ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法が、本明細書に開示される。また、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅および検出する方法、ならびに検出を補助するための修飾された検出標識も開示される。また、本発明は、修飾されたＴａｑＭａｎプローブ（およびこのプローブを用いる方法）も提供する。ここで、プローブは、５’または３’末端と相補的な短尾３’または５’末端を有し、ここでＴａｑＭａｎプローブは、この短尾を除いて標的核酸と相補的であり、短尾配列は、ステムループ構造を形成してもよい。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ、２００９年１月２７日、２００９年5月22日、および２０１０年１月８日に出願された米国仮出願第６１／１４７，６２３号、第６１／１８０，２１２号、および第６１／２９３，３６９号に対する優先権を主張し、それらは全て参照によりその全体がこれによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（ｔＨＤＡ）は、ヘリカーゼを利用して２本鎖ＤＮＡをほどき、熱サイクルを不要にする等温増幅技術である。ｔＨＤＡは、真の等温ＤＮＡ増幅法であり、ＰＣＲに類似した単純な反応スキームを有する。現在のｔＨＤＡは、ＵｖｒＤヘリカーゼおよびＧｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用い、百万倍超の増幅を達成することができる。しかしながら、ｔＨＤＡシステムの性能は、ｔＨＤＡが依然として、以下の幾つかの主な限界を有するため、さらに改善され得る：プライマー設計についての確立されたアルゴリズムが存在しないこと、プライマー−二量体形成が、ＰＣＲよりもｔＨＤＡにおいて、より顕著であること、アンプリコンキャリオーバーに対する保護が、未だに開発されていないこと、多重化がＵｖｒＤ ｔＨＤＡシステムにより限定されること、ｔＨＤＡが、長い標的配列を増幅するのに非効率的であること、および「ホットスタート」ｔＨＤＡが、現在のところ有効でないこと。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法が、本明細書に開示される。また、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅および検出する方法、ならびに検出を補助するための修飾された検出標識も開示される。
【０００４】
本発明は、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法を提供し、この方法は、
（ａ）増幅対象の標的核酸を提供するステップであって、標的核酸は、２本鎖であり、ステップ（ｂ）の前に、５０ｍＭ ＮａＯＨの存在下で、６５℃で１０分間加熱することによって変性される、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の標的核酸とハイブリッド形成するためのオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップと、
（ｃ）二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、テンプレートと相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の二重鎖を、二重鎖をほどくためのヘリカーゼ調製物と接触させて、ヘリカーゼ調製物が、ヘリカーゼと、ヘリカーゼ調製物が１本鎖結合タンパク質が任意選択である熱安定性ヘリカーゼを含まない限り、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含むようにするステップと、
（ｅ）ヘリカーゼ依存性反応において、標的核酸を指数関数的および選択的に増幅するために、ステップ（ｂ）（ｄ）を反復するステップと、を含む。
【０００５】
また、本発明は、標的核酸が、ＲＮＡプローブおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド捕捉抗体を伴う「前」ステップに供されるヘリカーゼ依存性反応において、標的核酸を増幅する方法を提供する。この方法は、
（ａ）増幅対象の標的核酸を提供するステップであって、標的核酸は、１本鎖ＤＮＡであり、相補的なＲＮＡプローブは、ＤＮＡに結合して標的核酸ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するために、１本鎖ＤＮＡに添加され、磁気ビーズに結合されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを認識するハイブリッド捕捉抗体は、ステップ（ｂ）で使用されるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに添加される、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の標的核酸ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとハイブリッド形成するためのオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップと、
（ｃ）二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、テンプレートと相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の二重鎖を、二重鎖をほどくためのヘリカーゼ調製物と接触させて、ヘリカーゼ調製物が、ヘリカーゼと、ヘリカーゼ調製物が１本鎖結合タンパク質が任意選択である熱安定性ヘリカーゼを含まない限り、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含むようにするステップと、
（ｅ）ヘリカーゼ依存性反応において、標的核酸を指数関数的および選択的に増幅するために、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を反復するステップと、を含む。
【０００６】
また、本発明は、修飾されたＴａｑＭａｎプローブ（およびこのプローブを用いる方法）を提供する。プローブは、５’または３’末端と相補的な短尾３’または５’末端を有し、ここでＴａｑＭａｎプローブは、この短尾を除いて標的核酸と相補的であり、短尾配列は、ステムループ構造を形成する。
【０００７】
また、本発明は、検定を改善するために特定の添加物が使用される修飾を提供する。添加物は、ＤＭＳＯ、ベタイン、ソルビトール、硫酸デキストラン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０００８】
開示の方法および組成物のさらなる利点は、次に続く説明で部分的に示され、説明から部分的に理解されるか、または開示の方法および組成物の実践によって理解されよう。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求で具体的に指摘される要素および組み合わせを用いて、実現および達成されるであろう。上述の一般的説明および次の詳細な説明の双方が、例示および説明するものにすぎず、特許請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ検出を用いたＣｔ／ＮＧ ｔＨＤＡ検定におけるアルカリ標的変性を示す、実施例１ａの結果を提示する。
【図２】エンドポイント検出でのＴａｑＭａｎプローブを用いたＮＧ１／ＮＧ２ ｔＨＤＡ検定におけるアルカリ標的変性を示す、実施例１ｂの結果を提示する。
【図３】ＴａｑＭａｎプローブを用いたＮＧ１／ＮＧ２リアルタイムｔＨＤＡ検定におけるアルカリ標的変性を示す、実施例１ｃの結果を示す。
【図４】Ｌｕｍｉｎｅｘ検出を用いたＣＴハイブリッド捕捉ｔＨＤＡ検定の実施例２ａの結果を提示する。
【図５】実施例２ｂの結果を提示する。
【図６】実施例２ｃの結果−ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｄｙｅを用いた検出を提示する。
【図７】実施例２ｃの結果−ＴａｑＭａｎプローブを用いた検出を提示する。
【図８】実施例４ａの結果−特定の添加物の効果の比較を提示する。
【図９】実施例４ｂの結果−特定の添加物の効果の比較を提示する。
【図１０】実施例４ｃの結果−−特定の添加物の効果の比較を提示する。
【図１１】ｔＨＤＡによるアンプリコン産生の分析および確認を提示する。棒グラフは、典型的な４つの標的多重（４重）から収集されたＳ／Ｎデータを示す。双方のＣＴアンプリコンは、検定を簡略化するために検出に使用される１つのフルオロフォアを有するように最適化されている。
【図１２】ｔＨＤＡによるアンプリコン産生の分析および確認を提示する。融解分析は、４つのアンプリコン全てが存在することを示す。
【図１３】ｔＨＤＡによるアンプリコン産生の分析および確認を提示する。ゲル分析は、所望の増幅された産物の存在を確認する。
【図１４】ｔＨＤＡによるアンプリコン産生の分析および確認を提示する。４重のリアルタイム分析は、４つのアンプリコンの検出を示す（それらのうちの２つは、同一のフルオロフォアを共有する：緑＝内部対照、青＝ＣＴ潜在プラスミド標的／ＣＴゲノム標的、赤＝ＮＧ標的）。
【図１５】ＨＡＤの図表を提示する。Ａ：太い最上部の鎖および細い下部の鎖がヘリカーゼ（青色の円形）によって分離されたときの、ＳＳＢ（オレンジ色の円形）によって結合された相補的なＤＮＡ鎖が示される。Ｂ：標的領域のｓｓＤＮＡテンプレートと相補的なプライマー（黒色の矢印）のハイブリダイゼーション。Ｃ：テンプレートＤＮＡとハイブリッド形成されたプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（青色のひし形）によって伸長される。Ｄ：増幅された産物は、別のサイクルの増幅に入る。
【図１６】実施例で使用されるプライマーおよびプローブの幾つかの配列を提供する。
【図１７】ＮＧの存在を特定するために使用される、修飾されたＴａｑＭａｎプローブを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、１つ以上の標的核酸のコピー数を判定することを対象とした方法およびシステムを含む。開示の方法および組成物は、本明細書に含まれる具体的な実施形態および実施例の次の詳細な説明、ならびに図とそれらの前のおよびそれに続く説明の参照によって、より容易に理解することができる。
【００１１】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、上記または下記に関わらず、本明細書に説明および特許請求される本発明の日付の時点で当業者に既知の最新技術をより完全に説明するために、参照によりそれらの全体がこれによって本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の合成方法に、または特に指示がない限り特定の組み換えバイオテクノロジー法に、または特に指示がない限り具体的な試薬に限定されないことを理解されたい。
【００１２】
クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）およびナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）は、現在のところ米国で報告される２つの最も流行している性感染症である。現在のところ、ＣＴおよびＮＧの同時検出のために複数の診断試験が利用可能である一方で、それらの幾つかはＰＣＲベースであり、したがって高処理能力により自動化することは困難である。
【００１３】
好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（ｔＨＤＡ）は、ＰＣＲよりも単純な自動化を可能にする新規の等温増幅技術である。ｔＨＤＡは、ヘリカーゼを利用して２本鎖ＤＮＡをほどき、故に熱サイクルを不要にする。エンドポイント蛍光検出と併せて、ｔＨＤＡ等温反応は、容易に自動化可能な診断試験のためのＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲの潜在的な代替手段を提供する。
【００１４】
一部には、ＣＴおよびＮＧの双方から選択された標的遺伝子を増幅するために利用されるｔＨＤＡ検定が本明細書に記載される。ＣＴ増幅プライマーおよび二重標識蛍光プローブについては、潜在プラスミドおよびゲノムＤＮＡ配列の標的領域が設計された。ＮＧについては、マルチコピーｏｐａ遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブが使用された。この態様について、ｔＨＤＡ産物の検出のために、二重標識プローブを用いたエンドポイント蛍光検出が利用された。検出は、アンプリコンキャリオーバー汚染を回避するために、増幅の後にプレートを開くことなく均一フォーマットで行われた。
【００１５】
また、増幅対照の存在下で、ＮＧと、ＣＴからの二重標的遺伝子との、同時増幅および検出を可能にする、多重化ｔＨＤＡ ＣＴ／ＮＧプロトタイプ検定も本明細書に開示される。本検定は、ＣＴおよびＮＧ病原体双方に対する１０〜２５コピーの感度を達成している。
【００１６】
本明細書に記載される方法および実施例の結果として、ｔＨＤＡは、均一エンドポイント蛍光検出と併せて、多標的ＣＴ／ＮＧ検出検定の開発のための好適な技術プラットフォームを提供し、熱サイクル装置を必要とせずに、高分析感度を可能にする。
【００１７】
別の態様では、Ｃ．トラコマチスを増幅および検出する方法が説明される。この方法では、潜在プラスミドおよびゲノムＤＮＡ配列の領域を標的とする、ｔＨＤＡ増幅プライマーおよびＴａｑｍａｎプローブが設計された。Ｎ．ゴノレアについては、マルチコピーｏｐａ遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブが使用された。増幅反応の阻害を検出するために、増幅のためにＣＴプライマーを利用する増幅阻害対照が、本検定に含まれた。ｔＤＨＡ検定は、リアルタイム検出プラットフォーム上で、６５℃で１２０分間実行される２５μｌの反応、次いで２５℃でのエンドポイント蛍光の読み取りからなる。
【００１８】
また、２つの多重化ｔＨＤＡ ＣＴ／ＮＧプロトタイプ検定も本明細書に説明され、そのうちの１つは使用のために最適化されている。双方のプロトタイプ検定は、増幅対照の存在下で、Ｎ．ゴノレアと、Ｃ．トラコマチスからの二重標的遺伝子との、同時増幅および検出を可能にする。この態様の検定期間は、およそ１２０分間であり、エンドポイント検出およびセットアップのための追加的時間を含めて、総検定時間は３時間以内となる。最適化された等温多重化検定は、双方の病原体に対する１０〜２５コピーレベルの感受性を達成し、Ｓ／Ｎ値は３超であった（図１１）。リアルタイムデータ表示標的は、首尾よく増幅および検出される（図１２）。各標的アンプリコンに対して１つである融解曲線分析は、４つの明確なピークを示し（図１３）、この結果は、４％アガロースゲルを用いてさらに確認される（図１４）。
【００１９】
また、複合的な異なる検出技術を用いて使用可能な好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（「ｔＨＤＡ」）検定も本明細書に説明され、それは以下を含むが、それらに限定されない：ＬｕｍｉｎｅｘのｘＭＡＰ、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムもしくはエンドポイント蛍光検出、Ｅｖａｇｒｅｅｎ染色を用いた融解曲線分析、またはアガロースゲル電気泳動。本明細書に記載される本方法は、「ヘリカーゼ依存性増幅」（ＨＤＡ）に対する改善を提供する。ＨＤＡは、ＤＮＡ二重鎖の２つの鎖を分離するために、熱よりもむしろヘリカーゼを使用し、標的核酸の体外増幅の目的で１本鎖テンプレートを生成する。配列特異的プライマーは、テンプレートとハイブリッド形成し、次いで標的配列を増幅するためにＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。このプロセスは、単一の温度で指数関数的増幅が達成され得るように反復される。
【００２０】
例えば、ｔＨＤＡが、熱と組み合わされたアルカリ変性ステップを利用してｔＨＤＡの前に２本鎖標的核酸を変性させる方法が、本明細書に記載される。ＣＴ／ＮＧ ｔＨＤＡ検定のために、ＮａＯＨによる６５℃での標的変性を利用して１０〜１００コピーの感度を達成した。化学変性は、全ての標的に対して、特に多重化ｔＨＤＡ反応において、温度変性（９５℃）よりも一貫した結果をもたらす。標的のアルカリ変性は、ｄｓＤＮＡを用いたｔＨＤＡ検定の性能を改善する（実施例１参照）。
【００２１】
また、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法も本明細書に説明され、本方法は、（ａ）増幅対象の標的核酸を提供するステップを含む。標的核酸が２本鎖であるとき、それは、ステップ（ｂ）の前に、５０ｍＭ ＮａＯＨの存在下で、６５℃で１０分間加熱することによって変性される。ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の標的核酸とハイブリッド形成するためのオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップを伴う。ステップ（ｃ）は、二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、テンプレートと相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップである。次いでステップ（ｄ）では、ステップ（ｃ）の二重鎖が、二重鎖をほどくためのヘリカーゼ調製物と接触させられる。ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼと、ヘリカーゼ調製物が１本鎖結合タンパク質が任意選択である熱安定性ヘリカーゼを含まない限り、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む。最後に、ステップ（ｂ）〜（ｄ）は、ヘリカーゼ依存性反応において、標的核酸を指数関数的および選択的に増幅するために反復される。
【００２２】
また、生物学的試料から標的核酸を増幅する方法も本明細書に記載される。標的核酸（ＤＮＡ）を含有する生物学的試料は、ＲＮＡプローブおよびハイブリッド捕捉抗体（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを認識する抗体）を伴う前処理に供される。標的核酸（ＤＮＡ）を含有する生物学的試料は、標的核酸と相補的で標的核酸に特異的に結合するＲＮＡプローブと組み合わされる。ＲＮＡプローブが標的核酸に結合するとき、それらはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する。次いで、磁気ビーズに結合するハイブリッド捕捉抗体（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを認識する抗体）が、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する試料に添加される。次いで、あらゆる非結合ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを除去するために、これらのビーズは洗浄される。次いで、これらのビーズは、ＨＤＡ増幅に直接使用される。完全なｔＨＤＡ検定におけるハイブリッド捕捉試料調製物の使用は、標的変性ステップの省略を可能にする。（実施例２参照）。
【００２３】
幾つかの態様では、ｔＨＤＡ検定は、複数の検出方法と共に使用可能であり、それはＬｕｍｉｎｅｘ（ＬＭＸ）検出、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムもしくはエンドポイント蛍光検出、Ｅｖａｇｒｅｅｎ染色を用いた融解曲線分析、およびアガロースゲル電気泳動を含むが、それらに限定されない。また、リアルタイムＰＣＲ検出におけるｔＨＤＡ検定の産物と共に使用可能な、修飾されたＴａｑＭａｎプローブも本明細書に記載される。この態様では、完全なｔＨＤＡ検定が使用され、リアルタイムＰＣＴ反応で使用するために、修飾されたＴａｑＭａｎプローブが、反応物に添加される。修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、５’または３’末端と相補的な３’および５’末端に短尾を有する。修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、この短尾を除いて標的核酸と相補的であり、短尾配列は、ステムループ構造を形成する。この修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、いかなる標的配列も含有しないステム−ループを形成する分子ビーコンとは異なる。ＴａｑＭａｎプローブは、フルオロフォアおよび消光剤で標識化された線形プローブである。しかしながら、それらはしばしば、不完全な消光のために、高蛍光バックグラウンドを産生し、したがってシグナル対バックグラウンド比を大幅に減少させる。本発明の修飾されたＴａｑＭａｎプローブのステム−ループヘアピン構造は、消光効率を最大化し、バックグラウンドシグナルを最小化することができる。したがって、ｔＨＤＡのエンドポイント蛍光検出についてのシグナル対ノイズ比は、大幅に増大する。（実施例３参照）。
【００２４】
また、反応に亢進剤を含めることによって、ｔＨＤＡ増幅における困難な標的の収率および特異性を改善するために使用可能な方法および試薬も本明細書に記載される。薬剤には、以下が含まれる：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）、ソルビトール、または硫酸デキストラン。ＤＭＳＯは、概して１〜２％の最終濃度で使用された。ベタインは、概して最終濃度０．１Ｍ〜０．５Ｍで使用された。ソルビトールは、概して０．１Ｍ〜０．３Ｍの最終濃度で使用された。硫酸デキストランは、概して１０ｐＭ〜１ｎＭの最終濃度で使用された。幾つかの標的標準ｔＨＤＡ増幅条件は、許容される結果を生み出さない。それらの場合には、反応の収率および特異性を増加させるために使用可能な幾つかの添加物が存在する。ベタインおよびＤＭＳＯは、単独でまたは組み合わせで効果的な、２つの頻繁に使用されるＰＣＲ添加物である。我々は、ｔＨＤＡ増幅の効率および特異性をも増加させる、それらの有用性を示している。ＤＭＳＯと組み合わせたソルビトールの使用もまた、特定のｔＨＤＡ多重化の性能に対して、幾らかの有益な効果を示した。また、ソルビトールおよびＤＭＳＯをｔＨＤＡ反応に添加することは、非特異的増幅を低減させる一助となった。ＤＭＳＯは、ＤＮＡ鎖分離を促進することによって機能する。それは特に、ＧＣリッチテンプレートに有用である。ベタインもまた、アイソ安定化剤として、二次構造形成の低減に作用する。ソルビトールは、水分子を反応物から除去することによって、タンパク質安定剤として作用する。したがって、ソルビトールは、増幅反応の間の活性の喪失に対して、ヘリカーゼおよびポリメラーゼを保護することができる。（実施例４参照）。
【００２５】
また、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅する方法も本明細書に記載される。例えば、２本鎖標的核酸を増幅する方法が本明細書に開示され、この方法は、（ａ）標的核酸を変性させるステップと、（ｂ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、変性させた標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブは、変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、１つ以上の捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｅ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｆ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む。
【００２６】
また、ヘリカーゼ依存性反応において１本鎖標的核酸を増幅する方法も本明細書に説明され、この方法は、（ａ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１本鎖標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｂ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｄ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｅ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む。
【００２７】
本明細書に記載される方法によって増幅された標的核酸を検出する方法もまた開示される。
【００２８】
定義および命名
本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を説明する目的にすぎず、限定するようには意図されていない。
【００２９】
明細書および添付の特許請求に使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含んでもよい。したがって、例えば、「調製（ａ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」という場合、化合物の混合物を含み、他も同様である。「構成成分（ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」という場合、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、単一もしくは複数の構成成分または構成成分の混合物を含んでもよい。
【００３０】
範囲は、「約」１つの特定値から、および／または「約」別の特定値までとして、本明細書に表現され得る。「約」という用語は、およそ、その領域内の、大体、またはその前後を意味するように本明細書で使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、それは示される数値の上方および下方に境界を延長することによってその範囲を修飾する。概して、「約」という用語は、指定された値の上方および下方の数値を２０％の変化量だけ修飾するように、本明細書において使用される。かかる範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定値から、および／またはもう１つの特定値までを含む。同様に、値の前に「約」という文言を付して、値が近似値として示されるとき、特定値は、別の実施形態を形成することが理解されよう。範囲の各々の終点は、もう１つの終点に関連して、かつもう１つの終点から独立して、有意であることがさらに理解されよう。
【００３１】
本明細書で使用される「または」という単語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、また、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
【００３２】
「試料」とは、動物；動物からの組織もしくは臓器；細胞（対象内にあり対象から直接採取されるか、または培養物中に維持されるか培養細胞株からの細胞のいずれか）；細胞溶解物（または溶解物分画）もしくは細胞抽出物；または細胞もしくは細胞物質（例えば、ポリペプチドまたは核酸）に由来する１つ以上の分子を含有する溶液を意味し、本明細書に記載される通りに検定される。試料はまた、細胞または細胞構成成分を含有する、任意の体液または排泄物（例えば、血液、尿、便、唾液、涙液、胆汁であるがそれらに限定されない）であってもよい。
【００３３】
「核酸」という用語は、２本鎖または１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。本明細書で使用される「核酸」という語句は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、１本鎖または２本鎖、センスまたはアンチセンスに関わらず、天然産または合成オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを指し、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋベースの対形成によって相補的な核酸とハイブリッド形成することができる。本発明の核酸はまた、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、および非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）も含むことができる。具体的には、核酸は、制限なしに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。２本鎖核酸分子であるそれらの核酸は、切れ目が入るか、または無処置であってもよい。２本鎖または１本鎖核酸分子は、線形または環状であってもよい。二重鎖は、平滑末端であってもよく、または１本鎖尾を有してもよい。１本鎖分子は、ヘアピンまたはループおよびステムの形態の二次構造を有してもよい。核酸は、環境、食物、農業、発酵、血液、乳、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引物、粘膜組織または組織試料または細胞のスワブ等の生体液を含む種々の源から単離されてもよい。核酸試料は、細胞またはウイルスから獲得されてもよく、次のいずれを含んでもよい：染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む染色体外ＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、ＤＮＡ断片、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、または細胞もしくはウイルス中で生じる他のＲＮＡ。上述の核酸のいずれも、核酸内の個々のヌクレオチドが、化学的に変化させられる（例えば、メチル化によって）修飾に供されてもよい。修飾は、天然にまたは体外合成によって生じてもよい。
