エラスチン由来ペプチドの製造方法、及びエラスチン由来ペプチド
【課題】エラスチンを、酵素的に分解して得られるエラスチン由来ペプチドの収量を向上させる方法の提供。
【解決手段】エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により不溶物を回収し、この不溶物にサーモリシンとパパインを添加してエラスチンを分解する、エラスチン由来ペプチドの製造方法。エラスチンを含有する肉として、マグロの心臓動脈球を使用する。不溶物にサーモリシンとパパインを添加した後、６５℃〜７０℃で加熱し、次いで８０℃で加熱する。
【解決手段】エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により不溶物を回収し、この不溶物にサーモリシンとパパインを添加してエラスチンを分解する、エラスチン由来ペプチドの製造方法。エラスチンを含有する肉として、マグロの心臓動脈球を使用する。不溶物にサーモリシンとパパインを添加した後、６５℃〜７０℃で加熱し、次いで８０℃で加熱する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスチンからペプチドを製造する方法に関し、特に酵素によりエラスチンを分解するエラスチン由来ペプチドの製造方法、及びエラスチン由来ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは、動脈、腱、皮膚などの生体内における伸縮性に富む組織に存在する繊維状タンパク質である。コラーゲンとともに細胞外部においてゲル状の細胞外マトリックスを形成している。コラーゲンが規則正しい三本鎖らせんを形成し、長くて丈夫な構造であるのに対し、エラスチンは、はっきりした構造をもたず、架橋をつくって結びつき、ゴムに似た弾性繊維を形成する。
このようなエラスチンの弾性により、皮膚などの組織は柔軟に伸縮することができるようになっている。
【０００３】
また、このようなエラスチンを分解して得られるエラスチン由来のペプチドには、皮下領域において毛細血管静脈の集中度を増加させ、また内皮細胞密度を増加させる機能があるとの報告があり（特許文献１の段落００２８）、皮膚外用剤としての有効利用が提案されている。
【０００４】
また、エラスチン由来ペプチドには、デスモシン、イソデスモシンという他のタンパク質には、ほとんど見られない特有のアミノ酸が含まれていることから、これを含有するペプチドによる生理活性効果等が期待されている。
さらに、このような特有の効能や特徴的なアミノ酸を含有しているエラスチンを、食品として利用することも期待されている。
このような状況において、エラスチン由来ペプチドを効率的に生産する技術の開発が求められている。
【０００５】
一方、エラスチンは、マグロなどの魚肉の心臓動脈球に多く含まれていることが知られているが、心臓動脈球は、魚肉全体においてごくわずかな量しか含まれておらず、キハダマグロの場合で、０．０２７％（２７０ｐｐｍ）程度しか含まれていないと言われている。
また、エラスチンは、この心臓動脈球から数％しか精製できないことから、その収量を向上させる技術は、極めて有効なものである。
【０００６】
また、エラスチンは、溶けにくいタンパク質であることでも知られている。このため、エラスチンは、一般に熱アルカリ抽出法を用いて、エラスチンを含有する肉からエラスチン以外のタンパク質を分解除去することで、精製することが可能である。
そして、精製したエラスチンをさらに分解してエラスチンペプチドを得る場合、エラスチンをシュウ酸又はアルカリエタノールを用いて分解することなどが行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０６０４１号公報
【特許文献２】特開２００８−７４８４６号公報
【特許文献３】特開２００３−３００８２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、エラスチン由来ペプチドを食品に利用する場合、その食品の製造工程においては、できるだけ穏やかな処理によりエラスチンを分解することが好ましく、シュウ酸やアルカリエタノールを用いるよりも、タンパク質分解酵素を使用して、より食品に適した条件により、酵素的に分解することが望ましい。
【０００９】
しかし、従来、酵素によりエラスチンを分解して得られたエラスチン由来ペプチドの収量は、原料に対して非常に少なく、その収量を増加させることが期待されている。
そこで、本発明者らは、エラスチンをより効率的に分解可能な酵素を探索するとともに、適切な反応条件を見出すべく鋭意研究を行った結果、パパインとサーモリシンを組み合わせて用いることで、エラスチンの分解効率を向上させることに成功した。
【００１０】
ここで、特許文献１には、エラスチンをサーモリシンにより分解して、エラスチン由来ペプチドを得ることが記載されている（段落０００５参照）。また、特許文献２には、エラスチンをパパインにより分解して、エラスチン由来ペプチドを得ることが記載されている（段落００１５参照）。
しかしながら、これらのいずれの特許文献にもサーモリシンとパパインを組み合わせることで、それぞれを単独で使用するよりもエラスチンを効率的に分解できることについては、記載も示唆もされていない。
【００１１】
一方、特許文献３には、エラスチンとともに、サーモリシンとパパインについても記載されている（段落０００１，００１２参照）。
しかしながら、本文献では、これらの酵素によりエラスチンを分解することは記載されておらず、貝肉におけるタンパク質をサーモリシンやパパインにより分解して除去し、得られた酸性ムコ多糖にエラスチンを添加して、皮膚外用剤とする構成が開示されているにすぎない。
【００１２】
このように、サーモリシン及びパパインを組み合わせることで、エラスチンの分解効率を向上させることについては、いずれの先行技術文献にも記載も示唆もされておらず、またその他の文献にもこれについて記載のあるものは見いだせなかった。
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、不溶性のエラスチンを、サーモリシンとパパインを組み合わせることで、より効率的に分解し、エラスチン由来ペプチドの収量を向上させることが可能なエラスチン由来ペプチドの製造方法、及びエラスチン由来ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のエラスチン由来ペプチドの製造方法は、エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により不溶物を回収し、この不溶物にサーモリシンとパパインを添加してエラスチンを分解する方法としてある。
また、本発明のエラスチン由来ペプチドは、エラスチンを含有する肉を粉砕してアルカリ分解したのち、濾過により回収された不溶物をサーモリシンとパパインにより分解してなる構成としてある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、不溶性のエラスチンに対して、サーモリシンとパパインを組み合わせて添加することで、エラスチンの分解効率を向上させることができ、エラスチン由来ペプチドの収量を増加させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態におけるエラスチン由来ペプチドの製造方法を示す概略工程図である。
