エリンギと五加皮の混合生薬抽出物、およびこれを含む骨成長促進活性を有する組成物
【課題】本発明は、エリンギと五加皮の混合生薬抽出物、およびこれを含む骨成長促進活性を有する物質を提供することを目的とする。
【解決手段】エリンギの水抽出物またはこれと均等なエリンギ抽出物と、五加皮の水抽出物またはこれと均等な五加皮抽出物とを用いて、骨芽細胞増殖および分化促進活性を有する生薬材抽出物混合物（組成物）を構成する。
【解決手段】エリンギの水抽出物またはこれと均等なエリンギ抽出物と、五加皮の水抽出物またはこれと均等な五加皮抽出物とを用いて、骨芽細胞増殖および分化促進活性を有する生薬材抽出物混合物（組成物）を構成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエリンギと五加皮から得られる生薬材抽出物混合物、およびこれを有効成分として骨成長促進機能を示す組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）とはヒラタケ科ヒラタケ属に属する死物寄生菌で、亜熱帯地方の大草原に自生し、ヨーロッパでは草原の茸（Ｂｏｌｅｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｐｐｅｓ）、または王ヒラタケ（Ｋｉｎｇ ｏｙｓｔｅｒ ｍｕｓｈｒｏｏｍ）と呼ばれている。東医宝鑑によると、エリンギは無毒で、味が甘く、香りが強い。胃腸の機能を整え、気の循環を促すため、手足がしびれて力が入らない時や、腰や膝にしびれがある時に好適な薬材である。エリンギの成分は未だ完全には解明されていないが、アルカリ性食品であり、コレステロール値を低下させ、抗癌作用があるという報告もある。蛋白質とビタミンが豊富で、へん桃腺、乳腺炎、脱下症および各種成人病に薬効があると言われる。特に、日本ではアルカリ性で抗癌効果が大きい自然健康食品として広く注目を集めている。
【０００３】
一方、「五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ Ｃｏｒｔｅｘ）」とは、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）に属する潅木植物で、北半球でも極東アジアのみに分布する。韓国では、絶滅危機にある野生保護植物である。五加皮の種類には、刺五加皮、一般五加皮および香五加皮があり、漢方では毒性も副作用もない上薬に分類され、根と皮を薬材として使用する。葉にはチイサノサイド（Ｃｈｉｉｓａｎｏｓｉｄｅ）が含まれていて薬理的機能を有し、根には五加皮配糖体のみでなく、ジリンギン（Ｓｙｌｒｇｉｎ）、クマリン配糖体などが含まれている。五加皮には、五加皮配糖体であるアカントサイド（Ａｃａｎｔｈｏｓｉｄｅ Ｂ， Ｄ）と、免疫性を高める水溶性多糖体とがある。
【０００４】
五加皮は、味は辛くかつ苦く、性は温、肝経や神経に作用して風湿を取り除き、益気昇精を助けると言われている。また、五労（五臓の虚弱により生じる虚労）と七傷（虚弱により生じる男性の七種類の症状）を補い、足が不自由な場合にも使われてきた。長期服用により、気の向上、胃の保護、精力増強、精神集中、意欲向上、疲労回復および老化防止の効果があると言われ、体の中の汚れた血をきれいにするとも言われている。さらに、腰や脊椎の痛み、男性の陰萎症、嚢湿および女性の陰痒症など様々な症状を治すと言われている。
【０００５】
一方、日本は高齢化社会への急速な進展とともに少子化も進んでおり、子供の健康に対する関心が高くなっている中で、特に子供の成長問題は両親にとって大きな関心を引く分野である。そこで、成長ホルモン分泌不全性低身長症および骨形成不全症などの明らかな病気の場合、成長ホルモン注射療法や薬物治療を受けることができ、特に小児の低身長症への治療に成長ホルモン注射を用いる場合はその費用を「小児慢性特定疾患治療研究事業」より、各家庭の所得に応じて助成を受けることができる。
【０００６】
しかしながら、２０歳に到達していない未成年の子どもであっても、男子は１５６．４ｃｍ、女子は１４５．４ｃｍの身長を超えるまたは２０歳以上の成人の方が成長ホルモン注射を受ける場合、健康保険適用外になり、非常に高額な費用を負担することになる。よって、単なる成長不振による身長の伸び悩みの場合は、その対応が難しく、一般的には運動やカルシウム製剤等健康食品の長期摂取に頼ることになるが、確実な効果を期待し難い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｗａｎｇ， Ｄ．Ｖ．Ｃ．， Ｃａｎ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． Ｊ． １５５：１２３７， １９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のような成長不振は、主に２０歳以下の子供と青少年時代の問題であり、長期投与が必須であるため、副作用がなく、優れた効果を有する新しい物質が求められているのが実情である。
【０００９】
そこで、本発明は、長期投与した場合にも副作用がなく、成長不振に対して優れた効果を有する物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のような課題を解決すべく、本発明者らは、種々の化合物や材料においてエリンギおよび五加皮に着目し、これらの多様な生理活性について鋭意研究を重ねた結果、エリンギの抽出物と五加皮の抽出物との生薬材抽出物混合物が、毒性を有さず、骨芽細胞の増殖と分化促進活性および実験動物における骨成長を促進する活性を示し、成長不振に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、エリンギの水抽出物またはこれと均等なエリンギ抽出物、および五加皮の水抽出物またはこれと均等な五加皮抽出物、を含む骨芽細胞の増殖と分化促進活性を有する生薬材抽出物混合物を提供する。
【００１２】
上記のような本発明に係る生薬材抽出物混合物は、エリンギ抽出物を固形分として０．５重量部〜２．５重量部、および五加皮抽出物を固形分として０．５重量部〜５．０重量部含むのが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、上記の生薬材抽出物混合物、およびこれを有効成分として骨成長促進機能を示す、子供と青少年の骨成長に有効な健康食品、骨形成不全症の予防剤または治療剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、長期投与した場合にも副作用がなく、成長不振に対して優れた効果を有する生薬材抽出物混合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。
【図２】本発明の生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の塩基性リン酸分解酵素の活性に及ぼす影響を示す図である。
【図３】本発明の生薬材抽出物混合物をラットに経口投与することが脛骨の長さの増加に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、エリンギの水抽出物またはこれと機能的に均等なエリンギ抽出物（主要活性成分が共通するエリンギ抽出物）と、五加皮の水抽出物またはこれと機能的に均等な五加皮抽出物（主要活性成分が共通する五加皮抽出物）と、を含む骨芽細胞増殖活性および骨成長促進効果を有する生薬材抽出物混合物、ならびにこれを用いた骨粗鬆症の治療剤または予防剤および健康食品に関する。
【００１７】
なかでも、上記生薬材抽出物混合物は、上記エリンギ抽出物を固形分として０．５重量部〜２．５重量部、および上記五加皮抽出物を固形分として０．５重量部〜５．０重量部含むのが好ましい。
【００１８】
本発明の生薬材抽出物混合物に含まれるエリンギ抽出物および五加皮抽出物は、それぞれエリンギおよび五加皮を、水またはアルコールで抽出して得られるものである。まずエリンギおよび五加皮の抽出方法について以下に説明する。
【００１９】
エリンギ抽出物を得るためには、エリンギを抽出容器に入れ、例えば蒸留水を加えて、８０℃以上で４時間熱水抽出する。上記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やし、濾過紙で濾過する。そして、濾過により得られた抽出液を、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して、粉末状（固体）のエリンギ抽出物を得る。このように濃縮して得られるエリンギ抽出物は、エタノールなどを用いて活性追跡分画法（Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）で分離してもよい。
