エンプリンとＳ１００Ａ９の結合の阻害を指標とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法
【課題】Ｓ１００Ａ９の新規受容体を標的とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法の提供。
【解決手段】本発明は、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法、を提供する。
【解決手段】本発明は、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法、を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ１００Ａ９の新規受容体であるエンプリンを標的とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過剰増殖や乾癬においてアップレギュレーションされるタンパク質としてＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が知られる。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、２０を超えるメンバーから構成されるＥＦ−ハンドカルシウム結合Ｓ１００タンパク質ファミリーに属する（非特許文献１：Marenholz I et al., Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122）。どちらのタンパク質も好中球、活性化単球、およびマクロファージによって分泌され、それらの細胞の化学走性分子として機能し、炎症性細胞の漸増に関する正のフィードバックループに関与する（非特許文献２：Roth J et al., Trends Immunol (2003) 24:155-158）。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９陽性骨髄細胞は、炎症領域内に浸潤する最初の細胞である（非特許文献３：Odink K et al., Nature (1987) 330:80-82）。慢性関節リウマチ（非特許文献４：Liao H et al., Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803）、多発性硬化症（非特許文献５：Bogumil T et al., Neurosci Lett (1998) 247:195-197）、クローン病（非特許文献６：Lugering N, et al., Digestion (1995) 56:406-414）、および結合組織疾患（非特許文献７：Kuruto R, et al., J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653）を含む多数のヒト炎症性疾患で高いＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９血清レベルが観察されている。従って、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、炎症の誘導および伝播に重要な役割を担うと考えられている。
【０００３】
上皮細胞中でＳ１００Ａ８と１００Ａ９が果たす生物学的機能について、本発明者は以前、外因性Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９が複合体（Ｓ１００Ａ８／Ａ９）（別名：カルプロテクチン）を形成することで正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を刺激して乾癬性病変などにおいて発現亢進される炎症性サイトカインを産生させ、さらにＳ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインがＮＨＥＫ中でのＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生および分泌を刺激することを明らかにした（非特許文献８：J Cell Biochem. 2007 Nov 28, Epub ahead of print)。さらに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９自体がＮＨＥＫの増殖を増強することも見出した。これらの結果は、主要メディエーターとしてＳ１００Ａ８／Ａ９が関与するＮＨＥＫの増殖と炎症の正のフィードバック機構の存在を明らかにした。即ち、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が炎症性サイトカインの産生を誘導して炎症性疾患を惹起し、その炎症が細胞増殖を誘導し、さらには細胞増殖が炎症を誘導するといったスパイラルを形成し、増殖・炎症が連鎖する持続性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬などの原因となることが示唆された。
【０００４】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９により引き起こされる慢性炎症の負のサイクル形成を阻止するためには、Ｓ１００Ａ８およびＡ９のレセプターの同定が必要と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122
【非特許文献２】Trends Immunol (2003) 24:155-158
【非特許文献３】Nature (1987) 330:80-82
【非特許文献４】Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803
【非特許文献５】Neurosci Lett (1998) 247:195-197
【非特許文献６】Digestion (1995) 56:406-414
【非特許文献７】J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653
【非特許文献８】J Cell Biochem. (2008) 104:453-464
【非特許文献９】Nature Cell Biol. (2006) 8(12): 1369-1375
【非特許文献１０】Hum Genet (2002) 111:310-313
【非特許文献１１】Morrison TB et al., Biotechniques (1998) 24:954-958, 960, 962
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｓ１００Ａ９の新規受容体を標的とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｓ１００タンパク質ファミリーの受容体として知られているＲＡＧＥ (Receptor for advanced glycation endoproducts)は、Ｓ１００Ａ９とも結合することが本発明者らにより確認された。しかしながら、両者の結合による信号系の存在は、中和抗体、ｓｉＲＮＡ試験のいずれによっても確認できなかった。
【０００８】
そこで、本発明者らが、培養ケラチノサイトからＳ１００Ａ８及び／又はＡ９と結合するタンパク質を単離してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析にかけ、Ｓ１００Ａ８／Ａ９結合タンパク質の同定を試みた結果、Ｓ１００Ａ９のレセプター候補が多数発見された。その中から、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、且つ膜貫通型の糖タンパク質であるエンプリン（Emmprin）(The extracellular matrix metalloproteinase inducer)（別名バシジン又はＣＤ１４７）に着目したところ、エンプリンの発現の抑制によりＳ１００Ａ９によるサイトカイン誘導やマトリックスメタロプロテアーゼ誘導が顕著に低下することが分かった。また、免疫染色の結果は、Ｓ１００Ａ９及びエンプリンがアトピー性皮膚炎や乾癬に罹患している患者の表皮、そして、浸潤するメラノーマ細胞において強発現していることを示した。
【０００９】
従って、エンプリンがＳ１００Ａ９のレセプターであること、そして、これらの間の結合を阻害することで、慢性炎症の抑制、更には癌の転移を抑制することが見出され、本発明が完成するに至った。
【００１０】
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
（２）慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質の存在下、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９とをインキュベートし、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選定することを含んで成る、（１）に記載の方法。
（３）エンプリンが固体支持体に固相化されている、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記結合の阻害がＥＬＩＳＡ法により決定される、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を含んで成る、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
（６）前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、（６）に記載の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
（７）エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を被験者に投与することを含んで成る、慢性炎症又は癌転移の抑制方法。
（８）前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、（９）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
エンプリンは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を誘導して癌の転移を誘導する。このように、エンプリンと悪性腫瘍との関係はよく知られている。また、Ｓ１００Ａ８／Ａ９についても、転移の好発部位は、癌細胞が出すＶＥＧＦ、ＴＮＦ等の因子などと反応して、Ｓ１００Ａ８／Ａ９を分泌し、これが癌細胞の転移を誘導することが知られている（非特許文献９：Nature Cell Biol. (2006) 8(12): 1369-1375）。本発明者らが培養ケラチノサイトをＳ１００Ａ８／Ａ９で刺激したところ、癌の浸潤に関与するＭＭＰは、当該刺激により発現が亢進されたものの、エンプリンをノックダウンした場合にはその発現が有意に抑制されることが確認された（結果は示さず）。従来、ＭＭＰの発現亢進はエンプリンの自己分泌ループによると考えられていたが、上記の結果は、ＭＭＰの発現はエンプリンのみでは亢進されず、Ｓ１００Ａ９刺激を経由することが必要であることを示している。
【００１２】
癌細胞の転移に関与しているエンプリンがＳ１００Ａ９のレセプターとして機能していることは、本発明者らによって初めて見出された。実際、エンプリンの発現を抑制することでＳ１００Ａ９によるサイトカインやＭＭＰの発現亢進は低下する（実施例）。そのため、エンプリンとＳ１００Ａ９の関係を考慮すれば、癌の転移とその悪性度について新たな解釈が可能になると考えられる。更に、エンプリンは、Ｓ１００Ａ９と同様にアトピー性皮膚炎や乾癬の患者の表皮上層やメラノーマ細胞の表皮において発現していたため、両者はアトピー性皮膚炎、乾癬、癌等の慢性炎症にも関与していることが予想される。従って、本発明によれば、エンプリンとＳ１００Ａ９との結合の阻害を指標とすることで、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の探索が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】エンプリンの一次構造。
【図２】多次元キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたタンパク質の網羅的解析法により同定されたＳ１００Ａ９の受容体候補タンパク質。
【図３】エンプリンｓｉＲＮＡによるエンプリンの発現抑制効果。
【図４】エンプリンの発現抑制に伴うサイトカインの発現変化。
【図５】エンプリンの発現抑制に伴うＭＭＰの発現変化。
【図６】ウェスタンブロットによるエンプリン結合タンパク質の同定。矢印はＳ１００Ａ９のバンドを示す。
