説明

オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥真菌宿主細胞

【課題】オキサロ酢酸産生の欠損した、それ故シュウ酸産生の欠損した細胞、例えば糸状菌細胞、特にA.ニガーの細胞の突然変異体の提供。
【解決手段】オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸。当該核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主、並びに当該ポリペプチドを生産するための組換方法。具体的には、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって:(a)アミノ酸1〜341と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする核酸;及び(b)特定のポリヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する核酸;から成る群から選ばれる核酸。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する。本発明は更に突然変異宿主細胞、詳しくはオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の欠損した、それ故シュウ酸産生能力の欠損した真菌突然変異宿主細胞、例えばアスペルギルス属の細胞に関連する。本発明は更にかかる突然変異細胞の所望の化合物、例えばポリペプチド、主要及び副次代謝物の生産のための利用、並びに本発明の突然変異細胞内でかかる化合物を生産するための方法に関連する。本発明は更に上記核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主、並びにオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するための組換方法に関連する。
【背景技術】
【0002】
関連技術の説明
糸状菌は様々な注目の化合物、例えば注目の真菌により通常産生される相同化合物、例えば主要又は副次代謝物及びポリペプチド、又は異種化合物、例えば注目の真菌の中に導入された外来DNAによりコードされる異種ポリペプチドの商業的生産のために幅広く利用されている。かかる産物は注目の真菌の発酵及びその発酵物から得られる所望の産物の収獲により生産される。
【0003】
真菌の種、A.ニガーは所望の化合物、例えばクエン酸及び工業用酵素の商業的生産のために幅広く利用されている。この種は大量のシュウ酸を産生することでよく知られている。多くの理由のため、この種を注目の化合物の商業的生産のために用いるとき、シュウ酸の産生は所望されない。例えば、シュウ酸の産生は大量の炭素を要し、従って所望の化合物の生産のためにだけ必要とされるものと比べ、余分で高価な炭素源を発酵培地に添加しなければならない。発酵ブロス内でのシュウ酸の存在は注目の産物の回収が関与する下流処理において問題を引き起こし、なぜならシュウ酸は回収を妨害するカルシウムとの沈殿物を形成してしまうからである。また、シュウ酸は毒性の化合物であり、このことはその存在が、A.ニガーからの食品級製品の生産における著しい問題となることを意味する。
【0004】
A.ニガーにおけるシュウ酸の生合成のための経路について2通りの可能性のルートが提唱されている。第一のルートはオキサロ酢酸塩+水→シュウ酸+酢酸塩であり、その反応はオキサロ酢酸ヒドロラーゼにより触媒される(Kubicek,C.P.,G. SchreferL−Kunar,W.Wohrer and M.Rohr(1988)Appl.Environ.Microbiol.54,633−637)。第二のルートはグリコキシル酸経路が関与する(Balmforth,A.J.,A.Thomson(1984):Biochem.J.218 113−118)。
【0005】
商業的A.ニガー発酵の際のシュウ酸の生成の制御は、発酵を低pHで実施することにより試みられており、その場合ほんのわずかなシュウ酸しか生成されない。しかしながら、低pHでの発酵は望ましくないことがあり、なぜなら通常このpHはA.ニガーの増殖及び所望の発酵産物の収量にとって最適でないからである。
【0006】
A.ニガー由来の部分精製されたオキサロ酢酸ヒドロラーゼが発表されているが(Lenzら、PartiaL purification and some properties of oxaloacetate from Aspergillus niger,1976,Enr.J.Biochem.65:225−236)、この酵素をコードする遺伝子は発表されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、オキサロ酢酸産生の欠損した、それ故シュウ酸産生の欠損した細胞、例えば糸状菌細胞、特にA.ニガーの細胞の突然変異体の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列であって:
(a)SEQ ID NO:2のオキサロ酢酸ヒドロラーゼのアミノ酸配列と少なくとも65%の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする核酸配列;
(b)SEQ ID NO:1のDNA配列のコード部分(ヌクレオチド1157〜1411、1504〜1651及び1764〜2383から構成)と少なくとも65%の相同性を有する核酸配列;
(c)中ストリンジェンシー条件下で(i)SEQ ID NO:1の核酸配列、(ii)SEQ ID NO:1のcDNA配列、(iii)少なくとも100ヌクレオチドの(i)もしくは(ii)のサブ配列、又は(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)の相補鎖とハイブリダイズする核酸配列;
(d)(a)、(b)又は(c)のアレル変異体;及び
(e)(a)、(b)、(c)又は(d)のサブ配列、ここで当該サブ配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするものである;
から成る群から選ばれる核酸配列に関連する。
【0009】
