エリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａｍｕｌｕｎｇｕ）の含水アルコール抽出物、薬剤組成物及びこれらの物質の生成方法
本発明は、コリン作動系及び／又はセロトニン作動系のモデルのための分子の使用を提供し、１１−ＯＨ−エリスラビン、エリスラビン、エリスラルチン、その製薬上許容される同配体、塩、副産物及び／又は溶媒和物を含み、他のエリスリナ副産物を任意選択で含む、不安障害を治療するための薬剤組成物を明らかにする。前記薬剤組成物を得る方法も明らかにする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリン作動系及び／又はセロトニン作動系に作用する分子に関する。より詳細には、本発明は、抗不安薬の調製に有用なエリスリナ副産物に関する。前記分子を含む薬剤組成物及び前記薬剤組成物の調製方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
エリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）（マメ科コチョウア科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ−Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ））とは、赤い花を咲かせ、パラナ川流域の半落葉性の広い葉をもつ樹木の林並びに低木地地帯、主にサンパウロ州西部及びミナストライアングル（Ｍｉｎａｓ Ｔｒｉａｎｇｌｅ）に生育している樹木植物である（高さ１０〜１４メートル）（ＬＯＲＥＮＺＩ、１９９２）。この植物の樹皮は、地元住民によって鎮静剤及び鎮痛剤として用いられている。これは一般に、ムルング、デイコ（ｃｏｒａｌ ｔｒｅｅ）、サンゴムルング（ｃｏｒａｌ ｍｕｌｕｎｇｕ）、サンゴ低木（ｃｏｒａｌ ｓｈｒｕｂ）として知られている（民族名には、とりわけ、ｃａｐａ−ｈｏｍｅｍ、ｓｕｉｎａ−ｓｕｉｎａ、ｔｉｒｉｃｅｉｒｏが含まれる）（ＬＯＲＥＮＺＩ、１９９２）。ブラジルにはエリスリナの８つの品種が見つかる：イー・ムルング、イー・ベルチナ（Ｅ．ｖｅｌｕｔｉｎａ）、イー・クリタガリ（Ｅ．ｃｒｉｔａ−ｇａｌｌｉ）、イー・ポッピジアーナ（Ｅ．ｐｏｅｐｐｉｇｉａｎａ）、イー・フスカ（Ｅ．ｆｕｓｃａ）、イー・ファルカタ（Ｅ．ｆａｌｃａｔａ）、イー・スペシオサ（Ｅ．ｓｐｅｃｉｏｓａ）及びイー・ベルナ（Ｅ．ｖｅｒｎａ）（ＬＯＲＥＮＺＩ、１９９２）。イー・ムルング種の研究は希少であるにもかかわらず、鎮痛剤、鎮静剤並びに緩下剤、抗炎症剤及び抗利尿剤としての一般的な使用も知られている、この品種の他の種の植物化学（ｆｉｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及び薬理学特性を確認するために多大な研究が行われている（ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。
【０００３】
植物化学（Ｆｉｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
エリスリナ種の研究に対する関心は、１８７７年に、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ及びＡｌｔａｍｉｒａｎｏがイー・アメリカーナ（Ｅ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）の種子抽出物の薬理学的作用がｄ−ツボクラリン（クラーレノキ（Ｃｈｏｎｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）から抽出した物質）の効果に類似していることを発見した際に始まった（ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＨＩＤＥＲ他、１９８６；ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。その時点以降、エリスリナの様々な種の抽出物の植物化学及び薬理学特性に関する調査が実施された。数年後、エリスリナの様々な種の抽出物で示される薬理学的作用が確認されたのち、この種の植物中のアルカロイドの単離及び同定に対する研究が活発化した（ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８１）。それまでは、薬理学的試験は粗抽出物で行っていた。１９３７年に、Ｆｏｌｋｅｒｓ及びＭａｊｏｒ（１９３７）はイー・アメリカーナ・ミル（Ｅ．ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｉｌｌ．）の種子について化学的調査を行い、ｄ−ツボクラリンと類似したコリン作動性活性を提示した結晶アルカロイドのエリトロイジを単離した。その後の分析（ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ及びＧＲＵＮＤＯＮ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３）により、エリトロイジンはα−エリトロイジン及びβ−エリトロイジンと命名された２つの異性体アルカロイドの混合物であることが示され、後者はコリン作動性活性を司っている（ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＨＩＤＥＲ他、１９８６；ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。イー・アメリカーナのα及びβ−エリトロイジンを単離したのち、エリスリナの他の種の研究を行った結果、新規エリスリナ骨格アルカロイドの単離がもたらされた（ＦＯＬＫＥＲＳ及びＫＯＮＩＵＳＺＹ、１９４０；ＦＯＬＫＥＲＳ他、１９４４；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ及びＧＲＵＮＤＯＮ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３；ＴＡＮＤＯＮ他、１９６９；ＩＴＯ他、１９７０；ＢＡＲＴＯＮ他、１９７０；ＧＨＯＳＡＬ、１９７０；ＧＨＯＳＡＬ他、１９７１；ＩＴＯ他、１９７１；ＭＩＡＮＡ他、１９７２；ＧＨＯＳＡＬ他、１９７２ａ、ｂ；ＢＡＲＴＯＮ他、１９７３；ＩＴＯ他、１９７３、ａ、ｂ、ｃ、ｄ；ＧＨＯＳＡＬ及びＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ、１９７４；ＭＩＬＬＩＮＧＴＯＮ他、１９７４；ＧＡＭＥＳ他、１９７４；ＩＴＯ他、１９７６；ＢＡＲＡＫＡＴ他、１９７７；ＥＬ−ＯＬＥＭＹ他、１９７８；ＡＨＭＡＤ他、１９７９；ＴＩＷＡＲＩ及びＭＡＳＳＯＤ、１９７９ａ、ｂ；ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８１）。
【０００４】
エリスリナアルカロイドの基本構造の明確化は、分解及び合成（ＧＲＵＮＤＯＮ及びＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ、１９５３；ＧＲＵＮＤＯＮ他、１９５３；ＷＥＩＮＳＴＯＣＫ及びＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３）によって達成した。これらのアルカロイドの構造中にスピロアミン骨格の存在が確証され、これは以下の一般式を表す（ジエン型のエリスリナアルカロイドを表す）。
【化１】
【０００５】