【図７】可溶性エンプリンによるＭＭＰ１の誘導効果。
【図８Ａ】ヒト正常皮膚におけるエンプリン及びＳ１００タンパク質の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｂ】皮膚モデルにおけるエンプリン及びＳ１００タンパク質の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｃ】アトピー性皮膚疾患皮膚におけるエンプリン及びＳ１００タンパク質の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｄ】Ｓ１００Ａ８抗体、２７Ｅ１０、Ｄａｐｉを用いて免疫染色したアトピー性皮膚炎及び乾癬の皮膚の比較。
【図８Ｅ】Ｓ１００Ａ９抗体、２７Ｅ１０、Ｄａｐｉを用いて免疫染色したアトピー性皮膚炎及び乾癬の皮膚の比較。
【図８Ｆ】メラノーマ組織におけるＳ１００Ａ９の局在を示す免疫染色図（上段はＨＥ染色、中段はＳ１００Ａ９抗体による染色、下段はＤＡＰＩ染色。左側、中央、右側の写真はそれぞれ異なるサンプルに由来する）。
【図８Ｇ】悪性メラノーマにおけるＳ１００Ａ９の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｈ】メラノーマ組織におけるエンプリンの局在を示す免疫染色図。
【図９】ＰＬＡ(Proximity Ligation Assay) 法によるアトピー性皮膚におけるエンプリンとＳ１００Ａ９の相互作用の証明（２００倍）。
【図１０】ＰＬＡ法によるアトピー性皮膚におけるエンプリンとＳ１００Ａ９の相互作用の証明（４００倍）。
【図１１】Ｓ１００Ａ９とエンプリンとの結合を阻害する植物抽出物のスクリーニング結果。
【図１２】ヨモギエキス、オドリコソウエキス、トウキエキスのＳ１００Ａ９−エンプリン結合阻害効果の比較。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
エンプリンは、２個のＩｇドメインを有する、１回膜貫通型の糖タンパク質であり、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）の発現亢進作用を有している。エンプリンヌルマウスには、精子形成、受精、感覚機能及び記憶機能、並びに混合リンパ球反応の欠損が見られる。エンプリンの一次構造を図１に、そしてエンプリンの全長配列を配列番号１に示す。ＭＭＰ−１で切断されたＩｇドメイン１は、コラーゲンの発現を誘導する。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、候補物質の存在下エンプリンとＳ１００Ａ９とをインキュベーションし、エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を有意に阻害する候補薬剤をＳ１００Ａ９に起因する慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選択することからなる。その評価基準として、例えばエンプリンとＳ１００Ａ９タンパク質との結合がコントロールを作用させた場合と比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％阻害されていたなら慢性炎症又は癌転移を「有意に抑制する」、と判断してよい。
【００１６】
Ｓ１００Ａ９は、上述のとおりＳ１００Ａ８と複合体を形成していることがあり、この複合体がエンプリンと結合することもある。従って、Ｓ１００Ａ８／Ａ９とエンプリンとの結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤としてスクリーニングしてもよい。
【００１７】
エンプリンとＳ１００Ａ９との結合の阻害を検出する手段は特に限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡ法に基づきエンプリンとＳ１００Ａ９（又はＳ１００Ａ８／Ａ９）との結合における検量線を作製し、この結合を阻害する分子、すなわち吸光度の低下する分子を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補薬剤として検出することができる。良好な検出感度を確保する観点から、固体支持体に吸着される分子は、分子量が大きいエンプリンが好ましい。
【００１８】
本明細書で使用する「慢性炎症」は、アトピー性皮膚炎、乾癬の他、癌なども包含する。また、本明細書で使用する「癌転移抑制」とは、癌細胞が原発巣である組織から、浸潤、血中およびリンパ管を通しての遊走、新たな組織への定着を経て、増殖を開始する過程のいずれかもしくは全てを抑制することを意味し、癌細胞の増殖抑制とは異なる。
【００１９】
Ｓ１００Ａ８およびＡ９
Ｓ１００Ａ８およびＡ９のアミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列は、例えばHum Genet (2002) 111:310-313（非特許文献１０）に公開されている。本発明において使用できるＳ１００Ａ８およびＡ９は、通常ヒト由来の天然型、あるいは組み換えタンパク質であるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。Ｓ１００Ａ８およびＡ９の組換タンパク質は、当業界で周知の方法に従い、例えば単離したまたはＰＣＲにより合成したＳ１００Ａ８又はＡ９遺伝子 (cDNA) を例えばプラスミド、ウィルス等に挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞又は植物細胞等の培養細胞に導入し、発現させることにより、大量調製することが可能である。
【００２０】
Ｓ１００Ａ９は、水や培地、例えば表皮角化細胞の培養に適当な培地、例えば上記EpiLife（登録商標）培地に溶解し、本発明のスクリーニング系に添加する。添加量は、一概には規定できないが１ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ程度の濃度とする。Ｓ１００Ａ９またはＳ１００Ａ８／Ａ９の添加は、好ましくは塩化カルシウムの存在下で行う。Ｓ１００Ａ９またはＳ１００Ａ８／Ａ９の存在下でのインキュベーション時間、インキュベーション温度といった培養条件は特に制限されることはなく、好ましくは３０〜３７℃で１〜１４時間、より好ましくは３４〜３７℃で２〜７時間、好ましくはＣＯ2５％の下でインキュベーションを行う。
【００２１】
本発明の慢性炎症抑制剤は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬などの予防、治療といった改善等に有効な医薬品又は化粧品として利用できる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法により得られた慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物が挙げられる。特に、ヨモギエキスはＳ１００Ａ９とエンプリンとの結合を有意に阻害することが確認されているため（図１２）、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の好ましい活性成分であることが予想される。ここで、本発明で使用する各植物の植物体又はその抽出物は、各々の植物体の各種部位（花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草など）をそのまま又は乾燥したものを粉砕して乾燥粉末としたもの、あるいはそのまま又は乾燥・粉砕後、溶媒で抽出したものである。
【００２３】
抽出物の場合、抽出に用いられる抽出溶媒は通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノールあるいは１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができ、このうち特に、アルコール類、含水アルコール類が好ましく、特にメタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、含水エタノールまたは含水１，３−ブチレングリコールが好ましい。また前記溶媒は、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
【００２４】
抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から、常圧下での溶媒の沸点の範囲であれば良く、抽出後は濾過又はイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすれば良い。更に多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラム等を用いれば良く、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えば良い。
【００２５】
植物体の抽出部位として、ヨモギの場合、葉が、トウキの場合、根が、オドリコソウの場合、茎、葉、花が考えられるが、抽出部位はこれらに限定されない。
【００２６】
上記溶媒で抽出して得られた抽出物をそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。
【００２７】
本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤は、前記植物体又はその抽出物の一種または二種以上からなるものであることが好ましいが、本発明の効果を損なわない範囲において、他の種々の成分を含有することができる。また、本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の慢性炎症抑制剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００２８】
本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の上記エキス成分の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には阻害剤全量中、乾燥物として0.0001〜20.0質量％、好ましくは0.0001〜10.0質量％である。ヨモギエキス、オドリコソウエキス、トウキエキスは濃度依存的に慢性炎症又は癌転移を抑制することが考えられる。
【００２９】
また、慢性炎症抑制剤中又は癌転移抑制剤中には、上記薬剤以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３０】
さらに、本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
【００３１】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
１．新規Ｓ１００Ａ９受容体候補のスクリーニング
培養ケラチノサイトから回収したタンパク質混合物とＧＳＴ融合Ｓ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９タンパク質とを混合した後、このサンプルについてキャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の網羅的解析法を行った。
【００３３】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析
内径１００μｍ、長さ１２０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｔｉｖｅ社製）のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１００ｍｍとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００３４】
内径２５０μｍ、長さ１５０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムの出口側に、平均粒径が５μｍのカチオン交換樹脂型充填剤Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＣＸ ｒｅｓｉｎｓ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）と、平均粒径が５μｍのアニオン交換樹脂型充填剤ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（ＰｏｌｙＬＣ社製）を質量比２：１で混合したもの、入口側に、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、それぞれ高さが２５ｍｍとなるように充填し、トラップ用逆相キャピラリーカラム及びＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラムからなる二相型キャピラリーカラムを得た。
