エリスロポイエチンを含む安定な薬剤組成物
本発明はＰＶＰで安定化されたエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の新規な安定した薬剤組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含む新規な安定した薬剤組成物に関係する。
【０００２】
ＥＰＯは哺乳動物における赤血球の形成を調節する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、骨髄における赤血球系前駆細胞に対する増殖及び／又は分化因子として作用し、これらの前駆細胞の増殖及び赤血球への分化をもたらす。
【背景技術】
【０００３】
天然に生じるヒトＥＰＯは、腎臓で産生され、赤血球生成を刺激する体液性血漿因子である。ＥＰＯは、骨髄における関連赤血球系前駆体の分裂及び分化を刺激する（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９、４２０２−４２１１、１９７４年、Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０３、８６６−８７０、１９７８年）。ＥＰＯは成体の腎臓（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０３、８６６−８７０、１９７８年）及び胎児の肝臓（Ｚａｎｊａｎｉら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８９、６４０−６４４、１９７７年）において産生される。
【０００４】
生体へのＥＰＯの薬剤組成物の投与は赤血球の生成を刺激及び／又は促進する。ＥＰＯの薬剤組成物は、慢性腎不全、癌における化学療法による治療に続発性の貧血、及びヒト免疫不全性ウイルス感染症のジドブジン治療と連合した貧血の治療、ならびに他の種類の貧血の治療に使用される（Ｄａｎｎａら、臨床用途におけるエリスロポイエチン−国際的展望（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；３０１−３２４、１９９０年；Ｅｓｃｈｂａｃｈ ｉｎ ｓｏｄ．、Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．、３１６、２、７３−７８、１９８７年；Ｋｒａｎｅ、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．、３１、３、１７７−１８１、１９８３年）。
【０００５】
哺乳動物細胞におけるヒトＥＰＯ遺伝子の発現の生成物である組換えＥＰＯがＥＰＯの薬剤組成物において使用されている（ＥＰ第１４８６０５号、ＥＰ第２０５５６４号、ＥＰ第２５５２３１号）。また、幾つかのＥＰＯ類似体及び誘導体も当技術分野において開示されている：ＥＰ第６４０６１９号、ＥＰ第６６８３５１号、ＷＯ第９４１２６５０号、ＥＰ第１０６４９５１号、ＷＯ第０２３２９５７号、ＷＯ第９５３３０５７号、ＵＳ第５９１６７７３号、ＷＯ第０９９０２７１０号、ＵＳ第５５８０８５３号、ＵＳ第５７４７４４６号、ＵＳ第５９１９７５８号及びＵＳ第６１０７２７２号。
【０００６】
ヒト血清アルブミンを含むＥＰＯの薬剤組成物が：ＥＰ第１７８６６５号、ＥＰ第１７８５７６号、ＵＳ第５６６１１２５号、ＷＯ第００６１１６９号に開示されている。ヒト血清アルブミンはアレルギー反応を引き起こす可能性がある（Ｓｔａｆｆｏｒｄ ＣＴら、Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ、６１（２）、８５−８８、１９８８年）。その上、薬剤組成物がヒト血液製剤を含んでいるときにはウイルスに感染する危険性が存在する。従って、安定しており、アルブミンなどのヒト血液製剤を含まないＥＰＯの薬剤調合物が必要とされている。
【０００７】
ＥＰ第３０６８２４号、ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第５２８３１３号及びＥＰ第５２８３１４号は、ＥＰＯ安定剤として尿素を用いる薬剤組成物を開示している。
【０００８】
ＥＰ第３０６８２４号、ＥＰ第１７８６６５号、ＧＢ第２１７１３０４号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第５２８３１３号及びＥＰ第１００２５４７号はＥＰＯの凍結乾燥調合物を開示している。
【０００９】
ＵＳ第５３７６６３２号は、アルファ及びベータシクロデキストリンを使用した薬剤調合物を開示している。
【００１０】
ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第１７８６６５号におけるＥＰ第５２８３１３号は、ベンジルアルコール、パラベン、フェノール及びこれらの混合物などの抗菌保存剤を含むＥＰＯの水性薬剤組成物を開示している。
【００１１】
ＥＰ第９０９５６４号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第４３０２００号及びＷＯ第００６１１６９号は、安定剤としてアミノ酸及び／又はアミノ酸と非イオン性界面活性剤の組合せの使用を開示している。
【００１２】
ＷＯ第０１８７３２９号は、ポリエチレングリコール化（ペグ化）されたＥＰＯ類似体の種々の異なる薬剤組成物を開示している。ここで開示されている薬剤組成物は、本質的に硫酸塩緩衝剤の使用に基づくものである。
【００１３】
ＲＵ第２１２８５１７号、ＷＯ第００６１１６９号、ＥＰ第５２８３１３号、ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第１７８６６５号：において開示されているＥＰＯの薬剤組成物はクエン酸塩緩衝剤中において調製される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、ＥＰＯを有益に安定化させることができる、ＥＰＯを含む薬剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、特許請求項１に記載の、ＥＰＯを含む新規な安定した薬剤組成物を提供する。好適な実施態様は従属請求項で説明されている。また、本発明は請求項１７に記載の使用、請求項１８に記載の方法、及び請求項２０に記載の使用も提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本薬剤組成物は、医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び安定剤として作用するポビドン（ポリビニルピロリドン；ＰＶＰ）と共に調合される。ＥＰＯの安定化は、本発明の組成物が好適にはヒトまたは動物起源に由来するＥＰＯ以外の添加剤（例えば血清タンパク質）を含まない状態でありながら達成される。本薬剤組成物は、等張化剤及び／又は１つ以上の医薬適合性の賦形剤を場合によって更に含む。本発明の薬剤組成物はヒト及び獣医学において使用するのに適しており、適切な投与形態において、特に非経口的適用、例えば筋肉内、皮下及び／又は静脈内適用に対して医薬適合性である。一つの特に好適な実施態様では、本発明の薬剤組成物は液体の形態、より好適には水溶液の形態を為している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
驚くべきことに、ＰＶＰを含み、好適にはＥＰＯ以外にはヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない薬剤組成物は、ＥＰＯを有益に安定化させることが判明した。
【００１８】
本発明は：
ａ．治療的に有効量のＥＰＯ、
ｂ．医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び
ｃ．ＰＶＰ
を含む、ＥＰＯの薬剤組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、成分ａ−ｃに加え：
ｄ．等張化剤及び／又は
ｅ．１つ以上の他の医薬適合性の賦形剤
を場合によって更に含む、ＥＰＯの薬剤組成物も提供する。
【００２０】
本発明の組成物は、好適にはヒトまたは動物起源に由来する添加剤を含んでいない。
【００２１】
「エリスロポイエチン（ＥＰＯ）」という用語は、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生成を高めさせるインビボにおける生物学的活性を有するタンパク質を表し、ヒトＥＰＯ及び誘導体ならびに類似体からなる群から選択され、これらについては以下で定義される。
【００２２】
「治療的に有効量のＥＰＯ」という用語は、ＥＰＯの治療的な効果を可能にする量のＥＰＯを表す。
【００２３】
「安定剤」という用語は、ＥＰＯに対する安定化効果を有する医薬適合性の賦形剤を表す。
【００２４】
「ＥＰＯ安定性」という用語は、ＥＰＯ含量の維持及びＥＰＯの生物学的活性の維持を表す。ＥＰＯ安定性はとりわけ以下のプロセスにより影響を受け得る：容器壁へのＥＰＯの吸着、ＥＰＯの変性または分解、及び例えばＥＰＯダイマー及び／又はＥＰＯマルチマー及び／又はもっと高い分子量を有する同様な分子などの凝集体形成。これらのプロセスは、サンプルが例えば比較的高い温度、不適切な容器、誤ったＥＰＯ安定剤の使用、日光、不適切な保管方法及び／又は不適切な単離手順などの種々の異なる条件に晒されることにより起こる。
【００２５】
「ヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない」という用語は、ヒト及び／又は動物に由来し、ＥＰＯとは異なるＨＳＡまたはＢＳＡのような血清アルブミンなどの添加剤が本組成物に意図的に加えられていない状態、または、ＥＰＯ調製物中に元々存在している場合には、前述の添加剤が、ＥＰＯの精製及び／又は単離中に、不可避的な痕跡量のレベルにまで、好適には標準的な分析方法によって典型的には検出できないレベルにまで分離または低減されている状態を表す。
【００２６】
驚くべきことに、本発明の組成におけるＥＰＯの調合は、冷蔵庫内の温度（例えば２から８℃）以上の温度、特に室温（即ち、２５℃以下）、更には比較的高い温度（例えば４０℃）においてさえ、安定性を改善することが判明した。これは、本組成物が、有意な量の活性を失うことなく、及び有意な分解を伴うことなく、冷却せずに長期間（室温で１０週間以上）保管できることを意味している。
【００２７】
本発明の薬剤組成物においては、ｐＨ緩衝系のほかに、及び場合によっては等張化剤及び／又は更なる医薬適合性の賦形剤のほかに、効果的なＥＰＯ安定剤としてＰＶＰのみを使用することができ、ＥＰＯを安定化させるために更なる安定剤は何ら必要でない。従って、ＰＶＰは、先行技術において説明されているＥＰＯの薬剤組成物におけるＥＰＯ安定性を維持するために使用することが知られている種々の安定剤の組合せに取って代わることができる。２つ以上の安定剤の代わりに１つの効果的な安定剤のみを含む薬剤組成物の調製は経済的な観点において一層優れている。この調製は、上述の先行技術よりも容易に果たすことができ、費用を抑えられ、調製に掛かる時間が短く、患者が生体内に受容する添加物の量も少なくて済む。従って、本発明の薬剤組成物は、この様式に限定されるものではないが、好適には前述の構成成分ａ．−ｃ．のみ、または場合によってａ．−ｄ．、ａ．−ｃ．プラスｅ．、もしくはａ．−ｅ．からなっていてよい。
【００２８】
先行技術から既知の幾つかの薬剤組成物においては、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０のような非イオン性界面活性剤がＥＰＯの安定剤として使用される。ＰＶＰの使用は、ＥＰＯダイマー、ＥＰＯマルチマー、及びＥＰＯ分子の凝集から生じるもっと高い分子量を有する関連物質を測定するための分析法としてゲル濾過法を用いることができるため、ポリソルベートを用いる場合よりも有利である。ポリソルベートは、ＥＰＯダイマーが溶出するのと同じ時間で溶出される。それ故、ポリソルベートを含む薬剤組成物の場合には、ＥＰＯダイマーに対する検出法としてゲル濾過法を使用することができない。従って、ＰＶＰの使用は、ＥＰＯ安定性をもたらす一層簡単な様式、高められた安全性、及びＥＰＯの薬剤組成物の品質の一層簡単な制御に寄与する。
【００２９】
本発明の薬剤組成物は好適には液体、特に水性の薬剤組成物である。このような液体組成物は、ＥＰＯの生物学的活性の低下を招く可能性があり、更には消失させることさえあり得る再構成、希釈または付加的な調製ステップを伴うことなく、皮下、静脈内または筋肉内適用などの非経口的な適用で直接的に使用することができ、また、適用時に生じる付加的な技術的問題を回避することにも寄与できる。従って、液体薬剤組成物の使用は、凍結乾燥調合物を使用する場合よりも実用的である。ＥＰＯの液体、特に水性調合物は、凍結乾燥組成物の再構成プロセスが時間の掛かるプロセスであり、このタンパク質調合物を不適切に取り扱う危険性をもたらし、または不適切に再構成される可能性があり、更にこの薬剤の充分な活性を保持するために通常は安定剤などの特定の添加剤を必要とするため、ＥＰＯの臨床的調合物を調製する上で、凍結乾燥調合物よりも一般的に好適である。
