の液滴が第２の液相内に分散したエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中には溶解したポリマーおよび架橋剤が含まれるという状態で製造する処理と、架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、を特徴とする粒子生成方法を提供する。
【００１４】
第１の液相は水相であり、従って第２の液相は油相となる。よって、エマルジョンは油中水分散型（water（ｗ）-in-oil（ｏ））のエマルジョン（すなわちｗ／ｏエマルジョン）となる。しかし、本発明の別の実施の形態では、エマルジョンを、水中油分散型（oil-in-water（ｏ／ｗ））エマルジョン、水中油分中に水が分散した型（water-in-oil-in-water（ｗ／ｏ／ｗ））のエマルジョン、あるいは、油中水分中に油が分散した型（oil-in-water-in-oil（ｏ／ｗ／ｏ））のエマルジョンとすることもできる。
【００１５】
本エマルジョンは、第１のエマルジョン（水滴で成り、その中にポリマーが溶けて油相で分散した状態で含まれるもの）を、第２のエマルジョン（水滴で成り、その中に架橋剤が溶けて油相で分散した状態で含まれるもの）と混合する方法で形成できる。
また、本発明の第３の様態として、第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第１のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解したポリマーが含まれているという状態で製造する処理と、第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第２のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解した架橋剤が含まれるという状態で、第１のエマルジョンと併せる処理と、架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、を特徴とする粒子生成方法を提供する。
【００１６】
相のうち少なくとも１つは、界面活性剤（detergent、surfactant）を含む。界面活性剤は、両性イオン界面活性剤、中性界面活性剤、荷電界面活性剤またはポリマー界面活性剤から選択すればよい。陰イオン界面活性剤としては、アルキル硫酸塩（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、アルキルエーテル硫酸など）がある。陽イオン界面活性剤としては、セントリモニウムクロリド（centrimonium chloride）がある。非イオン物質の界面活性剤としては、エトキシ化アルキルフェノール（ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルシクロヘキシルエーテル（Triton X100）、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル（ノノキシノール-９）など）がある。両性または両親媒性の界面活性剤としては、デシルベタイン（decyl betaine）がある。ポリマー界面活性剤としては、ソルビトール−（エチレンオキシド）８０、エチレンオキシド−プロピレンオキシド−エチレンオキシドのトリブロックコポリマー（これは、ポロキサマーとしても知られ、Pluronicの商品名でＢＡＳＦ社から入手できるものなどがある）、そして、プロピレンオキシド−エチレンオキシド−プロピレンオキシドのトリブロックコポリマー（メロキサポールとしても知られるもの）がある。
【００１７】
油相の油は、少なくとも原則上は、水と混和しない何らかの適当な有機溶剤、植物油、鉱物油、石炭または原油由来の油相成分（oily component）、または合成油であればよい。しかしながら、鉱物油、パラフィン、溶剤（イソオクタンなど）から選択するのが好ましい。
これまでに述べた通り、ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、架橋剤は、二官能基または多官能基のアルデヒド（グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、デキストランアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、グリオキサールなど）である。他の適当な架橋剤を、ＰＥＩまたは誘導化ＰＥＩ、あるいは他のポリマーに対して使用する場合もある。イソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネート、またはイソチオシアネートを含む）；エポキシド（２-クロロメチルオキシランなど）；無水物；エピクロルヒドリン,１-エチル-３,３-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド；エチルクロロアセテート、または、それに類するものが挙げられる。タンパク質または修飾タンパク質の固定化には未反応の官能基が用いられるので、架橋剤は、ポリマー修飾または架橋後（post cross-linking）修飾のための誘導（derivitization）剤とも見なされるであろう。他のポリマーまたはコポリマーを用いることもでき、そうしてものとしては、ポリビニルアルコール、ナイロン、アルギネート、その他タンパク質（アルブミン、コラーゲン、それに類するもの）、およびそれに類するもの（修飾されたもの、修飾されていないもの）がある。
【００１８】
本方法には、タンパク質（酵素、抗体または抗原、または修飾タンパク質）を粒子内または粒子上に導入する処理が含まれる場合があり、それによって、タンパク質または修飾タンパク質は、上述したように、ポリマー鎖または繊維において、または架橋剤において官能基と反応し、その結果、鎖状または繊維状のポリマーに、または架橋剤に結合されることで固定化される。
【００１９】
本方法は、相の１つに補助剤を加えて、補助剤を粒子の格子の内部に捕捉させる処理を含む場合がある。また、格子へのタンパク質の結合の前または後に補助剤を更に追加する場合がある。上述したように、補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択される。
また、本方法には、粒子を油相から回収する処理が含まれる場合がある。具体的には、粒子の回収は物理的な分離手段（遠心分離や濾過）で実行する。
【００２０】
また、本方法には、回収した粒子の乾燥処理が含まれる場合がある。粒子の乾燥処理としては、アセトン脱水、空気乾燥、噴霧乾燥、そして、好ましいものとして、凍結乾燥または真空乾燥がある。
なお、上述したとおり、本方法は、回収した粒子に乾燥処理に先立って補助剤を加える処理を含む場合があり、そうすると、補助剤は粒子の格子の内部に捕捉されることになる。
【００２１】
回収した粒子の乾燥処理は、タンパク質固定化の前後いずれであっても、タンパク質および粒子の安定化促進の達成、または、天然補因子や修飾補因子といった添加物の捕捉に関して効果がある。乾燥処理によって更に、多点結合によるタンパク質または修飾タンパク質の架橋状態の改善という結果が得られる。そして、これにより、酵素などのタンパク質の安定性が向上することになる。
【００２２】
また、本発明の粒子には多様な用法や用途があると考えられる。例えば、生体触媒用、酵素ベースの生物機能を利用した環境修復、診断に用いられる。また、膜反応器やタンパク質固定化マトリックスといった固体支持体の表面に結合させて表面積を大きくするのに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】例１によるグルタルアルデヒド架橋ＰＥＩポリマー粒子の顕微鏡写真であり、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子（support lattice）または網目主鎖（network backbone）を示す図である。
【図２】例２による、繊維格子に結合するラッカーゼに関して得られた結果を示すグラフであり、ｐＨプロフィール（profile）のシフトに関して結合効率の補正を行った場合の図である。
【図３】各種の油相を用いて製造した粒子の粒径分布（平均粒径）の分析結果を示す図であり、粒子を乾燥させなかった場合（湿った状態）、乾燥させた場合（凍結乾燥を採用）、インライン（in-line）超音波照射（ＵＳ）を伴う場合、超音波照射で前処理した後に測定した場合、について示す図である。
【図４】各種の界面活性剤を用いて製造した粒子の粒径分布の分析結果を示す図であり、そのままの状態で光散乱によって測定した場合と、超音波照射後（ＵＳ後）の分析で求めた場合とを示す図である。
【図５】単一エマルジョンを用いて製造した乾湿両粒子について粒径分布を示す図であり、結果は３回繰り返して行った実験の標準偏差を示しており、そのままの状態での光散乱によって測定した場合と、インライン超音波照射を伴う場合と（「ＵＳと共に」）、サンプルに事前超音波照射した後の分析で求めた場合（ＵＳ後）とを示す図である。
【図６】２０ｍｌの量の鉱物油と２００ｍｌの量の鉱物油とで製造した乾湿両粒子について粒径分布を示す図である。
【図７】潜在的な保護剤としての基質を有する場合と有していない場合とで、粒子に結合された各種酵素の活性度の維持状態を示す図である。
【図８】自由（free）ラッカーゼ結合粒子および乾湿両ラッカーゼ結合粒子に関する温度最適条件を示す図であり、（Ａ）はＰＥＩがｐＨ８で製造された場合、（Ｂ）はＰＥＩがｐＨ１１で製造された場合を示す図である。
【図９】ＰＥＩがｐＨ８、ｐｈ１１で製造された乾湿両方の粒子結合ラッカーゼおよび自由ラッカーゼについてｐＨ安定性（６時間）を示す図である。
【図１０】（Ａ）は、例１４による、後処理していない繊維格子または網目における、固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、ポリエチレンイミン（‘ＰＥＩ’）濃度の変化がｐＨプロフィールのシフトに与える影響を表す図であり、（Ｂ）は、例１４による、後処理していない繊維格子または網目における固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、グルタルアルデヒド濃度の変化がｐＨプロフィールのシフトに与える影響を表す図である。
【図１１】（Ａ）は、グルタルアルデヒド後処理した繊維格子または網目における、固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、ＰＥＩ濃度の変化がｐＨプロフィールのシフトに与える影響を表す図であり、（Ｂ）は、例１４により、グルタルアルデヒド後処理した繊維格子または網目における、固定化酵素および自由酵素のラッカーゼｐＨプロフィールを示しており、グルタルアルデヒド濃度の変化がｐＨプロフィールシフトに与える影響を表す図である。