【００３５】
なお、分析用逆相キャピラリーカラム及び二相型キャピラリーカラムを作製する際には、高圧窒素ガス及び加圧型充填容器を用いて、スラリー充填法により充填剤を充填した。
【００３６】
続いて、６ステップのＭｕｄＰＩＴ型分析（二次元ＨＰＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）により、上記タンパク質混合物を分析した。
【００３７】
まず、ペプチドを約４μｇ含む上清を、加圧法により、二相型キャピラリーカラムにロードした後、試料溶液の１０倍以上の体積の移動相Ａ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比９５：５：０．１の混合液；ｐＨ〜２．６）を用いて、洗浄、脱塩した。この二相型キャピラリーカラム１０を、貫通孔型ユニオン（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（不図示）を介して、分析用逆相キャピラリーカラム２０と接続した。次に、内径が１００μｍのキャピラリーを配管として用いたＮａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２型ＨＰＬＣ装置（資生堂社製）に接続した。このとき、トラップ用逆相キャピラリーカラム１１は、ＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラム１２及び分析用逆相キャピラリーカラム２０の上流側に配置した。
【００３８】
移動相としては、移動相Ａ、移動相Ｂ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比２０：８０：０．１の混合液）、移動相Ｃ（５００ｍＭの酢酸アンモニウムを含む移動相Ａ；ｐＨ〜６．８）を用い、ペプチドの溶出法は、矩形状に加える移動相Ｃの体積％をステップ毎に漸増させた、計６ステップのグラジエント溶出法とした。
【００３９】
ステップ１のグラジエントプロファイルは、５分間移動相Ａを流し、次の５分間で移動相Ｂの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｂの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｂの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。
【００４０】
ステップ２〜６のグラジエントプロファイルは、１分間移動相Ａを流し、次の４分間移動相Ｃの比率をＸ［体積％］として流し、次の５分間で移動相Ｃの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｃの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｃの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。このとき、ポンプの送液の流速を２５０μＬ／分とし、抵抗型キャピラリーによるスプリットにより、カラムの流速を３００〜４００ｎＬ／分に調整した。
【００４１】
また、ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを測定する際には、イオントラップ型質量分析計ＬＣＱ−Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。このとき、分析用逆相キャピラリーカラムから溶出されたペプチドは、スプリットすることなく、質量分析計に直接導入した。
【００４２】
なお、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００〜１４００のフルスキャンＭＳスペクトル測定１回及びデータ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトル測定３回を、各ステップを通じて繰り返した。このとき、標準化解裂エネルギーは３５％とした。また、マイクロスキャンは、ＭＳスペクトル測定及びＭＳ／ＭＳ測定ともに３とした。さらに、動的排除設定は、リピートカウント１、リピート期間０．５０分、排除リストサイズ２５、排除期間１０．００分とした。
【００４３】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにより、非冗長ヒトデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｎｒ．ｇｚ、２００７／２／８版）に対して、検索した。
【００４４】
その結果、図２に列記ような受容体候補タンパク質が同定された。これらのタンパク質の中から、バシジン（エンプリン）をＳ１００Ａ９の新規受容体として以下の実験を行った。
【００４５】
２．ｓｉＲＮＡによるエンプリンの発現抑制
エンプリンの発現抑制のために、RNAiMaxを用いて、エンプリンｓｉＲＮＡ(Santa Cruz: sc-35298)を、終濃度40 nM又は80 nMとなるように増殖期の培養ケラチノサイトにトランスフェクションした（図３中の「BSG」）。コントロールとして、何も添加していないもの（図３中の「NT」（non-treated control)）およびヒト遺伝子のいずれの部分とも相同性を有していないcontrol siRNA-A (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-3707)（図３中の「LF」）を使用した。尚、トランスフェクションは、培養培地を増殖因子を含まない基礎培地に交換してから行った。トランスフェクションから２４時間後にＳ１００Ａ９で増殖ケラチノサイトを刺激し、さらに２４時間経過後にＲＮＡを採取した。その結果、図３に示すとおり、エンプリンｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合、２４、４８、７２時間後には、上記コントロールを用いた場合のエンプリンの発現量と比較して１〜３％まで発現が抑制された。
【００４６】
３．エンプリンの発現抑制によるサイトカイン及びＭＭＰの発現変化
ＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）、ＴＮＦα、ＩＬ１−Ｆ９、ＣＸＣＬ−１は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の添加により、ケラチノサイトでの発現が亢進されることが明らかとなっている（前掲J Cell Biochem. (2008) 104:453-464）（非特許文献８）。Ｓ１００Ａ９の添加によってもＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）、ＴＮＦα、ＩＬ１−Ｆ９及びＣＸＣＬ−１の発現が亢進されるか、また、エンプリンの発現抑制がこれらのサイトカインの発現にどのような影響を与えるかについてリアルタイム定量ＰＣＲにより検討した。同様の方法により、Ｓ１００Ａ９刺激がＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１０の発現に及ぼす影響についても検討した。
【００４７】
リアルタイム定量ＰＣＲ
EpiLife（商標）-KG2（Cascade Biologies社）中で培養した増殖期のＮＨＥＫを、２ ｍＭの塩化カルシウム、Ｓ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９（各１０μｇ／ｍｌ）を含有又は非含有の同培地に置換し、３時間にわたり曝露させ、MagNA（商標） Pure mRNA抽出キットおよびMagNA Pure（商標）機器（Roche Diagnostics社、日本国、東京都）を用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡは、SuperScript（商標） II（Invitrogen Corporation社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて逆転写させた。リアルタイム定量ＰＣＲは、製造業者の取扱説明書にしたがってLightCycler FastStart DNA master SYBR green Iキット（Roche Diagnostics社）を用いてLightCycler高速サーマルサイクラーシステム上で実施した。典型的な反応条件は、１０分間の活性化ステップ、それに続く９５℃で１５秒の変性、６０℃で１０秒のアニーリング、７２℃で１０秒の伸長からなるサイクル４０回であった。使用したプライマーは、下記の表１に示す。各プライマーの最終濃度は２０μｌの総反応容量中で０．２〜０．２５μＭとした。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を対照遺伝子として使用した。増幅させたフラグメントの特異性は融解曲線分析によって確認した。各遺伝子の発現レベルは、LightCycler分析用ソフトウエアを用いて定量分析した（非特許文献１１：Morrison TB et al., Biotechniques (1998)24:954-958, 960, 962）。目的のｍＲＮＡ量は、Ａ８／control siRNA-A (santa Cruz: sc-37007)（Ａ８／ＬＦ）のｍＲＮＡの量に対する比率として表した。
【００４８】
【表１】
【００４９】
図４に示すとおり、Ｓ１００Ａ９を添加した試料（Ａ９／ＬＦ）は、全てのサイトカインの発現を誘導した。一方、エンプリンsiRNAを添加した試料（Ａ９／ｓｉＲＮＡ）は、全てのサイトカイン発現量が有意に低下した。これは、エンプリンsiRNAによってエンプリンの発現が抑制された場合、Ｓ１００Ａ９でサイトカインの発現を刺激してもサイトカインの発現が抑制されることを明確に示している。
【００５０】
ＭＭＰについても、Ｓ１００Ａ９を添加した場合、発現が亢進されるのに対し、エンプリンがノックダウンされている場合、Ｓ１００Ａ９を添加しても発現が有意に抑制されることが明らかとなった（図５）。
【００５１】
４．エンプリンとＳ１００タンパク質との結合試験
１）エンプリン細胞外ドメインの作製
[方法]
細胞： ヒト胎児腎細胞株 (HEK293) は ATCC 社より購入したものを使用し、 培養ヒト正常線維芽細胞 OUMS-24は、難波正義博士により単離されたものを使用した。 HEK293 と OUMS-24 は、 Gibco 社の DMEM/F12 培地 (最終濃度が 10% となるように牛胎児血清を添加) を用いて培養した。
【００５２】
２）エンプリン細胞外ドメイン発現コンストラクト：
CMV イントロンプロモーター (CMVi) を導入した PDNR 1r ベクター (プロモーターレスドナーベクター；Clontech 社) を構築し、CMVi の下流にヒトエンプリン細胞外ドメイン (C末にmyc-HA-Flag-6Hisタグが付加されている) をコードするcDNAを挿入した（pCMVi-exEmmp: エンプリン細胞外ドメイン発現ドナーベクター）。挿入cDNAの塩基配列は DNA シークエンサーにより正しいことを確認済みである。
【００５３】
３）エンプリン細胞外ドメインの細胞外への分泌：
pCMVi-exEmmp を、FuGENE-HD (Roche社) トランスフェクション試薬を用いて HEK293 に導入し、４８時間後に培養上清を回収した。培養上清に Sigma 社の抗 HA tag 抗体共有結合担体を添加し、４℃で３時間振盪混和した。その後、5000 rpm、１分間の遠心分離を行い、沈降してきた担体結合タンパク質を酸性バッファーにより溶出した。溶出サンプルを12% の SDS-PAGE を用いて電気泳動した後、PVDF 膜にエレクトロブロットして、CST 社の抗 HA tag 抗体を用いてウエスタンブロットを行い、エンプリン細胞外ドメインが分泌されていることを確認した。
【００５４】
４）エンプリン細胞外ドメイン発現アデノウィルス (Ad-exEmmp)：
pCMVi-exEmmp のアデノウィルスベクターへの変換は、アデノウィルス作製キット(Adeno-X-expression system: Clontech 社)を使用して行った。
【００５５】
５）エンプリン細胞外ドメインの大量精製：