この構造の明確化により、その後の新規化合物の同定が容易になった。現在では、３種のエリスリナアルカロイドが知られている。ジエノイド（ｄｉｅｎｏｉｄ）は環Ａ及びＢ中でジエン系を表す。アルカロイドは環Ａ中に二重結合Δ１，６を有する。エリスリナアルカロイドの第３の群には、エリソジエノン（ｅｒｙｓｏｄｉｅｎｏｎｅ）、３−デスメトキシエリトラチジノン（ｅｒｙｔｈｒａｔｉｄｉｎｏｎｅ）、α−エリトロイジン及びβ−エリトロイジンが含まれる。オリエンタリン（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｎｅ）、Ｎ−ノオリエンタリン（Ｎｏｏｒｉｅｎｔａｌｉｎｅ）、プロトシノメニン（ｐｒｏｔｏｓｉｎｏｍｅｎｉｎｅ）、Ｎ−ノルプロトシノメニン（Ｎｏｒｐｒｏｔｏｓｉｎｏｍｅｎｉｎｅ）、イソボルジン、エリビジン（ｅｒｙｂｉｄｉｎｅ）、スカウレリン（ｓｃｏｕｒｅｌｉｎｅ）、コレキシミン、ハイパフォリン（ｈｙｐａｆｏｒｉｎ）、コリン（ｃｏｌｉｎｅ）を含めた、エリスリナ骨格を表さない特定のエリスリナ種の一部のアルカロイドも単離した。
【０００６】
乾燥花で調製したエタノール抽出物を用いたイー・ムルングの植物化学的研究により、５つのアルカロイド（エリソトリナ（ｅｒｙｓｏｔｈｒｉｎａ）、Ｎ−エリソトリナオキシド、エリスラルチン（ｅｒｙｔｈｒａｒｔｉｎｅ）、Ｎ−エリスラルチンオキシド及びハイパフォリン）並びにテルペノイドのフィトール（ｆｉｔｈｏｌ）が単離された（ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８１；ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ、１９８１）。最近の植物化学的研究により、エリスリナ種はフラバノン、イソフラバノン、イソフラボン及びプテロカルパンなどの他のクラスの物質にも富んでいることが実証されている（ＤＡ−ＣＵＮＨＡ他、１９９８；ＴＡＮＡＫＡ他、１９９６、１９９７ａ、ｂ；１９９８；２００１；ＯＨ他、１９９９；ＹＥＮＥＳＥＷ他、２０００；ＮＫＥＮＧＦＡＣＫ他、２００１）。
【０００７】
薬理活性
エリスリナから得られた物質の主要な薬理学的作用にはコリン作動系に対するその末梢活性があり、これはｄ−ツボクラリンの効果と比較されている（ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＨＩＤＥＲ他、１９８６；ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。この効果は、イー・アメリカーナ（ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ及びＧＲＵＮＤＯＮ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３）並びにイー・ソロニアーナ（Ｅ．ｔｈｏｌｌｏｎｉａｎａ）（ＣＨＡＷＬＡ他、１９８５）から単離された、ニコチン様の拮抗剤受容体アルカロイドジヒドロ−β−エリトロイジン（ＤＨＢＥ）（ＨＩＤＥＲ他、１９８６）に起因していた。より最近では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ＤＨＢＥはセロトニン作動性３拮抗剤受容体（５−ＨＴ３）として特徴づけられた（ＥＬＳＥＬＥ他、１９９３）。エリスリナ品種の一部の種も、抗痙攣効果、催眠効果、麻酔効果、鎮痛効果及び抗不安効果など、中枢神経系に対して他の活性を提示する（ＧＨＯＳＡＬ他、１９７２；ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＲＡＴＮＡＳＯＯＲＩＹＡ及びＤＨＡＲＭＡＳＩＲＩ、１９９９；ＯＮＵＳＩＣ他、２００２）。しかし、これらの活性におけるエリスリナアルカロイドの役割を分析した研究は報告されていない。
【０００８】
イー・ベルチナの研究により、含水アルコール抽出物を用いた急性期治療では、オープンフィールド試験（２５０及び５００ｍｇ／ｋｇの用量、経口摂取）においてマウスの活動が低下し、また、ペントバルビタールで誘導した睡眠の期間及びピロカルピンで誘導した痙攣の開始の期間が増加すること（５００及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量、経口摂取）が実証され、中枢神経系に対する抑制効果が示された（ＣＡＢＲＡＬ他、２０００）。別の研究（ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＬＩＡＲ他、２０００）では、イー・アメリカーナのヘキサン画分（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いた急性期治療により、ジアゼパムと同様に雄マウスの攻撃的挙動が軽減されたことが明らかとなった。最近では、イー・ムルングの含水アルコール抽出物の研究（ＯＮＵＳＩＣ他、２００２）により、２００ｍｇ／ｋｇの用量（経口摂取）を用いた急性期治療が、高架式Ｔ迷路試験における抑制回避課題中のマウスに対してベンゾジアゼピン系抗不安剤（ＢＤＺ）のジアゼパムに匹敵する抗不安効果を表すことが観察された。ＯＮＵＳＩＣ及び共同研究者ら（２００２）はまた、明／暗遷移モデルで、２つのモデル区画の遷移の回数及び明区画に留まる長さのどちらにおいても同じ用量を用いてイー・ムルングの抗不安効果も観察した。別の研究により、イー・ムルングの抽出物を用いた慢性治療的経口摂取（９日間）により、抑制回避課題並びに高架式Ｔ迷路の開いたアームからの脱出のどちらにおいても、５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇの用量で抗不安効果が示されたことが明らかとなった（ＯＮＵＳＩＣ他、２００３）。明／暗遷移モデルでは、イー・ムルングの抽出物も、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１４日間の慢性治療ののちに抗不安効果を表した（ＯＮＵＳＩＣ他、２００３）。
【０００９】
これらの数々の手法にもかかわらず、現在までに、エリスリナの単離した活性成分又はその化学合成品から作製した抗不安薬の開発も、そのような医薬品の調製方法も、報告された例が知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の主題は、コリン作動系及び／又はセロトニン作動系に作用する能力を有する分子、並びにそれを含む薬剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明の分子は動物モデルにおいて活性のある抗不安剤であることが判明した。したがって、本発明の主題は、不安関連障害又は抗不安剤の使用を要する他の臨床徴候の治療に有用な分子を提供することである。
【００１２】
別の態様では、本発明の分子の薬理活性の単離、構造の特徴づけ及び評価により、不安障害の治療を意図した標準化した薬剤組成物の開発が可能となる。したがって、本発明の別の主題は、抗不安性分子を含む薬剤組成物を提供することである。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明の分子の単離及び／又は合成により、前記分子を含む薬剤組成物を生成するための容易な方法が提供される。したがって、本発明のさらなる主題は、薬剤組成物の生成方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の目的のために、「薬剤組成物」とは、活性成分を含み、予防的、姑息的及び／又は治癒的目的を有し、恒常性を維持及び／又は修復するように作用する、すべて且つ任意の組成物を意味するものとし、局所投与、非経口投与、腸内投与及び／又はくも膜下腔内投与し得る。
【００１５】