【図１２】実験Ａ〜Ｆに関する粒子のペルオキシダーゼ活動度について得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ここから、本発明について、後述の実施の形態および添付図面を参照しながら、より詳細に説明する。
（例１：ポリマー鎖／繊維の網目または格子からなる粒子の製造方法）
本方法で形成される油中水分散エマルジョンは、その内部で、ポリアミンポリマー（ポリエチレンイミン)を含むエマルジョンと別の主要なアミン架橋剤（グルタルアルデヒド）とが組み合わされる。２つの試薬が反応して、微細な粒子または粒の形をしたポリマーを形成する。
（使用化学物質）
グルタルアルデヒド（２５％の水溶液）は、Acros Organics社（Geel West Zone 2, Jansen Pharmaceuticalaan 3a, ２４４０ ゲール, ベルギー）から入手した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（５０％の水溶液、カタログ番号Ｐ−３１４３、Ｍｗ７５０，０００およびＭｎ６０，０００）は、Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州 ６３１７８）から取得した。鉱物油（医薬用ホワイトオイル、４８０３１）は、Castrol社（８ ジャンクションアベニュー、パークタウン、２１９３ ヨハネスバーグ、南アフリカ）から購入した。
（粒子の製造方法）
（エマルジョンＡの組成）
・１０ｍｌの鉱物油（油相）
・０.０５ｍｌのノノキシノール−４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのポリエチレンイミン（ポリアミン）、（１０％ｍ／ｖ水溶液）、ｐＨ１１
７００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
（エマルジョンＢの組成）
・１０ｍｌの鉱物油（油相）
・０.０５ｍｌのノノキシノール−４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのグルタルアルデヒド、（２５％ｍ／ｖ、等級（grade）II）
７００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
【００２５】
２つのエマルジョン（Ａ、Ｂ）を組み合わせると、ポリマー架橋反応を生じさせることができた。そして、電磁撹拌器を用いて７００ｒｐｍで３０分〜１時間撹拌することで、エマルジョンの状態は確実に維持された。その後、JA20.1ロータを備えたBeckman-Coulter J2-21MEに入れて１０分間、エマルジョンを３０００ｒｐｍで遠心分離し、形成された粒子を回収した。ペレットは、脱イオン水に再懸濁して１０〜４０ｍｌまで希釈した後、再び遠心分離した。そして、この洗浄工程を更に２回繰り返した。最終的に得られた上澄みは澄んでいた（clear）。そして最終的に残ったペレットは、１０ｍｌのTris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に懸濁した。
（結果）
全てのエマルジョン調製で得られる材料を、遠心分離によって回収し、光学顕微鏡検査によって視覚化した。図１に示すのは格子形成の結果であり、おおよそ球状の粒子が形成されたことを示している。
（ＰＥＩ対グルタルアルデヒドの濃度比が粒子形成に与える影響）
グルタルアルデヒドに対するＰＥＩの比率が粒子形成に与える影響を調査した。サンプルは表１に従って調製した。
【００２６】
乾燥重量の測定は、繊維主鎖格子／支持体の凍結乾燥および重量計測という手順で行った。この実験の結果は表１に示してあり、幅広い反応体の組合せで粒子が形成されることを示している。
表１：繊維ポリマー主鎖の製造評価に使用するＰＥＩおよびグルタルアルデヒドの量
【００２７】
【表１】
（例２：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖へのラッカーゼの結合）
（酵素）
DeniLite（登録商標）（ラッカーゼ）は、Novozymes社（Novozymes A／S、Krogshoejvej ３６、２８８０ バウスベア、デンマーク）から取得した。
（酵素洗浄）
ラッカーゼは、DeniLiteから部分的に精製した。その方法は、２回蒸留した１００ｍｌのＨ２Ｏに５gのDeniLite II Baseを溶かしながら、４℃で１時間、２００ｒｐｍで撹拌するというものであった。懸濁物質は、Beckman-Coulter J2-21ME遠心分離機のJA14ロータを用い、４℃で１時間、１００００ｒｐｍで遠心分離を行って除去した。上澄みを取り除き、１０ｋＤａカットオフ機能を備えたSnakeSkin（登録商標）（Pierce社）透析管を用いて、４℃の水５Ｌを３回交換して透析した。最初の２回の交換までの透析は２時間継続し、最後の透析は１２時間継続した。酵素は、液体窒素の中で凍結させて凍結乾燥した。その後、このラッカーゼは、必要になるまで４℃で保管した。
（ラッカーゼの分析評価）
ラッカーゼの分析評価は、ラッカーゼを支持体に結合した後の遠心分離による上澄みと、支持体に固定化されたラッカーゼとを対象に実施し、結合時の活性度の維持状態を測定した。ラッカーゼ試薬は、基質としての１ｍＭのグアヤコールを、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）の中に含むものとした（Jordaan J，Pletschke B，Leukes W（著）、２００４年、（題名）“Purification and partial characterization of a thermostable laccase from an unidentified basidiomycete.”（掲載誌）Enz. Microb. Technol. 34:635-641）。分析評価は、５ ２００Ｍ−１.ｃｍ−１の減衰係数で、４５０ｎｍにおいて３回繰り返して実施した。分析評価の実施には、PowerWave HT Microtitreプレートリーダを用いた。酵素の単位は、１分につき１μｍｏｌの基質を酸化させるのに必要な酵素量を１単位として定めた。
（タンパク質の測定）
タンパク質担持（protein loading）後に、ラッカーゼを基準タンパク質とし、２８０ｎｍでの光吸光を利用して溶液中のタンパク質濃度を測定した。溶液中の残留タンパク質をタンパク質全体から差し引いたものを、結合されたタンパク質と見なした。
（酵素固定化）
室温で３０分間緩やかに揺動して、酵素（ラッカーゼ）（１０ｍｇ.ｍｌ−１溶液で１ｍｌ）を支持体に結合させた。このとき、酵素は、表２に示す乾燥重量を持つ主鎖と結合した。ラッカーゼと結合した粒子は、７００×ｇで５分間遠心分離を行って回収した。固定化された酵素は、５０ｍｌの水で５回洗浄し、上述したような遠心分離を行って回収した。
【００２８】
タンパク質（この場合は酵素であるラッカーゼ）は、緩衝液の形でＰＥＩ-グルタルアルデヒド粒子（誘導化したもの、あるいは、誘導化していないもの）に加えた。粒子は例１で示した形で調製した。粒子をタンパク質と反応させて、上述したように、タンパク質をポリマーに固定化することができた。粒子は、遠心分離による回収から使用時まで、乾燥させないようにした。
【００２９】
様々な形で製造したタンパク質支持体にタンパク質を結合した結果を、下の表２に示す。一方、ラッカーゼ活性度に関する結果は図２に示してある。
（結果）
表２：主鎖支持体へのラッカーゼの結合効率
【００３０】
【表２】
別の実験用セットを表１に示す通りに調製した。しかし、本例での粒子はグルタルアルデヒドで後処理してあり、数字の２で区別している（すなわち、Ａ２−Ｊ２）。調製に続き、上述した方法に従ってラッカーゼを粒子に結合した。ラッカーゼが結合した粒子を、７００×ｇで５分間遠心分離して回収した。
【００３１】
ポリマー支持体に担持された酵素の活性に関する結果を図２に示す。
本調査が示しているのは、繊維格子または網目をタンパク質固定化の支持体として用いた場合、タンパク質結合容量が大きいと同時に、タンパク質の機能活性は保たれる、ということである。
（例３：各種の油を用いたポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖の製造方法）
エマルジョンの油相の違いが与える影響を調査した。粒子の製造にあたって、先ず２種類の異なるエマルジョンＡ，Ｂを調製した。
（エマルジョンＡの組成）
・１０ｍｌの鉱物油、パラフィン油またはイソオクタン（油相）
・０.１ｍｌのノノキシノール-４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのポリエチレンイミン（ポリアミン）、（１０％ｍ／ｖ水溶液）、ｐＨ１１
２５℃において、５００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
（エマルジョンＢの組成）
・上述したのと同じ油相１０ｍｌ
・０.１ｍｌのノノキシノール-４（界面活性剤）
・０.５ｍｌのグルタルアルデヒド、（２５％ｍ／ｖ、等級II）
２５℃において、５００ｒｐｍで３０分間、電磁撹拌器を用いて撹拌した。
【００３２】
続いて、エマルジョンＡを短時間でエマルジョンＢに加え、更に１時間撹拌した（７００ｒｐｍ）。そして、Sorvall benchtop遠心分離機によって３０００×ｇで１０分間遠心分離した後、１０ｍｌの量の脱イオン水で６回洗浄するという手順で、エマルジョンから粒子を回収した。洗浄後、最終的に得られた粒子を脱イオン水で２０ｍｌに再懸濁し、その半分を凍結乾燥によって乾燥させた。湿潤粒子（wet particle）および乾燥粒子の両方について、粒径分布を分析した（Malvern Mastersizer 2000使用）。凝塊の存在を調査する目的で、粒径の測定を、インライン超音波処理の前後、そして同処理と共に行った。また、凍結乾燥後の回収量を質量で測定した。
（結果）
異なる油相で製造した粒子（各々の総量は２０ｍｌ）の質量での回収量は、鉱物油、パラフィン油、イソオクタンでそれぞれ１１１ｍｇ、９０ｍｇ、７９ｍｇと測定された。異なる油相で製造し、超音波処理を行わなかった湿潤粒子と乾燥粒子とを比較した結果、鉱物油およびパラフィン油のサンプルについては、乾燥後に粒径の平均値が大きくなったことが分かった（図３）。イソオクタンで製造された粒子は、乾燥処理にもかかわらず比較的変化がなかった。インライン超音波処理およびプレ超音波処理（pre-sonication）では、鉱物油およびパラフィン油で製造し乾燥した粒子の粒径分布に大幅な低下が見られた。それは、乾燥処理した粒子には凝塊が生じるが（図３）、超音波処理によって分解することができた、ということを示している。また、鉱物油およびパラフィン油で作られた湿潤粒子の粒径の分析でも、粒子の超音波処理に伴って粒径の平均値が下がることが示されたが、その幅は乾燥した粒子の場合（図３）に比べれば小さい。イソオクタンで製造した粒子は、乾燥処理や超音波処理にかかわりなく、比較的変化がなかった。