【００３０】
本発明の薬剤組成物は、最も好適には、血液スクリーニングにもかかわらず伝染性物質での感染の危険性をもたらすヒト血清タンパク質のようなヒトまたは動物起源に由来する添加剤を含んでいない。更に、組換えＥＰＯは一般的に良好に耐性であるが、時折、このＥＰＯ調合物のある成分に対するアレルギー性過敏症を示唆する皮膚発疹及び蕁麻疹が観測されており、この成分はヒト血清アルブミンである可能性が高い。
【００３１】
本発明の薬剤組成物は好ましくは等張液中において調製することができ、薬学的に許容可能であり、アレルギー性過敏症のような副作用をもたらさないことが期待される。
【００３２】
本発明の薬剤組成物は、ＥＰＯの生物学的活性にかかわりなく、更には合成または製造方法にかかわりなく、ＥＰＯアルファ、ＥＰＯベータ、ＥＰＯオメガ、及び種々のイソ型プロフィールを有する他のＥＰＯ調製物を含むあらゆる形態のＥＰＯに対して、ならびに特定のＥＰＯイソ型、ＥＰＯムテイン、ＥＰＯフラグメント、ＥＰＯダイマーなどのＥＰＯ類似体、ＮＥＳＰ（組換えヒトＥＰＯの超グリコシル化類似体）、遺伝子活性化ＥＰＯ、ペグ化ＥＰＯ、ＥＰＯとのハイブリッド分子、ＥＰＯフラグメント、ＥＰＯとの融合タンパク質（オリゴマー及びマルチマー）、及び修飾されたグリコシル化プロフィールを有するＥＰＯに対して使用することができ、上述の合成または製造方法は、これらに限定するものではないが、天然に生じたＥＰＯ及び（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのどちらから生成されたかにかかわりなく）組換えＥＰＯの単離、合成による方法、トランスジェニック法及び遺伝子活性化による方法を含むことができる。
【００３３】
本発明の薬剤組成物は、１回の用量当たり５００単位から１０００００単位まで、またはそれ以上のＥＰＯ（１ＩＵは約１０ナノグラムの組換えＥＰＯに相当する）を含んでいてよく、好適には１回の用量当たり１０００ＩＵから４００００ＩＵまでのＥＰＯを含んでいてよい。一般的に、有効量は、特にＥＰＯが皮下的に与えられる場合には、１ＩＵ／ｋｇ体重から５００ＩＵ／ｋｇ体重まで、より好適には５０ＩＵ／ｋｇ体重から３００ＩＵ／ｋｇ体重までであろうと推測される。有効量は、更に、治療される被検者の種及びサイズ、治療される個々の状態または疾患及びそれの重症度、ならびに投与経路に依存する。好適な実施態様では約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ及び約４００００ＩＵからなる群から選択される１回の用量当たりの量をもたらすべく、薬学的な量が調合される。
【００３４】
本発明の薬剤組成物はアンプル、注射器及びバイアルに充填することができる。これらは、１回の用量当たり０．２ｍｌから２０ｍｌまでの適切な範囲における容量での適用を可能にする。
【００３５】
これらの溶液に対する好適なｐＨ範囲は約６から約８までであり、約６．８から約７．５までの範囲がより好適であり、約７．０のｐＨが最も好適である。リン酸塩緩衝系、特にＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ／Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏなどのリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの使用が好適である。約６から約８までの望ましいｐＨ範囲を維持するのに適した他の緩衝系は、これらに限定するものではないが、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、及び当技術分野において既知の他のあらゆる医薬適合性のｐＨ緩衝剤を含む。クエン酸塩緩衝剤は注入部位に痛みをもたらす可能性がある。従って、非経口的な適用ではリン酸塩緩衝剤の方が好適である。
【００３６】
緩衝系、特にリン酸塩緩衝剤の濃度は本調合物の望ましいｐＨに依存する。好適な濃度は１０ｍＭから５０ｍＭまで、より好適には１５ｍＭから３５ｍＭまで、最も好適には１５ｍＭから２５ｍＭまでの範囲である。ｐＨ調節剤、例えば、これらに限定するものではないが、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、クエン酸またはクエン酸ナトリウムなどが加えられてよい。
【００３７】
本発明の薬剤組成物はＥＰＯ安定剤としてＰＶＰを含む。本発明の意味において、ＰＶＰは、ポビドンまたはポリビニルピロリドンとしても知られている通常の形態のポリ［１−（２−オキソ−１−ピロリジニル）エチレン］で代表される。低分子量ＰＶＰ、特にＰＶＰ Ｋ１２からＫ１８までの使用が好適であり、ＰＶＰ Ｋ１２の使用が最も好適である。本発明の組成物におけるＰＶＰの含量はＥＰＯに対する安定化効果をもたらす量でなければならず、適切には少なくとも０．００１％（ｗ／ｖ）の量である。ＰＶＰの濃度は好適には約０．０１％から約５．０％まで、より好適には０．１％から１．０％までの範囲であり、最も好適には約０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００３８】
本発明の薬剤組成物は、本発明の調合物をヒト血液と等浸透圧に為すことができる物質を場合によって更に含む。典型的な適切な等張化剤は当技術分野において広く知られており、これらに限定するものではないが、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２などの無機塩、マンニトール、グリシン、グルコース及びソルビトールからなる群から選択される物質を含む。本発明の調合物における等張化剤としてＮａＣｌを使用することが好適である。
【００３９】
上述のように、単独の効果的な安定剤としてＰＶＰを伴う調合物が好適であるが、本発明の薬剤組成物は、望ましい場合には、前述の成分ａ．、ｂ．及び場合によってｄ．ならびにｅ．のほかに、１つより多くのタイプの安定剤を場合によって含んでよい。この付加的な安定剤は、好適には、ソルビタン誘導体／例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０などのポリソルベート、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ６８などのポロキサマーなどの界面活性剤を含む群から選択される。これらの中でもとりわけＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８が特に好適であり、適切には約１％または１％未満の濃度、より好適には０．０５％から０．２％までの濃度で使用される。
【００４０】
本発明の薬剤組成物は、１つ以上の医薬適合性の賦形剤を場合によって更に含んでよい。医薬適合性の適切な賦形剤は、マンニトール、ソルビトール、グリセロール及びポリエチレングリコールの群から選択されるポリオール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、マクロゴールエステル及びエーテル、グリコール及びグリセロールエステル、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−２−フェニルアラニン、Ｌ−トレオニンなどのアミノ酸を含む。
【００４１】
本発明の組成物はＥＰＯに関連する疾患の治療用及び／又は予防用薬剤を調製するために使用することができる。医学的な用途の例は、赤血球増殖（ＲＢＣ）の刺激が望まれる場合や、内因性ホルモン欠損が存在する場合、失血している場合、または患者が貧血の徴候を有している場合、もしくは患者が内因性ホルモンに対する骨髄の低応答性を有している場合などにおける様々な療法を含む。これらの医学的な適応は、例えば悪性疾患（即ち、あらゆるタイプの固形癌、または白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む血液性癌）の貧血、悪性疾患の化学療法／放射線療法による治療に由来する貧血、例えばリウマチ様関節炎及び肝炎などの自己免疫疾患を含む慢性疾患の貧血、ＡＩＤＳ患者、特にＡＺＴによる治療を受けているＡＩＤＳ患者における貧血、早産の貧血、（慢性）腎不全との関連性を有する貧血、サラセミアの貧血、自己免疫性溶血性貧血、無形成性貧血、及び（例えば、実質的な失血を阻止すべくヘモグロビンレベルを刺激及び増加するために行われる、または骨髄移植を受ける被験者の赤血球生成を増大させるために行われる自己輸血用の術前供血を改善するための）手術との関連性を有する貧血、疲労、疼痛、慢性心不全、律動異常または痴呆の治療、非血管及び非心臓手術における同種異系輸血の必要性を低減するための術前使用、ならびにＥＰＯに関連する他の適応症である。
【００４２】
以下の実施例により本発明を例証するが、本発明をこれらの実施例に限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
分析方法
以下の分析法を用いて本発明の薬剤組成物を分析した：免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ、及びマウスでのインビボ生物学的活性アッセイ。
【００４４】
免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ：還元剤を含まないローディング緩衝液中においてローディングサンプルを調製した。垂直式ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた：ゲルＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２％、８×８ｃｍ、厚み１．０ｍｍ、ＭＯＰＳ ＳＤＳ電気泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中における１５レーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。電気泳動は、２００Ｖの一定電圧で１時間実行した。ゲルからニトロセルロース膜へのエレクトロトランスファー後、免疫学的検出を２段階で実施した。最初のステップでは一次抗体（抗−ｈｕＥＰＯ、マウス、モノクローナル）を使用した。第二ステップでは、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された二次抗体（抗−マウスＩｇＧ、ウサギ、ポリクローナル）を用いた。ペルオキシダーゼ基質の付加は酵素反応を惹起し、青色に着色された複合体を形成する。
【００４５】
ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ：システムＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は二重抗体サンドイッチ法に基づいている。ＥＰＯに特異的なモノクローナル（マウス）抗体で予め被覆されたマイクロプレートウェルを試料または標準と共にインキュベートする。ＥＰＯはプレート上の固定化抗体に結合する。試料または標準の除去後、ウェルを西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された抗−ＥＰＯポリクローナル（ウサギ）抗体と共にインキュベートする。この二回目のインキュベーション中に、抗体−酵素接合体が上述の固定化されたＥＰＯに結合する。色原体がウェルに加えられ、酵素反応により酸化されて青色に着色した複合体を形成する。この発生した色の量は、ＥＰＯ抗体複合体に結合された接合体の量に直接的に比例し、これは、更に、試料または標準中のＥＰＯの量に直接的に比例する。
【００４６】
ＳＥＣ：ＳＥＣを用いて、２０００ＩＵ／ｍｌから１００００ＩＵ／ｍｌまでのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプル中におけるＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量を有する関連物質の割合を測定した。ヨーロッパ薬局方のプロトコルによる限界アッセイを用いた（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２００２年、第４版、エリスロポイエチン濃縮溶液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））。
