エリスロポエチンの多糖誘導体
【課題】ＥＰＯ（エリスロポエチン）の安定性、薬物動態、及び薬力学の改善に有用である、新規なＥＰＯの多糖誘導体を提供する。
【解決手段】ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の多糖誘導体である化合物であって、多糖がアニオン性であり、且つ２個〜２００個の糖ユニットを含む、化合物。新規化合物を含む医薬組成物、及び新規化合物の製造方法。
【解決手段】ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の多糖誘導体である化合物であって、多糖がアニオン性であり、且つ２個〜２００個の糖ユニットを含む、化合物。新規化合物を含む医薬組成物、及び新規化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＥＰＯの多糖誘導体及びかかる誘導体の製造方法に関する。誘導体は、ＥＰＯの安定性、薬物動態（pharmacokinetics）及び薬力学（pharmacodynamics）の改善に有用である。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチンは糖タンパク質ホルモンであると共に、骨髄の赤血球（erythrocyte
（red blood cell））前駆細胞に対するサイトカインである。ヘマトポエチン又はヘモポエチンとも呼ばれ、腎臓によって産生され、赤血球産生を調節する。
【０００３】
エリスロポエチンは、身体における赤血球造血（erythropoiesis：赤血球形成）の主要な調節因子である（Martindale、1996）。組換えヒトエリスロポエチンは、エポエチンα及びエポエチンβとして知られる形態で市販されている。これらは、慢性腎不全患者における貧血の管理で使用される。エポエチンγも利用可能である。全て、同一の１６５アミノ酸配列を有するが、そのグリコシル化パターンが異なる。
【０００４】
組換えヒトエリスロポエチンは、高血圧患者、発作歴のある患者、血小板増加症患者、慢性肝不全患者、虚血性血管疾患患者又は悪性腫瘍患者においては、慎重に使用するべきである。エポエチンα及びエポエチンβは、場合によってはグリコシル化及び市販製剤の配合の違いに起因して、その薬物動態が幾分異なる。エポエチンαは、皮下注射後の吸収が緩徐且つ不完全であり、静脈内投与に対する相対的バイオアベイラビリティは約１０％〜５０％と報告されている。エポエチンβも吸収が緩徐且つ不完全であり、その絶対的バイオアベイラビリティはおよそ４０％と報告されている。
【０００５】
ＥＰＯを誘導体化してその薬物動態特性を改善させる試みが為されている。ＥＰＯのポリエチレングリコール誘導体である、ＣＥＲＡ（持続性エリスロポエチン受容体活性化剤（Constant Erythropoiesis Receptor Activator））として知られる、Rocheにより開発
中の製品がある。これは、ＥＰＯよりも長い半減期を有することが示されており、頻繁な注射の必要性を低減させる。さらなる新規赤血球造血刺激剤は、慢性腎疾患及び癌に随伴する貧血を治療するための新規ＰＥＧ化合成ペプチド、Ｈｅｍａｔｉｄｅである。これはFan他（2006）によってさらに記載されている。
【０００６】
静脈内投与後の最終相半減期が組換えヒトＥＰＯ及び天然ホルモンよりもおよそ３倍長い、組換えヒトエリスロポエチンの高度にグリコシル化されたアナログである、Ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎ等、ＥＰＯの他の形態も開発されている。
【０００７】
特許文献１には、循環における血漿中半減期が長期化した、微生物から製造されたＥＰＯの修飾変異タンパク質が記載されている。無細胞タンパク質合成技法を使用することにより、ＰＥＧ又は多糖等の修飾因子と反応し得る非天然アミノ酸を有する、ＥＰＯの変異タンパク質が製造される。概して、ＰＥＧは、ＥＰＯの変異タンパク質中の遊離のスルフヒドリル基と結合する。
【０００８】
特許文献２は、ＥＰＯとＰＥＧとのＮ末端複合体を対象とする。複合体は、長い循環半減期及び血漿中滞留時間を有する。
【０００９】
特許文献３には、ＰＥＧと複合体を形成したＥＰＯの製造方法の改善が記載されている。本発明者らは、ｒｈＥＰＯ１分子当たり１個〜３個の直鎖ＰＥＧ分子を有する複合体の
組成物が最も持続的な効力を示すことを見出した。
【００１０】
特許文献４も、生物学的に活性なＥＰＯ複合体組成物を提供するという課題に取り組んでいる。ＥＰＯは、組成物の循環血清中半減期を増大させる有機分子と共有結合した非抗原性の親水性ポリマーと共有結合で複合体を形成する。水溶性ポリマーは、とりわけ、ポリアルキレンオキシド、ポリアミド又は糖質であり得る。
【００１１】
しかしながら、ポリシアル酸（ＰＳＡ）等のアニオン性多糖を用いたＥＰＯの誘導体化について記載する公表された著作は今日まで全く存在しない。
【００１２】
ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、或る特定の菌株により、また哺乳類の或る特定の細胞で産生されるシアル酸の天然非分岐ポリマーである。ポリシアル酸は、天然の細菌由来型ポリマーの、限定（limited）酸加水分解若しくはノイラミニダーゼによる消化、又は分画に
よって、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基から、最小でｎ＝２のシアル酸残基までの各種重合度で製造することができる。
【００１３】
近年、ポリシアル酸の生物学的特性、特にα−２，８結合ポリシアル酸ホモポリマーの生物学的特性が、タンパク質及び低分子量薬物分子の薬物動態特性を修飾するために活用されている。ポリシアル酸誘導体化により、多数の治療用タンパク質、例えば、カタラーゼ及びアスパラギナーゼの循環半減期が劇的に改善し、治療用タンパク質に対する先の曝露の望ましくない（且つ時には不可避の）結果として、既存抗体が増加するにもかかわらず、かかるタンパク質を使用することが可能である。α−２，８結合ポリシアル酸はＰＥＧの魅力的な代替物であり、元々人体の一部であり、且つ組織ノイラミニダーゼにより、無毒性の糖であるシアル酸に分解する、免疫学的には不可視の生分解性ポリマーである。
【００１４】
本発明者らは以前に、多糖（特にＰＳＡ）をタンパク質等の治療薬に結合させる方法を記載している［特許文献５、特許文献６］。これらの方法のうちの幾つかは、ポリマーの「非還元」末端を化学的に誘導体化して、第１級アミン基で反応するタンパク質反応性のアルデヒド部分を作り出すことに基づいている。非還元シアル酸末端ユニットは、隣接ジオールを含有するため、過ヨウ素酸塩を用いて容易に（且つ選択的に）酸化することにより、タンパク質に対する反応性が遥かに高く、且つ還元的アミノ化及び他の化学反応（chemistries：ケミストリー）によるタンパク質の結合に好適な反応要素を含む、モノアル
デヒド体を得ることができる。この反応を図１及び図２に示す。ここで、
図１は、過ヨウ素酸ナトリウムを用いたコロミン酸（大腸菌由来のα−２，８結合ポリシアル酸）の酸化により、非還元末端でタンパク質反応性アルデヒドが形成されることを示し、
図２は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いたシッフ塩基の選択的還元により、タンパク質のアミノ基との安定で不可逆的な共有結合が形成されることを示す。
【００１５】
上記従来の複合体形成反応中に、例えば、コロミン酸がアミノ酸の側鎖と反応することによって、意図しない副生成物が生成する可能性がある。これは、ヒト及び動物の治療用途で監督機関によって要求される既知組成の複合体の製造において十分に厄介なものとなる可能性がある。
【００１６】
反応生成物の殆どの物理化学的特性が類似しているため、意図する反応生成物（例えば、モノポリシアル化体）を各種の意図しない生成物と切り離して精製することは容易ではない。このことは、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル浸透クロマトグラフィ（それぞれ電荷及びサイズに基づいて分離する）等の技法によっては、好ましい精製プロファイルが得られないことを意味する。この問題は、複合体形成反応における生成物の複雑度を低減させることによって克服することができる。本発明者らは、多糖とタンパク質との複合
体を形成する新規な方法であって、それによりタンパク質のＮ末端の高い反応性を利用することができ、且つタンパク質と過ヨウ素酸塩酸化した天然のコロミン酸との還元的アミノ化に関する確立された方法（図１及び図２）を使用して得られる生成物の複雑度を回避する、新規な方法を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第１２１９６３６号
【特許文献２】米国特許第７，１２８，９１３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００８２７６５号
【特許文献４】米国特許第７，０７４，７５５号
【特許文献５】米国特許第５，８４６，９５１号
【特許文献６】国際公開第ＷＯ−Ａ−０１８７９２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従来技術を鑑みて、ヒト及び動物の治療で使用することができ、且つ安定性、半減期が最適化され、毒性の低い、改善されたＥＰＯ誘導体の提供が必要とされている。本発明者らは、ＰＳＡ等の多糖をＥＰＯと結合させることで、かかる性質が付与されることを見出し、それにより本発明に到達した。アニオン性多糖と結合したＥＰＯを記載したのはこれが初めてである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の第１の態様により、本発明者らは、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の多糖誘導体である化合物であって、多糖がアニオン性であり、且つ２個〜２００個の糖ユニットを含む、化合物を提供する。
【００２０】
以下、「ＥＰＯ」という用語を使用する場合、本発明者らは、ＥＰＯ様タンパク質を包含することも意図している。ＥＰＯ様タンパク質とは、ＥＰＯの活性と同等の活性を有するタンパク質を意味する。ＥＰＯは、上記で詳述したように赤血球産生を調節する。ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の活性は、Krystal（1983）に記載の標準的なアッセイを使用
して測定することができる。マウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を誘導する際のＥＰＯ試料の活性を測定する。マウスは、事前にフェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしている。アッセイにおいて、ＥＰＯを赤血球前駆細胞に加え、ＤＮＡ複製速度を、３Ｈ−チミジン取り込み速度を求めることによって測定する。タンパク質は、ＮＩＢＳＣ由来の標準ＥＰＯと比較して、１０％〜２００％の複製速度を誘導する場合、「ＥＰＯ様」として分類される。典型的には、ＥＰＯ様タンパク質は、標準ＥＰＯの活性の少なくとも３５％、好ましくは、標準ＥＰＯの活性の少なくとも５０％を有する。
【００２１】
上記で詳述した、必要な活性を有するＥＰＯの変異体も使用し得る。「ＥＰＯ様」タンパク質は、「ＥＰＯホモログ（homologue）」とも称され得る。２個の配列が相同である
かどうかは、当該技術分野において既知の用語である、％類似性又は％同一性を使用してルーチン的に計算される。配列は、スイスプロット（swissprot）アクセッション番号Ｐ
Ｏ１５８８のヒトＥＰＯ前駆体である、配列番号１と比較するものとする。活性ＥＰＯは、この配列の２８残基〜１９３残基である。ＥＰＯホモログ配列は、配列番号１の全体と比較してもよく、又はその２８残基〜１９３残基と比較してもよい。好ましくは、ＥＰＯホモログ配列は、活性ＥＰＯ、すなわち、２８残基〜１９３残基と比較される。
【００２２】
本発明において、ホモログは、５０％以上の類似性又は同一性（核酸レベル又はアミノ
酸レベル）、好ましくは６０％、７０％、８０％以上、より好ましくは９０％以上、例えば、９５％又は９９％の同一性又は類似性（アミノ酸レベル）を有する。類似性又は同一性の計算には多数のプログラムが利用可能であるが、好ましいプログラムは、ＢＬＡＳＴｎプログラム、ＢＬＡＳＴｐプログラム及びＢＬＡＳＴｘプログラムであり、初期設定パラメータで実行され、www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能である。例えば、２個のアミノ酸配列は、初期設定パラメータ（スコア＝１００、ワード長＝１１、期待値＝１１、低複雑度フィルタリング＝オン）でＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して比較し得る。上記の相同性のレベルは、これらの初期設定パラメータを使用して計算し得る。
【００２３】
ＥＰＯは、グリコシル化されてもよく、又はグリコシル化されなくてもよい。ＥＰＯがグリコシル化される場合、化合物は、典型的には２個〜１００個の糖ユニットを含む。より典型的には、化合物は、１０個〜８０個の糖ユニット、好ましくは２０個〜６０個の糖ユニット、最も好ましくは４０個〜５０個の糖ユニットを含む。
【００２４】
ＥＰＯがグリコシル化されない場合、化合物は、典型的には８０個〜１８０個の糖ユニット、好ましくは１００個〜１５０個の糖ユニット、より好ましくは１２０個〜１４５個の糖ユニット、最も好ましくは１３０個〜１４０個の糖ユニットを含む。
【００２５】
好ましくは、アニオン性多糖は、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは少なくとも１０個、例えば少なくとも５０個の糖ユニットを有する。
【００２６】
アニオン性多糖は、好ましくは、ポリシアル酸、ヘパリン、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸から選択される。好ましくは、多糖はポリシアル酸であり、実質的にシアル酸ユニットのみから成る。しかしながら、多糖は、分子中にシアル酸以外のユニットを有し得る。例えば、シアル酸ユニットを他の糖ユニットと交互にしてもよい。しかしながら、好ましくは、多糖は、実質的にシアル酸のユニットから成る。
【００２７】
好ましくは、化合物は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質のＮ末端誘導体である。すなわち、多糖は、そのＮ末端でＥＰＯと結合する。本明細書中において、Ｎ末端での誘導体化とは、ＥＰＯのＮ末端アミン基での誘導体化を意味する。しかしながら、代替的には、多糖は、中間鎖（mid-chain）アミノ酸、例えば、リジン、システイン、アスパラギン酸、
アルギニン、グルタミン、チロシン、グルタミン酸又はヒスチジンの側鎖で、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質と結合し得る。典型的には、側鎖は、リジンアミノ酸又はシステインアミノ酸の側鎖である。
【００２８】
好ましくは、多糖は末端シアル酸基を有し、上記で詳述したように、より好ましくは、α−２，８結合又はα−２，９結合を通じて相互に結合した少なくとも２個のシアル酸ユニットを含む多糖である、ポリシアル酸である。好適なポリシアル酸の重量平均分子量は２ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲、好ましくは５ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲である。最も好ましくは、ポリシアル酸は、細菌源、例えば、大腸菌ＫＩ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍａｒａｘｅｌｌａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ若しくはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの多糖Ｂ、又は大腸菌Ｋ９２株由来のＫ９２多糖に由来する。最も好ましくは、大腸菌Ｋ１に由来のコロミン酸である。
【００２９】
ポリシアル酸は、塩又は遊離酸の形態であり得る。細菌源からの回収後に分子量が低下した、加水分解形態であってもよい。
【００３０】
好ましくは、ポリシアル酸である多糖は、分子量が広範な（例えば多分散度が１．３超、例えば２以上にもなる）物質であり得る。好ましくは分子量の多分散度は１．３未満、より好ましくは１．２未満、例えば１．１未満である。多分散度は低いと１．０１にもな
り得る。
【００３１】
ＥＰＯは、２個以上のアニオン性多糖を用いて誘導体化され得る。例えば、ＥＰＯは、そのＮ末端及び内部のアミノ酸側鎖の両方で誘導体化され得る。例えば、リジン、システイン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン、チロシン、グルタミン酸、セリン及びヒスチジンの側鎖が、アニオン性多糖によって誘導体化され得る。ＥＰＯはグリコン（glycon）ユニットでも誘導体化され得る。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、ＥＰＯはそのＮ末端のみで誘導体化される。
【００３２】
本明細書中において、Ｎ末端での誘導体化とは、ＥＰＯのＮ末端アミン基での誘導体化を意味する。
【００３３】
本発明の第１の態様による化合物は、ＥＰＯとアニオン性多糖とが共有結合した複合体であり得る。多糖とＥＰＯとの間を結び付ける他の手段としては静電引力が挙げられる。しかしながら、共有結合が好ましい。ＥＰＯは、そのＮ末端アミノ酸で多糖と共有結合し得る。共有結合は、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合であり得る。ＥＰＯが多糖と共有結合することができる別の結合は、シッフ塩基を介する。アミンとの複合体形成に好適な基は、国際公開第ＷＯ２００６／０１６１６８号にさらに記載されている。
【００３４】
本発明において、多糖は、天然多糖又は天然多糖の誘導体、例えば、糖残基上での１個又は複数の活性基の反応によって誘導体化されているか、又は多糖鎖の末端で誘導体化基と共有結合している多糖であり得る。
【００３５】
多糖は、その還元末端ユニット又は非還元末端ユニットのいずれかを介してＥＰＯと結合し得る。このことは、１個の多糖鎖が、２個のＥＰＯタンパク質と結合し得る、すなわち、その還元末端及び非還元末端の両方で誘導体化され得ることを意味する。
【００３６】
多糖をタンパク質と結合させる方法は、当該技術分野において既知であり、国際公開第ＷＯ９２／２２３３１号及び特許文献６において、より詳細に記載されている。本発明における好ましい方法を以下でより詳細に説明する。方法は、本出願の図１及び図２にも記載されている。
【００３７】
多糖は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質と直接、すなわち、図１及び図２に示すように、又はリンカーを介して結合し得る。好適なリンカーは、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを含有する試薬に由来する。リンカーはまた、生物学的に安定である（biostable）か、又は生
分解性であり、例えば、ポリペプチド又は合成オリゴマーを含み得る。リンカーは、国際公開第ＷＯ２００５／０１６９７３号でさらに記載されるように、二官能性部分に由来し得る。好適な二官能性試薬は、例えば、Ｂｉｓ−ＮＨＳである。試薬は、一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚ（式中、各Ｚは官能基であり、同一であってもよく、又は異なっていてもよく、且つＲ１は二官能性有機基である）を有し得る。好ましくは、Ｒ１は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレン（これらは任意でカルボニル結合、エステル結合、スルフィド結合、エーテル結合、アミド結合及び／又はアミン結合によって置換及び／又は介在され得る）から成る群より選択される。特に好ましくは、Ｃ３〜Ｃ６アルカンジイルである。最も好ましくは、Ｒ１は、好適な二官能性試薬の適切な部分に相当する。
【００３８】
本発明の好ましい化合物は、一般式（Ｉ）：
【００３９】
【化１】
【００４０】
（式中、ｍは、少なくとも１であり、
ＸＢは、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質であるＢ−ＸＨに由来し（ここで、ＸＨは、ＮＨ２又はＳＨである）、
Ｌは、結合、連結基であるか、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
ＧｌｙＯは、アニオン性糖ユニットであり、
結合基は、存在すれば、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｙは、ＮＲ２又はＮＲ２−ＮＲ２であり、且つＲ１は、上記で規定した二官能性有機基であり、且つＲ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキルである）
のものである。
【００４１】
本発明の本態様において、ＥＰＯは、多糖の非還元末端と結合する。末端多糖ユニットはシアル酸ユニットである。多糖中の他の糖ユニットは、ＧｌｙＯで表され、同一であってもよく、又は異なっていてもよい。好適な糖ユニットとしては、ヘパリン、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸が挙げられる。
【００４２】
ＥＰＯが多糖と直接結合する場合、Ｌ基は結合である。しかしながら、Ｌ基は代替的には、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを含有する試薬に由来し得る。試薬は、上記で規定したように、一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚを有し得る。本実施形態において、Ｌは典型的には、基