【００３３】
結論としては、様々な油相を用いて粒子を製造することが可能である。また、異なる油相を用いること、ならびに乾燥処理や超音波処理などの各種後処理の技術を用いることで、粒径を操作することができる（油相の違いはエマルジョンの液滴サイズに影響すると推測される）。
（例４：各種の界面活性剤を用いたポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖の製造方法）
粒子の合成では、界面活性剤の種類が影響を与える場合がある。これを調査した。
【００３４】
粒子は、ほぼ例３に従って調製したが、油相としては鉱物油のみを用い、界面活性剤の種類を変えた。
（結果）
鉱物油に各種の界面活性剤を用いて製造した粒子（総量２０ｍｌ）の質量での回収量は、ノノキシノール-４、CHAPS、Triton X-100のそれぞれについて、１１１ｍｇ、７２ｍｇ、９２ｍｇと測定された。CHAPSやTriton X100を用いた場合、異なる界面活性剤で製造した粒子を乾燥処理しても、粒径に実際的な差は表れなかった（図４）。ノノキシノール-４を界面活性剤として製造した粒子を乾燥処理すると、粒径は約５０％大きくなった（図４）。さらに、超音波処理後の粒径分析は、テスト対象の全ての界面活性剤で製造した粒子で、そろって粒径が小さくなったことを示した。超音波処理した粒子の粒径を乾燥処理の前後で分析すると、結果は類似したものとなった。
【００３５】
結論としては、様々な界面活性剤を用いて粒子を製造することが可能であった。さらに、粒径は、界面活性剤の種類および後処理によって操作することができた。
（例５：ポリマー架橋剤として各種ポリアルデヒドを用いた粒子合成）
粒子の合成に用いる架橋剤アルデヒドは、様々に変更することができる。架橋剤としては、グルタルアルデヒド、デキストランアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネートが挙げられる。
【００３６】
粒子を作る方法は、以下の点を除けば、例３と同じである。すなわち、ある場合では、グルタルアルデヒドをデキストランアルデヒド（１５ｍｇ／ｍｌのものを１ｍｌ）と置き換えた。また、別の場合では、０.５ｍｌのヘキサメチレンジイソシアネート（２５％ｖ／ｖ）と置き換えた。
５ｍｌの粒子懸濁液に、Tris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に入れた５ｍｇ.ｍｌ−１の精製カンジダアンタークティカリパーゼＢ（CALB）を６ｍｌ加え、２５℃で１時間緩やかに撹拌した。その後、懸濁液を遠心分離し、４℃の緩衝液１０ｍｌを用いて２度洗浄した。それから、懸濁液を遠心分離し、ペレットを１０ｍｌのTris-Cl緩衝液に再懸濁した。そして、ｐ-ニトロフェニルブチラートを使って懸濁液（１０μｌ）を分析評価した。また、比較のために、Tris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に０.５ｍｇ-ｐｅｒ-ｍｌの精製カンジダアンタークティカリパーゼＢを１０μl入れた場合についても分析したが、これには、ｐ-ニトロフェニルブチラートの加水分解に基づく分析評価と、それに続く分光測光法による分析とを用いた（表３）。
（リパーゼ活性の分析評価）
リパーゼの活性により、ｐ-ニトロフェニルエステル（ｐ-ニトロフェニルブチラート（ＰＮＰＢ））はｐ-ニトロフェノールおよびブチル酸へと加水分解された。ｐ-ニトロフェノールの放出によって黄色が生じ、この黄色は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いれば４１０ｎｍで測定される。活性度の測定は３回繰り返した。溶液の調製は以下のように行う。すなわち、溶液Ａは、８ｍｌのプロパン-２-オールに溶けた形で酵素基質を含むものとした。一方、溶液Ｂは、５０ｍＭのTris-緩衝液（ｐＨ８.０）にデオキシコール酸ナトリウム２６７ｍｇを溶かした後に、６６.７ｍｇのアラビアゴムを溶解させたものとした。動的（Kinetic）分析評価を、PowerWave microtitreプレートリーダ（BioTek Instruments社）を用いて２５℃で実行し、上述した溶液の１対１０（Ａ：Ｂ）の混合物２４０μlと固定化リパーゼ懸濁溶液または自由酵素１０μlとを用いた。
（結果）
（表３：各種のアルデヒド架橋剤を用いて作った粒子の比較−CALBの活性度）
【００３７】
【表３】
この方法は最適化されていないが、ある程度の範囲のポリアルデヒド合成物が使用して粒子を生成できることを示している。
【００３８】
本材料は、０.４５μｍフィルタ（Sartorius社）で回収および再利用することができた。５回の再利用を終えて、グルタルアルデヒド粒子は７.０５Ｕ.ｍｌ−１の平均値を示し、活性度は当初の８１％であった。
類似の実験を、蛍光菌（ＰＦＬ：Pseudomonas fluorescens）由来のリパーゼを用いて実施した。酵素活性度の分析評価には、基質として、ブチル酸のｐ-ニトロフェニルエステル（ＰＮＰＢ）とパルミチン酸のそれ（ＰＮＰＰ）とを用いた。
（表４：各種のアルデヒド架橋剤で作られた粒子の比較−PFLの活性度）
【００３９】
【表４】
各種のアルデヒドを用いることで、粒子形成のための効果的な架橋の実現と、タンパク質を粒子に架橋するための官能基の提供との両方が可能となった。架橋剤の選択は、酵素変性の程度や基質および生成物に対する粒子の接触可能性（accessibility）の程度によって、酵素の活性度に影響を与える可能性がある。最適な架橋剤は、酵素および反応基質に基づいて選択すればよい。
（例６：２官能基エポキシド架橋剤を用いた粒子製造）
粒子の合成に使用する架橋剤アルデヒドは、ジエポキシド（例：１,４-ブタンジオールジグリシジルエーテル）などの他の架橋剤と置き換えることができる。これを（グルタルアルデヒドの代わりに）、５０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖ、１２.５％ｖ／ｖの薄めていない（neat）０.５ｍｌの溶液の形で、架橋剤エマルジョン（Ｂ）に加え、そして、４０℃で２時間反応させた（例３の場合と同様）。エマルジョンからの粒子の回収には、３０００×ｇの遠心分離（Sorvall RT7 benchtop遠心分離機使用）を１０分間行い、その後、１０ｍｌの量の脱イオン水で６回洗浄した。洗浄後、最終的に得られた粒子を脱イオン水で２０ｍｌに再懸濁した。１２.５％ｖ／ｖまたは２５％ｖ／ｖのエポキシド溶液を用いて上記のやり方で調製したものは、形状の点で最も均一であったのに対し、５０％のエポキシドを薄めずに用いて形成したものは、大きく、しかもばらつきがあった。
【００４０】
タンパク質の結合は、（前出の例に従い）ＣＡＬＢを使って調査した。それを一晩（overnight）透析し、エポキシドベースの粒子（１２.５％ｖ／ｖエポキシド溶液を用いて上述の通り調製したもの）と、緩やかに撹拌しながら1時間反応させた。例５で述べたようにリパーゼ結合粒子を回収および洗浄した後、酵素の活性度を分析評価した。全ての分析評価はＰＮＰＢを基質として実施した。
（結果）
ブタンジオールジグリシジルエーテルを架橋剤として使用した結果、直径が約０.１ｍｍの白色粒子が形成された。しかしながら、この粒子は形状がいくぶん不規則であり、これは、架橋または後続のクリーニングの手順で粒子の凝塊が生じたことを示す。
【００４１】
１２.５％ｖ／ｖエポキシド溶液で製造した粒子を、酵素が存在する状態で一晩インキュベート（incubate）した。これらの粒子は、０.２８Ｕ.ｍｌ−１の活性度を示した。これは、エポキシド架橋剤を用いた粒子の製造が可能であることを示す。
（例７：単一のエマルジョンで製造したポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目主鎖）
粒子の形成方法は、必要に応じて調整することができる。例えば、単一のエマルジョンを用いて粒子を形成することもできる。
【００４２】
ポリマーと架橋剤とは、混合チャンバに２重注入を行う装置を用いれば、水相で即座に混合することができる。こうした装置の最も単純な型は、同じポイントで共通のラインに注入を行う２つのシリンジで構成されたものであろう。これは油相への直接注入が可能である。一例として、２０ｍｌの鉱物油に０.２ｍｌのノノキシノール-４を約５分間溶解させ、さらに５００ｒｐｍで電磁撹拌器による撹拌を行う、という設定で評価を行った。一方のシリンジには０.５ｍｌのＰＥＩ（１０％）を入れ、他方には０.５ｍｌのグルタルアルデヒド（２０％、等級II）を入れた。両シリンジを同時に押し込んで、鉱物油に直接注入した。結果として得られたエマルジョンを１時間撹拌し、その後、粒子を例３と同じやり方で回収した。実験は３回繰り返して実施した。粒子は２等分し、その一方は冷凍乾燥し（Virtis使用）、元の量に再懸濁した後、粒径分布についての分析評価を行った（Malvern Mastersizer 2000使用）。サンプルに対し、乾燥後、回収量（質量）に関する分析評価を行った。
（結果）
単一のエマルジョンを用いて製造した粒子の回収量（質量）は１５２±１２ｍｇと算出されたが、その値は、２エマルジョン方式（例３を参照）を用いて得られるものに比べて約１.４倍大きかった。
【００４３】
単一のエマルジョンを用いた粒子形成は可能であり、現行の製造法（図５）を用いて再現可能であった。粒子は、２種のエマルジョンを用いて形成したものに比べ、粒径分布がより広いことが分かった（図５）。単一エマルジョン粒子に関して得られた乾湿の粒径分布は、２エマルジョン実験の場合に得られるもの（図３）に比べ、サイズで、５０〜７０％大きいことが分かった。
（例８：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子の拡大規模での製造）
ここでの目的は、粒子製造の規模を線形的に１０倍に拡大して粒径を評価することであった。別個の２バッチの粒子を、例３で概説した標準的製造方法にほぼ従って調製したが、異なる点として、第２のバッチは必要な構成成分の各々について１０倍の量を含むものとした。両バッチに対しては、規模に応じた形で、例３と同様の粒子回収処理を行った。
（結果）
