エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイスワクチンとその使用方法
【課題】本発明は、組成物、エリシペロスリックスルシオパチアに対する改善された一回投与ワクチン、およびエリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスとに対する改善された一回投与ワクチンを提供し、それらは以下の項目を提供する。
【解決手段】１）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する効果的な免疫を与え、２）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイス感染における臨床的兆候が現れる危険を減少させ、３）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫反応を誘発し、４）少なくとも4ヶ月間のエリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫持続期間を保持する。複合エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイス組成物またはワクチンそれぞれに加えて、組成物およびエリシペロスリックスルシオパチアワクチンが、不活性化されたエリシペロスリックスルシオパチア菌の菌成分と適切なアジュバントを含む。さらに、複合エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイス組成物またはワクチンは、ハエモフィルスパラスイス抗原を含む。ワクチンは、動物に対していかなる慣用的方法によって投与されてもよい。筋肉内投与での投与量は好ましくは５ｍｌ未満である。エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの一回の投与量は、ワクチンまたは組成物を接種する動物において免疫反応を誘導するのに十分な量でなければならず、それによって好ましくは効果的な免疫を与え、適切な免疫持続期間、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの感染によって生じる臨床的兆候が現れる危険を減少させるだろう。
【解決手段】１）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する効果的な免疫を与え、２）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイス感染における臨床的兆候が現れる危険を減少させ、３）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫反応を誘発し、４）少なくとも4ヶ月間のエリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫持続期間を保持する。複合エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイス組成物またはワクチンそれぞれに加えて、組成物およびエリシペロスリックスルシオパチアワクチンが、不活性化されたエリシペロスリックスルシオパチア菌の菌成分と適切なアジュバントを含む。さらに、複合エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイス組成物またはワクチンは、ハエモフィルスパラスイス抗原を含む。ワクチンは、動物に対していかなる慣用的方法によって投与されてもよい。筋肉内投与での投与量は好ましくは５ｍｌ未満である。エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの一回の投与量は、ワクチンまたは組成物を接種する動物において免疫反応を誘導するのに十分な量でなければならず、それによって好ましくは効果的な免疫を与え、適切な免疫持続期間、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの感染によって生じる臨床的兆候が現れる危険を減少させるだろう。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリシペロスリックスルシオパチアに対するワクチンとハエモフィルスパラスイスに対するワクチンに関する。さらに詳しくは、本発明はエリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスに対する効果的な免疫を与えるワクチンとその作成方法に関する。さらにまた詳しくは、一回投与により、望ましい免疫持続期間を与えるワクチンに関する。さらにいっそう詳しくは、本発明はワクチンを摂取している動物の平均寿命に相当する免疫持続期間を与える一回投与ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
エリシペロスリックスルシオパチアは、ブタやヒツジ、コヒツジ、ウシ、カモ、シチメンチョウ、およびヒトを含む50種類以上の脊椎動物、無脊椎動物に病原性のあるグラム陽性菌である。ハエモフィルスパラスイスはブタをはじめとする多くの動物に病原性のあるグラム陰性菌である。エリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスに対するワクチンは一般的には分割され、エリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスに対する効果的な免疫を保持させるため、動物の一生涯にわたる複数投与からなる。現在、一回の投与で済むハエモフィルスパラスイスに対するワクチンは存在するが、エリシペロスリックスルシオパチアに対するワクチンを別に与える必要がある。技術上、よく知られているように、一回以上の投与を必要とするワクチンの問題点は、どの動物が一回目、および／または二回目、またはそれ以降に投与されてしまっているかを記録し、初めて投与されたときに記録し、実際に投与するのに必要な時間と費用、一回目とそれ以降に投与する間の動物の成長、動物、および続けて投与する人への傷害の増大する危険、および複数投与を与えるに伴う費用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この技術に必要なことは、ワクチンを受けた動物に効果的な免疫を与える一回投与法であり、そのワクチンが、現在ワクチンによって得られるそれより長期の免疫持続期間を提供することである。さらに必要なものは、一回の投与によって約6ヶ月の免疫持続期間を与えるエリシペロスリックスルシオパチアに対するワクチンである。さらにまた必要なものは、ただ一回だけのワクチン投与後、約6ヶ月の免疫持続期間を与えるエリシペロスリックスルシオパチアおよびハエモフィルスパラスイスに対するワクチンである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、従来法の欠点を克服し、技術水準における目覚しい発展を提供する。とりわけ、現在の発明は一回の投与でよく、ひとつ、またはそれ以上の以下の項目を与えるワクチンを提供する。１）エリシペロスリックスルシオパチアに対する効果的な免疫を与え、２）エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させ、３）エリシペロスリックスルシオパチアに対する免疫反応を誘導し、４）少なくとも4ヶ月、より好ましくは少なくとも約5ヶ月、もっとも好ましくは少なくとも約6ヶ月の免疫持続期間を保持する。本発明は、一つかそれ以上の以下の項目を与える複合ワクチンをも提供する。１）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する効果的免疫を与え、２）ワクチンの一回投与によりエリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの臨床的兆候が現れる危険を減少させ、３）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫反応を誘導し、４）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫持続期間を少なくとも約4ヶ月、より好ましくは少なくとも約１３２日、より好ましくは少なくとも約5ヶ月、もっとも好ましくは少なくとも約6ヶ月、または少なくとも約１６２日与える。好ましくは、複合ワクチンもまた、一回投与により与えられてもよい。
【０００５】
エリシペロスリックスルシオパチアワクチンは不活性化されたエリシペロスリックスルシオパチア菌の菌成分と相当するアジュバント（抗原性補強剤）とを含む。アジュバントは投与法に基づいて選択され、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）完全、非完全アジュバントのようなミネラルオイル系アジュバント、ＩＳＡのようなモンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）非完全セピック（Ｓｅｐｐｉｃ）アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバントシステムやムラミルジペプチドを含むシンタクスアジュバント製剤のようなオイルインウォーターエマルジョンアジュバント、またはアルミニウム塩アジュバントを含む。アジュバントは、ミネラルオイル系アジュバントが好ましく、より好ましくはＩＳＡ２０６（ＳＥＰＰＩＣ、Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）である。組成物は、医薬的に適切な担体または賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）のいずれかひとつまたはその組み合わせを含むが、緩衝液、安定剤、希釈剤、保存料、および溶解補助剤に制約はない。ワクチンは、口、鼻空内、筋肉内、リンパ節内、真皮内、腹腔内、皮下、およびそれらの組み合わせを含むいずれかの慣用的方法で、もっとも好ましくは筋肉内注射によって、エリシペロスリックスルシオパチアによる感染に弱い動物、好ましくは哺乳動物、よりさらに好ましくはブタに対して投与される。筋肉内注射による投与量は、好ましくは約５ｍｌ以下、さらにまた好ましくは１ｍｌと３ｍｌとの間、もっとも好ましくは約２ｍｌである。