【００４３】
【化２】
【００４４】
である。
【００４５】
好ましくは、ＸＨはＮＨ２であり、且つＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質のＮ末端である。代替的には、ＮＨ２はリジンアミノ酸側鎖の第１級アミンである。異なる実施形態において、ＸＨはシステインアミノ酸の側鎖のチオール基、ＳＨである。
【００４６】
本発明の別の態様は、上記で規定したような新規化合物及び１個又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００４７】
医薬組成物は、水性懸濁液の形態であってもよい。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合した新規化合物を含有する。医薬組成物は、無菌の注射可能な水性懸濁液又は均質懸濁液の形態であってもよい。懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用する既知の技術に従って製剤化され得る。
【００４８】
医薬組成物は、ヒト用途又は家畜（veterinary）用途で、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻腔内投与、皮内投与、局所投与又は気管内投与され得る。
【００４９】
組成物は製剤添加物をさらに含み得る。製剤添加物とは、Wang他（1999）に記載されている、内的に又は外的にＥＰＯを安定化させることが可能な賦形剤を意味する。賦形剤は、安定化剤、可溶化剤又は金属イオンであり得る。製剤添加物の好適例としては、１個又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、又は組み合わせて使用してもよい。
【００５０】
安定化剤は、典型的には、タンパク質のアンフォールディングに対するギブス自由エネルギー変化の増大を引き起こすタンパク質の変性状態の不安定化により作用する。安定化剤は、好ましくは糖又はポリオール、例えばスクロース、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、マンニトール、ラクトース及びエチレングリコールである。安定化バッファーはリン酸ナトリウムである。
【００５１】
可溶化剤は、好ましくは界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤である。好適例としては、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ Ｆ６８、Ｂｒｉｊ ３５及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００が挙げられる。
【００５２】
金属イオンは、好ましくは二価である。好適な金属イオンとしては、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋が挙げられる。
【００５３】
製剤添加物はまた、ヒト血清アルブミン、ＰＳＡ、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーであり得る。
【００５４】
製剤添加物としての使用に好適なアミノ酸及びアミノ酸誘導体としては、ヒスチジン、グリシン、他の類似のアミノ酸及びアスパラギン酸ナトリウムが挙げられる。
【００５５】
本発明の別の態様は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質のアニオン性多糖誘導体の集団を含む、組成物であって、誘導体が２個〜１２５個の糖ユニットを含み、且つ集団が実質的にタンパク質のＮ末端誘導体のみから成る、組成物である。「集団」とは、組成物中に２個以上の多糖誘導体が存在することを意味する。誘導体は、同一であるか又は異なる数の糖ユニットを含み得る。好ましくは、組成物中の多糖の多分散度は、１．３未満、より好ましくは１．１未満である。好ましい多糖は、上記本発明の他の態様に関して詳述した通りである。
【００５６】
集団において、ＥＰＯの実質的に全てがＮ末端のみで誘導体化される。このことは、集団内のタンパク質の８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％がＰＳＡによりＮ末端のみで誘導体化されることを意味する。
【００５７】
Ｎ末端での誘導体化の程度は、当該技術分野において既知の技法、例えばペプチドマッピング又はエドマン分解によって求められ得る。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、治療で使用するための上記化合物である。
【００５９】
本発明の最後の態様により、本発明者らは、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の多糖誘導体の製造方法であって、２個〜２００個の糖ユニットを含むアニオン性多糖が、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質と化学的に反応する、製造方法を提供する。
【００６０】
なお、本発明の本態様において、多糖は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質上の任意の基で反応し得る。例えば、多糖は、アミン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基又はスルフ
ヒドリル基と反応し得る。好ましくは、基は、アミン基、より好ましくは末端アミン基である。アミンは、代替的には、アミノ酸、例えばリジンアミノ酸のアミン側鎖であり得る。多糖はまた、ＥＰＯ上の任意の糖質残基、例えばペンダントグリコン基で反応し得る。
【００６１】
多糖は、当該技術分野で既知の方法によってアミノ酸側鎖と結合し得る。例えば、多糖は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングによってＡｓｐ又はＧｌｕのＣ末端、−ＣＯＯＨ又はカルボキシル側鎖とカップリングし得る。システインアミノ酸のチオール基もｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングによって多糖と結合し得る。これらの方法は、国際公開第ＷＯ０３／０５５５２６号、特に第６頁及び第７頁の表にさらに記載されている。この参考文献において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングは、オリゴ糖部分とＧｌｎの側鎖上のアミド基との結合にも使用されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｒｇ残基及びＨｉｓ残基のイミダゾール基もそれぞれ記載されている。これらの方法をそれぞれ使用して、本発明のＥＰＯを誘導体化し得る。
【００６２】
多糖はＥＰＯの修飾形態とも反応し得る。例えば、ＥＰＯ上の１個又は複数の基は、例えば、還元又は酸化による化学変換を受けた可能性がある。例えば酸化条件を使用して、ＥＰＯの末端アミノ基の代わりに反応性カルボニルを生成することができる。
【００６３】
本発明の方法での使用に好適な多糖は、新規化合物について先に記載した通りである。
【００６４】
本発明の化合物は、従来技術で記載した好適な方法のいずれかによって製造し得る。例えば、典型的な方法は、本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ９２／２２３３１号に記載されている。
【００６５】
典型的には、アニオン性多糖は、ＥＰＯに対する誘導体化の前に活性化されている。例えば、反応性アルデヒド基を有する可能性があり、誘導体化反応が還元条件下で実行され得る。反応性アルデヒド基は、多糖のヒドロキシル基の制御酸化によって生成し得る。最も好ましくは、この反応性アルデヒドは予備段階（ここで多糖を、例えば、水溶液中で過ヨウ素酸ナトリウムを使用する制御酸化条件下で反応させる）で生じる。好ましくは、酸化は化学酸化であるが、この段階を実行することが可能な酵素も使用され得る。反応性アルデヒド基は、多糖の非還元末端又は還元末端に存在し得る。その後、ＥＰＯ、典型的にはＮ末端が反応性アルデヒド基と反応することにより、還元時にＥＰＯのＮ末端誘導体を生成する付加体を得ることができる。
【００６６】
多糖の活性化は、好ましくは多糖の中間鎖切断が実質的に無い、すなわち、実質的に分子量が低減しない条件下で実行されるべきである。酸化剤は、好適には過ルテニウム酸塩、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。酸化は、１ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度の過ヨウ素酸塩を用い、３〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度で、１分〜４８時間の範囲の時間、実行され得る。
【００６７】
誘導体化反応に好適な還元条件は、水素と触媒、又は好ましくはホウ水素化物(borohydride)等の水素化物を利用し得る。これらは固定化してもよい（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉ
ｔｅ（商標）−担持型ホウ水素化物）。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物が、１μＭ〜０．１Ｍの範囲の濃度、５．０〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度、及び１分〜４８時間の範囲の期間で、還元剤として使用される。出発原料上のペンダントカルボキシル基が還元されない反応条件が選択される。他の好適な還元剤は、酸性条件下でのシアノホウ水素化物(cyanoborohydride)、例えば、ポリマー担持型シアノホウ水素化物又はアルカリ金属シアノホウ水素化物、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−セレクトリド、トリアセトキシホウ水素化物等である。
【００６８】
多糖の他の活性化誘導体、例えば、本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ０６／００５４０号に記載されている、ＮＨＳ等のペンダント官能基を有するものは、本発明において有用であり得る。
【００６９】
一実施形態において、反応性アルデヒドは、多糖の還元末端に存在し、非還元末端は、ＥＰＯ上のペンダント基と反応しないように不動態化(passivated)されている。
【００７０】
コロミン酸の還元末端の反応性は、タンパク質標的に対しては弱いものの、化学的に規定された複合体の製造においては十分に厄介である。
【００７１】
多糖の還元末端に反応性アルデヒドを有する多糖を調製するのに好適な化学反応は、本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ０５／０１６９７４号に記載されている。この工程は、予備的な選択的酸化段階、続いての還元、及びその後のさらなる酸化により、還元末端にアルデヒドを有し、且つ非還元末端が不動態化された化合物を得ることを包含する。
【００７２】
国際公開第ＷＯ２００５／０１６９７３号には、タンパク質との複合体形成に有用なポリシアル酸誘導体、特に遊離のスルフヒドリル薬物を有するものが記載されている。ポ０リシアル酸化合物をヘテロ二官能性試薬と反応させることにより、スルフヒドリル基との部位特異的複合体形成のためのペンダント官能基を導入する。本発明で使用するアニオン性多糖も、このようにヘテロ二官能性試薬を用いて誘導体化され得る。
【００７３】
多糖は、ＥＰＯと反応する前に誘導体化され得る。例えば、多糖は二官能性試薬と反応し得る。
【００７４】
多糖は、国際公開第ＷＯ２００６／０１６１６８号でさらに記載されているように、予備反応段階（ここで、第１級アミン基、第２級アミン基及びヒドラジンから選択される基が、好ましくはシアル酸である末端糖上に形成される）と、続く反応段階（ここで、これが二官能性試薬と反応することにより、反応中間体が形成される）に付され得る。次いで、中間体はＥＰＯと反応し得る。二官能性試薬は、先に規定したように、一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚを有し得る。
【００７５】
本発明者らは、或る特定の反応条件が、ＥＰＯのＮ末端での選択的誘導体化を促進することを見出した。Ｎ末端での選択的反応を促進するために、誘導体化反応は、酸性ｐＨの第１の水溶液中で実行すべきであり、次いで得られた多糖誘導体は、第１の水溶液よりも高いｐＨの第２の水溶液中で精製すべきである。典型的には第１の水溶液のｐＨは４．０〜６．０の範囲であり、第２の水溶液のｐＨは６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．５又は６．５〜８．０の範囲である。誘導体化反応のｐＨが低いと、任意の中間鎖部位ではなく、タンパク質のＮ末端での選択的誘導体化が促進される。
【００７６】
さらに、本発明者らは、或る特定の製剤添加物を使用すると、選択的で安定的な多糖ＥＰＯ誘導体の形成が促進されることを見出した。製剤添加物は、１個又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸から選択され得る。これらは反応媒体に添加してもよく、又は代替的には安定化剤として最終製品組成物に添加してもよい。
【００７７】
本発明の一実施形態において、製剤添加物は、ソルビトール、トレハロース又はスクロースである。異なる実施形態において、製剤添加物は、非イオン性界面活性剤である。製剤添加物は代替的にはＰＳＡ、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーであり得る。異なる実施形態において、製剤添加物は、二価金属イオンである。好ましい二価金属イオンとしては、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｓｒ２＋、Ｆ
ｅ２＋、Ｍｇ２＋又はＣａ２＋が挙げられる。
【００７８】
製剤添加物はバッファーであり得る。好ましくは、製剤添加物がバッファーの場合、それはリン酸ナトリウムである。
【００７９】
本発明の方法における多糖誘導体の精製は、当該技術分野において既知の種々の方法を使用して実行され得る。好適な精製方法の例としては、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）、ＡＥＣ（陰イオン交換クロマトグラフィ）及び金属アフィニティクロマトグラフィが挙げられる。
【００８０】
分子量分布の広いポリシアル酸の集団を、多分散度が低めの画分、すなわち、異なる平均分子量の画分に分画し得る。分画は、好ましくは本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ２００５／０１６７９４号及び同第ＷＯ２００５／０３１４９号に記載されているように、好適な塩基性バッファーを溶出に使用する陰イオン交換クロマトグラフィによって実施される。この分画方法は、多糖出発原料及び誘導体に好適である。したがって、この技法は、本発明の必須の工程段階の前後に適用され得る。好ましくは、得られるＥＰＯの多糖誘導体の多分散度は１．３未満、より好ましくは１．２未満、最も好ましくは１．１未満である。
【００８１】
本発明によるＥＰＯの誘導体化の結果、タンパク質の半減期が増大し、安定性が改善し、免疫原性が低減し、且つ／又は溶解度が制御される。それゆえ、ＥＰＯのバイオアベイラビリティ及び薬物動態特性が改善する。モノポリシアル化ＥＰＯ複合体を作製する新規な方法には特別な価値がある。
【００８２】
本発明を、実施例１〜実施例３．１２によって、また添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】従来技術の非還元シアル酸末端ユニットの活性化を示す反応スキーム図である。
【図２】タンパク質のＮ末端又はランダム誘導体化を示す反応スキーム図である。
【図３ａ】Ｔｒｉｐｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＧＰＣ（Viscotek：ＲＩ＋ＲＡＬＳ＋Ｖｉｓｃｏｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用する、異なるｐＨでの２４ｋＤａのコロミン酸（ＣＡ）の分解を示す図である。
【図３ｂ】ＣＡポリマーのゲル浸透クロマトグラフィを示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＰＥＧ化ＥＰＯ及びポリシアル化ＥＰＯの特徴付けを示す図である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（右手側）及びＳＥ−ＨＰＬＣ（左手側）による、ポリシアル化ＥＰＯの特徴付けを示す図である。
【図６】ＳＥ−ＨＰＬＣによる、ＥＰＯ、ポリシアル化ＥＰＯ及びＰＥＧ化ＥＰＯの特徴付けを示す図である。
【図７】ＥＰＯに関するＦＡＣＳデータ（網状赤血球数）を示す図である。
【図８】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図９】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図１０】ＳＥ−ＨＰＬＣによる、ＥＰＯ−ＣＡ複合体の特徴付けを示す図である。
【図１１】非グリコシル化ＥＰＯ対ポリシアル化非グリコシル化ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図１２】非グリコシル化ＥＰＯ対ポリシアル化非グリコシル化ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図１３】ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＮＧ−ＥＰＯ−ＣＡ複合体の特徴付けを示す図である。
【図１４】サンドイッチＥＬＩＳＡによるＥＰＯ−ＰＳＡの検出を示す図である。
【図１５】試薬希釈液中のＥＰＯ−ＰＳＡに対するＥＬＩＳＡの感度を示す図である。
【図１６】サイズ排除ＨＰＬＣによるＥＰＯ複合体の安定性を示す図である。
【図１７】ポリシアル化ＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１８】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す図である（ｎ＝３〜４±ＳＥ）（非近交系雌性マウス；１２週齢；ＳＣ（アルデヒドケミストリー））。
【図１９】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す図である（雌性ウィスターラット；８週齢〜９週齢；ｎ＝５±ＳＥＭ）。
【図２０】ＳＥ−ＨＰＬＣによる、ＮＧ ＥＰＯのＰＥＧ化を示す図である。
【実施例】
【００８４】
材料
炭酸アンモニウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（８ＫＤａ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride)（純度９８％超）、メタ過ヨウ素
酸ナトリウム及び分子量マーカー、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ ２０並びにびＴｒｉｓは、Sigma Chemical Laboratory
、英国から入手した。酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムは、BDH、英国から入手した
。使用するコロミン酸、直鎖α−（２，８）−結合大腸菌Ｋ１ポリシアル酸（平均２２．７ｋＤａ、高多分散度１．３４、３９ｋＤａ、多分散度１．４；１１ｋＤａ、多分散度１．２７）は、Camida、アイルランド及びS.I.I.L. India Ltd.から入手した。他の材料と
しては、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（Aldrich Chemical Company、英国）、透析管（３．５ＫＤａ及び１０ＫＤａカットオフ限界；Medicell International Limited、英国）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ ＨｉＴｒａｐ、ＰＤ−１０カラム、Ｑ ＦＦ［カラム１ｍｌ又は５ｍｌ］；Ｈｉｔｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム［１ｍｌ又は５ｍｌ］（Pharmacia、英国）、Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（４％〜２０％及び８
％〜１６％）、Ｔｒｉｓ−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー（Novex、英国）が含まれた。脱イオン水は、Ｅｌｇａｓｔａｔ
Ｏｐｔｉｏｎ ４水精製ユニット（Elga Limited、英国）から入手した。使用した全ての試薬は分析用（analytical grade）である。プレートリーダー（Dynex Technologies、英国）をタンパク質アッセイ及びＣＡアッセイにおける分光光度定量に使用した。マウス及びラットは、Harlan、英国から購入し、使用前の少なくとも１週間馴化させた。ＥＰＯはSIIL、インドから入手した。
１．タンパク質及びコロミン酸の定量
他で記載されているように［Gregoriadis他、1993；Fernandes及びGregoriadis、1996
、1997］、レゾルシノール法［Svennerholm、1957］によって、レゾルシノール試薬を用
いた（シアル酸としての）ポリシアル酸の定量的評価を実行した。タンパク質を、ＢＣＡ比色法又は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定した。