２０ｍｌ、２００ｍｌの鉱物油量で製造した粒子の回収量は、質量でそれぞれ０.１１１ｇ、１.１１ｇと算出され、ちょうど１０倍の差があった。鉱物油量が２０ｍｌでも２００ｍｌでも粒子を製造することは可能であり、より大きな規模で製造した粒子の粒径は、２０ｍｌの規模で得られるものに比べ、一貫してわずかに小さいだけであった（図６）。興味深い点は、より大きい規模で製造し、超音波処理していない乾燥粒子のサイズが、より小さい規模で製造した乾燥粒子と比べて約５０％小さかったことである（図６）。
【００４４】
回収量（質量）および粒径分析に基づいて言えば、標準的条件での粒子の製造法は、少なくとも１０倍の規模拡大が可能であった。
（例９：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子を用いた広範囲の酵素群の固定化）
ここでの目的は、異なる酵素を粒子主鎖に結合し、それらの結合率（％）と酵素活性度の維持の程度とを算出することであった。
【００４５】
例３に従って製造した粒子を使用した。検査対象の酵素は、ラッカーゼ（Novozymes 51009, ミセリオフトラサーモフィラ）、グルコースオキシダーゼ（Seravac Pty Ltd, アスペルギルスニゲル）、そしてリパーゼ（CALB, Novozymes のカンジダアンタークチカ）であった。各々の実験について、各酵素５ｍｇ（１０ｍｇ.ｍｌ−１で０.５ｍｌ）を１４ｍｇ（２８ｍｇ.ｍｌ−１で０.５ｍｌ）の粒子に結合し、２５℃で２時間緩やかに振盪させた。各サンプルは、Allegra X22R遠心分離機を用いて１０分間遠心分離した（２０００×ｇ）。粒子は、連続して６回洗浄し、各回２ｍｌの脱イオン水を用いた。混ぜ合わせて生じた上澄み部分を分析して、総タンパク質を求めた。個別の酵素結合実験を、各々、潜在的（potential）保護剤として特定の基質を含む場合と含まない場合とで実施した。ラッカーゼの場合、市販の伝達物質Denillite II Assist（Novozymes）を潜在的保護剤とした（１００ｍｇ.ｍｌ−１ （ｐＨ６.８に調整）のものを５０μl）。グルコースオキシダーゼの場合、グルコースを潜在的保護剤とした（１０％ｍ／ｖグルコース一水和物を５０μl）。そして、ＣＡＬＢの場合、２-イソプロピル-５-メチルシクロヘキサール（メントール）の８−ジアステレオ異性体混合物を使用した（５０μl）。粒子は、脱イオン水で２ｍｌに再懸濁した。粒子を分析し、それぞれの酵素の活性度を求めた。全ての分析評価を３回繰り返した。
（総タンパク質）
総タンパク質分析評価は、Bio-Rad Total Protein Assay kit（カタログ番号：500-0006）というキットを用い、個別の酵素を各々基準として用いて実施した。
【００４６】
ラッカーゼの活性度を測定するために、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）に入れた１ｍＭの２,２’-アジノビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）を基質として使用した。溶液の光学濃度は４２０ｎｍで測定した。これらの分析評価は、１８０μlのABTS試薬にサンプル２０μlを加えて実行した。活性度の調査は、PowerWave HT（Biotek Instruments社）を用い、２５℃でインキュベートして、４２０ｎｍで分光測光法によって行った。
（グルコースオキシダーゼ）
グルコースオキシダーゼ（GOX）の活性度は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）によるｏ-ジアニシジンの間接酸化を利用して計測した。分析評価は、Bergmeyer（その他）による方法（１９８８年）に従って実施した。調剤した試薬は以下の通り：（試薬Ａ）ｏ-ジアニシジン-２ＨＣＬ（０.００６％）を含む０.１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）；（試薬Ｂ）Ｄ−グルコースの１０％の水溶液（使用前に１時間変旋光（mutarotate）を生じさせたもの）；（試薬Ｃ）６０Ｕｍｌ−１ＨＲＰ水溶液。試薬Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれを２４：５：１の割合で、グルコースオキシダーゼの分析評価の直前に混合した。反応試薬０.３ｍｌを入れて反応させており、サンプルを１０μl加えることで反応が開始された。反応結果は、２５℃において、４３６ｎｍで動力学的に計測した（Powerwave HT microtitreプレートリーダ使用）。グルコースオキシダーゼの活性度の単位は、２５℃およびｐＨ７で、１分につきに１μmoleのβ-Ｄ-グルコースをＤ-グルコノラクトンとＨ２Ｏ２とに転換するだけの触媒作用を生じる酵素の量を１単位と定めた。
（リパーゼ）
リパーゼの活性により、ｐ-ニトロフェニルエステルはｐ-ニトロフェノールおよび脂肪族カルボン酸に加水分解される。ｐ-ニトロフェノールの放出によって黄色が生じ、この黄色はＵＶ／Ｖｉｓ光度計では４１０ｎｍで計測される。２種のｐ-ニトロフェノールエステル（ｐ-ニトロフェニルアセテート（PNPA）およびｐ-ニトロフェニルブチレート（PNPB））を使用し、活性度の測定は３回繰り返した。溶液は以下のように調製した：溶液Ａは、酵素基質（１１.６ｍｇのPNPAまたは２４ｍｇのPNPP）を８ｍｌのプロパン-２-オールに溶かされた状態で含むものであり；一方の溶液Ｂは、２６７ｍｇのデオキシコール酸ナトリウムを含み、これを５０ｍＭのTris-緩衝液（ｐＨ８.０）に溶かした後に、６６.７ｍｇのアラビアゴムを加えたものである。動力学的分析評価を、２５℃で、PowerWave microtitreプレートリーダ（BioTek社）を使って実施し、上述した複数の溶液の混合物２４０μlと球体（sphere）酵素または自由リパーゼの溶液１０μlとを用いた。
（結果）
粒子への結合について検査した全ての酵素で、タンパク質担持の率は３０〜３６％の範囲となった（表５）。
（表５：粒子主鎖支持体への各種酵素の結合効率）
【００４７】
【表５】
（＊）活性部位の保護のため酵素の固定化中に基質を追加した（上述の方法を参照）。
ＰＮＰＡに対するＣＡＬＢの活性度の維持には、メントール基質を含ませることが効果的であり、約３０％高い活性度（８３％）が保たれた（図７）。
【００４８】
ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＣＡＬＢは全て、活性度を保ちながら粒子に結合することに成功した。それは、広範囲のタンパク質を、タンパク質担持が高い状態で、粒子に効果的に結合できることを示す。更に、他の酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼなど）も、粒子に結合することが示された（下の例を参照）。
（例１０：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子；複数の酵素が結合した粒子）
本調査は、複数の酵素を、両酵素に対する活性度を保った状態で粒子主鎖に結合できることを示す意図で行った。グルコースオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼ系とを選択した。
【００４９】
粒子は、例３に従って製造した。調査した酵素は、グルコースオキシダーゼ（Seravac Pty Ltdのアスペルゲルスニゲル）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（Serevac Pty Ltd）であった。一例として、５ｍｇ（１０ｍｇ.ｍｌ−１で０.５ｍｌ）のグルコースオキシダーゼと１０ｍｇ（１０ｍｇ.ｍｌ−１で１ｍｌ）のホースラディッシュペルオキシダーゼとを、２５℃で２時間緩やかに振盪して、２８ｍｇ（２８ｍｇ.ｍｌ−１で１ｍｌ）の粒子主鎖に結合した。各サンプルを、Allegra X22遠心分離機（２００×ｇ）を用い、１０分間遠心分離した。粒子は、連続して６回、各回２ｍｌの脱イオン水を用いて洗浄した。結合後の上澄み部分を、総タンパク質について分析した。粒子の活性度は、例９のグルコースオキシダーゼ用の分析評価方法に従って測定したが、分析評価試薬にホースラディッシュペルオキシダーゼは含まれていない。
（結果）
グルコースオキシダーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼの粒子主鎖への結合は成功し、３μｍｏｌｅ.ｍｉｎ−１の率でグルコースを変換することができた（表６）。このことは、分析評価で検出した活性度と同様、グルコースオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼとが結合され、活性度を維持していたことを示す。すなわち、粒子を用いれば、複数の酵素を、両方の酵素が活性度を保った状態で結合することができる。
（表６：グルコースオキシダーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼの２種酵素粒子に関する結合効率および活性度）
【００５０】
【表６】
（例１１：各種乾燥方法を用いて製造したポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体格子または網目）
ここでの目的は、粒子を製造した後に、様々な方法（凍結乾燥、真空乾燥、アセトン乾燥など）を用いて粒子を乾燥させることであった。
【００５１】
粒子は、例１で概説した標準的な条件で製造した。そして、洗浄した粒子を、凍結乾燥（Virtis Genesis凍結乾燥機使用）、真空濃縮機（Savant RVT100蒸気収集機を備えたSavant SpeedVac SC110）を用いた真空乾燥、または、アセトンを用いた脱水によって乾燥させ、その後さらに、２５℃で１２時間空気乾燥させた。アセトン乾燥した粒子は、凝塊したため水媒体に再懸濁することができず、そのため、それ以上の考察は行っていない。
【００５２】
しかし、真空乾燥と凍結乾燥とは、粒子を乾燥させる技術として両方とも成功であり、乾燥後の粒子を用いて、広範囲の酵素やタンパク質を付着させることができた（表７）。５ｍｇ ｐｅｒ ｍｌの精製酵素６ｍｌをTris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）に入れて、粒子懸濁液５ｍｌに加えた。そして、２５℃で１時間緩やかに撹拌した。懸濁液は、その後遠心分離してから、４℃の緩衝液１０ｍｌを用いて２度洗浄した。さらにその後、懸濁液を遠心分離し、ペレットを１０ｍｌのTris-Cl緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ８.０）で再懸濁した。粒径は、Malvern Mastersizerを用いて測定した。
（結果）
（表７：各種乾燥処置後の平均粒径）
【００５３】
【表７】