Ad-exEmmp (20 MOI)を培養ヒト正常線維芽細胞 OUMS-24 (10 cm dish x 20)に感染させた。感染させる時期は、OUMS-24 が高密度状態になった時とした。これは、高密度培養により接触阻止が惹起された細胞では細胞分裂が起こらず、細胞内に存在するアデノウィルス由来エピソーム含量の低下が抑制され、その結果、アデノウィルスによる標的遺伝子発現が極めて長期間（2-3週間）持続するからである。しかも、OUMS-24 は無血清培養が可能であることより、長期に渡って培養上清中に分泌された組み換えタンパク質を、血清を含まない状態で回収することができる。感染操作後、２４時間培養して無血清培地 DMEM/F12 (フェノールレッド不含) に置換する。３日の間隔で液換えを行い、その度に培養上清を回収して４℃で保存する (タンパク質の安定性に応じて保存条件を変える)。この操作を３０日間行った。約２Ｌの回収培養上清について、８０％飽和硫安条件で得られた沈殿を５０ｍｌの純水に溶かし、その後、純水に対して透析することで硫安を除いた。 透析後、目的の組み換えタンパク質は、抗 HA tag 抗体共有結合担体充填カラム(sigma 社)を用いて回収した。
【００５６】
６）エンプリン結合タンパク質の同定：
エンプリンがＳ１００タンパク質の新規レセプターであることを確認するべく、免疫沈降及びウェスタンブロットによりエンプリン結合タンパク質の同定を行った。本実験において、エンプリンはC末にmyc-HA-Flag-6Hisタグが付加されているものを使用した。また、Ｓ１００タンパク質としてＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９タンパク質を使用した。これらのタンパク質がコードされているプラスミド(C末にHAタグが付加されている)をそれぞれHEK293細胞にトランスフェクションし、その培養上清からそれぞれのタンパク質を単離して使用した。
【００５７】
エンプリンとＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９タンパク質の結合解析のために、それぞれのタンパク質が含まれる培養上清を混合して反応させた後、HA抗体及びMyc抗体を用いて免疫沈降を行った。ウェスタンブロットの結果を図６に示す。エンプリンとＳ１００Ａ８とを混合した試料については、３２ｋＤａ付近にエンプリンのバンドのみが確認された（「Emprin + S100A8」）。一方、エンプリンとＳ１００Ａ９タンパク質とを混合した試料では（「Emprin + S100A9」）、４７．５ｋＤａ付近にそれらの結合を示すバンドが確認された。以上の結果から、エンプリンはＳ１００Ａ９タンパク質の新規レセプター候補であることが明らかとなった。
【００５８】
５．可溶性エンプリンのＭＭＰ発現に及ぼす影響
従来、ＭＭＰの発現亢進は、エンプリンの細胞外ドメインがＭＭＰにより分解され、放出された可溶性のエンプリンが細胞表面に存在する受容体としてのエンプリンに結合し、ＭＭＰの産生を促すというエンプリンの自己分泌（オートクリン）に起因すると考えられていた。従って、可溶性エンプリンが実際にＭＭＰの発現を亢進させるか否かについて検討した。
【００５９】
可溶性エンプリンとして上記方法により精製したエンプリン細胞外ドメインを用い、これをケラチノサイトに添加したところ、０．０２５、０．２５、２．５μＭのいずれの濃度でもＭＭＰ−１誘導効果はほとんど見られなかった。また、Ｓ１００Ａ９単独ではＭＭＰ−１の発現が顕著に亢進されたのに対し、可溶性エンプリンとＳ１００Ａ９とを一緒にケラチノサイトに添加した場合、Ｓ１００Ａ９によるＭＭＰ１発現亢進効果は有意に抑制された。結果を図７に示す。可溶性エンプリンとＳ１００Ａ９とが共存した場合にＭＭＰの発現が抑制されたのは、ＭＭＰ産生を誘導するＳ１００Ａ９が、可溶性エンプリンに捕捉され、両者が結合体したことによるものと考えられる。これらの結果から、従来提唱されていたエンプリンの自己分泌によるメカニズムより、Ｓ１００Ａ９刺激がエンプリンを通じてＭＭＰの発現を亢進させるというメカニズムの方が合理的と思われる。結果は示さないが、可溶性エンプリンはＭＭＰ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８の発現も有意に抑制した。
【００６０】
６．表皮におけるエンプリンの局在
１）免疫染色
エンプリンがヒト表皮に存在するか、また、Ｓ１００タンパク質と同一局在を示すかについて、免疫染色により確認した。結果を図８Ａ〜Ｃに示す。エンプリンは、正常表皮、皮膚モデル、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）の皮膚のいずれでも顆粒層で多く発現している。また、Ｓ１００タンパク質もエンプリン付近で発現していた。
【００６１】
更に、アトピー性皮膚炎の皮膚では、エンプリンが高発現しており、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９タンパク質の発現も亢進されていることが明らかとなった。また、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体を特異的に結合する２７Ｅ１０抗体を用いた免疫染色の結果は、乾癬（Ｐｓｏ）の皮膚と比較した場合、アトピー性皮膚疾患の皮膚の顆粒層でＳ１００Ａ８／Ａ９複合体が高発現していることを示している（図８Ｄ及び図８Ｅ）。
【００６２】
免疫染色の結果によると、正常表皮では、Ｓ１００Ａ８、Ａ９、エンプリンはほとんど発現していない。しかし、メラノーマ組織におけるＳ１００Ａ９の発現について免疫染色により確認したところ、いずれのサンプルでも表皮側にＳ１００Ａ９の強発現が認められた（図８Ｆ、左側、中央、右側の写真）。また、正常部位ではＳ１００Ａ９の発現はほとんど認められないのに対し、悪性メラノーマ（Clark's level III）では、メラノーマ細胞の浸潤に対応するように基底層直上の表皮にＳ１００Ａ９が発現していることが確認された（図８Ｇ）。一方、同じ腫瘍塊でも、母斑組織では表皮側にＳ１００Ａ９の発現は認められなかった。
【００６３】
Ｓ１００Ａ９抗体とエンプリン（ＣＤ１４７）抗体を用いて免疫染色した部位について、エンプリン抗体に代えてメラノーマ特異的抗体（ＨＭＢ４５）を用いて染色したところ、メラノーマ特異的抗体により染色される部位がエンプリン抗体のものと重複していた（図８Ｈ）。この結果により、エンプリンは浸潤するメラノーマ細胞において発現していることが確認された。
【００６４】
２）アトピー皮膚におけるエンプリンとＳ１００Ａ９の相互作用の証明
エンプリンとＳ１００Ａ９タンパク質とが、単に結合しているだけでなく、実際に相互作用していることをPLA (Proximity Ligation Assay) 法により確認した。PLA法によれば、ＤＮＡプローブで標識された２種類の抗体を用い、蛍光色素をラベルした相補的DNAをハイブリダイズさせることで、それらのタンパク質が相互作用しているか否かを明らかにすることができる。PLA法は、通常の免疫染色と比較してはるかに高感度である。
【００６５】
Olink社のDuolink in situ PLAキットを用い、相互作用試験を行った。アトピー患者から得られた患部皮膚組織を、4％ パラホルムアルデヒドで固定後、通常の方法でパラフィンに包埋した。 4μｍで細切後、キシレン処理、エタノール処理を経てPBSにて洗浄し、ブロッキング後、一次抗体（以下の表１参照）と４℃で一晩反応させた。PBSで洗浄後、PLAプローブ（以下の表１参照）と、３７℃で２時間反応させた。
【００６６】
【表２】
【００６７】
洗浄後、DNAプローブとハイブリダイゼーションを行い、TBS-Tで洗浄し、リガーゼを加えて３７℃で１５分インキュベートし、プローブを融合させた。ポリメラーゼを加え、３７℃で９０分インキュベートし、ライゲートしたDNAプローブの増幅を行った。Detection kit 613 (Olink社) を用いて蛍光色素をラベルし、顕微鏡観察を行った。結果を図９及び図１０に示す。
【００６８】
エンプリンとＳ１００Ａ９抗体とを用いてPLA法を行った場合、有棘層から顆粒層付近に強い陽性反応が認められた（図９）。これは、エンプリンとＳ１００Ａ９とが相互作用をしていることを示すものである。一方、Ｓ１００Ａ８についても、顆粒層付近に陽性反応が認められたが、これはＳ１００Ａ９とダイマーを形成した結果によるものと考えられる（結果は示さない）。
【００６９】
７．エンプリン細胞外ドメインへのＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９タンパク質の結合を阻害する薬剤のスクリーニング
１）リコンビナントＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９の調製とビオチン化：
ヒトＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で産生させ、グルタチオン共有結合担体によるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。その後、ＧＳＴを切断・除去した。精製したＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９タンパク質のビオチン化については次の方法をとる。各精製タンパク質濃度に対して３倍モル量の Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu (Dojindo社) を混合した。室温で 2 時間反応させた後に Nap-5 (GE Healthcare社) により未反応のビオチン化試薬を除いた。
【００７０】
２）エンプリン細胞外ドメインへのＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９タンパク質の結合を阻害する薬剤のスクリーニング：
リコンビナントエンプリン細胞外ドメイン（図１中のsignal peptideの後から、transmembrane domainの前に相当）を96 well プレート (Pierce社) のウェル上に結合させる。ウェルを洗浄後、非特異的吸着を抑えるため、各ウェルは5%BSAその他のブロッキング剤で処理する。次に試験する薬剤（対象としては、溶媒のみ）をウェル内に添加して室温で 1 時間インキュベートする。ウェルを洗浄後、リコンビナントS100A9w（エンプリンの全長配列）を加え室温で1時間インキュベートする。さらにHRP標識した抗 S100A9抗体を同ウェル内に添加して反応させる。再度洗浄し、発色基質 (オルソフェニレンジアミン) を添加して ELISAリーダーで吸光度 (O.D.492 nm)を測定する。この操作により、まずはエンプリンとＳ１００Ａ９（又はＳ１００Ａ８／Ａ９）との結合における検量線を作製する。次にこの結合を阻害する分子のスクリーニングを行う。上記のアッセイ系に薬剤を添加し、吸光度の低下するものを候補薬剤とする。
【００７１】
種々の植物抽出物を上記スクリーニング方法にかけたところ、ヨモギエキス、トウキエキス、オドリコソウエキスがコントロールよりも有意にエンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害することが明らかとなった（図１１）。中でも、ヨモギエキスは強い阻害効果を示した（図１２）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ１００Ａ９の新規受容体であるエンプリンを標的とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過剰増殖や乾癬においてアップレギュレーションされるタンパク質としてＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が知られる。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、２０を超えるメンバーから構成されるＥＦ−ハンドカルシウム結合Ｓ１００タンパク質ファミリーに属する（非特許文献１：Marenholz I et al., Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122）。どちらのタンパク質も好中球、活性化単球、およびマクロファージによって分泌され、それらの細胞の化学走性分子として機能し、炎症性細胞の漸増に関する正のフィードバックループに関与する（非特許文献２：Roth J et al., Trends Immunol (2003) 24:155-158）。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９陽性骨髄細胞は、炎症領域内に浸潤する最初の細胞である（非特許文献３：Odink K et al., Nature (1987) 330:80-82）。慢性関節リウマチ（非特許文献４：Liao H et al., Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803）、多発性硬化症（非特許文献５：Bogumil T et al., Neurosci Lett (1998) 247:195-197）、クローン病（非特許文献６：Lugering N, et al., Digestion (1995) 56:406-414）、および結合組織疾患（非特許文献７：Kuruto R, et al., J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653）を含む多数のヒト炎症性疾患で高いＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９血清レベルが観察されている。従って、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、炎症の誘導および伝播に重要な役割を担うと考えられている。