更なる重要な観点において、本発明は突然変異細胞を生産するための方法であって、本発明の核酸配列又はそのコントロール配列を中断又は欠失させ、もとの細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼを産生する突然変異体を生み出すことを含んで成る方法に関連する。本発明の方法はこの方法により生産された突然変異体にも関連する。
【0010】
本発明は更に上記核酸配列を含んで成る核酸構築体、ベクター及び宿主細胞、並びに上記ポリペプチドを生産するための組換方法に関連する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】実施例4に記載のプラスミドpHP3の構築を示す。
【図2】実施例4に記載のプラスミドpHP3の構築を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列
「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性」とは、本明細書では
オキサロ酢酸塩+水→シュウ酸+酢酸塩
の反応を触媒する活性と定義する。この酵素はEC3.7.1.1に属するものとして分類される。本発明の目的のため、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性は以降の材料と方法の章に記載の手順に従って決定される。1単位のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性は30℃、pH7.5において1分当り1.0μモルのシュウ酸の産生と定義する。
【0013】
本明細書において用いる「単離された核酸配列」とは、他の核酸配列を本質的に含まない核酸配列、例えばアガロース電気泳動による決定に従い、少なくとも約20%の純度、好ましくは少なくとも約40%の純度、より好ましくは少なくとも約60%の純度、更により好ましくは少なくとも約80%の純度、そして最も好ましくは少なくとも約90%の純度のものを意味する。例えば、単離された核酸配列は、その核酸配列をその天然の位置からそれが再生されるであろう別の部位へと移動させる遺伝子操作において利用される標準のクローニング手順により獲得できうる。クローニング手順は当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、このフラグメントのベクター分子への挿入、そしてこの組換ベクターの宿主細胞への組込みを包含し得、その宿主細胞で当該核酸配列の複数のコピー又はクローンが複製されるようになる。この核酸配列はゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成起源、又は任意のそれらの組合せのものであってよい。
【0014】
第一の態様において、本発明はSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜341(即ち、成熟ポリペプチド)と少なくとも約65%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%、そして更に最も好ましくは少なくとも約97%の同一性を有するアミノ酸配列をもち、且つオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する(以降、「相同性ポリペプチド」)。好適な態様において、この相同性ポリペプチドはSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜341とは5個のアミノ酸、好ましくは4個のアミノ酸、より好ましくは3個のアミノ酸、更により好ましくは2個のアミノ酸、そして最も好ましくは1個のアミノ酸で相違する。本発明の目的のため、2本のアミノ酸配列間での同一性の度合いはLASERGENETMMEGALIGNTMソフトウェア(DNSTAR,Inc.,Madison,Wl)を用いるClustaL法(Higgins,1989,CABIOS 5:151−153)で、アイデンティティーテーブル及び下記のマルチプルアラインメントパラメーターを利用して決定する:10のギャップペナルティー及び10のギャップ長ペナルティー。対合アラインメントパラメーターはKtuple=1、ギャップペナルティー=3、ウィンドウ=5及びダイアゴナル=5。
【0015】
好ましくは、本発明の核酸配列はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列又はそのアレル変異体を含んで成る又はそれから成るポリペプチド、あるいはオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するそのフラグメントをコードする。
【0016】
本発明はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列であって、SEQ ID NO:1とは遺伝子コードの縮重の観点で相違するものも包含する。本発明は更にオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するSEQ ID NO:2のフラグメントをコードする、又は微生物細胞内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の不活化に利用するのに十分な長さのSEQ ID NO:1のサブ配列にも関連する(「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制」の章に記載)。
【0017】
SEQ ID NO:1のサブ配列はSEQ ID NO:1に包含される核酸配列であるが、但し5’及び/又は3’末端から1又は複数個のヌクレオチドが欠失しているものである。好ましくは、サブ配列は少なくとも2800個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも3000個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも3200個のヌクレオチドを含む。SEQ ID NO:2のフラグメントはこのアミノ酸配列のアミノ及び/又はカルボキシ粒物から1又は複数個のアミノ酸が欠失したポリペプチドである。好ましくは、フラグメントは少なくとも270個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも300個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも320個のアミノ酸残基を含む。