本発明中で言及する薬剤組成物はエリスリナ副産物のクラスに属し、エリスリナ・ムルングのエリスラルチン及び／若しくはエリスラビン単離体又は化学合成品を任意選択で含む、１１−ＯＨ−エリスラビン、その製薬上許容される同配体（ｉｓｏｓｔｅｒｓ）、塩、副産物及び／或いは溶媒和物が含まれる。
【００１６】
本発明の化合物の治療適用性を様々な段階で実施した。行った実験及びそれぞれの結果は、以下に単なる例として示し、添付の特許請求の範囲を限定しない。
【実施例１】
【００１７】
抽出物の調製及び植物材料を用いた分画
冬季にＲｉｆａｉｎａ郡（スペイン）で成体樹木から花を採取した。新鮮な植物材料（６ｋｇ）を、７日間のエタノール／水（ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ）（７：３）を用いた冷浸工程による抽出に供した。次に、ロータリーエバポレーターの補助の下で抽出物を濾過及び濃縮した結果、２９２ｇの乾燥含水アルコール抽出物が得られた。その後、化学成分のバイオモニター分画及び単離を実施した。その後、エリスリナアルカロイドの分離を最適化することを目的として、酸−塩基抽出を行った。これを達成するために、乾燥含水アルコール抽出物（１２０ｇ）を酢酸水溶液（１０％）に溶解し、クロロホルム抽出（ＣＨＣｌ３）を用いた液体／液体に供した。クロロホルム相を水相から分離し、溶媒を蒸発させた結果、画分１が得られた（７．８３ｇ）。次に、ｐＨが９〜１０に達するために十分な体積の水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）を用いて水相をアルカリ化し、再度ＣＨＣｌ３を用いた抽出に供した。クロロホルム相を分離し、溶媒を蒸発させた結果、画分２（Ｆ２）が得られた（６７０ｍｇ）。
【実施例２】
【００１８】
クロマトグラフィー、装置及び分光測定
「分析用」の溶媒等級を用いた。シリカの分析用薄層クロマトグラフィー（ＣＣＤ）には、溶媒系としてＣＨＣｌ３／メタノール（ＭｅＯＨ）（９：１）を用いた。Ｆ２中のアルカロイドについてドラーゲンドルフ試験は陽性であり、これをオープンカラムクロマトグラフィー（ＣＣＡ）に供した（直径５ｃｍ及び高さ１５ｃｍ）。ＣＣＡ（０．０３５〜０．０７０ｍｍ、φ６ｎｍ）、シリカを固定相として、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１０：０〜８：２）を移動相として用いた。分離には６７０ｍｇのＦ２を用いて、１０１個の約２０ｍｌの画分が採取された。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（７：１）の移動相中で分析用ＣＣＤに供し、ドラーゲンドルフアッセイによって明らかにしたのち、１０１個の画分を画分Ａ（ＦＡ−１３６．２ｍｇ）（１〜２７）、画分Ｂ（ＦＢ−９３．４ｍｇ）（２８〜５０）、画分Ｃ（ＦＣ−１４８．３ｍｇ）（５１〜６９）、画分Ｄ（ＦＤ−２８４．５ｍｇ）（７０〜１０１）に分類した。アルカロイドを単離及び精製するために、シリカ固定相（Ｍｅｒｃｋ）にフルオレセイン、移動相にトルエン、アセトン、エタノール及びＮＨ４ＯＨ（４５：４５：７：３）を採用して、調製用薄層クロマトグラフィー（ＣＣＤＰ）を用いた。ＣＣＤＰから単離した物質の分光測定分析には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光計 Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔを用い、５００ＭＨｚで操作した。重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒として用いた。単離したアルカロイドの化学構造を決定するために、１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲ分光分析並びにＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ及びＣＯＳＹ二次元分光測定を用いた。結果を、エリスリナアルカロイドについて文献で現在利用可能な情報と比較した。アルカロイド１は、ＦＢを用いて実施したＣＣＤＰによって単離した。アルカロイド２は、ＦＣ及びＦＤの両方から単離した。ＦＤを用いて、アルカロイド３を単離することもできた。物質１、２及び３のＣＨＣｌ３中の１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲスペクトル（表１）により、エリスリナアルカロイドの骨格に特徴的なシグナルの存在が示された。
【００１９】
表１−エリスラルチン、エリスラビン、１１−ＯＨ−エリスラビンの１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃｌ中）の化学シフト測定値（δ）及びカップリング（Ｊ）。
【表１】
【００２０】
表１に示すように、水素Ｈ−１４及びＨ−１７に関連する芳香族プロトンの２本の一重線並びに炭素Ｃ−１５及びＣ−１６の位置のメトキシル水素に起因する２本の一重線のシグナルを同定することが可能である。オレフィンプロトンの３つのシグナル（ブロード一重線（ｓｌ）、Ｈ−７；ブロード二重線（ｄｉ）、Ｈ−１；２本の二重線（ｄｄ）、Ｈ−２）の存在は、エリスリナ骨格のジエン系水素に起因している可能性がある。以前の研究（ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８２）で、それぞれδ１２５．３及びδ１３１．２におけるＣ−１及びＣ−２の共鳴が報告されているが、本発明の開発においては、ＨＭＱＣ二次元スペクトルの化学シフト間の相関によりこれらの共鳴がそれぞれδ１３１．５及びδ１２５．５で起こることが実証された。
【００２１】
１１−ヒドロキシ−エリスラビン（１１−ＯＨ−エリスラビン）
１１−ＯＨ−エリスラビンの１ＨのＮＭＲスペクトルでは（表２）、エリスラビンと同様に、位置Ｃ−３ではメトキシル水素のシグナルがなく、エリスラルチンでは、酸素化された置換体に関するδ４．５の多重線のみが位置Ｃ−３に起因していた。エリスラルチンで観察されたものと同様に、１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲスペクトルにより、Ｃ−１１のヒドロキシルの存在に起因するそれぞれδ４．７４（ｔ）及びδ６３．６９の化学シフトが明らかとなった。これらの結果は今回初めて報告されるものであり、したがって、物質３は新規エリスリナアルカロイドであると認識され、１１−ヒドロキシ−エリスラビン（１１−ＯＨ−エリスラビン）と命名した。イー・ムルングの花の粗抽出物から単離したアルカロイド１１−ＯＨ−エリスラビンの化学構造を以下に表す。
【化２】
【実施例３】
【００２２】
薬理学的評価