【０００６】
エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイス複合ワクチンは、エリシペロスリックスルシオパチアおよびハエモフィルスパラスイス両方の不活性化された菌成分と相当するアジュバントを含む。好ましくは、アジュバントはミネラル−オイル系、もっとも好ましくはＩＳＡ２０６である。ワクチンは、口、鼻空内、筋肉内、リンパ内、真皮内、腹腔内、皮下、およびそれらの組み合わせを含むいずれかの慣用的方法で、もっとも好ましくは筋肉内注射によって、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスによる感染に弱い動物、好ましくは哺乳動物、よりさらに好ましくはブタに対して投与される。筋肉内注射が選択された投与経路の場合、投与量は好ましくは約５ｍｌ以下、よりさらに好ましくは１ｍｌと３ｍｌとの間、もっとも好ましくは約２ｍｌである。エリシペロスリックスルシオパチア抗原の一回の投与量は、ワクチンを投与した動物に対して効果的な免疫を与え、エリシペロスリックスルシオパチア感染から生じる臨床的兆候が発展する危険を減少させるために十分なものではなければならない。好ましくは、エリシペロスリックスルシオパチア抗原の量は約５ｍｌ以下、より好ましくは約０．２から３ｍｌで、さらにまた好ましくは０．３から１．５ｍｌまでの間、さらに好ましくは約０．４から０．８ｍｌまでの間、さらにまた好ましくは約０．６ｍｌである。ハエモフィルスパラスイス抗原の一回の投与量は約５ｍｌ以下、より好ましくは約０．１から３ｍｌまでの間、さらにより好ましくは約０．１５から１．５ｍｌまでの間、さらに好ましくは約０．２から０．６ｍｌまでの間、さらにより好ましくは約０．４ｍｌである。測定法で異なるが、ハエモフィルスパラスイス抗原の一回の投与量に少なくとも１．５ｘ10７ｃｆｕ、より好ましくは約１．５ｘ10８から１．５ｘ10１０ｃｆｕとの間、さらにより好ましくは約１．5ｘ１0９ｃｆｕが含まれる。とりわけ好ましい２ｍｌの投与のうち、約０．６ｍｌはエリシペロスリックスルシオパチア抗原、約１．０ｍｌはアジュバント、約０．４ｍｌはハエモフィルスパラスイス抗原である。好ましくは、菌は慣用的な不活性化方法と特別に慣用的なホルマリン不活性化法で不活性化される。
【０００７】
本発明のワクチンと組成物は、一般的に、免疫応答−刺激治療、または予防ワクチンとして、動物へ免疫反応を誘導するのに有用である。好ましくは、本発明の組成物またはワクチンの投与は、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候の深刻化を減少させたり発症を遅らせたりすることを含むさまざまな方法で、ワクチンを接種した動物を保護する免疫反応をもたらす。さらにまた好ましくは、組成物またはワクチンの投与は、たとえ有毒な形態のエリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスにさらされたり攻撃されたりした後でさえ、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候が現れる危険の減少をもたらす。とりわけ好ましい方法では、組成物、またはワクチンの投与は、このような臨床的兆候を完全に妨げるという結果をもたらす。
【０００８】
さまざまな慣用法が、免疫反応が動物へ導入されたかどうかを決定するために使用できる。たとえば、組成物やワクチンを接種している動物は、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの有毒形態に攻撃され、攻撃後、しばらくの間は感染の臨床的兆候の発症が観察される。組成物やワクチンの投与によって免疫反応が導入されたかどうかを決定する代替法は、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの一つまたはそれ以上の抗原に対する抗体に対して、動物からの生態標本を分析することであった。このような方法はこの分野では一般的であり、適切な抗体分析を当業者が決定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施様態を示す。これらの実施例は説明のためのものであり、これにより何ら本発明の総体的な範囲を限定するものでないと理解されるべきである。
【実施例１】
【００１０】
この実施例は、好ましくは一回投与によるハエモフィルスパラスイス−エリシペロスリックスルシオパチアワクチンがもたらす、有毒なエリシペロスリックスルシオパチアに対する免疫の効能と持続期間に関する資料を提供する。
【００１１】
材料および方法
いずれも過去にエリシペロスリックスバクテリンまたはワクチンを接種していない生後3から4週目の全部で37匹のブタがこの実施例を導く研究に使用された。本研究が行われる間、動物は大きさ、年齢、およびその他の物理的特徴にふさわしい食事を与えられた。水は随時与えられた。動物は、その年齢に適した全体、または部分羽根板、機械制御換気装置、および補助ヒーターと光源を備え付けたブタ家畜小屋に居住させた。
【００１２】
実験の2日前、全てのブタは健康診断と仮性狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）菌のワクチン投与を受けた。研究の1日目、ブタは二つのグループに分けられた。グループ1は、1日目にアジュバントＩＳＡ２０６を含むハエモフィルスパラスイス−エリシペロスリックスルシオパチアバクテリン（以下、ＨＰＥという）(ベーリンガー インゲルヘイム ヴェトメディカ アイエヌシー， Ｓｔ． Ｊｏｓｅｐｈ， ＭＯ製）を首の左に２ｍｌ筋肉内注射により投与した23匹のブタから構成された。エリシペロスリックスルシオパチア抗原は、１回投与当たり０．６ｍｌの率の収穫抗原（ｈａｒｖｅｓｔ ａｎｔｉｇｅｎ）を含んでいた。グループ２のコントロールは、何も処置されていない１４匹のブタから構成された。実験２１、５４、および１６１日目、すべての動物は、ワクチンによる血清変換の観察のため採血された。
【００１３】
実験１６２日目、すべてのブタ（１６２日目より以前に付随的事故により死亡した３匹を除く）はエリシペロスリックスルシオパチアＥＬ−６Ｐの有毒菌株により攻撃された。全てのブタは、７日間一般的健康状態とエリシペロスリックスルシオパチアの臨床的兆候を観察された。攻撃から７日後、すべての動物は安楽死させ、そのうち９ＣＦＲ １１３．６７に規定されたエリシペロスリックスルシオパチアに特徴的な2日間連続した執拗な臨床的兆候および／または高い体温を示したものは解剖された。解剖は、実験中死亡した全ての動物に対しても施行された。重大な損傷は評価、記録され、組織は採取され、菌培養のため研究室へ送られた。
【００１４】
上記実験（プロトコル）のまとめを表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
結果と議論
グループ２の１３匹全てのブタは攻撃を受け、エリシペロスリックスルシオパチアによる感染の臨床的兆候である華氏１０６．５度以上の高い体温を示すか、または有毒なエリシペロスリックスルシオパチアによる攻撃後、死亡した。グループ２の１３匹中９匹のブタからエリシペロスリックスルシオパチアが回収され、グループ２の１３匹中６匹は攻撃後、死亡した。対照的に、グループ１のうち２１匹中２０匹は健康状態を保ち、ワクチン投与後１６２日間、エリシペロスリックスルシオパチアによる有毒な攻撃から保護されていた。グループ１のうち、攻撃後、死亡したものは一匹もいなかった。攻撃後、健康状態を保たなかったグループ１のブタからはエリシペロスリックスルシオパチアは回収されなかった。表２は有病率の結果と分析、表３は死亡率の結果を示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３】
【００１９】
【表４】
【００２０】
【表５】
【００２１】
ワクチン投与後１６２日目に有毒なエリシペロスリックスルシオパチアの攻撃を受けた、ワクチン投与を受けたもの（ｖａｃｃｉｎａｔｅｓ）は、コントロールに比べてよく保護されていた。ワクチン投与を受けていないコントロールの１００％は病気を発症し、４６％は攻撃後に死亡した。反対に、ＨＰＥの一回投与は攻撃されたブタの９５%を保護し、ワクチン投与を受けたブタは攻撃後一匹も死ななかった。本実験の結果は、生後３週間またはそれ以上の飼育ブタにおける豚丹毒の予防と制御のため、一回投与法によるＨＰＥの少なくとも１６２日間の免疫持続期間を確証するものである。
【実施例２】
【００２２】
この実施例は、ワクチン投与後、有毒なハエモフィルスパラスイスの攻撃に対するワクチンの好ましくは一回投与による免疫持続期間を示す。
【００２３】
実験器具と実験方法
この実施例に対する本研究は、いずれも過去にハエモフィルスパラスイスバクテリンまたはワクチンを接種していない生後３から４週間の３６匹のブタから開始した。本実験の間、動物は大きさ、年齢、またその他の物理的特徴にふさわしい食料を与えられた。水は随時供給された。
【００２４】