【００４７】
インビボ生物学的活性：
低酸素症マウスでの生物学的活性をインビボ測定するためのＥｕｒ．Ｐｈに記載されているプロトコルを用いた。生物学的活性の推定もＥｕｒ．Ｐｈからのプロトコルの下で実施した（ヨーロッパ薬局方−１９９７年；生物学的なアッセイ及び試験の結果の統計解析；平行線モデル（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｓ；Ｔｈｅ ｐａｒａｌｌｅｌ−ｌｉｎｅ ｍｏｄｅｌ））。Ｅｕｒ．Ｐｈの要求の下では、生物学的活性の推定値はマークされた活性の８０％から１２０％までの間の範囲に入っていなければならない。本方法の目的は、注入されたＥＰＯの含量（値）（１００００ＩＵ／ｍｌ）に関して８０％から１２０％までの間の範囲に到達することであり、得られた結果は生物学的活性の推定値であって精確な値ではない。信頼限界はマークされた活性の６４％から１５６％までの間の範囲に入っていなければならない。
【００４８】
ＥＰＯの薬剤組成物の安定性を試験する条件
ＨＬ−対照標準：２℃から８℃、冷蔵庫
４０：４０℃±２℃、相対湿度７５％±５％、気候室
２５：２５℃±２℃、相対湿度６０％±５％、気候室
（実施例１）
安定性試験
調合物ＦＰ１からＦＰ８までの以下の組成物を調製した：
ＦＰ１：Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（０．０３％（重量／容量（ｗ／ｖ））、グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤２０（ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＣｌ（１００ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ２：グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、グリセロール（１．４％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（３２ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ３：グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＣｌ（９０．６ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ４：ソルビトール（４．５％（ｗ／ｖ））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ５：デキストラン７０（１％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１２３ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ６：グリセロール（２％（ｗ／ｖ））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１７．１ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ７：グリセロール（２％（ｗ／ｖ））、ＰＶＰ Ｋ１２（０．５％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ８：ＰＶＰ Ｋ１２（０．５％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１２３ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）。
【００４９】
これらの調合物におけるＥＰＯの含量は、以下で説明されているように、２０００ＩＵ／ｍｌまたは１００００ＩＵ／ｍｌに設定される。
【００５０】
それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルを４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した（４０）。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛けた；各レーンに０．４μｇがローディングされた。図１はこれらの結果を示している。
【００５１】
図１の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ４０
６：ＦＰ２ ４０
７：ＦＰ３ ４０
８：ＦＰ４ ４０
９：ＦＰ５ ４０
１０：ＦＰ６ ４０
１１：ＦＰ７ ４０
１２：ＦＰ８ ４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５２】
図２は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管した場合（ＨＬ）と４０℃（±２℃）で保管した場合（４０）における、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ４までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５３】
図２の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ＨＬ
６：ＦＰ２ ＨＬ
７：ＦＰ３ ＨＬ
８：ＦＰ４ ＨＬ
９：ＦＰ１ ４０
１０：ＦＰ２ ４０
１１：ＦＰ３ ４０
１２：ＦＰ４ ４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５４】
図３は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管した場合（ＨＬ）と４０℃（±２℃）で保管した場合（４０）における、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ５からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を決定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５５】
図３の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ５ ＨＬ
６：ＦＰ６ ＨＬ
７：ＦＰ７ ＨＬ
８：ＦＰ８ ＨＬ
９：ＦＰ５ ４０
１０：ＦＰ６ ４０
１１：ＦＰ７ ４０
１２：ＦＰ８ ４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５６】
図４は、１０週間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）された、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５７】
図４の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ＨＬ
６：ＦＰ２ ＨＬ
７：ＦＰ３ ＨＬ
８：ＦＰ４ ＨＬ
９：ＦＰ５ ＨＬ
１０：ＦＰ６ ＨＬ
１１：ＦＰ７ ＨＬ
１２：ＦＰ８ ＨＬ
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５８】
図５は、１０週間２５℃（±２℃）で保管（２５）された、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５９】
図５の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ２５
６：ＦＰ２ ２５
７：ＦＰ３ ２５
８：ＦＰ４ ２５
９：ＦＰ５ ２５
１０：ＦＰ６ ２５
１１：ＦＰ７ ２５
１２：ＦＰ８ ２５
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００６０】
図６は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）されたＦＰ１からＦＰ８までのサンプルに対する、１ヶ月間４０℃（±２℃）で保管（４０）された、それぞれＥＰＯ １００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＥＰＯ−ＥＬＩＳＡの相対的な応答（％単位）を示している。
【００６１】
図７は、１０週間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）されたＦＰ１からＦＰ８までのサンプルに対する、１０週間２５℃（±２℃）で保管（２５）された、それぞれＥＰＯ １００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＥＰＯ−ＥＬＩＳＡの相対的な応答（％単位）を示している。
【００６２】
安定性試験の結果：
免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥは、本発明の薬剤組成物（ＦＰ７及びＦＰ８）の場合、室温において、例えばＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量を有する関連物質などのＥＰＯ凝集体が生じないことを示している（図１−５）。高められた温度の場合には、凝集体が少量存在する。高められた温度（４０℃で一ヶ月間）における本発明の薬剤組成物のＥＰＯ安定性と、ポリソルベートとアミノ酸グリシンの組合せを用いた薬剤組成物ＦＰ１との比較（図１、２、３）は、ＦＰ１でＥＰＯダイマーが形成されることを示している。ＥＰＯダイマーの形成は、ＥＰＯの安定性にとって一つの決定的なファクターである。また、例えばＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量が測定される関連物質などのＥＰＯ凝集体は、適用後の望ましくない副作用及びこの薬剤組成物で治療された患者の不快感の原因となる可能性もある。更に、これらの凝集体が生体の免疫応答を引き起こし、ＥＰＯを用いる治療を中止しなければならなくなる可能性もある。
【００６３】
効果的な安定剤としてＰＶＰのみを含む本発明の薬剤組成物（ＦＰ８）は、別な具合に調製された薬剤組成物（ＦＰ１−ＦＰ７）との高められた温度（４０℃、１ヶ月間；図６）での比較において、ＦＰ８のバイアルへのＥＰＯの吸着が、他の調合物と比較したときに、それ以下または同等であることを示す。室温の場合には、これらの吸着は同様であり、またはもっと良好である（図７）。バイアルへの吸着の増加はＥＰＯの安定性を低減させ、全体的な生物学的活性が低下することとなる。
【００６４】
先行技術において説明されている調合物では、ＥＰＯの安定剤としてアミノ酸が使用されてきた。しかし、アミノ酸は必ずしもＥＰＯに安定化効果をもたらさない。図６及び７において、グリシンを含む薬剤組成物ＦＰ２及びＦＰ３の高められた温度（４０℃で１ヶ月間）における安定性は、グリシンを含んでいない薬剤組成物ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６及びＦＰ８の安定性よりも低く、グリシンを含むＦＰ１よりも低いことが分かる。種々の安定剤の正しい組合せを用いれば高いＥＰＯ安定性を得ることができるが、これらの適切な組成は予測することができない。本発明の薬剤組成物の場合には、驚くべきことに、ＰＶＰがＥＰＯを安定化させることが判明した。
【００６５】
ＳＥＣにより測定されたＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量を有する関連物質の割合を、これらのサンプルの希釈された溶液と（２％の濃度において）比較した。これらの限界アッセイの結果が以下の表１に提示されている：
【００６６】
【表１】
【００６７】
インビボ生物学的活性を、２５℃で１０週間保管された、または４ヶ月間冷蔵庫内で保管された、１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するサンプルＦ８で測定した。
【００６８】
得られた結果が以下の表２に提示されている：
【００６９】
【表２】
【００７０】
これらの結果は、生物学的活性の推定値が要求された範囲内にあり、Ｅｕｒ．Ｐｈの要件を満たしていることを示す。信頼限界も要求された範囲内にある。
【００７１】
（実施例２及び３）
ＥＰＯの薬剤組成物の組成
本発明の実施例２及び３（において提示されている薬剤組成物）の組成が、それぞれ表３及び４に示されている。
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
物質の品質：