【００３４】
「標的核酸」という用語は、増幅、検出、または他の方法で特定されることが求められる核酸を指す。特定の実施形態では、標的核酸は、クラミジア・トラコマチス（「ＣＴ」）またはナイセリア・ゴノレア（「ＮＧ」）ＤＮＡもしくはＲＮＡである。
【００３５】
「二重鎖」または「ハイブリッド」という用語は、全体または一部が２本鎖である核酸分子を指す。例えば、「２本鎖プローブ−標的ハイブリッド」は、オリゴヌクレオチドプローブが、変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、オリゴヌクレオチドプローブが変性させた標的核酸と特異的にハイブリッド形成される領域において、２本鎖核酸分子を形成するときに形成される核酸分子を指す。
【００３６】
「融解する」、「ほどく」、または「変性させる」という用語は、核酸二重鎖または核酸ハイブリッドの２つの相補的な鎖の全てまたは一部を分離することを指す。
【００３７】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリッド形成する」という用語は、組成物が、別の組成物を認識し、それと物理的に相互作用することを意味する。例えば、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴヌクレオチドプライマーの、１本鎖核酸テンプレートの領域との結合を指すことができる。
【００３８】
「特異的に結合する」または「特異的にハイブリッド形成する」とは、組成物が、その同族標的を認識し、それと物理的に相互作用することを意味する。例えば、プライマーは、その標的核酸に特異的に結合することができる。例えば、潜在プラスミドに存在する配列に特異的なプライマーは、潜在プラスミドと特異的にハイブリッド形成することができるが、他の標的または標的核酸配列を有意に認識し、それと相互作用することはない。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度、イオン強度、およびｐＨによって影響を受ける可能性がある。
【００３９】
「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」とは、相補的な配列（「標的」）を含有する第２のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と塩基対形成することができる、規定の配列の１本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。「プライマー」という用語はまた、標的核酸のポリメラーゼ依存性複製を促進するために、標的核酸上の１本鎖領域に結合することができる１本鎖核酸も指す。得られたハイブリッドの安定性は、生じる塩基対形成の程度に依存する。塩基対形成の程度は、プローブと標的分子との間の相補性の度合いおよびハイブリダイゼーション条件の厳格度等のパラメータによって影響を受ける。ハイブリダイゼーション厳格度の度合いは、温度、塩濃度、およびホルムアミド等の有機分子の濃度等のパラメータによって影響を受け、当業者に既知の方法によって判定される。標的核酸に特異的なプローブまたはプライマー（例えば、遺伝子および／またはｍＲＮＡｓ）は、それらがハイブリッド形成する標的の領域に対して、少なくとも８０％〜９０％の配列相補性、少なくとも９１％〜９５％の配列相補性、少なくとも９６％〜９９％の配列相補性、または少なくとも１００％の配列相補性を有する。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、放射性または非放射性のいずれかで、当業者に周知の方法によって検出可能に標識化されてもよい。プローブまたはオリゴヌクレオチドプローブは、以下等の核酸ハイブリダイゼーションを伴う方法に使用可能である：オリゴヌクレオチドプローブと変性させた標的核酸との間に、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、記載の方法。プライマーおよびオリゴヌクレオチドプライマーは、以下等の核酸ハイブリダイゼーションを伴う方法に使用可能である：標的核酸と相補的な、またはｔＨＤＡ反応において標的核酸を増幅するために、標的核酸とハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成すること。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドはまた、ポリメラーゼ鎖反応、１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限断片多型（ＲＦＬＰ）分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、Ｎｏｒｔｈｅｒｎハイブリダイゼーション、インサイツハイブリダイゼーション、および電気泳動移動度シフト検定（ＥＭＳＡ）による、核酸配列決定、逆転写および／または核酸増幅にも使用可能である。
【００４０】
「プライマーセット」とは、各々、同一の標的配列の反対側の鎖と相補的な配列を含有する少なくとも２つのプライマーを意味することが意図される。プライマーセットにおいて、２つのプライマーのうちの少なくとも１つは、「順方向プライマー」であるべきで、２つのプライマーのうちの少なくとも１つは、「逆方向プライマー」であるべきである。「順方向プライマー」は、標的核酸センス鎖と相補的なプライマーであり、ここで「逆方向プライマー」は、標的核酸のセンス鎖の補体と相補的なプライマー（標的核酸のアンチセンス鎖とも称される）である。プライマーセットは、ｔＨＤＡ反応に使用可能なプライマーの対であってもよい。
【００４１】
同様に、「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、相補的な配列を含有する第２のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と塩基対形成することができる、規定の配列の１本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味することが意図される。本発明に従って、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のポリヌクレオチドプローブが、変性させた標的核酸型２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成するのに十分な条件下で、変性させた核酸配列と接触させられる。幾つかの態様では、標的核酸は、ＤＮＡであり、オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡである。
【００４２】
「アンプリコン」とは、天然または人工増幅事象の産物としてのＤＮＡ片を意味することが意図される。例えば、それらは本明細書に記載される方法、ｔＨＤＡ、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、またはリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）を介して、ならびに天然の遺伝子重複によって、形成されてもよい。
【００４３】
「特異的にハイブリッド形成する」とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高厳格度条件下で、実質的に相補的な核酸（例えば、標的核酸）を認識し、それと物理的に相互作用し（つまり、塩基対形成する）、他の核酸とは実質的に塩基対形成しないことを意味する。
【００４４】
「高厳格度条件」とは、６５℃の温度で、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（分画Ｖ）を含有する緩衝剤、または４２℃の温度で、４８％ホルムアミド、４．８Ｘ ＳＳＣ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ＳＤＳを含有する緩衝剤中で、少なくとも４０ヌクレオチド長のＤＮＡプローブを使用することから得られるハイブリダイゼーションに匹敵するハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。ＰＣＲ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、またはインサイツハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定等の、高厳格度ハイブリダイゼーションのための他の条件は、分子生物学の分野に精通する者に周知である。（例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９８を参照されたい）。
【００４５】
「アクセサリータンパク質」という用語は、使用されてもよいヘリカーゼ活性を刺激することができる任意のタンパク質を指す。例えば、大腸菌ＭｕｔＬタンパク質は、ＵｖｒＤヘリカーゼ融解活性を亢進するためのアクセサリータンパク質である（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：９１９７ ９２０１（１９９８）、Ｍｅｃｈａｎｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８３３７ ３８３４６（２０００））。本方法の実施形態では、アクセサリータンパク質は、選択されたヘリカーゼと共に使用可能である。代替的実施形態では、核酸のアンワインドは、アクセサリータンパク質の非存在下で、ヘリカーゼによって達成されてもよい。
【００４６】
特定の実施形態では、「補因子」が使用されてもよい。「補因子」は、ヘリカーゼアンワインド活性に必要とされる小分子剤を指す。ヘリカーゼ補因子には、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）およびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびマグネシウム（または他の二価陽イオン）が含まれる。例えば、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）は、０．１ １００ｍＭの範囲、および好ましくは１〜１０ｍＭの範囲（例えば、３ｍＭ）の濃度で、ＵｖｒＤヘリカーゼのための補因子として使用されてもよい。同様に、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）は、Ｔ７ Ｇｐ４Ｂヘリカーゼのために、１ １０ｍＭ（例えば、３ｍＭ）の範囲で、補因子として使用されてもよい。
【００４７】
「ＨＤＡ」という用語は、プライマーハイブリダイゼーションおよび後続のプライマー伸長のためのテンプレートを生成するために、２本鎖核酸をほどくためのヘリカーゼ調製物を用いることによって、核酸を増幅するための体外方法である、ヘリカーゼ依存性増幅（Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を指す。このプロセスは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、その各々は、標的配列を含有するセンス鎖または逆相補的な標的配列を含有するアンチセンス鎖のいずれかの３’末端とハイブリッド形成する。ＨＤＡ反応は、ヘリカーゼ依存性核酸増幅のための一般的方法である。
【００４８】
「好熱性ヘリカーゼ依存性増幅」または「ｔＨＤＡ」は、ヘリカーゼを利用して２本鎖ＤＮＡをほどき、熱サイクルを不要にする等温増幅技術を指す。ｔＨＤＡは、真の等温ＤＮＡ増幅法であり、ＰＣＲに類似した単純な反応スキームを有する。基本的な、ｔＨＤＡは、米国特許第７，２８２，３２８号明細書（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）に記載され、参照によりその全体がこれによって組み込まれる。
【００４９】
「等温増幅」という用語は、単一の温度で生じる増幅を指す。これは、増幅手順として同一の温度でまたはより高温で行われ得る増幅の開始時の、単一の短時間（１５分間未満）を含まない。
【００５０】
「ヘリカーゼ調製物」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸テンプレート、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸、およびオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わされるとき、体外で等温の特異的核酸増幅を達成することができる試薬の混合物を指す。
【００５１】
「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、相補的な配列を含有する第２のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と塩基対形成することができる、規定の配列の１本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。本明細書に記載される方法に従って、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のポリヌクレオチドプローブが、変性させた標的核酸型２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成するのに十分な条件下で、変性させた核酸配列と接触させられる。
【００５２】
本明細書で、「ヘリカーゼ」という用語は、２本鎖核酸を酵素的にほどくことができる任意の酵素を指す。例えば、ヘリカーゼは、全ての生物に、ならびに複製、組み換え、修復、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング等の、核酸を伴う全てのプロセスに見出される酵素である。（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（２ｎｄ ｅｄ．（１９９２））、特に１１章）。
【００５３】
「検出標識」という用語は、直接にまたは間接に、増幅された標的核酸と会合可能であり、直接にまたは間接に、測定可能で検出可能なシグナルをもたらす任意の分子を指す。
【００５４】
物質
開示の方法および組成物のために使用可能であり、開示の方法および組成物と併せて使用可能であり、開示の方法および組成物の調製に使用可能な物質、組成物、および構成成分、または開示の方法および組成物の産物が開示される。これらのおよび他の物質が本明細書に開示されているが、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の各様々な個々のおよび集合的な組み合わせならびに置換の特定の参照が明白に開示されない可能性がある一方で、各々が具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、オリゴヌクレオチドプローブが開示および説明され、オリゴヌクレオチドプローブを含む幾つかの分子に対して行なうことのできる幾つかの修飾が説明される場合、特にそれとは反対の指示がない限り、オリゴヌクレオチドプローブの各々およびあらゆる組み合わせおよび置換、ならびに可能な修飾が具体的に企図される。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラス、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスと組み合わせ分子Ａ−Ｄの例とが開示される場合、たとえ各々が個々に列挙されていなくても、各々は個々におよび集合的に企図されるものとする。したがって、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの各々は、具体的に企図され、Ａ、Ｂ、およびＣと、Ｄ、Ｅ、およびＦと、例示的組み合わせＡ−Ｄとの開示から開示されたものと考えるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図および開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループは、具体的に企図され、またそれがＡ、Ｂ、およびＣと、Ｄ、Ｅ、およびＦと、例示的組み合わせＡ−Ｄとの開示から開示されたものと考えるべきである。この概念は、開示の組成物を作製し、使用する方法のステップを含むが、それらに限定されない本開示の全ての態様に適用する。したがって、行うことができる種々の追加的ステップが存在する場合、これらの追加的ステップの各々が、任意の特定の実施形態または開示の方法の実施形態の組み合わせを用いて行われてもよいこと、またかかる組み合わせの各々が具体的に企図され、開示されたものとして考えられるべきであることが理解される。
【００５５】
Ａ．ハイブリッド捕捉のための組成物
１．標的核酸
開示の組成物は、直接にまたは間接に、標的核酸と相互作用するように設計される。「標的核酸」は、増幅、検出、または他の方法で特定されることが求められるあらゆる核酸であってもよい。概して、任意の天然核酸、合成核酸、修飾された核酸、または核酸誘導体が、標的核酸であってもよい。標的核酸は、制限なしに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。例えば、特定の態様では、標的核酸は、クラミジア・トラコマチス（「ＣＴ」）またはナイセリア・ゴノレア（「ＮＧ」）ＤＮＡである。
【００５６】
加えて、標的核酸は、１本鎖または２本鎖であってもよい。核酸は、環境、食物、農業、発酵、尿、血液、乳、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引物、粘膜組織または組織試料または細胞のスワブ等の生体液を含む種々の源から単離されてもよい。上述の標的核酸のいずれも、核酸内の個々のヌクレオチドが化学的に変化させられる（例えば、メチル化によって）修飾に供されてもよい。修飾は、天然にまたは体外合成によって生じてもよい。
【００５７】
開示の方法は、標的核酸を増幅、検出、または特定するために使用可能である。また、開示の方法は、標的核酸間の差異または対照核酸との差異を、増幅、検出、または特定するためにも使用可能である。標的核酸はまた、好ましくは配列内で、直接にまたは間接に基質と会合可能である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、文脈上、特に指示がない限り、標的核酸という用語は、実際の核酸、およびより大きい核酸分子の一部である核酸配列の両方を指す。
【００５９】
２．標的試料
標的核酸を含有する試料、または標的核酸を含有し得る試料は、標的試料と称されてもよい。標的核酸試料は、細胞またはウイルスから獲得されてもよく、次のいずれかを含んでもよい：染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む染色体外ＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、ＤＮＡ断片、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、または細胞またはウイルス中で生じる他のＲＮＡ。
【００６０】
標的試料は、標的核酸を有するか、または標的核酸を有することが疑われる任意の源に由来してもよい。標的試料は、標的核酸の源であってもよい。標的試料は、例えば、標的核酸等のＤＮＡまたはＲＮＡを含有してもよい。標的試料は、天然標的核酸、化学的に合成された標的核酸、またはその両方を含んでもよい。標的試料は、例えば、１つ以上の細胞からの試料、組織、または血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、もしくは羊水等の体液、または組織培養物細胞、口腔スワブ、鼻腔スワブ、痰、口内洗浄液、便、組織薄片、吸引生検等の他の生物学的試料、および骨またはミイラ化組織等の考古学的試料であってもよい。有用な標的試料のタイプには、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、穿刺吸引生検試料、癌試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、産生試料、薬物調製試料、生物学的分子産生試料、タンパク質調製試料、脂質調製試料、および／または炭水化物調製試料が含まれる。
【００６１】
標的核酸試料は、標的核酸を有するか、または標的核酸を有することが疑われる任意の源に由来してもよい。標的核酸試料は、標的核酸分子および標的核酸配列の源である。標的核酸試料は、例えば、標的核酸、例えば、特定のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子のプール、特定のＤＮＡ、または特定のウイルスＲＮＡを含有してもよい。標的核酸試料は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはその両方を含有してもよい。特定の態様の標的核酸試料はまた、化学的に合成された標的核酸を含んでもよい。標的核酸試料は、任意のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド置換、またはヌクレオチド共役を含んでもよい。
【００６２】
３．オリゴヌクレオチドプローブ
「オリゴヌクレオチドプローブ」は、相補的な配列を含有する第２のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と塩基対形成することができる、規定の配列の１本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。本発明に従って、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のポリヌクレオチドプローブが、変性させた標的核酸型２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成するのに十分な条件下で、変性させた核酸配列と接触させられる。幾つかの態様では、標的核酸は、ＤＮＡであり、オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡである。オリゴヌクレオチドプローブは、１５〜１００ヌクレオチドであってもよい。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、２０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。
【００６３】
幾つかの態様では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、転写された完全長ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブとは対照的に、短いオリゴヌクレオチドプローブである。これらの短いＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブはまた、本明細書で合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブまたは「ｓｙｎＲＮＡ」と称されてもよい。幾つかの態様では、標的核酸は、ＲＮＡであり、オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡである。
【００６４】
態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブが使用される（すなわち、１つを超えるプローブ）。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の標的核酸に特異的であってもよい。例えば、増幅または検出されるべき２つの標的核酸が存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブは、各々と特異的にハイブリッド形成することができるが、標的核酸の両方を使用できるわけではない。例えば、ＣＴおよびＮＧの双方は、ＣＴに特異的な１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブおよびＮＧに特異的な１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、同一の反応において増幅可能である。
【００６５】
幾つかの態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸の約３〜４ｋｂのカバレッジを確保するために使用可能であり、それは強力で、可読のシグナルを確保する。幾つかの態様では、本明細書に記載される方法を用いたＣＴの増幅または検出は、表１に列挙される、次のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上を用いることができる。
【００６６】
【表１】

【００６７】
幾つかの態様では、本明細書に記載される方法を用いたＣＴの増幅または検出は、表２に列挙される、次のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上を用いることができる。
【００６８】
【表２−１】

【００６９】
【表２−２】

【００７０】
幾つかの態様では、本明細書に記載される方法を用いたＮＧの増幅または検出は、表３に列挙される、次のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上を用いることができる。
【００７１】
幾つかの態様では、本明細書に記載される方法を用いたＮＧの増幅または検出は、表４に列挙される、次のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上を用いることができる。
【００７２】
幾つかの態様では、内部対象配列はまた、増幅または検出されることができ、表５に列挙される、次のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上を用いることができる。
【００７３】
幾つかの態様では、多数セットのプローブを含むオリゴヌクレオチドプローブ混合物は、所望の標的核酸の混合物のうちの任意の１つ以上を同時にスクリーニングするために使用される。例えば、同一の試料中におけるＮＧおよびＣＴの存在について、生物学的試料をスクリーニングすることが望ましい可能性がある。かかる状況では、表１〜５に提供されるプローブのうちの幾つかのプローブ混合物、および場合によっては、それらの全てが使用される。例えば、プローブ混合物は、ＣＴ、ＮＧならびに内部対照のためのプローブセットを提供するように設計可能である。さらに、多数のオリゴヌクレオチドプローブは、同一の標的配列の異なる領域とハイブリッド形成するために使用可能である。
【００７４】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプローブは、非常に類似した関連標的核酸配列に対しても優れた特異性を達成しながら、１つ以上の標的核酸配列の高感度な検出を可能にする。
【００７５】
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、利用されるハイブリダイゼーション条件下で、それらが標的核酸の変異型、または非標的核酸配列とハイブリッド形成しないように設計可能である。１セット当たりに用いられる、異なるオリゴヌクレオチドプローブの数は、所望の感度に依存する。対応するオリゴヌクレオチドプローブを用いた、核酸標的のより高いカバレッジにより、より強力なシグナルを提供することができる（捕捉抗体が結合するための、より多くのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが存在するであろうため）。
【００７６】
【表３−１】

【００７７】
【表３−２】

【００７８】
【表４】

【００７９】
【表５】

【００８０】
１つ以上のポリヌクレオチドプローブを判定する１つの方法は、米国特許出願第１２／４２６，０７６号に見出すことができ、この特許は、特にオリゴヌクレオチドプローブのその教示ならびに同プローブを用いる方法および特定する方法について、参照によりその全体が具体的に組み込まれる。例えば、目的の標的核酸および対応する非標的核酸に依存して、１つ以上のポリヌクレオチドプローブは、追求される標的核酸配列との標的特異的なハイブリダイゼーションを提供するのに十分な長さを有するように調製可能である。
【００８１】