【００２０】
また、五加皮抽出物を得るためには、エリンギ抽出物の場合と同様に、五加皮を抽出容器に入れ、例えば蒸留水を加えて、８０℃以上で４時間熱水抽出する。上記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やし、濾過紙で濾過する。そして、濾過により得られた抽出液を、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮して、粉末状（固体）の五加皮抽出物を得る。このように濃縮して得られる五加皮抽出物は、エタノールなどを用いて活性追跡分画法で分離してもよい。
【００２１】
本発明に係る生薬材抽出物混合物は、上記のようにして得られたエリンギ抽出物と五加皮抽出物とを上記の混合割合で混合することによって得られる。エリンギ抽出物と五加皮抽出物とを混合する方法は特に限定されず、常法により混合すればよい。
【００２２】
また、抽出工程に供するエリンギおよび五加皮は、例えば粉末状にあらかじめ粉砕されていてもよい。さらに、まずエリンギと五加皮とを混合して混合物を得、得られた混合物を上記抽出工程に供してエリンギ抽出物および五加皮抽出物を同時に生成してもよい。したがって、例えば粉末状のエリンギおよび五加皮を混合した後、当該混合物から抽出によって本発明に係る生薬材抽出物混合物を得ることもできる。
【００２３】
このようにして得られる本発明に係る生薬材抽出物混合物は、エリンギ抽出物および五加皮抽出物をそれぞれ単独で使用する場合に比べ、約１２０％〜１３０％以上の細胞増殖効果を示し、骨芽細胞の標識細胞である塩基性リン酸分解酵素の活性を１１０％〜１５０％程度増加させる。
【００２４】
また、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、ＳＤ系ラットに経口投与することで脛骨の成長を顕著に増加させる。
【００２５】
すなわち、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨芽細胞の標識酵素である塩基性リン酸分解酵素に優れた活性を示し、骨芽細胞の増殖に効果があり、ＳＤ系ラットに経口投与することで脛骨の成長を顕著に増加させるため、骨成長を促進させる目的に有効に用いることが可能である。
【００２６】
なお、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、上記のエリンギ抽出物および五加皮抽出物に加えて、これらと同一または類似の機能を示す有効成分をさらに１種以上含有してもよい。
【００２７】
上記生薬材抽出物混合物は、臨床投与の際に経口または非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用し得る。すなわち、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、実際の臨床投与の際に経口および非経口のいくつかの剤型で投与し得るが、製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤および界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製すればよい。
【００２８】
経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤およびカプセル剤などが挙げられる。このような固形製剤は、生薬材抽出物混合物に、少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトースおよびゼラチンなどを混合して調製することができる。単純な賦形剤以外に、マグネシウムスチレートタルクなどの潤滑剤なども使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、耐溶液剤、油剤およびシロップ剤などが該当するが、広く使われている単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤および保存剤なども該当し得る。
【００２９】
非経口投与のための製剤としては、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥剤および坐剤などが挙げられる。非水性溶剤と懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオールレートなどの注射可能なエステルなどが挙げられる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロールおよびゼラチンなどを使用し得る。
【００３０】
投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重篤度によってその範囲がさまざまである。一日の投与量は、生薬材抽出物混合物が１５０ｍｇ／ｋｇ〜４５０ｍｇ／ｋｇであればよく、好ましくは、３００ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇであればよい。また、一日１回〜６回の投与が可能である。
【００３１】
ここで、本発明に係る生薬材抽出物混合物をラットに経口投与して毒性実験を行った結果、経口投与毒性試験による５０％致死量（ＬＤ ５０）は少なくとも１ｇ／ｋｇ以上と、安全な物質であると判断される。
【００３２】
本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨形成不全症の予防および治療のために、単独で使用することもできるが、手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００３３】
また、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨形成不全症の予防・改善を目的として摂取する健康食品（飲料を含む。）に添加することができる。本発明に係る生薬材抽出物混合物を食品添加物として使用する場合、上記生薬材抽出物混合物をそのまま添加してもよく、また、他の食品や食品成分と共に使用することができ、通常の方法により適宜使用され得る。
【００３４】
本発明に係る健康食品の有効成分（すなわち本発明に係る生薬材抽出物混合物）の配合量は、使用目的（予防、健康維持または治療的処置）に応じて適宜決定され得る。一般的に、食品または飲料の製造時、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、固形分として食品または飲料の原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康維持および衛生を目的として、または健康調節を目的として長期間にわたり摂取する場合、上記量はさらに少なくてもよく、一方、安全性の面において何ら問題がないため、上記有効成分の上記量はさらに多くてもよい。
【００３５】
本発明に係る生薬材抽出物混合物を含む本発明に係る健康食品（すなわち本発明に係る生薬材抽出物混合物を有効成分とする組成物）の種類は、特に限定されない。本発明に係る健康食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などが挙げられ、通常の意味での健康食品を全て含む。
【００３６】
本発明に係る健康食品のうちの健康飲料は、通常の飲料と同様に、色々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有し得る。上述の天然炭水化物とは、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライド、マルトース、シュークロスなどのジサッカライド、およびデキストリン、サイクロデキストリンなどのポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤や、サッカリン、アスファルタムなどの合成甘味剤などが挙げられる。上記天然炭水化物の比率は、一般的に本発明に係る健康飲料（本発明に係る生薬材抽出物混合物を有効成分とする組成物）１００ｍｌ当たり約０．０１ｇ〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２ｇ〜０．０３ｇであればよい。
【００３７】
さらに、本発明に係る健康食品（本発明に係る生薬材抽出物混合物を有効成分とする組成物）は、添加剤として、種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有し得る。
【００３８】