ＥＰＯ：ヨーロッパ薬局方による要求通りの品質（Ｐｈ Ｅｕｒ．品質）、ポビドン Ｋ１２（ポリ［１−（２−オキソ−１−ピロリジニル）エチレン］、ポリビドンまたはポリビニルピロリドン、ＰＶＰ）Ｐｈ Ｅｕｒ品質、米国薬局方にも対応する（ＵＳＰ品質）、ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入、
ＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ＮａＯＨ、注射用水：Ｐｈ．Ｅｕｒ．品質。
【００７５】
ＥＰＯを含む薬剤組成物の調製
ＰＶＰ Ｋ１２を含むプラシーボ溶液の調製：緩衝剤（Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ）、ＮａＣｌ及び安定剤ＰＶＰ Ｋ１２を、磁気攪拌機で混合することにより、室温で注射用水に溶解した。この後、１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．０−７．１に調節した。透明で無色な溶液が得られた。
【００７６】
ＥＰＯ溶液の調製：ＥＰＯ溶液の計算された容量（計算は、ＥＰＯ活性に関して行われた）を上述のプラシーボ溶液に加えた。このステップの直前に、同じ容量のプラシーボ溶液を採取した。磁気攪拌機を低回転数で用いることにより、この溶液を攪拌した。透明で無色の溶液が得られた。
【００７７】
この後、両濃度でＥＰＯを含む薬剤組成物の溶液を、細孔径が０．２μｍのＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜を用いる膜濾過により、無菌的（クラス１００の清浄化レベル）に無菌濾過した。０．８ｍｌの濾液を、洗浄及び滅菌された２ｍｌ用バイアル（無色の管状ガラス製加水分解タイプＩからのバイアル）に充填した後、ブロムブチルゴムでできた弾性栓で蓋をし、アルミニウム製キャップで密封した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した後のＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図２】４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した場合との比較における、冷蔵庫内で１ヶ月間保管したときのＥＰＯを含む対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図３】４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した場合との比較における、冷蔵庫内で１ヶ月間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図４】冷蔵庫内で１０週間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図５】２５℃（±２℃）で１０週間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図６】冷蔵庫内で１ヶ月間保管したとき（ＨＬ）の個々のサンプルに対する、４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管したとき（４０）の本発明及び対照標準サンプルの相対的応答ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ（％単位）を示している。
【図７】冷蔵庫内で１０週間保管したとき（ＨＬ）の個々のサンプルに対する、２５℃（±２℃）で１０週間保管したとき（２５）のＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルの相対的応答ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ（％単位）を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明はエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含む新規な安定した薬剤組成物に関係する。
【０００２】
ＥＰＯは哺乳動物における赤血球の形成を調節する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、骨髄における赤血球系前駆細胞に対する増殖及び／又は分化因子として作用し、これらの前駆細胞の増殖及び赤血球への分化をもたらす。
【背景技術】
【０００３】
天然に生じるヒトＥＰＯは、腎臓で産生され、赤血球生成を刺激する体液性血漿因子である。ＥＰＯは、骨髄における関連赤血球系前駆体の分裂及び分化を刺激する（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９、４２０２−４２１１、１９７４年、Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０３、８６６−８７０、１９７８年）。ＥＰＯは成体の腎臓（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０３、８６６−８７０、１９７８年）及び胎児の肝臓（Ｚａｎｊａｎｉら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、８９、６４０−６４４、１９７７年）において産生される。
【０００４】
生体へのＥＰＯの薬剤組成物の投与は赤血球の生成を刺激及び／又は促進する。ＥＰＯの薬剤組成物は、慢性腎不全、癌における化学療法による治療に続発性の貧血、及びヒト免疫不全性ウイルス感染症のジドブジン治療と連合した貧血の治療、ならびに他の種類の貧血の治療に使用される（Ｄａｎｎａら、臨床用途におけるエリスロポイエチン−国際的展望（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；３０１−３２４、１９９０年；Ｅｓｃｈｂａｃｈ ｉｎ ｓｏｄ．、Ｎ．Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．、３１６、２、７３−７８、１９８７年；Ｋｒａｎｅ、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐ．Ｍｅｄ．Ｊ．、３１、３、１７７−１８１、１９８３年）。
【０００５】
哺乳動物細胞におけるヒトＥＰＯ遺伝子の発現の生成物である組換えＥＰＯがＥＰＯの薬剤組成物において使用されている（ＥＰ第１４８６０５号、ＥＰ第２０５５６４号、ＥＰ第２５５２３１号）。また、幾つかのＥＰＯ類似体及び誘導体も当技術分野において開示されている：ＥＰ第６４０６１９号、ＥＰ第６６８３５１号、ＷＯ第９４１２６５０号、ＥＰ第１０６４９５１号、ＷＯ第０２３２９５７号、ＷＯ第９５３３０５７号、ＵＳ第５９１６７７３号、ＷＯ第０９９０２７１０号、ＵＳ第５５８０８５３号、ＵＳ第５７４７４４６号、ＵＳ第５９１９７５８号及びＵＳ第６１０７２７２号。
【０００６】
ヒト血清アルブミンを含むＥＰＯの薬剤組成物が：ＥＰ第１７８６６５号、ＥＰ第１７８５７６号、ＵＳ第５６６１１２５号、ＷＯ第００６１１６９号に開示されている。ヒト血清アルブミンはアレルギー反応を引き起こす可能性がある（Ｓｔａｆｆｏｒｄ ＣＴら、Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ、６１（２）、８５−８８、１９８８年）。その上、薬剤組成物がヒト血液製剤を含んでいるときにはウイルスに感染する危険性が存在する。従って、安定しており、アルブミンなどのヒト血液製剤を含まないＥＰＯの薬剤調合物が必要とされている。
【０００７】
ＥＰ第３０６８２４号、ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第５２８３１３号及びＥＰ第５２８３１４号は、ＥＰＯ安定剤として尿素を用いる薬剤組成物を開示している。
【０００８】
ＥＰ第３０６８２４号、ＥＰ第１７８６６５号、ＧＢ第２１７１３０４号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第５２８３１３号及びＥＰ第１００２５４７号はＥＰＯの凍結乾燥調合物を開示している。
【０００９】
ＵＳ第５３７６６３２号は、アルファ及びベータシクロデキストリンを使用した薬剤調合物を開示している。
【００１０】
ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第１７８６６５号におけるＥＰ第５２８３１３号は、ベンジルアルコール、パラベン、フェノール及びこれらの混合物などの抗菌保存剤を含むＥＰＯの水性薬剤組成物を開示している。
【００１１】
ＥＰ第９０９５６４号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第４３０２００号及びＷＯ第００６１１６９号は、安定剤としてアミノ酸及び／又はアミノ酸と非イオン性界面活性剤の組合せの使用を開示している。
【００１２】
ＷＯ第０１８７３２９号は、ポリエチレングリコール化（ペグ化）されたＥＰＯ類似体の種々の異なる薬剤組成物を開示している。ここで開示されている薬剤組成物は、本質的に硫酸塩緩衝剤の使用に基づくものである。
【００１３】
ＲＵ第２１２８５１７号、ＷＯ第００６１１６９号、ＥＰ第５２８３１３号、ＥＰ第６０７１５６号、ＥＰ第５２８３１４号、ＥＰ第１７８６６５号：において開示されているＥＰＯの薬剤組成物はクエン酸塩緩衝剤中において調製される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、ＥＰＯを有益に安定化させることができる、ＥＰＯを含む薬剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、特許請求項１に記載の、ＥＰＯを含む新規な安定した薬剤組成物を提供する。好適な実施態様は従属請求項で説明されている。また、本発明は請求項１７に記載の使用、請求項１８に記載の方法、及び請求項２０に記載の使用も提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本薬剤組成物は、医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び安定剤として作用するポビドン（ポリビニルピロリドン；ＰＶＰ）と共に調合される。ＥＰＯの安定化は、本発明の組成物が好適にはヒトまたは動物起源に由来するＥＰＯ以外の添加剤（例えば血清タンパク質）を含まない状態でありながら達成される。本薬剤組成物は、等張化剤及び／又は１つ以上の医薬適合性の賦形剤を場合によって更に含む。本発明の薬剤組成物はヒト及び獣医学において使用するのに適しており、適切な投与形態において、特に非経口的適用、例えば筋肉内、皮下及び／又は静脈内適用に対して医薬適合性である。一つの特に好適な実施態様では、本発明の薬剤組成物は液体の形態、より好適には水溶液の形態を為している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
驚くべきことに、ＰＶＰを含み、好適にはＥＰＯ以外にはヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない薬剤組成物は、ＥＰＯを有益に安定化させることが判明した。
【００１８】
本発明は：
ａ．治療的に有効量のＥＰＯ、
ｂ．医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び
ｃ．ＰＶＰ
を含む、ＥＰＯの薬剤組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、成分ａ−ｃに加え：
ｄ．等張化剤及び／又は
ｅ．１つ以上の他の医薬適合性の賦形剤
を場合によって更に含む、ＥＰＯの薬剤組成物も提供する。
【００２０】
本発明の組成物は、好適にはヒトまたは動物起源に由来する添加剤を含んでいない。
【００２１】
「エリスロポイエチン（ＥＰＯ）」という用語は、骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生成を高めさせるインビボにおける生物学的活性を有するタンパク質を表し、ヒトＥＰＯ及び誘導体ならびに類似体からなる群から選択され、これらについては以下で定義される。
【００２２】
「治療的に有効量のＥＰＯ」という用語は、ＥＰＯの治療的な効果を可能にする量のＥＰＯを表す。
【００２３】
「安定剤」という用語は、ＥＰＯに対する安定化効果を有する医薬適合性の賦形剤を表す。
【００２４】