【図２】本発明の実施形態におけるエラスチン由来ペプチドの製造方法により製造されたエラスチン由来ペプチドのアミノ酸組成を示す図である。
【図３】サーモリシン及びパパインと、その他の酵素によるエラスチン由来ペプチドの収量を示す図である。
【図４】反応温度がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図５】酵素の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図６】酵素添加量と反応温度の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図７】反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図８】二段階加熱による反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
（エラスチンを含有する肉）
本実施形態で使用するエラスチンを含有する肉としては、魚肉や哺乳動物、鳥類等の各種生物の肉を用いることができ、特に限定されるものではないが、エラスチンを多く含有するマグロの心臓動脈球を好適に使用することができる。
上記の通り、キハダマグロ一匹において、心臓動脈球は、全重量の約０．０２７重量％（２７０ｐｐｍ）含まれている。
【００１８】
（サーモリシン）
サーモリシンは、耐熱性のタンパク質分解酵素である。このサーモリシンとしては、例えば大和化成株式会社製のサモアーゼ(R)PC10Fを用いることができる。
このサモアーゼ(R)は、高温細菌性の一種（Bacillus stearothermophilus (Bacillus thermoproteolyticus Rokko)）由来のエンド型プロテアーゼであり、優れた耐熱性を備えており、至適温度は６５℃〜７０℃、至適ｐＨは７．０〜８．５である。
【００１９】
（パパイン）
パパインは、耐熱性のタンパク質分解酵素であり、サーモリシンよりもさらに高い至適温度を有している。このパパインとしては、例えば天野エンザイム株式会社製のパパインW-40を用いることができる。
このパパインは、Carica papaya L.から抽出されたものであり、至適温度は８０℃、至適ｐＨは微酸性〜中性である。
【００２０】
（製造方法）
次に、本発明のエラスチン由来ペプチドの製造方法について、図１を参照して説明する。同図は、本実施形態のエラスチン由来ペプチドの製造方法を示す概略工程図である。なお、本発明は、以下の製造方法に限定されるものではなく、サーモリシンとパパインを使用してエラスチンを分解するものであれば良い。
【００２１】
（１）粉砕工程
マグロの心臓動脈球を、ミンサーを用いて細断する。ダイスは直径４．８ｍｍのものを好適に使用することができる。
【００２２】
（２）熱アルカリ分解工程
得られたマグロの心臓動脈球のミンチに対して、３倍の重量の０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えて、８０℃で１時間加熱する。これによって、エラスチン以外のタンパク質を溶解させる。
その後、ＮａＯＨと等ｍｏｌ数のクエン酸を添加して中和させる。
【００２３】
（３）濾過工程
次に、３０メッシュ網で濾過し、エラスチンが含まれる不溶物を回収する。さらに、この不溶物を３回水洗いし、再度３０メッシュ網で濾過して、その不溶物を回収する。
【００２４】
（４）エラスチン分解工程
次に、回収された不溶物の３倍の重量の水を添加し、サーモリシンとパパインを合わせて、原料の心臓動脈球の重量に対して１．０重量％添加する。このとき、サーモリシンとパパインの割合は特に限定されるものではないが、原料の心臓動脈球の重量に対して、サーモリシンを０．２５重量％〜０．７５重量％にするとともに、パパインを０．７５重量％〜０．２５重量％とする場合に、好適にエラスチンを分解することができる。例えば、サーモリシンとパパインを、それぞれ０．５重量％ずつにすることができる。
また、サーモリシン及びパパインを合わせた添加量は、１．０重量％に限定されるものではなく、０．１重量％以上であれば、エラスチンを好適に分解することができる。
【００２５】
次に、回収された不溶物に対して３倍量の水とサーモリシン及びパパインを添加した混合液を、６５℃〜７０℃で１〜５時間加熱し（第一段階の加熱）、次いで８０℃で１〜４時間加熱することが好ましい（第二段階の加熱）。特に、６５℃〜７０℃で３〜５時間加熱した後に、次いで８０℃で４時間加熱することが好ましい。
このとき、混合液のｐＨは、微酸性〜中性であることが好ましい。本実施形態では、熱アルカリ分解工程における中和処理により、混合液のｐＨは、微酸性〜中性に維持されている。
【００２６】
次に、第二段階の加熱が終了して得られた溶液を、９０℃で２０分間加熱し、サーモリシンとパパインを失活させる。
【００２７】
（５）後処理工程
次に、ミンチの重量に対して０．５重量％の珪藻土を添加して攪拌することで、不溶物を凝集させ、溶液の上清を回収することで、不純物を除去する。
さらに、その上清の固形量の１０重量％になるように、活性炭素を添加して、常温で１時間静置し、脱臭脱色を行う。
次いで、珪藻土を用いて、濾過を行う。
そして、殺菌処理を行った後、濃縮してスプレードライにより乾燥させ、エラスチン由来ペプチド粉末を得る。
【００２８】
このようなエラスチン由来ペプチド粉末は、食品の成分として、好適に用いることが可能である。そのほか、当該エラスチン由来ペプチドを、食品以外の成分として、例えば飲料や、化粧品、皮膚外用剤、その他各種医薬品などの成分として使用することも可能である。
【００２９】
図２は、以上のような本実施形態のエラスチン由来ペプチドの製造方法を用いて、キハダマグロの心臓動脈球におけるエラスチンを分解して得られたエラスチン由来ペプチドのアミノ酸組成を示す図である。
同図に示すように、本実施形態の製造方法によりキハダマグロの心臓動脈球からエラスチン由来ペプチドを得た場合、そのアミノ酸組成は、アスパラギン酸２．０７ｍｏｌ％、トレオニン６．９８ｍｏｌ％、セリン２．９０ｍｏｌ％、グルタミン酸３．５６ｍｏｌ％、グリシン４４．３６ｍｏｌ％、アラニン８．３４ｍｏｌ％、バリン６．８８ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．１０ｍｏｌ％、メチオニン０．０７ｍｏｌ％、イソロイシン１．３７ｍｏｌ％、ロイシン３．５６ｍｏｌ％、チロシン２．７８ｍｏｌ％、フェニルアラニン２．３１ｍｏｌ％、ヒスチジン０．４０ｍｏｌ％、リジン１．０６ｍｏｌ％、イソデスモシン０．０６ｍｏｌ％、デスモシン０．０４ｍｏｌ％、アルギニン２．２３ｍｏｌ％、ヒドロキシプロリン０．６５ｍｏｌ％、プロリン１０．２５ｍｏｌ％となっている。エラスチンに特異的に含まれるアミノ酸であるデスモシン、イソデスモシンを含むことから本ペプチドがエラスチンに由来しているということが分かる。
ただし、本実施形態のエラスチン由来ペプチドは、このアミノ酸組成のものに限定されるものではない。すなわち、本実施形態のエラスチン由来ペプチドの製造方法を使用して、その他のマグロや他の動物等からエラスチン由来ペプチドを製造した場合には、その生物に特徴的なアミノ酸組成が示されるものと考えられる。
【実施例】
【００３０】