１つ以上のポリヌクレオチドプローブは、各々、少なくとも約１５ヌクレオチド、例証的に、約１５〜約１０００、約２０〜約８００、約３０〜約４００、約４０〜約２００、約５０〜約１００、約２０〜約６０、約２０〜約４０、約２０〜約２０、および約２５〜約３０ヌクレオチドの長さを有することができる。幾つかの態様では、１つ以上のポリヌクレオチドプローブは、各々、約２５〜約５０ヌクレオチドの長さを有する。幾つかの態様では、プローブは、２５ヌクレオチドの長さを有する。幾つかの態様では、セット内のプローブの全ては、２５ヌクレオチド等の同一の長さを有し、また同一のハイブリダイゼーション条件下で、セット内のプローブの全てのハイブリダイゼーションを可能にするように、非常に類似した融解温度を有するであろう。
【００８２】
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを判定するために、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓツールが用いられてもよい。例えば、特定のオリゴヌクレオチドを設計するソフトウェアプログラムである、Ｏｌｉｇｏａｒｒａｙ２．０が利用されてもよい。Ｏｌｉｇｏａｒｒａｙ２．０は、Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１：３０５７−３０６２（２００３）によって記載され、この参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｏｌｉｇｏａｒｒａｙ２．０は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）およびＭｆｏｌｄ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の機能性を組み合わせるプログラムである。Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３（１９９３）による統計的マッチング理論を実行するＢＬＡＳＴは、所定の問い合わせ配列にマッチするヌクレオチド配列を迅速に検出するために広範に使用されるプログラムである。当業者は、例えば、ＣＴまたはＮＧの存在または非存在と照合されるべき配列のデータベースを提供することができる。次いで目的の標的配列、例えば、ＣＴに対する外膜タンパク質遺伝子は、あらゆる同一性領域を検索するために、そのデータベースと照らし合わせてＢＬＡＳＴにかけられてもよい。次いで融解温度（Ｔｍ）および％ＧＣは、特定の長さの１つ以上のポリヌクレオチドプローブについてコンピュータ算出し、パラメータと比較可能であり、その後、二次構造もまた試験可能である。一旦、全ての目的のパラメータが満たされると、クロスハイブリダイゼーションは、ＢＬＡＳＴによって判定された類似性を用いて、Ｍｆｏｌｄパッケージで照合可能である。種々のプログラムが、所望の特異性要件を満たす１つ以上のポリヌクレオチドプローブを判定するように適合可能である。例えば、プログラムのパラメータは、５５〜９５℃のＴｍ範囲、３５〜６５％のＧＣ範囲、および５５℃以下の二次構造またはクロスハイブリダイゼーションを含まない、２５ｎｔ長のポリヌクレオチドを調製するように設定可能である。
【００８３】
４．２本鎖プローブ標的ハイブリッド
「２本鎖プローブ−標的ハイブリッド」という用語は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１本鎖標的核酸（本来１本鎖であるか、または１本鎖となるように変性させたかのいずれか）と接触させることから形成される２本鎖分子を指し、ここでオリゴヌクレオチドプローブは、変性させた標的核酸とハイブリッド形成する。例えば、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドは、標的核酸とハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドプローブからなってもよい。２本鎖プローブ−標的ハイブリッドは、１つ以上の捕捉抗体のための標的として機能することができる。
【００８４】
５．捕捉抗体
捕捉抗体はまた、本明細書に記載される方法にも使用可能である。捕捉抗体は、標的核酸配列のための反応を強化するために使用可能である。例えば、説明される方法の幾つかの態様では、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドは、１つ以上の捕捉抗体と接触させられ、ここで１つ以上の捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する。本明細書で使用される場合、「ハイブリッド捕捉抗体」という用語は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的に結合することができる抗体を指す。例えば、「捕捉抗体」という用語は、２本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的な抗体を指すことができる。
【００８５】
開示の方法では、説明される方法に従って形成された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドは、２本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的な１つ以上の捕捉抗体により捕捉可能である。捕捉抗体は、ＲＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、およびそれらの模倣体を含むが、それらに限定されない２本鎖ハイブリッドに免疫特異的であってもよく、この場合、本明細書で定義される「模倣体」は、ＲＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドと同様に機能する分子を指す。使用される捕捉抗体は、形成される２本鎖核酸ハイブリッドのタイプに依存するであろう。一態様では、捕捉抗体は、免疫特異的ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。
【００８６】
当業者であれば、ポリクローナル捕捉抗体またはモノクローナル捕捉抗体のいずれかが、下で説明される本検定において使用されてもよくおよび／または固体支持体もしくは固体相上に固定化可能であることを理解するであろう。標準技術を用いて調製されるモノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体の代わりに使用可能である。また、捕捉抗体の免疫断片または誘導体も含まれ、ここでかかる断片または誘導体は、捕捉抗体の結合領域を含有する。
【００８７】
例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドで免疫付与されたヤギに由来するポリクローナルＲＮＡ：ＤＮＡ特異的抗体を使用可能である。捕捉抗体は、例えば、Ｋｉｔａｗａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９：４１３（１９８２）、および米国特許第４，７３２，８４７号明細書に記載される通り、固体支持体上に固定化されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対する親和性精製によってヤギ血清から精製することができ、これらの参考文献および特許の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
ヒト抗体または人工抗体を含む抗体を産生または単離する他の好適な方法が使用されてもよく、それは例えば、ライブラリから組み換え抗体（例えば、１本鎖ＦｖまたはＦａｂ、またはそれらの他の断片）を選択する方法、またはヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫付与に依存する方法を含む（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）、ならびに米国特許第５，５４５，８０６号明細書および米国特許第５，５４５，８０７号明細書を参照されたい）。
【００８９】
一態様では、判定されるべき標的核酸は、ＤＮＡ（例えば、ＮＧゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核小体ＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ）であり、ここで１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドである。この態様に従って、形成された２本鎖核酸ハイブリッド（すなわち、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである２本鎖プローブ−標的ハイブリッド）は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに免疫特異的な捕捉抗体を用いて捕捉可能である。
【００９０】
任意の脊椎動物が、モノクローナル抗ＲＮＡ／ＤＮＡ捕捉抗体の調製に使用されてもよい一方で、ヤギまたはウサギが好ましい。好ましくは、ヤギまたはウサギは、従来の注射手順に従って合成ポリ（Ａ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドを動物に注射することによって、合成ポリ（Ａ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドで免疫付与される。ポリクローナル捕捉抗体は、周知の抗体単離技術に従って、免疫付与された動物の種に特異的な抗体を備える動物の血液から採取および精製されてもよい。モノクローナル捕捉抗体の産生について、十分な期間の後に脾臓が動物から除去可能であり、脾臓細胞は、ハイブリドーマを産生するために、適切な骨髄腫細胞と融合可能である。次いでハイブリドーマは、抗ハイブリッド抗体を分泌する能力についてスクリーニング可能である。次いで選択されたハイブリドーマは、腹水の産生のために第２の動物の腹膜腔への注射に使用されてもよく、その腹水は抽出され、参照により本明細書に組み込まれる、濃縮された所望のモノクローナル抗体の源として使用されてもよい。
【００９１】
捕捉抗体はまた、ビオチン化され、その後、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた管もしくはシリカ上で固定化可能であり、または固相に共有結合するように他の方法によって修飾可能である。可溶化されたビオチン化捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドの捕捉前に、ストレプトアビジンでコーティングされた管上で固定化可能である。
【００９２】
態様では、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドは、固定化された捕捉抗体による２本鎖プローブ−標的ハイブリッドの捕捉を可能にするために十分な期間にわたって、１つ以上の捕捉抗体でコーティングされた管中でインキュベートされる。２本鎖プローブ−標的ハイブリッドは、インキュベーション、例えば、約１５〜約６５℃での約５分間〜約２４時間にわたるインキュベーションによって、固定化された捕捉抗体に結合可能である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は、約３００〜約１２００ｒｐｍで振とうしながら、約２０〜約４０℃で約３０〜約１２０分間である。別の実施形態では、捕捉は、回転式プラットフォーム上で激しく振とうしながら、室温前後で約１時間のインキュベーションを用いて生じる。当業者であれば、インキュベーション時間、温度、および／または振とうが、所望の代替的捕捉の動力学を達成するために、変化させられてもよいことを理解するであろう。
【００９３】
他の態様では、捕捉抗体は、磁気ビーズ（例えば、ＣＯＯＨビーズ）に結合されてもよい。磁気ビーズベースの技術は、当技術分野で周知である。幾つかの態様では、捕捉抗体と反応するために誘導体化された表面を有する磁気シリカビーズが用いられてもよい。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡ標的核酸に結合するとき、それらは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、次いで、磁気ビーズに結合されるハイブリッド捕捉抗体（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを認識する抗体）は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する試料に添加可能である。一旦、捕捉抗体が２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成すると、それらは、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する。
【００９４】
別の態様では、上述の捕捉抗体は、検出標識と共役可能である。標識化のための共役方法は、当技術分野で周知である。例えば、捕捉抗体は、アルカリホスファターゼ等の検出可能な標識と共役可能である。当業者であれば、酵素、蛍光分子、またはビオチン−アビジン共役等の任意の検出可能な標識が使用されてもよいことを理解するであろう。抗体共役は、一価抗体断片を産出するために、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いるモノクローナル抗体の直接還元等の周知の方法によって、産生可能である。次いで還元された抗体は、Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ４：２０９−２３７（１９８３）およびＭｅａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．１：２−１２（１９９０）の方法によって、マレイミド化アルカリホスファターゼと直接に共役可能であり、得られた共役は、ＨＰＬＣによって精製可能である。
【００９５】
したがって、標的特異的なオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチドは、市販のバイオインフォマティクスソフトウェアを用いて設計可能である。例えば、ｄｓＤＮＡ標的の検出のために、ＤＮＡは、変性させられ、ＲＮＡプローブとハイブリッド形成され、固体支持体上の抗ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド抗体を介して捕捉されてもよい。検出は、化学発光検出のためにアルカリホスファターゼと共役させられた抗ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉抗体を含む、種々の方法によって行うことができる。代替的に、例えば、フィコエリトリンと共役させられた抗ＲＮＡ：ＤＮＡ捕捉抗体を用いる、蛍光による検出に好適な他の検出方法が用いられてもよい。
【００９６】
６．捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッド
本明細書の他の箇所に説明される通り、本方法は、一部には、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを標的核酸（標的核酸が２本鎖である場合には変性させられる）とハイブリッド形成させ、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成することを含む。一旦、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドが形成されると、固体支持体（例えば常磁性ビーズ）と共役させられたハイブリッド捕捉抗体（２本鎖核酸ハイブリッドを認識する抗体）は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドに結合することができる。このため、「２本鎖プローブ−標的ハイブリッド」は、標的核酸配列および捕捉プローブを含む組成物を指し、ここで標的核酸配列およびオリゴヌクレオチドプローブは、互いにハイブリッド形成され（すなわち、２本鎖プローブ−標的ハイブリッド）、捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドに結合される。例えば、幾つかの態様では、本方法は、一部には、１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡ標的核酸とハイブリッド形成させ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成することを含み、次いで磁気ビーズに結合されるハイブリッド捕捉抗体（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを認識する抗体）は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する試料に添加可能である。一旦、捕捉抗体が２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成すると、それらは、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する。
【００９７】
一旦、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドが形成されると、それらは、上述の通りまたは当技術分野で周知の他の方法によって固定化可能である。一旦、固定化されると、捕捉されていない２本鎖プローブ−標的ハイブリッドは、非標的核酸、細胞破片等の、あらゆる捕捉されていない、固定化されていない物質を洗浄除去することによって、反応物から除去可能である。洗浄に使用されるべき溶液は、当技術分野で既知であり、当業者であれば、説明される洗浄を行う方法を理解するであろう。例えば、標的および捕捉プローブを加水分解せず、抗体を変性させない任意の緩衝剤を使用可能である。
【００９８】
例えば、反応物は、次いで、捕捉されていない２本鎖プローブ−標的ハイブリッドまたは非特異的に結合された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドの可能な限り多くを除去するために、洗浄緩衝剤（例えば、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）、およびアジ化ナトリウム）を用いて洗浄可能である。
【００９９】
Ｂ．ｔＨＤＡのための組成物
１．オリゴヌクレオチドプライマー
上述の通り、「ＨＤＡ」という用語は、プライマーハイブリダイゼーションおよび後続のプライマー伸長のためのテンプレートを生成するために、２本鎖核酸をほどくためのヘリカーゼ調製物を用いることによって、核酸を増幅するための体外方法である、ヘリカーゼ依存性増幅（Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を指す。このプロセスは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、その各々は、標的配列を含有するセンス鎖または逆相補的な標的配列を含有するアンチセンス鎖のいずれかの３’末端とハイブリッド形成する。ＨＤＡ反応は、ヘリカーゼ依存性核酸増幅のための一般的方法である。オリゴヌクレオチドプライマーは、それとハイブリッド形成される標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するためにも使用可能である。
【０１００】
本明細書に記載される方法では、使用に好適なオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列またはその補体の１つ以上の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを含むが、それらに限定されない。オリゴヌクレオチドプライマーはまた、エキソヌクレアーゼ分解に抵抗性にさせるように修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、１つ以上のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を有してもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列もしくはその補体に特異的であるか、またはそれに相当する。相補的な部分は、それが、同一の条件下で標的の相補的な部分と完全に相補的な配列の融解温度よりも１０℃低い融解温度を有する場合、別の配列と実質的には相補的でない。
【０１０１】
概して、ＨＤＡにおける使用に好適なプライマー対は、例えば、１０ヌクレオチドよりも長く、５０ヌクレオチドよりも短い長さを有する、短い合成オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプライマー設計は、連鎖ベースの整列スコア、融解温度、プライマー長、およびＧＣ含量等の種々のパラメータを伴う（Ｋａｍｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：２１４ ２２５（２００３））。プライマーを設計するときに重要な要因の１つは、増幅されるべき核酸分子に特異的な標的断片内の配列を選択することである。もう１つの重要な要因は、ＨＤＡ反応のためのプライマーの融解温度を決定することである。プライマーの融解温度は、そのオリゴヌクレオチドの長さおよびＧＣ含量によって判定される。幾つかの態様では、プライマーの融解温度は、ハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるであろう温度よりも約１０〜３０℃高くてもよい。例えば、ハイブリダイゼーションおよび増幅の温度が３７℃に設定される場合、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物を用いるとき、この反応ために設計されたプライマーの対の融解温度は、約４７℃〜６７℃の範囲であるべきである。ハイブリダイゼーションおよび増幅の温度が６０℃である場合、その反応のために設計されたプライマーの対の融解温度は、６５℃〜９０℃の範囲であってもよい。ＨＤＡ反応のための最適なプライマーを選択するために、種々の融解温度を備えるプライマーのセットが平行検定で試験可能である。プライマー設計に関するさらなる情報は、Ｋａｍｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：２１４ ２２５（２００３）によって記載される。
【０１０２】
ＨＤＡ反応における各オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸の各末端とハイブリッド形成し、テンプレートとして標的ヌクレオチド配列を用いるポリメラーゼによって、３’→５’方向に伸長されてもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”２^ｎｄ ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｐｕｂ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００３）に記載される通り、標準である。特定の増幅を達成するために、相同または完全マッチのプライマーが好ましい。しかしながら、プライマーは、５’末端に、標的ヌクレオチド配列と相補的でない配列を含んでもよい。代替的に、プライマーは、全体にわたって、標的核酸と完全には相補的でないヌクレオチドまたは配列を含有してもよい。プライマーは、特異的ハイブリダイゼーションが、所定の温度でプライマー−テンプレート結合によって達成され得る限り、ＨＤＡに使用するために、類似したプライマーを表してもよく、または非特異的もしくはユニバーサルプライマーであってもよい。
【０１０３】
プライマーは、デオキシリボヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣおよび／または１つ以上のリボヌクレオチド塩基、Ａ、Ｃ、Ｕ、Ｇおよび／または１つ以上の修飾されたヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のいずれを含んでもよく、ここで修飾は、プライマーの核酸とのハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長または２本鎖分子の変性を妨げない。プライマーは、それらの性能を亢進させるため、または増幅産物の特性化を促進するために、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート等の化学基で、または非ヌクレオチドリンカーで修飾されてもよい。
【０１０４】
増幅された標的核酸を検出するために、プライマーは、蛍光標識化または化学発光標識化、およびビオチン化等の修飾に供することができる。（例えば、カルボキシフルオレセインのアミン反応性フルオレセインエステル等の蛍光タグ−Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．）。他の標識化方法は、放射性同位体、発色団、およびビオチンまたはハプテン等のリガンドを含み、それらは直接に検出可能でない一方で、それらの特異的結合相手、例えば、それぞれアビジンおよび抗体の標識型との反応によって容易に検出され得る。
【０１０５】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーは、当技術分野で既知の方法によって調製可能である（例えば、米国特許第６，２１４，５８７号明細書を参照されたい）。
【０１０６】
一態様では、１つが標的配列の５’境界とハイブリッド形成し、もう１つが標的の３’境界とハイブリッド形成する、２つの配列特異的プライマーの対は、標的配列の指数関数的増幅を達成するためにＨＤＡに使用される。このアプローチは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１６：１９ ３４（２００２））から容易に識別可能である。多数のプライマーの対は、多重化反応における異なる検出タグを用いて、多数の標的を同時に増幅するために単一のＨＤＡ反応において利用可能である。多重化は、ＳＮＰ分析で、および病原体を検出する際に、一般的に使用される（Ｊｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４０９５ ４１００（２００３））。
【０１０７】
また、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）またはナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）を増幅するために使用可能なオリゴヌクレオチドプライマーも本明細書に開示される。例えば、マルチコピーＯｐａ遺伝子、潜在プラスミドゲノムＤＮＡ、および外膜タンパク質（ＯＭＰ）遺伝子を増幅するために使用可能なプライマーが開示される。
【０１０８】
クラミジア・トラコマチスを増幅するために使用可能なプライマーが本明細書に開示される。かかるプライマーには、表６に列挙されるプライマーが含まれる。
【０１０９】
【表６】

【０１１０】
ナイセリア・ゴノレアを増幅するために使用可能なプライマーが本明細書に開示される。かかるプライマーには、表７に列挙されるプライマーが含まれる。
【０１１１】
【表７】

【０１１２】
２．ＤＮＡポリメラーゼ
ポリメラーゼは、処理能力および鎖置換活性の基準ならびに用いられている具体的な方法で使用される温度に基づいて、本明細書に記載される方法のために選択することができる。例えば、ｔＨＤＡのためのポリメラーゼは、処理能力および鎖置換活性の基準に基づいて選択することができる。融解およびオリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーションの後に、核酸は、重合ステップに供されてもよい。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。開示の組成物および方法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼはまた、所望の場合、処理能力が高い可能性がある。ＤＮＡポリメラーゼは、増幅されるべき核酸がＤＮＡである場合に選択される。開示の組成物および方法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼの適合性は、鎖伸長またはｔＨＤＡを行うその能力を査定することによって容易に判定することができる。
【０１１３】
初期標的がＲＮＡであるとき、逆転写酵素は、ＲＮＡ標的をｃＤＮＡ分子へとコピーするために最初に使用可能であり、次いでｃＤＮＡは、選択されたＤＮＡポリメラーゼによって、ｔＨＤＡにおいてさらに増幅される。ＤＮＡポリメラーゼは、標的核酸に作用して、４つのｄＮＴＰｓの存在下で核酸テンプレートとハイブリッド形成されて核酸テンプレート上のヌクレオチド配列と相補的なプライマー伸長産物を形成する、ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる。
【０１１４】
加えて、逆転写反応を行うことができるポリメラーゼ、ならびにｔＨＤＡ反応におけるＤＮＡポリメラーゼ活性は、本明細書に記載される方法に使用可能である。例えば。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＰＤＢ １ＨＭＶ）からのＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスからのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、またはトリ骨髄芽球症ウイルスからのＡＭＶ逆転写酵素は、単独または組み合わせで使用可能である。