「ＥＰＯ安定性」という用語は、ＥＰＯ含量の維持及びＥＰＯの生物学的活性の維持を表す。ＥＰＯ安定性はとりわけ以下のプロセスにより影響を受け得る：容器壁へのＥＰＯの吸着、ＥＰＯの変性または分解、及び例えばＥＰＯダイマー及び／又はＥＰＯマルチマー及び／又はもっと高い分子量を有する同様な分子などの凝集体形成。これらのプロセスは、サンプルが例えば比較的高い温度、不適切な容器、誤ったＥＰＯ安定剤の使用、日光、不適切な保管方法及び／又は不適切な単離手順などの種々の異なる条件に晒されることにより起こる。
【００２５】
「ヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない」という用語は、ヒト及び／又は動物に由来し、ＥＰＯとは異なるＨＳＡまたはＢＳＡのような血清アルブミンなどの添加剤が本組成物に意図的に加えられていない状態、または、ＥＰＯ調製物中に元々存在している場合には、前述の添加剤が、ＥＰＯの精製及び／又は単離中に、不可避的な痕跡量のレベルにまで、好適には標準的な分析方法によって典型的には検出できないレベルにまで分離または低減されている状態を表す。
【００２６】
驚くべきことに、本発明の組成におけるＥＰＯの調合は、冷蔵庫内の温度（例えば２から８℃）以上の温度、特に室温（即ち、２５℃以下）、更には比較的高い温度（例えば４０℃）においてさえ、安定性を改善することが判明した。これは、本組成物が、有意な量の活性を失うことなく、及び有意な分解を伴うことなく、冷却せずに長期間（室温で１０週間以上）保管できることを意味している。
【００２７】
本発明の薬剤組成物においては、ｐＨ緩衝系のほかに、及び場合によっては等張化剤及び／又は更なる医薬適合性の賦形剤のほかに、効果的なＥＰＯ安定剤としてＰＶＰのみを使用することができ、ＥＰＯを安定化させるために更なる安定剤は何ら必要でない。従って、ＰＶＰは、先行技術において説明されているＥＰＯの薬剤組成物におけるＥＰＯ安定性を維持するために使用することが知られている種々の安定剤の組合せに取って代わることができる。２つ以上の安定剤の代わりに１つの効果的な安定剤のみを含む薬剤組成物の調製は経済的な観点において一層優れている。この調製は、上述の先行技術よりも容易に果たすことができ、費用を抑えられ、調製に掛かる時間が短く、患者が生体内に受容する添加物の量も少なくて済む。従って、本発明の薬剤組成物は、この様式に限定されるものではないが、好適には前述の構成成分ａ．−ｃ．のみ、または場合によってａ．−ｄ．、ａ．−ｃ．プラスｅ．、もしくはａ．−ｅ．からなっていてよい。
【００２８】
先行技術から既知の幾つかの薬剤組成物においては、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０のような非イオン性界面活性剤がＥＰＯの安定剤として使用される。ＰＶＰの使用は、ＥＰＯダイマー、ＥＰＯマルチマー、及びＥＰＯ分子の凝集から生じるもっと高い分子量を有する関連物質を測定するための分析法としてゲル濾過法を用いることができるため、ポリソルベートを用いる場合よりも有利である。ポリソルベートは、ＥＰＯダイマーが溶出するのと同じ時間で溶出される。それ故、ポリソルベートを含む薬剤組成物の場合には、ＥＰＯダイマーに対する検出法としてゲル濾過法を使用することができない。従って、ＰＶＰの使用は、ＥＰＯ安定性をもたらす一層簡単な様式、高められた安全性、及びＥＰＯの薬剤組成物の品質の一層簡単な制御に寄与する。
【００２９】
本発明の薬剤組成物は好適には液体、特に水性の薬剤組成物である。このような液体組成物は、ＥＰＯの生物学的活性の低下を招く可能性があり、更には消失させることさえあり得る再構成、希釈または付加的な調製ステップを伴うことなく、皮下、静脈内または筋肉内適用などの非経口的な適用で直接的に使用することができ、また、適用時に生じる付加的な技術的問題を回避することにも寄与できる。従って、液体薬剤組成物の使用は、凍結乾燥調合物を使用する場合よりも実用的である。ＥＰＯの液体、特に水性調合物は、凍結乾燥組成物の再構成プロセスが時間の掛かるプロセスであり、このタンパク質調合物を不適切に取り扱う危険性をもたらし、または不適切に再構成される可能性があり、更にこの薬剤の充分な活性を保持するために通常は安定剤などの特定の添加剤を必要とするため、ＥＰＯの臨床的調合物を調製する上で、凍結乾燥調合物よりも一般的に好適である。
【００３０】
本発明の薬剤組成物は、最も好適には、血液スクリーニングにもかかわらず伝染性物質での感染の危険性をもたらすヒト血清タンパク質のようなヒトまたは動物起源に由来する添加剤を含んでいない。更に、組換えＥＰＯは一般的に良好に耐性であるが、時折、このＥＰＯ調合物のある成分に対するアレルギー性過敏症を示唆する皮膚発疹及び蕁麻疹が観測されており、この成分はヒト血清アルブミンである可能性が高い。
【００３１】
本発明の薬剤組成物は好ましくは等張液中において調製することができ、薬学的に許容可能であり、アレルギー性過敏症のような副作用をもたらさないことが期待される。
【００３２】
本発明の薬剤組成物は、ＥＰＯの生物学的活性にかかわりなく、更には合成または製造方法にかかわりなく、ＥＰＯアルファ、ＥＰＯベータ、ＥＰＯオメガ、及び種々のイソ型プロフィールを有する他のＥＰＯ調製物を含むあらゆる形態のＥＰＯに対して、ならびに特定のＥＰＯイソ型、ＥＰＯムテイン、ＥＰＯフラグメント、ＥＰＯダイマーなどのＥＰＯ類似体、ＮＥＳＰ（組換えヒトＥＰＯの超グリコシル化類似体）、遺伝子活性化ＥＰＯ、ペグ化ＥＰＯ、ＥＰＯとのハイブリッド分子、ＥＰＯフラグメント、ＥＰＯとの融合タンパク質（オリゴマー及びマルチマー）、及び修飾されたグリコシル化プロフィールを有するＥＰＯに対して使用することができ、上述の合成または製造方法は、これらに限定するものではないが、天然に生じたＥＰＯ及び（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのどちらから生成されたかにかかわりなく）組換えＥＰＯの単離、合成による方法、トランスジェニック法及び遺伝子活性化による方法を含むことができる。
【００３３】
本発明の薬剤組成物は、１回の用量当たり５００単位から１０００００単位まで、またはそれ以上のＥＰＯ（１ＩＵは約１０ナノグラムの組換えＥＰＯに相当する）を含んでいてよく、好適には１回の用量当たり１０００ＩＵから４００００ＩＵまでのＥＰＯを含んでいてよい。一般的に、有効量は、特にＥＰＯが皮下的に与えられる場合には、１ＩＵ／ｋｇ体重から５００ＩＵ／ｋｇ体重まで、より好適には５０ＩＵ／ｋｇ体重から３００ＩＵ／ｋｇ体重までであろうと推測される。有効量は、更に、治療される被検者の種及びサイズ、治療される個々の状態または疾患及びそれの重症度、ならびに投与経路に依存する。好適な実施態様では約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ及び約４００００ＩＵからなる群から選択される１回の用量当たりの量をもたらすべく、薬学的な量が調合される。
【００３４】
本発明の薬剤組成物はアンプル、注射器及びバイアルに充填することができる。これらは、１回の用量当たり０．２ｍｌから２０ｍｌまでの適切な範囲における容量での適用を可能にする。
【００３５】
これらの溶液に対する好適なｐＨ範囲は約６から約８までであり、約６．８から約７．５までの範囲がより好適であり、約７．０のｐＨが最も好適である。リン酸塩緩衝系、特にＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ／Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏなどのリン酸一水素ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの使用が好適である。約６から約８までの望ましいｐＨ範囲を維持するのに適した他の緩衝系は、これらに限定するものではないが、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、及び当技術分野において既知の他のあらゆる医薬適合性のｐＨ緩衝剤を含む。クエン酸塩緩衝剤は注入部位に痛みをもたらす可能性がある。従って、非経口的な適用ではリン酸塩緩衝剤の方が好適である。
【００３６】
緩衝系、特にリン酸塩緩衝剤の濃度は本調合物の望ましいｐＨに依存する。好適な濃度は１０ｍＭから５０ｍＭまで、より好適には１５ｍＭから３５ｍＭまで、最も好適には１５ｍＭから２５ｍＭまでの範囲である。ｐＨ調節剤、例えば、これらに限定するものではないが、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、クエン酸またはクエン酸ナトリウムなどが加えられてよい。
【００３７】
本発明の薬剤組成物はＥＰＯ安定剤としてＰＶＰを含む。本発明の意味において、ＰＶＰは、ポビドンまたはポリビニルピロリドンとしても知られている通常の形態のポリ［１−（２−オキソ−１−ピロリジニル）エチレン］で代表される。低分子量ＰＶＰ、特にＰＶＰ Ｋ１２からＫ１８までの使用が好適であり、ＰＶＰ Ｋ１２の使用が最も好適である。本発明の組成物におけるＰＶＰの含量はＥＰＯに対する安定化効果をもたらす量でなければならず、適切には少なくとも０．００１％（ｗ／ｖ）の量である。ＰＶＰの濃度は好適には約０．０１％から約５．０％まで、より好適には０．１％から１．０％までの範囲であり、最も好適には約０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００３８】
本発明の薬剤組成物は、本発明の調合物をヒト血液と等浸透圧に為すことができる物質を場合によって更に含む。典型的な適切な等張化剤は当技術分野において広く知られており、これらに限定するものではないが、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２などの無機塩、マンニトール、グリシン、グルコース及びソルビトールからなる群から選択される物質を含む。本発明の調合物における等張化剤としてＮａＣｌを使用することが好適である。
【００３９】
上述のように、単独の効果的な安定剤としてＰＶＰを伴う調合物が好適であるが、本発明の薬剤組成物は、望ましい場合には、前述の成分ａ．、ｂ．及び場合によってｄ．ならびにｅ．のほかに、１つより多くのタイプの安定剤を場合によって含んでよい。この付加的な安定剤は、好適には、ソルビタン誘導体／例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０などのポリソルベート、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ６８などのポロキサマーなどの界面活性剤を含む群から選択される。これらの中でもとりわけＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８が特に好適であり、適切には約１％または１％未満の濃度、より好適には０．０５％から０．２％までの濃度で使用される。
【００４０】
本発明の薬剤組成物は、１つ以上の医薬適合性の賦形剤を場合によって更に含んでよい。医薬適合性の適切な賦形剤は、マンニトール、ソルビトール、グリセロール及びポリエチレングリコールの群から選択されるポリオール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、マクロゴールエステル及びエーテル、グリコール及びグリセロールエステル、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−２−フェニルアラニン、Ｌ−トレオニンなどのアミノ酸を含む。
【００４１】
本発明の組成物はＥＰＯに関連する疾患の治療用及び／又は予防用薬剤を調製するために使用することができる。医学的な用途の例は、赤血球増殖（ＲＢＣ）の刺激が望まれる場合や、内因性ホルモン欠損が存在する場合、失血している場合、または患者が貧血の徴候を有している場合、もしくは患者が内因性ホルモンに対する骨髄の低応答性を有している場合などにおける様々な療法を含む。これらの医学的な適応は、例えば悪性疾患（即ち、あらゆるタイプの固形癌、または白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む血液性癌）の貧血、悪性疾患の化学療法／放射線療法による治療に由来する貧血、例えばリウマチ様関節炎及び肝炎などの自己免疫疾患を含む慢性疾患の貧血、ＡＩＤＳ患者、特にＡＺＴによる治療を受けているＡＩＤＳ患者における貧血、早産の貧血、（慢性）腎不全との関連性を有する貧血、サラセミアの貧血、自己免疫性溶血性貧血、無形成性貧血、及び（例えば、実質的な失血を阻止すべくヘモグロビンレベルを刺激及び増加するために行われる、または骨髄移植を受ける被験者の赤血球生成を増大させるために行われる自己輸血用の術前供血を改善するための）手術との関連性を有する貧血、疲労、疼痛、慢性心不全、律動異常または痴呆の治療、非血管及び非心臓手術における同種異系輸血の必要性を低減するための術前使用、ならびにＥＰＯに関連する他の適応症である。