実験の一日目、ブタは２つのグループに分類された。グループ１は、一日目に、アジュバントＩＳＡ ２０６を含むハエモフィルスパラスイスバクテリン（以下、ＨＰＥという）(ベーリンガー インゲルヘイム ヴェトメディカ， アイエヌシー， Ｓｔ． Ｊｏｓｅｐｈ， ＭＯ製）を２ｍｌ筋肉内注射により投与した、２３匹のブタから構成された。ハエモフィルスパラスイス抗原は、一回投与当たり１．５ｘ１０９ｃｆｕを含んでいた。グループ２はコントロールで、何も処置を受けていない１３匹のブタから構成された。
【００２５】
実験後１３２日目、グループ２からの１１匹とグループ１からの１７匹のブタは健康で、ハエモフィルスパラスイスの有毒菌株の攻撃を受けるのに適切であった。攻撃を受けなかった８匹のブタ（グループ１から６匹、グループ２から２匹）は、不健康であるかワクチン接種とは関連のない理由のため死亡していた。全てのブタは、その後７日間、一般的健康状態とハエモフィルスパラスイスの臨床的兆候を観察された。解剖は、実験中死亡した全ての動物に対して施行され、必要と思われる場合、死亡原因である菌の解明のため組織が摘出された。攻撃後７日目、すべての動物は安楽死させられ、そのうちハエモフィルスパラスイスに特有な２日間連続した執拗な臨床的兆候および／または高い体温を示したものは解剖された。重大な損傷は評価、記録され、組織は採取して菌培養のため研究室へ送られた。
【００２６】
以上の実験のまとめを表４に示す。
【００２７】
【表６】
【００２８】
結果と議論
ハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候は、コントロールグループ１１匹のうち８匹のブタに対してあらわれ、解剖により１１匹中７匹がハエモフィルスパラスイスに特徴的なひどい死後の損傷をもっていたことがわかった。攻撃後、全部で６匹のコントロールブタが死亡し、その６匹中５匹がハエモフィルスパラスイスに特徴的なひどい損傷（ｇｒｏｓｓ ｌｅｓｓｉｏｎｓ）を受けていた。２日かそれ以上の間、末期の臥床状態（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｃｕｍｂｅｎｃｙ）に至る深刻な臨床的兆候が２匹以上のブタに発症した。これらのブタは、解剖の際ハエモフィルスパラスイスに特徴的な損傷も受けていた。変化の見られた８匹のコントロールブタのうち、６匹は菌培地でハエモフィルスパラスイスに対し陽性であった。残りの３匹は、ハエモフィルスパラスイスに由来するいかなる病気の兆候も示さなかった。
【００２９】
対照的に、グループ１からの１７匹中１６匹のブタは、ワクチン投与後１３２日間、ハエモフィルスパラスイスの有毒な攻撃から保護されていた。グループ１からの１匹は、攻撃後死亡した。攻撃後死亡した一匹のグループ１のブタからはハエモフィルスパラスイスは回収されなかったが、病気の発症に伴った死後の傷害が見られた。表５に有病率の結果を、表６に死亡率の結果を示した。
【００３０】
【表７】
【００３１】
【表８】
【００３２】
【表９】
【００３３】
【表１０】
【００３４】
ワクチン投与後１３２日目に有毒なハエモフィルスパラスイスの攻撃を受けた、ワクチン投与を受けたものは、コントロールに比べてよく保護されていた。ワクチンを受けていないコントロールのうち７３％が病気を発症し、５５％が攻撃後死亡した。比較すると、ＨＰＢの一回投与は攻撃された９４％のブタを保護した。統計的にみて、ワクチンを受けたものは、コントロールに比べてハエモフィルスパラスイスに由来する死亡率が極めて低かった。本実施例の結果は、生後３週間かそれ以上の養殖ブタにおいて、一回投与法により、少なくとも１３２日間のＨＰＢに対する免疫の持続期間を確認した。
【実施例３】
【００３５】
この実施例は、本発明のワクチン調整の好ましい方法を記述するものである。
【００３６】
試料および方法
エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイスバクテリン組成物は、エリシペロスリックスルシオパチアおよびハエモフィルスパラスイスの菌株ＳＥ−９とＺ−１５１７をそれぞれ含む。これらの菌株はＡＴＣＣに寄託され、それぞれ寄託番号ＰＴＡ−６２６１とＰＴＳ−６２６２が与えられた。それぞれのシード原料は、特徴的な成長パターンとグラム染色反応、および生化学的検査によって識別される。シード原料の毒性はマウスへの殺傷力および／または感染しやすいブタにおける臨床的兆候の発症力によって決定される。
【００３７】
エリシペロスリックスルシオパチアに対する成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ）の構成成分を表７に示す。ハエモフィルスパラスイスに対する成長培地の構成成分を表８に示す。
【００３８】
【表１１】
【００３９】
【表１２】
【００４０】
エリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスシード培養菌の両方の菌株は５００から２０，０００ｍｌの容器（ｖｅｓｓｅｌ）中で育てなければならない。それらの生産培養菌は２０−１０００Lの容器で育てる。両菌株のマスターシード（親種）とワーキングシードは−６０°Ｃ以下で保存しなければならない。
【００４１】
シーディングまたは接種（ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）のためのエリシペロスリックスルシオパチアの懸濁培養菌を調整するため、マスターシードは液体層に戻され、１−２ｍｌがワーキングシード培地へ接種される。その後、培養菌は統計的に３４−３８°Ｃ、６−２４時間培養される。培養菌は、その後、５％ヒツジ血液寒天培地中のみかけのコロニー、細胞形態、およびグラム染色によって純度を測定される。保存のため同量の安定剤が加えられ、寒冷管（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）へ分配される。
【００４２】
シーディングまたは接種のためのハエモフィルスパラスイスの懸濁培養菌を調整するため、マスターシードは液体層に戻され、ワーキングシード培地へ接種される。培養菌は、その後３４−３８°Ｃ、１２−１８時間攪拌される。それから培養菌は、５％ヒツジ血液寒天培地中のみかけのコロニー、細胞形態、およびグラム染色によって純度を測定される。保存のため同量の安定剤が加えられ、寒冷管へ分配される。
【００４３】
エリシペロスリックスルシオパチアの接種のため、ワーキングシード１−１２ｍｌは５００−１８，０００ｍｌの培地を含むガラス容器へ接種され、生産シードが調整される。生産培養菌を調整するため、５％（ｖ／ｖ）までの生産シードは、２０−１０００L管を用い、培地１５−７５０Ｌ中へ接種される。生産培養菌は、５％ヒツジ血液寒天培地中に画線され、３４−３８°Ｃ，２４−４８時間培養され、コロニー形態を観察することによって純度を測定される。
【００４４】
ハエモフィルスパラスイスの接種のため、１−１０ｍｌのワーキングシードが５００−１８，０００ｍｌの培地を含むガラス管へ接種され、生産シードが作成される。７％（ｖ／ｖ）までの生産シードは、２０−１０００L管を用い、培地１４−７５０L中へ接種し、生産培養菌が作成される。生産培養菌は、ＮＡＤ画線を追加した５％ヒツジ血液寒天培地中に画線され、３４−３８°Ｃ、１８−２４時間培養、コロニー形態を観察することによって純度を測定される。
【００４５】
エリシペロスリックスルシオパチアの接種のため、シード培養菌は３４−３８°Ｃ、６−２４時間、好気的条件下で培養される。生産培養菌は３４−３８°Ｃ、６−１２時間、随時攪拌しながら好気的条件下で培養される。ハエモフィルスパラスイスの培養のため、シード、生産培養菌は、攪拌し随時圧縮空気を散布しながら、３４−３８°Ｃ、６−１２時間培養される。
【００４６】
エリシペロスリックスルシオパチアの成長期間、ｐＨは２Ｍトリスによって調整され、培養期間中、異常な成長やコンタミネーションの兆候の形跡を見るために培養菌は肉眼で観察される。培地は接種前に懸濁している。成長にともなって、沈殿が観察されるだろう。％透過度を測るためにサンプルが採取される。純度は５％ヒツジ血液寒天培地中のコロニー形態および／またはグラム染色によって決定される。十分な懸濁の肉眼による観察は培養菌が採取期を迎えていることを示している。これは、生産培養菌の接種後６−１２時間の間に起こるだろう。
【００４７】
ハエモフィルスパラスイスに対して、異常な成長やコンタミネーションの兆候の形跡を見るために培養期間中、培養菌は肉眼で観察される。直接数えるために、サンプルが採取される。純度はＮＡＤ画線を追加した５％ヒツジ血液寒天培地中のコロニー形態および／またはグラム染色によって決定される。十分な懸濁の肉眼による観察とｐＨの低下（＜７．０）は、培養菌が採取期を迎えていることを示している。これは、生産培養菌の接種後６−１２時間の間に起こるだろう。
【００４８】
どちらの種に対しても、それぞれの生産培養菌は純度と％透過率の試験のためサンプリングされ、それぞれの生産培養菌容器が不活性化のため作成された。エリシペロスリックスルシオパチアに対しては、生産培養菌は記載されたとおりの特徴的成長を示し、％透過率は６２０ｎｍにおいて４０％以下、コンタミネーションの兆候なしとしなければならない。ハエモフィルスパラスイスに対しては、生産培養菌は顕微鏡観察において５ｘ１０７ｏｒｇａｎｉｓｍｓ／ｍｌ以上、コンタミネーションの兆候なしとなるだろう。
【００４９】
両菌株は、０．５％（ｖ／ｖ）以下のホルマリンを生産培養菌へ添加することによって不活性化される。不活性化は２０−３８°Ｃ、１２−７２時間、随時攪拌しながら行われる。不活性化された菌株は、その後２−７°Ｃに保存される。不活性化は標準技術によって確認される。
【００５０】