【０１１５】
本明細書に記載される方法のためのＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、さらに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠き得る、ＤＮＡポリメラーゼの群から選択することができる。
【０１１６】
好適なＤＮＡポリメラーゼの例としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損Ｋｌｅｎｏｗ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．））、エキソヌクレアーゼ欠損Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；ＵＳＢ，（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ））、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．））、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのＬａｒｇｅ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．））、ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，７１６，８１９号明細書）、およびＰｏｌ ＩＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６，５５５，３４９号明細書）が挙げられる。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＬａｒｇｅ断片、およびＳｅｑｕｅｎａｓｅ等の、鎖置換活性をプロセスするＤＮＡポリメラーゼは、ヘリカーゼ依存性増幅に使用可能である。Ｔ７ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも有意に低い、３．５．×．１０^５の誤り率を有する、高正確性ポリメラーゼである（Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ ａｎｄ Ｔｈｉｌｌｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，９２５３ ９２５７（１９８９））。しかしながら、Ｔ７ポリメラーゼは、熱安定性でなく、したがって熱サイクルを必要とする増幅システムに使用するために最適でない。等温で行われてもよいＨＤＡにおいて、Ｔ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅは、ＤＮＡの増幅に使用可能である。
【０１１７】
３．標的核酸二重鎖
「標的核酸二重鎖」は、一部には標的核酸配列、標的核酸配列の補体、またはそのコピーを含む２本鎖核酸を指す。標的核酸二重鎖は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリッド形成される標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成することによって、作り出すことができる。標的核酸二重鎖は、ＨＤＡまたはｔＨＤＡのためのテンプレートとして機能することができる。例えば、標的核酸二重鎖は、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するために、ヘリカーゼおよびポリメラーゼ調製物と接触させられてもよい。
【０１１８】
４．ヘリカーゼ調製物
本明細書に記載される方法では、ヘリカーゼは、「ヘリカーゼ調製物」として提供されてもよい。「ヘリカーゼ調製物」は、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸テンプレート、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸、およびオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わされたとき、体外での、等温の、特異的核酸増幅を達成することができる試薬の混合物を指す。
【０１１９】
より具体的には、ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼ、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）等のエネルギー源を含んでもよい。１つ以上の追加的試薬がまた、ヘリカーゼ調製物に含まれてもよく、それらは次から選択される：１つ以上の追加的ヘリカーゼ、アクセサリータンパク質、小分子、化学試薬、および緩衝剤。熱安定性ヘリカーゼが、ヘリカーゼ調製物に利用されるとき、１本鎖結合タンパク質の存在は、任意選択である。
【０１２０】
１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
幾つかのヘリカーゼは、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在下で改善された活性を示す。これらの状況では、ＳＳＢの選択は、概して特定のタンパク質に限定されない。１本鎖結合タンパク質の例としては、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌ＳＳＢ、Ｔ７ ｇｐ２．５ＳＳＢ、ファージｐｈｉ２９ＳＳＢ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、上掲（１９９２））、および前述の物質の欠失型が挙げられる。
【０１２１】
他の化学試薬
塩およびｐＨに加えて、尿素およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む変性試薬等の他の化学試薬が、二重鎖ＤＮＡを部分的に変性または不安定化するためにｔＨＤＡ反応に添加可能である。これらの他の化学試薬はまた、ヘリカーゼ調製物の一部であってもよい。ｔＨＤＡ反応は、ＳＳＢタンパク質を用いて、または用いずに、変性試薬の異なる濃度で比較されてもよい。このような方法で、１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ安定化におけるＳＳＢのために、ｔＨＤＡ効率を増加させるおよび／または置換する化学化合物を、特定することができる。核酸およびタンパク質等の生体高分子のほとんどは、体外実験条件よりもはるかに高濃度で、生存細胞中のそれらの天然構造を機能させるおよび／または形成するように設計される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、水を除外し、溶質ポリカチオンとの静電相互作用を作り出すことによって、人工クラウディング条件を作り出すために使用されている（Ｍｉｙｏｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１：１５０１７ １５０２４（２００２））。ＰＥＧ（７．５％）が、ＤＮＡ連結反応物に添加されるとき、反応時間は、５分間に短縮される（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．））。また、ＰＥＧは、反応の効率を増加させるために、ヘリカーゼアンワインド検定にも添加されている（Ｄｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４４５６ １４４６１（１９９６））。ＨＤＡ上のＰＥＧまたは他のクラウディング試薬は、ｔＨＤＡ反応における酵素および核酸の有効濃度を増加させ得、したがって反応時間を短縮し、反応に必要とされるタンパク質濃度を減少させる。
【０１２２】
補因子
ＡＴＰまたはＴＴＰは、処理能力が高いヘリカーゼのための一般的なエネルギー源である。平均して、１個のＡＴＰ分子は、１〜４つの塩基対をほどくためにＤＮＡヘリカーゼによって消費される（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、上掲（１９９２））。説明される方法の幾つかの態様では、ＵｖｒＤベースのｔＨＤＡシステムは、３ｍＭの最適初期ＡＴＰ濃度を有した。より長い標的を増幅するために、より短い標的と比較してより多くのＡＴＰが消費され得る。これらの状況では、ヘリカーゼとの使用のために、ピルビン酸キナーゼベースのＡＴＰ再生システムを含むことが望ましい可能性がある（Ｈａｒｍｏｎ ａｎｄ Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７６：２３２ ２４３（２００１））。
【０１２３】
トポイソメラーゼ
トポイソメラーゼは、ｔＨＤＡの、長い標的アンプリコンを増幅する能力を増加させるために、長いｔＨＤＡ反応に使用可能である。非常に長い線形ＤＮＡ二重鎖がヘリカーゼによって分離されるとき、トポイソメラーゼの旋回（弛緩）機能は、ねじれを除去し、巻きすぎを防止する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、上掲（１９９２））。例えば、大腸菌トポイソメラーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）は、１つのＤＮＡ鎖に切れ目を導入することによって、負の超らせんＤＮＡを弛緩するために使用可能である。対照的に、大腸菌ＤＮＡジャイレース（トポイソメラーゼＩＩ）は、ＤＮＡ中に一時的な２本鎖破断を導入し、ＤＮＡが互いに通り越すことを可能にする（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、上掲（１９９２））。
【０１２４】
ヘリカーゼ
本明細で、「ヘリカーゼ」という用語は、２本鎖核酸を酵素的にほどくことができる任意の酵素を指す。例えば、ヘリカーゼは、核酸等の複製、組み換え、修復、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシングを伴う、全ての生物中および全てのプロセスにおいて見出される酵素である。（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（２^ｎｄ ｅｄ．（１９９２））、特に１１章）。５’→３’方向に、または反対の３’→５’方向に、ＤＮＡまたはＲＮＡを移行する任意のヘリカーゼが、本発明の本実施形態に使用されてもよい。これには、原核生物、ウイルス、古細菌、および真核生物から得られたヘリカーゼ、または天然産酵素の組み換え型ならびに特異的活性を有する類似体または誘導体が含まれる。天然産ＤＮＡヘリカーゼの例としては、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、彼らの本の１１章、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（２ｎｄ ｅｄ．（１９９２））によって説明されるヘリカーゼが挙げられ、大腸菌ヘリカーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ、Ｒｅｐ、ＤｎａＢ、ＰｒｉＡ、ＰｃｒＡ、Ｔ４ Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４ Ｄｄａヘリカーゼ、Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原、酵母ＲＡＤを含む。ＨＤＡに有用であり得る追加的ヘリカーゼには、ＲｅｃＱヘリカーゼ（Ｈａｒｍｏｎ ａｎｄ Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２３２ ２４３（２００１））、Ｔ．テングコンゲネシス（本発明、実施例ＸＩＩに開示）およびＴ．サーモフィルス（Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．７：３５ ４１．（２００３））からの熱安定性ＵｖｒＤヘリカーゼ、アクアティクスからの熱安定性ＤｎａＢヘリカーゼ（Ｋａｐｌａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６８８９ ６８９７（１９９９））、ならびに古細菌および真核性生物からのＭＣＭヘリカーゼ（（Ｇｒａｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４８８８ ４８９８（２００３））が含まれる。
【０１２５】
本実施形態に使用するためのヘリカーゼの例はまた、次のウェブアドレスでも見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ（Ｇｅｔ Ｂｌｏｃｋｓ ｂｙ Ｋｅｙｗｏｒｄ：Ｈｅｌｉｃａｓｅ）。このサイトは、４９のＨｅｒｐｅｓヘリカーゼ、２２４のＤｎａＢヘリカーゼ、２５０のＵｖｒＤ−ヘリカーゼおよびＵｖｒＤ／Ｒｅｐヘリカーゼ、２７６のＤＥＡＨ＿ＡＴＰ−依存性ヘリカーゼ、１４７のＰａｐｉｌｌｏｍ＿Ｅ１ ＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓヘリカーゼＥ１タンパク質、６０８のＶｉｒａｌヘリカーゼ１Ｖｉｒａｌ（スーパーファミリー１）ＲＮＡヘリカーゼ、ならびに５５６のＤＥＡＤ＿ＡＴＰ−依存性ヘリカーゼを列挙する。概して５’→３’方向に複製するヘリカーゼの例としては、Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、およびＲｈｏヘリカーゼがある一方で、３’→５’方向に複製するヘリカーゼの例としては、ＨＣＶのＵｖｒＤヘリカーゼ、ＰｃｒＡ、Ｒｅｐ、ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼが挙げられる。
【０１２６】
ヘリカーゼは、二重鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ内で鎖を結び付けている水素結合を切断するための、ヌクレオシド三リン酸（例えば、ＡＴＰ）加水分解のエネルギーを使用する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（２^ｎｄ ｅｄ．（１９９２））、特に１１章）。ヘリカーゼは、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復および組み換え、転写、ならびにＲＮＡプロセシング等の、細胞中の核酸代謝のあらゆる側面に関与する。この幅広い用途は、全ての生存生物に見出される多数のヘリカーゼによって反映され得る。
【０１２７】
ヘリカーゼは、幾つかの異なる特徴に従って分類されている。例えば、異なるヘリカーゼの特徴は、単一のまたは多量体構造を備えるヘリカーゼを含む、それらのオリゴマー構造である。例えば、ヘリカーゼの１つのファミリーは、六量体構造に特徴付けられる一方で、別のファミリーは、単量体または二量体ヘリカーゼからなる。
【０１２８】
ヘリカーゼの別の特徴は、保存されたモチーフの発現度である。全てのヘリカーゼは、ＡＴＰ結合およびＭｇ^２＋結合に関連する古典的ＷａｌｋｅｒＡおよびＢモチーフを有する（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ａｎｄ ＭｃＫａｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３ １３３（２００２），Ｓｏｕｌｔａｎａｓ ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：４７ ５４（２００１）に概説）。ヘリカーゼは、ヘリカーゼシグネチャーモチーフの数およびモチーフに対するコンセンサス配列の差異に従って、複数のスーパーファミリーに分類されている（Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：４１９ ４２９（１９９３））。スーパーファミリー１および２は、７つの特徴的ヘリカーゼシグネチャーモチーフを有し、これには、古細菌、真正細菌、真核生物、およびウイルスからのヘリカーゼが含まれ、ヘリカーゼは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを３’→５’方向または５’→３’方向のいずれかにほどく。スーパーファミリー１ヘリカーゼの例としては、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ．テングコンゲネシスＵｖｒＤヘリカーゼ、およびＲｅｃＢＣＤのＢサブユニットが挙げられる。スーパーファミリー３は、３つのモチーフを有し、スーパーファミリー４は５つのモチーフを有する。スーパーファミリー４ヘリカーゼの例としては、Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼおよびＤｎａＢヘリカーゼが挙げられる。標準的なヘリカーゼとは異なる新しいファミリーは、ＡＡＡ^＋ファミリー（種々の細胞活動に関連するＡＴＰａｓｅの拡張ファミリー）である。
【０１２９】
第３のタイプの分類は、ヘリカーゼのアンワインド方向、すなわち、ヘリカーゼが核酸二本鎖を、ヘリカーゼが結合して移動する方の鎖に基づいて５’→３’方向（Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼなど）または３’→５’方向（ＵｖｒＤヘリカーゼなど）のいずれにほどくかに関する。
【０１３０】
分類の第４のタイプは、ヘリカーゼが平滑末端核酸二本鎖またはフォークもしくは一本鎖尾を備える二本鎖のいずれを好んでほどくかに関する。平滑末端核酸二本鎖は、ヘリカーゼ依存性増幅の第１のサイクルには必要とされない可能性があるが、後続の増幅サイクルにおいては望ましく、これは増幅反応の進行に伴って、平滑末端標的断片が優占種となるためである。これらの平滑末端標的核酸は、後続の増幅回に対するテンプレート基質を形成する。
【０１３１】
本明細書に記載されるｔＨＤＡを達成するために、上述のいずれに従って分類されたヘリカーゼも核酸増幅に好適である。ヘリカーゼ依存性増幅を達成するための本方法に従って。
【０１３２】
標的核酸の源に関わらず、ヘリカーゼ調製物は、反応の温度を変化させることなく、２本鎖分子をほどいて、ポリメラーゼ依存性増幅のための１本鎖分子を産生することによって、核酸の増幅の間の熱変性ステップを置換するために使用されてもよい。したがって、Ｔａｑポリメラーゼを用いた標準ＰＣＲ増幅の間に必要とされる熱サイクルは、回避され得る。
【０１３３】
概して、プライマー−テンプレート認識の特異性および後続のアニールを可能にするのに好適な変性の温度は、例えば、２０℃〜７５℃の温度の範囲にわたって生じてもよい。例えば、温度は、どのヘリカーゼが融解プロセスに選択されるかに従って選択されてもよい。選択されたヘリカーゼの存在下で、核酸の増幅のための最適温度を判定する試験は、反応混合物の温度を変化させ、ゲル電気泳動を用いて増幅産物を比較することによる所定の実験によって、判定される。
【０１３４】
核酸ハイブリッドまたは二重鎖の変性は、例えば、４５℃〜７５℃の範囲のより高温を含むインキュベーション条件下で、熱安定性ヘリカーゼ調製物を用いることによって加速化することができる。熱安定性ヘリカーゼ調製物および熱安定性ポリメラーゼを用いて高温でＨＤＡを行うことは、プライマー結合の特異性を増加させる可能性があり、それは増幅の特異性を改善することができる。
【０１３５】
特定の態様では、増幅反応において複数の異なるヘリカーゼ酵素を利用することが望ましい可能性がある。複数のヘリカーゼの使用は、異なるヘリカーゼが、二重鎖核酸のアンワインドの効率を増加させるために種々の機能を連係させる特定の条件下で、ＨＤＡにおける収率および標的増幅の長さを高める可能性がある。例えば、低処理能力を有するが、平滑末端ＤＮＡを融解させることができるヘリカーゼは、高処理能力を有するが、アンワインドの開始のために二重鎖領域の境界で１本鎖尾を認識する第２のヘリカーゼと組み合わされてもよい。この例では、第１のヘリカーゼは、最初に、５’および３’１本鎖尾を生成する長い核酸二重鎖の平滑末端を分離し、次いでその限定された処理能力に起因して、その基質から解離する。この部分的に巻き戻された基質は、その後、次いでより優れた処理能力でアンワインドを継続する第２のヘリカーゼによって認識される。このような方法で、核酸二重鎖内の長い標的は、複数のヘリカーゼを含有するヘリカーゼ調製物の使用によって巻き戻されてもよく、その後、ＨＤＡ反応において増幅されてもよい。
【０１３６】
５．検出標識
本明細書に記載される方法はまた、標的核酸配列を検出するために使用することもできる。標的核酸の検出は、増幅反応の間または後に起こり得る。開示の組成物および方法を用いて増幅された標的核酸の検出および定量を補助するために、検出標識は利用可能である。検出標識は、増幅された標的核酸に直接に組み込むことができるか、または増幅された標的核酸に結合させることができる。本明細書で使用される場合、「検出標識」は、直接にまたは間接に、増幅された標的核酸に会合可能であり、直接にまたは間接に、測定可能で検出可能なシグナルをもたらす任意の分子を指す。核酸への組み込みまたは核酸への結合のための多くのかかる標識は、当業者に既知である。開示の方法で使用するのに好適な検出標識の例としては、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドが挙げられる。蛍光標識は、特に蛍光変化プローブおよびプライマーの文脈において、増幅のリアルタイム検出に有用である。
【０１３７】
好適な蛍光標識の例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリトロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンチン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、量子染色ＴＭ等のランタニドイオンの大環状キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体等の蛍光エネルギー移動染色、ならびにシアニン染色Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７が挙げられる。他の特定の蛍光標識の例としては、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコファーＦＦＧ溶液、ブランコファーＳＶ、ボディピＦ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルセインブルー、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコフォールホワイトＡＢＴ溶液、カルコフォールホワイト標準溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、チナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１ ８、ＣＹ５．１ ８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、二フッ化ジピロメテンホウ素、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、Ｆｕｒａ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、グロキサン酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、Ｉｎｄｏ−１、イントラホワイトＣｆ液、ロイコフォアＰＡＦ、ロイコフォアＳＦ、ロイコフォアＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアファストレッド、ヌクレアイエロー、ニロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラロサニリン（フォイルゲン）、ホルワイトＡＲ溶液、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトＲｅｖ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢカンＣ、スルホローダミンＧエクストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオフラビン、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣが挙げられる。
【０１３８】
蛍光標識の例としては、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、ならびにシアニン染色Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７が挙げられる。これらの蛍光についての吸収および発光極大波長は、それぞれ：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ、５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ、５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ、５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ、６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ、７０３ｎｍ）、およびＣｙ７（７５５ｎｍ、７７８ｎｍ）であり、これによってそれらの同時検出が可能になる。フルオレセイン色素の他の例としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’、５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が挙げられる。蛍光標識は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏを含む、種々の商業的供給源から入手できる。
【０１３９】
目的の追加的標識としては、それらが会合するプローブが標的分子に特異的に結合されるときのみシグナルを提供する標識が挙げられ、かかる標識としては以下が挙げられる：Ｔｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３および欧州特許第０ ０７０ ６８５ Ｂ１号に記載される「分子ビーコン」。目的の他の標識としては、米国特許第５，５６３，０３７号明細書ならびに国際公開第９７／１７４７１号および国際公開第９７／１７０７６号に記載される標識が挙げられる。
【０１４０】
標識化されたヌクレオチドは、合成の間に増幅産物に直接組み込まれ得るため、検出標識の別の形態である。増幅される標的核酸に組み込むことのできる検出標識の例としては、例えば、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン、Ｈｏｙ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２９０：２１７−２３０（１９９３））、アミノアリルデオキシウリジン（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８：３４５−３４８（２０００））、５−メチルシトシン（Ｓａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５１：１５７−１６５（１９９８））、ブロモウリジン（Ｗａｎｓｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２２：２８３−２９３（１９９３））、ならびにビオチンで（Ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６６３３（１９８１））またはジゴキシゲニン等の好適なハプテンで（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））修飾されたヌクレオチド等のヌクレオチド類似体が挙げられる。好適な蛍光標識化ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアン酸塩−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰ、およびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））である。ＤＮＡのための好ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）である。ＤＮＡへの検出標識の組み込みに好ましい他のヌクレオチド類似体は、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジン三リン酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、および５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。ＲＮＡへの検出標識の組み込みに好ましいヌクレオチド類似体は、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸塩、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５を、直接標識化のためにｄＵＴＰに結合させてもよい。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチンまたはジゴキシゲニン標識化プローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ジゴキシゲニン共役として利用可能である。