【０００３】
上皮細胞中でＳ１００Ａ８と１００Ａ９が果たす生物学的機能について、本発明者は以前、外因性Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９が複合体（Ｓ１００Ａ８／Ａ９）（別名：カルプロテクチン）を形成することで正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を刺激して乾癬性病変などにおいて発現亢進される炎症性サイトカインを産生させ、さらにＳ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインがＮＨＥＫ中でのＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生および分泌を刺激することを明らかにした（非特許文献８：J Cell Biochem. 2007 Nov 28, Epub ahead of print)。さらに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９自体がＮＨＥＫの増殖を増強することも見出した。これらの結果は、主要メディエーターとしてＳ１００Ａ８／Ａ９が関与するＮＨＥＫの増殖と炎症の正のフィードバック機構の存在を明らかにした。即ち、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が炎症性サイトカインの産生を誘導して炎症性疾患を惹起し、その炎症が細胞増殖を誘導し、さらには細胞増殖が炎症を誘導するといったスパイラルを形成し、増殖・炎症が連鎖する持続性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬などの原因となることが示唆された。
【０００４】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９により引き起こされる慢性炎症の負のサイクル形成を阻止するためには、Ｓ１００Ａ８およびＡ９のレセプターの同定が必要と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122
【非特許文献２】Trends Immunol (2003) 24:155-158
【非特許文献３】Nature (1987) 330:80-82
【非特許文献４】Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803
【非特許文献５】Neurosci Lett (1998) 247:195-197
【非特許文献６】Digestion (1995) 56:406-414
【非特許文献７】J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653
【非特許文献８】J Cell Biochem. (2008) 104:453-464
【非特許文献９】Nature Cell Biol. (2006) 8(12): 1369-1375
【非特許文献１０】Hum Genet (2002) 111:310-313
【非特許文献１１】Morrison TB et al., Biotechniques (1998) 24:954-958, 960, 962
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｓ１００Ａ９の新規受容体を標的とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｓ１００タンパク質ファミリーの受容体として知られているＲＡＧＥ (Receptor for advanced glycation endoproducts)は、Ｓ１００Ａ９とも結合することが本発明者らにより確認された。しかしながら、両者の結合による信号系の存在は、中和抗体、ｓｉＲＮＡ試験のいずれによっても確認できなかった。
【０００８】
そこで、本発明者らが、培養ケラチノサイトからＳ１００Ａ８及び／又はＡ９と結合するタンパク質を単離してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析にかけ、Ｓ１００Ａ８／Ａ９結合タンパク質の同定を試みた結果、Ｓ１００Ａ９のレセプター候補が多数発見された。その中から、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、且つ膜貫通型の糖タンパク質であるエンプリン（Emmprin）(The extracellular matrix metalloproteinase inducer)（別名バシジン又はＣＤ１４７）に着目したところ、エンプリンの発現の抑制によりＳ１００Ａ９によるサイトカイン誘導やマトリックスメタロプロテアーゼ誘導が顕著に低下することが分かった。また、免疫染色の結果は、Ｓ１００Ａ９及びエンプリンがアトピー性皮膚炎や乾癬に罹患している患者の表皮、そして、浸潤するメラノーマ細胞において強発現していることを示した。
【０００９】
従って、エンプリンがＳ１００Ａ９のレセプターであること、そして、これらの間の結合を阻害することで、慢性炎症の抑制、更には癌の転移を抑制することが見出され、本発明が完成するに至った。
【００１０】
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
（２）慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質の存在下、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９とをインキュベートし、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選定することを含んで成る、（１）に記載の方法。
（３）エンプリンが固体支持体に固相化されている、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記結合の阻害がＥＬＩＳＡ法により決定される、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を含んで成る、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
（６）前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、（６）に記載の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
（７）エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を被験者に投与することを含んで成る、慢性炎症又は癌転移の抑制方法。
（８）前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、（９）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
エンプリンは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を誘導して癌の転移を誘導する。このように、エンプリンと悪性腫瘍との関係はよく知られている。また、Ｓ１００Ａ８／Ａ９についても、転移の好発部位は、癌細胞が出すＶＥＧＦ、ＴＮＦ等の因子などと反応して、Ｓ１００Ａ８／Ａ９を分泌し、これが癌細胞の転移を誘導することが知られている（非特許文献９：Nature Cell Biol. (2006) 8(12): 1369-1375）。本発明者らが培養ケラチノサイトをＳ１００Ａ８／Ａ９で刺激したところ、癌の浸潤に関与するＭＭＰは、当該刺激により発現が亢進されたものの、エンプリンをノックダウンした場合にはその発現が有意に抑制されることが確認された（結果は示さず）。従来、ＭＭＰの発現亢進はエンプリンの自己分泌ループによると考えられていたが、上記の結果は、ＭＭＰの発現はエンプリンのみでは亢進されず、Ｓ１００Ａ９刺激を経由することが必要であることを示している。
【００１２】
癌細胞の転移に関与しているエンプリンがＳ１００Ａ９のレセプターとして機能していることは、本発明者らによって初めて見出された。実際、エンプリンの発現を抑制することでＳ１００Ａ９によるサイトカインやＭＭＰの発現亢進は低下する（実施例）。そのため、エンプリンとＳ１００Ａ９の関係を考慮すれば、癌の転移とその悪性度について新たな解釈が可能になると考えられる。更に、エンプリンは、Ｓ１００Ａ９と同様にアトピー性皮膚炎や乾癬の患者の表皮上層やメラノーマ細胞の表皮において発現していたため、両者はアトピー性皮膚炎、乾癬、癌等の慢性炎症にも関与していることが予想される。従って、本発明によれば、エンプリンとＳ１００Ａ９との結合の阻害を指標とすることで、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の探索が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】エンプリンの一次構造。
【図２】多次元キャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたタンパク質の網羅的解析法により同定されたＳ１００Ａ９の受容体候補タンパク質。
【図３】エンプリンｓｉＲＮＡによるエンプリンの発現抑制効果。
【図４】エンプリンの発現抑制に伴うサイトカインの発現変化。
【図５】エンプリンの発現抑制に伴うＭＭＰの発現変化。
【図６】ウェスタンブロットによるエンプリン結合タンパク質の同定。矢印はＳ１００Ａ９のバンドを示す。
【図７】可溶性エンプリンによるＭＭＰ１の誘導効果。
【図８Ａ】ヒト正常皮膚におけるエンプリン及びＳ１００タンパク質の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｂ】皮膚モデルにおけるエンプリン及びＳ１００タンパク質の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｃ】アトピー性皮膚疾患皮膚におけるエンプリン及びＳ１００タンパク質の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｄ】Ｓ１００Ａ８抗体、２７Ｅ１０、Ｄａｐｉを用いて免疫染色したアトピー性皮膚炎及び乾癬の皮膚の比較。
【図８Ｅ】Ｓ１００Ａ９抗体、２７Ｅ１０、Ｄａｐｉを用いて免疫染色したアトピー性皮膚炎及び乾癬の皮膚の比較。
【図８Ｆ】メラノーマ組織におけるＳ１００Ａ９の局在を示す免疫染色図（上段はＨＥ染色、中段はＳ１００Ａ９抗体による染色、下段はＤＡＰＩ染色。左側、中央、右側の写真はそれぞれ異なるサンプルに由来する）。
【図８Ｇ】悪性メラノーマにおけるＳ１００Ａ９の局在を示す免疫染色図。
【図８Ｈ】メラノーマ組織におけるエンプリンの局在を示す免疫染色図。
【図９】ＰＬＡ(Proximity Ligation Assay) 法によるアトピー性皮膚におけるエンプリンとＳ１００Ａ９の相互作用の証明（２００倍）。
【図１０】ＰＬＡ法によるアトピー性皮膚におけるエンプリンとＳ１００Ａ９の相互作用の証明（４００倍）。
【図１１】Ｓ１００Ａ９とエンプリンとの結合を阻害する植物抽出物のスクリーニング結果。
【図１２】ヨモギエキス、オドリコソウエキス、トウキエキスのＳ１００Ａ９−エンプリン結合阻害効果の比較。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
エンプリンは、２個のＩｇドメインを有する、１回膜貫通型の糖タンパク質であり、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）の発現亢進作用を有している。エンプリンヌルマウスには、精子形成、受精、感覚機能及び記憶機能、並びに混合リンパ球反応の欠損が見られる。エンプリンの一次構造を図１に、そしてエンプリンの全長配列を配列番号１に示す。ＭＭＰ−１で切断されたＩｇドメイン１は、コラーゲンの発現を誘導する。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、候補物質の存在下エンプリンとＳ１００Ａ９とをインキュベーションし、エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を有意に阻害する候補薬剤をＳ１００Ａ９に起因する慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選択することからなる。その評価基準として、例えばエンプリンとＳ１００Ａ９タンパク質との結合がコントロールを作用させた場合と比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％阻害されていたなら慢性炎症又は癌転移を「有意に抑制する」、と判断してよい。