アジュバントＩＳＡ２０６は３０−６５％（ｗ／ｖ）添加される。不活性化された培養菌はＩＳＡ２０６との均質化によって乳化される。３５％重亜硫酸ナトリウムがフリーのホルムアルデヒドを中和するために分画、または生成物に添加されてもよい。ホルムアルデヒド溶液は、最終生成物において０．２％を超えない濃度で分画、または生成物の集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に添加されてもよい。
【００５１】
その結果得られる生成物は、その後、無菌密閉ループシステム中、分子量１００，０００カットオフの中空繊維ろ過装置、または無菌デカンテーション固定培養によって濃縮され、２ｘ１０１０ｏｒｇａｎｉｓｍ／ｍｌ以下の濃度とされる。
【００５２】
エリシペロスリックスルシオパチアは％透過率と濃度によって標準化される。ハエモフィルスパラスイスは菌体を直接数えることによって標準化される。
【実施例４】
【００５３】
この実施例は、本発明の好ましいワクチンの異なるワクチン成分の組み合わせを示す。
【００５４】
試料と方法
本発明に基づいたワクチンは、エリシペロスリックスルシオパチア培養菌９０，０００ｍｌ（透過率４０％のエリシペロスリックスルシオパチア培養菌９０，０００ｍｌを示す）、ハエモフィルスパラスイス培養菌５６，２５０ｍｌ（４ｘ１０９ｏｒｇａｎｉｓｍ/ｍｌのハエモフィルスパラスイス培養菌５６，２５０ｍｌを示す）、滅菌ＲＯ水２，２５０ｍｌ、ＩＳＡ２０６ １５０，０００ｍｌ、および３５％重硫酸ナトリウム水溶液１，５００ｍｌの組み合わせにより構成されてもよい。滅菌３５％重硫酸ナトリウム水溶液もまた、必要に応じホルムアルデヒド濃度を０．２％ホルムアルデヒド溶液まで中和するために用いられる。得られる混合物のｐＨは、必要に応じ１０Ｎ水酸化ナトリウムまたは５Ｎ塩酸の添加によって６．２−７．２に調整される。
【００５５】
この混合物は、２ｍｌ中、採取培養菌（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ）で透過率４０％、０．３−０．９ｍｌに相当する濃度のエリシペロスリックスルシオパチア、および少なくとも１．５ｘ１０９ｏｒｇａｎｉｓｍのハエモフィルスパラスイスを提供しなければならない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリシペロスリックスルシオパチアに対するワクチンとハエモフィルスパラスイスに対するワクチンに関する。さらに詳しくは、本発明はエリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスに対する効果的な免疫を与えるワクチンとその作成方法に関する。さらにまた詳しくは、一回投与により、望ましい免疫持続期間を与えるワクチンに関する。さらにいっそう詳しくは、本発明はワクチンを摂取している動物の平均寿命に相当する免疫持続期間を与える一回投与ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
エリシペロスリックスルシオパチアは、ブタやヒツジ、コヒツジ、ウシ、カモ、シチメンチョウ、およびヒトを含む50種類以上の脊椎動物、無脊椎動物に病原性のあるグラム陽性菌である。ハエモフィルスパラスイスはブタをはじめとする多くの動物に病原性のあるグラム陰性菌である。エリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスに対するワクチンは一般的には分割され、エリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスに対する効果的な免疫を保持させるため、動物の一生涯にわたる複数投与からなる。現在、一回の投与で済むハエモフィルスパラスイスに対するワクチンは存在するが、エリシペロスリックスルシオパチアに対するワクチンを別に与える必要がある。技術上、よく知られているように、一回以上の投与を必要とするワクチンの問題点は、どの動物が一回目、および／または二回目、またはそれ以降に投与されてしまっているかを記録し、初めて投与されたときに記録し、実際に投与するのに必要な時間と費用、一回目とそれ以降に投与する間の動物の成長、動物、および続けて投与する人への傷害の増大する危険、および複数投与を与えるに伴う費用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この技術に必要なことは、ワクチンを受けた動物に効果的な免疫を与える一回投与法であり、そのワクチンが、現在ワクチンによって得られるそれより長期の免疫持続期間を提供することである。さらに必要なものは、一回の投与によって約6ヶ月の免疫持続期間を与えるエリシペロスリックスルシオパチアに対するワクチンである。さらにまた必要なものは、ただ一回だけのワクチン投与後、約6ヶ月の免疫持続期間を与えるエリシペロスリックスルシオパチアおよびハエモフィルスパラスイスに対するワクチンである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、従来法の欠点を克服し、技術水準における目覚しい発展を提供する。とりわけ、現在の発明は一回の投与でよく、ひとつ、またはそれ以上の以下の項目を与えるワクチンを提供する。１）エリシペロスリックスルシオパチアに対する効果的な免疫を与え、２）エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させ、３）エリシペロスリックスルシオパチアに対する免疫反応を誘導し、４）少なくとも4ヶ月、より好ましくは少なくとも約5ヶ月、もっとも好ましくは少なくとも約6ヶ月の免疫持続期間を保持する。本発明は、一つかそれ以上の以下の項目を与える複合ワクチンをも提供する。１）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する効果的免疫を与え、２）ワクチンの一回投与によりエリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの臨床的兆候が現れる危険を減少させ、３）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫反応を誘導し、４）エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスに対する免疫持続期間を少なくとも約4ヶ月、より好ましくは少なくとも約１３２日、より好ましくは少なくとも約5ヶ月、もっとも好ましくは少なくとも約6ヶ月、または少なくとも約１６２日与える。好ましくは、複合ワクチンもまた、一回投与により与えられてもよい。
【０００５】
エリシペロスリックスルシオパチアワクチンは不活性化されたエリシペロスリックスルシオパチア菌の菌成分と相当するアジュバント（抗原性補強剤）とを含む。アジュバントは投与法に基づいて選択され、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）完全、非完全アジュバントのようなミネラルオイル系アジュバント、ＩＳＡのようなモンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）非完全セピック（Ｓｅｐｐｉｃ）アジュバント、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバントシステムやムラミルジペプチドを含むシンタクスアジュバント製剤のようなオイルインウォーターエマルジョンアジュバント、またはアルミニウム塩アジュバントを含む。アジュバントは、ミネラルオイル系アジュバントが好ましく、より好ましくはＩＳＡ２０６（ＳＥＰＰＩＣ、Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）である。組成物は、医薬的に適切な担体または賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）のいずれかひとつまたはその組み合わせを含むが、緩衝液、安定剤、希釈剤、保存料、および溶解補助剤に制約はない。ワクチンは、口、鼻空内、筋肉内、リンパ節内、真皮内、腹腔内、皮下、およびそれらの組み合わせを含むいずれかの慣用的方法で、もっとも好ましくは筋肉内注射によって、エリシペロスリックスルシオパチアによる感染に弱い動物、好ましくは哺乳動物、よりさらに好ましくはブタに対して投与される。筋肉内注射による投与量は、好ましくは約５ｍｌ以下、さらにまた好ましくは１ｍｌと３ｍｌとの間、もっとも好ましくは約２ｍｌである。
【０００６】
エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイス複合ワクチンは、エリシペロスリックスルシオパチアおよびハエモフィルスパラスイス両方の不活性化された菌成分と相当するアジュバントを含む。好ましくは、アジュバントはミネラル−オイル系、もっとも好ましくはＩＳＡ２０６である。ワクチンは、口、鼻空内、筋肉内、リンパ内、真皮内、腹腔内、皮下、およびそれらの組み合わせを含むいずれかの慣用的方法で、もっとも好ましくは筋肉内注射によって、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスによる感染に弱い動物、好ましくは哺乳動物、よりさらに好ましくはブタに対して投与される。筋肉内注射が選択された投与経路の場合、投与量は好ましくは約５ｍｌ以下、よりさらに好ましくは１ｍｌと３ｍｌとの間、もっとも好ましくは約２ｍｌである。エリシペロスリックスルシオパチア抗原の一回の投与量は、ワクチンを投与した動物に対して効果的な免疫を与え、エリシペロスリックスルシオパチア感染から生じる臨床的兆候が発展する危険を減少させるために十分なものではなければならない。好ましくは、エリシペロスリックスルシオパチア抗原の量は約５ｍｌ以下、より好ましくは約０．２から３ｍｌで、さらにまた好ましくは０．３から１．５ｍｌまでの間、さらに好ましくは約０．４から０．８ｍｌまでの間、さらにまた好ましくは約０．６ｍｌである。ハエモフィルスパラスイス抗原の一回の投与量は約５ｍｌ以下、より好ましくは約０．１から３ｍｌまでの間、さらにより好ましくは約０．１５から１．５ｍｌまでの間、さらに好ましくは約０．２から０．６ｍｌまでの間、さらにより好ましくは約０．４ｍｌである。測定法で異なるが、ハエモフィルスパラスイス抗原の一回の投与量に少なくとも１．５ｘ10７ｃｆｕ、より好ましくは約１．５ｘ10８から１．５ｘ10１０ｃｆｕとの間、さらにより好ましくは約１．5ｘ１0９ｃｆｕが含まれる。とりわけ好ましい２ｍｌの投与のうち、約０．６ｍｌはエリシペロスリックスルシオパチア抗原、約１．０ｍｌはアジュバント、約０．４ｍｌはハエモフィルスパラスイス抗原である。好ましくは、菌は慣用的な不活性化方法と特別に慣用的なホルマリン不活性化法で不活性化される。