以下、酵素の種類や反応条件がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を検証するために行った実施例及び比較例について説明する。
＜実験１．酵素の種類がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例１）
キハダマグロから取り出した心臓動脈球２６６ｇを、ミンサー（ダイスの直径４．８ｍｍ）を用いて細断した。得られたミンチに対して、３倍量の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（８００ｍｌ）を加え、８０℃で１時間加熱して、エラスチン以外のタンパク質を分解した。そして、ＮａＯＨと等ｍｏｌ数のクエン酸（１５．４ｇ）を添加して中和させた。
【００３１】
次いで、溶液を３０メッシュ網で濾過し、エラスチンが含まれる不溶物を回収し、不溶物を３回水洗いした後、再度３０メッシュ網で濾過して、その不溶物を回収した。
この不溶物を水洗して、サンプルミルによりホモジナイズした結果、精製したエラスチンの粉砕物２０６ｇが得られた。
【００３２】
次に、この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、サーモリシン（サモアーゼ(R)PC-10：大和化成株式会社製。以下の実施例及び比較例において同様。）０．０５ｇと、パパイン（パパインW-40：天野エンザイム株式会社製。以下の実施例及び比較例において同様。）０．０５ｇとを添加した。
【００３３】
そして、この混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、６．０％であった。このうち、１．０％は、添加した酵素（０．１ｇ）とリン酸緩衝液とによるものであり、残り（実施例１では５．０％）が、溶液中に含まれるエラスチン由来ペプチド量を示している。これは、以下の実施例及び比較例でも同様である。
【００３４】
（比較例１）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、サーモリシンを０．１ｇ添加し、７０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、５．４％であった。
【００３５】
（比較例２）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、パパインを０．１ｇ添加し、８０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、４．４％であった。
【００３６】
（比較例３）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、プロチンPC-10（大和化成株式会社製）を０．１ｇ添加し、５０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、４．６％であった。
【００３７】
（比較例４）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、プロテアーゼA「アマノ」G（天野エンザイム株式会社製）を０．１ｇ添加し、５０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、３．２％であった。
【００３８】
（比較例５）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、アロアーゼAP-10（ヤクルト製薬工業株式会社製）を０．１ｇ添加し、７０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、２．０％であった。
【００３９】
実施例１は、比較例１〜５に対して、エラスチン由来ペプチドの収量が、それぞれ約１１％，３６％，３０％，８８％，２００％増加している。
ここで、サーモリシンを単独で使用した場合と、パパインと併用した場合とでは、収量の差は約１１％であるが、エラスチン由来ペプチドの場合、この差は非常に大きい。
すなわち、上述したように、キハダマグロを原料にした場合、エラスチンを多く含む心臓動脈球は、およそ０．０２７重量％しか得られず、抽出されたエラスチンは、希少なものである（現在１ｋｇ当たり十数万円で取引されている）。したがって、さらにこれを分解して得られるエラスチン由来ペプチドもまた大変希少であり、約１１％の収量の差は、当該分野では非常に大きなものである。
【００４０】
＜実験２．反応温度がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例２）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図４に示すように、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、実施例１と同様に、この混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、７．０％であった。なお、本実施例は、実施例１と同条件であるが、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）の測定結果が異なっているのは、キハダマグロから取り出した心臓動脈球の水分含有量が一定していないからである。このため、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）による測定結果は、各実験内において相対的に比較するために使用する。
【００４１】
（実施例３）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を６０℃で４時間加熱した点以外は、実施例２と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、６．６％であった。
【００４２】
（実施例４）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で４時間加熱した点以外は、実施例２と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４３】
（実施例５）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を８０℃で４時間加熱した点以外は、実施例２と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４４】
実施例２〜５において示される通り、加熱時間を全体で４時間とした場合には、加熱温度がサーモリシン及びパパインの至適温度ではない実施例３では、エラスチン由来ペプチドの収量は相対的に少なかったが、加熱温度がサーモリシン及び／又はパパインの至適温度であるその他の実施例では、エラスチン由来ペプチドの収量に差は見られなかった。
【００４５】
＜実験３．酵素の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例６）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図５に示すように、サーモリシン０．０２５ｇと、パパイン０．０７５ｇとを添加した。
そして、実施例１と同様に、この混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、７．２％であった。