【００４２】
以下の実施例により本発明を例証するが、本発明をこれらの実施例に限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
分析方法
以下の分析法を用いて本発明の薬剤組成物を分析した：免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ、及びマウスでのインビボ生物学的活性アッセイ。
【００４４】
免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ：還元剤を含まないローディング緩衝液中においてローディングサンプルを調製した。垂直式ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた：ゲルＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２％、８×８ｃｍ、厚み１．０ｍｍ、ＭＯＰＳ ＳＤＳ電気泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中における１５レーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。電気泳動は、２００Ｖの一定電圧で１時間実行した。ゲルからニトロセルロース膜へのエレクトロトランスファー後、免疫学的検出を２段階で実施した。最初のステップでは一次抗体（抗−ｈｕＥＰＯ、マウス、モノクローナル）を使用した。第二ステップでは、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された二次抗体（抗−マウスＩｇＧ、ウサギ、ポリクローナル）を用いた。ペルオキシダーゼ基質の付加は酵素反応を惹起し、青色に着色された複合体を形成する。
【００４５】
ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ：システムＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は二重抗体サンドイッチ法に基づいている。ＥＰＯに特異的なモノクローナル（マウス）抗体で予め被覆されたマイクロプレートウェルを試料または標準と共にインキュベートする。ＥＰＯはプレート上の固定化抗体に結合する。試料または標準の除去後、ウェルを西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された抗−ＥＰＯポリクローナル（ウサギ）抗体と共にインキュベートする。この二回目のインキュベーション中に、抗体−酵素接合体が上述の固定化されたＥＰＯに結合する。色原体がウェルに加えられ、酵素反応により酸化されて青色に着色した複合体を形成する。この発生した色の量は、ＥＰＯ抗体複合体に結合された接合体の量に直接的に比例し、これは、更に、試料または標準中のＥＰＯの量に直接的に比例する。
【００４６】
ＳＥＣ：ＳＥＣを用いて、２０００ＩＵ／ｍｌから１００００ＩＵ／ｍｌまでのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプル中におけるＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量を有する関連物質の割合を測定した。ヨーロッパ薬局方のプロトコルによる限界アッセイを用いた（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２００２年、第４版、エリスロポイエチン濃縮溶液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））。
【００４７】
インビボ生物学的活性：
低酸素症マウスでの生物学的活性をインビボ測定するためのＥｕｒ．Ｐｈに記載されているプロトコルを用いた。生物学的活性の推定もＥｕｒ．Ｐｈからのプロトコルの下で実施した（ヨーロッパ薬局方−１９９７年；生物学的なアッセイ及び試験の結果の統計解析；平行線モデル（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｓ；Ｔｈｅ ｐａｒａｌｌｅｌ−ｌｉｎｅ ｍｏｄｅｌ））。Ｅｕｒ．Ｐｈの要求の下では、生物学的活性の推定値はマークされた活性の８０％から１２０％までの間の範囲に入っていなければならない。本方法の目的は、注入されたＥＰＯの含量（値）（１００００ＩＵ／ｍｌ）に関して８０％から１２０％までの間の範囲に到達することであり、得られた結果は生物学的活性の推定値であって精確な値ではない。信頼限界はマークされた活性の６４％から１５６％までの間の範囲に入っていなければならない。
【００４８】
ＥＰＯの薬剤組成物の安定性を試験する条件
ＨＬ−対照標準：２℃から８℃、冷蔵庫
４０：４０℃±２℃、相対湿度７５％±５％、気候室
２５：２５℃±２℃、相対湿度６０％±５％、気候室
（実施例１）
安定性試験
調合物ＦＰ１からＦＰ８までの以下の組成物を調製した：
ＦＰ１：Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（０．０３％（重量／容量（ｗ／ｖ））、グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤２０（ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＣｌ（１００ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ２：グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、グリセロール（１．４％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（３２ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ３：グリシン（０．５％（ｗ／ｖ））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＣｌ（９０．６ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ４：ソルビトール（４．５％（ｗ／ｖ））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ５：デキストラン７０（１％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１２３ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ６：グリセロール（２％（ｗ／ｖ））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．１％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１７．１ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ７：グリセロール（２％（ｗ／ｖ））、ＰＶＰ Ｋ１２（０．５％（ｗ／ｖ））、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）
ＦＰ８：ＰＶＰ Ｋ１２（０．５％（ｗ／ｖ））、ＮａＣｌ（１２３ｍｍｏｌ／ｌ）、リン酸塩緩衝剤（２０ｍｍｏｌ／ｌ）。
【００４９】
これらの調合物におけるＥＰＯの含量は、以下で説明されているように、２０００ＩＵ／ｍｌまたは１００００ＩＵ／ｍｌに設定される。
【００５０】
それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルを４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した（４０）。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛けた；各レーンに０．４μｇがローディングされた。図１はこれらの結果を示している。
【００５１】
図１の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ４０
６：ＦＰ２ ４０
７：ＦＰ３ ４０
８：ＦＰ４ ４０
９：ＦＰ５ ４０
１０：ＦＰ６ ４０
１１：ＦＰ７ ４０
１２：ＦＰ８ ４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５２】
図２は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管した場合（ＨＬ）と４０℃（±２℃）で保管した場合（４０）における、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ４までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５３】
図２の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ＨＬ
６：ＦＰ２ ＨＬ
７：ＦＰ３ ＨＬ
８：ＦＰ４ ＨＬ
９：ＦＰ１ ４０
１０：ＦＰ２ ４０
１１：ＦＰ３ ４０
１２：ＦＰ４ ４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５４】
図３は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管した場合（ＨＬ）と４０℃（±２℃）で保管した場合（４０）における、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ５からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を決定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５５】
図３の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ５ ＨＬ
６：ＦＰ６ ＨＬ
７：ＦＰ７ ＨＬ
８：ＦＰ８ ＨＬ
９：ＦＰ５ ４０
１０：ＦＰ６ ４０
１１：ＦＰ７ ４０
１２：ＦＰ８ ４０
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５６】
図４は、１０週間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）された、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５７】
図４の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ＨＬ
６：ＦＰ２ ＨＬ
７：ＦＰ３ ＨＬ
８：ＦＰ４ ＨＬ
９：ＦＰ５ ＨＬ
１０：ＦＰ６ ＨＬ
１１：ＦＰ７ ＨＬ
１２：ＦＰ８ ＨＬ
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００５８】
図５は、１０週間２５℃（±２℃）で保管（２５）された、それぞれ１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管されたリン酸塩緩衝剤中のＥＰＯバルクをＥＰＯダイマーの含量を測定するための陽性対照（ＰＫ）として採用した。各レーンに０．４μｇがローディングされた。
【００５９】
図５の説明：
レーン：サンプル
１：空のレーン
２：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード
３：空のレーン
４：ＥＰＯ−ＢＲＰ（ヨーロッパ薬局方のＥＰＯ標準）
５：ＦＰ１ ２５
６：ＦＰ２ ２５
７：ＦＰ３ ２５
８：ＦＰ４ ２５
９：ＦＰ５ ２５
１０：ＦＰ６ ２５
１１：ＦＰ７ ２５
１２：ＦＰ８ ２５
１３：ＰＫ
１４：空のレーン
１５：予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＭＷ標準、低レンジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４μｌロード。
【００６０】
図６は、１ヶ月間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）されたＦＰ１からＦＰ８までのサンプルに対する、１ヶ月間４０℃（±２℃）で保管（４０）された、それぞれＥＰＯ １００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＥＰＯ−ＥＬＩＳＡの相対的な応答（％単位）を示している。