【００１６】
Ｓ１００Ａ９は、上述のとおりＳ１００Ａ８と複合体を形成していることがあり、この複合体がエンプリンと結合することもある。従って、Ｓ１００Ａ８／Ａ９とエンプリンとの結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤としてスクリーニングしてもよい。
【００１７】
エンプリンとＳ１００Ａ９との結合の阻害を検出する手段は特に限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡ法に基づきエンプリンとＳ１００Ａ９（又はＳ１００Ａ８／Ａ９）との結合における検量線を作製し、この結合を阻害する分子、すなわち吸光度の低下する分子を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補薬剤として検出することができる。良好な検出感度を確保する観点から、固体支持体に吸着される分子は、分子量が大きいエンプリンが好ましい。
【００１８】
本明細書で使用する「慢性炎症」は、アトピー性皮膚炎、乾癬の他、癌なども包含する。また、本明細書で使用する「癌転移抑制」とは、癌細胞が原発巣である組織から、浸潤、血中およびリンパ管を通しての遊走、新たな組織への定着を経て、増殖を開始する過程のいずれかもしくは全てを抑制することを意味し、癌細胞の増殖抑制とは異なる。
【００１９】
Ｓ１００Ａ８およびＡ９
Ｓ１００Ａ８およびＡ９のアミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列は、例えばHum Genet (2002) 111:310-313（非特許文献１０）に公開されている。本発明において使用できるＳ１００Ａ８およびＡ９は、通常ヒト由来の天然型、あるいは組み換えタンパク質であるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。Ｓ１００Ａ８およびＡ９の組換タンパク質は、当業界で周知の方法に従い、例えば単離したまたはＰＣＲにより合成したＳ１００Ａ８又はＡ９遺伝子 (cDNA) を例えばプラスミド、ウィルス等に挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞又は植物細胞等の培養細胞に導入し、発現させることにより、大量調製することが可能である。
【００２０】
Ｓ１００Ａ９は、水や培地、例えば表皮角化細胞の培養に適当な培地、例えば上記EpiLife（登録商標）培地に溶解し、本発明のスクリーニング系に添加する。添加量は、一概には規定できないが１ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ程度の濃度とする。Ｓ１００Ａ９またはＳ１００Ａ８／Ａ９の添加は、好ましくは塩化カルシウムの存在下で行う。Ｓ１００Ａ９またはＳ１００Ａ８／Ａ９の存在下でのインキュベーション時間、インキュベーション温度といった培養条件は特に制限されることはなく、好ましくは３０〜３７℃で１〜１４時間、より好ましくは３４〜３７℃で２〜７時間、好ましくはＣＯ2５％の下でインキュベーションを行う。
【００２１】
本発明の慢性炎症抑制剤は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９に起因する持続性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬などの予防、治療といった改善等に有効な医薬品又は化粧品として利用できる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法により得られた慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物が挙げられる。特に、ヨモギエキスはＳ１００Ａ９とエンプリンとの結合を有意に阻害することが確認されているため（図１２）、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の好ましい活性成分であることが予想される。ここで、本発明で使用する各植物の植物体又はその抽出物は、各々の植物体の各種部位（花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草など）をそのまま又は乾燥したものを粉砕して乾燥粉末としたもの、あるいはそのまま又は乾燥・粉砕後、溶媒で抽出したものである。
【００２３】
抽出物の場合、抽出に用いられる抽出溶媒は通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノールあるいは１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができ、このうち特に、アルコール類、含水アルコール類が好ましく、特にメタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、含水エタノールまたは含水１，３−ブチレングリコールが好ましい。また前記溶媒は、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
【００２４】
抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から、常圧下での溶媒の沸点の範囲であれば良く、抽出後は濾過又はイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすれば良い。更に多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラム等を用いれば良く、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えば良い。
【００２５】
植物体の抽出部位として、ヨモギの場合、葉が、トウキの場合、根が、オドリコソウの場合、茎、葉、花が考えられるが、抽出部位はこれらに限定されない。
【００２６】
上記溶媒で抽出して得られた抽出物をそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。
【００２７】
本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤は、前記植物体又はその抽出物の一種または二種以上からなるものであることが好ましいが、本発明の効果を損なわない範囲において、他の種々の成分を含有することができる。また、本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の慢性炎症抑制剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００２８】
本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の上記エキス成分の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には阻害剤全量中、乾燥物として0.0001〜20.0質量％、好ましくは0.0001〜10.0質量％である。ヨモギエキス、オドリコソウエキス、トウキエキスは濃度依存的に慢性炎症又は癌転移を抑制することが考えられる。
【００２９】
また、慢性炎症抑制剤中又は癌転移抑制剤中には、上記薬剤以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３０】
さらに、本発明の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
【００３１】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
１．新規Ｓ１００Ａ９受容体候補のスクリーニング
培養ケラチノサイトから回収したタンパク質混合物とＧＳＴ融合Ｓ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９タンパク質とを混合した後、このサンプルについてキャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の網羅的解析法を行った。
【００３３】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析
内径１００μｍ、長さ１２０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｔｉｖｅ社製）のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１００ｍｍとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００３４】
内径２５０μｍ、長さ１５０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムの出口側に、平均粒径が５μｍのカチオン交換樹脂型充填剤Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＣＸ ｒｅｓｉｎｓ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）と、平均粒径が５μｍのアニオン交換樹脂型充填剤ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（ＰｏｌｙＬＣ社製）を質量比２：１で混合したもの、入口側に、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、それぞれ高さが２５ｍｍとなるように充填し、トラップ用逆相キャピラリーカラム及びＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラムからなる二相型キャピラリーカラムを得た。
【００３５】
なお、分析用逆相キャピラリーカラム及び二相型キャピラリーカラムを作製する際には、高圧窒素ガス及び加圧型充填容器を用いて、スラリー充填法により充填剤を充填した。
【００３６】
続いて、６ステップのＭｕｄＰＩＴ型分析（二次元ＨＰＬＣ／ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）により、上記タンパク質混合物を分析した。
【００３７】
まず、ペプチドを約４μｇ含む上清を、加圧法により、二相型キャピラリーカラムにロードした後、試料溶液の１０倍以上の体積の移動相Ａ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比９５：５：０．１の混合液；ｐＨ〜２．６）を用いて、洗浄、脱塩した。この二相型キャピラリーカラム１０を、貫通孔型ユニオン（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（不図示）を介して、分析用逆相キャピラリーカラム２０と接続した。次に、内径が１００μｍのキャピラリーを配管として用いたＮａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２型ＨＰＬＣ装置（資生堂社製）に接続した。このとき、トラップ用逆相キャピラリーカラム１１は、ＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラム１２及び分析用逆相キャピラリーカラム２０の上流側に配置した。
【００３８】
移動相としては、移動相Ａ、移動相Ｂ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比２０：８０：０．１の混合液）、移動相Ｃ（５００ｍＭの酢酸アンモニウムを含む移動相Ａ；ｐＨ〜６．８）を用い、ペプチドの溶出法は、矩形状に加える移動相Ｃの体積％をステップ毎に漸増させた、計６ステップのグラジエント溶出法とした。
【００３９】
ステップ１のグラジエントプロファイルは、５分間移動相Ａを流し、次の５分間で移動相Ｂの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｂの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｂの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。