【００４６】
（実施例７）
サーモリシンとパパインを、それぞれ０．０５ｇずつ添加した点以外は、実施例６と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４７】
（実施例８）
サーモリシンを０．０７５ｇ、及びパパインを０．０２５ｇ添加した点以外は、実施例６と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４８】
サーモリシンとパパインの添加比率を、実施例６〜８のように、原料の心臓動脈球の重量に対して、サーモリシン０．２５重量％〜０．７５重量％、パパイン０．７５重量％〜０．２５重量％の範囲で変えても、エラスチン由来ペプチドの収量にほとんど差は見られなかった。
【００４９】
＜実験４．反応温度の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例９）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図６に示すように、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、この混合液を８０℃で８時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、８．４％であった。
【００５０】
（実施例１０）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で６時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、８．６％であった。
【００５１】
（実施例１１）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で４時間加熱した後、次いで８０℃で４時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、９．０％であった。
【００５２】
（実施例１２）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で６時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、８．２％であった。
【００５３】
（実施例１３）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で８時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．６％であった。
【００５４】
上述した実験２では、反応時間が４時間の場合、加熱温度条件によりエラスチン由来ペプチドの収量に差は見られなかったが、反応時間をより長くした結果、まずサーモリシンの至適温度内である７０℃で反応させた後、次いでパパインの至適温度である８０℃で反応させることで、エラスチンがより効率的に分解されることが明らかとなった。
【００５５】
＜実験５．反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例１４）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、この混合液を７０℃で７時間加熱し、１時間ごとに溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した。その結果を図７に示す。
同図に示すように、反応開始から１時間目までは、可溶性固形分は急激に増加し、その後は緩やかに上昇した。また、５時間以上反応させても可溶性固形分は増えなかった。このことから、酵素を十分に添加して反応温度を７０℃とした場合、反応時間は１時間以上５時間以下とすることが適切であることがわかる。
【００５６】
＜実験６．二段階加熱による反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例１５）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、この混合液を７０℃で３時間加熱した後、次いで８０℃で５時間加熱し、１時間ごとに溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した。その結果を図８に示す。
【００５７】
同図に示すように、７０℃で３時間加熱した後、８０℃に温度を上げた場合、可溶性固形分は反応開始から１時間目まで急激に増加した後は緩やかに上昇した。また、８０℃での最初の１時間（３時間目〜４時間目）にやや大きく増加した後、４時間目までは緩やかに増加し、４時間以上反応させても増加は見られなかった。
このことから、酵素を十分に添加して７０℃で３時間加熱した後、８０℃に温度を上げた場合は、８０℃での加熱時間は１時間以上４時間以下とすることが適切であると考えられる。
【００５８】
以上の実験結果から、サーモリシンとパパインを組み合わせて用いることで、エラスチンの分解効率をより向上させ得ることが明らかとなった。すなわち、これらをそれぞれ単独で使用する場合と比較して、サーモリシンのみの場合に対して約１１％、パパインのみの場合に対して約３６％の収量の向上が見られた。
また、実施例１４では、収量が急激に増加した後の反応１時間目の可溶性固形分が６．８％であるのに対して、可溶性固形分の増加が停止した反応５時間目の可溶性固形分は８．２％であり、この間の収量の増加は、約２１％となっている。
これに対して、実施例１５では、収量が急激に増加した後の反応１時間目の可溶性固形分が６．０％であるのに対して、反応７時間目（８０℃で３時間目）の可溶性固形分は８．８％であり、この間の収量を約４２％増加させることができている。
このように、７０℃のみの場合では５時間で可溶性固形分の増加が停止したのに対し、７０℃と８０℃の二段階で反応させることによって、７時間に亘って可溶性固形分を増加させることができ、その分エラスチン由来ペプチドの収量を大きく増加させることが可能となっている。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、食品の成分等として利用するためのエラスチン由来ペプチドの製造において好適に利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスチンからペプチドを製造する方法に関し、特に酵素によりエラスチンを分解するエラスチン由来ペプチドの製造方法、及びエラスチン由来ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは、動脈、腱、皮膚などの生体内における伸縮性に富む組織に存在する繊維状タンパク質である。コラーゲンとともに細胞外部においてゲル状の細胞外マトリックスを形成している。コラーゲンが規則正しい三本鎖らせんを形成し、長くて丈夫な構造であるのに対し、エラスチンは、はっきりした構造をもたず、架橋をつくって結びつき、ゴムに似た弾性繊維を形成する。
このようなエラスチンの弾性により、皮膚などの組織は柔軟に伸縮することができるようになっている。
【０００３】
また、このようなエラスチンを分解して得られるエラスチン由来のペプチドには、皮下領域において毛細血管静脈の集中度を増加させ、また内皮細胞密度を増加させる機能があるとの報告があり（特許文献１の段落００２８）、皮膚外用剤としての有効利用が提案されている。