サンパウロ州立大学（ＵＮＥＳＰ／Ａｒａｒａｑｕａｒａ）の中央動物研究室（ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｉｍａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）からの体重２５〜３５ｇのスイスマウスを用いた。動物は、床に木屑を敷き、飼料及び水が自由に利用可能なポリプロピレン製ケージ内で、１０〜１２匹の動物の群で飼育した］。動物研究室は２２±１℃の一定温度の下に維持し、照明は午前７：００から午後７：００の１２時間サイクルで制御し、湿度は５０〜６０％に保った。抽出物、標準薬物及びビヒクルで薬理学的評価を行った。したがって、Ｆ２（３、６、１０、１７及び３０ｍｇ／ｋｇ）並びにアルカロイドエリスラルチン、エリスラビン及び１１−ＯＨ−エリスラビン（３及び１０ｍｇ／ｋｇ）に加えて、凍結乾燥した含水アルコール抽出物（５０、１００、２００及び４００ｍｇ／ｋｇ）を用い、胃管栄養法による経口摂取で投与した。用いた標準薬物は２ｍｇ／ｋｇの用量のジアゼパム（ＤＺＰ）であった（腹腔内による）。すべての溶液は実験当日に０．９％塩素酸ナトリウムで調製して１５分間超音波処理し、ジアゼパムは０．９％塩素酸ナトリウム及びＴｗｅｅｎ−８０中の溶液とした。午前１１：００及び午後５：００の間に実施し、実験の装置及び手順は後に記載する。高架式Ｔ迷路は透明なガラス製の壁及び木製の床で作製され、２つの開いたアーム（３０×５×０．２５ｃｍ）に垂直に連結された１つの閉じたアーム（３０×５×１５ｃｍ）からなり、木製の支柱によって床から３８．５ｃｍの高さに持ち上げられている。この試験では、抑制回避の測定を５回連続して行い（基礎待ち時間、回避１、２、３及び４）、開いたアームからの脱出を１回行い、それぞれの試行の間に３０秒間の間隔を設けた。回避の測定では、動物を閉じたアームの遠位部分に配置し、開いたアームに向かう４本の足すべてのこのアームの退出待ち時間を計測した。脱出の測定では、動物を右側の開いたアームの末端に配置し、このアームからの出発時刻を測定した。これらの測定中に動物が迷路のアーム内に滞在する最長時間は３００秒間であった。各動物を試験した後に装置を２０％エタノールで清掃した。偽陽性又は陰性を避けるために、高架式Ｔ迷路で試験した直後に動物をアリーナにおける運動活動試験に供した。この装置は、長方形底辺（４０×４８ｃｍ）を有し、３０ｃｍの高い壁に囲まれた白色のポリプロピレン製の箱からなる。床は３０個の正方形（８×８ｃｍ）に分割されている。この試験では、動物を箱の中心に配置し、その活動を５分間ビデオ録画し、次いで象限領域を横断した回数及びストレッチ−注意姿勢の回数を分析した（ＷＡＬＳＨ及びＣＵＭＭＩＮＳ、１９７６）。
【００２３】
動物モデルのすべての結果は、最初にレヴィーン均質性試験に供した。不均一な結果を対数スケールに変換し、のちに統計的に分析した。高架式Ｔ迷路から得られた結果を二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供し、ここで、治療は独立因子であり、試行が従属因子である。治療の効果が有意であると判明した場合は、一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでダンカン事後試験を用いてデータを分析した。アリーナを用いて得られた結果を一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでダンカン事後試験に供した。ｐ≦０．０５の量が有意な結果であるとみなされた。
【００２４】
高架式Ｔ迷路試験
表２で見られるように、１１−ＯＨ−エリスラビンは高架式Ｔ迷路モデルにおける抑制回避課題において動物の成績を損なわせた。二元配置ＡＮＯＶＡにより、治療（Ｆ（３．３３）＝８．３０；ｐ＜０．００１）、試行（Ｆ（４．１３２）＝１４．７５；ｐ＜０．０００１）及び治療と試行との間の相互作用（Ｆ（１２．１３２）＝２．４２；ｐ＜０．０１）において有意な差が明らかとなった。一元配置ＡＮＯＶＡにより、治療群間でＥ１（Ｆ（３．３３）＝４．４７；ｐ＜０．０１）、Ｅ２（Ｆ（３．３３）＝５．２９；ｐ＜０．０１）、Ｅ３（Ｆ（３．３３）＝５．２９；ｐ＜０．０１）及びＥ４（Ｆ（３．３３）＝１０．２９；ｐ＜０．０００１）に有意な差が示されたが、基礎待ち時間（Ｆ（３．３３）＝０．５１；ｐ＜０．６７）には示されなかった。表２は、ダンカン事後試験による、対象群と比較した各群間の差異を示す。
【００２５】
開いたアームからの脱出の測定に関して、一元配置ＡＮＯＶＡにより、対象群と比較して治療群間で差異は存在しなかったことが示された（Ｆ（３．３３）＝０．７１；ｐ＜０．５４）。
【００２６】
表２−高架式Ｔ迷路試験に供したマウスにおける１１−ＯＨ−エリスラビンを用いた急性期治療の効果（平均＋ＥＰＭ）
【表２】
【００２７】
運動活動−アリーナ
一元配置ＡＮＯＶＡにより、アリーナの象限を横断した回数（Ｆ（３．３３）＝０．７６；ｐ＜０．５１）及びストレッチ−注意姿勢の回数（Ｆ（３．３３）＝１．２０；ｐ＜０．３２）のどちらに関しても、用いた１１−ＯＨ−エリスラビンの用量はいずれも運動活動を変更しなかったことが示された。表３は、運動活動試験で得られた結果を示す。
【００２８】
表３−アリーナ内のマウスの運動活動に対する１１−ＯＨ−エリスラビンの急性期治療の効果（平均＋ＥＰＭ）。
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】イー・ムルングの含水アルコール粗抽出物を抽出及び分画する段階、並びにイー・ムルングの含水アルコール粗抽出物を用いてアルカロイドエリスラルチン、エリスラビン及び１１−ＯＨ−エリスラビンを単離する段階の一般的な例示的なスキームを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリン作動系及び／又はセロトニン作動系に作用する分子に関する。より詳細には、本発明は、抗不安薬の調製に有用なエリスリナ副産物に関する。前記分子を含む薬剤組成物及び前記薬剤組成物の調製方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
エリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）（マメ科コチョウア科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ−Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ））とは、赤い花を咲かせ、パラナ川流域の半落葉性の広い葉をもつ樹木の林並びに低木地地帯、主にサンパウロ州西部及びミナストライアングル（Ｍｉｎａｓ Ｔｒｉａｎｇｌｅ）に生育している樹木植物である（高さ１０〜１４メートル）（ＬＯＲＥＮＺＩ、１９９２）。この植物の樹皮は、地元住民によって鎮静剤及び鎮痛剤として用いられている。これは一般に、ムルング、デイコ（ｃｏｒａｌ ｔｒｅｅ）、サンゴムルング（ｃｏｒａｌ ｍｕｌｕｎｇｕ）、サンゴ低木（ｃｏｒａｌ ｓｈｒｕｂ）として知られている（民族名には、とりわけ、ｃａｐａ−ｈｏｍｅｍ、ｓｕｉｎａ−ｓｕｉｎａ、ｔｉｒｉｃｅｉｒｏが含まれる）（ＬＯＲＥＮＺＩ、１９９２）。ブラジルにはエリスリナの８つの品種が見つかる：イー・ムルング、イー・ベルチナ（Ｅ．ｖｅｌｕｔｉｎａ）、イー・クリタガリ（Ｅ．ｃｒｉｔａ−ｇａｌｌｉ）、イー・ポッピジアーナ（Ｅ．ｐｏｅｐｐｉｇｉａｎａ）、イー・フスカ（Ｅ．ｆｕｓｃａ）、イー・ファルカタ（Ｅ．ｆａｌｃａｔａ）、イー・スペシオサ（Ｅ．ｓｐｅｃｉｏｓａ）及びイー・ベルナ（Ｅ．ｖｅｒｎａ）（ＬＯＲＥＮＺＩ、１９９２）。イー・ムルング種の研究は希少であるにもかかわらず、鎮痛剤、鎮静剤並びに緩下剤、抗炎症剤及び抗利尿剤としての一般的な使用も知られている、この品種の他の種の植物化学（ｆｉｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及び薬理学特性を確認するために多大な研究が行われている（ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。
【０００３】
植物化学（Ｆｉｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