【０１４１】
ビオチン等の、増幅された標的核酸に組み込まれる検出標識を、当技術分野で周知の高感度な方法を用いて、その後検出することができる。例えば、ビオチンはストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を用いて検出可能で、それはビオチンに結合され、その後適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：二ナトリウム，３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリクロロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸塩；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光により検出される。標識はまた、アルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびポリメラーゼ等の酵素であってもよく、これらは例えば、化学シグナル増幅を用いて、または光（例えば化学発光性１，２−ジオキセタン基質）もしくは蛍光シグナルを発生する酵素に対する基質を使用することによって検出できる。標識はまた、開示の試薬組成物でもある。
【０１４２】
これらの検出標識のうち２つ以上を組み合わせる分子もまた検出標識として考えられる。既知の検出標識のいずれも、開示されたプローブ、タグ、ならびに開示された方法を用いて増幅された核酸を標識化および検出するための方法とともに使用可能である。例えば、放射性同位体はシンチレーション計数または直接的視覚化により検出可能であり、蛍光分子は蛍光分光光度計で検出可能であり、リン光分子は分光光度計またはカメラによる直接的視覚化で検出可能であり、酵素は、その酵素で触媒される反応の産物の検出または視覚化によって検出可能であり、抗体は、その抗体に結合された二次標識を検出することによって検出可能である。本明細書で使用される場合、検出分子とは、増幅された核酸と相互作用して、そこに１つ以上の標識が結合される分子である。
【０１４３】
蛍光変化プローブおよびプライマー
蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーとは、検出、検定、もしくは複製されるべきプローブまたはプライマーおよび核酸の形態または高次構造の変化に基づく、蛍光強度または波長の変化を伴う全てのプローブおよびプライマーを指す。蛍光変化プローブおよびプライマーの例としては、三重分子ビーコンまたは三重ＦＲＥＴプローブ、蛍光水溶性共役ポリマー、ＰＮＡプローブ、およびＱＰＮＡプローブを含むが、それらに限定されない、分子ビーコン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒｓ、ＦＲＥＴプローブ、切断可能ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重オリゴが挙げられる。米国特許第７，４４５，９００号明細書、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ１７，８０４−８０７、Ｔｈｅｌｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２９，３７５２−３７６１、Ｓｏｌｉｎａｓ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９，１−９に記載されるＤｘＳのスコーピオンプライマーもまた使用可能であり、スコーピオンプライマーの教示について、これらの特許および参考文献の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
蛍光変化プローブおよびプライマーは、それらの構造および／または機能に従って分類可能である。蛍光変化プローブとしては、ヘアピン消光性プローブ、切断消光性プローブ、切断活性化プローブ、および蛍光活性化プローブが挙げられる。蛍光変化プライマーとしては、ステム消光性プライマーおよびヘアピン消光性プライマーが挙げられる。複数のタイプの蛍光変化プローブおよびプライマーの使用は、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）に概説される。Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８２７２−８２７７（２０００）は、Ｉｎｖａｄｅｒ検定による蛍光変化プローブの使用を記載している。
【０１４５】
ヘアピン消光性プローブとは、標的配列に結合されないとき、ヘアピン構造（および典型的にはループ）を形成し、蛍光標識および消光部分を近位にもたらし、その結果、標識からの蛍光が消光されるプローブである。プローブが標的配列に結合するとき、このステムは破壊され、その消光部分はもはや蛍光標識に近位ではなくなり、蛍光が増大する。ヘアピン消光性プローブの例としては、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブ、およびＱＰＮＡプローブが挙げられる。
【０１４６】
切断活性化プローブとは、蛍光がプローブの切断によって増大されるプローブである。切断活性化プローブは、蛍光標識および消光部分を近位で含む可能性があり、その結果、標識からの蛍光が消光される。プローブがクリップされるかまたは分解されるとき（典型的には、増幅の間のポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって）、この消光部分はもはや蛍光標識に近位ではなくなり、蛍光が増大する。ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７２７６−７２８０（１９９１））は、切断活性化プローブの例である。
【０１４７】
修飾されたＴａｑＭａｎプローブ
また、修飾されたＴａｑＭａｎプローブも本明細書に記載される。ＴａｑＭａｎプローブは、検出、検定、もしくは複製されるべきプローブまたはプライマーおよび核酸の形態または高次構造の変化に基づく、蛍光強度または波長の変化を伴う蛍光変化プローブである。例えば、標的配列と相補的な配列からなり、追加的に、それぞれ５’または３’末端の修飾されたＴａｑＭａｎプローブと相補的な修飾されたＴａｑＭａｎプローブの３’または５’末端のいずれかに短尾を有する、修飾されたＴａｑＭａｎプローブが本明細書に記載される。短尾は、修飾されたＴａｑＭａｎプローブが標的核酸とハイブリッド形成されないとき、ステム−ループ構造の形成を補助することが可能である。修飾されたＴａｑＭａｎプローブの尾でない部分は、標的核酸と相補的であり、標的核酸とハイブリッド形成することができる。幾つかの態様では、修飾されたＴａｑＭａｎプローブの短尾は、標的と相補的であるか、または非相補的である可能性がある。
【０１４８】
修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、本明細書に記載される方法において検出標識として使用可能である。修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、それらが分子ビーコンよりもより容易に開き、修飾されたＴａｑＭａｎプローブが既存のＴａｑＭａｎプローブよりもより予測可能におよび効率的に消光するため、分子ビーコンおよび既存のＴａｑＭａｎプローブの改善体である。
【０１４９】
また、切断消光性プローブも、本明細書に記載される方法に使用可能である。切断消光性プローブとは、蛍光がプローブの切断によって減少されるかまたは変更されているプローブである。切断消光性プローブは、アクセプター蛍光標識およびドナー部分を含んでもよく、その結果、アクセプターおよびドナーが近位にあるとき、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー転移がアクセプターに蛍光を発生させる。プローブは、したがって、例えば、標的配列とハイブリッド形成されるとき、蛍光である。プローブがクリップされるかまたは分解されるとき（典型的には、増幅の間のポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって）、このドナー部分はもはやアクセプター蛍光標識に近位ではなくなり、アクセプターからの蛍光が減少する。ドナー部分がそれ自体蛍光標識である場合、それは、アクセプターに近位でないときに蛍光（典型的にはアクセプターの蛍光と異なる波長で）としてエネルギーを放出することが可能である。全体的な効果は、つまり、アクセプター蛍光の減少およびドナー蛍光の増大であろう。切断消光性プローブの場合のドナー蛍光は、切断活性化プローブによって発せられる蛍光と等しく、アクセプターが消光部分であり、ドナーが蛍光標識である。切断可能なＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）プローブは、切断消光性プローブの例である。
【０１５０】
蛍光活性化プローブとは、プローブの標的配列とのハイブリダイゼーションによって蛍光が増大されるかまたは変更されている、プローブまたはプローブの対である。蛍光活性化プローブは、アクセプター蛍光標識およびドナー部分を含んでもよく、その結果、アクセプターおよびドナーが近位にあるとき（プローブが標的配列とハイブリッド形成されるとき）、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー転移がアクセプターに蛍光を発生させる。蛍光活性化プローブとは典型的には、隣接した配列とハイブリッド形成するように設計され、その結果アクセプターおよびドナーが近位にされているプローブの対である。蛍光活性化プローブはまた、ドナーおよびアクセプターの両方を含む単一のプローブであってもよく、ここでプローブが標的配列とハイブリッド形成されないとき、このドナーおよびアクセプターは近位にないが、ドナーおよびアクセプターは、プローブが標的配列とハイブリッド形成したとき近位にされる。これは、例えば、プローブの反対の末端にドナーおよびアクセプターを配置すること、およびプローブの各末端に標的相補的配列を配置することによって達成可能であり、ここでこの標的相補的配列は、標的配列における隣接した配列に相補的である。蛍光活性化プローブのドナー部分がそれ自体蛍光標識である場合、それは、アクセプターに近位でないときに（つまり、プローブが標的配列とハイブリッド形成されないとき）、蛍光（典型的にはアクセプターの蛍光と異なる波長で）としてエネルギーを放出することが可能である。プローブが標的配列とハイブリッド形成するとき、全体的な効果は、つまり、ドナー蛍光の減少およびアクセプター蛍光の増大であろう。ＦＲＥＴプローブは、蛍光活性化プローブの例である。
【０１５１】
ステム消光性プライマーとは、相補的な配列とハイブリッド形成されないとき、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近位にさせるステム構造（分子内ステム構造または分子間ステム構造のいずれか）を形成するプライマーである。プライマーが相補的な配列に結合するとき、このステムは破壊され、その消光部分はもはや蛍光標識に近位ではなく、蛍光が増大する。開示の方法では、ステム消光性プライマーは、核酸合成のためのプライマーとして使用され、したがって合成核酸または増幅核酸に組み込まれる。ステム消光性プライマーの例としては、ペプチド核酸消光性プライマーおよびヘアピン消光性プライマーが挙げられる。
【０１５２】
ペプチド核酸消光性プライマーとは、ペプチド核酸消光剤またはペプチド核酸蛍光と会合してステム構造を形成するプライマーである。このプライマーは、蛍光標識または消光部分を含有し、それぞれペプチド核酸消光剤またはペプチド核酸蛍光のいずれかと会合する。これは、消光部分の近位に蛍光標識を置く。プライマーが複製されるとき、ペプチド核酸は置換され、これによって蛍光標識が蛍光シグナルを産生することが可能になる。
【０１５３】
ヘアピン消光性プライマーとは、相補的な配列とハイブリッド形成されないとき、標識からの蛍光が消光されるように蛍光標識および消光部分を近位にさせるヘアピン構造（および典型的には、ループ）を形成するプライマーである。プライマーが相補的な配列に結合するとき、このステムは破壊され、その消光部分はもはや蛍光標識に近位ではなくなり、蛍光が増大する。ヘアピン消光性プライマーは典型的には、核酸合成のためのプライマーとして使用され、したがって合成核酸または増幅核酸に組み込まれる。ヘアピン消光性プライマーの例としては、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー（Ｎａｚｅｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１（１９９７））およびスコーピオンプライマー（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１９）：３７５２−３７６１（２０００））が挙げられる。
【０１５４】
切断活性化プライマーは、それらが複製された鎖に組み込まれるプライマーであり、次いでその後切断されることを除いて、プローブに類似する。Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７−７８４（１９９９）は、切断活性化プライマーの使用を記載する。
【０１５５】
固体支持体
固体支持体は、開示の方法の標的核酸または増幅産物（または開示の方法に使用されるか、またはそれによって産生される他の構成成分）が会合される固体基質または支持体である。標的核酸は、固体支持体に直接にまたは間接に会合可能である。増幅産物は、固体支持体に直接にまたは間接に会合可能である。例えば、増幅産物は、固体支持体の表面に結合可能であるか、または捕捉抗体もしくは固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに会合可能である。アレイ検出器は、多数の異なる捕捉抗体またはオリゴヌクレオチドプローブが、アレイ、グリッド、または他の組織化パターンとして結合可能な固体支持体である。標的アレイは、固体支持体に結合された標的核酸のアレイである。オリゴヌクレオチドプローブアレイは、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイである。捕捉抗体アレイは、固体支持体に結合された捕捉抗体のアレイである。
【０１５６】
固体支持体に使用するための固体基質は、構成成分が直接にまたは間接に会合可能である、任意の固体物質を含んでもよい。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ニロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グルコサミノグリカン、ポリアミノ酸、または磁石等の物質が含まれる。固体基質は、薄膜、膜、瓶、皿、繊維、織られた繊維、成形重合体、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを含む、あらゆる有用な形態を有することができる。固体基質および固体支持体は、多孔質または非多孔質であってもよい。チップは、物質の長方形または正方形の小片である。固体基質のために有用な形態は、マイクロタイター皿である。幾つかの実施形態では、マルチウェルガラススライドが用いられてもよい。
【０１５７】
アレイは、固体支持体上の特定されたまたは前規定された位置に固定化された複数の構成成分（標的核酸、標的試料、検出標識、オリゴヌクレオチドプローブ、捕捉抗体、または増幅産物等）を含んでもよい。固体支持体上の各前規定された位置は、概して、１つのタイプの構成成分を有する（つまり、その位置の全ての構成成分は、同一である）。代替的に、多数のタイプの構成成分が、固体支持体上の同一の前規定された位置に固定化可能である。各位置は、所定の構成成分の多数のコピーを有するであろう。固体支持体上の異なる構成成分の空間分離は、増幅産物の別個の検出および特定を可能にする。固体支持体が単一のユニットまたは構造であることは、有用であるが、必須ではない。構成成分のセットは、任意の数の固体支持体上に分配可能である。例えば、１つの末端で、各構成成分は、別個の反応管または容器中で、または別個のビーズまたは微粒子上で固定化可能である。
【０１５８】
オリゴヌクレオチドの固体基質に対する固定化のための方法は、定着している。オリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立された結合方法を用いて基質に結合可能である。例えば、好適な結合方法は、Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）、およびＫｈｒａｐｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）によって記載される。３’−アミンオリゴヌクレオチドの、カゼインコーティングされたスライド上での固定化のための方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６３７９−６３８３（１９９５）によって記載される。オリゴヌクレオチドを固体基質に結合させる有用な方法は、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）によって記載される。
【０１５９】
抗体および他のタンパク質を固体基質に対して固定化する方法は、定着している。固定化は、標準固定化化学を用いて、例えば、アミノ化された表面、カルボキシル化された表面、またはヒドロキシル化された表面への結合によって達成可能である。結合薬剤の例としては、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジン−ビオチン、光架橋性剤、エポキシド、およびマレイミドが挙げられる。結合剤の別の例は、グルタルアルデヒドである。これらのおよび他の結合剤、ならびにそれらを結合に使用する方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，ｅｄ．（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８７）ｐａｇｅｓ２０９−２１６ａｎｄ２４１−２４２、およびＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｃｒａｉｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）に記載される。抗体および他のタンパク質は、抗体またはタンパク質上の遊離アミノ基を、固体基質内に存在する反応性側基に化学的に架橋結合することによって、基質に結合可能である。例えば、抗体は、架橋結合剤としてグルタルアルデヒドまたはカルボジイミドを用いて、遊離アミノ基またはカルボキシル基を含有する基質に化学的に架橋結合されてもよい。この方法では、遊離抗体を含有する水溶液は、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下で固体基質を用いてインキュベートされる。グルタルアルデヒドとの架橋結合について、反応物は、ｐＨ７．４の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム等の緩衝溶液中で、２容量％グルタルアルデヒドを用いてインキュベートすることが可能である。他の標準固定化化学は、当業者に既知である。
【０１６０】
固体支持体上で固定化された構成成分の各々は、固体支持体の前規定された異なる領域に位置することが可能である。異なる位置は、異なる反応チャンバであり得る。前規定された異なる領域の各々は、異なる領域の互いから物理的に分離可能である。固体支持体の前規定された異なる領域の間の距離は、固定されるか、または可変のいずれかであり得る。例えば、アレイにおいて、構成成分の各々は、互いに固定化された距離で配列可能である一方で、ビーズと会合する構成成分は、固定化された空間関係にはないであろう。特に、多数の固体支持体ユニット（例えば、多数のビーズ）の使用は、可変の距離をもたらすであろう。
【０１６１】
構成成分は、固体支持体上で、任意の密度で会合または固定化可能である。構成成分は、１立方センチメートル当たり４００個を超える異なる構成成分の密度で、固体支持体に対して固定化可能である。構成成分のアレイは、任意の数の構成成分を有することができる。例えば、アレイは、固体支持体上で固定化された少なくとも１，０００個の異なる構成成分、固体支持体上で固定化された少なくとも１０，０００個の異なる構成成分、固体支持体上で固定化された少なくとも１００，０００個の異なる構成成分、または固体支持体上で固定化された少なくとも１，０００，０００個の異なる構成成分を有することができる。
【０１６２】
固体検出器
固体検出器は、オリゴヌクレオチドプローブまたは捕捉抗体が結合されている固体支持体である。固体検出器の好ましい形態は、アレイ検出器である。アレイ検出器は、多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブまたは捕捉抗体が、アレイ、グリッド、または他の組織化パターンとして結合されている固体検出器である。
【０１６３】
固体検出器に使用するための固体基質は、オリゴヌクレオチドが結合可能な任意の固体物質を含んでもよい。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ニロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グルコサミノグリカン、およびポリアミノ酸等の物質が含まれる。固体基質は、薄膜、膜、瓶、皿、繊維、織られた繊維、成形重合体、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを含む、あらゆる有用な形態を有することができる。固体基質および固体支持体は、多孔質または非多孔質であってもよい。チップは、物質の長方形または正方形の小片である。固体基質のための好ましい形態は、薄膜、ビーズ、またはチップである。固体基質のために有用な形態は、マイクロタイター皿である。幾つかの実施形態では、マルチウェルガラススライドが用いられてもよい。
【０１６４】
固体基質上に固定化された捕捉抗体は、固体検出器上の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドまたはそれらの増幅標的の捕捉を可能にする。かかる捕捉は、後続の方法ステップを妨げ得る反応構成成分を洗浄除去する簡便な手段を提供する。異なる捕捉抗体を固体検出器の異なる領域に結合させることによって、異なる産物が、固体検出器上の異なる、およびしたがって特徴的な位置で捕捉可能である。例えば、多重化検定において、多数の異なる標的核酸（各々、異なるセットのプライマーを介して増幅される異なる標的核酸配列を表す）に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、各々異なる位置で、アレイにおいて固定化可能である。捕捉および検出は、対応する標的核酸配列がそれに対して試料中に存在していた増幅された核酸に相当するアレイ位置のみで生じるであろう。
【０１６５】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプライマー、または他のあらゆるオリゴヌクレオチドは、確立されたオリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成可能である。オリゴヌクレオチドを産生または合成する方法は、周知である。かかる方法は、標準酵素分解とそれに続くヌクレオチド断片単離から（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）５、６章を参照されたい）、例えば、シアノエチルホスホラミダイト法による、純粋な合成方法の範囲に及び得る。ＤＮＡ断片の固相化学合成は、保護ヌクレオシドシアノエチルホスホラミダイトを用いて規定通りに行われる（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９）。このアプローチでは、初期５’−保護ヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基は、最初に重合体支持体に共有結合される（Ｒ．Ｃ．Ｐｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２：７７３（１９７５））。次いでオリゴヌクレオチドの合成は、結合されたヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基の脱保護、続いて入来ヌクレオシド−３’−ホスホラミダイトの、脱保護されたヒドロキシル基への結合によって進行する（Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５）。得られた亜リン酸トリエステルは、最終的にリン酸トリエステルに酸化されて、ヌクレオチド間結合を完了する（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９：３６５５）。代替的に、ホスホロチオエート結合の合成は、亜リン酸トリエステルの硫酸化によって行われてもよい。この反応を行うために複数の化学物質が使用可能であり、その中でも３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、１，１−ジオキシド（Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｗ．Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｂ．Ｒｅｇａｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１２５３−１２５４）がある。脱保護、結合、および酸化のステップは、所望の長さおよび配列のオリゴヌクレオチドが得られるまで反復される。Ｈ−ホスホネート方法（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ，（１９５７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３２９１−３２９６）またはＩｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）、（ホスホトリエステルおよび亜リン酸トリエステル法）、およびＮａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０）、（ホスホトリエステル法）によって記載される、ホスホトリエステル法等のオリゴヌクレオチドを生成するための他の方法が存在する。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって記載される方法等の、既知の方法を用いて作製可能である。オリゴヌクレオチド合成の他の形態は、米国特許第６，２９４，６６４号明細書および米国特許第６，２９１，６６９号明細書に記載される。
【０１６６】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、概して、合成の間、その中のサブユニットブロックのサブユニットがオリゴヌクレオチド鎖に付加される配列順序によって判定される。各回の付加は、異なる、特定のヌクレオチド前駆体、または１つ以上の異なるヌクレオチド前駆体の混合物を伴うことができる。概して、オリゴヌクレオチド内の縮重位置または無作為位置は、その位置で存在可能なヌクレオチドの範囲を表すヌクレオチド前駆体の混合物を用いることによって産生可能である。したがって、ＡおよびＴのための前駆体は、その位置がＡおよびＴのために縮重されるべきである場合、オリゴヌクレオチド内の具体的な位置のための反応に含まれてもよい。４つのヌクレオチド全てのための前駆体は、完全な縮重位置または無作為位置のために含まれてもよい。完全に無作為なオリゴヌクレオチドは、４つのヌクレオチド前駆体全てを各回の合成に含むことによって作製可能である。異なる比率の異なるヌクレオチドを有する縮重オリゴヌクレオチドもまた、作製可能である。かかるオリゴヌクレオチドは、反応において、例えば、異なるヌクレオチド前駆体を所望の比率で用いることによって作製可能である。
【０１６７】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの多くは、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸の特定の部分と相補的であるように設計され、その結果、安定的ハイブリッドがそれらの間に形成可能となる。これらのハイブリッドの安定性は、Ｌｅｓｎｉｃｋ ａｎｄ Ｆｒｅｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１０８０７−１０８１５（１９９５）、ＭｃＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ８：６７４−６７８（１９９０）、およびＲｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６４０９−６４１２（１９９０）に記載される方法等の既知の方法を用いて算出可能である。
【０１６８】