【０００４】
また、エラスチン由来ペプチドには、デスモシン、イソデスモシンという他のタンパク質には、ほとんど見られない特有のアミノ酸が含まれていることから、これを含有するペプチドによる生理活性効果等が期待されている。
さらに、このような特有の効能や特徴的なアミノ酸を含有しているエラスチンを、食品として利用することも期待されている。
このような状況において、エラスチン由来ペプチドを効率的に生産する技術の開発が求められている。
【０００５】
一方、エラスチンは、マグロなどの魚肉の心臓動脈球に多く含まれていることが知られているが、心臓動脈球は、魚肉全体においてごくわずかな量しか含まれておらず、キハダマグロの場合で、０．０２７％（２７０ｐｐｍ）程度しか含まれていないと言われている。
また、エラスチンは、この心臓動脈球から数％しか精製できないことから、その収量を向上させる技術は、極めて有効なものである。
【０００６】
また、エラスチンは、溶けにくいタンパク質であることでも知られている。このため、エラスチンは、一般に熱アルカリ抽出法を用いて、エラスチンを含有する肉からエラスチン以外のタンパク質を分解除去することで、精製することが可能である。
そして、精製したエラスチンをさらに分解してエラスチンペプチドを得る場合、エラスチンをシュウ酸又はアルカリエタノールを用いて分解することなどが行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０６０４１号公報
【特許文献２】特開２００８−７４８４６号公報
【特許文献３】特開２００３−３００８２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、エラスチン由来ペプチドを食品に利用する場合、その食品の製造工程においては、できるだけ穏やかな処理によりエラスチンを分解することが好ましく、シュウ酸やアルカリエタノールを用いるよりも、タンパク質分解酵素を使用して、より食品に適した条件により、酵素的に分解することが望ましい。
【０００９】
しかし、従来、酵素によりエラスチンを分解して得られたエラスチン由来ペプチドの収量は、原料に対して非常に少なく、その収量を増加させることが期待されている。
そこで、本発明者らは、エラスチンをより効率的に分解可能な酵素を探索するとともに、適切な反応条件を見出すべく鋭意研究を行った結果、パパインとサーモリシンを組み合わせて用いることで、エラスチンの分解効率を向上させることに成功した。
【００１０】
ここで、特許文献１には、エラスチンをサーモリシンにより分解して、エラスチン由来ペプチドを得ることが記載されている（段落０００５参照）。また、特許文献２には、エラスチンをパパインにより分解して、エラスチン由来ペプチドを得ることが記載されている（段落００１５参照）。
しかしながら、これらのいずれの特許文献にもサーモリシンとパパインを組み合わせることで、それぞれを単独で使用するよりもエラスチンを効率的に分解できることについては、記載も示唆もされていない。
【００１１】
一方、特許文献３には、エラスチンとともに、サーモリシンとパパインについても記載されている（段落０００１，００１２参照）。
しかしながら、本文献では、これらの酵素によりエラスチンを分解することは記載されておらず、貝肉におけるタンパク質をサーモリシンやパパインにより分解して除去し、得られた酸性ムコ多糖にエラスチンを添加して、皮膚外用剤とする構成が開示されているにすぎない。
【００１２】
このように、サーモリシン及びパパインを組み合わせることで、エラスチンの分解効率を向上させることについては、いずれの先行技術文献にも記載も示唆もされておらず、またその他の文献にもこれについて記載のあるものは見いだせなかった。
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、不溶性のエラスチンを、サーモリシンとパパインを組み合わせることで、より効率的に分解し、エラスチン由来ペプチドの収量を向上させることが可能なエラスチン由来ペプチドの製造方法、及びエラスチン由来ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のエラスチン由来ペプチドの製造方法は、エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により不溶物を回収し、この不溶物にサーモリシンとパパインを添加してエラスチンを分解する方法としてある。
また、本発明のエラスチン由来ペプチドは、エラスチンを含有する肉を粉砕してアルカリ分解したのち、濾過により回収された不溶物をサーモリシンとパパインにより分解してなる構成としてある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、不溶性のエラスチンに対して、サーモリシンとパパインを組み合わせて添加することで、エラスチンの分解効率を向上させることができ、エラスチン由来ペプチドの収量を増加させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態におけるエラスチン由来ペプチドの製造方法を示す概略工程図である。
【図２】本発明の実施形態におけるエラスチン由来ペプチドの製造方法により製造されたエラスチン由来ペプチドのアミノ酸組成を示す図である。
【図３】サーモリシン及びパパインと、その他の酵素によるエラスチン由来ペプチドの収量を示す図である。
【図４】反応温度がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図５】酵素の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図６】酵素添加量と反応温度の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図７】反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【図８】二段階加熱による反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
（エラスチンを含有する肉）
本実施形態で使用するエラスチンを含有する肉としては、魚肉や哺乳動物、鳥類等の各種生物の肉を用いることができ、特に限定されるものではないが、エラスチンを多く含有するマグロの心臓動脈球を好適に使用することができる。
上記の通り、キハダマグロ一匹において、心臓動脈球は、全重量の約０．０２７重量％（２７０ｐｐｍ）含まれている。
【００１８】
（サーモリシン）
サーモリシンは、耐熱性のタンパク質分解酵素である。このサーモリシンとしては、例えば大和化成株式会社製のサモアーゼ(R)PC10Fを用いることができる。
このサモアーゼ(R)は、高温細菌性の一種（Bacillus stearothermophilus (Bacillus thermoproteolyticus Rokko)）由来のエンド型プロテアーゼであり、優れた耐熱性を備えており、至適温度は６５℃〜７０℃、至適ｐＨは７．０〜８．５である。
【００１９】
（パパイン）
パパインは、耐熱性のタンパク質分解酵素であり、サーモリシンよりもさらに高い至適温度を有している。このパパインとしては、例えば天野エンザイム株式会社製のパパインW-40を用いることができる。