エリスリナ種の研究に対する関心は、１８７７年に、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ及びＡｌｔａｍｉｒａｎｏがイー・アメリカーナ（Ｅ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）の種子抽出物の薬理学的作用がｄ−ツボクラリン（クラーレノキ（Ｃｈｏｎｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）から抽出した物質）の効果に類似していることを発見した際に始まった（ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＨＩＤＥＲ他、１９８６；ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。その時点以降、エリスリナの様々な種の抽出物の植物化学及び薬理学特性に関する調査が実施された。数年後、エリスリナの様々な種の抽出物で示される薬理学的作用が確認されたのち、この種の植物中のアルカロイドの単離及び同定に対する研究が活発化した（ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８１）。それまでは、薬理学的試験は粗抽出物で行っていた。１９３７年に、Ｆｏｌｋｅｒｓ及びＭａｊｏｒ（１９３７）はイー・アメリカーナ・ミル（Ｅ．ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｍｉｌｌ．）の種子について化学的調査を行い、ｄ−ツボクラリンと類似したコリン作動性活性を提示した結晶アルカロイドのエリトロイジを単離した。その後の分析（ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ及びＧＲＵＮＤＯＮ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３）により、エリトロイジンはα−エリトロイジン及びβ−エリトロイジンと命名された２つの異性体アルカロイドの混合物であることが示され、後者はコリン作動性活性を司っている（ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＨＩＤＥＲ他、１９８６；ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。イー・アメリカーナのα及びβ−エリトロイジンを単離したのち、エリスリナの他の種の研究を行った結果、新規エリスリナ骨格アルカロイドの単離がもたらされた（ＦＯＬＫＥＲＳ及びＫＯＮＩＵＳＺＹ、１９４０；ＦＯＬＫＥＲＳ他、１９４４；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ及びＧＲＵＮＤＯＮ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３；ＴＡＮＤＯＮ他、１９６９；ＩＴＯ他、１９７０；ＢＡＲＴＯＮ他、１９７０；ＧＨＯＳＡＬ、１９７０；ＧＨＯＳＡＬ他、１９７１；ＩＴＯ他、１９７１；ＭＩＡＮＡ他、１９７２；ＧＨＯＳＡＬ他、１９７２ａ、ｂ；ＢＡＲＴＯＮ他、１９７３；ＩＴＯ他、１９７３、ａ、ｂ、ｃ、ｄ；ＧＨＯＳＡＬ及びＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡ、１９７４；ＭＩＬＬＩＮＧＴＯＮ他、１９７４；ＧＡＭＥＳ他、１９７４；ＩＴＯ他、１９７６；ＢＡＲＡＫＡＴ他、１９７７；ＥＬ−ＯＬＥＭＹ他、１９７８；ＡＨＭＡＤ他、１９７９；ＴＩＷＡＲＩ及びＭＡＳＳＯＤ、１９７９ａ、ｂ；ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８１）。
【０００４】
エリスリナアルカロイドの基本構造の明確化は、分解及び合成（ＧＲＵＮＤＯＮ及びＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ、１９５３；ＧＲＵＮＤＯＮ他、１９５３；ＷＥＩＮＳＴＯＣＫ及びＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３）によって達成した。これらのアルカロイドの構造中にスピロアミン骨格の存在が確証され、これは以下の一般式を表す（ジエン型のエリスリナアルカロイドを表す）。
【化１】
【０００５】
この構造の明確化により、その後の新規化合物の同定が容易になった。現在では、３種のエリスリナアルカロイドが知られている。ジエノイド（ｄｉｅｎｏｉｄ）は環Ａ及びＢ中でジエン系を表す。アルカロイドは環Ａ中に二重結合Δ１，６を有する。エリスリナアルカロイドの第３の群には、エリソジエノン（ｅｒｙｓｏｄｉｅｎｏｎｅ）、３−デスメトキシエリトラチジノン（ｅｒｙｔｈｒａｔｉｄｉｎｏｎｅ）、α−エリトロイジン及びβ−エリトロイジンが含まれる。オリエンタリン（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｎｅ）、Ｎ−ノオリエンタリン（Ｎｏｏｒｉｅｎｔａｌｉｎｅ）、プロトシノメニン（ｐｒｏｔｏｓｉｎｏｍｅｎｉｎｅ）、Ｎ−ノルプロトシノメニン（Ｎｏｒｐｒｏｔｏｓｉｎｏｍｅｎｉｎｅ）、イソボルジン、エリビジン（ｅｒｙｂｉｄｉｎｅ）、スカウレリン（ｓｃｏｕｒｅｌｉｎｅ）、コレキシミン、ハイパフォリン（ｈｙｐａｆｏｒｉｎ）、コリン（ｃｏｌｉｎｅ）を含めた、エリスリナ骨格を表さない特定のエリスリナ種の一部のアルカロイドも単離した。
【０００６】
乾燥花で調製したエタノール抽出物を用いたイー・ムルングの植物化学的研究により、５つのアルカロイド（エリソトリナ（ｅｒｙｓｏｔｈｒｉｎａ）、Ｎ−エリソトリナオキシド、エリスラルチン（ｅｒｙｔｈｒａｒｔｉｎｅ）、Ｎ−エリスラルチンオキシド及びハイパフォリン）並びにテルペノイドのフィトール（ｆｉｔｈｏｌ）が単離された（ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８１；ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ、１９８１）。最近の植物化学的研究により、エリスリナ種はフラバノン、イソフラバノン、イソフラボン及びプテロカルパンなどの他のクラスの物質にも富んでいることが実証されている（ＤＡ−ＣＵＮＨＡ他、１９９８；ＴＡＮＡＫＡ他、１９９６、１９９７ａ、ｂ；１９９８；２００１；ＯＨ他、１９９９；ＹＥＮＥＳＥＷ他、２０００；ＮＫＥＮＧＦＡＣＫ他、２００１）。
【０００７】
薬理活性
エリスリナから得られた物質の主要な薬理学的作用にはコリン作動系に対するその末梢活性があり、これはｄ−ツボクラリンの効果と比較されている（ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＨＩＤＥＲ他、１９８６；ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＩＬＡＲ他、２０００）。この効果は、イー・アメリカーナ（ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ及びＧＲＵＮＤＯＮ、１９５３；ＢＯＥＫＥＬＨＥＩＤＥ他、１９５３）並びにイー・ソロニアーナ（Ｅ．ｔｈｏｌｌｏｎｉａｎａ）（ＣＨＡＷＬＡ他、１９８５）から単離された、ニコチン様の拮抗剤受容体アルカロイドジヒドロ−β−エリトロイジン（ＤＨＢＥ）（ＨＩＤＥＲ他、１９８６）に起因していた。より最近では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ＤＨＢＥはセロトニン作動性３拮抗剤受容体（５−ＨＴ３）として特徴づけられた（ＥＬＳＥＬＥ他、１９９３）。エリスリナ品種の一部の種も、抗痙攣効果、催眠効果、麻酔効果、鎮痛効果及び抗不安効果など、中枢神経系に対して他の活性を提示する（ＧＨＯＳＡＬ他、１９７２；ＨＡＲＧＲＥＡＶＥＳ他、１９７４；ＲＡＴＮＡＳＯＯＲＩＹＡ及びＤＨＡＲＭＡＳＩＲＩ、１９９９；ＯＮＵＳＩＣ他、２００２）。しかし、これらの活性におけるエリスリナアルカロイドの役割を分析した研究は報告されていない。
【０００８】