また、本発明に係る健康食品は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有し得る。また、上記の添加剤は、それぞれ単独で、または混合して使用することができる。かかる添加剤の比率は、きわめて重要なことではないが、本発明に係る健康食品１００重量部当たり０．０１１重量部〜０．１重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の技術内容を明らかにするためのものに過ぎず、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４０】
（実施例）
《実施例：生薬材抽出物混合物の製造》
１．エリンギ抽出物の製造
エリンギ１００ｇを３Ｌ抽出容器に入れ、蒸留水１Ｌを加えて、８０℃で４時間熱水抽出した。上記過程（蒸留水１Ｌを加えて８０℃で４時間熱水抽出する過程）を３回繰り返した後、得られた溶液（抽出液）を室温で冷やし、濾過紙で濾過した。濾過によって得られた抽出液（濾液）は、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して、粉末状のエリンギ抽出物を得た（収率：４２％、凍結乾燥後固形分を測定して得られる固形分収率）。
【００４１】
２．五加皮抽出物の製造
五加皮１００ｇを３Ｌ抽出容器に入れ、蒸留水１Ｌを加えて、８０℃で４時間熱水抽出した。上記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やし、濾過紙で濾過した。濾過によって得られた抽出液を、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して、粉末状の五加皮抽出物を得た（固形分収率：５．８％）。
【００４２】
３．生薬材抽出物混合物の調合例
上記１で得られたエリンギ抽出物０．５重量部〜２．５重量部と上記２で得られた五加皮抽出物０．５重量部〜５．０重量部とを混合して、生薬材抽出物混合物を製造した。
【００４３】
上記生薬材抽出物混合物は、培養液に希釈して、下記実験に使用した。すなわち、以下の実験においては、各生薬抽出物を培養液で表に示した濃度に希釈して実験を行った。
【００４４】
《実験例１：本発明の生薬材抽出物混合物による骨芽細胞の増殖効能分析》
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の増殖および細胞活性度に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を行った。
【００４５】
１．骨芽細胞の増殖および細胞活性度分析
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の増殖に及ぼす影響を評価するために、人間骨肉腫から由来した細胞株であるＭＧ−６３およびＨＯＳ細胞株をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ）で購入して使用し、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地で培養して使用した。
【００４６】
本発明に係る生薬材抽出物混合物が毒性を示すかを間接的に評価し、かつ骨芽細胞の増殖に対する生薬材抽出物混合物の影響を調べるために、上記で培養したＭＧ−６３骨芽細胞を用いて細胞増殖時に細胞のＤＮＡ内に流入した３Ｈ−サイミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の量を測定した。具体的には、骨芽細胞を２４‐ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個の細胞となるように分株し、翌日１％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭに交替した。交替した培養液内に、上記実施例の生薬材抽出物混合物を１×１０−４ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で希釈して、濃度別に添加し、４８時間培養した。
【００４７】
最後に４時間３μＣｉ／ウェルの３Ｈ−サイミジンを添加して培養した後、細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ） 緩衝液で洗浄し、４℃の５％ＴＣＡ（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）で処理して、ＴＣＡ−不溶性である分画を分離し、０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解した。これらのうち一定の分画を用いて、液体シンチレーションカウンタ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）で放射線量を測定することによって、３Ｈ−サイミジンの流入度を測定した。
【００４８】
その結果を表１および図１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
表１および図１から明らかなように、本発明に係る生薬材抽出物混合物を添加した細胞は、エリンギ抽出物および五加皮抽出物を単独で添加した細胞に比べて、約１２０％〜１３０％以上の細胞増殖効果を示した。
【００５１】
２．骨芽細胞の標識酵素である塩基性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の活性測定
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の活性に及ぼす影響を評価するために、上記１で培養したＨＯＳ骨芽細胞を９６−ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０３細胞となるように分株し、単層で増殖した後、生薬材抽出物混合物を０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で培養液に添加し、１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭで９６−ウェルプレートにおいて４８時間培養した後、細胞を０．１％トリトンＸ−１００／生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）において３７℃で３０分間処理した。
【００５２】
ついで、細胞処理液の一定量を、基質である１００ｍＭのＰＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の存在下に０．１Ｎグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １０．４）と共に３７℃で３０分間反応させて、基質であるＰＮＰＰから遊離して出たＰＮＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）の量を４０５ｎｍで比色定量した。
【００５３】
その結果を表２および図２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
表２および図２から明らかなように、本発明に係る生薬材抽出物混合物を添加した細胞は、エリンギ抽出物および五加皮抽出物を単独で添加した細胞に比べて、塩基性リン酸分解酵素の活性が１１０％〜１５０％程度増加した。
【００５６】
したがって、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨芽細胞の標識酵素である塩基性リン酸分解酵素に優秀な活性を示すので、骨芽細胞の増殖に有効であることが分かる。
【００５７】
《実験例２：ラットに対する経口投与急性毒性実験》
本発明の生薬材抽出物混合物の急性毒性を調べるために、下記のような方法で急性毒性実験を実施した。すなわち、実験動物として６週齢の特定病原体不在（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ， ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを使用して急性毒性実験を実施した。群当たり２匹ずつの動物に、本発明における生薬材抽出物を各々０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して１ｇ／ｋｇ／ｍｌの容量で１回経口投与した。試験物質の投与後、動物の廃死可否、臨床症状、体重変化を観察し、血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、剖検して目視で腹腔臓器と胸腔臓器の異常有無を観察した。