２．１．コロミン酸の活性化
新たに調製した０．０２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）溶液（８倍モル過剰）を２０℃でＣＡと混合し、反応混合物を暗所で１５分間、磁気的に撹拌した。次に、２倍容量のエチレングリコールを反応混合物に加えて、過剰のＮａＩＯ４を消費し、混合物をそのまま２０℃でさらに３０分間撹拌した。酸化したコロミン酸を、４℃の０．０１％炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．４）に対して長時間（extensively）（２４時
間）透析した（３．５ＫＤａ分子量カットオフ透析管）。限外濾過（分子量カットオフ３．５ｋＤａに対する）を使用して、透析管からＣＡＯ溶液を濃縮した。必要容量まで濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、さらに使用するまで−４０℃で保存した。代替的には、ＣＡＯを、エタノールによる沈殿（２回）によって反応混合物から回収した。
２．２．ＣＡ及び誘導体の酸化状態の定量
カルボニル化合物との相互作用で難溶性の２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いて、コロミン酸酸化度の定性的評価を実行した。非酸化コロミン酸（ＣＡ）／酸化コロミン酸（ＣＡＯ）を２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に加え、溶液を振盪した後、結晶性の沈殿物が観察されるまで３７℃で放置した［Shriner他、1980］。ＣＡの酸化度（定量的）を、アルカ
リ性溶液中でのフェリシアン化物イオンのフェロシアン化第二鉄（プルシアンブルー（Persian blue））への還元に基づく方法［Park及びJohnson、1949］を用いて測定した（こ
れは次に６３０ｎｍで測定される）。この場合、グルコースを標準として使用した。
２．３．ゲル浸透クロマトグラフィ
コロミン酸試料（ＣＡ及びＣＡＯ）をＮａＮＯ３（０．２Ｍ）、ＣＨ３ＣＮ（１０％；５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、２×ＧＭＰＷＸＬカラムでクロマトグラフィにかけ、屈折率により検出した（ＧＰＣ系：ＶＥ１１２１ ＧＰＣ溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０ ＲＩ検出器及びＴｒｉｓｅｃ ３ソフトウェアによる照合、Viscotek Europe Ltd）。試料（５ｍｇ
／ｍｌ）を０．４５μｍのナイロン膜で濾過し、移動相として０．２Ｍ ＮａＮＯ３ 及びＣＨ３ＣＮ（１０％）を用いて０．７ｃｍ／分で流した。
【００８５】
結果を図３ｂ並びに第５表及び第６表に示す。
２．４．コロミン酸の安定性
ＰＥＧ化の化学反応に関するルールをそのままポリシアル化に応用することができないのは、これらの分子の生理化学的特性が異なるからである。ＰＳＡは、酸に不安定なポリマーであると共に、中性付近のｐＨでは何週間も安定である（図３ａ）。図３ａの結果から、ｐＨ６．０及び７．４では、ＣＡは８日間安定であり、ｐＨ５．０では緩徐に分解し（４８時間後、初期分子量の９２％）、ｐＨ４．０では緩徐に分解する（４８時間後、初期分子量の７０％）ことが示される。ポリシアル酸は親水性が高いが、ＰＥＧは両親媒性である。ＰＥＧ化に使用される条件を使用してポリシアル化を実行すると、多くの場合、タンパク質の凝集及び沈殿が観察される。
３．製剤添加物を含むＮ末端タンパク質−ＣＡ複合体の調製
３．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体（Ｎ末端法）の調製
ＥＰＯを溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、０．３４ｍｇ／ｍｌ；比活性：１１０,０００Ｕ／ｍｇ、分子量：３０６００）
として供給し、−３２℃で保存し、タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を、２ｍｌのエッペンドルフチューブに採取した。必要量（２５倍モル過剰）のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体ＣＡに加え、緩やかに混合した。反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌとなるように、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、最終反応混合物のｐＨをチェックした（必要に応じて、ｐＨを６．０に調整する）。チューブをシールし、所望の温度で２４時間撹拌するか、又は反応混合物を最初に室温（２２℃）で８時間インキュベートした後、４℃±１℃で一晩（１４時間）保持した。インキュベーション後、必要な試料を採取した（例えば、活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ用）。
３．１．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け（Ｎ末端法）
残りの反応混合物試料を、最終濃度が２Ｍとなるように、ＨＩＣバッファーＡ１（３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で希釈し、室温で１．５ｍｌ／分の速度でＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ２（２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）（少なくとも６カラム容量）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）（６ＣＶ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上（４℃±１℃）に保持した。
【００８６】
タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ/ｍｌのＥＰＯの吸光
度は約０．７４３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を採取した。ＣＡの分子量が、ＳＥ−ＨＰＬＣによる複合体及びＥＰＯの分離には小さ過ぎる場合（例えば、２２ｋＤａ）、非複合体形成ＥＰＯの分離を陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）を使用して実施した。ＡＥＣでは、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＡＥＣ バッファーＡ（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）（試料１ｍｌ＋ＡＥＣバッファーＡ ５ｍｌ）で希釈し、１．０ｍｌ／分でＡＥＣバッファーＡを用いて事前に平衡化したＥＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＡＥＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出し、２．０ｍｌ／分での第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
【００８７】
代替的には、精製は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって行うことができる（例えば、使用するＣＡが高分子量、例えば、３９ｋＤａの場合に、ＥＰＯから複合体を分離する）。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ/ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．
７４３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を採取した。
【００８８】
一定分量をタンパク質アッセイ及びＣＡアッセイ用に取り出した。残りの溶液は、使用するまで−２０℃で保存した。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。フェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしたマウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を誘導する際のＥＰＯ試料及びＮＧ ＥＰＯ試料の活性の定量を使用した。プロトコルは、Krystal（1972）により報告されている方法
に基づき改作した。アッセイは、赤血球前駆細胞へのＥＰＯの添加及び３Ｈ−チミジン取り込み速度の定量によるＤＮＡ複製速度の測定に基づく。Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態（ＰＫ）試験及び薬力学（ＰＤ）試験を行った。
３．２．ＥＰＯ−ＣＡ複合体（ランダム）の調製
ＥＰＯを溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、０．３４ｍｇ／ｍｌ；比活性：１１００００Ｕ／ｍｇ、分子量：３０６００）として供給し、−３２℃で保存し、タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を２ｍｌのエッペンドルフチューブに採取した。必要量のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体ＣＡに加え、緩やかに混合した。反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ/ｍｌとなるよ
うに、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、最終反応混合物のｐＨをチェックした（必要に応じて、ｐＨを７．４に調整する）。チューブをシールし、所望の温度（４℃±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベーション後、必要な試料を採取した（例えば、活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ用）。
３．２．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体（ランダム）の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料を、最終濃度が２Ｍとなるように、ＨＩＣバッファーＡ１（３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で溶解し、室温で１．５ｍｌ／分の速度でＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ２（２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）（少なくとも６カラム容量）で洗浄し、洗浄画分を回収及び標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）（６ＣＶ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上（４℃±１℃）に保持した。
【００８９】
タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。ＣＡの分子量が、ＳＥ−ＨＰＬＣによる複合体及びＥＰＯの分離には小さ過ぎる場合（例えば、２２ｋＤａ）、非複合体形成ＥＰＯの分離を陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＸＣ）を使用して実施した。ＡＸＣでは、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＡＸＣバッファーＡ（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）（試料１ｍｌ＋ＡＸＣバッファーＡ ５ｍｌ）で希釈し、１．０ｍｌ／分でＡＸＣバッファーＡで事前に平衡化したＡＸＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＡＸＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出し、２．０ｍｌ／分での第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
【００９０】
代替的な精製は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって行うことができる（例えば、使用するＣＡが高分子量、例えば、３９ｋＤａの場合に、ＥＰＯから複合体を分離する）。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ/ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４
３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を採取した。
３．３．グリコンケミストリー
ヒドラジドコロミン酸を、最終ＣＡ濃度が１０ｍＭとなるようにＥＰＯ溶液に溶解した。溶液のｐＨを５．５に調整した。必要容量のＮａＩＯ４溶液のＮａＯＡｃ溶液を、最終濃度が５ｍＭ ＮａＩＯ４となるように加えた。ＮａＨＳＯ３（ＮａＨＳＯ３の最終濃度２０ｍＭ）を用いて反応を停止した。反応混合物を室温でインキュベートした。最後に、必要容量のＮａＣＮＢＨ３溶液のＮａＯＡｃ溶液を、最終濃度が５０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３となるように加えた。振盪器上で反応を４℃±１℃で１時間継続した。インキュベーション後、ＳＤＳ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、活性アッセイに必要な試料を採取した。
３．３．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け（グリコンケミストリー）
残りの反応混合物試料を、最終濃度が２Ｍとなるように、ＨＩＣバッファーＡ１（３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で希釈し、室温で１．５ｍｌ／分の速度でＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した（Ｌ１〜Ｌｘ）。カラムをＨＩＣバッファーＡ２（２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）（少なくとも６カラム容量）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）（６ＣＶ）を回収及び標識した。精製中は、試料を氷上（４℃±１℃）に保持した。
【００９１】
タンパク質濃度をＵＶ（２７６ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３であった）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。ＣＡの分子量が、ＳＥ−ＨＰＬＣによる複合体及びＥＰＯの分離には小さ過ぎる場合（例えば、２２ｋＤａ）、非複合体形成ＥＰＯの分離を、陰イオン交換クロマトグラフィ陰イオン交換（ＡＸＣ）を使用して実施した。ＡＸＣでは、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＡＸＣバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で希釈し（試料１ｍｌ＋ＡＸＣバッファーＡ ５ｍｌ）、１．０ｍｌ／分でＡＸＣバッファーＡで事前に平衡化したＡＸＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＡＸＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出し、２．０ｍｌ／分での第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
【００９２】
代替的な精製は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって行うことができる（例えば、使用するＣＡが高分子量、例えば、３９ｋＤａである場合に、ＥＰＯから複合体を分離する）。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。
３．４．ＥＰＯのＰＥＧ化：
ＥＰＯ（３０．６ｋＤａ）を溶液（５％ソルビトール、０．０２５ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０中、０．９５４ｍ
ｇ／ｍｌ）として供給し、２℃〜８℃で保存した。ＥＰＯ溶液を濃縮して、約１．０ｍｇ/ｍｌの溶液とした。必要量のＥＰＯをエッペンドルフチューブに取り、氷上に載置した
。複合体形成用に添加したＰＥＧの量は、式：
ＰＥＧの重量＝{タンパク質の量（ｇ）／（タンパク質の分子量）}×（ＰＥＧの分子量）×（ＰＥＧのモル過剰）
に基づいて計算した。
【００９３】
必要量のＰＥＧ ２０Ｋを秤量した。１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５％ソルビトール、ｐＨ５．５（ここで使用するのは、最終反応容量の２０％容量）中に可溶化し、混合物を、全てのＰＥＧが溶解するまで緩やかにボルテックスした後、濾過して新しいエッペンドルフに入れるか、又は４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいエッペンドルフに移すことにより、いかなる凝集／沈殿物質も除去した。ＰＥＧが２５倍モル過剰となるように、必要量のＥＰＯをタンパク質溶液をＰＥＧ溶液に加え、４℃±１℃で緩速振盪器上に反応混合物を保持することによって緩やかに混合した。最終反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌとなるように、必要容量の１００ｍｇ／ｍｌ ＮａＣＮＢＨ３溶液を加え、緩やかに混合し、最終反応混合物のｐＨをチェックし、必要に応じて、４℃±１℃の１Ｍ ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いて５．５に調整した。最後に、反応の容量を、反応混合物中のタンパク質濃度が１ｍｇ/ｍｌとなるように、２０ｍＭ ＮａＯＡＣ、５％ソルビトー
ル、ｐＨ５．５を使用して調整した。チューブをシールし、所望の温度（４℃±１℃）で２４時間撹拌した。反応を適切な方法によって停止し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを使用）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム）用の試料を採取し、反応混合物のｐＨをチェックした。いかなる沈殿物も除去するために、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析及び精製前に反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心した。好ましいＳＥ−ＨＰＬＣ用バッファーは０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）であった。結果を図５に示す。
３．５．Ｎ末端非グリコシル化エリスロポエチン（ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡ）複合体の調製
ＮＧ ＥＰＯを溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．６５中、０．１８ｍｇ／ｍｌ；比活性：１０００００Ｕ／ｍｇ；分子量：１９０００）として供給し、−３２℃で保存し、タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を２ｍｌのエッペンドルフに採取した。複合体形成に必要なコロミン酸（例えば、酸化コロミン酸又は非酸化コロミン酸）の量を計算した。必要量のコロミン酸を秤量した。タンパク質溶液を固体ＣＡに加え、穏やかに混合した。反応混合物中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌとなるように、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を、反応混合物に加えた。最終反応混合物をボルテックスし、ｐＨをチェックした（必要に応じて、ｐＨを７．４に調整した）。チューブをシールし、所望の温度（４℃±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベーション後、活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ等に必要な試料を採取した。
３．５．１．ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をＨＩＣバッファーＡ（１．２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で希釈し（試料１ｍｌ＋バッファーＡ ４ｍｌ）、ＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄した。洗浄画分を回収し標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢで溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのｎＥＰＯの吸光度は約０．７４３であった）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。反応条件により、反応混合物中に有意な遊離のＮＧ ＥＰＯが存在しなかったため、さらなる精製は不必要であった。ＮＧ