このパパインは、Carica papaya L.から抽出されたものであり、至適温度は８０℃、至適ｐＨは微酸性〜中性である。
【００２０】
（製造方法）
次に、本発明のエラスチン由来ペプチドの製造方法について、図１を参照して説明する。同図は、本実施形態のエラスチン由来ペプチドの製造方法を示す概略工程図である。なお、本発明は、以下の製造方法に限定されるものではなく、サーモリシンとパパインを使用してエラスチンを分解するものであれば良い。
【００２１】
（１）粉砕工程
マグロの心臓動脈球を、ミンサーを用いて細断する。ダイスは直径４．８ｍｍのものを好適に使用することができる。
【００２２】
（２）熱アルカリ分解工程
得られたマグロの心臓動脈球のミンチに対して、３倍の重量の０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えて、８０℃で１時間加熱する。これによって、エラスチン以外のタンパク質を溶解させる。
その後、ＮａＯＨと等ｍｏｌ数のクエン酸を添加して中和させる。
【００２３】
（３）濾過工程
次に、３０メッシュ網で濾過し、エラスチンが含まれる不溶物を回収する。さらに、この不溶物を３回水洗いし、再度３０メッシュ網で濾過して、その不溶物を回収する。
【００２４】
（４）エラスチン分解工程
次に、回収された不溶物の３倍の重量の水を添加し、サーモリシンとパパインを合わせて、原料の心臓動脈球の重量に対して１．０重量％添加する。このとき、サーモリシンとパパインの割合は特に限定されるものではないが、原料の心臓動脈球の重量に対して、サーモリシンを０．２５重量％〜０．７５重量％にするとともに、パパインを０．７５重量％〜０．２５重量％とする場合に、好適にエラスチンを分解することができる。例えば、サーモリシンとパパインを、それぞれ０．５重量％ずつにすることができる。
また、サーモリシン及びパパインを合わせた添加量は、１．０重量％に限定されるものではなく、０．１重量％以上であれば、エラスチンを好適に分解することができる。
【００２５】
次に、回収された不溶物に対して３倍量の水とサーモリシン及びパパインを添加した混合液を、６５℃〜７０℃で１〜５時間加熱し（第一段階の加熱）、次いで８０℃で１〜４時間加熱することが好ましい（第二段階の加熱）。特に、６５℃〜７０℃で３〜５時間加熱した後に、次いで８０℃で４時間加熱することが好ましい。
このとき、混合液のｐＨは、微酸性〜中性であることが好ましい。本実施形態では、熱アルカリ分解工程における中和処理により、混合液のｐＨは、微酸性〜中性に維持されている。
【００２６】
次に、第二段階の加熱が終了して得られた溶液を、９０℃で２０分間加熱し、サーモリシンとパパインを失活させる。
【００２７】
（５）後処理工程
次に、ミンチの重量に対して０．５重量％の珪藻土を添加して攪拌することで、不溶物を凝集させ、溶液の上清を回収することで、不純物を除去する。
さらに、その上清の固形量の１０重量％になるように、活性炭素を添加して、常温で１時間静置し、脱臭脱色を行う。
次いで、珪藻土を用いて、濾過を行う。
そして、殺菌処理を行った後、濃縮してスプレードライにより乾燥させ、エラスチン由来ペプチド粉末を得る。
【００２８】
このようなエラスチン由来ペプチド粉末は、食品の成分として、好適に用いることが可能である。そのほか、当該エラスチン由来ペプチドを、食品以外の成分として、例えば飲料や、化粧品、皮膚外用剤、その他各種医薬品などの成分として使用することも可能である。
【００２９】
図２は、以上のような本実施形態のエラスチン由来ペプチドの製造方法を用いて、キハダマグロの心臓動脈球におけるエラスチンを分解して得られたエラスチン由来ペプチドのアミノ酸組成を示す図である。
同図に示すように、本実施形態の製造方法によりキハダマグロの心臓動脈球からエラスチン由来ペプチドを得た場合、そのアミノ酸組成は、アスパラギン酸２．０７ｍｏｌ％、トレオニン６．９８ｍｏｌ％、セリン２．９０ｍｏｌ％、グルタミン酸３．５６ｍｏｌ％、グリシン４４．３６ｍｏｌ％、アラニン８．３４ｍｏｌ％、バリン６．８８ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．１０ｍｏｌ％、メチオニン０．０７ｍｏｌ％、イソロイシン１．３７ｍｏｌ％、ロイシン３．５６ｍｏｌ％、チロシン２．７８ｍｏｌ％、フェニルアラニン２．３１ｍｏｌ％、ヒスチジン０．４０ｍｏｌ％、リジン１．０６ｍｏｌ％、イソデスモシン０．０６ｍｏｌ％、デスモシン０．０４ｍｏｌ％、アルギニン２．２３ｍｏｌ％、ヒドロキシプロリン０．６５ｍｏｌ％、プロリン１０．２５ｍｏｌ％となっている。エラスチンに特異的に含まれるアミノ酸であるデスモシン、イソデスモシンを含むことから本ペプチドがエラスチンに由来しているということが分かる。
ただし、本実施形態のエラスチン由来ペプチドは、このアミノ酸組成のものに限定されるものではない。すなわち、本実施形態のエラスチン由来ペプチドの製造方法を使用して、その他のマグロや他の動物等からエラスチン由来ペプチドを製造した場合には、その生物に特徴的なアミノ酸組成が示されるものと考えられる。
【実施例】
【００３０】
以下、酵素の種類や反応条件がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響を検証するために行った実施例及び比較例について説明する。
＜実験１．酵素の種類がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例１）
キハダマグロから取り出した心臓動脈球２６６ｇを、ミンサー（ダイスの直径４．８ｍｍ）を用いて細断した。得られたミンチに対して、３倍量の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（８００ｍｌ）を加え、８０℃で１時間加熱して、エラスチン以外のタンパク質を分解した。そして、ＮａＯＨと等ｍｏｌ数のクエン酸（１５．４ｇ）を添加して中和させた。
【００３１】
次いで、溶液を３０メッシュ網で濾過し、エラスチンが含まれる不溶物を回収し、不溶物を３回水洗いした後、再度３０メッシュ網で濾過して、その不溶物を回収した。
この不溶物を水洗して、サンプルミルによりホモジナイズした結果、精製したエラスチンの粉砕物２０６ｇが得られた。
【００３２】
次に、この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、サーモリシン（サモアーゼ(R)PC-10：大和化成株式会社製。以下の実施例及び比較例において同様。）０．０５ｇと、パパイン（パパインW-40：天野エンザイム株式会社製。以下の実施例及び比較例において同様。）０．０５ｇとを添加した。
【００３３】
そして、この混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、６．０％であった。このうち、１．０％は、添加した酵素（０．１ｇ）とリン酸緩衝液とによるものであり、残り（実施例１では５．０％）が、溶液中に含まれるエラスチン由来ペプチド量を示している。これは、以下の実施例及び比較例でも同様である。
【００３４】
（比較例１）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、サーモリシンを０．１ｇ添加し、７０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、５．４％であった。