それらの関連機能が維持される限り、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、および他のあらゆるオリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド（ヌクレオチド類似体）からなってもよく、またはそれを含んでもよい。多くの修飾されたヌクレオチドは、既知であり、オリゴヌクレオチド内で使用可能である。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸塩部分のいずれかに対する、ある種のタイプの修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、ならびにウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、および２−アミノアデニン−９−イル等の異なるプリン塩基またはピリミジン塩基の、天然修飾および合成修飾を含むであろう。修飾された塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チロウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（擬似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、具体的には、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、それらに限定されない。追加的塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号明細書、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に見出すことができる。５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン等の特定のヌクレオチド類似体。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増加させることができる。他の修飾された塩基は、ユニバーサル塩基として機能する塩基である。ユニバーサル塩基は、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールを含む。ユニバーサル塩基は、通常の塩基を置換するが、塩基対形成の際のバイアスを有さない。つまり、ユニバーサル塩基は、他のあらゆる塩基と塩基対形成することができる。塩基修飾は、しばしば、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル等の糖修飾と組み合わされて、増加された二重鎖安定性等の固有の特性を達成することができる。塩基修飾の範囲を詳述および説明する、米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号明細書等の多数の米国特許が存在する。これらの特許の各々は、特に塩基修飾、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みのそれらの説明について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
キット
上述の物質ならびに他の物質は、開示の方法を行うため、またはその性能を補助するための有用なキットとして、あらゆる好適な組み合わせで共にパッケージ化可能である。それは、所定のキット内のキットの構成要素が、開示の方法で共に使用するように設計および適合される場合に有用である。例えば、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸を増幅するためのキットが開示され、そのキットは、標的核酸の捕捉、ｔＨＤＡ増幅、増幅産物の検出のために、１つ以上の試薬組成物および１つ以上の構成成分もしくは試薬またはその両方を含む。例えば、キットは、１つ以上の試薬組成物および１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ、１つ以上の捕捉抗体、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１つ以上の検出標識、または組み合わせを含んでもよい。キットの別の形態は、複数の試薬組成物を含んでもよい。キットはまた、例えば、ヌクレオチド、緩衝剤、ヘリカーゼ、アクセサリータンパク質、トポイソメラーゼ、または組み合わせを含有してもよい。
【０１７０】
混合物
開示の組成物を調製することによって、または開示の方法を行うこともしくは行うための調製をすることによって、形成される混合物が開示される。本方法が、組成物もしくは構成成分もしくは試薬を混合するまたは接触させることを伴う場合はいつでも、本方法を行うことによって、幾つかの異なる混合物が作り出される。例えば、方法が３つの混合ステップを含む場合で、ステップが別個で行われる場合、これらのステップの各々の後に固有の混合物が形成される。加えて、ステップがどのように行われたかに関わらず、全てのステップの完了時に混合物が形成される。本開示は、開示の方法の性能によって得られるこれらの混合物、ならびに例えば、本明細書に開示の、開示のあらゆる試薬、組成物、または構成成分を含有する混合物を企図する。
【０１７１】
システム
開示の方法を行う、またはその性能を補助するのに有用な、システムが開示される。また、試薬組成物を産生するためのシステムも開示される。システムは、概して、構造、機械、装置等、および組成物、化合物、物質等の、製造品の組み合わせを含む。開示のまたは開示から明白なかかる組み合わせが企図される。例えば、固体支持体および試薬組成物を含むシステムが開示または企図される。
【０１７２】
データ構造およびコンピュータ制御
開示の方法に使用され、それによって生成され、またはそれから生成されるデータ構造が開示される。概してデータ構造は、組成物または媒体中で、採取、組織化、保管、および／または具体化されたデータ、情報、および／または対象の任意の形態である。ＲＡＭ内または保管ディスク上等の電子的形態で保管された標的フィンガープリントは、データ構造のタイプである。
【０１７３】
開示の方法、またはその任意の部分もしくはそのための調製は、コンピュータ制御によって制御、管理、または他の方法で補助可能である。かかるコンピュータ制御は、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって達成可能であり、データ構造を使用するおよび／またはそれを生成することができ、ならびにコンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムは、企図され、本明細書に開示されるものとして理解されたい。
【０１７４】
使用
開示の組成物および方法は、標的核酸の検出および／または分析、疾患検出、タンパク質検出、核酸マッピング、突然変異検出、遺伝子発見、遺伝子マッピング、および農業研究を含むが、それらに限定されない多数の領域に適用可能である。標的核酸を増幅または検出する検定は、特に有用である。他の使用には、例えば、試料中の標的核酸の検出、突然変異検出、ならびにクラミジア・トラコマチス（ＣＴ）およびナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）等の性感染症の検出が含まれる。
【０１７５】
方法
ヘリカーゼ依存性反応において２本鎖標的核酸を増幅する方法が本明細書に開示される。例えば、ヘリカーゼ依存性反応において２本鎖標的核酸を増幅する方法が本明細書に開示され、この方法は、（ａ）標的核酸を変性させるステップと、（ｂ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、変性させた標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、１つ以上の捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｅ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｆ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む。この方法は、例えば、ステップ（ａ）が最初に行われ、次いでステップ（ｂ）、次いでステップ（ｃ）といったように、別個のステップで行われてもよい。加えて、この方法は、ステップ（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）、またはステップ（ｆ）および（ｇ）が同時に行われるように行われてもよい。
【０１７６】
２本鎖標的核酸は、ステップ（ａ）の前に試料から単離されてもよく、または２本鎖標的核酸は、標的核酸試料中に存在してもよい。つまり、方法は、試料上で直接に行われてもよい。試料は、血液、尿、便、唾液、涙液、胆汁頸部、泌尿生殖器、鼻腔スワブ、痰、または他の生物学的試料を含むが、それらに限定されない、本明細書に記載される試料のいずれであってもよい。
【０１７７】
２本鎖標的核酸がＤＮＡである場合には、ポリヌクレオチドプローブは、ＲＮＡであってもよい。代替的に、２本鎖標的核酸がＲＮＡである場合には、ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡであってもよい。
【０１７８】
また、増幅が、本明細書の他の箇所に説明される通り、等温条件下で行われてもよい。「ヘリカーゼ依存性反応」は、ゲル電気泳動によって判定されるヘリカーゼの非存在下では生じない増幅反応である。本明細書に記載される方法では、ヘリカーゼ調製物が使用される。幾つかの態様では、ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼおよび任意選択で１本鎖結合タンパク質を含む。幾つかの態様では、ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼと、ヘリカーゼ調製物が、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）が任意選択である熱安定性ヘリカーゼを含まない限り、１本鎖結合タンパク質とを含む。
【０１７９】
また、ヘリカーゼ依存性反応において２本鎖標的核酸を増幅する方法も本明細書に開示され、この方法は、（ａ）標的核酸を変性させるステップと、（ｂ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、変性させた標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、捕捉抗体は、磁気ビーズを含み、１つ以上の捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｅ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｆ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む。
【０１８０】
本明細書に記載される方法では、ステップ（ｅ）で添加される１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するため、ならびにヘリカーゼ依存性反応のために使用可能である。例えば、ステップ（ｅ）で伸長されるプライマーはまた、ヘリカーゼ依存性反応において、順方向または逆方向プライマーとしても機能することができる。代替的に、異なるオリゴヌクレオチドプライマーが、ステップ（ｅ）に、およびヘリカーゼ調製物に添加可能である。幾つかの態様では、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、互いにハイブリッド形成する可能性を最小化するように設計可能である。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ設計の方法は、本明細書の他の箇所に説明される。加えて、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、それらの同族標的との重複を最小化するように設計可能である。ある程度の重複が、反応が起こることを妨げることはないであろうが、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの間の重複は最小化されるべきである。
【０１８１】
また、ヘリカーゼ依存性反応において２本鎖標的核酸を増幅する方法も本明細書に開示され、この方法は、（ａ）標的核酸を変性させるステップと、（ｂ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、変性させた標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、１つ以上の捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｅ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｆ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つ以上は、異なる濃度で存在するステップと、を含む。例えば、オリゴヌクレオチドプローブがより低い濃度で存在し、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプローブがそれとハイブリッド形成するように設計された標的核酸の鎖の補体とハイブリッド形成するように設計されるとき、プライマーが、標的核酸の同一の鎖とハイブリッド形成するように設計される方法が開示される。そのような、オリゴヌクレオチド濃度の非対称は、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸配列とより容易に、より少ない競合によりハイブリッド形成することを可能にする。
【０１８２】
幾つかの態様では、標的核酸を変性させることは、標的核酸を変性させるために標的核酸を加熱することを含んでもよい。幾つかの態様では、標的核酸を変性させることは、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、変性させた標的核酸と接触させる前に、標的核酸をＮａＯＨの存在下でインキュベートすることを含んでもよい。他の態様では、標的核酸を変性させることは、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、変性させた標的核酸と接触させる前に、標的核酸を５０ｍＭ ＮａＯＨの存在下で、６５℃で１０分間インキュベートすることを含んでもよい。
【０１８３】
また、ヘリカーゼ依存性反応において２本鎖標的核酸を増幅する方法も本明細書に開示され、この方法は、（ａ）標的核酸を変性させるステップと、（ｂ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、変性させた標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、１つ以上の捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｅ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｆ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含み、この方法は、標的核酸を検出することをさらに含む。検出は、検出標識を反応混合物に添加することによって行われてもよい。例えば、ステップ（ａ）〜（ｇ）の間または後に検出標識が添加される方法が本明細書に開示される。また、検出標識がステップ（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）の間または後に添加される方法も開示される。検出は、増幅反応（例えば、ヘリカーゼ依存性反応）の間、増幅反応の後、または増幅反応の間と後に起こり得る。標的核酸は、エンドポイント蛍光検出によって検出可能である。
【０１８４】
また、ヘリカーゼ依存性反応において１本鎖標的核酸を増幅する方法も開示され、この方法は、（ａ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１本鎖標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｂ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、捕捉抗体のうちの１つ以上は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｄ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｅ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む。
【０１８５】
１本鎖標的核酸は、任意の１本鎖核酸であってもよく、それには、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または本明細書の他の箇所に説明される他のあらゆる核酸が含まれる。
【０１８６】
１本鎖標的核酸がＲＮＡである場合には、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブが使用可能である。１本鎖標的核酸がｍＲＮＡである幾つかの態様では、ステップ（ａ）の前に逆転写が行われてもよく、そこでｍＲＮＡは、逆転写されてｃＤＮＡを形成する。ｍＲＮＡが逆転写されてｃＤＮＡを形成する場合には、ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブが使用可能である。ステップ（ａ）の前にｍＲＮＡが逆転写されてｃＤＮＡを形成する幾つかの態様では、逆転写反応の後、ｍＲＮＡは、ステップ（ａ）の前または間に分解可能であるか、またはｍＲＮＡ分解は行われ得ない。１本鎖標的核酸がｍＲＮＡである幾つかの態様では、ｍＲＮＡ自体が１本鎖標的核酸として作用することができる。かかる態様では、ステップ（ｅ）は、逆転写反応をさらに含んでもよく、それによってステップ（ｅ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写反応を起こしてｃＤＮＡを形成するために機能することができる。次いでｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ標的核酸二重鎖を形成するために、プライマー伸長のためのテンプレートとして機能することができる。
【０１８７】
幾つかの態様では、１本鎖標的核酸配列を増幅する方法であり、この方法は、例えば、ステップ（ａ）が最初に行われ、次いでステップ（ｂ）、次いでステップ（ｃ）といったように、別個のステップで行われてもよい。加えて、この方法は、ステップ（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）、またはステップ（ｆ）および（ｇ）が同時に行われるように行われてもよい。
【０１８８】
１本鎖標的核酸は、ステップ（ａ）の前に試料から単離されてもよく、または２本鎖標的核酸は、標的核酸試料中に存在してもよい。つまり、方法は、試料上で直接に行われてもよい。試料は、血液、尿、便、唾液、涙液、胆汁頸部、泌尿生殖器、鼻腔スワブ、痰、または他の生物学的試料を含むが、それらに限定されない、本明細書に記載される試料のいずれであってもよい。
【０１８９】
１本鎖標的核酸がＤＮＡである場合には、ポリヌクレオチドプローブは、ＲＮＡであってもよい。代替的に、１本鎖標的核酸がＲＮＡである場合には、ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡであってもよい。
【０１９０】
増幅はまた、本明細書の他の箇所に説明される通り、等温条件下で行われてもよい。「ヘリカーゼ依存性反応」は、ゲル電気泳動によって判定されるヘリカーゼの非存在下では生じない増幅反応である。本明細書に記載される方法では、ヘリカーゼ調製物が使用される。幾つかの態様では、ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼおよび任意選択で１本鎖結合タンパク質を含む。幾つかの態様では、ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼと、ヘリカーゼ調製物が、１本鎖結合タンパク質が任意選択である熱安定性ヘリカーゼを含まない限り、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む。
【０１９１】
また、ヘリカーゼ依存性反応において１本鎖標的核酸を増幅する方法も開示され、この方法は、（ａ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１本鎖標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｂ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、捕捉抗体は、磁気ビーズを含み、１つ以上の捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｄ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｅ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む。
【０１９２】
本明細書に記載される方法では、ステップ（ｅ）で添加される１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するため、ならびにヘリカーゼ依存性反応のために使用可能である。例えば、ステップ（ｅ）で伸長されるプライマーはまた、ヘリカーゼ依存性反応において、順方向または逆方向プライマーとしても機能することができる。代替的に、異なるオリゴヌクレオチドプライマーが、ステップ（ｅ）に、およびヘリカーゼ調製物に添加可能である。幾つかの態様では、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、互いにハイブリッド形成する可能性を最小化するように設計可能である。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ設計の方法は、本明細書の他の箇所に説明される。加えて、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、それらの同族標的との重複を最小化するように設計可能である。ある程度の重複が、反応が起こることを妨げはしないであろうが、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの間の重複は最小化されるべきである。
【０１９３】
また、ヘリカーゼ依存性反応において１本鎖標的核酸を増幅する方法も開示され、この方法は、（ａ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１本鎖標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｂ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、捕捉抗体のうちの１つ以上は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｄ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｅ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含み、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つ以上は、異なる濃度で存在する。例えば、オリゴヌクレオチドプローブがより低い濃度で存在し、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプローブがそれとハイブリッド形成するように設計された標的核酸の鎖の補体とハイブリッド形成するように設計されるとき、プライマーが、標的核酸の同一の鎖とハイブリッド形成するように設計される方法が開示される。そのような、オリゴヌクレオチド濃度の非対称は、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸配列とより容易に、より少ない競合によりハイブリッド形成することを可能にする。
【０１９４】
増幅された核酸産物は、臭化エチジウム染色、ならびに放射標識、蛍光標識、および酵素からなる群から選択される標識を用いて、増幅された配列を検出することを含む種々の方法によって検出されてもよい。例えば、ＨＤＡ増幅産物は、蛍光標識化されたＬＵＸ（商標）用いてリアルタイムで検出可能である。ヘアピン構造の３’末端の近くのフルオロフォアを用いて設計されたオリゴヌクレオチドである、プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）。この構成は、別個の消光部分を用いずに、本質的に蛍光消光能力を提供する。プライマーが２本鎖増幅産物に組み込まれるとき、フルオロフォアが発光され、蛍光シグナルの有意な増大をもたらす。
【０１９５】
例えば、ヘリカーゼ依存性反応において１本鎖標的核酸を増幅する方法も開示され、この方法は、（ａ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１本鎖標的核酸と接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｂ）２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、捕捉抗体のうちの１つ以上は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｄ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸とハイブリッド形成するステップと、（ｅ）標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含み、この方法は、標的核酸を検出することをさらに含む。検出は、検出標識を反応混合物に添加することによって行われてもよい。例えば、ステップ（ａ）〜（ｇ）の間または後に検出標識が添加される方法が本明細書に開示される。また、検出標識がステップ（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）の間または後に添加される方法も開示される。検出は、増幅反応（例えば、ヘリカーゼ依存性反応）の間、増幅反応の後、または増幅反応の間と後に起こり得る。標的核酸は、エンドポイント蛍光検出によって検出可能である。
【０１９６】
幾つかの態様では、開示の方法の一部は、均一検定において行われてもよい。「均一検定」は、標的核酸の増幅および検出が同一の反応で起こる検定である。均一検定は、標的核酸の増幅の間または後に検出可能なシグナルを発生させる検定であってもよい。例えば、ステップ（ｅ）〜（ｇ）は、均一検定において行われてもよい。
【０１９７】
本明細書に記載される方法の幾つかの態様では、糖および／または他の添加物は、高温で使用されるポリメラーゼまたはヘリカーゼを安定化させるために使用可能である。添加物は、他の試薬から独立して添加されてもよく、またはそれらは、ヘリカーゼ調製物の一部であってもよい。例えば、開示の増幅法に使用するための添加物は、熱不安定性核酸ポリメラーゼが、昇温でテンプレート依存性重合を行うことを可能にする、任意の化合物、組成物、または組み合わせである。概して、添加物は、核酸ポリメラーゼに対する熱安定効果を有する。添加物は、熱不安定性核酸ポリメラーゼが、ポリメラーゼの通常の活性範囲を超える温度で使用されることを可能にする。有用な添加物には、糖、シャペロン、タンパク質、糖類、アミノ酸、多価アルコール、およびそれらの誘導体、および他のオスモライトが含まれる。有用な糖には、トレハロース、グルコースおよびスクロースが含まれる。有用な糖類には、オリゴ糖類、およびトレハロース、マルトース、グルコース、スクロース、ラクトース、キシロビオース、アガロビオース、セロビオース、レバンビオース、キトビオース、２−β−グルクロノシルグルクロン酸、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、マンノース、タロース、ソルビトール、レブロース、キシリトール、アラビトール等の単糖類、およびグリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等の多価アルコールが含まれる。有用なアミノ酸およびその誘導体には、を含むＮ^ｅ−アセチル−β−リシン、アラニン、γ−アミノ酪酸、ベタイン、Ｎ^α−カルバモイル−Ｌ−グルタミン１−アミド、コリン、ジメチルテチン、エコタイン（１，４，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−４−ピリミジンカルボン酸）、グルタミン酸塩、β−グルタミン、グリシン、オクトピン、プロリン、サルコシン、タウリン、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）が含まれる。有用なシャペロンタンパク質には、好熱性細菌のシャペロンタンパク質、ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、およびＨＳＰ６０等の熱ショックタンパク質が含まれる。他の有用な添加物には、ソルビトール、マンノシルグリセリン酸、ジグリセロールリン酸塩、および環状−２，３−ジホスホグリセリン酸が含まれる。化合物および組成物の組み合わせは、添加物として使用可能である。