【００５８】
その結果、試験物質を投与したあらゆる動物において特記すべき臨床症状がなく、廃死した動物もなく、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見などでも毒性変化は観察されなかった。したがって、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、いずれもラットにおいて１ｇ／ｋｇまでも毒性変化が認められず、経口投与最小致死量（ＬＤ ５０）は、抽出物１ｇ／ｋｇ以上と安全な物質であると判断された。
【００５９】
《実験例３：本発明の生薬材抽出物混合物によるラット骨の成長効果測定》
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨の成長に及ぼす影響を調べるために、実験動物として４週齢の特定病原体不在（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰａｔｈｏｇｅｎＦｒｅｅ， ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを使用して脛骨成長実験を実施した。群当たり７匹ずつの雌と雄をそれぞれ配置し、本発明における生薬材抽出物を滅菌蒸留水に懸濁して各々９９０ｍｇ／ｋｇ／ｍｌの容量で１日１回、４週間経口投与した。対照群の場合は同量の滅菌蒸留水を経口投与した。雄の場合、試験物質を投与してから１週、２週、３週そして４週が経過した時点で、雌の場合は、１週、２週、３週そして４週が経過した時点でノギス（Ｖｅｒｎｉｅｒ Ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて脛骨の長さを測定した。
【００６０】
その結果を表３および図３に示す。
【００６１】
【表３】
【００６２】
表３および図３から明らかなように、本発明に係る生薬材抽出物混合物を投与したラットは、雌と雄ともに 滅菌蒸留水を経口投与した対照群に比べて、４週が経過した時点で脛骨の長さが２７．４％〜３８．６％増加した。
【００６３】
したがって、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、ラットへの経口投与によって脛骨の長さを増加させることが分かる。
【００６４】
ここで、以下に本発明に係る生薬材抽出物混合物のための製剤例を例示する。
【００６５】
《製剤例１：薬学的製剤の製造》
１．散剤の製造
生薬材抽出物混合物 ２ｇ
乳糖 １ｇ
上記の成分を混合し、気密袋に充填して、散剤を製造した。
【００６６】
２．錠剤の製造
生薬材抽出物混合物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法により打錠して、錠剤を製造した。
【００６７】
３．カプセル剤の製造
生薬材抽出物混合物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によりゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造した。
【００６８】
《製剤例２：食品の製造》
本発明の生薬材抽出物混合物を含む食品を次のように製造した。
【００６９】
１．調理用薬味の製造
本発明の生薬材抽出物混合物を２０重量％〜９５重量％となるような量使用して健康増進用調理用薬味を製造した。
【００７０】
２．トマトケチャップおよびソースの製造
本発明の生薬材抽出物混合物が０．２重量％〜１．０重量％となるようにトマトケチャップまたはソースに添加して、健康増進用トマトケチャップ又はソースを製造した。
【００７１】
３．小麦粉食品の製造
本発明の生薬材抽出物混合物０．５重量％〜５．０重量％を小麦粉に添加し、この混合物を用いてパン、ケーキ、クッキー、クラッカーおよび麺類を製造して、健康増進用食品を製造した。
【００７２】
４．スープおよび肉汁（Ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
本発明の生薬材抽出物混合物０．１重量％〜５．０重量％をスープおよび肉汁に添加して、健康増進用肉加工製品、麺類のスープおよび肉汁を製造した。
【００７３】
５．グラウンドビーフ（Ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｆ）の製造
本発明の生薬材抽出物混合物１０重量％をグラウンドビーフに添加して、健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【００７４】
６．乳製品（Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明の生薬材抽出物混合物５重量％〜１０重量％を牛乳に添加し、上記牛乳を用いてバターおよびアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【００７５】
７．禅食の製造
玄米、大麦、餅米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕器を用いて粒度６０メッシュの粉末に製造した
黒豆、黒胡麻、荏胡麻を公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕器を用いて粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００７６】
本発明の生薬材抽出物混合物を真空濃縮器で減圧・濃縮し、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を、粉砕器を用いて粒度６０メッシュに粉砕し、乾燥粉末を得た。
【００７７】
上記で製造した穀物類、種実類および生薬材抽出物混合物の乾燥粉末を次の割合で配合して製造した。
【００７８】
穀物類（玄米３０重量％、鳩麦１５重量％、大麦２０重量％）
種実類（荏胡麻７重量％、黒豆８重量％、黒胡麻７重量％）
生薬材抽出物混合物の乾燥粉末（３重量％）
霊芝（０．５重量％）
地黄（０．５重量％）
【００７９】
《製剤例３：飲料の製造》
１．炭酸飲料の製造
砂糖５％〜１０％、クエン酸０．０５％〜０．３％、カラメル０．００５％〜０．０２％、ビタミンＣ０．１％〜１％の添加物を混合し、これに、７９％〜９４％の精製水を混合してシロップを作り、上記シロップを８５℃〜９８℃で２０秒間〜１８０秒間殺菌して、冷却水と１：４の割合で混合した後、炭酸ガスを０．５％〜０．８２％注入して、本発明の生薬材抽出物混合物を含有する炭酸飲料を製造した。
【００８０】
２．健康飲料の製造
液状果糖０．５％、オリゴ糖２％、砂糖２％、食塩０．５％、水７５％のような副材料と、生薬材抽出物混合物とを均質に配合して、瞬間殺菌を実施した後、これをガラス瓶、ＰＥＴ瓶など小包装容器に包装して、健康飲料を製造した。
【００８１】
３．野菜ジュースの製造
本発明の生薬材抽出物混合物５ｇをトマト又はニンジンジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００８２】
４．果物ジュースの製造
本発明の生薬材抽出物混合物１ｇをリンゴ又はブドウジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用果物ジュースを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨芽細胞を増殖させ、かつ骨芽細胞の分化促進活性を有するため、健康食品および骨形成不全症の予防および治療に有用な医薬品として広く利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はエリンギと五加皮から得られる生薬材抽出物混合物、およびこれを有効成分として骨成長促進機能を示す組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）とはヒラタケ科ヒラタケ属に属する死物寄生菌で、亜熱帯地方の大草原に自生し、ヨーロッパでは草原の茸（Ｂｏｌｅｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｐｐｅｓ）、または王ヒラタケ（Ｋｉｎｇ ｏｙｓｔｅｒ ｍｕｓｈｒｏｏｍ）と呼ばれている。東医宝鑑によると、エリンギは無毒で、味が甘く、香りが強い。胃腸の機能を整え、気の循環を促すため、手足がしびれて力が入らない時や、腰や膝にしびれがある時に好適な薬材である。エリンギの成分は未だ完全には解明されていないが、アルカリ性食品であり、コレステロール値を低下させ、抗癌作用があるという報告もある。蛋白質とビタミンが豊富で、へん桃腺、乳腺炎、脱下症および各種成人病に薬効があると言われる。特に、日本ではアルカリ性で抗癌効果が大きい自然健康食品として広く注目を集めている。