【０００７】
本発明のワクチンと組成物は、一般的に、免疫応答−刺激治療、または予防ワクチンとして、動物へ免疫反応を誘導するのに有用である。好ましくは、本発明の組成物またはワクチンの投与は、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候の深刻化を減少させたり発症を遅らせたりすることを含むさまざまな方法で、ワクチンを接種した動物を保護する免疫反応をもたらす。さらにまた好ましくは、組成物またはワクチンの投与は、たとえ有毒な形態のエリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスにさらされたり攻撃されたりした後でさえ、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候が現れる危険の減少をもたらす。とりわけ好ましい方法では、組成物、またはワクチンの投与は、このような臨床的兆候を完全に妨げるという結果をもたらす。
【０００８】
さまざまな慣用法が、免疫反応が動物へ導入されたかどうかを決定するために使用できる。たとえば、組成物やワクチンを接種している動物は、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの有毒形態に攻撃され、攻撃後、しばらくの間は感染の臨床的兆候の発症が観察される。組成物やワクチンの投与によって免疫反応が導入されたかどうかを決定する代替法は、エリシペロスリックスルシオパチアおよび／またはハエモフィルスパラスイスの一つまたはそれ以上の抗原に対する抗体に対して、動物からの生態標本を分析することであった。このような方法はこの分野では一般的であり、適切な抗体分析を当業者が決定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施様態を示す。これらの実施例は説明のためのものであり、これにより何ら本発明の総体的な範囲を限定するものでないと理解されるべきである。
【実施例１】
【００１０】
この実施例は、好ましくは一回投与によるハエモフィルスパラスイス−エリシペロスリックスルシオパチアワクチンがもたらす、有毒なエリシペロスリックスルシオパチアに対する免疫の効能と持続期間に関する資料を提供する。
【００１１】
材料および方法
いずれも過去にエリシペロスリックスバクテリンまたはワクチンを接種していない生後3から4週目の全部で37匹のブタがこの実施例を導く研究に使用された。本研究が行われる間、動物は大きさ、年齢、およびその他の物理的特徴にふさわしい食事を与えられた。水は随時与えられた。動物は、その年齢に適した全体、または部分羽根板、機械制御換気装置、および補助ヒーターと光源を備え付けたブタ家畜小屋に居住させた。
【００１２】
実験の2日前、全てのブタは健康診断と仮性狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）菌のワクチン投与を受けた。研究の1日目、ブタは二つのグループに分けられた。グループ1は、1日目にアジュバントＩＳＡ２０６を含むハエモフィルスパラスイス−エリシペロスリックスルシオパチアバクテリン（以下、ＨＰＥという）(ベーリンガー インゲルヘイム ヴェトメディカ アイエヌシー， Ｓｔ． Ｊｏｓｅｐｈ， ＭＯ製）を首の左に２ｍｌ筋肉内注射により投与した23匹のブタから構成された。エリシペロスリックスルシオパチア抗原は、１回投与当たり０．６ｍｌの率の収穫抗原（ｈａｒｖｅｓｔ ａｎｔｉｇｅｎ）を含んでいた。グループ２のコントロールは、何も処置されていない１４匹のブタから構成された。実験２１、５４、および１６１日目、すべての動物は、ワクチンによる血清変換の観察のため採血された。
【００１３】
実験１６２日目、すべてのブタ（１６２日目より以前に付随的事故により死亡した３匹を除く）はエリシペロスリックスルシオパチアＥＬ−６Ｐの有毒菌株により攻撃された。全てのブタは、７日間一般的健康状態とエリシペロスリックスルシオパチアの臨床的兆候を観察された。攻撃から７日後、すべての動物は安楽死させ、そのうち９ＣＦＲ １１３．６７に規定されたエリシペロスリックスルシオパチアに特徴的な2日間連続した執拗な臨床的兆候および／または高い体温を示したものは解剖された。解剖は、実験中死亡した全ての動物に対しても施行された。重大な損傷は評価、記録され、組織は採取され、菌培養のため研究室へ送られた。
【００１４】
上記実験（プロトコル）のまとめを表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
結果と議論
グループ２の１３匹全てのブタは攻撃を受け、エリシペロスリックスルシオパチアによる感染の臨床的兆候である華氏１０６．５度以上の高い体温を示すか、または有毒なエリシペロスリックスルシオパチアによる攻撃後、死亡した。グループ２の１３匹中９匹のブタからエリシペロスリックスルシオパチアが回収され、グループ２の１３匹中６匹は攻撃後、死亡した。対照的に、グループ１のうち２１匹中２０匹は健康状態を保ち、ワクチン投与後１６２日間、エリシペロスリックスルシオパチアによる有毒な攻撃から保護されていた。グループ１のうち、攻撃後、死亡したものは一匹もいなかった。攻撃後、健康状態を保たなかったグループ１のブタからはエリシペロスリックスルシオパチアは回収されなかった。表２は有病率の結果と分析、表３は死亡率の結果を示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３】
【００１９】
【表４】
【００２０】
【表５】
【００２１】
ワクチン投与後１６２日目に有毒なエリシペロスリックスルシオパチアの攻撃を受けた、ワクチン投与を受けたもの（ｖａｃｃｉｎａｔｅｓ）は、コントロールに比べてよく保護されていた。ワクチン投与を受けていないコントロールの１００％は病気を発症し、４６％は攻撃後に死亡した。反対に、ＨＰＥの一回投与は攻撃されたブタの９５%を保護し、ワクチン投与を受けたブタは攻撃後一匹も死ななかった。本実験の結果は、生後３週間またはそれ以上の飼育ブタにおける豚丹毒の予防と制御のため、一回投与法によるＨＰＥの少なくとも１６２日間の免疫持続期間を確証するものである。
【実施例２】
【００２２】
この実施例は、ワクチン投与後、有毒なハエモフィルスパラスイスの攻撃に対するワクチンの好ましくは一回投与による免疫持続期間を示す。
【００２３】
実験器具と実験方法
この実施例に対する本研究は、いずれも過去にハエモフィルスパラスイスバクテリンまたはワクチンを接種していない生後３から４週間の３６匹のブタから開始した。本実験の間、動物は大きさ、年齢、またその他の物理的特徴にふさわしい食料を与えられた。水は随時供給された。
【００２４】
実験の一日目、ブタは２つのグループに分類された。グループ１は、一日目に、アジュバントＩＳＡ ２０６を含むハエモフィルスパラスイスバクテリン（以下、ＨＰＥという）(ベーリンガー インゲルヘイム ヴェトメディカ， アイエヌシー， Ｓｔ． Ｊｏｓｅｐｈ， ＭＯ製）を２ｍｌ筋肉内注射により投与した、２３匹のブタから構成された。ハエモフィルスパラスイス抗原は、一回投与当たり１．５ｘ１０９ｃｆｕを含んでいた。グループ２はコントロールで、何も処置を受けていない１３匹のブタから構成された。
【００２５】
実験後１３２日目、グループ２からの１１匹とグループ１からの１７匹のブタは健康で、ハエモフィルスパラスイスの有毒菌株の攻撃を受けるのに適切であった。攻撃を受けなかった８匹のブタ（グループ１から６匹、グループ２から２匹）は、不健康であるかワクチン接種とは関連のない理由のため死亡していた。全てのブタは、その後７日間、一般的健康状態とハエモフィルスパラスイスの臨床的兆候を観察された。解剖は、実験中死亡した全ての動物に対して施行され、必要と思われる場合、死亡原因である菌の解明のため組織が摘出された。攻撃後７日目、すべての動物は安楽死させられ、そのうちハエモフィルスパラスイスに特有な２日間連続した執拗な臨床的兆候および／または高い体温を示したものは解剖された。重大な損傷は評価、記録され、組織は採取して菌培養のため研究室へ送られた。
【００２６】
以上の実験のまとめを表４に示す。
【００２７】
【表６】
【００２８】
結果と議論
ハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候は、コントロールグループ１１匹のうち８匹のブタに対してあらわれ、解剖により１１匹中７匹がハエモフィルスパラスイスに特徴的なひどい死後の損傷をもっていたことがわかった。攻撃後、全部で６匹のコントロールブタが死亡し、その６匹中５匹がハエモフィルスパラスイスに特徴的なひどい損傷（ｇｒｏｓｓ ｌｅｓｓｉｏｎｓ）を受けていた。２日かそれ以上の間、末期の臥床状態（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｃｕｍｂｅｎｃｙ）に至る深刻な臨床的兆候が２匹以上のブタに発症した。これらのブタは、解剖の際ハエモフィルスパラスイスに特徴的な損傷も受けていた。変化の見られた８匹のコントロールブタのうち、６匹は菌培地でハエモフィルスパラスイスに対し陽性であった。残りの３匹は、ハエモフィルスパラスイスに由来するいかなる病気の兆候も示さなかった。