【０１９８】
幾つかの態様では、添加物は、糖、シャペロン、タンパク質、糖類、アミノ酸、多価アルコール、およびそれらの誘導体、他のオスモライト、アミノ酸誘導体、およびシャペロンタンパク質からなる群から選択することができる。例えば、添加物は、ＤＭＳＯ、ベタイン、ソルビトール、硫酸デキストラン、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。ＤＭＳＯが添加物として使用される幾つかの態様では、ＤＭＳＯは、１〜２％の最終濃度で使用可能である。ベタインが添加物として使用される幾つかの態様では、ベタインは、０．１Ｍ〜０．５Ｍの最終濃度で使用可能である。ソルビトールが添加物として使用される幾つかの態様では、ソルビトールは、０．１Ｍ〜０．３Ｍの最終濃度で使用可能である。硫酸デキストランが添加物として使用される幾つかの態様では、硫酸デキストランは、１０ｐＭ〜１ｎＭの最終濃度で使用可能である。
【０１９９】
また、単一の反応で１つを超える標的核酸を増幅する方法も本明細書に開示される。本明細書に記載される方法は、異なる試薬組成物（異なるオリゴヌクレオチドプローブおよび異なるオリゴヌクレオチドプライマーを有する）のセットを用いることによって多重化されてもよく、各試薬組成物は、例えば、異なる標的核酸および／またはアレイ位置と会合する。例えば、同一の反応において、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）およびナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）を増幅する方法が本明細書に開示され（例えば、実施例５を参照されたい）、ここでマルチコピーＯｐａ遺伝子（ＮＧのため）、潜在プラスミド（ＣＴのため）、または外膜タンパク質（ＯＭＰ）遺伝子（ＣＴのため）のいずれかに特異的なｅＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、同対象に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて使用された。
【０２００】
また、単一のヘリカーゼ依存性反応において、２つの２本鎖標的核酸を増幅する方法も本明細書に開示され、ここで２つの２本鎖標的核酸は、第１および第２の２本鎖標的核酸を含み、この方法は、（ａ）標的核酸を変性させるステップと、（ｂ）第１の変性させた標的核酸を、第１の変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、第１の標的２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、第２の変性させた標的核酸を、第２の変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、第２の標的２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップと、（ｃ）第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、１つ以上の捕捉抗体は、第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｅ）第１の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上の第１の標的オリゴヌクレオチドプライマーを添加し、第２の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上の第２の標的オリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップと、（ｆ）第１および第２の標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、それぞれ、第１および第２の標的核酸と相補的な第１および第２の標的オリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の第１および第２の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップであって、ヘリカーゼ調製物は、第１の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上のプライマーを含み、かつ第２の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上のプライマーをさらに含むステップと、を含む。
【０２０１】
また、単一のヘリカーゼ依存性反応において、２つの１本鎖標的核酸を増幅する方法も本明細書に開示され、ここで２つの１本鎖標的核酸は、第１および第２の２本鎖標的核酸を含み、この方法は、（ａ）第１の変性させた標的核酸を、第１の変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、第１の標的２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、第２の変性させた標的核酸を、第２の変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、第２の標的２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップと、（ｂ）第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、１つ以上の捕捉抗体は、第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成するステップと、（ｃ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、（ｄ）第１の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上の第１の標的オリゴヌクレオチドプライマーを添加し、第２の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上の第２の標的オリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップと、（ｅ）第１および第２の標的核酸二重鎖を形成するためのＤＮＡポリメラーゼを用いて、それぞれ、第１および第２の標的核酸と相補的な第１および第２の標的オリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の第１および第２の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させ、ヘリカーゼ依存性反応において標的核酸二重鎖を増幅するステップであって、ヘリカーゼ調製物は、第１の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上のプライマーを含み、かつ第２の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上のプライマーをさらに含むステップと、を含む。
【０２０２】
単一の反応において１つ以上の標的核酸を増幅または検出するとき、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計が重要となる。各オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、その同族標的核酸配列に特異的であるように設計されるべきである。また、本方法をより効率的にするために、プライマー二量体またはプライマープローブ二量体を回避するようにも注意が払われるべきである。加えて、異なる２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを捕捉するために、捕捉抗体は、異なる可能性があるか、または同一の捕捉抗体を使用することができる。
【０２０３】
異なる標的核酸を特定するための異なる検出標識の使用もまた、使用可能である。例えば、異なる検出標識を、異なる標的核酸と会合させることであり、各々異なる標的核酸は、種々の検出標識の分化した検出によって検出可能である。これは、例えば、各標的核酸のために異なるＴａｑＭａｎプローブを設計することによって、達成可能である。異なる標的核酸の増幅は、例えば、蛍光変化プライマーであるオリゴヌクレオチドプローブプライマーを用いることによって、標的核酸の異なる相補的部分の配列に基づいて検出可能である。
【実施例】
【０２０４】
実施例１：アルカリ標的変性
ヘリカーゼは、二重鎖ＤＮＡを酵素的にほどくことができるため、ｔＨＤＡ反応全体を、９５℃の前熱変性を用いずに６５℃の単一の温度で行うことが可能であるかどうかを試験した。加えて、熱変性を、６５℃の化学アルカリ変性によって置換することが可能であるかどうかも試験した。ナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）およびクラミジア・トラコマチス（ＣＴ）遺伝子を、多重化ｔＨＤＡ反応のために標的として選択した。水酸化ナトリウムを、ＣＴおよびＮＧ標的（実施例１ａ．）に、またはＮＧ標的（実施例１ｂ．）に添加し、６５℃で１０分間インキュベートした。対照反応のために、標的をＨ_２Ｏ中で希釈した。標的変性に続いて、ｔＨＤＡ反応を行い、Ｌｕｍｉｎｅｘ検定（実施例１ａ．）またはリアルタイムおよびエンドポイント蛍光検出（実施例１ｂ．および１ｃ．）のいずれかを用いて特異的標的を検出した。
【０２０５】
実施例１ａ：ＣＴ／ＮＧ多重化検定におけるアルカリ標的変性の評価
この実施例のための核酸標的は、ＣＴ潜在プラスミドおよびＮＧゲノムＤＮＡであった。ｔＨＤＡ反応においてＣＴを増幅するために、ＯＲＦ ３ＦおよびＯＲＦ ３Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（それぞれ、５’−ＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＴＡＴＧＣＧＴ−３’（配列番号１８５）および５’Ｂｉｏ−ＣＴＣＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴ−３’（配列番号１８６））。ｔＨＤＡ反応においてＮＧを増幅するために、ｏｐａＤ ＦおよびｏｐａＤ Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（それぞれ、５’−ＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡ−３’（配列番号２２１）および５’−ＴＴＴＣＧＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＡ−３’（配列番号２２２））。ｏｐａＤ ＦおよびｏｐａＤ Ｒのためのプライマー濃度は、それぞれ、３０ｎＭおよび７５ｎＭであった。
【０２０６】
また、ｔＨＤＡ反応のためのヘリカーゼ調製物は、ＭｇＳＯ４：３．５ｍＭ、ＮａＣｌ：４０ｍＭ、ｄＮＴＰ：０．４ｍＭ、ｄＡＴＰ：３ｍＭ、Ｂｓｔポリメラーゼ：０．４Ｕ／ｕｌ、ヘリカーゼ：３ｎｇ／ｕｌ、およびベタイン：１Ｍも含んだ。ＮａＯＨ中、６５℃で１０分間のインキュベーション／変性、６５℃で９０分間の増幅により反応を行った。
【０２０７】
この実験の結果により、Ｌｕｍｉｎｅｘ検出を用いた多重化ＣＴ／ＮＧ ｔＨＤＡ検定において、ＮａＯＨ中の標的変性が、特にＣＴ標的の低コピー数について、改善されたシグナルをもたらし得ることが示された。また、アルカリ変性を用いないＬｕｍｉｎｅｘ−ｂａｓｅｄ検定においても、同等の感度を達成することができる。しかしながら、ＮａＯＨ変性を用いるｔＨＤＡは、減少した変動性（ＣＶ％）により、より一貫した結果を生み出すことができる。非アルカリ標的変性については、低コピー標的（１０コピーおよび２５コピー）で、より大きな変動性（より高いＣＶ％）が見られた。（図１参照）。
【０２０８】
実施例１ｂ：ｔＨＤＡｏｐａ／ｐｏｒ多重化検定における標的変性方法の比較
この実験では、２つの異なる標的核酸配列を、ＣＴおよびＮＧ（それぞれ、ｏｐａおよびｐｏｒ）の存在を特定するために使用した。まず、０、１０、１０２、および１０５コピー／検定の濃度のナイセリア・ゴノレアゲノムＤＮＡを、０．１Ｍ ＮａＯＨまたは水中で個別に希釈し、次いで６５℃で１０分間変性させた。次いでナイセリア・ゴノレアゲノムＤＮＡをリアルタイムｔＨＤＡに供した。ｔＨＤＡ反応について、ヘリカーゼ調製物は、３．５ｍＭ Ｍｇ２^＋、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ｄＡＴＰ、５Ｕ ｒＢＳＴ、０．５Ｕヘリカーゼ、０．２Ｍベタイン、および１％ＤＭＳＯを含んだ。加えて、Ｔｅｘ６１５と共役させられたＴａｑＭａｎプローブ：ＯｐａＤ ｂ１＿Ｔｅｘ；ＣＧＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＧ（配列番号１３２）およびＣｙ５（各８０ｎＭ）と共役させられたｐｏｒＡ５＿ＶＤ５＿Ｃｙ５；ＣＧＣＣＴＡＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧ（配列番号１３３）も、ヘリカーゼ調製物に添加した。
【０２０９】
ｏｐａＤｖ Ｆ１＿６／Ｒ１（それぞれ、配列番号２２８および２２９）およびｐｏｒＡ Ｆ５／Ｒ５（それぞれ、配列番号２３０および２３１）（４０／１２０ｎＭ）プライマーを、それぞれ、ｏｐａＤ（ＮＧ）およびｐｏｒＡ（ＣＴ）を増幅するために使用した。
【０２１０】
一旦、ヘリカーゼ調製物を、変性させたナイセリア・ゴノレアゲノムＤＮＡに添加すると、反応混合物を、リアルタイムサーモサイクラー機器上で、６５℃の初期ステップで６分間、続いて６５℃で１２０サイクル（各６０秒間）、インキュベートした。６５℃での増幅の後、サイクラーは、自動的に、２５℃のエンドポイント検出を循環させるであろう。増幅が完了したとき、反応混合物をサーモサイクラーから除去し、−２０℃の冷凍庫に配置することができる。
【０２１１】
結果として、ＮａＯＨ中の標的変性が、エンドポイント蛍光検出を用いた多重化ＣＴ／ＮＧ ｔＨＤＡにおいて、シグナル対ノイズ比を改善することが示された。（図２参照）。結果として、ＮａＯＨ中の標的変性が、より早い増幅（より低いＣｔ値）を促進することが示された。（図３参照）。
【０２１２】
実施例２：ｔＨＤＡと組み合わされたハイブリッド捕捉試料調製
ハイブリッド捕捉試料調製を、ＣＴ／ＮＧ多重化ｔＨＤＡ検定のための潜在的な分析前プラットフォームとして評価した。ｓｙｎＲＮＡを利用するフロントエンドハイブリッド捕捉（ＦＥ−ＨＣ）は、ＣＴおよびＮＧ標的の両方について以前に評価されている。１ＫＢ（各５０ｎｔ）の長さにわたる２０個の隣接したＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（ｓｙｎＲＮＡとも称される）を、ＣＴ標的核酸のために捕捉プローブおよびプライマー領域周辺に設計した。２２個の隣接したＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（ｓｙｎＲＮＡとも称される）（各５０ｎｔ）を、ＮＧ標的核酸のために捕捉プローブおよびプライマー領域周辺に設計した。本明細書に記載される実験について、ＮＧ遺伝子ｏｐａＤのためのＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、５０ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブの２０個の鎖として最初に設計した。追加的に、ＮＧ特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブをより小さいオリゴ鎖に調節し、各３０ｎｔの２２個のオリゴを形成した。このセットを、アンプリコン重複を用いずに設計し、それは一貫して、ＮＧ ｏｐａＤ標的のリアルタイムおよびエンドポイント検出の両方と最適に作用した。
【０２１３】
実施例２ｃは、ハイブリッド捕捉検定と、それに続くＥｖａＧｒｅｅｎを用いたリアルタイムｔＨＤＡまたはエンドポイント蛍光検出における、ｏｐａＤ特異的ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す。
【０２１４】
実施例２ａ：ハイブリッド捕捉試料調製およびＬｕｍｉｎｅｘ検定を用いたｔＨＤＡによる、ＣＴプラスミドの検出
この実施例のための標的核酸は、ＣＴ−１Ｂ潜在プラスミドであった。ＣＴプラスミドに特異的な、２０個の隣接した５０ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、ＯＲＦ捕捉プローブおよびプライマー領域周辺に設計した。この反応のための捕捉プローブは、Ｌｕｍｉｎｅｘ捕捉プローブ：ＣＴ−ＯＲＦ ＬＭＸ ＣＰ（５’−／５ＡｍＭＣ１２／ＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＧ−３’）（配列番号２３２）であった。また、表１に提供するＣＴプラスミドに特異的な、次のＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上も使用した：
【０２１５】
ＣＴプラスミドに特異的な、上に列挙するＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブの各々は、ＣＴプラスミドのヌクレオチド１７８６から出発する（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｘ０６７０７）。表１の５０ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、ＯＲＦ ３Ｆプライマーとして、同一の鎖とハイブリッド形成するように設計した。タンパク質Ｇビーズ：２．５Ｅ＋６ビーズ／検定」をこの反応で使用した。
【０２１６】
５０ｕｌの反応容積中、１５ｎＭのＣＴ ＯＲＦ順方向プライマー（５’−ＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＴＡＴＧＣＧＴ−３’、配列番号１８９）および７５ｎＭのＣＴ ＯＲＦ逆方向プライマー（５’−ＣＴＣＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴ−３’、配列番号１９０）、４ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ｄＡＴＰ、２０Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、および１Ｕ Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物を用いて、ｔＨＤＡを行った。次いでｔＨＤＡ反応を６５℃で９０分間行った。
【０２１７】
この評価の結果として、ＦＥ−ＨＣがｔＨＤＡ増幅と適合することが示された。（図４参照）。ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、ＣＴプラスミドを用いるｔＨＤＡの前に、ＦＥ−ＨＣにおいて使用可能である。ｔＨＤＡと組み合わされたＨＣ試料調製物は、したがって、標的変性に対する必要性を排除する。
【０２１８】
実施例２ｂ：ハイブリッド捕捉試料調製物およびＬｕｍｉｎｅｘ検定を用いた多重化ｔＨＤＡによる、クラミジアおよびゴノレア細胞の検出
この実施例のための標的核酸を含む試料は、ＣＴ基本小体およびＮＧ生存細胞（Ｖｉａｂｌｅ Ｃｅｌｌｓ）であった。ＣＴに特異的な２０個の隣接した５０ｍｅｒ ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブおよびＮＧに特異的な３４個の隣接した３０ｍｅｒ ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、ＯＲＦ捕捉プローブおよびプライマー領域周辺に設計した。ＣＴのためのＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを表１に上述する。また、表３に提供する、ＮＧに特異的な次のＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上も使用した。
【０２１９】
表９の３０ｍｅｒ ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、ＯＲＦ ３Ｆプライマーとして、同一の鎖とハイブリッド形成するように設計した。追加的に、オリゴヌクレオチドプローブが１５〜１００個のヌクレオチドであり得ることを判定した。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、２０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。
【０２２０】
５０ｕｌの反応容積中、１５ｎＭのＣＴ ＯＲＦ順方向プライマー（５’−ＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＧＡＧＴＡＴＧＣＧＴ−３’、配列番号１８９）および７５ｎＭのＣＴ ＯＲＦ逆方向プライマー（５’−ＣＴＣＡＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴ−３’、配列番号１９０）、４ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ｄＡＴＰ、２０Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、および１Ｕ Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物を用いて、ｔＨＤＡを行った。次いでｔＨＤＡ反応を６５℃で９０分間行った。
【０２２１】
結果として、ｔＤＨＡの前に、ＦＥ−ＨＣにおけるＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いてＣＴ基本小体（ＥＢ）およびナイセリア・ゴノレア細胞の両方を多重化で検出できることが示される。ハイブリッド捕捉と、それに続くＬｕｍｉｎｅｘ検出でのｔＨＤＡを用いるＣＴ／ＮＧの検出の限界は、１回の検定当たり２個のクラミジア細胞および３個のゴノレア細胞で、Ｓ／Ｎは１００超であり得る。また、この結果として、ｔＨＤＡを粗試料上で行うことができ、潜在的に診断ツールとして使用可能であることも示される。（図５参照）。
【０２２２】
実施例２ｃ：ハイブリッド捕捉試料調製物およびリアルタイムまたはエンドポイント蛍光検出を用いたｔＨＤＡによる、ＮＧゲノムＤＮＡの検出
概して、反応条件を実施例２ａに示す。ＮＧ ｏｐａＤ遺伝子に特異的な２２個の合成３０ｎｔ ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、ＮＧ標的核酸を捕捉するために使用した。
【０２２３】
ヘリカーゼ調製物は、４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ｄＡＴＰ、５Ｕ ｒＢＳＴ、および０．５Ｕヘリカーゼを含んだ。この実験では、ｏｐａＤ＿Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号２２１）および逆方向プライマー（配列番号２２２）を、それぞれ、４０ｎＭおよび１８０ｎＭの濃度で使用した。加えて、ｏｐａＤｖ Ｆ７プライマー（５’−ＧＴＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＴＡＴＴＧＴＧＴＴＧ−３’、配列番号２２３）およびｏｐａＤｖ Ｒ７プライマー（５’−ＣＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＡＴＴＡＴ−３’、配列番号２２４）もまた、それぞれ、４０ｎＭおよび１４０ｎＭの濃度で使用した。検出のために、ｏｐａＤ特異的ＴａｑＭａｎプローブを４０ｎＭの濃度で使用した。
【０２２４】
検出のために、０．２％ＥｖａＧｒｅｅｎを用いたリアルタイム曲線およびｏｐａＤ＿ｂ１ＴＥＸを用いたエンドポイント検出を使用した。
【０２２５】
結果として、ハイブリッド捕捉試料調製物は、ＴａｑＭａｎプローブならびにＥｖａＧｒｅｅｎ染色を用いたリアルタイムおよびエンドポイントｔＨＤＡ検定と適合することが示された。結果として、増幅混合物を捕捉された二重鎖に添加可能であること、およびＨＣビーズ上での捕捉された二重鎖の溶出が必要でないことが示された。反応を有意に阻害することなく、ｔＨＤＡ反応において１００％の捕捉二重鎖を使用することができる。（図６および７参照）。
【０２２６】
実施例３：修飾された捕捉プローブ：リアルタイムおよびエンドポイントｏｐａＤ ｔＨＤＡ検定における、ビーコン様ＴａｑＭａｎプローブの評価
修飾されたＴａｑＭａｎプローブを、ＮＧ Ｏｐａ遺伝子の標的のために設計した。修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、２５ｎｔであり、プローブの３’末端の１つの追加的ヌクレオチド（Ｇ尾）を例外として、ＮＧ標的のｏｐａＤ遺伝子配列と相補的であるように設計された。このＧヌクレオチドの付加は、このプローブについての低バックグラウンドシグナルを確保するためのステム−ループ構造を作り出す一助となった。古典的なＴａｑＭａｎプローブ、およびＮＧ ｏｐａ ｔＨＤＡ検定のために修飾されたＴａｑＭａｎプローブを用いたエンドポイント結果を本明細書に示す。
【０２２７】
ＮＧゲノムＤＮＡのＮａＯＨ変性を用いてｔＨＤＡを行った。０、１０、１００、１０^３コピー／検定のＮＧゲノムＤＮＡを使用した。ヘリカーゼ調製物は、４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ｄＡＴＰ、５Ｕ ｒＢＳＴ、０．５Ｕヘリカーゼ、および１％ＤＭＳＯを含んだ。ｏｐａＤ＿Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号２２１）および逆方向プライマー（配列番号２２２）を、それぞれ、４０ｎＭおよび１２０ｎＭの濃度で使用した。検出のために、線形ｏｐａＤプローブ（ＦＡＭ）ならびに修飾されたＴａｑＭａｎプローブを使用した。８０ｎｍの各プローブを使用した。修飾されたＴａｑＭａｎプローブ「ｏｐａｂ１修飾ＴａｑＭａｎプローブ」を図１６に示す。リアルタイムｔＨＤＡを６５℃で１２０サイクル行った。
【０２２８】
結果を本明細書の表８および９で示す。
【０２２９】
【表８】

【０２３０】
【表９】

【０２３１】
結果として、エンドポイントｔＨＤＡ検定のための、修飾されたｏｐａｂ１ ＴａｑＭａｎプローブの使用が、より低いバックグラウンドに起因してＳ／Ｎ値の有意な増加をもたらしたことが示される。修飾されたＴａｑＭａｎプローブを用いたｔＨＤＡ検定において、１０コピーのＮＧゲノムＤＮＡを検出した。
【０２３２】
実施例４：ｔＨＤＡへの添加物
実施例４は、以下の複数のｔＨＤＡ検定上の、ソルビトール／ＤＭＳＯの組み合わせの有益な効果を示す：ＮＧ１／ＮＧ２ ｏｐａ／ｐｏｒ（実施例４ａ）、ＣＴ１／ＣＴ２／ＮＧ ３重（実施例４ｂ）、およびＣＴ１／ＣＴ２／ＮＧ／ＩＣ ４重（実施例４ｃ）。ＴａｑＭａｎプローブを用いて生成されたエンドポイント蛍光データを、全ての３つの実施例について提示する。
【０２３３】
実施例４ａ：ＮＧ１／ＮＧ２ ｏｐａ／ｐｏｒ二重鎖反応における添加物
本明細書に説明される変更を例外として、上述の反応を行った。説明される反応で使用された標的核酸は、０、１０、１０２、および１０５コピー／検定の濃度のＮＧゲノムＤＮＡであった。各標的投入物の３つの複製を使用した。ｔＨＤＡ反応条件には、以下が含まれた：０．１５Ｍソルビトール、１．２５％ＤＭＳＯ、３．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ｄＡＴＰ、５Ｕ ｒＢＳＴ、０．５Ｕヘリカーゼ、（２５ｕｌ反応）。あらゆる添加物の非存在下で対照反応を行った。検出のために、ＴａｑＭａｎプローブ：ＯｐａＤ ｂ１５＿ＴｅｘおよびｐｏｒＡ５＿ＶＤ５＿Ｔｙｅ６６５（各８０ｎＭ）を使用した。ｏｐａＤｖ Ｆ１＿６／Ｒ１およびｐｏｒＡ Ｆ５／Ｒ５（４０／１２０ｎＭ）プライマーを指定の濃度で使用した。
【０２３４】
これらの実験の結果として、ソルビトールを用いたＤＭＳＯが、エンドポイント蛍光検出を用いたこの二重鎖ｔＨＤＡ検定における両方の標的について、シグナル対ノイズ比を増加させることが示された。検定の感度は、添加物の添加により、両方の標的について１０コピー標的投入であった。
【０２３５】
実施例４ｂ：ＣＴ１／ＣＴ２／ＮＧ ３重反応における添加物
本明細書に説明される変更を例外として、上述の通り反応を行った。説明される反応で使用された標的核酸は、０、１０、１０^２、および１０^３コピー／検定の濃度のＮＧおよびＣＴゲノムＤＮＡであった。各標的投入の３つの複製を使用した。ｔＨＤＡ反応条件には、以下が含まれた：０．１５Ｍソルビトール、１．２％ＤＭＳＯ、４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．６ｍＭ ｄＮＴＰ、４．５ｍＭ ｄＡＴＰ、２０Ｕ ＧＳＴ ＬＦ、１００ｎｇ ＴｔｅＵｖｒＤヘリカーゼ、および２５ｎｇ ＳＳＢ（２５ｕｌ反応）。あらゆる添加物の非存在下で対照反応を行った。ＮＧ検出のために、ＯｐａＤ ｂ１＿Ｔｅｘを使用した（６０ｎＭ）。ＣＴの検出のために、ｐ６＿Ｔｙｅ６６５およびｏｍｐ３＿ＭＡＸプローブを使用した（各６０ｎＭ）。
【０２３６】