ＥＰＯが反応混合物中に存在した場合には、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＶｉｖａｓｐｉｎ ６（５０００ ＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって精製を行った。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＮＧ
ＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。
【００９４】
一定分量をタンパク質アッセイ及びＣＡアッセイ用に取り出した。残りは、使用するまで−２０℃で保存した。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。
３．６．ＥＰＯ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣ
４℃で冷却したJascoのＡＳ−２０５７ ｐｌｕｓオートサンプラー及びJascoのＵＶ−９７５ ＵＶ／ＶＩＳ検出器を備えたＬｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Jasco）でＨＰＬＣを実施した。データをＩＢＭ／ＰＣ上のＥＺｃｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅソフ
トウェアによって記録した。ＳＥＣ試料を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムで、０．１Ｍリン酸Ｎａ、ｐＨ６．９の定組成移動相を用いて分析した（図５）。図６は室温での唯一のピーク＝７６．４０８を示し、これはＥＰＯに帰属される。
【００９５】
図５の左手側に示すＳＥＣのピーク表は以下の通りである：
【００９６】
【表１】
【００９７】
３．７．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング＆ＥＬＩＳＡ
４％〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。試料を、還元バッファー又は非還元バッファーのいずれかで希釈し、タンパク質５．０μｇを各ウェルにローディングした。ゲルをトリグリセリンバッファー系で試験し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色した。抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロッティングを実施した（図４）。図４はＥＰＯ製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す（部位特異的、Ｎ末端）。
３．８．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性
フェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしたマウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を誘導する際のＥＰＯ試料の活性の定量を使用した。プロトコルは、Krystal［1972］により報告されている方法に基づき改作
した。アッセイは、赤血球前駆細胞へのＥＰＯの添加及び３Ｈ−チミジン取り込み速度の定量によるＤＮＡ複製速度の測定に基づく。
３．９．安定性試験
無菌のＥＰＯ複合体を２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４；５％ソルビトール及び０．０２５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０中で、４℃で６週間保存した。下記条件の下、ＳＥＣカラムを使用して試料のＳＥ−ＨＰＬＣを実施した：注入容量：１００μｌ、流速：０．２５０ｍｌ／分、ランニングバッファー：０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ：６．９。
３．１０．ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力
ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を、雌性マウスＢ６Ｄ２Ｆ１（７週齢〜８週齢）で試験し、５μｇ〜１５μｇのタンパク質用量（同一活性）をマウスに皮下注射した。これらの動物は、４匹ずつ７つの群に分けた。以下のようにＥＰＯ製剤を各群の各動物に与えた：ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＰＳＡ複合体、ＰＢＳ、Ａｒａｎｅｓｐ（５μｇ）。各動物から血液５０μｌを採取し、ｒｅｔｉｃ ｃｏｕｎｔ染料で染色した後、ＦＡＣＳによって分
析した（図８及び図９）。
【００９８】
十分に混合した全血５μｌを、Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ試薬１ｍｌと混合し、暗所で室温で３０分間インキュベートした。その後、試料をＦＡＣＳ機器の助けを借りて網状赤血球を計数することによって分析した。
３．１１．Ｅｌｉｓａ
ＥＰＯ−ＰＳＡをプレート全体にコーティングされた抗ＰＳＡ抗体によって捕捉した。捕捉されたＥＰＯ−ＰＳＡを抗ＥＰＯ抗体を用いて検出し、ＥＰＯとＰＳＡとの複合体のみを検出した。
３．１２．ｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス
ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスをマウスで試験した。適切量のタンパク質用量をマウスに皮下注射及び静脈内注射した。ＥＰＯ製剤を１２５Ｉで放射標識し、血液試料の放射能を頻繁に測定した。
結果
ＣＡの活性化及び酸化度の定量
Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の直鎖α−２，８−結合ホモポリマーである、コロミン酸（ＣＡ）を使用した。コロミン酸の酸化への曝露を室温で２０ｍＭ過ヨウ素酸塩を使用して１５分間実行した。過ヨウ素酸塩処理後の内部α−２，８結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基の完全性をゲル浸透クロマトグラフィによって分析し、酸化コロミン酸（ＣＡＯ）に対するクロマトグラフが得られ、物質を天然のＣＡの物質と比較した。酸化ＣＡ及び天然ＣＡがほぼ同一の溶出プロファイルを示すことが分かり、逐次酸化段階がポリマー鎖の有意な断片化を引き起こすという証拠は無かった。
【００９９】
ＣＡの酸化状態の定量測定を、標準としてグルコースを使用して、フェロシアン化物（プルシアンブルー）へのアルカリ性溶液中でのフェリシアン化物イオンの還元［Park及びJohnson、1949］によって実施した。第１表は、酸化コロミン酸が、化学量論量を上回る
（１００％超の）量の還元物質、すなわち、１１２ｍｏｌ％の見かけ上のアルデヒド含量（還元末端のヘミケタール及び（他の末端、非還元末端に）導入されたアルデヒドの還元力の組合せを含む）を有することが分かった。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
ＥＰＯ複合体の調製、精製及び特徴付け
低ｐＨ（ｐＨ５．５）及びランダムｐＨ（７．４）並びに４℃±１℃で反応を行うことによってＮ末端選択的にエリスロポエチン（ＥＰＯ）のコロミン酸（ＣＡ）複合体を調製
及び精製する手順は、上記に詳述されている。これには、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下での複合体形成、続く遊離のＥＰＯを除去するためのイオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）を使用する精製、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によるＣＡの除去が包含される。Ｎ末端のα−アミノ基の選択的誘導体化が優勢となるように、また反応中のＥＰＯの凝集を最小限にするために低ｐＨを使用した。最終反応バッファーの組成は、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中、５％ソルビトール、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐＨ５．５）であった。
【０１０２】
ＥＰＯ−ＣＡ複合体の形成をＳＥ−ＨＰＬＣ（ＥＰＯと比較しての、ＥＰＯ−ＣＡの保持時間の変化；両方の部分が同時に溶出もする）；イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムへの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；高分子量種へ向かってのバンドの広がり及びシフト）によって確認した（図４）。ポリシアル化試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性であり、未処理のＥＰＯよりも著しく優れたプロファイル（ＰＫ及びＰＤ）を示した。図１１及び図１２はｉｎ ｖｉｖｏでの結果を示す。
【０１０３】
図５の左手側は、２４時間後のＥＰＯ−ＣＡ ３９ｋＤａ複合体形成のＳＥ−ＨＰＬＣを示す。第３表はピーク解析表である。特徴付け条件：カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、バッファー：炭酸水素アンモニウム０．１５Ｍ、ｐＨ：７．８。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
誘導体化の程度は、ポリシアル化ＥＰＯよりもＰＥＧ化ＥＰＯの方が大きいことが分かった（図６）。これは、ＰＥＧの不活性な性質及びシアル酸の帯電した性質に起因する可能性がある。ＦＡＣＳデータからの網状赤血球数は、ＥＰＯよりもＰＳＡ−ＥＰＯ複合体の方が多かった（図７）。ＥＰＯ−ＣＡＯ複合体の精製後、ＳＥＣ ＨＰＬＣからのクロマトグラム上に有意なＥＰＯは観察されず、誘導体化は、ＳＥ−ＨＰＬＣでの保持時間の変化並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の高分子量バンドの広がり及びシフトによって示された。ＥＰＯのポリシアル化は、マウス抗ＰＳＡ抗体を使用するウエスタンブロッティングによっても示された。静脈内投与では、ＰＳＡ−ＥＰＯ複合体のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスプロファイルは、ＥＰＯと比べて優れていることも分かり（図８）、曲線下面積は７．１倍増大した。同様にＥＰＯ−ＰＳＡの皮下投与もＥＰＯと比較してより大きな保持を示し、曲線下面積は２．５倍増大した。ＥＰＯのポリシアル化が反応混合物のインキュベーション時間、モル過剰及びｐＨに比例することも分かった。ポリシアル化ＮＧ ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスプロファイル（静脈内及び皮下）は、ＮＧ ＥＰＯよりも良好であることが分かった（図１１及び図１２）。幾つかのＳＤＳゲルにおいて、ＥＰＯのジポリシアル化も観察された。ＥＰＯ−ＰＳＡ複合体は、ＥＬＩＳＡ法によっても確認した（図１４及び図１５）。赤血球造血現象は、ＥＰＯと比較してＥＰＯ−ＰＳＡ複合体の方が大きいことが分かり、６ＫＤａ〜１５ＫＤａではポリマーの分子量に比例することが分かった（図１８）。シアル酸の鎖が大きくなるにつれて赤血球造血の現象は低減するため、１５ＫＤａがＥＰＯに最適な鎖長であることが分かった。これは、受容体から
の反発で生じるポリマーの負に帯電した性質に起因する可能性がある。この試験は、図１８の助けを借りて確認した。ＡｒａｎｅｓｐのＥｍａｘは、臨床的に良好ではなく、血栓症をもたらし、骨髄枯渇の原因となり得るＥＰＯ−ＰＳＡよりも遥かに大きいことが分かり、処置後、ベースライン未満まで網状赤血球を低下させることも分かった。ＥＰＯ−ＰＳＡは、ＥＰＯよりも著しく優れていることが分かり、ＥＰＯ−ＰＳＡは、ＥＰＯ−ＰＥＧと同様に優れていることが分かり、ＥＰＯ−ＰＳＡも一定の赤血球造血をもたらす。
【０１０６】
ＰＳＡ複合体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイにおいて活性であることが分かった。ＰＳＡ−ＥＰＯ複合体がＰＥＧ複合体と同様に良好であり、ＥＰＯよりもはるかに優れていることがｉｎ ｖｉｖｏでの効力試験から示される（図８及び図９）。
【０１０７】
ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡ複合体の形成をＳＥ−ＨＰＬＣ（ＮＧＥＰＯと比較しての、ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡの保持時間の変化；両方の部分が同時に溶出もする）；イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムへの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；高分子量種のバンドのシフト）によって確認した。図は、２４時間後のＥＰＯ−ＣＡ ３９ｋＤａ複合体形成を示す。ポリシアル化試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性であり、未処理のＮＧｅｐｏよりも著しく優れたプロファイル（ＰＫ及びＰＤ）を示した。
【０１０８】
図１０は、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。下記第４表にピーク解析を示す。特徴付け条件−カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、バッファー：炭酸水素アンモニウム０．１５Ｍ、ｐＨ：７．８。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
図１２は、ｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスの結果を示す。ＰＳＡ−ＮＧ ＥＰＯは、ＮＧ ＥＰＯと比べて、著しく優れたプロファイルを示した。
【０１１１】
第５表は、使用した各種パラメータの値を示し、第６表は、ＣＡ画分の分子量及び多分散度を示す。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
参照文献
【０１１５】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＥＰＯの多糖誘導体及びかかる誘導体の製造方法に関する。誘導体は、ＥＰＯの安定性、薬物動態（pharmacokinetics）及び薬力学（pharmacodynamics）の改善に有用である。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチンは糖タンパク質ホルモンであると共に、骨髄の赤血球（erythrocyte
（red blood cell））前駆細胞に対するサイトカインである。ヘマトポエチン又はヘモポエチンとも呼ばれ、腎臓によって産生され、赤血球産生を調節する。
【０００３】
エリスロポエチンは、身体における赤血球造血（erythropoiesis：赤血球形成）の主要な調節因子である（Martindale、1996）。組換えヒトエリスロポエチンは、エポエチンα及びエポエチンβとして知られる形態で市販されている。これらは、慢性腎不全患者における貧血の管理で使用される。エポエチンγも利用可能である。全て、同一の１６５アミノ酸配列を有するが、そのグリコシル化パターンが異なる。
【０００４】
組換えヒトエリスロポエチンは、高血圧患者、発作歴のある患者、血小板増加症患者、慢性肝不全患者、虚血性血管疾患患者又は悪性腫瘍患者においては、慎重に使用するべきである。エポエチンα及びエポエチンβは、場合によってはグリコシル化及び市販製剤の配合の違いに起因して、その薬物動態が幾分異なる。エポエチンαは、皮下注射後の吸収が緩徐且つ不完全であり、静脈内投与に対する相対的バイオアベイラビリティは約１０％〜５０％と報告されている。エポエチンβも吸収が緩徐且つ不完全であり、その絶対的バイオアベイラビリティはおよそ４０％と報告されている。
【０００５】
ＥＰＯを誘導体化してその薬物動態特性を改善させる試みが為されている。ＥＰＯのポリエチレングリコール誘導体である、ＣＥＲＡ（持続性エリスロポエチン受容体活性化剤（Constant Erythropoiesis Receptor Activator））として知られる、Rocheにより開発
中の製品がある。これは、ＥＰＯよりも長い半減期を有することが示されており、頻繁な注射の必要性を低減させる。さらなる新規赤血球造血刺激剤は、慢性腎疾患及び癌に随伴する貧血を治療するための新規ＰＥＧ化合成ペプチド、Ｈｅｍａｔｉｄｅである。これはFan他（2006）によってさらに記載されている。
【０００６】
静脈内投与後の最終相半減期が組換えヒトＥＰＯ及び天然ホルモンよりもおよそ３倍長い、組換えヒトエリスロポエチンの高度にグリコシル化されたアナログである、Ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎ等、ＥＰＯの他の形態も開発されている。
【０００７】
特許文献１には、循環における血漿中半減期が長期化した、微生物から製造されたＥＰＯの修飾変異タンパク質が記載されている。無細胞タンパク質合成技法を使用することにより、ＰＥＧ又は多糖等の修飾因子と反応し得る非天然アミノ酸を有する、ＥＰＯの変異タンパク質が製造される。概して、ＰＥＧは、ＥＰＯの変異タンパク質中の遊離のスルフヒドリル基と結合する。
【０００８】
特許文献２は、ＥＰＯとＰＥＧとのＮ末端複合体を対象とする。複合体は、長い循環半減期及び血漿中滞留時間を有する。
【０００９】
特許文献３には、ＰＥＧと複合体を形成したＥＰＯの製造方法の改善が記載されている。本発明者らは、ｒｈＥＰＯ１分子当たり１個〜３個の直鎖ＰＥＧ分子を有する複合体の
組成物が最も持続的な効力を示すことを見出した。
【００１０】
特許文献４も、生物学的に活性なＥＰＯ複合体組成物を提供するという課題に取り組んでいる。ＥＰＯは、組成物の循環血清中半減期を増大させる有機分子と共有結合した非抗原性の親水性ポリマーと共有結合で複合体を形成する。水溶性ポリマーは、とりわけ、ポリアルキレンオキシド、ポリアミド又は糖質であり得る。
【００１１】
しかしながら、ポリシアル酸（ＰＳＡ）等のアニオン性多糖を用いたＥＰＯの誘導体化について記載する公表された著作は今日まで全く存在しない。
【００１２】
ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、或る特定の菌株により、また哺乳類の或る特定の細胞で産生されるシアル酸の天然非分岐ポリマーである。ポリシアル酸は、天然の細菌由来型ポリマーの、限定（limited）酸加水分解若しくはノイラミニダーゼによる消化、又は分画に
よって、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基から、最小でｎ＝２のシアル酸残基までの各種重合度で製造することができる。
【００１３】
近年、ポリシアル酸の生物学的特性、特にα−２，８結合ポリシアル酸ホモポリマーの生物学的特性が、タンパク質及び低分子量薬物分子の薬物動態特性を修飾するために活用されている。ポリシアル酸誘導体化により、多数の治療用タンパク質、例えば、カタラーゼ及びアスパラギナーゼの循環半減期が劇的に改善し、治療用タンパク質に対する先の曝露の望ましくない（且つ時には不可避の）結果として、既存抗体が増加するにもかかわらず、かかるタンパク質を使用することが可能である。α−２，８結合ポリシアル酸はＰＥＧの魅力的な代替物であり、元々人体の一部であり、且つ組織ノイラミニダーゼにより、無毒性の糖であるシアル酸に分解する、免疫学的には不可視の生分解性ポリマーである。
【００１４】
本発明者らは以前に、多糖（特にＰＳＡ）をタンパク質等の治療薬に結合させる方法を記載している［特許文献５、特許文献６］。これらの方法のうちの幾つかは、ポリマーの「非還元」末端を化学的に誘導体化して、第１級アミン基で反応するタンパク質反応性のアルデヒド部分を作り出すことに基づいている。非還元シアル酸末端ユニットは、隣接ジオールを含有するため、過ヨウ素酸塩を用いて容易に（且つ選択的に）酸化することにより、タンパク質に対する反応性が遥かに高く、且つ還元的アミノ化及び他の化学反応（chemistries：ケミストリー）によるタンパク質の結合に好適な反応要素を含む、モノアル
デヒド体を得ることができる。この反応を図１及び図２に示す。ここで、
図１は、過ヨウ素酸ナトリウムを用いたコロミン酸（大腸菌由来のα−２，８結合ポリシアル酸）の酸化により、非還元末端でタンパク質反応性アルデヒドが形成されることを示し、
図２は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いたシッフ塩基の選択的還元により、タンパク質のアミノ基との安定で不可逆的な共有結合が形成されることを示す。
【００１５】
上記従来の複合体形成反応中に、例えば、コロミン酸がアミノ酸の側鎖と反応することによって、意図しない副生成物が生成する可能性がある。これは、ヒト及び動物の治療用途で監督機関によって要求される既知組成の複合体の製造において十分に厄介なものとなる可能性がある。
【００１６】
反応生成物の殆どの物理化学的特性が類似しているため、意図する反応生成物（例えば、モノポリシアル化体）を各種の意図しない生成物と切り離して精製することは容易ではない。このことは、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル浸透クロマトグラフィ（それぞれ電荷及びサイズに基づいて分離する）等の技法によっては、好ましい精製プロファイルが得られないことを意味する。この問題は、複合体形成反応における生成物の複雑度を低減させることによって克服することができる。本発明者らは、多糖とタンパク質との複合