【００６１】
図７は、１０週間冷蔵庫内で保管（ＨＬ）されたＦＰ１からＦＰ８までのサンプルに対する、１０週間２５℃（±２℃）で保管（２５）された、それぞれＥＰＯ １００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するＦＰ１からＦＰ８までのサンプルのＥＰＯ−ＥＬＩＳＡの相対的な応答（％単位）を示している。
【００６２】
安定性試験の結果：
免疫学的検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥは、本発明の薬剤組成物（ＦＰ７及びＦＰ８）の場合、室温において、例えばＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量を有する関連物質などのＥＰＯ凝集体が生じないことを示している（図１−５）。高められた温度の場合には、凝集体が少量存在する。高められた温度（４０℃で一ヶ月間）における本発明の薬剤組成物のＥＰＯ安定性と、ポリソルベートとアミノ酸グリシンの組合せを用いた薬剤組成物ＦＰ１との比較（図１、２、３）は、ＦＰ１でＥＰＯダイマーが形成されることを示している。ＥＰＯダイマーの形成は、ＥＰＯの安定性にとって一つの決定的なファクターである。また、例えばＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量が測定される関連物質などのＥＰＯ凝集体は、適用後の望ましくない副作用及びこの薬剤組成物で治療された患者の不快感の原因となる可能性もある。更に、これらの凝集体が生体の免疫応答を引き起こし、ＥＰＯを用いる治療を中止しなければならなくなる可能性もある。
【００６３】
効果的な安定剤としてＰＶＰのみを含む本発明の薬剤組成物（ＦＰ８）は、別な具合に調製された薬剤組成物（ＦＰ１−ＦＰ７）との高められた温度（４０℃、１ヶ月間；図６）での比較において、ＦＰ８のバイアルへのＥＰＯの吸着が、他の調合物と比較したときに、それ以下または同等であることを示す。室温の場合には、これらの吸着は同様であり、またはもっと良好である（図７）。バイアルへの吸着の増加はＥＰＯの安定性を低減させ、全体的な生物学的活性が低下することとなる。
【００６４】
先行技術において説明されている調合物では、ＥＰＯの安定剤としてアミノ酸が使用されてきた。しかし、アミノ酸は必ずしもＥＰＯに安定化効果をもたらさない。図６及び７において、グリシンを含む薬剤組成物ＦＰ２及びＦＰ３の高められた温度（４０℃で１ヶ月間）における安定性は、グリシンを含んでいない薬剤組成物ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６及びＦＰ８の安定性よりも低く、グリシンを含むＦＰ１よりも低いことが分かる。種々の安定剤の正しい組合せを用いれば高いＥＰＯ安定性を得ることができるが、これらの適切な組成は予測することができない。本発明の薬剤組成物の場合には、驚くべきことに、ＰＶＰがＥＰＯを安定化させることが判明した。
【００６５】
ＳＥＣにより測定されたＥＰＯダイマー及びもっと高い分子量を有する関連物質の割合を、これらのサンプルの希釈された溶液と（２％の濃度において）比較した。これらの限界アッセイの結果が以下の表１に提示されている：
【００６６】
【表１】
【００６７】
インビボ生物学的活性を、２５℃で１０週間保管された、または４ヶ月間冷蔵庫内で保管された、１００００ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ含量を有するサンプルＦ８で測定した。
【００６８】
得られた結果が以下の表２に提示されている：
【００６９】
【表２】
【００７０】
これらの結果は、生物学的活性の推定値が要求された範囲内にあり、Ｅｕｒ．Ｐｈの要件を満たしていることを示す。信頼限界も要求された範囲内にある。
【００７１】
（実施例２及び３）
ＥＰＯの薬剤組成物の組成
本発明の実施例２及び３（において提示されている薬剤組成物）の組成が、それぞれ表３及び４に示されている。
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
物質の品質：
ＥＰＯ：ヨーロッパ薬局方による要求通りの品質（Ｐｈ Ｅｕｒ．品質）、ポビドン Ｋ１２（ポリ［１−（２−オキソ−１−ピロリジニル）エチレン］、ポリビドンまたはポリビニルピロリドン、ＰＶＰ）Ｐｈ Ｅｕｒ品質、米国薬局方にも対応する（ＵＳＰ品質）、ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入、
ＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ＮａＯＨ、注射用水：Ｐｈ．Ｅｕｒ．品質。
【００７５】
ＥＰＯを含む薬剤組成物の調製
ＰＶＰ Ｋ１２を含むプラシーボ溶液の調製：緩衝剤（Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ）、ＮａＣｌ及び安定剤ＰＶＰ Ｋ１２を、磁気攪拌機で混合することにより、室温で注射用水に溶解した。この後、１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．０−７．１に調節した。透明で無色な溶液が得られた。
【００７６】
ＥＰＯ溶液の調製：ＥＰＯ溶液の計算された容量（計算は、ＥＰＯ活性に関して行われた）を上述のプラシーボ溶液に加えた。このステップの直前に、同じ容量のプラシーボ溶液を採取した。磁気攪拌機を低回転数で用いることにより、この溶液を攪拌した。透明で無色の溶液が得られた。
【００７７】
この後、両濃度でＥＰＯを含む薬剤組成物の溶液を、細孔径が０．２μｍのＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜を用いる膜濾過により、無菌的（クラス１００の清浄化レベル）に無菌濾過した。０．８ｍｌの濾液を、洗浄及び滅菌された２ｍｌ用バイアル（無色の管状ガラス製加水分解タイプＩからのバイアル）に充填した後、ブロムブチルゴムでできた弾性栓で蓋をし、アルミニウム製キャップで密封した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した後のＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図２】４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した場合との比較における、冷蔵庫内で１ヶ月間保管したときのＥＰＯを含む対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図３】４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管した場合との比較における、冷蔵庫内で１ヶ月間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図４】冷蔵庫内で１０週間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図５】２５℃（±２℃）で１０週間保管したときのＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図６】冷蔵庫内で１ヶ月間保管したとき（ＨＬ）の個々のサンプルに対する、４０℃（±２℃）で１ヶ月間保管したとき（４０）の本発明及び対照標準サンプルの相対的応答ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ（％単位）を示している。
【図７】冷蔵庫内で１０週間保管したとき（ＨＬ）の個々のサンプルに対する、２５℃（±２℃）で１０週間保管したとき（２５）のＥＰＯを含む本発明及び対照標準サンプルの相対的応答ＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ（％単位）を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．治療的に有効量のＥＰＯ
ｂ．医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び
ｃ．ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
を含む、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）の安定な薬剤組成物。
【請求項２】
ヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｄ．等張化剤及び／又は
ｅ．１つ以上の医薬適合性の賦形剤
を場合によって更に含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
当該組成物が水性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ＥＰＯの薬学的量が、１回の用量当たり約５００ＩＵ ＥＰＯから約１０００００ＩＵ ＥＰＯまでの範囲の量を与えるよう調合された、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
上記薬学的量が、１回の用量当たり約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ及び約４００００ＩＵからなる群から選択される量を与えるよう調合された、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上記ｐＨ緩衝系が約６から約８までのｐＨ範囲を与える、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
上記ｐＨ緩衝系が約６．８から約７．５までのｐＨ範囲を与える、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
上記ｐＨ緩衝系が約７．０のｐＨを与える、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
上記ｐＨ緩衝系がリン酸塩緩衝剤である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＶＰが約０．０１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＰＶＰが約０．１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＰＶＰの濃度が約０．５％である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
上記ＰＶＰがＫ１２からＫ１８までの範囲のＫ値を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
上記等張化剤が無機塩からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
上記等張化剤がＮａＣｌである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
水溶液中においてエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を安定化させるためのＰＶＰの使用。
【請求項１８】
ＥＰＯをＰＶＰと混合するステップを含む、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含有する組成物の調製方法。
【請求項１９】
請求項１から１６までのいずれかの組成物が調製される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）に関連する疾患の治療用及び／又は予防用薬剤を調製するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．治療的に有効量のＥＰＯ
ｂ．医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び
ｃ．ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
ならびに、場合によって
・付加的な安定剤としてのポロキサマー
ｄ．等張化剤及び／又は
ｅ．ポリオール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、マクロゴールエステル及びエーテル、グリコール及びグリセロールエステル、ならびにアミノ酸からなる群から選択される１つ以上の医薬適合性の賦形剤
からなる、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）の安定な薬剤組成物。