これらの実験の結果として、ソルビトール／ＤＭＳＯの添加が、ＴａｑＭａｎプローブエンドポイント蛍光検出を用いたこの３重ｔＨＤＡ検定における全ての標的について、シグナル対ノイズ比を増加させることが示された。（図９参照）。
【０２３７】
実施例４ｃ：ＣＴ１／ＣＴ２／ＮＧ／ＩＣ ４重反応における添加物
本明細書に説明される変更を例外として、上述の通り反応を行った。説明される反応で使用された標的核酸は、０、１０、１０^２、および１０^３コピー／検定の濃度のＮＧおよびＣＴゲノムＤＮＡであった。制御ＩＣとして：ＧＩＣ１−ｓｓＤＮＡを使用した（１０００コピーのＧＩＣ１）。各標的投入の３つの複製を使用した。
【０２３８】
ｔＨＤＡ反応条件には、以下が含まれた：０．１５Ｍソルビトール、１．２％ＤＭＳＯ、４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．６ｍＭ ｄＮＴＰ、４．５ｍＭ ｄＡＴＰ、２０Ｕ ＧＳＴ ＬＦ、１００ｎｇ ＴｔｅＵｖｒＤヘリカーゼ、および２５ｎｇ ＳＳＢ（２５ｕｌ反応）。あらゆる添加物の非存在下で対照反応を行った。
【０２３９】
ＮＧ検出のために、ＯｐａＤ ｂ１＿Ｔｅｘを使用した（６０ｎＭ）。ＣＴの検出のために、ｐ６＿Ｔｙｅ６６５およびｏｍｐ３＿ＭＡＸプローブを使用した（各６０ｎＭ）。ｐ３６ ＧＩＣ１を、対照（６０ｎＭ）を検出するために使用した。ｏｐａＤｖ Ｆ／Ｒ、ｏｍｐＦ５／Ｒ４、およびＣＴ ｃｒ．ｐｌ Ｆ９／Ｒ６（４０／１２０ｎＭ）プライマーを指定の濃度で使用した。ｏｍｐ Ｆ５Ｒ４プライマー対を対照のために使用した。
【０２４０】
これらの実験の結果により、ＤＭＳＯと組み合わせたソルビトールの使用がまた、このＣＴ／ＮＧ ｔＨＤＡ多重化検定の性能も改善することが示された。（図１０参照）。
【０２４１】
実施例５．Ｎ．ゴノレアおよびＣ．トラコマチスの検出のための、均一多重化蛍光ｔＨＤＡ検定の開発
この実施例は、ハイブリッド捕捉試料調製物、好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（ｔＨＤＡ）、およびエンドポイント蛍光検出を組み合わせて、ナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）、および内部対照（ＩＣ）の検出のための、非常に高感度なおよび特異的な多重化検定を形成するために示される。
【０２４２】
ＮＧ増幅に使用された標的核酸は、マルチコピーＯｐａ遺伝子であった。ＣＴ増幅に使用された標的核酸は、潜在プラスミドおよび外膜タンパク質（ＯＭＰ）遺伝子の両方であった。二重ＣＴ標的核酸およびマルチコピーＮＧ標的核酸の使用は、突然変異または欠失が存在する場合であっても、両方の病原体の検出を可能にする。
【０２４３】
ＤＮＡの形態の標的核酸を、尿、ＳＴＭ、ＰｒｅｓｅｒｖｅＣｙｔ（登録商標）（Ｃｙｔｙｃ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ．）、およびＳｕｒｅＰａｔｈ（商標）（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を含む種々の試料採取媒体と適合する、Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ．）試料調製物を用いて抽出した。この方法により、標的核酸に対する標的特異的ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを利用してＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを作り出し、次いでそれを、磁気ビーズと共役させた捕捉抗体を用いて捕捉した。
【０２４４】
試料調製に続いて、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、ｔＨＤＡ反応に直接に添加した。ｔＨＤＡ反応は、単一の温度で２本鎖ＤＮＡをほどくためにヘリカーゼを用いた。サーマルサイクラーは、この反応で必要とされなかった。次いで二重標識蛍光プローブを用いてエンドポイント検出を行った。
【０２４５】
特定の増幅産物の最適なサイズは、約７０〜８５ｂｐであることを見出した。不斉増幅条件は、エンドポイント蛍光検出に有用であった。
この実験のための検出の限界は、１ｍＬの試料当たり、約２個のＣＴ基本小体および１０個未満のＮＧ細胞であると判定した。標的を、他の標的を大幅に超過して（１０^５コピー標的差異）、多重化で検出した。ＣＴ血清型Ａ−ＫおよびＬ１−Ｌ３を同等の感度により検出した。ナイセリア・メニンギティディスおよび複数の片利共生ナイセリア株との交差反応性は観察されなかった。
【０２４６】
これらの結果は、この検定が、その密封管フォーマット、等温増幅、および迅速なターンアラウンドタイムに起因して、高処理自動化に好適であり得ることを支持する。
【０２４７】
実施例６．クラミジア・トラコマチスおよびナイセリア・ゴノレアの検出のための多重化等温増幅検定
この実施例は、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）およびナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）の検出のための、高感度で非常に特異的な多重化検定の開発を支持する。この実施例は、等温ヘリカーゼ依存性増幅（ｔＨＤＡ）およびエンドポイント蛍光検出を用いた試料プロセシングのために、Ｑｉａｇｅｎの専有ハイブリッド捕捉（登録商標）（ＨＣ）技術（Ｑｉａｇｅｎ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を組み合わせて、臨床試料中のＣＴおよびＮＧの検出のための多重化検定を開発する。
【０２４８】
複数の採取媒体のいずれにおいて最大１ｍｌの試料を、試料プロセシングのためにＱｉａｇｅｎ ＥＴＵ（抽出管ユニット）に添加した。アルカリ中で、試料を溶解させ、ＤＮＡを変性させた。中和希釈剤中の合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ、続いて捕捉ビーズを、試料に添加した。合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸とハイブリッド形成して２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成することを可能にするために、試料を５０℃でインキュベートした。次いで磁気ビーズと共役させられた捕捉抗体を、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドに添加した。捕捉抗体は、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドに結合して捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成した。次いで捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを洗浄して、あらゆる非結合核酸を流出させた。数回の洗浄後、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドが結合されたビーズを、再懸濁させ、増幅のために反応プレートに移した。プライマー／検出プローブの混合を含むヘリカーゼ調製物を添加した。プレートを、６５℃で９０分間の増幅のために光学フィルムで密封した。増幅の後、密封管フォーマットで、二重標識プローブを用いたエンドポイント蛍光検出によって核酸を検出した。
【０２４９】
具体的には、この検定は、潜在プラスミドおよび外膜タンパク質（ｏｍｐ）遺伝子を含む２つのＣＴ標的核酸を検出した。二重標的は、偽陰性の結果を引き起こす標的配列の欠失または突然変異を回避することを確実にする。また、ＮＧ標的核酸も使用した。具体的には、外膜混濁タンパク質（ｏｐａ）、マルチコピー遺伝子が、標的核酸として機能した。
【０２５０】
この実施例から、１ｍＬの試料当たり、わずか２つのＣＴ基本小体、および１０個未満のＮＧ細胞を検出した。標的は、多重化で検出可能であり、各標的は、（１０^５）超の他の物質の存在下で検出可能であった。全てのＣＴ血清型Ａ−Ｋ、およびＬ１−Ｌ３を、同等の感度で増幅および検出した。本方法は、多くの異なる媒体中の試料のプロセシングに好適である。
【０２５１】
そのようなものとして、配列特異的な試料調製および等温標的増幅の組み合わせは、高分析感度および特異性を発揮する多重化ＣＴ／ＮＧ検定を可能にする。短いターンアラウンドタイム（３時間未満）、等温反応条件、および密封管フォーマットの組み合わせは、検定を、将来の高処理自動化への適合に最適にさせる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリカーゼ依存性反応において２本鎖標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）前記標的核酸を変性させるステップと、
（ｂ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、前記変性させた標的核酸と接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上が、前記変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、ステップと、
（ｃ）前記２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、前記１つ以上の捕捉抗体は、前記２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、ステップと
（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、
（ｅ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記標的核酸とハイブリッド形成する、ステップと、
（ｆ）標的核酸二重鎖を形成するために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記標的核酸と相補的な前記オリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させて、ヘリカーゼ依存性反応において前記標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）が同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｆ）および（ｇ）が同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２本鎖標的核酸は、標的核酸試料中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料は、血液、尿、便、唾液、涙液、胆汁頸部、泌尿生殖器、鼻腔スワブ、痰、または他の生物学的試料である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記２本鎖標的核酸は、ステップ（ａ）の前に試料から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
増幅は、等温的である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドプローブは、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼおよび任意選択で１本鎖結合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼと、前記ヘリカーゼ調製物が、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）が任意選択である熱安定性ヘリカーゼを含まない限り、前記１本鎖結合タンパク質と、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅は、ゲル電気泳動によって判定されたとき、ヘリカーゼの非存在下では生じない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｅ）〜（ｇ）は、均一検定において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）は、前記標的核酸を変性させるために、前記標的核酸を加熱することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）の前にステップ（ａ）として、ＮａＯＨの存在下で前記標的核酸をインキュベートすることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）の前に、５０ｍＭ ＮａＯＨの存在下で、６５℃で１０分間、前記標的核酸をインキュベートすることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ヘリカーゼ調製物は、添加物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記添加物は、糖、シャペロン、タンパク質、糖類、アミノ酸、多価アルコール、ならびにそれらの誘導体、他のオスモライト、アミノ酸誘導体、およびシャペロンタンパク質からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記添加物は、ＤＭＳＯ、ベタイン、ソルビトール、硫酸デキストラン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＭＳＯは、１〜２％の最終濃度で使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ベタインは、０．１Ｍ〜０．５Ｍの最終濃度で使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ソルビトールは、０．１Ｍ〜０．３Ｍの最終濃度で使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
硫酸デキストランは、１０ｐＭ〜１ｎＭの最終濃度で使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ハイブリッド捕捉抗体は、磁気ビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つ以上は、異なる濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的核酸を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法は、検出標識を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出標識は、ステップ（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）の間または後に添加される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸は、前記増幅反応の間および後の両方で検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸は、前記増幅反応の間に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的核酸は、前記増幅反応の後に検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｅ）〜（ｇ）および前記検出は、均一検定において行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的核酸は、エンドポイント蛍光検出によって検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出標識は、修飾されたＴａｑＭａｎプローブである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの５’末端と相補的な前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの３’末端に短尾を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的と相補的でない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的にも相補的である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの３’末端と相補的な前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの５’末端に短尾を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的と相補的でない、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的にも相補的である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ヘリカーゼ依存性反応において１本鎖標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、前記１本鎖標的核酸と接触させるステップとであって、前記オリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、前記標的核酸とハイブリッド形成して、２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、ステップと、
（ｂ）前記２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、捕捉抗体のうちの前記１つ以上は、前記２本鎖プローブ−標的ハイブリッドとハイブリッド形成して、捕捉された２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、ステップと、
（ｃ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、
（ｄ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記標的核酸とハイブリッド形成する、ステップと、
（ｅ）標的核酸二重鎖を形成するために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記標的核酸と相補的な前記オリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させて、ヘリカーゼ依存性反応において前記標的核酸二重鎖を増幅するステップと、を含む、方法。
【請求項４１】
前記１本鎖標的核酸は、ＤＮＡである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記１本鎖標的核酸は、ｃＤＮＡであり、前記ｃＤＮＡは、標的ｍＲＮＡを逆転写することから産生される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）が同時に行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｆ）および（ｇ）が同時に行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記１本鎖標的核酸は、標的核酸試料中に存在する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料は、血液、尿、便、唾液、涙液、胆汁頸部、泌尿生殖器、鼻腔スワブ、痰、または他の生物学的試料である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
増幅は、等温的である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリヌクレオチドプローブは、ＲＮＡである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドプライマーのうちの１つ以上が、異なる濃度で存在する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼおよび任意選択で１本鎖結合タンパク質を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼと、前記ヘリカーゼ調製物が、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）が任意選択である熱安定性ヘリカーゼを含まない限り、前記１本鎖結合タンパク質とを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記増幅は、ゲル電気泳動によって判定されたとき、ヘリカーゼの非存在下では生じない、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ｅ）〜（ｇ）は、均一検定において行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
ヘリカーゼ調製物は、添加物を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
前記添加物は、糖、シャペロン、タンパク質、糖類、アミノ酸、多価アルコール、ならびにそれらの誘導体、他のオスモライト、アミノ酸誘導体、およびシャペロンタンパク質からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記添加物は、ＤＭＳＯ、ベタイン、ソルビトール、硫酸デキストラン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
ＤＭＳＯは、１〜２％の最終濃度で使用される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ベタインは、０．１Ｍ〜０．５Ｍの最終濃度で使用される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ソルビトールは、０．１Ｍ〜０．３Ｍの最終濃度で使用される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
硫酸デキストランは、１０ｐＭ〜１ｎＭの最終濃度で使用される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記ハイブリッド捕捉抗体は、磁気ビーズを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的核酸を検出することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項６３】
ステップ（ｅ）〜（ｇ）および前記検出は、均一検定において行われる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法は、検出標識を添加することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項６５】
前記検出標識は、ステップ（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）の間または後に添加される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記標的核酸は、前記増幅反応の間および後の両方で検出される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記標的核酸は、前記増幅反応の間に検出される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的核酸は、前記増幅反応の後に検出される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
記標的核酸は、エンドポイント蛍光検出によって検出される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出標識は、修飾されたＴａｑＭａｎプローブである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの５’末端と相補的な前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの３’末端に短尾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブは、前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの３’末端と相補的な前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの５’末端に短尾を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的と相補的でない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的と相補的でない、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的とも相補的である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記修飾されたＴａｑＭａｎプローブの前記短尾が、前記標的とも相補的である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記１本鎖標的核酸は、ＲＮＡである、請求項４０に記載の方法。
【請求項７８】
前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡプローブである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
単一のヘリカーゼ依存性反応において、２つの２本鎖標的核酸を増幅する方法であって、前記２つの２本鎖標的核酸は、第１および第２の２本鎖標的核酸を含み、
（ａ）前記標的核酸を変性させるステップと、
（ｂ）第１の変性させた標的核酸を、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記第１の変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、第１の標的２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、ステップと、第２の変性させた標的核酸を、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記第２の変性させた標的核酸とハイブリッド形成して、第２の標的２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、ステップと、
（ｃ）前記第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを、１つ以上の捕捉抗体と接触させるステップであって、前記１つ以上の捕捉抗体は、前記第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドに結合して、捕捉された第１および第２の２本鎖プローブ−標的ハイブリッドを形成する、ステップと、
（ｄ）全ての捕捉されていない核酸を除去するステップと、
（ｅ）１つ以上の第１の標的オリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、前記第１の標的オリゴヌクレオチドプライマーは、前記第１の標的核酸とハイブリッド形成する、ステップと、１つ以上の第２の標的オリゴヌクレオチドプライマーを添加するステップであって、前記第２の標的オリゴヌクレオチドプライマーは、前記第２の標的核酸とハイブリッド形成する、ステップと、
（ｆ）第１および第２の標的核酸二重鎖を形成するために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記第１および第２の標的核酸とそれぞれ相補的な前記第１および第２の標的オリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記第１および第２の標的核酸二重鎖を、ヘリカーゼ調製物と接触させて、ヘリカーゼ依存性反応において前記標的核酸二重鎖を増幅するステップであって、前記ヘリカーゼ調製物は、前記第１の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上のプライマーを含み、かつ前記第２の標的核酸とハイブリッド形成する１つ以上のプライマーをさらに含む、ステップと、を含む、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１３】

【公表番号】特表２０１２−５１６１５５（Ｐ２０１２−５１６１５５Ａ）
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８２５２（Ｐ２０１１−５４８２５２）
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２２３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８８２７３
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５１１１８１６５８）
【Ｆターム（参考）】