体を形成する新規な方法であって、それによりタンパク質のＮ末端の高い反応性を利用することができ、且つタンパク質と過ヨウ素酸塩酸化した天然のコロミン酸との還元的アミノ化に関する確立された方法（図１及び図２）を使用して得られる生成物の複雑度を回避する、新規な方法を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第１２１９６３６号
【特許文献２】米国特許第７，１２８，９１３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００８２７６５号
【特許文献４】米国特許第７，０７４，７５５号
【特許文献５】米国特許第５，８４６，９５１号
【特許文献６】国際公開第ＷＯ−Ａ−０１８７９２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従来技術を鑑みて、ヒト及び動物の治療で使用することができ、且つ安定性、半減期が最適化され、毒性の低い、改善されたＥＰＯ誘導体の提供が必要とされている。本発明者らは、ＰＳＡ等の多糖をＥＰＯと結合させることで、かかる性質が付与されることを見出し、それにより本発明に到達した。アニオン性多糖と結合したＥＰＯを記載したのはこれが初めてである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の第１の態様により、本発明者らは、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の多糖誘導体である化合物であって、多糖がアニオン性であり、且つ２個〜２００個の糖ユニットを含む、化合物を提供する。
【００２０】
以下、「ＥＰＯ」という用語を使用する場合、本発明者らは、ＥＰＯ様タンパク質を包含することも意図している。ＥＰＯ様タンパク質とは、ＥＰＯの活性と同等の活性を有するタンパク質を意味する。ＥＰＯは、上記で詳述したように赤血球産生を調節する。ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の活性は、Krystal（1983）に記載の標準的なアッセイを使用
して測定することができる。マウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を誘導する際のＥＰＯ試料の活性を測定する。マウスは、事前にフェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしている。アッセイにおいて、ＥＰＯを赤血球前駆細胞に加え、ＤＮＡ複製速度を、３Ｈ−チミジン取り込み速度を求めることによって測定する。タンパク質は、ＮＩＢＳＣ由来の標準ＥＰＯと比較して、１０％〜２００％の複製速度を誘導する場合、「ＥＰＯ様」として分類される。典型的には、ＥＰＯ様タンパク質は、標準ＥＰＯの活性の少なくとも３５％、好ましくは、標準ＥＰＯの活性の少なくとも５０％を有する。
【００２１】
上記で詳述した、必要な活性を有するＥＰＯの変異体も使用し得る。「ＥＰＯ様」タンパク質は、「ＥＰＯホモログ（homologue）」とも称され得る。２個の配列が相同である
かどうかは、当該技術分野において既知の用語である、％類似性又は％同一性を使用してルーチン的に計算される。配列は、スイスプロット（swissprot）アクセッション番号Ｐ
Ｏ１５８８のヒトＥＰＯ前駆体である、配列番号１と比較するものとする。活性ＥＰＯは、この配列の２８残基〜１９３残基である。ＥＰＯホモログ配列は、配列番号１の全体と比較してもよく、又はその２８残基〜１９３残基と比較してもよい。好ましくは、ＥＰＯホモログ配列は、活性ＥＰＯ、すなわち、２８残基〜１９３残基と比較される。
【００２２】
本発明において、ホモログは、５０％以上の類似性又は同一性（核酸レベル又はアミノ
酸レベル）、好ましくは６０％、７０％、８０％以上、より好ましくは９０％以上、例えば、９５％又は９９％の同一性又は類似性（アミノ酸レベル）を有する。類似性又は同一性の計算には多数のプログラムが利用可能であるが、好ましいプログラムは、ＢＬＡＳＴｎプログラム、ＢＬＡＳＴｐプログラム及びＢＬＡＳＴｘプログラムであり、初期設定パラメータで実行され、www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能である。例えば、２個のアミノ酸配列は、初期設定パラメータ（スコア＝１００、ワード長＝１１、期待値＝１１、低複雑度フィルタリング＝オン）でＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して比較し得る。上記の相同性のレベルは、これらの初期設定パラメータを使用して計算し得る。
【００２３】
ＥＰＯは、グリコシル化されてもよく、又はグリコシル化されなくてもよい。ＥＰＯがグリコシル化される場合、化合物は、典型的には２個〜１００個の糖ユニットを含む。より典型的には、化合物は、１０個〜８０個の糖ユニット、好ましくは２０個〜６０個の糖ユニット、最も好ましくは４０個〜５０個の糖ユニットを含む。
【００２４】
ＥＰＯがグリコシル化されない場合、化合物は、典型的には８０個〜１８０個の糖ユニット、好ましくは１００個〜１５０個の糖ユニット、より好ましくは１２０個〜１４５個の糖ユニット、最も好ましくは１３０個〜１４０個の糖ユニットを含む。
【００２５】
好ましくは、アニオン性多糖は、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは少なくとも１０個、例えば少なくとも５０個の糖ユニットを有する。
【００２６】
アニオン性多糖は、好ましくは、ポリシアル酸、ヘパリン、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸から選択される。好ましくは、多糖はポリシアル酸であり、実質的にシアル酸ユニットのみから成る。しかしながら、多糖は、分子中にシアル酸以外のユニットを有し得る。例えば、シアル酸ユニットを他の糖ユニットと交互にしてもよい。しかしながら、好ましくは、多糖は、実質的にシアル酸のユニットから成る。
【００２７】
好ましくは、化合物は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質のＮ末端誘導体である。すなわち、多糖は、そのＮ末端でＥＰＯと結合する。本明細書中において、Ｎ末端での誘導体化とは、ＥＰＯのＮ末端アミン基での誘導体化を意味する。しかしながら、代替的には、多糖は、中間鎖（mid-chain）アミノ酸、例えば、リジン、システイン、アスパラギン酸、
アルギニン、グルタミン、チロシン、グルタミン酸又はヒスチジンの側鎖で、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質と結合し得る。典型的には、側鎖は、リジンアミノ酸又はシステインアミノ酸の側鎖である。
【００２８】
好ましくは、多糖は末端シアル酸基を有し、上記で詳述したように、より好ましくは、α−２，８結合又はα−２，９結合を通じて相互に結合した少なくとも２個のシアル酸ユニットを含む多糖である、ポリシアル酸である。好適なポリシアル酸の重量平均分子量は２ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲、好ましくは５ｋＤａ〜５０ｋＤａの範囲である。最も好ましくは、ポリシアル酸は、細菌源、例えば、大腸菌ＫＩ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍａｒａｘｅｌｌａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ若しくはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの多糖Ｂ、又は大腸菌Ｋ９２株由来のＫ９２多糖に由来する。最も好ましくは、大腸菌Ｋ１に由来のコロミン酸である。
【００２９】
ポリシアル酸は、塩又は遊離酸の形態であり得る。細菌源からの回収後に分子量が低下した、加水分解形態であってもよい。
【００３０】
好ましくは、ポリシアル酸である多糖は、分子量が広範な（例えば多分散度が１．３超、例えば２以上にもなる）物質であり得る。好ましくは分子量の多分散度は１．３未満、より好ましくは１．２未満、例えば１．１未満である。多分散度は低いと１．０１にもな
り得る。
【００３１】
ＥＰＯは、２個以上のアニオン性多糖を用いて誘導体化され得る。例えば、ＥＰＯは、そのＮ末端及び内部のアミノ酸側鎖の両方で誘導体化され得る。例えば、リジン、システイン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン、チロシン、グルタミン酸、セリン及びヒスチジンの側鎖が、アニオン性多糖によって誘導体化され得る。ＥＰＯはグリコン（glycon）ユニットでも誘導体化され得る。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、ＥＰＯはそのＮ末端のみで誘導体化される。
【００３２】
本明細書中において、Ｎ末端での誘導体化とは、ＥＰＯのＮ末端アミン基での誘導体化を意味する。
【００３３】
本発明の第１の態様による化合物は、ＥＰＯとアニオン性多糖とが共有結合した複合体であり得る。多糖とＥＰＯとの間を結び付ける他の手段としては静電引力が挙げられる。しかしながら、共有結合が好ましい。ＥＰＯは、そのＮ末端アミノ酸で多糖と共有結合し得る。共有結合は、カルボキシル基とアミン基との間のアミド結合であり得る。ＥＰＯが多糖と共有結合することができる別の結合は、シッフ塩基を介する。アミンとの複合体形成に好適な基は、国際公開第ＷＯ２００６／０１６１６８号にさらに記載されている。
【００３４】
本発明において、多糖は、天然多糖又は天然多糖の誘導体、例えば、糖残基上での１個又は複数の活性基の反応によって誘導体化されているか、又は多糖鎖の末端で誘導体化基と共有結合している多糖であり得る。
【００３５】
多糖は、その還元末端ユニット又は非還元末端ユニットのいずれかを介してＥＰＯと結合し得る。このことは、１個の多糖鎖が、２個のＥＰＯタンパク質と結合し得る、すなわち、その還元末端及び非還元末端の両方で誘導体化され得ることを意味する。
【００３６】
多糖をタンパク質と結合させる方法は、当該技術分野において既知であり、国際公開第ＷＯ９２／２２３３１号及び特許文献６において、より詳細に記載されている。本発明における好ましい方法を以下でより詳細に説明する。方法は、本出願の図１及び図２にも記載されている。
【００３７】
多糖は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質と直接、すなわち、図１及び図２に示すように、又はリンカーを介して結合し得る。好適なリンカーは、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを含有する試薬に由来する。リンカーはまた、生物学的に安定である（biostable）か、又は生
分解性であり、例えば、ポリペプチド又は合成オリゴマーを含み得る。リンカーは、国際公開第ＷＯ２００５／０１６９７３号でさらに記載されるように、二官能性部分に由来し得る。好適な二官能性試薬は、例えば、Ｂｉｓ−ＮＨＳである。試薬は、一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚ（式中、各Ｚは官能基であり、同一であってもよく、又は異なっていてもよく、且つＲ１は二官能性有機基である）を有し得る。好ましくは、Ｒ１は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレン（これらは任意でカルボニル結合、エステル結合、スルフィド結合、エーテル結合、アミド結合及び／又はアミン結合によって置換及び／又は介在され得る）から成る群より選択される。特に好ましくは、Ｃ３〜Ｃ６アルカンジイルである。最も好ましくは、Ｒ１は、好適な二官能性試薬の適切な部分に相当する。
【００３８】
本発明の好ましい化合物は、一般式（Ｉ）：
【００３９】
【化１】
【００４０】
（式中、ｍは、少なくとも１であり、
ＸＢは、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質であるＢ−ＸＨに由来し（ここで、ＸＨは、ＮＨ２又はＳＨである）、
Ｌは、結合、連結基であるか、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
ＧｌｙＯは、アニオン性糖ユニットであり、
結合基は、存在すれば、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｙは、ＮＲ２又はＮＲ２−ＮＲ２であり、且つＲ１は、上記で規定した二官能性有機基であり、且つＲ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキルである）
のものである。
【００４１】
本発明の本態様において、ＥＰＯは、多糖の非還元末端と結合する。末端多糖ユニットはシアル酸ユニットである。多糖中の他の糖ユニットは、ＧｌｙＯで表され、同一であってもよく、又は異なっていてもよい。好適な糖ユニットとしては、ヘパリン、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸が挙げられる。
【００４２】
ＥＰＯが多糖と直接結合する場合、Ｌ基は結合である。しかしながら、Ｌ基は代替的には、Ｎ−マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヨードアセトアミド、オルトピリジル又はＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを含有する試薬に由来し得る。試薬は、上記で規定したように、一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚを有し得る。本実施形態において、Ｌは典型的には、基
【００４３】
【化２】
【００４４】
である。
【００４５】
好ましくは、ＸＨはＮＨ２であり、且つＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質のＮ末端である。代替的には、ＮＨ２はリジンアミノ酸側鎖の第１級アミンである。異なる実施形態において、ＸＨはシステインアミノ酸の側鎖のチオール基、ＳＨである。
【００４６】
本発明の別の態様は、上記で規定したような新規化合物及び１個又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００４７】
医薬組成物は、水性懸濁液の形態であってもよい。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合した新規化合物を含有する。医薬組成物は、無菌の注射可能な水性懸濁液又は均質懸濁液の形態であってもよい。懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用する既知の技術に従って製剤化され得る。
【００４８】
医薬組成物は、ヒト用途又は家畜（veterinary）用途で、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻腔内投与、皮内投与、局所投与又は気管内投与され得る。
【００４９】
組成物は製剤添加物をさらに含み得る。製剤添加物とは、Wang他（1999）に記載されている、内的に又は外的にＥＰＯを安定化させることが可能な賦形剤を意味する。賦形剤は、安定化剤、可溶化剤又は金属イオンであり得る。製剤添加物の好適例としては、１個又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、又は組み合わせて使用してもよい。
【００５０】
安定化剤は、典型的には、タンパク質のアンフォールディングに対するギブス自由エネルギー変化の増大を引き起こすタンパク質の変性状態の不安定化により作用する。安定化剤は、好ましくは糖又はポリオール、例えばスクロース、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、マンニトール、ラクトース及びエチレングリコールである。安定化バッファーはリン酸ナトリウムである。
【００５１】
可溶化剤は、好ましくは界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤である。好適例としては、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ Ｆ６８、Ｂｒｉｊ ３５及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００が挙げられる。
【００５２】
金属イオンは、好ましくは二価である。好適な金属イオンとしては、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋が挙げられる。
【００５３】
製剤添加物はまた、ヒト血清アルブミン、ＰＳＡ、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーであり得る。
【００５４】
製剤添加物としての使用に好適なアミノ酸及びアミノ酸誘導体としては、ヒスチジン、グリシン、他の類似のアミノ酸及びアスパラギン酸ナトリウムが挙げられる。
【００５５】
本発明の別の態様は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質のアニオン性多糖誘導体の集団を含む、組成物であって、誘導体が２個〜１２５個の糖ユニットを含み、且つ集団が実質的にタンパク質のＮ末端誘導体のみから成る、組成物である。「集団」とは、組成物中に２個以上の多糖誘導体が存在することを意味する。誘導体は、同一であるか又は異なる数の糖ユニットを含み得る。好ましくは、組成物中の多糖の多分散度は、１．３未満、より好ましくは１．１未満である。好ましい多糖は、上記本発明の他の態様に関して詳述した通りである。
【００５６】
集団において、ＥＰＯの実質的に全てがＮ末端のみで誘導体化される。このことは、集団内のタンパク質の８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％がＰＳＡによりＮ末端のみで誘導体化されることを意味する。
【００５７】
Ｎ末端での誘導体化の程度は、当該技術分野において既知の技法、例えばペプチドマッピング又はエドマン分解によって求められ得る。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、治療で使用するための上記化合物である。
【００５９】
本発明の最後の態様により、本発明者らは、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質の多糖誘導体の製造方法であって、２個〜２００個の糖ユニットを含むアニオン性多糖が、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質と化学的に反応する、製造方法を提供する。
【００６０】
なお、本発明の本態様において、多糖は、ＥＰＯ又はＥＰＯ様タンパク質上の任意の基で反応し得る。例えば、多糖は、アミン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基又はスルフ
ヒドリル基と反応し得る。好ましくは、基は、アミン基、より好ましくは末端アミン基である。アミンは、代替的には、アミノ酸、例えばリジンアミノ酸のアミン側鎖であり得る。多糖はまた、ＥＰＯ上の任意の糖質残基、例えばペンダントグリコン基で反応し得る。
【００６１】
多糖は、当該技術分野で既知の方法によってアミノ酸側鎖と結合し得る。例えば、多糖は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングによってＡｓｐ又はＧｌｕのＣ末端、−ＣＯＯＨ又はカルボキシル側鎖とカップリングし得る。システインアミノ酸のチオール基もｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングによって多糖と結合し得る。これらの方法は、国際公開第ＷＯ０３／０５５５２６号、特に第６頁及び第７頁の表にさらに記載されている。この参考文献において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカップリングは、オリゴ糖部分とＧｌｎの側鎖上のアミド基との結合にも使用されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｒｇ残基及びＨｉｓ残基のイミダゾール基もそれぞれ記載されている。これらの方法をそれぞれ使用して、本発明のＥＰＯを誘導体化し得る。
【００６２】
多糖はＥＰＯの修飾形態とも反応し得る。例えば、ＥＰＯ上の１個又は複数の基は、例えば、還元又は酸化による化学変換を受けた可能性がある。例えば酸化条件を使用して、ＥＰＯの末端アミノ基の代わりに反応性カルボニルを生成することができる。
【００６３】
本発明の方法での使用に好適な多糖は、新規化合物について先に記載した通りである。
【００６４】
本発明の化合物は、従来技術で記載した好適な方法のいずれかによって製造し得る。例えば、典型的な方法は、本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ９２／２２３３１号に記載されている。
【００６５】
典型的には、アニオン性多糖は、ＥＰＯに対する誘導体化の前に活性化されている。例えば、反応性アルデヒド基を有する可能性があり、誘導体化反応が還元条件下で実行され得る。反応性アルデヒド基は、多糖のヒドロキシル基の制御酸化によって生成し得る。最も好ましくは、この反応性アルデヒドは予備段階（ここで多糖を、例えば、水溶液中で過ヨウ素酸ナトリウムを使用する制御酸化条件下で反応させる）で生じる。好ましくは、酸化は化学酸化であるが、この段階を実行することが可能な酵素も使用され得る。反応性アルデヒド基は、多糖の非還元末端又は還元末端に存在し得る。その後、ＥＰＯ、典型的にはＮ末端が反応性アルデヒド基と反応することにより、還元時にＥＰＯのＮ末端誘導体を生成する付加体を得ることができる。