【請求項２】
ヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該組成物が水性である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＥＰＯの薬学的量が、１回の用量当たり約５００ＩＵ ＥＰＯから約１０００００ＩＵ ＥＰＯまでの範囲の量を与えるよう調合された、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
上記薬学的量が、１回の用量当たり約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ及び約４００００ＩＵからなる群から選択される量を与えるよう調合された、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
上記ｐＨ緩衝系が約６から約８までのｐＨ範囲を与える、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
上記ｐＨ緩衝系が約６．８から約７．５までのｐＨ範囲を与える、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記ｐＨ緩衝系が約７．０のｐＨを与える、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
上記ｐＨ緩衝系がリン酸塩緩衝剤である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＰＶＰが約０．０１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＶＰが約０．１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＰＶＰの濃度が約０．５％である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ＰＶＰがＫ１２からＫ１８までの範囲のＫ値を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
上記等張化剤が無機塩からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
上記等張化剤がＮａＣｌである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
水溶液中においてエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を安定化させるための唯一の安定剤としてのＰＶＰの使用。
【請求項１７】
ＥＰＯをＰＶＰと混合するステップを含み、請求項１から１６までのいずれかに記載の組成物が調製される、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含有する組成物の調製方法。
【請求項１８】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）に関連する疾患の治療用及び／又は予防用薬剤を調製するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１】
ａ．治療的に有効量のＥＰＯ
ｂ．医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び
ｃ．ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
を含む、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）の安定な薬剤組成物。
【請求項２】
ヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｄ．等張化剤及び／又は
ｅ．１つ以上の医薬適合性の賦形剤
を場合によって更に含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
当該組成物が水性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ＥＰＯの薬学的量が、１回の用量当たり約５００ＩＵ ＥＰＯから約１０００００ＩＵ ＥＰＯまでの範囲の量を与えるよう調合された、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
上記薬学的量が、１回の用量当たり約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ及び約４００００ＩＵからなる群から選択される量を与えるよう調合された、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上記ｐＨ緩衝系が約６から約８までのｐＨ範囲を与える、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
上記ｐＨ緩衝系が約６．８から約７．５までのｐＨ範囲を与える、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
上記ｐＨ緩衝系が約７．０のｐＨを与える、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
上記ｐＨ緩衝系がリン酸塩緩衝剤である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＶＰが約０．０１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＰＶＰが約０．１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＰＶＰの濃度が約０．５％である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
上記ＰＶＰがＫ１２からＫ１８までの範囲のＫ値を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
上記等張化剤が無機塩からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
上記等張化剤がＮａＣｌである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
水溶液中においてエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を安定化させるためのＰＶＰの使用。
【請求項１８】
ＥＰＯをＰＶＰと混合するステップを含む、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含有する組成物の調製方法。
【請求項１９】
請求項１から１６までのいずれかの組成物が調製される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）に関連する疾患の治療用及び／又は予防用薬剤を調製するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．治療的に有効量のＥＰＯ
ｂ．医薬適合性のｐＨ緩衝系、及び
ｃ．ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
ならびに、場合によって
・付加的な安定剤としてのポロキサマー
ｄ．等張化剤及び／又は
ｅ．ポリオール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、マクロゴールエステル及びエーテル、グリコール及びグリセロールエステル、ならびにアミノ酸からなる群から選択される１つ以上の医薬適合性の賦形剤
からなる、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）の安定な薬剤組成物。
【請求項２】
ヒト及び／又は動物起源に由来する添加剤を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該組成物が水性である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＥＰＯの薬学的量が、１回の用量当たり約５００ＩＵ ＥＰＯから約１０００００ＩＵ ＥＰＯまでの範囲の量を与えるよう調合された、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
上記薬学的量が、１回の用量当たり約１０００ＩＵ、約２０００ＩＵ、約３０００ＩＵ、約４０００ＩＵ、約１００００ＩＵ、約２００００ＩＵ、約２５０００ＩＵ及び約４００００ＩＵからなる群から選択される量を与えるよう調合された、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
上記ｐＨ緩衝系が約６から約８までのｐＨ範囲を与える、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
上記ｐＨ緩衝系が約６．８から約７．５までのｐＨ範囲を与える、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記ｐＨ緩衝系が約７．０のｐＨを与える、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
上記ｐＨ緩衝系がリン酸塩緩衝剤である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＰＶＰが約０．０１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＶＰが約０．１％から約１％までの範囲で含まれる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＰＶＰの濃度が約０．５％である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ＰＶＰがＫ１２からＫ１８までの範囲のＫ値を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
上記等張化剤が無機塩からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
上記等張化剤がＮａＣｌである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
水溶液中においてエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を安定化させるための唯一の安定剤としてのＰＶＰの使用。
【請求項１７】
ＥＰＯをＰＶＰと混合するステップを含み、請求項１から１６までのいずれかに記載の組成物が調製される、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含有する組成物の調製方法。
【請求項１８】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）に関連する疾患の治療用及び／又は予防用薬剤を調製するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５０１１９３（Ｐ２００６−５０１１９３Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２０９３０（Ｐ２００４−５２０９３０）
【出願日】平成１４年１１月８日（２００２．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００２／００４６９０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００６９４８
【国際公開日】平成１６年１月２２日（２００４．１．２２）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年１１月８日（２００２．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００２／００４６９０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００６９４８
【国際公開日】平成１６年１月２２日（２００４．１．２２）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
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