本例が示すのは、乾燥処理、特に凍結乾燥した場合、酵素と結合した粒子が大きく凝塊することはない、ということである。
（例１２：様々なｐＨでＰＥＩから調製したポリマー鎖／繊維の支持体網目または格子へのラッカーゼ結合の特性評価）
乾燥処理が、結合後のラッカーゼ結合粒子の特性、酵素の性質に与える影響を判定した。
【００５４】
粒子は、例３で概説した標準の製造方法にほぼ従って製造したが、ｐＨ１１で調製したＰＥＩ（１０％）に加えて、ｐＨ８に調整して調製したものについても評価を行った。さらにラッカーゼを主鎖に固定化し、その方法は例９で述べたものとほぼ同じであるが、以下の点が異なる。すなわち、１ｍｌのラッカーゼ（Novozyme 51004，５０ｍｇ.ｍｌ−１）を６.２５ｍｌの粒子（１６ｍｇ.ｍｌ−１）と反応させた。従って、１００ｍｇの粒子について５０ｍｇのラッカーゼが結合したことになる。ラッカーゼ結合粒子は、脱イオン水１２.５ｍｌで洗浄し、さらに、脱イオン水を用いて２０ｍｌに再懸濁した。粒子は１０ｍｌずつ２等分した。そして、そのサンプルの１つを、回収量（質量）測定のために凍結乾燥し、乾湿両方のラッカーゼ結合粒子の特徴を調査した。乾燥させたサンプルは、脱イオン水で元の量に再懸濁した。全ての分析評価は３回繰り返した。
【００５５】
ラッカーゼの上澄みのサンプルの総タンパク質を、Bio-Rad Total Protein Assay kit（カタログ番号：500-0006）というキットを用い、ラッカーゼをタンパク質の基準として測定した。ラッカーゼの活性度は例９に従って測定した。
（結果）
凍結乾燥によるラッカーゼ結合粒子の乾燥処理では、粒子製造の際にＰＥＩがｐＨ８であった場合の方が、粒子に結合されるラッカーゼタンパク質は多いものの、粒子製造の際にＰＥＩがｐＨ１１であった場合の方が、回収できる量（質量）は大きいことが分かった（表８）。ABTSに対しての活性度を最も高く保つことができたのは、ｐＨ８のＰＥＩを用いて製造し、凍結乾燥しなかった粒子であったが（１６％）、凍結乾燥後の同じサンプルはラッカーゼ活性度を３％しか保持していなかった。注目すべき点として、ｐＨ８のＰＥＩを用いて製造された粒子は乾燥後に再懸濁するのが難しく、そのため凝塊する可能性があるが、凝塊すれば表面対面積（surface to area）の比率が下がり、従って、基質および生成物への分散制約（diffusional constraint）が原因で活性度が下がることになる。ｐＨ１１のＰＥＩを用いて生成された粒子については、活性度に関して同様の影響は観察されなかった（表８）。
【００５６】
表８：凍結乾燥を行う場合と行わない場合とで、ＰＥＩのｐＨ値を様々に変えながら製造したラッカーゼ結合粒子の結合効率および活性度保持の度合
【００５７】
【表８】
この実験が示すのは、粒子はＰＥＩのｐＨを変えて調製することができ、これによって酵素に対する粒子の結合特性が変わる、ということである。
（例１３：ｐＨ８またはｐＨ１１で製造および凍結乾燥し、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子に結合されたラッカーゼの安定性）
ｐＨ８またはｐＨ１１で製造および凍結乾燥され、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子に結合されたラッカーゼの熱安定性およびｐＨ安定性を測定した（ラッカーゼ結合粒子は例１２に記述した形で製造した）。
（温度最適条件）
自由ラッカーゼおよび粒子結合ラッカーゼ（タンパク質担持は均等）の温度最適条件の解析（profile）を、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）に基質として入れた１ｍＭのＡＢＴＳを用いて実行した。ウォーターバス内で、正確な温度に前平衡（pre-equilibrated）しておいた１.９ｍｌの基質に、サンプル（１００μl）を加えた。分析評価は、ペルティエ温度コントローラを備えたＤＵ８００分光光度計（Beckman-Coulter社、４２０ｎｍ）を用いて実施した。分光光度計を対象の温度に設定し、キュベットは、ウォーターバス内の平衡化した試薬を追加する前に、５分間平衡化させた。
（ｐＨ安定性）
自由ラッカーゼおよび粒子結合ラッカーゼ（タンパク質担持は均等）のｐＨ安定化は、１００ｍＭのサクシネートラクテート緩衝液（ｐＨ４.５）に入れたＡＢＴＳ（１ｍＭ）を用いて行った。各ラッカーゼサンプルは、ｐＨ２.５、ｐＨ３、ｐＨにおいて、Britton-Robinson汎用緩衝液内でインキュベートした。サンプル（２０μl）を、定期的に取り出し、２５℃でインキュベートすると共に、PowerWave HT（Biotek Instruments社）を用いて４２０ｎｍで分析評価した（２３０μlの分析評価試薬）。６時間の時点での本実験の結果を図９に示す。
（結果）
結果を図８（Ａ）、（Ｂ）、図９に示す。
【００５８】
粒子結合ラッカーゼと自由（固定化されていない）ラッカーゼとは両方とも、７０℃で活性度が最高になった（図８）。しかし、粒子結合ラッカーゼは、９０℃では、自由ラッカーゼ（活性度０％）と比較して熱安定性の向上（活性度５５〜６５％）を示した（分析評価用サンプルの調製に要する時間で）。また、乾燥粒子を使用した場合も小幅な向上が見られ、乾燥による効果があることを示唆している。これは、水が除去されるにつれて、形成されるタンパク質−粒子連結が多くなることによるかもしれない。これによってタンパク質または酵素の複数点（multi-point）共有結合が増加するが、それは、熱安定性の向上などの形で安定性を高めることが知られている [“Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques”、Mateo, C, Palomo, J. M., Fernandez-Lorente, G., Guisan, J. M., Fernandez-Lafuente, R.（著）、２００７年、（誌名）“Enzyme and Microbial Technology 40(6)”、ページ1451-1463]。
【００５９】
また、ラッカーゼ結合粒子および自由酵素のｐＨ安定性を、ｐＨ２.５、ｐＨ３、ｐＨ６で測定した。ｐＨ２.５およびｐＨ３では、ラッカーゼ結合粒子のサンプル全てが、８０〜１１０％の活性度を保ったが、自由酵素は、それぞれのｐＨで活性度を約４０〜７０％失っていた（図９）。すなわち、固定化によってｐＨ安定性は向上する。自由酵素を含むサンプルの全ては、６時間後にｐＨ６で安定していた。
【００６０】
従って、ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子の粒子に酵素を固定化することにより、ｐＨの両極での安定性を更に高めることができる。
（例１４：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子への固定化に伴う酵素最適ｐＨのシフト）
酵素は活性に最適のｐＨを有する。いくつかの場合、酵素の最適ｐＨは、他の反応にとっての最適ｐＨと一致しない。たとえば、酵素基質／反応物は別のｐＨ値で最も溶解しやすい、という場合がある。もう１つの例として、複数の酵素を複数ステップのワンポット（one-pot）反応に用いる場合、それらの最適ｐＨは一致しないことがある。それゆえ、固定化処理中に酵素の最適ｐＨを変化させることができれば、これによって経済的および技術的な効果が得られるだろう。そこで、ラッカーゼの最適ｐＨを、粒子上に固定化する場合と固定化しない場合とで測定した。
（酵素分析評価）
ラッカーゼ試薬は、５０ｍＭのBritton-Robinson汎用緩衝液の中に１ｍＭのグアヤコールを含んでおり、当該緩衝液は目標とするｐＨ値に調整してあった（Davies TJ, Banks CE, Nuthakki B, Rusling JF, France RR, Wadhawana JD, Compton RG（著）、２００２年。（題名）“Surfactant-free emulsion electrosynthesis via power ultrasound: electrocatalytic formation of carbon-carbon bonds”、（誌名）Green Chem. 4:570-577）。汎用緩衝液を用いたのは、同じ緩衝液系が存在すること、そして広範囲のｐＨにわたって効果的に緩衝できることを確実にするためである。分析評価は、５ ２００Ｍ−１.ｃｍ−１の吸光係数で、４５０ｎｍにおいて３回繰り返した。自由酵素ならびに支持体網目または格子の粒子に固定化されたラッカーゼについて、ｐＨ値プロフィールを実験で測定した。分析評価の実施には、PowerWave HT Microtitreプレートリーダを用いた。酵素の単位については、１分につき１μmolの基質を酸化させるのに必要な酵素の量を１単位とした。
（ｐＨ値プロフィールのシフト）
ｐＨプロフィールのシフトは固定化処理中に起こることは公知であるため、繊維格子または網目主鎖支持体に結合されたラッカーゼについて、ｐＨプロフィールを測定した。粒子は例３に従って作った。グルタルアルデヒドおよびＰＥＩの濃度の変化が最適ｐＨのシフトに与える影響についても、グルタルアルデヒド後処置（例２、Ａ２−Ｊ２）の影響と同様に調査した。
（結果）
結果を図１０（Ａ）、（Ｂ）、図１１（Ａ）、（Ｂ）に示す。
【００６１】
ｐＨ値プロフィールのシフトの全体的な傾向は、中性から弱アルカリｐＨに向かっている。本例が示すのは、酵素のｐＨプロフィールが、粒子への固定化によってシフトするということである。
（例１５：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ網目または支持体格子の官能性）
粒子主鎖の官能性を変えることで、タンパク質の疎水性結合、イオン結合、そして親和性をベースとした結合を示すものにすることができる。
【００６２】
粒子は、０.１ｍｌのノノキシノール-４と０.５ｍｌのポリエチレンイミン溶液（ｐＨ１１）とを含む鉱物油１０ｍｌのエマルジョンと、０.１ｍｌのノノキシノール-４と０.５ｍｌのグルタルアルデヒド（Sigma 等級II）とを含む鉱物油１０ｍｌのエマルジョンとを混合することで製造した。混合前に、両エマルジョンを５００ｒｐｍで３０分間揺動した。そして、一緒にしたエマルジョンを５００ｒｐｍで３０分間揺動した。これにより、装飾されていない粒子が得られ、それを上述したように遠心分離処理で回収した。
（イオン結合）