【００６６】
多糖の活性化は、好ましくは多糖の中間鎖切断が実質的に無い、すなわち、実質的に分子量が低減しない条件下で実行されるべきである。酸化剤は、好適には過ルテニウム酸塩、又は好ましくは過ヨウ素酸塩である。酸化は、１ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度の過ヨウ素酸塩を用い、３〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度で、１分〜４８時間の範囲の時間、実行され得る。
【００６７】
誘導体化反応に好適な還元条件は、水素と触媒、又は好ましくはホウ水素化物(borohydride)等の水素化物を利用し得る。これらは固定化してもよい（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉ
ｔｅ（商標）−担持型ホウ水素化物）。好ましくは、水素化ホウ素ナトリウム等のアルカリ金属水素化物が、１μＭ〜０．１Ｍの範囲の濃度、５．０〜１０の範囲のｐＨ、０℃〜６０℃の範囲の温度、及び１分〜４８時間の範囲の期間で、還元剤として使用される。出発原料上のペンダントカルボキシル基が還元されない反応条件が選択される。他の好適な還元剤は、酸性条件下でのシアノホウ水素化物(cyanoborohydride)、例えば、ポリマー担持型シアノホウ水素化物又はアルカリ金属シアノホウ水素化物、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−セレクトリド、トリアセトキシホウ水素化物等である。
【００６８】
多糖の他の活性化誘導体、例えば、本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ０６／００５４０号に記載されている、ＮＨＳ等のペンダント官能基を有するものは、本発明において有用であり得る。
【００６９】
一実施形態において、反応性アルデヒドは、多糖の還元末端に存在し、非還元末端は、ＥＰＯ上のペンダント基と反応しないように不動態化(passivated)されている。
【００７０】
コロミン酸の還元末端の反応性は、タンパク質標的に対しては弱いものの、化学的に規定された複合体の製造においては十分に厄介である。
【００７１】
多糖の還元末端に反応性アルデヒドを有する多糖を調製するのに好適な化学反応は、本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ０５／０１６９７４号に記載されている。この工程は、予備的な選択的酸化段階、続いての還元、及びその後のさらなる酸化により、還元末端にアルデヒドを有し、且つ非還元末端が不動態化された化合物を得ることを包含する。
【００７２】
国際公開第ＷＯ２００５／０１６９７３号には、タンパク質との複合体形成に有用なポリシアル酸誘導体、特に遊離のスルフヒドリル薬物を有するものが記載されている。ポ０リシアル酸化合物をヘテロ二官能性試薬と反応させることにより、スルフヒドリル基との部位特異的複合体形成のためのペンダント官能基を導入する。本発明で使用するアニオン性多糖も、このようにヘテロ二官能性試薬を用いて誘導体化され得る。
【００７３】
多糖は、ＥＰＯと反応する前に誘導体化され得る。例えば、多糖は二官能性試薬と反応し得る。
【００７４】
多糖は、国際公開第ＷＯ２００６／０１６１６８号でさらに記載されているように、予備反応段階（ここで、第１級アミン基、第２級アミン基及びヒドラジンから選択される基が、好ましくはシアル酸である末端糖上に形成される）と、続く反応段階（ここで、これが二官能性試薬と反応することにより、反応中間体が形成される）に付され得る。次いで、中間体はＥＰＯと反応し得る。二官能性試薬は、先に規定したように、一般式Ｚ−Ｒ１−Ｚを有し得る。
【００７５】
本発明者らは、或る特定の反応条件が、ＥＰＯのＮ末端での選択的誘導体化を促進することを見出した。Ｎ末端での選択的反応を促進するために、誘導体化反応は、酸性ｐＨの第１の水溶液中で実行すべきであり、次いで得られた多糖誘導体は、第１の水溶液よりも高いｐＨの第２の水溶液中で精製すべきである。典型的には第１の水溶液のｐＨは４．０〜６．０の範囲であり、第２の水溶液のｐＨは６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．５又は６．５〜８．０の範囲である。誘導体化反応のｐＨが低いと、任意の中間鎖部位ではなく、タンパク質のＮ末端での選択的誘導体化が促進される。
【００７６】
さらに、本発明者らは、或る特定の製剤添加物を使用すると、選択的で安定的な多糖ＥＰＯ誘導体の形成が促進されることを見出した。製剤添加物は、１個又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸から選択され得る。これらは反応媒体に添加してもよく、又は代替的には安定化剤として最終製品組成物に添加してもよい。
【００７７】
本発明の一実施形態において、製剤添加物は、ソルビトール、トレハロース又はスクロースである。異なる実施形態において、製剤添加物は、非イオン性界面活性剤である。製剤添加物は代替的にはＰＳＡ、ＰＥＧ又はヒドロキシ−β−シクロデキストリンから選択されるポリマーであり得る。異なる実施形態において、製剤添加物は、二価金属イオンである。好ましい二価金属イオンとしては、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｓｒ２＋、Ｆ
ｅ２＋、Ｍｇ２＋又はＣａ２＋が挙げられる。
【００７８】
製剤添加物はバッファーであり得る。好ましくは、製剤添加物がバッファーの場合、それはリン酸ナトリウムである。
【００７９】
本発明の方法における多糖誘導体の精製は、当該技術分野において既知の種々の方法を使用して実行され得る。好適な精製方法の例としては、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）、ＡＥＣ（陰イオン交換クロマトグラフィ）及び金属アフィニティクロマトグラフィが挙げられる。
【００８０】
分子量分布の広いポリシアル酸の集団を、多分散度が低めの画分、すなわち、異なる平均分子量の画分に分画し得る。分画は、好ましくは本発明者らの先の国際特許出願第ＷＯ２００５／０１６７９４号及び同第ＷＯ２００５／０３１４９号に記載されているように、好適な塩基性バッファーを溶出に使用する陰イオン交換クロマトグラフィによって実施される。この分画方法は、多糖出発原料及び誘導体に好適である。したがって、この技法は、本発明の必須の工程段階の前後に適用され得る。好ましくは、得られるＥＰＯの多糖誘導体の多分散度は１．３未満、より好ましくは１．２未満、最も好ましくは１．１未満である。
【００８１】
本発明によるＥＰＯの誘導体化の結果、タンパク質の半減期が増大し、安定性が改善し、免疫原性が低減し、且つ／又は溶解度が制御される。それゆえ、ＥＰＯのバイオアベイラビリティ及び薬物動態特性が改善する。モノポリシアル化ＥＰＯ複合体を作製する新規な方法には特別な価値がある。
【００８２】
本発明を、実施例１〜実施例３．１２によって、また添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】従来技術の非還元シアル酸末端ユニットの活性化を示す反応スキーム図である。
【図２】タンパク質のＮ末端又はランダム誘導体化を示す反応スキーム図である。
【図３ａ】Ｔｒｉｐｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＧＰＣ（Viscotek：ＲＩ＋ＲＡＬＳ＋Ｖｉｓｃｏｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用する、異なるｐＨでの２４ｋＤａのコロミン酸（ＣＡ）の分解を示す図である。
【図３ｂ】ＣＡポリマーのゲル浸透クロマトグラフィを示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＰＥＧ化ＥＰＯ及びポリシアル化ＥＰＯの特徴付けを示す図である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（右手側）及びＳＥ−ＨＰＬＣ（左手側）による、ポリシアル化ＥＰＯの特徴付けを示す図である。
【図６】ＳＥ−ＨＰＬＣによる、ＥＰＯ、ポリシアル化ＥＰＯ及びＰＥＧ化ＥＰＯの特徴付けを示す図である。
【図７】ＥＰＯに関するＦＡＣＳデータ（網状赤血球数）を示す図である。
【図８】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図９】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図１０】ＳＥ−ＨＰＬＣによる、ＥＰＯ−ＣＡ複合体の特徴付けを示す図である。
【図１１】非グリコシル化ＥＰＯ対ポリシアル化非グリコシル化ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図１２】非グリコシル化ＥＰＯ対ポリシアル化非グリコシル化ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスを示す図である。
【図１３】ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＮＧ−ＥＰＯ−ＣＡ複合体の特徴付けを示す図である。
【図１４】サンドイッチＥＬＩＳＡによるＥＰＯ−ＰＳＡの検出を示す図である。
【図１５】試薬希釈液中のＥＰＯ−ＰＳＡに対するＥＬＩＳＡの感度を示す図である。
【図１６】サイズ排除ＨＰＬＣによるＥＰＯ複合体の安定性を示す図である。
【図１７】ポリシアル化ＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１８】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す図である（ｎ＝３〜４±ＳＥ）（非近交系雌性マウス；１２週齢；ＳＣ（アルデヒドケミストリー））。
【図１９】ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を示す図である（雌性ウィスターラット；８週齢〜９週齢；ｎ＝５±ＳＥＭ）。
【図２０】ＳＥ−ＨＰＬＣによる、ＮＧ ＥＰＯのＰＥＧ化を示す図である。
【実施例】
【００８４】
材料
炭酸アンモニウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（８ＫＤａ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride)（純度９８％超）、メタ過ヨウ素
酸ナトリウム及び分子量マーカー、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ ２０並びにびＴｒｉｓは、Sigma Chemical Laboratory
、英国から入手した。酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムは、BDH、英国から入手した
。使用するコロミン酸、直鎖α−（２，８）−結合大腸菌Ｋ１ポリシアル酸（平均２２．７ｋＤａ、高多分散度１．３４、３９ｋＤａ、多分散度１．４；１１ｋＤａ、多分散度１．２７）は、Camida、アイルランド及びS.I.I.L. India Ltd.から入手した。他の材料と
しては、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（Aldrich Chemical Company、英国）、透析管（３．５ＫＤａ及び１０ＫＤａカットオフ限界；Medicell International Limited、英国）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＳＰ ＨｉＴｒａｐ、ＰＤ−１０カラム、Ｑ ＦＦ［カラム１ｍｌ又は５ｍｌ］；Ｈｉｔｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム［１ｍｌ又は５ｍｌ］（Pharmacia、英国）、Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（４％〜２０％及び８
％〜１６％）、Ｔｒｉｓ−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー（Novex、英国）が含まれた。脱イオン水は、Ｅｌｇａｓｔａｔ
Ｏｐｔｉｏｎ ４水精製ユニット（Elga Limited、英国）から入手した。使用した全ての試薬は分析用（analytical grade）である。プレートリーダー（Dynex Technologies、英国）をタンパク質アッセイ及びＣＡアッセイにおける分光光度定量に使用した。マウス及びラットは、Harlan、英国から購入し、使用前の少なくとも１週間馴化させた。ＥＰＯはSIIL、インドから入手した。
１．タンパク質及びコロミン酸の定量
他で記載されているように［Gregoriadis他、1993；Fernandes及びGregoriadis、1996
、1997］、レゾルシノール法［Svennerholm、1957］によって、レゾルシノール試薬を用
いた（シアル酸としての）ポリシアル酸の定量的評価を実行した。タンパク質を、ＢＣＡ比色法又は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定した。
２．１．コロミン酸の活性化
新たに調製した０．０２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）溶液（８倍モル過剰）を２０℃でＣＡと混合し、反応混合物を暗所で１５分間、磁気的に撹拌した。次に、２倍容量のエチレングリコールを反応混合物に加えて、過剰のＮａＩＯ４を消費し、混合物をそのまま２０℃でさらに３０分間撹拌した。酸化したコロミン酸を、４℃の０．０１％炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．４）に対して長時間（extensively）（２４時
間）透析した（３．５ＫＤａ分子量カットオフ透析管）。限外濾過（分子量カットオフ３．５ｋＤａに対する）を使用して、透析管からＣＡＯ溶液を濃縮した。必要容量まで濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、さらに使用するまで−４０℃で保存した。代替的には、ＣＡＯを、エタノールによる沈殿（２回）によって反応混合物から回収した。
２．２．ＣＡ及び誘導体の酸化状態の定量
カルボニル化合物との相互作用で難溶性の２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いて、コロミン酸酸化度の定性的評価を実行した。非酸化コロミン酸（ＣＡ）／酸化コロミン酸（ＣＡＯ）を２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に加え、溶液を振盪した後、結晶性の沈殿物が観察されるまで３７℃で放置した［Shriner他、1980］。ＣＡの酸化度（定量的）を、アルカ
リ性溶液中でのフェリシアン化物イオンのフェロシアン化第二鉄（プルシアンブルー（Persian blue））への還元に基づく方法［Park及びJohnson、1949］を用いて測定した（こ
れは次に６３０ｎｍで測定される）。この場合、グルコースを標準として使用した。
２．３．ゲル浸透クロマトグラフィ
コロミン酸試料（ＣＡ及びＣＡＯ）をＮａＮＯ３（０．２Ｍ）、ＣＨ３ＣＮ（１０％；５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、２×ＧＭＰＷＸＬカラムでクロマトグラフィにかけ、屈折率により検出した（ＧＰＣ系：ＶＥ１１２１ ＧＰＣ溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０ ＲＩ検出器及びＴｒｉｓｅｃ ３ソフトウェアによる照合、Viscotek Europe Ltd）。試料（５ｍｇ
／ｍｌ）を０．４５μｍのナイロン膜で濾過し、移動相として０．２Ｍ ＮａＮＯ３ 及びＣＨ３ＣＮ（１０％）を用いて０．７ｃｍ／分で流した。
【００８５】
結果を図３ｂ並びに第５表及び第６表に示す。
２．４．コロミン酸の安定性
ＰＥＧ化の化学反応に関するルールをそのままポリシアル化に応用することができないのは、これらの分子の生理化学的特性が異なるからである。ＰＳＡは、酸に不安定なポリマーであると共に、中性付近のｐＨでは何週間も安定である（図３ａ）。図３ａの結果から、ｐＨ６．０及び７．４では、ＣＡは８日間安定であり、ｐＨ５．０では緩徐に分解し（４８時間後、初期分子量の９２％）、ｐＨ４．０では緩徐に分解する（４８時間後、初期分子量の７０％）ことが示される。ポリシアル酸は親水性が高いが、ＰＥＧは両親媒性である。ＰＥＧ化に使用される条件を使用してポリシアル化を実行すると、多くの場合、タンパク質の凝集及び沈殿が観察される。
３．製剤添加物を含むＮ末端タンパク質−ＣＡ複合体の調製
３．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体（Ｎ末端法）の調製
ＥＰＯを溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、０．３４ｍｇ／ｍｌ；比活性：１１０,０００Ｕ／ｍｇ、分子量：３０６００）
として供給し、−３２℃で保存し、タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を、２ｍｌのエッペンドルフチューブに採取した。必要量（２５倍モル過剰）のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体ＣＡに加え、緩やかに混合した。反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌとなるように、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、最終反応混合物のｐＨをチェックした（必要に応じて、ｐＨを６．０に調整する）。チューブをシールし、所望の温度で２４時間撹拌するか、又は反応混合物を最初に室温（２２℃）で８時間インキュベートした後、４℃±１℃で一晩（１４時間）保持した。インキュベーション後、必要な試料を採取した（例えば、活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ用）。
３．１．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け（Ｎ末端法）
残りの反応混合物試料を、最終濃度が２Ｍとなるように、ＨＩＣバッファーＡ１（３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で希釈し、室温で１．５ｍｌ／分の速度でＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ２（２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）（少なくとも６カラム容量）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）（６ＣＶ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上（４℃±１℃）に保持した。
【００８６】
タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ/ｍｌのＥＰＯの吸光
度は約０．７４３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を採取した。ＣＡの分子量が、ＳＥ−ＨＰＬＣによる複合体及びＥＰＯの分離には小さ過ぎる場合（例えば、２２ｋＤａ）、非複合体形成ＥＰＯの分離を陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）を使用して実施した。ＡＥＣでは、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＡＥＣ バッファーＡ（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）（試料１ｍｌ＋ＡＥＣバッファーＡ ５ｍｌ）で希釈し、１．０ｍｌ／分でＡＥＣバッファーＡを用いて事前に平衡化したＥＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＡＥＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出し、２．０ｍｌ／分での第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
【００８７】
代替的には、精製は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって行うことができる（例えば、使用するＣＡが高分子量、例えば、３９ｋＤａの場合に、ＥＰＯから複合体を分離する）。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ/ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．
７４３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を採取した。
【００８８】
一定分量をタンパク質アッセイ及びＣＡアッセイ用に取り出した。残りの溶液は、使用するまで−２０℃で保存した。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。フェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしたマウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を誘導する際のＥＰＯ試料及びＮＧ ＥＰＯ試料の活性の定量を使用した。プロトコルは、Krystal（1972）により報告されている方法