【０００３】
一方、「五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ Ｃｏｒｔｅｘ）」とは、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）に属する潅木植物で、北半球でも極東アジアのみに分布する。韓国では、絶滅危機にある野生保護植物である。五加皮の種類には、刺五加皮、一般五加皮および香五加皮があり、漢方では毒性も副作用もない上薬に分類され、根と皮を薬材として使用する。葉にはチイサノサイド（Ｃｈｉｉｓａｎｏｓｉｄｅ）が含まれていて薬理的機能を有し、根には五加皮配糖体のみでなく、ジリンギン（Ｓｙｌｒｇｉｎ）、クマリン配糖体などが含まれている。五加皮には、五加皮配糖体であるアカントサイド（Ａｃａｎｔｈｏｓｉｄｅ Ｂ， Ｄ）と、免疫性を高める水溶性多糖体とがある。
【０００４】
五加皮は、味は辛くかつ苦く、性は温、肝経や神経に作用して風湿を取り除き、益気昇精を助けると言われている。また、五労（五臓の虚弱により生じる虚労）と七傷（虚弱により生じる男性の七種類の症状）を補い、足が不自由な場合にも使われてきた。長期服用により、気の向上、胃の保護、精力増強、精神集中、意欲向上、疲労回復および老化防止の効果があると言われ、体の中の汚れた血をきれいにするとも言われている。さらに、腰や脊椎の痛み、男性の陰萎症、嚢湿および女性の陰痒症など様々な症状を治すと言われている。
【０００５】
一方、日本は高齢化社会への急速な進展とともに少子化も進んでおり、子供の健康に対する関心が高くなっている中で、特に子供の成長問題は両親にとって大きな関心を引く分野である。そこで、成長ホルモン分泌不全性低身長症および骨形成不全症などの明らかな病気の場合、成長ホルモン注射療法や薬物治療を受けることができ、特に小児の低身長症への治療に成長ホルモン注射を用いる場合はその費用を「小児慢性特定疾患治療研究事業」より、各家庭の所得に応じて助成を受けることができる。
【０００６】
しかしながら、２０歳に到達していない未成年の子どもであっても、男子は１５６．４ｃｍ、女子は１４５．４ｃｍの身長を超えるまたは２０歳以上の成人の方が成長ホルモン注射を受ける場合、健康保険適用外になり、非常に高額な費用を負担することになる。よって、単なる成長不振による身長の伸び悩みの場合は、その対応が難しく、一般的には運動やカルシウム製剤等健康食品の長期摂取に頼ることになるが、確実な効果を期待し難い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｗａｎｇ， Ｄ．Ｖ．Ｃ．， Ｃａｎ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． Ｊ． １５５：１２３７， １９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のような成長不振は、主に２０歳以下の子供と青少年時代の問題であり、長期投与が必須であるため、副作用がなく、優れた効果を有する新しい物質が求められているのが実情である。
【０００９】
そこで、本発明は、長期投与した場合にも副作用がなく、成長不振に対して優れた効果を有する物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のような課題を解決すべく、本発明者らは、種々の化合物や材料においてエリンギおよび五加皮に着目し、これらの多様な生理活性について鋭意研究を重ねた結果、エリンギの抽出物と五加皮の抽出物との生薬材抽出物混合物が、毒性を有さず、骨芽細胞の増殖と分化促進活性および実験動物における骨成長を促進する活性を示し、成長不振に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、エリンギの水抽出物またはこれと均等なエリンギ抽出物、および五加皮の水抽出物またはこれと均等な五加皮抽出物、を含む骨芽細胞の増殖と分化促進活性を有する生薬材抽出物混合物を提供する。
【００１２】
上記のような本発明に係る生薬材抽出物混合物は、エリンギ抽出物を固形分として０．５重量部〜２．５重量部、および五加皮抽出物を固形分として０．５重量部〜５．０重量部含むのが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、上記の生薬材抽出物混合物、およびこれを有効成分として骨成長促進機能を示す、子供と青少年の骨成長に有効な健康食品、骨形成不全症の予防剤または治療剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、長期投与した場合にも副作用がなく、成長不振に対して優れた効果を有する生薬材抽出物混合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。
【図２】本発明の生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の塩基性リン酸分解酵素の活性に及ぼす影響を示す図である。
【図３】本発明の生薬材抽出物混合物をラットに経口投与することが脛骨の長さの増加に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、エリンギの水抽出物またはこれと機能的に均等なエリンギ抽出物（主要活性成分が共通するエリンギ抽出物）と、五加皮の水抽出物またはこれと機能的に均等な五加皮抽出物（主要活性成分が共通する五加皮抽出物）と、を含む骨芽細胞増殖活性および骨成長促進効果を有する生薬材抽出物混合物、ならびにこれを用いた骨粗鬆症の治療剤または予防剤および健康食品に関する。
【００１７】
なかでも、上記生薬材抽出物混合物は、上記エリンギ抽出物を固形分として０．５重量部〜２．５重量部、および上記五加皮抽出物を固形分として０．５重量部〜５．０重量部含むのが好ましい。
【００１８】
本発明の生薬材抽出物混合物に含まれるエリンギ抽出物および五加皮抽出物は、それぞれエリンギおよび五加皮を、水またはアルコールで抽出して得られるものである。まずエリンギおよび五加皮の抽出方法について以下に説明する。
【００１９】
エリンギ抽出物を得るためには、エリンギを抽出容器に入れ、例えば蒸留水を加えて、８０℃以上で４時間熱水抽出する。上記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やし、濾過紙で濾過する。そして、濾過により得られた抽出液を、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して、粉末状（固体）のエリンギ抽出物を得る。このように濃縮して得られるエリンギ抽出物は、エタノールなどを用いて活性追跡分画法（Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）で分離してもよい。
【００２０】
また、五加皮抽出物を得るためには、エリンギ抽出物の場合と同様に、五加皮を抽出容器に入れ、例えば蒸留水を加えて、８０℃以上で４時間熱水抽出する。上記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やし、濾過紙で濾過する。そして、濾過により得られた抽出液を、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮して、粉末状（固体）の五加皮抽出物を得る。このように濃縮して得られる五加皮抽出物は、エタノールなどを用いて活性追跡分画法で分離してもよい。
【００２１】
本発明に係る生薬材抽出物混合物は、上記のようにして得られたエリンギ抽出物と五加皮抽出物とを上記の混合割合で混合することによって得られる。エリンギ抽出物と五加皮抽出物とを混合する方法は特に限定されず、常法により混合すればよい。
【００２２】
また、抽出工程に供するエリンギおよび五加皮は、例えば粉末状にあらかじめ粉砕されていてもよい。さらに、まずエリンギと五加皮とを混合して混合物を得、得られた混合物を上記抽出工程に供してエリンギ抽出物および五加皮抽出物を同時に生成してもよい。したがって、例えば粉末状のエリンギおよび五加皮を混合した後、当該混合物から抽出によって本発明に係る生薬材抽出物混合物を得ることもできる。
【００２３】
このようにして得られる本発明に係る生薬材抽出物混合物は、エリンギ抽出物および五加皮抽出物をそれぞれ単独で使用する場合に比べ、約１２０％〜１３０％以上の細胞増殖効果を示し、骨芽細胞の標識細胞である塩基性リン酸分解酵素の活性を１１０％〜１５０％程度増加させる。