イオン性基は、上記の修飾されていない粒子で生成され、その方法は、グルタルアルデヒドを用いて官能化し（２５％の水溶液２００μl、２０ｍｌの脱イオン水で３回洗浄）、その後、エチレンジアミン（０.３３Ｍを１ｍｌ）を用いた処理を行うことで、自由なアルデヒド残基と反応させる（定期的にひっくり返しながら室温で１時間）、というものであった。粒子は、充分な量の脱イオン水で繰り返し洗浄し、２０００×ｇで１０分間遠心分離を行って回収した。ラッカーゼ（２.５ｍｇ）を５ｍｇの修飾された粒子と、充分な混合が確実に行われるように定期的にひっくり返しながら、４℃で３０分間インキュベートした。イオン結合を促進するために、１.０ＭのNaClを（対イオンとして）ラッカーゼ結合粒子に加え、ひっくり返して５分間混合した。粒子は、上述したのと同様に遠心分離によって回収し、活性度を測定した。
（疎水性結合）
修飾されていない粒子（５ｍｇ）をエポキシオクタン（０.１ｍｌ）と共に２５℃で４時間インキュベートするやり方で、疎水基を粒子に追加した。その後、これらを充分な量の水で繰り返し洗浄し、上述したように遠心分離によって回収した。疎水結合されたタンパク質（蛍光菌リパーゼ、５ｍｇ）は、界面活性剤（１％、デオキシコレート）の追加によって取り出すことができた。２８０ｎｍでのタンパク質吸光度を測るやり方で測定を行った。
（親和性結合）
タンパク質の親和性結合については例１７に示す。
（結果）
（イオン結合）
修飾された粒子には、追加したラッカーゼの４５％が結合された（Bio-Rad protein assay dye reagent method（５００-０００６）によって求めた値、メーカ側の記録による）。この４５％のラッカーゼのうち７６.９％は、対イオンとして塩（１.０Ｍ、NaCl）を追加することで取り出すことができた。これに対し、修飾されていない粒子はラッカーゼの１４％としか結合せず、塩溶液によって取り出せたのは、その５２.６％だけであった。
（疎水性結合）
修飾された粒子にタンパク質を結合した。修飾された粒子に結合されたタンパク質の約２８％は、デオキシコレートを追加することで取り出されたが、これは、結合された酵素のうちの疎水性結合部分である。
【００６３】
本例が示すのは、粒子マトリックスの官能性を変更することで、粒子マトリックスへのタンパク質結合の別メカニズムを実現できる、ということである。
（例１６：化学伝達物質および補因子の共捕捉（co-entrapment））
補因子（または修飾された補因子や化学伝達物質）を含ませることで、架橋後、酵素と補因子との共補足が可能になる。処理条件を選択することにより、反応体（例:酵素基質、共基質、生成物、共生成物）などの小分子の出入りを許す一方で補因子を保持するよう、粒子の多孔度を決めることができる。
【００６４】
アミノ酸デヒドロゲナーゼ（AADH）、ギ酸塩デヒドロゲナーゼ（凍結乾燥したもの）は、Biocatalytics社（米国）から購入した。PEG20000-NADHは、Julich Fine Chemicals社（ドイツ）から取得した。鉱物油は、Castrol社（ドイツ）から取得した。ノノキシノール-４は、ICI社（英国）から取得した。グルタルアルデヒド（Glut）（２５％水溶液）は、Acros Organics社（ベルギー）から取得した。ギ酸は、Merck社（ドイツ）から取得した。エチレンジアミン（EDA）、ポリエチレンイミン（PEI）、３-メチル-２-オキソ酪酸（２-ケトバリン）、ＤＬ-バリン、NADHそしてNAD＋は、Sigma Aldrich社から取得した。
【００６５】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をグルタルアルデヒドと架橋することで、ポリマー粒子を製造した。ポリエチレンイミンの油中水エマルジョンは、予め溶かした状態の２００μlのノノキシノール-４を含む鉱物油４０ｍｌに１０％のＰＥＩを８００μl乳化する方法で調製した（５００ｒｐｍで撹拌する２０ｍｍの電磁撹拌器を用い、１００ｍｌビーカー内で２０分間電磁撹拌した）。第２の油中水エマルジョンも同様に、２０％のグルタルアルデヒド溶液を用いて調製した。２つのエマルジョンは、高速（７００ｒｐｍ）で撹拌しているポリエチレンイミンエマルジョンにグルタルアルデヒドエマルジョンを加えるやり方で混合した。これにより、連続的な撹拌で３０分間反応させることができた。
【００６６】
ポリマー粒子は、２０００×ｇで１０分間の遠心分離を行って回収した（Sorvall, RT7）。そのポリマー粒子を４５ｍｌの脱イオン水で４回洗浄した。洗浄作業の間に、先に述べた例と同様の遠心分離によって回収を実行した。そして、生成物は、１０ｍｌに再懸濁した。この溶液（１ｍｌ）をエッペンドルフチューブに等分して、以降の実験に使用した。
【００６７】
１０ｍｇ.ｍｌ−１を含んだ各タンパク質（ギ酸塩デヒドロゲナーゼ、バリンデヒドロゲナーゼ）のタンパク質溶液を調製した。その後、これら２つの溶液（各溶液２００μl）を混合し、ポリマー材料とインキュベートした。この溶液は、逆さまにして混合し、緩やかに揺動しながら３０分間反応させた。固定化酵素を含む粒子を、後述の方法を用いて、活性度測定のために分析評価した。
【００６８】
粒子は、脱イオン水で洗浄し、上述したやり方で回収した。粒子は、１００μlの PEG20000-NADH（ドイツ、ユーリッヒのJulich Fine Chemicals社から取得）と混合し、緩やかに揺動しながら室温で２時間インキュベートした。その後、この溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥による生成物を、２ｍｌの水で２回洗浄し、遠心分離によって回収した。それから、粒子を、１００ｍｇのリジンを含んだ１００ｍＭのTris-Cl緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌに再懸濁して、粒子上の余剰のアルデヒド官能基を抑制（quench）し、室温で１時間インキュベートした。そして、粒子を２ｍｌのTris-Cl緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８.０）で５回洗浄した。その後、このサンプルに対しては、１ｍｌの再利用試薬を用い、再利用能力に関する検査をした。サンプルは、サイクルとサイクルとの合間に２ｍｌ量の水で３回洗浄した。そしてサンプルを分析したが、これは、後述するやり方でアミノ酸ＴＬＣとＨＰＬＣとからバリンを製造するためである。
【００６９】
これらの粒子を反応させ、再利用して、後続の反応のための新しい反応媒体とした。
（試薬の再利用）
バリン生成を目的としたPEG-20000-NADHの再利用のための試薬は、５０ｍＭのギ酸塩（ナトリウムギ酸塩１Ｍ株（stock）から出たもの、ｐＨ８.０）、５０ｍＭのTris-Cl緩衝液（ｐＨ８.０）、５０ｍＭの酒石酸アンモニウム、そして１０ｍＭの２-ケトバリンから成るものとした。この試薬の組成を、PEG NADHが再利用された場合に確実にバリンのみが生成されるように公式化（formulated）した。
（分析法）
アミノ酸ＴＬＣを、Ｆ２５４シリカゲルプレート（Merck社）で実施した。使用した移動相は、氷酢酸に対してエタノール９：１であった。アミノ酸（バリン）は、アセトン中にニンヒドリン２％の溶液を用いて染色した。バリン（Ｒｆ０.４９）とアンモニア（Ｒｆ０.３１）とが適当に分離したことが明らかに見て取れるまで、プレートを１２０℃で加熱した。
【００７０】
ＨＰＬＣは、アミノ酸の測定のために、ＯＰＡ誘導化法（ｏ-フタルアルデヒド試薬）を用いて実行した。サンプルは、インライン誘導化した。また、バリン標準（valine standards）を含めた。
（結果）
反応および再利用は、ＴＬＣデータによれば成功であり、連続的な粒子触媒反応の全てについてバリンスポット（valine spot）が形成された。６回の連続的な１６時間反応サイクルのそれぞれにおいて、粒子として、１０ｍＭのケトバリンを４８、３５、５９、４３、３３、２９％のいずれかの割合でバリンに変換したものを用いた。これによって肯定的なＴＬＣ結果が確認され、ＨＰＬＣ ＯＰＡ法を用いて定量化できた。
【００７１】
この例が示すのは、酵素粒子マトリックスでの補因子の捕捉によって、酵素は補因子を利用して官能基を維持でき、そして、捕捉された補因子は再利用できる、ということである。
（例１７：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子を有する粒子による抗体の結合）
本例で示すのは、粒子への抗体や抗原の結合である。抗体や抗原が結合された場合には、固定化された抗体または抗原を介したタンパク質の親和性結合に対する粒子の適合性が示される。さらに、診断用途（例：ELISA）に対する粒子の信頼性が示される。
【００７２】
ポリエチレンイミン（Ｐ３１４３；５０％水溶液）、等級IIのグルタルアルデヒド（Ｇ６２５７；２５％水溶液）、鉱物油（Ｍ８４１０）、抗原マウスインターロイキン２（Ｉ０５２３−２０ＵＧ；ＳＬ０６０９２）、そして、Streptomyces avidinii由来のマーカー酵素ストレプトアビジン−ペロキシダーゼ（Ｓ５５１２−２５０ＵＧ；ＳＬ０５１８１）は、Sigma-Aldrich社から取得した。主要な抗体であるラットアンチマウス（rat anti-mouse）インターロイキン２（ＩＬ−２）ＭＡＢ（Ｉ７６６３−２７Ｋ１； Ｌ６０８０８０１）と、補助的な抗体であるラットアンチマウスインターロイキン２（ＩＬ−２）ビオチンＭＡＢ（Ｉ７６６３−２７Ｍ５；Ｌ６０８０８０３）とは、USBiologicals社から取得した。塩化ナトリウム（Ｓ７６５３）、二塩基のリン酸ナトリウム（Ｓ０８７６）、一塩基のリン酸ナトリウム（Ｓ０７５７）、過酸化水素（２１６７６−３）、ツイン２０（Ｐ９４１６）、そして塩酸（Ｈ１７５８）は、Signa Aldrich社から取得した。２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンズチアゾリン-６-スルホン酸）（１０１０２９４６００１）はRoche社から取得した。
（粒子の調製）
架橋ポリエチレンイミン粒子は、例２（サンプルＧ）に従って調製した。試薬に対して唯一行った調整は、ポリエチレンイミン溶液を１０％に希薄する前にＨＣＩでｐＨ９にしたことである。実験は４倍に直接拡大して行った。従って、乳化した反応体それぞれ８００μlと共に溶解したＮＰ４を２００μl含んだ２０ｍｌの鉱物油が必要であった。結果として生じる架橋ポリエチレンイミン粒子を、５０ｍｌの脱イオン水で６回洗浄し、洗浄と洗浄との合間に５０００×ｇで５分間遠心分離する、というやり方で鉱物油から回収した。粒子ペレットは、その後、脱イオン水で１０ｍｌの量に再懸濁し、実験Ａ〜Ｆに５００μlずつ使用した。
（タンパク質の固定化）
各実験には、下の表９に示すように文字を割り当てた。各種のタンパク質の追加は、表９で実験の下側の欄に示す手順で実行した。各実験について、第１のタンパク質成分の固定化は、１０分毎にサンプルを逆さまにして充分な混合が行われることを確実にしつつ、４℃の脱イオン水で１時間かけて実施した（表９の順次追加ステップの１）。粒子は、１ｍｌの脱イオン水で３回洗浄し、上述したやり方で回収した。