【００２９】
対照的に、グループ１からの１７匹中１６匹のブタは、ワクチン投与後１３２日間、ハエモフィルスパラスイスの有毒な攻撃から保護されていた。グループ１からの１匹は、攻撃後死亡した。攻撃後死亡した一匹のグループ１のブタからはハエモフィルスパラスイスは回収されなかったが、病気の発症に伴った死後の傷害が見られた。表５に有病率の結果を、表６に死亡率の結果を示した。
【００３０】
【表７】
【００３１】
【表８】
【００３２】
【表９】
【００３３】
【表１０】
【００３４】
ワクチン投与後１３２日目に有毒なハエモフィルスパラスイスの攻撃を受けた、ワクチン投与を受けたものは、コントロールに比べてよく保護されていた。ワクチンを受けていないコントロールのうち７３％が病気を発症し、５５％が攻撃後死亡した。比較すると、ＨＰＢの一回投与は攻撃された９４％のブタを保護した。統計的にみて、ワクチンを受けたものは、コントロールに比べてハエモフィルスパラスイスに由来する死亡率が極めて低かった。本実施例の結果は、生後３週間かそれ以上の養殖ブタにおいて、一回投与法により、少なくとも１３２日間のＨＰＢに対する免疫の持続期間を確認した。
【実施例３】
【００３５】
この実施例は、本発明のワクチン調整の好ましい方法を記述するものである。
【００３６】
試料および方法
エリシペロスリックスルシオパチア−ハエモフィルスパラスイスバクテリン組成物は、エリシペロスリックスルシオパチアおよびハエモフィルスパラスイスの菌株ＳＥ−９とＺ−１５１７をそれぞれ含む。これらの菌株はＡＴＣＣに寄託され、それぞれ寄託番号ＰＴＡ−６２６１とＰＴＳ−６２６２が与えられた。それぞれのシード原料は、特徴的な成長パターンとグラム染色反応、および生化学的検査によって識別される。シード原料の毒性はマウスへの殺傷力および／または感染しやすいブタにおける臨床的兆候の発症力によって決定される。
【００３７】
エリシペロスリックスルシオパチアに対する成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ）の構成成分を表７に示す。ハエモフィルスパラスイスに対する成長培地の構成成分を表８に示す。
【００３８】
【表１１】
【００３９】
【表１２】
【００４０】
エリシペロスリックスルシオパチアとハエモフィルスパラスイスシード培養菌の両方の菌株は５００から２０，０００ｍｌの容器（ｖｅｓｓｅｌ）中で育てなければならない。それらの生産培養菌は２０−１０００Lの容器で育てる。両菌株のマスターシード（親種）とワーキングシードは−６０°Ｃ以下で保存しなければならない。
【００４１】
シーディングまたは接種（ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）のためのエリシペロスリックスルシオパチアの懸濁培養菌を調整するため、マスターシードは液体層に戻され、１−２ｍｌがワーキングシード培地へ接種される。その後、培養菌は統計的に３４−３８°Ｃ、６−２４時間培養される。培養菌は、その後、５％ヒツジ血液寒天培地中のみかけのコロニー、細胞形態、およびグラム染色によって純度を測定される。保存のため同量の安定剤が加えられ、寒冷管（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）へ分配される。
【００４２】
シーディングまたは接種のためのハエモフィルスパラスイスの懸濁培養菌を調整するため、マスターシードは液体層に戻され、ワーキングシード培地へ接種される。培養菌は、その後３４−３８°Ｃ、１２−１８時間攪拌される。それから培養菌は、５％ヒツジ血液寒天培地中のみかけのコロニー、細胞形態、およびグラム染色によって純度を測定される。保存のため同量の安定剤が加えられ、寒冷管へ分配される。
【００４３】
エリシペロスリックスルシオパチアの接種のため、ワーキングシード１−１２ｍｌは５００−１８，０００ｍｌの培地を含むガラス容器へ接種され、生産シードが調整される。生産培養菌を調整するため、５％（ｖ／ｖ）までの生産シードは、２０−１０００L管を用い、培地１５−７５０Ｌ中へ接種される。生産培養菌は、５％ヒツジ血液寒天培地中に画線され、３４−３８°Ｃ，２４−４８時間培養され、コロニー形態を観察することによって純度を測定される。
【００４４】
ハエモフィルスパラスイスの接種のため、１−１０ｍｌのワーキングシードが５００−１８，０００ｍｌの培地を含むガラス管へ接種され、生産シードが作成される。７％（ｖ／ｖ）までの生産シードは、２０−１０００L管を用い、培地１４−７５０L中へ接種し、生産培養菌が作成される。生産培養菌は、ＮＡＤ画線を追加した５％ヒツジ血液寒天培地中に画線され、３４−３８°Ｃ、１８−２４時間培養、コロニー形態を観察することによって純度を測定される。
【００４５】
エリシペロスリックスルシオパチアの接種のため、シード培養菌は３４−３８°Ｃ、６−２４時間、好気的条件下で培養される。生産培養菌は３４−３８°Ｃ、６−１２時間、随時攪拌しながら好気的条件下で培養される。ハエモフィルスパラスイスの培養のため、シード、生産培養菌は、攪拌し随時圧縮空気を散布しながら、３４−３８°Ｃ、６−１２時間培養される。
【００４６】
エリシペロスリックスルシオパチアの成長期間、ｐＨは２Ｍトリスによって調整され、培養期間中、異常な成長やコンタミネーションの兆候の形跡を見るために培養菌は肉眼で観察される。培地は接種前に懸濁している。成長にともなって、沈殿が観察されるだろう。％透過度を測るためにサンプルが採取される。純度は５％ヒツジ血液寒天培地中のコロニー形態および／またはグラム染色によって決定される。十分な懸濁の肉眼による観察は培養菌が採取期を迎えていることを示している。これは、生産培養菌の接種後６−１２時間の間に起こるだろう。
【００４７】
ハエモフィルスパラスイスに対して、異常な成長やコンタミネーションの兆候の形跡を見るために培養期間中、培養菌は肉眼で観察される。直接数えるために、サンプルが採取される。純度はＮＡＤ画線を追加した５％ヒツジ血液寒天培地中のコロニー形態および／またはグラム染色によって決定される。十分な懸濁の肉眼による観察とｐＨの低下（＜７．０）は、培養菌が採取期を迎えていることを示している。これは、生産培養菌の接種後６−１２時間の間に起こるだろう。
【００４８】
どちらの種に対しても、それぞれの生産培養菌は純度と％透過率の試験のためサンプリングされ、それぞれの生産培養菌容器が不活性化のため作成された。エリシペロスリックスルシオパチアに対しては、生産培養菌は記載されたとおりの特徴的成長を示し、％透過率は６２０ｎｍにおいて４０％以下、コンタミネーションの兆候なしとしなければならない。ハエモフィルスパラスイスに対しては、生産培養菌は顕微鏡観察において５ｘ１０７ｏｒｇａｎｉｓｍｓ／ｍｌ以上、コンタミネーションの兆候なしとなるだろう。
【００４９】
両菌株は、０．５％（ｖ／ｖ）以下のホルマリンを生産培養菌へ添加することによって不活性化される。不活性化は２０−３８°Ｃ、１２−７２時間、随時攪拌しながら行われる。不活性化された菌株は、その後２−７°Ｃに保存される。不活性化は標準技術によって確認される。
【００５０】
アジュバントＩＳＡ２０６は３０−６５％（ｗ／ｖ）添加される。不活性化された培養菌はＩＳＡ２０６との均質化によって乳化される。３５％重亜硫酸ナトリウムがフリーのホルムアルデヒドを中和するために分画、または生成物に添加されてもよい。ホルムアルデヒド溶液は、最終生成物において０．２％を超えない濃度で分画、または生成物の集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に添加されてもよい。
【００５１】
その結果得られる生成物は、その後、無菌密閉ループシステム中、分子量１００，０００カットオフの中空繊維ろ過装置、または無菌デカンテーション固定培養によって濃縮され、２ｘ１０１０ｏｒｇａｎｉｓｍ／ｍｌ以下の濃度とされる。
【００５２】
エリシペロスリックスルシオパチアは％透過率と濃度によって標準化される。ハエモフィルスパラスイスは菌体を直接数えることによって標準化される。
【実施例４】
【００５３】
この実施例は、本発明の好ましいワクチンの異なるワクチン成分の組み合わせを示す。
【００５４】
試料と方法
本発明に基づいたワクチンは、エリシペロスリックスルシオパチア培養菌９０，０００ｍｌ（透過率４０％のエリシペロスリックスルシオパチア培養菌９０，０００ｍｌを示す）、ハエモフィルスパラスイス培養菌５６，２５０ｍｌ（４ｘ１０９ｏｒｇａｎｉｓｍ/ｍｌのハエモフィルスパラスイス培養菌５６，２５０ｍｌを示す）、滅菌ＲＯ水２，２５０ｍｌ、ＩＳＡ２０６ １５０，０００ｍｌ、および３５％重硫酸ナトリウム水溶液１，５００ｍｌの組み合わせにより構成されてもよい。滅菌３５％重硫酸ナトリウム水溶液もまた、必要に応じホルムアルデヒド濃度を０．２％ホルムアルデヒド溶液まで中和するために用いられる。得られる混合物のｐＨは、必要に応じ１０Ｎ水酸化ナトリウムまたは５Ｎ塩酸の添加によって６．２−７．２に調整される。
【００５５】