イー・ベルチナの研究により、含水アルコール抽出物を用いた急性期治療では、オープンフィールド試験（２５０及び５００ｍｇ／ｋｇの用量、経口摂取）においてマウスの活動が低下し、また、ペントバルビタールで誘導した睡眠の期間及びピロカルピンで誘導した痙攣の開始の期間が増加すること（５００及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量、経口摂取）が実証され、中枢神経系に対する抑制効果が示された（ＣＡＢＲＡＬ他、２０００）。別の研究（ＧＡＲＩＮ−ＡＧＵＬＩＡＲ他、２０００）では、イー・アメリカーナのヘキサン画分（３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いた急性期治療により、ジアゼパムと同様に雄マウスの攻撃的挙動が軽減されたことが明らかとなった。最近では、イー・ムルングの含水アルコール抽出物の研究（ＯＮＵＳＩＣ他、２００２）により、２００ｍｇ／ｋｇの用量（経口摂取）を用いた急性期治療が、高架式Ｔ迷路試験における抑制回避課題中のマウスに対してベンゾジアゼピン系抗不安剤（ＢＤＺ）のジアゼパムに匹敵する抗不安効果を表すことが観察された。ＯＮＵＳＩＣ及び共同研究者ら（２００２）はまた、明／暗遷移モデルで、２つのモデル区画の遷移の回数及び明区画に留まる長さのどちらにおいても同じ用量を用いてイー・ムルングの抗不安効果も観察した。別の研究により、イー・ムルングの抽出物を用いた慢性治療的経口摂取（９日間）により、抑制回避課題並びに高架式Ｔ迷路の開いたアームからの脱出のどちらにおいても、５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇの用量で抗不安効果が示されたことが明らかとなった（ＯＮＵＳＩＣ他、２００３）。明／暗遷移モデルでは、イー・ムルングの抽出物も、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、１４日間の慢性治療ののちに抗不安効果を表した（ＯＮＵＳＩＣ他、２００３）。
【０００９】
これらの数々の手法にもかかわらず、現在までに、エリスリナの単離した活性成分又はその化学合成品から作製した抗不安薬の開発も、そのような医薬品の調製方法も、報告された例が知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の主題は、コリン作動系及び／又はセロトニン作動系に作用する能力を有する分子、並びにそれを含む薬剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明の分子は動物モデルにおいて活性のある抗不安剤であることが判明した。したがって、本発明の主題は、不安関連障害又は抗不安剤の使用を要する他の臨床徴候の治療に有用な分子を提供することである。
【００１２】
別の態様では、本発明の分子の薬理活性の単離、構造の特徴づけ及び評価により、不安障害の治療を意図した標準化した薬剤組成物の開発が可能となる。したがって、本発明の別の主題は、抗不安性分子を含む薬剤組成物を提供することである。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明の分子の単離及び／又は合成により、前記分子を含む薬剤組成物を生成するための容易な方法が提供される。したがって、本発明のさらなる主題は、薬剤組成物の生成方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の目的のために、「薬剤組成物」とは、活性成分を含み、予防的、姑息的及び／又は治癒的目的を有し、恒常性を維持及び／又は修復するように作用する、すべて且つ任意の組成物を意味するものとし、局所投与、非経口投与、腸内投与及び／又はくも膜下腔内投与し得る。
【００１５】
本発明中で言及する薬剤組成物はエリスリナ副産物のクラスに属し、エリスリナ・ムルングのエリスラルチン及び／若しくはエリスラビン単離体又は化学合成品を任意選択で含む、１１−ＯＨ−エリスラビン、その製薬上許容される同配体（ｉｓｏｓｔｅｒｓ）、塩、副産物及び／或いは溶媒和物が含まれる。
【００１６】
本発明の化合物の治療適用性を様々な段階で実施した。行った実験及びそれぞれの結果は、以下に単なる例として示し、添付の特許請求の範囲を限定しない。
【実施例１】
【００１７】
抽出物の調製及び植物材料を用いた分画
冬季にＲｉｆａｉｎａ郡（スペイン）で成体樹木から花を採取した。新鮮な植物材料（６ｋｇ）を、７日間のエタノール／水（ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ）（７：３）を用いた冷浸工程による抽出に供した。次に、ロータリーエバポレーターの補助の下で抽出物を濾過及び濃縮した結果、２９２ｇの乾燥含水アルコール抽出物が得られた。その後、化学成分のバイオモニター分画及び単離を実施した。その後、エリスリナアルカロイドの分離を最適化することを目的として、酸−塩基抽出を行った。これを達成するために、乾燥含水アルコール抽出物（１２０ｇ）を酢酸水溶液（１０％）に溶解し、クロロホルム抽出（ＣＨＣｌ３）を用いた液体／液体に供した。クロロホルム相を水相から分離し、溶媒を蒸発させた結果、画分１が得られた（７．８３ｇ）。次に、ｐＨが９〜１０に達するために十分な体積の水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）を用いて水相をアルカリ化し、再度ＣＨＣｌ３を用いた抽出に供した。クロロホルム相を分離し、溶媒を蒸発させた結果、画分２（Ｆ２）が得られた（６７０ｍｇ）。
【実施例２】
【００１８】
クロマトグラフィー、装置及び分光測定
「分析用」の溶媒等級を用いた。シリカの分析用薄層クロマトグラフィー（ＣＣＤ）には、溶媒系としてＣＨＣｌ３／メタノール（ＭｅＯＨ）（９：１）を用いた。Ｆ２中のアルカロイドについてドラーゲンドルフ試験は陽性であり、これをオープンカラムクロマトグラフィー（ＣＣＡ）に供した（直径５ｃｍ及び高さ１５ｃｍ）。ＣＣＡ（０．０３５〜０．０７０ｍｍ、φ６ｎｍ）、シリカを固定相として、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１０：０〜８：２）を移動相として用いた。分離には６７０ｍｇのＦ２を用いて、１０１個の約２０ｍｌの画分が採取された。ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（７：１）の移動相中で分析用ＣＣＤに供し、ドラーゲンドルフアッセイによって明らかにしたのち、１０１個の画分を画分Ａ（ＦＡ−１３６．２ｍｇ）（１〜２７）、画分Ｂ（ＦＢ−９３．４ｍｇ）（２８〜５０）、画分Ｃ（ＦＣ−１４８．３ｍｇ）（５１〜６９）、画分Ｄ（ＦＤ−２８４．５ｍｇ）（７０〜１０１）に分類した。アルカロイドを単離及び精製するために、シリカ固定相（Ｍｅｒｃｋ）にフルオレセイン、移動相にトルエン、アセトン、エタノール及びＮＨ４ＯＨ（４５：４５：７：３）を採用して、調製用薄層クロマトグラフィー（ＣＣＤＰ）を用いた。ＣＣＤＰから単離した物質の分光測定分析には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光計 Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔを用い、５００ＭＨｚで操作した。重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶媒として用いた。単離したアルカロイドの化学構造を決定するために、１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲ分光分析並びにＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ及びＣＯＳＹ二次元分光測定を用いた。結果を、エリスリナアルカロイドについて文献で現在利用可能な情報と比較した。アルカロイド１は、ＦＢを用いて実施したＣＣＤＰによって単離した。アルカロイド２は、ＦＣ及びＦＤの両方から単離した。ＦＤを用いて、アルカロイド３を単離することもできた。物質１、２及び３のＣＨＣｌ３中の１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲスペクトル（表１）により、エリスリナアルカロイドの骨格に特徴的なシグナルの存在が示された。