【００７３】
それに続くタンパク質結合、タンパク質処理（表９の第２列から第５列の処理）は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（結合緩衝液）を含んだ１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６.８）で実施した。この結合は、充分な混合を確実にするために５分ごとにひっくり返しながら、３７℃で３０分間実行した。タンパク質結合が終わる度に、サンプルは、１０分間緩やかに揺動させながら（IKA Vortex Genius使用、設定２）、ツイン２０を０.０５％含んだ１ｍｌの結合緩衝液で２回洗浄し、非特異的なタンパク質相互作用を抑制した。順次行うステップの合間々々に、５０００×ｇで５分間遠心分離を行って粒子を回収した。タンパク質処理の各ステップ（表９）に関して追加したタンパク質の量は、以下の通りである。アルブミンは５ｍｇ；ラットアンチマウスインターロイキン２ＭＡＢ（A-IL２-MA）は５０μg；ラットアンチマウスＩＬ２ＭＡＢビオチン（B-A-IL２-MA）は２５μg；インターロイキン２（IL-２）は２ｕｇ；ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（strep-perox）は１０μg。これらの量のタンパク質を１ｍｌの結合緩衝液で調製した。
（表９：実験Ａ〜Ｆのタンパク質結合の手順）
【００７４】
【表９】
（分析評価）
ペルオキシダーゼ分析評価試薬は、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６.８）に、２ｍＭのＡＢＴＳと２ｍＭの過酸化水素とを含んで成るものとした。分析評価値は３回繰り返して測定し、１ウェル（well）につき２００μlの試薬と５０μlの粒子懸濁液とを用い、３０℃において、Powerwave HT マイクロプレート分光光度計（Biotek Instruments社）で４２０ｎｍの値を計測した。
（結果）
抗原に対する抗体の結合は、実験Ｂ（図１２）で評価した。この実験では、粒子表面への主要な抗体（A-IL２-MA）の結合、それに続く抗原（IL-２）の結合、粒子への補助的な抗体（B-A-IL２-MA）およびストレプトアビジン−ペロキシダーゼの結合について、結合が成功したと解釈しうる肯定的な反応が示された。これは、マイクロプレートのウェルなどの表面で実行されるsandwich-ELISAに類似している。実験Ｃは、抗原が粒子の表面に結合され、その後、抗体結合のための認識要素（recognition element）として用いられることを示す。これらの実験は、各種の対照例（control）と比較して見た場合、粒子を抗体または抗原の結合に用いることが可能であることを示している。
【００７５】
実験Ａは、主要な抗体が固定化された状態の粒子に対し、補助的な抗体（B-A-IL2-MA）またはストレプトアビジンペルオキシダーゼが非特異結合することを示すための対照例である。Ｂと比較して反応が低いことは、粒子に対する補助的な抗体の結合を抗原（IL-２）が強化することを示す。実験Ｄ，Ｅは、アルブミンを抑制処理(quenching)した後の粒子に対し、主要な抗体（A-IL２-MA）や補助的な抗体（B-A-IL2-MA）が非特異性結合することを示すための対照例である。実験Ｆは、非処理の架橋ポリエチレンイミン粒子に関するものであり、分析評価の対照用に用いた。
【００７６】
本例は、粒子が、抗原または抗体にとって適当な固定化支持体であることを示す。更に強調しておきたい点は、抗原に対して抗体が、抗体に対して抗原が、それぞれ親和相互作用によって固定化されることである。従って、本例は、親和クロマトグラフィおよび診断法（酵素結合免疫吸着検査法など）に、当該支持体が適用できることを示している。
（例１８：ポリマー鎖／繊維のＰＥＩ支持体網目または格子の粒子への磁鉄鉱の組み入れ）
化学伝達物質および補因子を粒子に含ませる処理についてはすでに示した。本例では、粒子に磁性粒子を含ませる処理について示す。
（粒子の調製）
粒子は、上記の例１７に従って調製し、各エマルジョンについて鉱物油が２５ｍｌになるよう線形的に数値を大きくした。乳化の前に、１０％のポリエチレンイミン溶液（ｐＨ９.０）に磁鉄鉱（２５０ｍｇ）を含ませた。架橋したポリエチレンイミン粒子を、５０ｍｌの量の脱イオン水で６回洗浄し、洗浄ステップの合間に、５０００×ｇで５分間遠心分離して鉱物油から回収した。続いて、粒子ペレットを脱イオン水で１０ｍｌの量に再懸濁し、５００μlのエチレンジアミンと３０分間反応させることで、陰イオン交換のために官能化した。次いで、球体を、５０ｍｌに３等分した脱イオン水で洗浄し、上述したように遠心分離を行って回収した。最終的に得られたペレットは、脱イオン水で１０ｍｌに再懸濁し、後述するアルブミン結合実験に使用した。粒子の乾燥重量は、１０ｍｌの粒子懸濁液を１ｍｌずつに等分したものを凍結乾燥および重量測定するやり方で、３回繰り返して測定した。
（タンパク質の結合および定量化）
上記の等分した懸濁液から得た粒子を、磁気スタンド（Magnetic Separation Stand （Promega社; Z5332))で磁気分離して回収し、液体は除去した。その粒子を２ｍｌのTris-Cl緩衝液（ｐＨ７.４）（５０ｍＭ）で２回洗浄して平衡化した。そして、粒子にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えて、最終的な濃度を２０ｍｇ.ｍｌ-１とした。タンパク質のイオン結合を、室温において３０分間、回転混合することで生じさせた。混合物は磁気スタンド内に配置して、磁化された樹脂を反応管の側壁に保持させた状態で、サンプルからの液体が除去されるようにした。樹脂は、５０ｍＭの Tris-Cl（ｐＨ７.４）１ｍｌ で５回洗浄し、前述した磁気保持器（retainer）によって回収した。５０ｍＭ のTris-Cl（ｐＨ７.４）に入れた１ＭのNaCl５００μlを２回追加することで、イオン結合されたＢＳＡを樹脂から抽出した。
（タンパク質定量化）
溶出した分のタンパク質は、メーカの指示に従って、Qubit Fluorometer（Invitrogen社）で、Quant-iT分析評価を用いて定量化した（表１０）。
（結果）
（表１０：磁鉄鉱含有粒子へのアルブミンの結合（３回分データの平均））
【００７７】
【表１０】
この結果が示すのは、磁鉄鉱を粒子に取り込めば、粒子の磁気特性を利用して粒子を懸濁液から効果的に分離できる、ということである。更に、上記の結果は、本支持体が効率の良いイオン交換樹脂として使用できることを示している。ここで提示する例では、アミン（エチレンジアミン）などの正荷電分子で粒子マトリックスを修飾することで、粒子を陰イオン交換樹脂として使用することができる。また、カルボキシル含有分子などの負荷電分子を用いれば、陽イオン交換樹脂としての使用が可能である。
【００７８】
本例は更に、格子内に磁性粒子を含ませる方式の別の回収方法の例を提供する。その方法では、磁場の利用によって粒子を引きつけることができる。
本発明の粒子は、架橋剤によって架橋されたポリマー鎖または繊維の格子と、隣接して繊維を囲む格子間の開口領域または空間とを有する。言い換えると、本発明が提供するのは、繊維相互貫入網目粒子であり、好ましい構成として、グルタルアルデヒド架橋したポリエチレンイミンから構成または製造されている。この粒子は、酵素固定化マトリックスとして利用できる。
【００７９】
粒子は、本発明の第２、第３の様態によるエマルジョンベースのテクノロジーまたは技術を用いて製造するのが好ましい。エマルジョンベースのテクノロジーを用いれば、粒子のサイズに関する制御（例えば、粒子における体積と表面積との比率）や所定の粒径分布を実現できる利点があると共に、粒子を単一ステップで合成できるという効果もある。本粒子は、固定化に利用できる表面積が大きくなるため、大小の基質の生体触媒にも利用できる（ただし、それに限定はされない）。この酵素固定化マトリックスは、固定化効率が高く、固定後の酵素の活性度も高く保たれる。
【００８０】
樹枝状粒子の繊維の性質として、酵素の結合に役立つ内部表面積が大きくなる。また、酵素サブユニットごとの利用可能な結合点の数が大きいため、タンパク質の安定化は、主鎖支持体の材料（例えば、ＰＥＩそれ自体）と比較した場合、大幅に改善する可能性がある。これを、ゆるい格子または網目と組み合わせた場合、生体触媒付加後の重量に対する活性度の比率を高めることができるが、それは、固定化に有用な露出表面積が大きいこと、そして、大小の基質について分散制約が限られていることによる。更に、粒径の制御によって、基質の分散制約をより小さくすることができる(それが本固定化マトリックスの障害となる場合)。
【００８１】
粒子の調製方法には、同相で架橋剤が存在する場合、存在しない場合について、主鎖支持体または格子を乳化する処理が含まれる。上述の２エマルジョンシステムを製造に用いるのが望ましい。架橋剤が第１のエマルジョンに含まれない場合、架橋剤は、油相に溶かしてもよいし、前記架橋剤を含んだ第２のエマルジョンを混合する形で取り込んでもよい。
【００８２】
好ましい製造方法には、エマルジョンの中で主鎖ポリマー（ポリエチレンイミン）を別個に乳化する処理が含まれるが、その場合は、第２のエマルジョンに少なくとも２官能基の架橋化学物質（グルタルアルデヒド）を入れておく。ポリマーと架橋剤との間の自然反応の結果、繊維の格子または網目が生じるが、この場合、余剰のアルデヒド官能基が含まれている。続いて、その余剰のアルデヒド官能基を用いて、アミンアルデヒド交差反応性を介したタンパク質の格子または支持体への自然発生的な共有結合連結が実現される。このアルデヒドの官能基については更に、別の化合物と連結すること、あるいは、疎水性などの他の特性をもたらすことにすれば、より広い範囲のタンパク質（例：疎水性タンパク質）の結合にまで用途を拡大するものと推測される。
【００８３】
マトリックスにタンパク質を固定化することにより、酵素の溶媒安定性、熱安定性、ｐＨ安定性は高まる。こうした安定は、樹枝状支持体へのタンパク質固定化の後で支持体を乾燥させれば、更に強化される。この乾燥処理によって、交差反応性を有する化学官能基が近接する状況が少なくなるので、その結果、「タンパク質−主鎖」および「主鎖−主鎖」の更なる自然発生的な化学結合（chemical coupling）が引き起こされると考えられる。さらに、乾燥処理の間に添加物がマトリックスに捕捉されるが、これは、孔サイズの制御や、機能分子または補助剤の捕捉に役立つ可能性がある。本発明の粒子であれば、タンパク質担持を高めることができる（すなわち、小さな粒子体積に対して比較的大量のタンパク質を担持することができる）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋剤によって架橋されたポリマー鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマー鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有するエマルジョン由来粒子であって、