この混合物は、２ｍｌ中、採取培養菌（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ）で透過率４０％、０．３−０．９ｍｌに相当する濃度のエリシペロスリックスルシオパチア、および少なくとも１．５ｘ１０９ｏｒｇａｎｉｓｍのハエモフィルスパラスイスを提供しなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリシペロスリックスルシオパチア（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ Ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）由来の抗原、ハエモフィルスパラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）由来の抗原、およびアジュバントを含有する組成物。
【請求項２】
前記組成物に含まれる前記エリシペロスリックスルシオパチア由来の抗原が、エリシペロスリックスルシオパチアに感染しやすい動物へ投与したとき、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるのに効果的な量である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記効果的な量のエリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ハエモフィルスパラスイス由来の抗原が、ハエモフィルスパラスイスに感染しやすい動物へ投与したとき、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるのに効果的な量である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記効果的な量のハエモフィルスパラスイス抗原が、約５ｍｌ以下である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記効果的な量のハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記アジュバントがミネラルオイルを主成分として含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ハエモフィルスパラスイス、エリシペロスリックスルシオパチア、およびそれらの複合物からなるグループから選択された病原体による感染に対する免疫反応を誘導するのに効果的である請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
エリシペロスリックスルシオパチア抗原とアジュバントとを含む、一回投与後、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるためのワクチン。
【請求項１０】
さらに、ハエモフィルスパラスイス抗原を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記ハエモフィルスパラスイス由来の抗原が、ハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるのに効果的な量である請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、約５ｍｌ以下である請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記効果的な量のハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記アジュバントが、ミネラルオイルを主成分として含有する請求項９に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ワクチンが、少なくとも投与後４ヶ月間、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させる請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ワクチンが、少なくとも投与後４ヶ月間、ハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させる請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記ワクチンが、ハエモフィルスパラスイス、エリシペロスリックスルシオパチア、およびそれらの複合物からなるグループから選択された病原体による感染に対する免疫反応を誘導するのに効果的である請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１９】
ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアへ感染しやすい動物への組成物の投与段階を含み、前記組成物は、エリシペロスリックスルシオパチア由来の抗原、ハエモフィルスパラスイス由来の抗原、およびアジュバントを含む、ハエモフィルスパラスイス、エリシペロスリックスルシオパチア、およびそれらの複合物を含むグループから選択された病原体による感染からの臨床的兆候が動物に発症する危険を減少させる方法。
【請求項２０】
前記投与段階が、筋肉内注射である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、約５ｍｌ以下である請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記アジュバントが、ミネラルオイルを主成分として含有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が動物に現れる危険の減少が、少なくとも１３２日間持続する請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与段階が、ハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が動物に現れる危険を減少させる請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアの有毒菌株で動物を攻撃することにより動物の危険を減少させることを確認し、前記臨床的兆候の現れた前記動物を観察する段階を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
組成物がエリシペロスリックスルシオパチア由来抗原、ハエモフィルスパラスイス抗原、およびアジュバントを含み、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアに感染しやすい動物への組成物の投与段階を含む、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチア感染に対する免疫反応を誘導する方法。
【請求項２９】
前記投与段階が、筋肉内注射である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が約５ｍｌ以下である請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記アジュバントが、ミネラルオイルを主成分として含有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチア感染に対する前記動物の免疫反応が、少なくとも４ヶ月間持続する請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与段階が、ハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア感染に対する免疫反応を誘導する請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアの有毒菌株で動物を攻撃し、前記免疫反応を試験することによって動物の免疫反応を確認する段階を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
ハエモフィルスパラスイス由来の抗原、エリシペロスリックスルシオパチア由来の抗原、およびアジュバントを組み合わせて混合物を作成し、前記混合物を乳化する段階を含む組成物の調整方法。
【請求項３８】
さらに、前記方法が、ハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア由来の前記抗原のもと（ｓｏｕｒｃｅ）を不活性化する段階を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、Ｚ−１５１７菌株由来である請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、ＳＥ−９菌株由来である請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
さらに、既知の効果的な量のハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア抗原を提供するために前記組成物を標準化する段階を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
エリシペロスリックスルシオパチア（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ Ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）由来の抗原、ハエモフィルスパラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）由来の抗原、およびアジュバントを含有する組成物。
【請求項２】