【００３５】
（比較例２）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、パパインを０．１ｇ添加し、８０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、４．４％であった。
【００３６】
（比較例３）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、プロチンPC-10（大和化成株式会社製）を０．１ｇ添加し、５０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、４．６％であった。
【００３７】
（比較例４）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、プロテアーゼA「アマノ」G（天野エンザイム株式会社製）を０．１ｇ添加し、５０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、３．２％であった。
【００３８】
（比較例５）
精製したエラスチン１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図３に示すように、アロアーゼAP-10（ヤクルト製薬工業株式会社製）を０．１ｇ添加し、７０℃で４時間加熱した点以外は、実施例１と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、２．０％であった。
【００３９】
実施例１は、比較例１〜５に対して、エラスチン由来ペプチドの収量が、それぞれ約１１％，３６％，３０％，８８％，２００％増加している。
ここで、サーモリシンを単独で使用した場合と、パパインと併用した場合とでは、収量の差は約１１％であるが、エラスチン由来ペプチドの場合、この差は非常に大きい。
すなわち、上述したように、キハダマグロを原料にした場合、エラスチンを多く含む心臓動脈球は、およそ０．０２７重量％しか得られず、抽出されたエラスチンは、希少なものである（現在１ｋｇ当たり十数万円で取引されている）。したがって、さらにこれを分解して得られるエラスチン由来ペプチドもまた大変希少であり、約１１％の収量の差は、当該分野では非常に大きなものである。
【００４０】
＜実験２．反応温度がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例２）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図４に示すように、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、実施例１と同様に、この混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、７．０％であった。なお、本実施例は、実施例１と同条件であるが、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）の測定結果が異なっているのは、キハダマグロから取り出した心臓動脈球の水分含有量が一定していないからである。このため、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）による測定結果は、各実験内において相対的に比較するために使用する。
【００４１】
（実施例３）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を６０℃で４時間加熱した点以外は、実施例２と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、６．６％であった。
【００４２】
（実施例４）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で４時間加熱した点以外は、実施例２と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４３】
（実施例５）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を８０℃で４時間加熱した点以外は、実施例２と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４４】
実施例２〜５において示される通り、加熱時間を全体で４時間とした場合には、加熱温度がサーモリシン及びパパインの至適温度ではない実施例３では、エラスチン由来ペプチドの収量は相対的に少なかったが、加熱温度がサーモリシン及び／又はパパインの至適温度であるその他の実施例では、エラスチン由来ペプチドの収量に差は見られなかった。
【００４５】
＜実験３．酵素の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例６）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図５に示すように、サーモリシン０．０２５ｇと、パパイン０．０７５ｇとを添加した。
そして、実施例１と同様に、この混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、７．２％であった。
【００４６】
（実施例７）
サーモリシンとパパインを、それぞれ０．０５ｇずつ添加した点以外は、実施例６と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４７】
（実施例８）
サーモリシンを０．０７５ｇ、及びパパインを０．０２５ｇ添加した点以外は、実施例６と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．０％であった。
【００４８】
サーモリシンとパパインの添加比率を、実施例６〜８のように、原料の心臓動脈球の重量に対して、サーモリシン０．２５重量％〜０．７５重量％、パパイン０．７５重量％〜０．２５重量％の範囲で変えても、エラスチン由来ペプチドの収量にほとんど差は見られなかった。
【００４９】
＜実験４．反応温度の比率がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例９）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、図６に示すように、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、この混合液を８０℃で８時間加熱した。
得られた溶液に対して、可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した結果、８．４％であった。
【００５０】
（実施例１０）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で２時間加熱した後、次いで８０℃で６時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、８．６％であった。
【００５１】
（実施例１１）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で４時間加熱した後、次いで８０℃で４時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、９．０％であった。