【００２４】
また、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、ＳＤ系ラットに経口投与することで脛骨の成長を顕著に増加させる。
【００２５】
すなわち、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨芽細胞の標識酵素である塩基性リン酸分解酵素に優れた活性を示し、骨芽細胞の増殖に効果があり、ＳＤ系ラットに経口投与することで脛骨の成長を顕著に増加させるため、骨成長を促進させる目的に有効に用いることが可能である。
【００２６】
なお、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、上記のエリンギ抽出物および五加皮抽出物に加えて、これらと同一または類似の機能を示す有効成分をさらに１種以上含有してもよい。
【００２７】
上記生薬材抽出物混合物は、臨床投与の際に経口または非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用し得る。すなわち、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、実際の臨床投与の際に経口および非経口のいくつかの剤型で投与し得るが、製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤および界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製すればよい。
【００２８】
経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤およびカプセル剤などが挙げられる。このような固形製剤は、生薬材抽出物混合物に、少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトースおよびゼラチンなどを混合して調製することができる。単純な賦形剤以外に、マグネシウムスチレートタルクなどの潤滑剤なども使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、耐溶液剤、油剤およびシロップ剤などが該当するが、広く使われている単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤および保存剤なども該当し得る。
【００２９】
非経口投与のための製剤としては、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥剤および坐剤などが挙げられる。非水性溶剤と懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオールレートなどの注射可能なエステルなどが挙げられる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロールおよびゼラチンなどを使用し得る。
【００３０】
投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重篤度によってその範囲がさまざまである。一日の投与量は、生薬材抽出物混合物が１５０ｍｇ／ｋｇ〜４５０ｍｇ／ｋｇであればよく、好ましくは、３００ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇであればよい。また、一日１回〜６回の投与が可能である。
【００３１】
ここで、本発明に係る生薬材抽出物混合物をラットに経口投与して毒性実験を行った結果、経口投与毒性試験による５０％致死量（ＬＤ ５０）は少なくとも１ｇ／ｋｇ以上と、安全な物質であると判断される。
【００３２】
本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨形成不全症の予防および治療のために、単独で使用することもできるが、手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００３３】
また、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨形成不全症の予防・改善を目的として摂取する健康食品（飲料を含む。）に添加することができる。本発明に係る生薬材抽出物混合物を食品添加物として使用する場合、上記生薬材抽出物混合物をそのまま添加してもよく、また、他の食品や食品成分と共に使用することができ、通常の方法により適宜使用され得る。
【００３４】
本発明に係る健康食品の有効成分（すなわち本発明に係る生薬材抽出物混合物）の配合量は、使用目的（予防、健康維持または治療的処置）に応じて適宜決定され得る。一般的に、食品または飲料の製造時、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、固形分として食品または飲料の原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康維持および衛生を目的として、または健康調節を目的として長期間にわたり摂取する場合、上記量はさらに少なくてもよく、一方、安全性の面において何ら問題がないため、上記有効成分の上記量はさらに多くてもよい。
【００３５】
本発明に係る生薬材抽出物混合物を含む本発明に係る健康食品（すなわち本発明に係る生薬材抽出物混合物を有効成分とする組成物）の種類は、特に限定されない。本発明に係る健康食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などが挙げられ、通常の意味での健康食品を全て含む。
【００３６】
本発明に係る健康食品のうちの健康飲料は、通常の飲料と同様に、色々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有し得る。上述の天然炭水化物とは、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライド、マルトース、シュークロスなどのジサッカライド、およびデキストリン、サイクロデキストリンなどのポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤や、サッカリン、アスファルタムなどの合成甘味剤などが挙げられる。上記天然炭水化物の比率は、一般的に本発明に係る健康飲料（本発明に係る生薬材抽出物混合物を有効成分とする組成物）１００ｍｌ当たり約０．０１ｇ〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２ｇ〜０．０３ｇであればよい。
【００３７】
さらに、本発明に係る健康食品（本発明に係る生薬材抽出物混合物を有効成分とする組成物）は、添加剤として、種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有し得る。
【００３８】
また、本発明に係る健康食品は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有し得る。また、上記の添加剤は、それぞれ単独で、または混合して使用することができる。かかる添加剤の比率は、きわめて重要なことではないが、本発明に係る健康食品１００重量部当たり０．０１１重量部〜０．１重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の技術内容を明らかにするためのものに過ぎず、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４０】
（実施例）
《実施例：生薬材抽出物混合物の製造》
１．エリンギ抽出物の製造
エリンギ１００ｇを３Ｌ抽出容器に入れ、蒸留水１Ｌを加えて、８０℃で４時間熱水抽出した。上記過程（蒸留水１Ｌを加えて８０℃で４時間熱水抽出する過程）を３回繰り返した後、得られた溶液（抽出液）を室温で冷やし、濾過紙で濾過した。濾過によって得られた抽出液（濾液）は、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して、粉末状のエリンギ抽出物を得た（収率：４２％、凍結乾燥後固形分を測定して得られる固形分収率）。
【００４１】
２．五加皮抽出物の製造
五加皮１００ｇを３Ｌ抽出容器に入れ、蒸留水１Ｌを加えて、８０℃で４時間熱水抽出した。上記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やし、濾過紙で濾過した。濾過によって得られた抽出液を、真空回転蒸発器を用いて４０℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して、粉末状の五加皮抽出物を得た（固形分収率：５．８％）。