に基づき改作した。アッセイは、赤血球前駆細胞へのＥＰＯの添加及び３Ｈ−チミジン取り込み速度の定量によるＤＮＡ複製速度の測定に基づく。Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態（ＰＫ）試験及び薬力学（ＰＤ）試験を行った。
３．２．ＥＰＯ−ＣＡ複合体（ランダム）の調製
ＥＰＯを溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、０．３４ｍｇ／ｍｌ；比活性：１１００００Ｕ／ｍｇ、分子量：３０６００）として供給し、−３２℃で保存し、タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を２ｍｌのエッペンドルフチューブに採取した。必要量のコロミン酸を取り、タンパク質溶液を固体ＣＡに加え、緩やかに混合した。反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ/ｍｌとなるよ
うに、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、ボルテックスし、最終反応混合物のｐＨをチェックした（必要に応じて、ｐＨを７．４に調整する）。チューブをシールし、所望の温度（４℃±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベーション後、必要な試料を採取した（例えば、活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ用）。
３．２．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体（ランダム）の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料を、最終濃度が２Ｍとなるように、ＨＩＣバッファーＡ１（３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で溶解し、室温で１．５ｍｌ／分の速度でＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ２（２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）（少なくとも６カラム容量）で洗浄し、洗浄画分を回収及び標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）（６ＣＶ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上（４℃±１℃）に保持した。
【００８９】
タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。ＣＡの分子量が、ＳＥ−ＨＰＬＣによる複合体及びＥＰＯの分離には小さ過ぎる場合（例えば、２２ｋＤａ）、非複合体形成ＥＰＯの分離を陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＸＣ）を使用して実施した。ＡＸＣでは、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＡＸＣバッファーＡ（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）（試料１ｍｌ＋ＡＸＣバッファーＡ ５ｍｌ）で希釈し、１．０ｍｌ／分でＡＸＣバッファーＡで事前に平衡化したＡＸＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＡＸＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出し、２．０ｍｌ／分での第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
【００９０】
代替的な精製は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって行うことができる（例えば、使用するＣＡが高分子量、例えば、３９ｋＤａの場合に、ＥＰＯから複合体を分離する）。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ/ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４
３である）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を採取した。
３．３．グリコンケミストリー
ヒドラジドコロミン酸を、最終ＣＡ濃度が１０ｍＭとなるようにＥＰＯ溶液に溶解した。溶液のｐＨを５．５に調整した。必要容量のＮａＩＯ４溶液のＮａＯＡｃ溶液を、最終濃度が５ｍＭ ＮａＩＯ４となるように加えた。ＮａＨＳＯ３（ＮａＨＳＯ３の最終濃度２０ｍＭ）を用いて反応を停止した。反応混合物を室温でインキュベートした。最後に、必要容量のＮａＣＮＢＨ３溶液のＮａＯＡｃ溶液を、最終濃度が５０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３となるように加えた。振盪器上で反応を４℃±１℃で１時間継続した。インキュベーション後、ＳＤＳ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、活性アッセイに必要な試料を採取した。
３．３．１．ＥＰＯ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け（グリコンケミストリー）
残りの反応混合物試料を、最終濃度が２Ｍとなるように、ＨＩＣバッファーＡ１（３Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で希釈し、室温で１．５ｍｌ／分の速度でＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した（Ｌ１〜Ｌｘ）。カラムをＨＩＣバッファーＡ２（２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）（少なくとも６カラム容量）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢ（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）（６ＣＶ）を回収及び標識した。精製中は、試料を氷上（４℃±１℃）に保持した。
【００９１】
タンパク質濃度をＵＶ（２７６ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３であった）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。ＣＡの分子量が、ＳＥ−ＨＰＬＣによる複合体及びＥＰＯの分離には小さ過ぎる場合（例えば、２２ｋＤａ）、非複合体形成ＥＰＯの分離を、陰イオン交換クロマトグラフィ陰イオン交換（ＡＸＣ）を使用して実施した。ＡＸＣでは、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＡＸＣバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で希釈し（試料１ｍｌ＋ＡＸＣバッファーＡ ５ｍｌ）、１．０ｍｌ／分でＡＸＣバッファーＡで事前に平衡化したＡＸＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＡＸＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄し、画分を回収及び標識した。生成物を溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出し、２．０ｍｌ／分での第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。
【００９２】
代替的な精製は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって行うことができる（例えば、使用するＣＡが高分子量、例えば、３９ｋＤａである場合に、ＥＰＯから複合体を分離する）。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。
３．４．ＥＰＯのＰＥＧ化：
ＥＰＯ（３０．６ｋＤａ）を溶液（５％ソルビトール、０．０２５ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を含有する１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０中、０．９５４ｍ
ｇ／ｍｌ）として供給し、２℃〜８℃で保存した。ＥＰＯ溶液を濃縮して、約１．０ｍｇ/ｍｌの溶液とした。必要量のＥＰＯをエッペンドルフチューブに取り、氷上に載置した
。複合体形成用に添加したＰＥＧの量は、式：
ＰＥＧの重量＝{タンパク質の量（ｇ）／（タンパク質の分子量）}×（ＰＥＧの分子量）×（ＰＥＧのモル過剰）
に基づいて計算した。
【００９３】
必要量のＰＥＧ ２０Ｋを秤量した。１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５％ソルビトール、ｐＨ５．５（ここで使用するのは、最終反応容量の２０％容量）中に可溶化し、混合物を、全てのＰＥＧが溶解するまで緩やかにボルテックスした後、濾過して新しいエッペンドルフに入れるか、又は４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいエッペンドルフに移すことにより、いかなる凝集／沈殿物質も除去した。ＰＥＧが２５倍モル過剰となるように、必要量のＥＰＯをタンパク質溶液をＰＥＧ溶液に加え、４℃±１℃で緩速振盪器上に反応混合物を保持することによって緩やかに混合した。最終反応混合物中で５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌとなるように、必要容量の１００ｍｇ／ｍｌ ＮａＣＮＢＨ３溶液を加え、緩やかに混合し、最終反応混合物のｐＨをチェックし、必要に応じて、４℃±１℃の１Ｍ ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いて５．５に調整した。最後に、反応の容量を、反応混合物中のタンパク質濃度が１ｍｇ/ｍｌとなるように、２０ｍＭ ＮａＯＡＣ、５％ソルビトー
ル、ｐＨ５．５を使用して調整した。チューブをシールし、所望の温度（４℃±１℃）で２４時間撹拌した。反応を適切な方法によって停止し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを使用）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム）用の試料を採取し、反応混合物のｐＨをチェックした。いかなる沈殿物も除去するために、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析及び精製前に反応混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心した。好ましいＳＥ−ＨＰＬＣ用バッファーは０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）であった。結果を図５に示す。
３．５．Ｎ末端非グリコシル化エリスロポエチン（ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡ）複合体の調製
ＮＧ ＥＰＯを溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．６５中、０．１８ｍｇ／ｍｌ；比活性：１０００００Ｕ／ｍｇ；分子量：１９０００）として供給し、−３２℃で保存し、タンパク質を２℃〜８℃で解凍し、必要量を２ｍｌのエッペンドルフに採取した。複合体形成に必要なコロミン酸（例えば、酸化コロミン酸又は非酸化コロミン酸）の量を計算した。必要量のコロミン酸を秤量した。タンパク質溶液を固体ＣＡに加え、穏やかに混合した。反応混合物中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ又は３．１７ｍｇ／ｍｌとなるように、必要容量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を、反応混合物に加えた。最終反応混合物をボルテックスし、ｐＨをチェックした（必要に応じて、ｐＨを７．４に調整した）。チューブをシールし、所望の温度（４℃±１℃）で２４時間撹拌した。インキュベーション後、活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ等に必要な試料を採取した。
３．５．１．ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡ複合体の精製及び特徴付け
残りの反応混合物試料をＨＩＣバッファーＡ（１．２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．３）で希釈し（試料１ｍｌ＋バッファーＡ ４ｍｌ）、ＨＩＣバッファーＡで事前に平衡化したＨＩＣカラムにローディングした。ローディング画分を回収及び標識した。カラムをＨＩＣバッファーＡ（少なくとも１０ｍｌ）で洗浄した。洗浄画分を回収し標識した。生成物をＨＩＣバッファーＢで溶出し、第１の画分（０．５ｍｌ）及びその後の画分（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を回収及び標識した。精製中、試料を氷上に保持した。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのｎＥＰＯの吸光度は約０．７４３であった）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。反応条件により、反応混合物中に有意な遊離のＮＧ ＥＰＯが存在しなかったため、さらなる精製は不必要であった。ＮＧ
ＥＰＯが反応混合物中に存在した場合には、タンパク質を含有するＨＩＣ画分をＶｉｖａｓｐｉｎ ６（５０００ ＭＷＣＯ）を使用して濃縮し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって精製を行った。タンパク質濃度をＵＶ（２８０ｎｍ）によって分析した（１ｍｇ／ｍｌのＮＧ
ＥＰＯの吸光度は約０．７４３である）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。
【００９４】
一定分量をタンパク質アッセイ及びＣＡアッセイ用に取り出した。残りは、使用するまで−２０℃で保存した。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。
３．６．ＥＰＯ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣ
４℃で冷却したJascoのＡＳ−２０５７ ｐｌｕｓオートサンプラー及びJascoのＵＶ−９７５ ＵＶ／ＶＩＳ検出器を備えたＬｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Jasco）でＨＰＬＣを実施した。データをＩＢＭ／ＰＣ上のＥＺｃｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅソフ
トウェアによって記録した。ＳＥＣ試料を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムで、０．１Ｍリン酸Ｎａ、ｐＨ６．９の定組成移動相を用いて分析した（図５）。図６は室温での唯一のピーク＝７６．４０８を示し、これはＥＰＯに帰属される。
【００９５】
図５の左手側に示すＳＥＣのピーク表は以下の通りである：
【００９６】
【表１】
【００９７】
３．７．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング＆ＥＬＩＳＡ
４％〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。試料を、還元バッファー又は非還元バッファーのいずれかで希釈し、タンパク質５．０μｇを各ウェルにローディングした。ゲルをトリグリセリンバッファー系で試験し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色した。抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロッティングを実施した（図４）。図４はＥＰＯ製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す（部位特異的、Ｎ末端）。
３．８．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性
フェニルヒドラジンの腹腔内注射を通じて人工的に貧血状態にしたマウスの脾臓から単離した赤血球前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を誘導する際のＥＰＯ試料の活性の定量を使用した。プロトコルは、Krystal［1972］により報告されている方法に基づき改作
した。アッセイは、赤血球前駆細胞へのＥＰＯの添加及び３Ｈ−チミジン取り込み速度の定量によるＤＮＡ複製速度の測定に基づく。
３．９．安定性試験
無菌のＥＰＯ複合体を２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４；５％ソルビトール及び０．０２５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０中で、４℃で６週間保存した。下記条件の下、ＳＥＣカラムを使用して試料のＳＥ−ＨＰＬＣを実施した：注入容量：１００μｌ、流速：０．２５０ｍｌ／分、ランニングバッファー：０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ：６．９。
３．１０．ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力
ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでの効力を、雌性マウスＢ６Ｄ２Ｆ１（７週齢〜８週齢）で試験し、５μｇ〜１５μｇのタンパク質用量（同一活性）をマウスに皮下注射した。これらの動物は、４匹ずつ７つの群に分けた。以下のようにＥＰＯ製剤を各群の各動物に与えた：ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＰＳＡ複合体、ＰＢＳ、Ａｒａｎｅｓｐ（５μｇ）。各動物から血液５０μｌを採取し、ｒｅｔｉｃ ｃｏｕｎｔ染料で染色した後、ＦＡＣＳによって分
析した（図８及び図９）。
【００９８】
十分に混合した全血５μｌを、Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ試薬１ｍｌと混合し、暗所で室温で３０分間インキュベートした。その後、試料をＦＡＣＳ機器の助けを借りて網状赤血球を計数することによって分析した。
３．１１．Ｅｌｉｓａ
ＥＰＯ−ＰＳＡをプレート全体にコーティングされた抗ＰＳＡ抗体によって捕捉した。捕捉されたＥＰＯ−ＰＳＡを抗ＥＰＯ抗体を用いて検出し、ＥＰＯとＰＳＡとの複合体のみを検出した。
３．１２．ｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス
ＥＰＯ製剤のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスをマウスで試験した。適切量のタンパク質用量をマウスに皮下注射及び静脈内注射した。ＥＰＯ製剤を１２５Ｉで放射標識し、血液試料の放射能を頻繁に測定した。
結果
ＣＡの活性化及び酸化度の定量
Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基の直鎖α−２，８−結合ホモポリマーである、コロミン酸（ＣＡ）を使用した。コロミン酸の酸化への曝露を室温で２０ｍＭ過ヨウ素酸塩を使用して１５分間実行した。過ヨウ素酸塩処理後の内部α−２，８結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基の完全性をゲル浸透クロマトグラフィによって分析し、酸化コロミン酸（ＣＡＯ）に対するクロマトグラフが得られ、物質を天然のＣＡの物質と比較した。酸化ＣＡ及び天然ＣＡがほぼ同一の溶出プロファイルを示すことが分かり、逐次酸化段階がポリマー鎖の有意な断片化を引き起こすという証拠は無かった。
【００９９】
ＣＡの酸化状態の定量測定を、標準としてグルコースを使用して、フェロシアン化物（プルシアンブルー）へのアルカリ性溶液中でのフェリシアン化物イオンの還元［Park及びJohnson、1949］によって実施した。第１表は、酸化コロミン酸が、化学量論量を上回る
（１００％超の）量の還元物質、すなわち、１１２ｍｏｌ％の見かけ上のアルデヒド含量（還元末端のヘミケタール及び（他の末端、非還元末端に）導入されたアルデヒドの還元力の組合せを含む）を有することが分かった。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
ＥＰＯ複合体の調製、精製及び特徴付け
低ｐＨ（ｐＨ５．５）及びランダムｐＨ（７．４）並びに４℃±１℃で反応を行うことによってＮ末端選択的にエリスロポエチン（ＥＰＯ）のコロミン酸（ＣＡ）複合体を調製