【００５２】
（実施例１２）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で６時間加熱した後、次いで８０℃で２時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、８．２％であった。
【００５３】
（実施例１３）
サーモリシンとパパインを添加した混合液を７０℃で８時間加熱した点以外は、実施例９と同様にして行った。
その結果、得られた溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）は、７．６％であった。
【００５４】
上述した実験２では、反応時間が４時間の場合、加熱温度条件によりエラスチン由来ペプチドの収量に差は見られなかったが、反応時間をより長くした結果、まずサーモリシンの至適温度内である７０℃で反応させた後、次いでパパインの至適温度である８０℃で反応させることで、エラスチンがより効率的に分解されることが明らかとなった。
【００５５】
＜実験５．反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例１４）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、この混合液を７０℃で７時間加熱し、１時間ごとに溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した。その結果を図７に示す。
同図に示すように、反応開始から１時間目までは、可溶性固形分は急激に増加し、その後は緩やかに上昇した。また、５時間以上反応させても可溶性固形分は増えなかった。このことから、酵素を十分に添加して反応温度を７０℃とした場合、反応時間は１時間以上５時間以下とすることが適切であることがわかる。
【００５６】
＜実験６．二段階加熱による反応時間がエラスチン由来ペプチドの収量に及ぼす影響＞
（実施例１５）
実施例１と同様にして、新たに精製したエラスチンを得た。この精製したエラスチンのうち１０ｇに対して、１／１５Ｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０ｍｌ加えた後、サーモリシン０．０５ｇと、パパイン０．０５ｇとを添加した。
そして、この混合液を７０℃で３時間加熱した後、次いで８０℃で５時間加熱し、１時間ごとに溶液の可溶性固形分（Ｂｒｉｘ）を測定した。その結果を図８に示す。
【００５７】
同図に示すように、７０℃で３時間加熱した後、８０℃に温度を上げた場合、可溶性固形分は反応開始から１時間目まで急激に増加した後は緩やかに上昇した。また、８０℃での最初の１時間（３時間目〜４時間目）にやや大きく増加した後、４時間目までは緩やかに増加し、４時間以上反応させても増加は見られなかった。
このことから、酵素を十分に添加して７０℃で３時間加熱した後、８０℃に温度を上げた場合は、８０℃での加熱時間は１時間以上４時間以下とすることが適切であると考えられる。
【００５８】
以上の実験結果から、サーモリシンとパパインを組み合わせて用いることで、エラスチンの分解効率をより向上させ得ることが明らかとなった。すなわち、これらをそれぞれ単独で使用する場合と比較して、サーモリシンのみの場合に対して約１１％、パパインのみの場合に対して約３６％の収量の向上が見られた。
また、実施例１４では、収量が急激に増加した後の反応１時間目の可溶性固形分が６．８％であるのに対して、可溶性固形分の増加が停止した反応５時間目の可溶性固形分は８．２％であり、この間の収量の増加は、約２１％となっている。
これに対して、実施例１５では、収量が急激に増加した後の反応１時間目の可溶性固形分が６．０％であるのに対して、反応７時間目（８０℃で３時間目）の可溶性固形分は８．８％であり、この間の収量を約４２％増加させることができている。
このように、７０℃のみの場合では５時間で可溶性固形分の増加が停止したのに対し、７０℃と８０℃の二段階で反応させることによって、７時間に亘って可溶性固形分を増加させることができ、その分エラスチン由来ペプチドの収量を大きく増加させることが可能となっている。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、食品の成分等として利用するためのエラスチン由来ペプチドの製造において好適に利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により不溶物を回収し、この不溶物にサーモリシンとパパインを添加してエラスチンを分解することを特徴とするエラスチン由来ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記エラスチンを含有する肉が、マグロの心臓動脈球であることを特徴とする請求項１記載のエラスチン由来ペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記不溶物にサーモリシンとパパインを添加し、６５〜７０℃で加熱したのちに、次いで８０℃で加熱することを特徴とする請求項１又は２記載のエラスチン由来ペプチドの製造方法。
【請求項４】
エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により回収された不溶物をサーモリシンとパパインにより分解してなることを特徴とするエラスチン由来ペプチド。
【請求項１】
エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により不溶物を回収し、この不溶物にサーモリシンとパパインを添加してエラスチンを分解することを特徴とするエラスチン由来ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記エラスチンを含有する肉が、マグロの心臓動脈球であることを特徴とする請求項１記載のエラスチン由来ペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記不溶物にサーモリシンとパパインを添加し、６５〜７０℃で加熱したのちに、次いで８０℃で加熱することを特徴とする請求項１又は２記載のエラスチン由来ペプチドの製造方法。
【請求項４】
エラスチンを含有する肉を細断してアルカリ分解したのち、濾過により回収された不溶物をサーモリシンとパパインにより分解してなることを特徴とするエラスチン由来ペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２３９９１９（Ｐ２０１０−２３９９１９Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９４１５４（Ｐ２００９−９４１５４）
【出願日】平成２１年４月８日（２００９．４．８）
【出願人】（５９１２７３９６０）はごろもフーズ株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月８日（２００９．４．８）
【出願人】（５９１２７３９６０）はごろもフーズ株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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