タンパク質または修飾タンパク質と反応することで、当該タンパク質または修飾タンパク質を格子に結合させ、固定化すること、
を特徴とするエマルジョン由来粒子。
【請求項２】
官能基は、前記格子を成すポリマー鎖に存在しており、タンパク質または修飾タンパク質のポリマーへの結合が、格子修飾を通して官能基を付与するように実現することができる共有結合、イオン結合、疎水結合、親和結合のうち１または複数で成されるように選択されたものであること、
を特徴とする請求項１に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項３】
官能基によって格子に結合され、それによって固定化されたタンパク質または修飾タンパク質を少なくとも１つ含むこと、
を特徴とする請求項１または２に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項４】
複数の異なるタンパク質または複数の異なる修飾タンパク質が内部で固定化されていること、
を特徴とする請求項３に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項５】
鎖状または繊維状のポリマーはポリエチレンイミンであること、
を特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項６】
格子内に捕捉された補助剤を含むこと、
を特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項７】
補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択されること、
を特徴とする請求項６に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項８】
第１の液相の液滴が第２の液相内に分散したエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中には溶解したポリマーおよび架橋剤が含まれるという状態で製造する処理と、
架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、
当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、
を特徴とする粒子生成方法。
【請求項９】
第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第１のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解したポリマーが含まれているという状態で製造する処理と、
第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第２のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解した架橋剤が含まれるという状態で、第１のエマルジョンと併せる処理と、
架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、
当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、
を特徴とする粒子生成方法。
【請求項１０】
ポリマーはポリエチレンイミンであること、
を特徴とする請求項８または９に記載の粒子生成方法。
【請求項１１】
液相の少なくとも１つに補助剤を加え、当該補助剤が粒子の格子内に捕捉された状態にする処理を有すること、
を特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載の粒子生成方法。
【請求項１２】
粒子を回収し、回収した粒子を乾燥させる処理を有すること、
を特徴とする請求項８乃至１１のいずれかに記載の粒子生成方法。
【請求項１３】
回収された粒子に対し、当該粒子の乾燥処理の前に補助剤を加え、当該補助剤が粒子の格子内に捕捉された状態にする処理を有すること、
を特徴とする請求項１２に記載の粒子生成方法。
【請求項１４】
補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択されること、
を特徴とする請求項１１乃至１３のいずれかに記載の粒子生成方法。
【請求項１】
架橋剤によって架橋されたポリマー鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマー鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有するエマルジョン由来粒子であって、
タンパク質または修飾タンパク質と反応することで、当該タンパク質または修飾タンパク質を格子に結合させ、固定化すること、
を特徴とするエマルジョン由来粒子。
【請求項２】
官能基は、前記格子を成すポリマー鎖に存在しており、タンパク質または修飾タンパク質のポリマーへの結合が、格子修飾を通して官能基を付与するように実現することができる共有結合、イオン結合、疎水結合、親和結合のうち１または複数で成されるように選択されたものであること、
を特徴とする請求項１に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項３】
官能基によって格子に結合され、それによって固定化されたタンパク質または修飾タンパク質を少なくとも１つ含むこと、
を特徴とする請求項１または２に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項４】
複数の異なるタンパク質または複数の異なる修飾タンパク質が内部で固定化されていること、
を特徴とする請求項３に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項５】
鎖状または繊維状のポリマーはポリエチレンイミンであること、
を特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項６】
格子内に捕捉された補助剤を含むこと、
を特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項７】
補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択されること、
を特徴とする請求項６に記載のエマルジョン由来粒子。
【請求項８】
第１の液相の液滴が第２の液相内に分散したエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中には溶解したポリマーおよび架橋剤が含まれるという状態で製造する処理と、
架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、
当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、
を特徴とする粒子生成方法。
【請求項９】
第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第１のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解したポリマーが含まれているという状態で製造する処理と、
第１の液相の液滴が第２の液相内に分散した第２のエマルジョンを、一方の液相は水相であり、他方の液相は油相であり、水相中に溶解した架橋剤が含まれるという状態で、第１のエマルジョンと併せる処理と、
架橋剤にポリマーの鎖を架橋させて粒子を形成する処理と、を有し、
当該粒子の各々は、架橋剤によって架橋されたポリマーの鎖で成る格子と、前記格子を成すポリマーの鎖に隣接および囲まれる形で存在する開口領域と、格子上に配された官能基とを有し、タンパク質または修飾タンパク質が当該粒子と反応し、それによって格子に結合され、固定化されること、
を特徴とする粒子生成方法。
【請求項１０】
ポリマーはポリエチレンイミンであること、
を特徴とする請求項８または９に記載の粒子生成方法。
【請求項１１】
液相の少なくとも１つに補助剤を加え、当該補助剤が粒子の格子内に捕捉された状態にする処理を有すること、
を特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載の粒子生成方法。
【請求項１２】
粒子を回収し、回収した粒子を乾燥させる処理を有すること、
を特徴とする請求項８乃至１１のいずれかに記載の粒子生成方法。
【請求項１３】
回収された粒子に対し、当該粒子の乾燥処理の前に補助剤を加え、当該補助剤が粒子の格子内に捕捉された状態にする処理を有すること、
を特徴とする請求項１２に記載の粒子生成方法。
【請求項１４】
補助剤は、補因子、修飾補因子、化学伝達物質、磁鉄鉱または磁性物質から選択されること、
を特徴とする請求項１１乃至１３のいずれかに記載の粒子生成方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５０００９９（Ｐ２０１１−５０００９９Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１６２３（Ｐ２０１０−５３１６２３）
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４４５８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５７０４９
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０６２５７２７２）
【氏名又は名称原語表記】ＣＳＩＲ
【住所又は居所原語表記】Ｓｃｉｅｎｔｉａ，０００２ ＰＲＥＴＯＲＩＡ（ＺＡ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５４４５８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５７０４９
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０６２５７２７２）
【氏名又は名称原語表記】ＣＳＩＲ
【住所又は居所原語表記】Ｓｃｉｅｎｔｉａ，０００２ ＰＲＥＴＯＲＩＡ（ＺＡ）
【Ｆターム（参考）】
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