【００１９】
表１−エリスラルチン、エリスラビン、１１−ＯＨ−エリスラビンの１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃｌ中）の化学シフト測定値（δ）及びカップリング（Ｊ）。
【表１】
【００２０】
表１に示すように、水素Ｈ−１４及びＨ−１７に関連する芳香族プロトンの２本の一重線並びに炭素Ｃ−１５及びＣ−１６の位置のメトキシル水素に起因する２本の一重線のシグナルを同定することが可能である。オレフィンプロトンの３つのシグナル（ブロード一重線（ｓｌ）、Ｈ−７；ブロード二重線（ｄｉ）、Ｈ−１；２本の二重線（ｄｄ）、Ｈ−２）の存在は、エリスリナ骨格のジエン系水素に起因している可能性がある。以前の研究（ＳＡＲＲＡＧＩＯＴＯ他、１９８２）で、それぞれδ１２５．３及びδ１３１．２におけるＣ−１及びＣ−２の共鳴が報告されているが、本発明の開発においては、ＨＭＱＣ二次元スペクトルの化学シフト間の相関によりこれらの共鳴がそれぞれδ１３１．５及びδ１２５．５で起こることが実証された。
【００２１】
１１−ヒドロキシ−エリスラビン（１１−ＯＨ−エリスラビン）
１１−ＯＨ−エリスラビンの１ＨのＮＭＲスペクトルでは（表２）、エリスラビンと同様に、位置Ｃ−３ではメトキシル水素のシグナルがなく、エリスラルチンでは、酸素化された置換体に関するδ４．５の多重線のみが位置Ｃ−３に起因していた。エリスラルチンで観察されたものと同様に、１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲスペクトルにより、Ｃ−１１のヒドロキシルの存在に起因するそれぞれδ４．７４（ｔ）及びδ６３．６９の化学シフトが明らかとなった。これらの結果は今回初めて報告されるものであり、したがって、物質３は新規エリスリナアルカロイドであると認識され、１１−ヒドロキシ−エリスラビン（１１−ＯＨ−エリスラビン）と命名した。イー・ムルングの花の粗抽出物から単離したアルカロイド１１−ＯＨ−エリスラビンの化学構造を以下に表す。
【化２】
【実施例３】
【００２２】
薬理学的評価
サンパウロ州立大学（ＵＮＥＳＰ／Ａｒａｒａｑｕａｒａ）の中央動物研究室（ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｉｍａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）からの体重２５〜３５ｇのスイスマウスを用いた。動物は、床に木屑を敷き、飼料及び水が自由に利用可能なポリプロピレン製ケージ内で、１０〜１２匹の動物の群で飼育した］。動物研究室は２２±１℃の一定温度の下に維持し、照明は午前７：００から午後７：００の１２時間サイクルで制御し、湿度は５０〜６０％に保った。抽出物、標準薬物及びビヒクルで薬理学的評価を行った。したがって、Ｆ２（３、６、１０、１７及び３０ｍｇ／ｋｇ）並びにアルカロイドエリスラルチン、エリスラビン及び１１−ＯＨ−エリスラビン（３及び１０ｍｇ／ｋｇ）に加えて、凍結乾燥した含水アルコール抽出物（５０、１００、２００及び４００ｍｇ／ｋｇ）を用い、胃管栄養法による経口摂取で投与した。用いた標準薬物は２ｍｇ／ｋｇの用量のジアゼパム（ＤＺＰ）であった（腹腔内による）。すべての溶液は実験当日に０．９％塩素酸ナトリウムで調製して１５分間超音波処理し、ジアゼパムは０．９％塩素酸ナトリウム及びＴｗｅｅｎ−８０中の溶液とした。午前１１：００及び午後５：００の間に実施し、実験の装置及び手順は後に記載する。高架式Ｔ迷路は透明なガラス製の壁及び木製の床で作製され、２つの開いたアーム（３０×５×０．２５ｃｍ）に垂直に連結された１つの閉じたアーム（３０×５×１５ｃｍ）からなり、木製の支柱によって床から３８．５ｃｍの高さに持ち上げられている。この試験では、抑制回避の測定を５回連続して行い（基礎待ち時間、回避１、２、３及び４）、開いたアームからの脱出を１回行い、それぞれの試行の間に３０秒間の間隔を設けた。回避の測定では、動物を閉じたアームの遠位部分に配置し、開いたアームに向かう４本の足すべてのこのアームの退出待ち時間を計測した。脱出の測定では、動物を右側の開いたアームの末端に配置し、このアームからの出発時刻を測定した。これらの測定中に動物が迷路のアーム内に滞在する最長時間は３００秒間であった。各動物を試験した後に装置を２０％エタノールで清掃した。偽陽性又は陰性を避けるために、高架式Ｔ迷路で試験した直後に動物をアリーナにおける運動活動試験に供した。この装置は、長方形底辺（４０×４８ｃｍ）を有し、３０ｃｍの高い壁に囲まれた白色のポリプロピレン製の箱からなる。床は３０個の正方形（８×８ｃｍ）に分割されている。この試験では、動物を箱の中心に配置し、その活動を５分間ビデオ録画し、次いで象限領域を横断した回数及びストレッチ−注意姿勢の回数を分析した（ＷＡＬＳＨ及びＣＵＭＭＩＮＳ、１９７６）。
【００２３】
動物モデルのすべての結果は、最初にレヴィーン均質性試験に供した。不均一な結果を対数スケールに変換し、のちに統計的に分析した。高架式Ｔ迷路から得られた結果を二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供し、ここで、治療は独立因子であり、試行が従属因子である。治療の効果が有意であると判明した場合は、一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでダンカン事後試験を用いてデータを分析した。アリーナを用いて得られた結果を一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでダンカン事後試験に供した。ｐ≦０．０５の量が有意な結果であるとみなされた。
【００２４】
高架式Ｔ迷路試験
表２で見られるように、１１−ＯＨ−エリスラビンは高架式Ｔ迷路モデルにおける抑制回避課題において動物の成績を損なわせた。二元配置ＡＮＯＶＡにより、治療（Ｆ（３．３３）＝８．３０；ｐ＜０．００１）、試行（Ｆ（４．１３２）＝１４．７５；ｐ＜０．０００１）及び治療と試行との間の相互作用（Ｆ（１２．１３２）＝２．４２；ｐ＜０．０１）において有意な差が明らかとなった。一元配置ＡＮＯＶＡにより、治療群間でＥ１（Ｆ（３．３３）＝４．４７；ｐ＜０．０１）、Ｅ２（Ｆ（３．３３）＝５．２９；ｐ＜０．０１）、Ｅ３（Ｆ（３．３３）＝５．２９；ｐ＜０．０１）及びＥ４（Ｆ（３．３３）＝１０．２９；ｐ＜０．０００１）に有意な差が示されたが、基礎待ち時間（Ｆ（３．３３）＝０．５１；ｐ＜０．６７）には示されなかった。表２は、ダンカン事後試験による、対象群と比較した各群間の差異を示す。
【００２５】
開いたアームからの脱出の測定に関して、一元配置ＡＮＯＶＡにより、対象群と比較して治療群間で差異は存在しなかったことが示された（Ｆ（３．３３）＝０．７１；ｐ＜０．５４）。
【００２６】
表２−高架式Ｔ迷路試験に供したマウスにおける１１−ＯＨ−エリスラビンを用いた急性期治療の効果（平均＋ＥＰＭ）
【表２】
【００２７】
運動活動−アリーナ