前記組成物に含まれる前記エリシペロスリックスルシオパチア由来の抗原が、エリシペロスリックスルシオパチアに感染しやすい動物へ投与したとき、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるのに効果的な量である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記効果的な量のエリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ハエモフィルスパラスイス由来の抗原が、ハエモフィルスパラスイスに感染しやすい動物へ投与したとき、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるのに効果的な量である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記効果的な量のハエモフィルスパラスイス抗原が、約５ｍｌ以下である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記効果的な量のハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記アジュバントがミネラルオイルを主成分として含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ハエモフィルスパラスイス、エリシペロスリックスルシオパチア、およびそれらの複合物からなるグループから選択された病原体による感染に対する免疫反応を誘導するのに効果的である請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
エリシペロスリックスルシオパチア抗原とアジュバントとを含む、一回投与後、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるためのワクチン。
【請求項１０】
さらに、ハエモフィルスパラスイス抗原を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記ハエモフィルスパラスイス由来の抗原が、ハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させるのに効果的な量である請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、約５ｍｌ以下である請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記効果的な量のハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記アジュバントが、ミネラルオイルを主成分として含有する請求項９に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ワクチンが、少なくとも投与後４ヶ月間、エリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させる請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ワクチンが、少なくとも投与後４ヶ月間、ハエモフィルスパラスイス感染の臨床的兆候が現れる危険を減少させる請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記ワクチンが、ハエモフィルスパラスイス、エリシペロスリックスルシオパチア、およびそれらの複合物からなるグループから選択された病原体による感染に対する免疫反応を誘導するのに効果的である請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１９】
ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアへ感染しやすい動物への組成物の投与段階を含み、前記組成物は、エリシペロスリックスルシオパチア由来の抗原、ハエモフィルスパラスイス由来の抗原、およびアジュバントを含む、ハエモフィルスパラスイス、エリシペロスリックスルシオパチア、およびそれらの複合物を含むグループから選択された病原体による感染からの臨床的兆候が動物に発症する危険を減少させる方法。
【請求項２０】
前記投与段階が、筋肉内注射である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、約５ｍｌ以下である請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記アジュバントが、ミネラルオイルを主成分として含有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が動物に現れる危険の減少が、少なくとも１３２日間持続する請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与段階が、ハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア感染の臨床的兆候が動物に現れる危険を減少させる請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアの有毒菌株で動物を攻撃することにより動物の危険を減少させることを確認し、前記臨床的兆候の現れた前記動物を観察する段階を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
組成物がエリシペロスリックスルシオパチア由来抗原、ハエモフィルスパラスイス抗原、およびアジュバントを含み、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアに感染しやすい動物への組成物の投与段階を含む、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチア感染に対する免疫反応を誘導する方法。
【請求項２９】
前記投与段階が、筋肉内注射である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、約５ｍｌ以下である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が約５ｍｌ以下である請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、一回投与当たり少なくとも１．５ｘ１０７ｃｆｕを含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記アジュバントが、ミネラルオイルを主成分として含有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチア感染に対する前記動物の免疫反応が、少なくとも４ヶ月間持続する請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与段階が、ハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア感染に対する免疫反応を誘導する請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、ハエモフィルスパラスイスまたはエリシペロスリックスルシオパチアの有毒菌株で動物を攻撃し、前記免疫反応を試験することによって動物の免疫反応を確認する段階を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
ハエモフィルスパラスイス由来の抗原、エリシペロスリックスルシオパチア由来の抗原、およびアジュバントを組み合わせて混合物を作成し、前記混合物を乳化する段階を含む組成物の調整方法。
【請求項３８】
さらに、前記方法が、ハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア由来の前記抗原のもと（ｓｏｕｒｃｅ）を不活性化する段階を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ハエモフィルスパラスイス抗原が、Ｚ−１５１７菌株由来である請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記エリシペロスリックスルシオパチア抗原が、ＳＥ−９菌株由来である請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
さらに、既知の効果的な量のハエモフィルスパラスイスとエリシペロスリックスルシオパチア抗原を提供するために前記組成物を標準化する段階を含む、請求項３７に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５０９９８６（Ｐ２００７−５０９９８６Ａ）
【公表日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３８４１４（Ｐ２００６−５３８４１４）
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６３３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４１８９０
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０１４５８９３３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６３３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４１８９０
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０１４５８９３３）
【Ｆターム（参考）】
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