【００４２】
３．生薬材抽出物混合物の調合例
上記１で得られたエリンギ抽出物０．５重量部〜２．５重量部と上記２で得られた五加皮抽出物０．５重量部〜５．０重量部とを混合して、生薬材抽出物混合物を製造した。
【００４３】
上記生薬材抽出物混合物は、培養液に希釈して、下記実験に使用した。すなわち、以下の実験においては、各生薬抽出物を培養液で表に示した濃度に希釈して実験を行った。
【００４４】
《実験例１：本発明の生薬材抽出物混合物による骨芽細胞の増殖効能分析》
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の増殖および細胞活性度に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を行った。
【００４５】
１．骨芽細胞の増殖および細胞活性度分析
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の増殖に及ぼす影響を評価するために、人間骨肉腫から由来した細胞株であるＭＧ−６３およびＨＯＳ細胞株をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ）で購入して使用し、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地で培養して使用した。
【００４６】
本発明に係る生薬材抽出物混合物が毒性を示すかを間接的に評価し、かつ骨芽細胞の増殖に対する生薬材抽出物混合物の影響を調べるために、上記で培養したＭＧ−６３骨芽細胞を用いて細胞増殖時に細胞のＤＮＡ内に流入した３Ｈ−サイミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の量を測定した。具体的には、骨芽細胞を２４‐ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個の細胞となるように分株し、翌日１％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭに交替した。交替した培養液内に、上記実施例の生薬材抽出物混合物を１×１０−４ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で希釈して、濃度別に添加し、４８時間培養した。
【００４７】
最後に４時間３μＣｉ／ウェルの３Ｈ−サイミジンを添加して培養した後、細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ） 緩衝液で洗浄し、４℃の５％ＴＣＡ（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）で処理して、ＴＣＡ−不溶性である分画を分離し、０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解した。これらのうち一定の分画を用いて、液体シンチレーションカウンタ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）で放射線量を測定することによって、３Ｈ−サイミジンの流入度を測定した。
【００４８】
その結果を表１および図１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
表１および図１から明らかなように、本発明に係る生薬材抽出物混合物を添加した細胞は、エリンギ抽出物および五加皮抽出物を単独で添加した細胞に比べて、約１２０％〜１３０％以上の細胞増殖効果を示した。
【００５１】
２．骨芽細胞の標識酵素である塩基性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の活性測定
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨芽細胞の活性に及ぼす影響を評価するために、上記１で培養したＨＯＳ骨芽細胞を９６−ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０３細胞となるように分株し、単層で増殖した後、生薬材抽出物混合物を０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で培養液に添加し、１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭで９６−ウェルプレートにおいて４８時間培養した後、細胞を０．１％トリトンＸ−１００／生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）において３７℃で３０分間処理した。
【００５２】
ついで、細胞処理液の一定量を、基質である１００ｍＭのＰＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の存在下に０．１Ｎグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １０．４）と共に３７℃で３０分間反応させて、基質であるＰＮＰＰから遊離して出たＰＮＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）の量を４０５ｎｍで比色定量した。
【００５３】
その結果を表２および図２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
表２および図２から明らかなように、本発明に係る生薬材抽出物混合物を添加した細胞は、エリンギ抽出物および五加皮抽出物を単独で添加した細胞に比べて、塩基性リン酸分解酵素の活性が１１０％〜１５０％程度増加した。
【００５６】
したがって、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨芽細胞の標識酵素である塩基性リン酸分解酵素に優秀な活性を示すので、骨芽細胞の増殖に有効であることが分かる。
【００５７】
《実験例２：ラットに対する経口投与急性毒性実験》
本発明の生薬材抽出物混合物の急性毒性を調べるために、下記のような方法で急性毒性実験を実施した。すなわち、実験動物として６週齢の特定病原体不在（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ， ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを使用して急性毒性実験を実施した。群当たり２匹ずつの動物に、本発明における生薬材抽出物を各々０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して１ｇ／ｋｇ／ｍｌの容量で１回経口投与した。試験物質の投与後、動物の廃死可否、臨床症状、体重変化を観察し、血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、剖検して目視で腹腔臓器と胸腔臓器の異常有無を観察した。
【００５８】
その結果、試験物質を投与したあらゆる動物において特記すべき臨床症状がなく、廃死した動物もなく、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見などでも毒性変化は観察されなかった。したがって、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、いずれもラットにおいて１ｇ／ｋｇまでも毒性変化が認められず、経口投与最小致死量（ＬＤ ５０）は、抽出物１ｇ／ｋｇ以上と安全な物質であると判断された。
【００５９】
《実験例３：本発明の生薬材抽出物混合物によるラット骨の成長効果測定》
本発明に係る生薬材抽出物混合物が骨の成長に及ぼす影響を調べるために、実験動物として４週齢の特定病原体不在（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰａｔｈｏｇｅｎＦｒｅｅ， ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを使用して脛骨成長実験を実施した。群当たり７匹ずつの雌と雄をそれぞれ配置し、本発明における生薬材抽出物を滅菌蒸留水に懸濁して各々９９０ｍｇ／ｋｇ／ｍｌの容量で１日１回、４週間経口投与した。対照群の場合は同量の滅菌蒸留水を経口投与した。雄の場合、試験物質を投与してから１週、２週、３週そして４週が経過した時点で、雌の場合は、１週、２週、３週そして４週が経過した時点でノギス（Ｖｅｒｎｉｅｒ Ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて脛骨の長さを測定した。