【００４０】
ステップ２〜６のグラジエントプロファイルは、１分間移動相Ａを流し、次の４分間移動相Ｃの比率をＸ［体積％］として流し、次の５分間で移動相Ｃの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｃの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｃの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。このとき、ポンプの送液の流速を２５０μＬ／分とし、抵抗型キャピラリーによるスプリットにより、カラムの流速を３００〜４００ｎＬ／分に調整した。
【００４１】
また、ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳを測定する際には、イオントラップ型質量分析計ＬＣＱ−Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。このとき、分析用逆相キャピラリーカラムから溶出されたペプチドは、スプリットすることなく、質量分析計に直接導入した。
【００４２】
なお、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００〜１４００のフルスキャンＭＳスペクトル測定１回及びデータ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトル測定３回を、各ステップを通じて繰り返した。このとき、標準化解裂エネルギーは３５％とした。また、マイクロスキャンは、ＭＳスペクトル測定及びＭＳ／ＭＳ測定ともに３とした。さらに、動的排除設定は、リピートカウント１、リピート期間０．５０分、排除リストサイズ２５、排除期間１０．００分とした。
【００４３】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにより、非冗長ヒトデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｎｒ．ｇｚ、２００７／２／８版）に対して、検索した。
【００４４】
その結果、図２に列記ような受容体候補タンパク質が同定された。これらのタンパク質の中から、バシジン（エンプリン）をＳ１００Ａ９の新規受容体として以下の実験を行った。
【００４５】
２．ｓｉＲＮＡによるエンプリンの発現抑制
エンプリンの発現抑制のために、RNAiMaxを用いて、エンプリンｓｉＲＮＡ(Santa Cruz: sc-35298)を、終濃度40 nM又は80 nMとなるように増殖期の培養ケラチノサイトにトランスフェクションした（図３中の「BSG」）。コントロールとして、何も添加していないもの（図３中の「NT」（non-treated control)）およびヒト遺伝子のいずれの部分とも相同性を有していないcontrol siRNA-A (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-3707)（図３中の「LF」）を使用した。尚、トランスフェクションは、培養培地を増殖因子を含まない基礎培地に交換してから行った。トランスフェクションから２４時間後にＳ１００Ａ９で増殖ケラチノサイトを刺激し、さらに２４時間経過後にＲＮＡを採取した。その結果、図３に示すとおり、エンプリンｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合、２４、４８、７２時間後には、上記コントロールを用いた場合のエンプリンの発現量と比較して１〜３％まで発現が抑制された。
【００４６】
３．エンプリンの発現抑制によるサイトカイン及びＭＭＰの発現変化
ＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）、ＴＮＦα、ＩＬ１−Ｆ９、ＣＸＣＬ−１は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の添加により、ケラチノサイトでの発現が亢進されることが明らかとなっている（前掲J Cell Biochem. (2008) 104:453-464）（非特許文献８）。Ｓ１００Ａ９の添加によってもＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）、ＴＮＦα、ＩＬ１−Ｆ９及びＣＸＣＬ−１の発現が亢進されるか、また、エンプリンの発現抑制がこれらのサイトカインの発現にどのような影響を与えるかについてリアルタイム定量ＰＣＲにより検討した。同様の方法により、Ｓ１００Ａ９刺激がＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１０の発現に及ぼす影響についても検討した。
【００４７】
リアルタイム定量ＰＣＲ
EpiLife（商標）-KG2（Cascade Biologies社）中で培養した増殖期のＮＨＥＫを、２ ｍＭの塩化カルシウム、Ｓ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９（各１０μｇ／ｍｌ）を含有又は非含有の同培地に置換し、３時間にわたり曝露させ、MagNA（商標） Pure mRNA抽出キットおよびMagNA Pure（商標）機器（Roche Diagnostics社、日本国、東京都）を用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡは、SuperScript（商標） II（Invitrogen Corporation社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて逆転写させた。リアルタイム定量ＰＣＲは、製造業者の取扱説明書にしたがってLightCycler FastStart DNA master SYBR green Iキット（Roche Diagnostics社）を用いてLightCycler高速サーマルサイクラーシステム上で実施した。典型的な反応条件は、１０分間の活性化ステップ、それに続く９５℃で１５秒の変性、６０℃で１０秒のアニーリング、７２℃で１０秒の伸長からなるサイクル４０回であった。使用したプライマーは、下記の表１に示す。各プライマーの最終濃度は２０μｌの総反応容量中で０．２〜０．２５μＭとした。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を対照遺伝子として使用した。増幅させたフラグメントの特異性は融解曲線分析によって確認した。各遺伝子の発現レベルは、LightCycler分析用ソフトウエアを用いて定量分析した（非特許文献１１：Morrison TB et al., Biotechniques (1998)24:954-958, 960, 962）。目的のｍＲＮＡ量は、Ａ８／control siRNA-A (santa Cruz: sc-37007)（Ａ８／ＬＦ）のｍＲＮＡの量に対する比率として表した。
【００４８】
【表１】
【００４９】
図４に示すとおり、Ｓ１００Ａ９を添加した試料（Ａ９／ＬＦ）は、全てのサイトカインの発現を誘導した。一方、エンプリンsiRNAを添加した試料（Ａ９／ｓｉＲＮＡ）は、全てのサイトカイン発現量が有意に低下した。これは、エンプリンsiRNAによってエンプリンの発現が抑制された場合、Ｓ１００Ａ９でサイトカインの発現を刺激してもサイトカインの発現が抑制されることを明確に示している。
【００５０】
ＭＭＰについても、Ｓ１００Ａ９を添加した場合、発現が亢進されるのに対し、エンプリンがノックダウンされている場合、Ｓ１００Ａ９を添加しても発現が有意に抑制されることが明らかとなった（図５）。
【００５１】
４．エンプリンとＳ１００タンパク質との結合試験
１）エンプリン細胞外ドメインの作製
[方法]
細胞： ヒト胎児腎細胞株 (HEK293) は ATCC 社より購入したものを使用し、 培養ヒト正常線維芽細胞 OUMS-24は、難波正義博士により単離されたものを使用した。 HEK293 と OUMS-24 は、 Gibco 社の DMEM/F12 培地 (最終濃度が 10% となるように牛胎児血清を添加) を用いて培養した。
【００５２】
２）エンプリン細胞外ドメイン発現コンストラクト：
CMV イントロンプロモーター (CMVi) を導入した PDNR 1r ベクター (プロモーターレスドナーベクター；Clontech 社) を構築し、CMVi の下流にヒトエンプリン細胞外ドメイン (C末にmyc-HA-Flag-6Hisタグが付加されている) をコードするcDNAを挿入した（pCMVi-exEmmp: エンプリン細胞外ドメイン発現ドナーベクター）。挿入cDNAの塩基配列は DNA シークエンサーにより正しいことを確認済みである。
【００５３】
３）エンプリン細胞外ドメインの細胞外への分泌：
pCMVi-exEmmp を、FuGENE-HD (Roche社) トランスフェクション試薬を用いて HEK293 に導入し、４８時間後に培養上清を回収した。培養上清に Sigma 社の抗 HA tag 抗体共有結合担体を添加し、４℃で３時間振盪混和した。その後、5000 rpm、１分間の遠心分離を行い、沈降してきた担体結合タンパク質を酸性バッファーにより溶出した。溶出サンプルを12% の SDS-PAGE を用いて電気泳動した後、PVDF 膜にエレクトロブロットして、CST 社の抗 HA tag 抗体を用いてウエスタンブロットを行い、エンプリン細胞外ドメインが分泌されていることを確認した。
【００５４】
４）エンプリン細胞外ドメイン発現アデノウィルス (Ad-exEmmp)：
pCMVi-exEmmp のアデノウィルスベクターへの変換は、アデノウィルス作製キット(Adeno-X-expression system: Clontech 社)を使用して行った。
【００５５】
５）エンプリン細胞外ドメインの大量精製：
Ad-exEmmp (20 MOI)を培養ヒト正常線維芽細胞 OUMS-24 (10 cm dish x 20)に感染させた。感染させる時期は、OUMS-24 が高密度状態になった時とした。これは、高密度培養により接触阻止が惹起された細胞では細胞分裂が起こらず、細胞内に存在するアデノウィルス由来エピソーム含量の低下が抑制され、その結果、アデノウィルスによる標的遺伝子発現が極めて長期間（2-3週間）持続するからである。しかも、OUMS-24 は無血清培養が可能であることより、長期に渡って培養上清中に分泌された組み換えタンパク質を、血清を含まない状態で回収することができる。感染操作後、２４時間培養して無血清培地 DMEM/F12 (フェノールレッド不含) に置換する。３日の間隔で液換えを行い、その度に培養上清を回収して４℃で保存する (タンパク質の安定性に応じて保存条件を変える)。この操作を３０日間行った。約２Ｌの回収培養上清について、８０％飽和硫安条件で得られた沈殿を５０ｍｌの純水に溶かし、その後、純水に対して透析することで硫安を除いた。 透析後、目的の組み換えタンパク質は、抗 HA tag 抗体共有結合担体充填カラム(sigma 社)を用いて回収した。
【００５６】
６）エンプリン結合タンパク質の同定：
エンプリンがＳ１００タンパク質の新規レセプターであることを確認するべく、免疫沈降及びウェスタンブロットによりエンプリン結合タンパク質の同定を行った。本実験において、エンプリンはC末にmyc-HA-Flag-6Hisタグが付加されているものを使用した。また、Ｓ１００タンパク質としてＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９タンパク質を使用した。これらのタンパク質がコードされているプラスミド(C末にHAタグが付加されている)をそれぞれHEK293細胞にトランスフェクションし、その培養上清からそれぞれのタンパク質を単離して使用した。
【００５７】
エンプリンとＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９タンパク質の結合解析のために、それぞれのタンパク質が含まれる培養上清を混合して反応させた後、HA抗体及びMyc抗体を用いて免疫沈降を行った。ウェスタンブロットの結果を図６に示す。エンプリンとＳ１００Ａ８とを混合した試料については、３２ｋＤａ付近にエンプリンのバンドのみが確認された（「Emprin + S100A8」）。一方、エンプリンとＳ１００Ａ９タンパク質とを混合した試料では（「Emprin + S100A9」）、４７．５ｋＤａ付近にそれらの結合を示すバンドが確認された。以上の結果から、エンプリンはＳ１００Ａ９タンパク質の新規レセプター候補であることが明らかとなった。
【００５８】
５．可溶性エンプリンのＭＭＰ発現に及ぼす影響
従来、ＭＭＰの発現亢進は、エンプリンの細胞外ドメインがＭＭＰにより分解され、放出された可溶性のエンプリンが細胞表面に存在する受容体としてのエンプリンに結合し、ＭＭＰの産生を促すというエンプリンの自己分泌（オートクリン）に起因すると考えられていた。従って、可溶性エンプリンが実際にＭＭＰの発現を亢進させるか否かについて検討した。