及び精製する手順は、上記に詳述されている。これには、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下での複合体形成、続く遊離のＥＰＯを除去するためのイオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）を使用する精製、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によるＣＡの除去が包含される。Ｎ末端のα−アミノ基の選択的誘導体化が優勢となるように、また反応中のＥＰＯの凝集を最小限にするために低ｐＨを使用した。最終反応バッファーの組成は、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中、５％ソルビトール、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐＨ５．５）であった。
【０１０２】
ＥＰＯ−ＣＡ複合体の形成をＳＥ−ＨＰＬＣ（ＥＰＯと比較しての、ＥＰＯ−ＣＡの保持時間の変化；両方の部分が同時に溶出もする）；イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムへの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；高分子量種へ向かってのバンドの広がり及びシフト）によって確認した（図４）。ポリシアル化試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性であり、未処理のＥＰＯよりも著しく優れたプロファイル（ＰＫ及びＰＤ）を示した。図１１及び図１２はｉｎ ｖｉｖｏでの結果を示す。
【０１０３】
図５の左手側は、２４時間後のＥＰＯ−ＣＡ ３９ｋＤａ複合体形成のＳＥ−ＨＰＬＣを示す。第３表はピーク解析表である。特徴付け条件：カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、バッファー：炭酸水素アンモニウム０．１５Ｍ、ｐＨ：７．８。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
誘導体化の程度は、ポリシアル化ＥＰＯよりもＰＥＧ化ＥＰＯの方が大きいことが分かった（図６）。これは、ＰＥＧの不活性な性質及びシアル酸の帯電した性質に起因する可能性がある。ＦＡＣＳデータからの網状赤血球数は、ＥＰＯよりもＰＳＡ−ＥＰＯ複合体の方が多かった（図７）。ＥＰＯ−ＣＡＯ複合体の精製後、ＳＥＣ ＨＰＬＣからのクロマトグラム上に有意なＥＰＯは観察されず、誘導体化は、ＳＥ−ＨＰＬＣでの保持時間の変化並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の高分子量バンドの広がり及びシフトによって示された。ＥＰＯのポリシアル化は、マウス抗ＰＳＡ抗体を使用するウエスタンブロッティングによっても示された。静脈内投与では、ＰＳＡ−ＥＰＯ複合体のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスプロファイルは、ＥＰＯと比べて優れていることも分かり（図８）、曲線下面積は７．１倍増大した。同様にＥＰＯ−ＰＳＡの皮下投与もＥＰＯと比較してより大きな保持を示し、曲線下面積は２．５倍増大した。ＥＰＯのポリシアル化が反応混合物のインキュベーション時間、モル過剰及びｐＨに比例することも分かった。ポリシアル化ＮＧ ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスプロファイル（静脈内及び皮下）は、ＮＧ ＥＰＯよりも良好であることが分かった（図１１及び図１２）。幾つかのＳＤＳゲルにおいて、ＥＰＯのジポリシアル化も観察された。ＥＰＯ−ＰＳＡ複合体は、ＥＬＩＳＡ法によっても確認した（図１４及び図１５）。赤血球造血現象は、ＥＰＯと比較してＥＰＯ−ＰＳＡ複合体の方が大きいことが分かり、６ＫＤａ〜１５ＫＤａではポリマーの分子量に比例することが分かった（図１８）。シアル酸の鎖が大きくなるにつれて赤血球造血の現象は低減するため、１５ＫＤａがＥＰＯに最適な鎖長であることが分かった。これは、受容体から
の反発で生じるポリマーの負に帯電した性質に起因する可能性がある。この試験は、図１８の助けを借りて確認した。ＡｒａｎｅｓｐのＥｍａｘは、臨床的に良好ではなく、血栓症をもたらし、骨髄枯渇の原因となり得るＥＰＯ−ＰＳＡよりも遥かに大きいことが分かり、処置後、ベースライン未満まで網状赤血球を低下させることも分かった。ＥＰＯ−ＰＳＡは、ＥＰＯよりも著しく優れていることが分かり、ＥＰＯ−ＰＳＡは、ＥＰＯ−ＰＥＧと同様に優れていることが分かり、ＥＰＯ−ＰＳＡも一定の赤血球造血をもたらす。
【０１０６】
ＰＳＡ複合体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイにおいて活性であることが分かった。ＰＳＡ−ＥＰＯ複合体がＰＥＧ複合体と同様に良好であり、ＥＰＯよりもはるかに優れていることがｉｎ ｖｉｖｏでの効力試験から示される（図８及び図９）。
【０１０７】
ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡ複合体の形成をＳＥ−ＨＰＬＣ（ＮＧＥＰＯと比較しての、ＮＧ ＥＰＯ−ＣＡの保持時間の変化；両方の部分が同時に溶出もする）；イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣカラムへの複合体の結合）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；高分子量種のバンドのシフト）によって確認した。図は、２４時間後のＥＰＯ−ＣＡ ３９ｋＤａ複合体形成を示す。ポリシアル化試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性であり、未処理のＮＧｅｐｏよりも著しく優れたプロファイル（ＰＫ及びＰＤ）を示した。
【０１０８】
図１０は、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。下記第４表にピーク解析を示す。特徴付け条件−カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、バッファー：炭酸水素アンモニウム０．１５Ｍ、ｐＨ：７．８。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
図１２は、ｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスの結果を示す。ＰＳＡ−ＮＧ ＥＰＯは、ＮＧ ＥＰＯと比べて、著しく優れたプロファイルを示した。
【０１１１】
第５表は、使用した各種パラメータの値を示し、第６表は、ＣＡ画分の分子量及び多分散度を示す。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
参照文献
【０１１５】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰＯ又はＥＰＯホモログのＮ末端多糖誘導体である化合物であって、該多糖がアニオン性であり、且つ２個〜１２５個の糖ユニットを含み、該ＥＰＯホモログが、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する、化合物。
【請求項２】
前記多糖が、ポリシアル酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記多糖が、シアル酸ユニットのみから成る、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログが、前記多糖の還元末端ユニットで誘導体化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、ｍは、少なくとも１であり、
ＸＢは、ＥＰＯ又はＥＰＯホモログであるＢ−ＸＨに由来し（ここで、ＸＨは、ＮＨ２であり、且つ前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯ様タンパク質のＮ末端である、又は、ＮＨ２であり、且つリジンアミノ酸側鎖のアミン基である）、
Ｌは、結合、結合基であるか、又はポリペプチドを含み、
ＧｌｙＯは、アニオン性糖ユニットであり、
前記結合基は、存在すれば、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｙは、ＮＲ２又はＮＲ２−ＮＲ２であり、Ｒ１は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレン（これらのいずれかはカルボニル結合、エステル結合、スルフィド結合、エーテル結合、アミド結合及び／又はアミン結合によって置換及び／又は介在されていてもよい）から成る群より選択される二官能性有機基であり、
且つＲ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキルであり、
該ＥＰＯホモログは、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する）の化合物。
【請求項６】
Ｌが結合であるか、又は基
【化２】
である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＥＰＯがグリコシル化され、且つ２個〜１００個の糖ユニットを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＥＰＯがグリコシル化されず、且つ８０個〜１８０個の糖ユニットを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、及び１個又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
治療で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ＥＰＯ又はＥＰＯホモログのＮ末端多糖誘導体の製造方法であって、２個〜２００個の糖ユニットを含むアニオン性多糖を、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログと化学的に反応させ、該ＥＰＯホモログが、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する、製造方法。
【請求項１２】
前記アニオン性多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログと反応する反応性アルデヒド基を有し、且つ前記誘導体が還元条件下で生成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応性アルデヒド基が前記多糖の非還元末端に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログのアミン基と反応する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミンが末端アミン基である、又は、
前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログのリジンアミノ酸に由来する、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アニオン性多糖又は反応中間体が、酸性ｐＨの第１の水溶液中で、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログの末端アミン基と反応し、且つ得られた多糖誘導体を、前記第１の水溶液よりも高いｐＨの第２の水溶液中で精製する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の水溶液の前記ｐＨが４．０〜６．０の範囲であり、前記第２の水溶液の前記ｐＨが６．５〜９．０の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログ上の糖質残基で反応する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖質残基が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログ上のペンダントグリコン基に位置する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１個又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸から選択される製剤添加物の存在下で実行される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記製剤添加物が、バッファーであり、且つ該バッファーがリン酸ナトリウム／酢酸ナトリウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＰＯ又はＥＰＯホモログの多糖誘導体の化合物であって、
該多糖がアニオン性であり、且つ２０個〜６０個の糖ユニットを含み、
更に、該多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログ上の糖質残基で化学的に反応し、該ＥＰＯホモログが、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する、化合物。
【請求項２３】
前記多糖が、ポリシアル酸である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
請求項１８又は１９に記載の方法により得られる、ＥＰＯ又はＥＰＯホモログの多糖誘導体の化合物。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の化合物、及び１個又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
治療で使用するための、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のＥＰＯ又はＥＰＯホモログの多糖誘導体の化合物。
【請求項１】
ＥＰＯ又はＥＰＯホモログのＮ末端多糖誘導体である化合物であって、該多糖がアニオン性であり、且つ２個〜１２５個の糖ユニットを含み、該ＥＰＯホモログが、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する、化合物。
【請求項２】
前記多糖が、ポリシアル酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記多糖が、シアル酸ユニットのみから成る、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログが、前記多糖の還元末端ユニットで誘導体化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、ｍは、少なくとも１であり、
ＸＢは、ＥＰＯ又はＥＰＯホモログであるＢ−ＸＨに由来し（ここで、ＸＨは、ＮＨ２であり、且つ前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯ様タンパク質のＮ末端である、又は、ＮＨ２であり、且つリジンアミノ酸側鎖のアミン基である）、
Ｌは、結合、結合基であるか、又はポリペプチドを含み、
ＧｌｙＯは、アニオン性糖ユニットであり、
前記結合基は、存在すれば、一般式−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｙは、ＮＲ２又はＮＲ２−ＮＲ２であり、Ｒ１は、アルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレン（これらのいずれかはカルボニル結合、エステル結合、スルフィド結合、エーテル結合、アミド結合及び／又はアミン結合によって置換及び／又は介在されていてもよい）から成る群より選択される二官能性有機基であり、
且つＲ２は、Ｈ又はＣ１−６アルキルであり、
該ＥＰＯホモログは、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する）の化合物。
【請求項６】
Ｌが結合であるか、又は基
【化２】
である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＥＰＯがグリコシル化され、且つ２個〜１００個の糖ユニットを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＥＰＯがグリコシル化されず、且つ８０個〜１８０個の糖ユニットを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、及び１個又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
治療で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ＥＰＯ又はＥＰＯホモログのＮ末端多糖誘導体の製造方法であって、２個〜２００個の糖ユニットを含むアニオン性多糖を、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログと化学的に反応させ、該ＥＰＯホモログが、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する、製造方法。
【請求項１２】
前記アニオン性多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログと反応する反応性アルデヒド基を有し、且つ前記誘導体が還元条件下で生成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応性アルデヒド基が前記多糖の非還元末端に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログのアミン基と反応する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミンが末端アミン基である、又は、
前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログのリジンアミノ酸に由来する、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アニオン性多糖又は反応中間体が、酸性ｐＨの第１の水溶液中で、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログの末端アミン基と反応し、且つ得られた多糖誘導体を、前記第１の水溶液よりも高いｐＨの第２の水溶液中で精製する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の水溶液の前記ｐＨが４．０〜６．０の範囲であり、前記第２の水溶液の前記ｐＨが６．５〜９．０の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログ上の糖質残基で反応する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖質残基が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログ上のペンダントグリコン基に位置する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１個又は複数のバッファー、安定化剤、界面活性剤、塩、ポリマー、金属イオン、糖、ポリオール又はアミノ酸から選択される製剤添加物の存在下で実行される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記製剤添加物が、バッファーであり、且つ該バッファーがリン酸ナトリウム／酢酸ナトリウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＰＯ又はＥＰＯホモログの多糖誘導体の化合物であって、
該多糖がアニオン性であり、且つ２０個〜６０個の糖ユニットを含み、
更に、該多糖が、前記ＥＰＯ又は前記ＥＰＯホモログ上の糖質残基で化学的に反応し、該ＥＰＯホモログが、配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の類似性又は相同性を有する、化合物。
【請求項２３】
前記多糖が、ポリシアル酸である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
請求項１８又は１９に記載の方法により得られる、ＥＰＯ又はＥＰＯホモログの多糖誘導体の化合物。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の化合物、及び１個又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
治療で使用するための、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のＥＰＯ又はＥＰＯホモログの多糖誘導体の化合物。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２０１３−１００３０９（Ｐ２０１３−１００３０９Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２８７３２４（Ｐ２０１２−２８７３２４）
【出願日】平成２４年１２月２８日（２０１２．１２．２８）
【分割の表示】特願２００９−５２１３４３（Ｐ２００９−５２１３４３）の分割
【原出願日】平成１９年７月２５日（２００７．７．２５）
【出願人】（５０７０４２５４５）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１２月２８日（２０１２．１２．２８）
【分割の表示】特願２００９−５２１３４３（Ｐ２００９−５２１３４３）の分割
【原出願日】平成１９年７月２５日（２００７．７．２５）
【出願人】（５０７０４２５４５）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
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