【００６０】
その結果を表３および図３に示す。
【００６１】
【表３】
【００６２】
表３および図３から明らかなように、本発明に係る生薬材抽出物混合物を投与したラットは、雌と雄ともに 滅菌蒸留水を経口投与した対照群に比べて、４週が経過した時点で脛骨の長さが２７．４％〜３８．６％増加した。
【００６３】
したがって、本発明に係る生薬材抽出物混合物は、ラットへの経口投与によって脛骨の長さを増加させることが分かる。
【００６４】
ここで、以下に本発明に係る生薬材抽出物混合物のための製剤例を例示する。
【００６５】
《製剤例１：薬学的製剤の製造》
１．散剤の製造
生薬材抽出物混合物 ２ｇ
乳糖 １ｇ
上記の成分を混合し、気密袋に充填して、散剤を製造した。
【００６６】
２．錠剤の製造
生薬材抽出物混合物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法により打錠して、錠剤を製造した。
【００６７】
３．カプセル剤の製造
生薬材抽出物混合物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法によりゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造した。
【００６８】
《製剤例２：食品の製造》
本発明の生薬材抽出物混合物を含む食品を次のように製造した。
【００６９】
１．調理用薬味の製造
本発明の生薬材抽出物混合物を２０重量％〜９５重量％となるような量使用して健康増進用調理用薬味を製造した。
【００７０】
２．トマトケチャップおよびソースの製造
本発明の生薬材抽出物混合物が０．２重量％〜１．０重量％となるようにトマトケチャップまたはソースに添加して、健康増進用トマトケチャップ又はソースを製造した。
【００７１】
３．小麦粉食品の製造
本発明の生薬材抽出物混合物０．５重量％〜５．０重量％を小麦粉に添加し、この混合物を用いてパン、ケーキ、クッキー、クラッカーおよび麺類を製造して、健康増進用食品を製造した。
【００７２】
４．スープおよび肉汁（Ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
本発明の生薬材抽出物混合物０．１重量％〜５．０重量％をスープおよび肉汁に添加して、健康増進用肉加工製品、麺類のスープおよび肉汁を製造した。
【００７３】
５．グラウンドビーフ（Ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｆ）の製造
本発明の生薬材抽出物混合物１０重量％をグラウンドビーフに添加して、健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【００７４】
６．乳製品（Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明の生薬材抽出物混合物５重量％〜１０重量％を牛乳に添加し、上記牛乳を用いてバターおよびアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【００７５】
７．禅食の製造
玄米、大麦、餅米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕器を用いて粒度６０メッシュの粉末に製造した
黒豆、黒胡麻、荏胡麻を公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕器を用いて粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００７６】
本発明の生薬材抽出物混合物を真空濃縮器で減圧・濃縮し、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を、粉砕器を用いて粒度６０メッシュに粉砕し、乾燥粉末を得た。
【００７７】
上記で製造した穀物類、種実類および生薬材抽出物混合物の乾燥粉末を次の割合で配合して製造した。
【００７８】
穀物類（玄米３０重量％、鳩麦１５重量％、大麦２０重量％）
種実類（荏胡麻７重量％、黒豆８重量％、黒胡麻７重量％）
生薬材抽出物混合物の乾燥粉末（３重量％）
霊芝（０．５重量％）
地黄（０．５重量％）
【００７９】
《製剤例３：飲料の製造》
１．炭酸飲料の製造
砂糖５％〜１０％、クエン酸０．０５％〜０．３％、カラメル０．００５％〜０．０２％、ビタミンＣ０．１％〜１％の添加物を混合し、これに、７９％〜９４％の精製水を混合してシロップを作り、上記シロップを８５℃〜９８℃で２０秒間〜１８０秒間殺菌して、冷却水と１：４の割合で混合した後、炭酸ガスを０．５％〜０．８２％注入して、本発明の生薬材抽出物混合物を含有する炭酸飲料を製造した。
【００８０】
２．健康飲料の製造
液状果糖０．５％、オリゴ糖２％、砂糖２％、食塩０．５％、水７５％のような副材料と、生薬材抽出物混合物とを均質に配合して、瞬間殺菌を実施した後、これをガラス瓶、ＰＥＴ瓶など小包装容器に包装して、健康飲料を製造した。
【００８１】
３．野菜ジュースの製造
本発明の生薬材抽出物混合物５ｇをトマト又はニンジンジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００８２】
４．果物ジュースの製造
本発明の生薬材抽出物混合物１ｇをリンゴ又はブドウジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用果物ジュースを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明に係る生薬材抽出物混合物は、骨芽細胞を増殖させ、かつ骨芽細胞の分化促進活性を有するため、健康食品および骨形成不全症の予防および治療に有用な医薬品として広く利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリンギの水抽出物またはこれと均等なエリンギ抽出物と、五加皮の水抽出物またはこれと均等な五加皮抽出物とを含む
骨芽細胞増殖および分化促進活性を有する生薬材抽出物混合物。
【請求項２】
前記エリンギ抽出物を固形分として０．５重量部〜２．５重量部と、前記五加皮抽出物を固形分として０．５重量部〜５．０重量部とを含む
請求項１に記載の生薬材抽出物混合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の生薬材抽出物混合物を有効成分とする
骨成長促進および骨形成不全症の治療剤または予防剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の生薬材抽出物混合物を含有する
健康食品。
【請求項１】
エリンギの水抽出物またはこれと均等なエリンギ抽出物と、五加皮の水抽出物またはこれと均等な五加皮抽出物とを含む
骨芽細胞増殖および分化促進活性を有する生薬材抽出物混合物。
【請求項２】
前記エリンギ抽出物を固形分として０．５重量部〜２．５重量部と、前記五加皮抽出物を固形分として０．５重量部〜５．０重量部とを含む
請求項１に記載の生薬材抽出物混合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の生薬材抽出物混合物を有効成分とする
骨成長促進および骨形成不全症の治療剤または予防剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の生薬材抽出物混合物を含有する
健康食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−２８５９３（Ｐ２０１３−２８５９３Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３８２５７（Ｐ２０１２−１３８２５７）
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【出願人】（５１２０４３６５８）オスコテク インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＯＳＣＯＴＥＣ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【出願人】（５１２０４３６５８）オスコテク インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＯＳＣＯＴＥＣ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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