【００５９】
可溶性エンプリンとして上記方法により精製したエンプリン細胞外ドメインを用い、これをケラチノサイトに添加したところ、０．０２５、０．２５、２．５μＭのいずれの濃度でもＭＭＰ−１誘導効果はほとんど見られなかった。また、Ｓ１００Ａ９単独ではＭＭＰ−１の発現が顕著に亢進されたのに対し、可溶性エンプリンとＳ１００Ａ９とを一緒にケラチノサイトに添加した場合、Ｓ１００Ａ９によるＭＭＰ１発現亢進効果は有意に抑制された。結果を図７に示す。可溶性エンプリンとＳ１００Ａ９とが共存した場合にＭＭＰの発現が抑制されたのは、ＭＭＰ産生を誘導するＳ１００Ａ９が、可溶性エンプリンに捕捉され、両者が結合体したことによるものと考えられる。これらの結果から、従来提唱されていたエンプリンの自己分泌によるメカニズムより、Ｓ１００Ａ９刺激がエンプリンを通じてＭＭＰの発現を亢進させるというメカニズムの方が合理的と思われる。結果は示さないが、可溶性エンプリンはＭＭＰ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−８の発現も有意に抑制した。
【００６０】
６．表皮におけるエンプリンの局在
１）免疫染色
エンプリンがヒト表皮に存在するか、また、Ｓ１００タンパク質と同一局在を示すかについて、免疫染色により確認した。結果を図８Ａ〜Ｃに示す。エンプリンは、正常表皮、皮膚モデル、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）の皮膚のいずれでも顆粒層で多く発現している。また、Ｓ１００タンパク質もエンプリン付近で発現していた。
【００６１】
更に、アトピー性皮膚炎の皮膚では、エンプリンが高発現しており、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９タンパク質の発現も亢進されていることが明らかとなった。また、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体を特異的に結合する２７Ｅ１０抗体を用いた免疫染色の結果は、乾癬（Ｐｓｏ）の皮膚と比較した場合、アトピー性皮膚疾患の皮膚の顆粒層でＳ１００Ａ８／Ａ９複合体が高発現していることを示している（図８Ｄ及び図８Ｅ）。
【００６２】
免疫染色の結果によると、正常表皮では、Ｓ１００Ａ８、Ａ９、エンプリンはほとんど発現していない。しかし、メラノーマ組織におけるＳ１００Ａ９の発現について免疫染色により確認したところ、いずれのサンプルでも表皮側にＳ１００Ａ９の強発現が認められた（図８Ｆ、左側、中央、右側の写真）。また、正常部位ではＳ１００Ａ９の発現はほとんど認められないのに対し、悪性メラノーマ（Clark's level III）では、メラノーマ細胞の浸潤に対応するように基底層直上の表皮にＳ１００Ａ９が発現していることが確認された（図８Ｇ）。一方、同じ腫瘍塊でも、母斑組織では表皮側にＳ１００Ａ９の発現は認められなかった。
【００６３】
Ｓ１００Ａ９抗体とエンプリン（ＣＤ１４７）抗体を用いて免疫染色した部位について、エンプリン抗体に代えてメラノーマ特異的抗体（ＨＭＢ４５）を用いて染色したところ、メラノーマ特異的抗体により染色される部位がエンプリン抗体のものと重複していた（図８Ｈ）。この結果により、エンプリンは浸潤するメラノーマ細胞において発現していることが確認された。
【００６４】
２）アトピー皮膚におけるエンプリンとＳ１００Ａ９の相互作用の証明
エンプリンとＳ１００Ａ９タンパク質とが、単に結合しているだけでなく、実際に相互作用していることをPLA (Proximity Ligation Assay) 法により確認した。PLA法によれば、ＤＮＡプローブで標識された２種類の抗体を用い、蛍光色素をラベルした相補的DNAをハイブリダイズさせることで、それらのタンパク質が相互作用しているか否かを明らかにすることができる。PLA法は、通常の免疫染色と比較してはるかに高感度である。
【００６５】
Olink社のDuolink in situ PLAキットを用い、相互作用試験を行った。アトピー患者から得られた患部皮膚組織を、4％ パラホルムアルデヒドで固定後、通常の方法でパラフィンに包埋した。 4μｍで細切後、キシレン処理、エタノール処理を経てPBSにて洗浄し、ブロッキング後、一次抗体（以下の表１参照）と４℃で一晩反応させた。PBSで洗浄後、PLAプローブ（以下の表１参照）と、３７℃で２時間反応させた。
【００６６】
【表２】
【００６７】
洗浄後、DNAプローブとハイブリダイゼーションを行い、TBS-Tで洗浄し、リガーゼを加えて３７℃で１５分インキュベートし、プローブを融合させた。ポリメラーゼを加え、３７℃で９０分インキュベートし、ライゲートしたDNAプローブの増幅を行った。Detection kit 613 (Olink社) を用いて蛍光色素をラベルし、顕微鏡観察を行った。結果を図９及び図１０に示す。
【００６８】
エンプリンとＳ１００Ａ９抗体とを用いてPLA法を行った場合、有棘層から顆粒層付近に強い陽性反応が認められた（図９）。これは、エンプリンとＳ１００Ａ９とが相互作用をしていることを示すものである。一方、Ｓ１００Ａ８についても、顆粒層付近に陽性反応が認められたが、これはＳ１００Ａ９とダイマーを形成した結果によるものと考えられる（結果は示さない）。
【００６９】
７．エンプリン細胞外ドメインへのＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９タンパク質の結合を阻害する薬剤のスクリーニング
１）リコンビナントＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９の調製とビオチン化：
ヒトＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で産生させ、グルタチオン共有結合担体によるアフィニティークロマトグラフィーで精製した。その後、ＧＳＴを切断・除去した。精製したＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９タンパク質のビオチン化については次の方法をとる。各精製タンパク質濃度に対して３倍モル量の Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu (Dojindo社) を混合した。室温で 2 時間反応させた後に Nap-5 (GE Healthcare社) により未反応のビオチン化試薬を除いた。
【００７０】
２）エンプリン細胞外ドメインへのＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９タンパク質の結合を阻害する薬剤のスクリーニング：
リコンビナントエンプリン細胞外ドメイン（図１中のsignal peptideの後から、transmembrane domainの前に相当）を96 well プレート (Pierce社) のウェル上に結合させる。ウェルを洗浄後、非特異的吸着を抑えるため、各ウェルは5%BSAその他のブロッキング剤で処理する。次に試験する薬剤（対象としては、溶媒のみ）をウェル内に添加して室温で 1 時間インキュベートする。ウェルを洗浄後、リコンビナントS100A9w（エンプリンの全長配列）を加え室温で1時間インキュベートする。さらにHRP標識した抗 S100A9抗体を同ウェル内に添加して反応させる。再度洗浄し、発色基質 (オルソフェニレンジアミン) を添加して ELISAリーダーで吸光度 (O.D.492 nm)を測定する。この操作により、まずはエンプリンとＳ１００Ａ９（又はＳ１００Ａ８／Ａ９）との結合における検量線を作製する。次にこの結合を阻害する分子のスクリーニングを行う。上記のアッセイ系に薬剤を添加し、吸光度の低下するものを候補薬剤とする。
【００７１】
種々の植物抽出物を上記スクリーニング方法にかけたところ、ヨモギエキス、トウキエキス、オドリコソウエキスがコントロールよりも有意にエンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害することが明らかとなった（図１１）。中でも、ヨモギエキスは強い阻害効果を示した（図１２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤をスクリーニングする方法であって、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質の存在下、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９とをインキュベートし、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選定することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エンプリンが固体支持体に固相化されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合の阻害がＥＬＩＳＡ法により決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を含んで成る、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
【請求項６】
前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項５に記載の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
【請求項７】
エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を被験者に投与することを含んで成る、慢性炎症又は癌転移の抑制方法。
【請求項８】
前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１】
慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質がエンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質は慢性炎症又は癌転移を有意に抑制させると評価する、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤をスクリーニングする方法であって、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤の候補物質の存在下、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９とをインキュベートし、エンプリンとＳ１００Ａ９又はＳ１００Ａ８／Ａ９との結合を阻害する物質を慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤として選定することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エンプリンが固体支持体に固相化されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合の阻害がＥＬＩＳＡ法により決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を含んで成る、慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
【請求項６】
前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項５に記載の慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤。
【請求項７】
エンプリンとＳ１００Ａ９との結合を阻害する薬剤を被験者に投与することを含んで成る、慢性炎症又は癌転移の抑制方法。
【請求項８】
前記薬剤が、ヨモギ、トウキ及びオドリコソウから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図６】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図６】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−４７９３２（Ｐ２０１１−４７９３２Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７４０３８（Ｐ２０１０−１７４０３８）
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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