一元配置ＡＮＯＶＡにより、アリーナの象限を横断した回数（Ｆ（３．３３）＝０．７６；ｐ＜０．５１）及びストレッチ−注意姿勢の回数（Ｆ（３．３３）＝１．２０；ｐ＜０．３２）のどちらに関しても、用いた１１−ＯＨ−エリスラビンの用量はいずれも運動活動を変更しなかったことが示された。表３は、運動活動試験で得られた結果を示す。
【００２８】
表３−アリーナ内のマウスの運動活動に対する１１−ＯＨ−エリスラビンの急性期治療の効果（平均＋ＥＰＭ）。
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】イー・ムルングの含水アルコール粗抽出物を抽出及び分画する段階、並びにイー・ムルングの含水アルコール粗抽出物を用いてアルカロイドエリスラルチン、エリスラビン及び１１−ＯＨ−エリスラビンを単離する段階の一般的な例示的なスキームを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式を有する物質：
【化１】
又はその製薬上許容される同配体、塩、及び／若しくは溶媒和物を含み、前記物質がコリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連することを特徴とする、エリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）の含水アルコール抽出物。
【請求項２】
コリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害が不安であることを特徴とする、請求項１記載の含水アルコール抽出物。
【請求項３】
製薬上許容されるビヒクル並びに少なくとも１つの以下の一般式の活性物質：
【化２】
又はその製薬上許容される同配体、塩、及び／若しくは溶媒和物を含みコリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害を治療することを特徴とする、エリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）の含水アルコール抽出物を含む薬剤組成物。
【請求項４】
コリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害が不安であることを特徴とする、請求項３記載の薬剤組成物。
【請求項５】
エリスラルチン及び／又はエリスラビンも含むことを特徴とする、請求項３又は４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
製薬上許容されるビヒクルを調製する段階と；
少なくとも１つの以下の一般式の活性物質：
【化３】
又はその製薬上許容される同配体、塩、及び／若しくは溶媒和物を前記ビヒクル内に取り込ませる段階と
を含むことを特徴とする、コリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害を治療するための医薬品の製造方法。
【請求項７】
活性物質のエリスラルチン及び／又はエリスラビンを前記ビヒクルに任意選択で加えることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記活性物質がエリスリナ属の植物の含水アルコール抽出物から得られることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記活性物質がエリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）植物種の含水アルコール抽出物から得られることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１】
以下の一般式を有する物質：
【化１】
又はその製薬上許容される同配体、塩、及び／若しくは溶媒和物を含み、前記物質がコリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連することを特徴とする、エリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）の含水アルコール抽出物。
【請求項２】
コリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害が不安であることを特徴とする、請求項１記載の含水アルコール抽出物。
【請求項３】
製薬上許容されるビヒクル並びに少なくとも１つの以下の一般式の活性物質：
【化２】
又はその製薬上許容される同配体、塩、及び／若しくは溶媒和物を含みコリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害を治療することを特徴とする、エリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）の含水アルコール抽出物を含む薬剤組成物。
【請求項４】
コリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害が不安であることを特徴とする、請求項３記載の薬剤組成物。
【請求項５】
エリスラルチン及び／又はエリスラビンも含むことを特徴とする、請求項３又は４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
製薬上許容されるビヒクルを調製する段階と；
少なくとも１つの以下の一般式の活性物質：
【化３】
又はその製薬上許容される同配体、塩、及び／若しくは溶媒和物を前記ビヒクル内に取り込ませる段階と
を含むことを特徴とする、コリン作動系及び／又はセロトニン作動系の機能不全に関連する障害を治療するための医薬品の製造方法。
【請求項７】
活性物質のエリスラルチン及び／又はエリスラビンを前記ビヒクルに任意選択で加えることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記活性物質がエリスリナ属の植物の含水アルコール抽出物から得られることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記活性物質がエリスリナ・ムルング（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｍｕｌｕｎｇｕ）植物種の含水アルコール抽出物から得られることを特徴とする請求項８記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５１６９９２（Ｐ２００８−５１６９９２Ａ）
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３７０７７（Ｐ２００７−５３７０７７）
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＲ２００５／０００２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２３８９
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１３０６０２）ユニベルシダデ エスタドゥアル パウリスタ ジュリオ デ メスクイタ フィルオ − ウネスプ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＲ２００５／０００２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２３８９
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１３０６０２）ユニベルシダデ エスタドゥアル パウリスタ ジュリオ デ メスクイタ フィルオ − ウネスプ (2)
【Ｆターム（参考）】
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