【0018】
アレル変異体とは、同一の染色体座を占めている遺伝子の2以上の択一的な形態のいずれかを意味する。アレル変異体は突然変異を通じて自然に発生し、そして集団内での多形態をもたらしうる。遺伝子の突然変異はサイレント(コードポリペプチドに変化なし)であるか、又は改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。ポリペプチドのアレル変異体は遺伝子のアレル変異体によりコードされるポリペプチドをいう。
【0019】
相同性ポリペプチドのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からは、1もしくは複数個のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失、及び/又は1もしくは複数個のアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置換により、相違しうる。好ましくは、アミノ酸変化はささいなもの、即ち、タンパク質のフォルディング及び/又は活性に有意な影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換;小さな欠失(典型的には1〜約30個のアミノ酸);小さなアミノ又はカルボキシル末端の伸長(例えば、アミノ末端メチオニン残基);約20〜25残基までの小リンカーペプチド;又は正味の電荷もしくはその他の機能を変えることにより精製を助長する小さな伸長(例えばポリヒスチジントラクト、抗原エピトーブ又は結合ドメイン)である。
【0020】
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、リジン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(例えばグルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えばロイシン、イソロイシン及びバリン)、芳香族アミノ酸(例えばフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、並びに小アミノ酸(例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン)の群内のものである。比活性を概して改変しないアミノ酸置換は当業界において公知であり、そしてH.Neurath and R.L.Hill,1979,The Proteins,Academic Press,New Yorkに記載されている。最もよくある交換はAla/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu及びAsp/Gly、並びにそれらの逆である。
【0021】
第二の態様において、本発明はSEQ ID NO:1の成熟ポリペプチドコード配列(SEQ ID NO:1のヌクレオチド1157−1411,1504−1651及び1764−2383から構成)と少なくとも約65%、好ましくは約70%、好ましくは約80%、より好ましくは約90%、更により好ましくは約95%、そして最も好ましくは約97%の相同性の度合いを有し、活性ポリペプチドをコードする、又は微生物細胞内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の不活化に利用するのに十分な長さを有する単離された核酸配列(「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制」の章に記載);又はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする又は微生物内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼの不活化に利用するのに十分な長さのSEQ ID NO:1のアレル変異体及びサブ配列(「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去及び抑制」の章に記載)に関連する。本発明の目的のため、2本の核酸間の相同性の度合いはFastaプログラムパッケージ(Version V20u6)中のコンピュータープログラムAlignにより、ヌクレオチド配列対比のための下記の設定によりGAPを用いて決定する:−16のGAPにおけるGAP構築ペナルティー(第一残基について)及びー4のGAP伸長(他の残基について)ペナルティー。AlignはE.Myers and W.Miller由来のプログラムの若干改良されたバージョンである。アルゴリズムはE.Myers and W.Miller「OptimaL Alignments in Linear Space」(CABIOS(1988)4:11−17)に記載されている。
【0022】
第三の態様において、本発明は(i)SEQ ID NO:1の核酸配列、(ii)SEQ ID NO:1のcDNA配列、(iii)(i)もしくは(ii)のサブ配列、又は(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)の相補鎖のサブ配列と中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中高ストリンジェンシー条件下、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸プローブと同一条件下でオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関連する(J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory ManuaL,第2版、Cold Spring Harbor,New York)。SEQ ID NO:1のサブ配列は少なくとも100ヌクレオチド、又はより好ましくは少なくとも200ヌクレオチドであってよい。更に、このサブ配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードしうる。
【0023】
SEQ ID NO:1の核酸配列又はそのサブ配列、並びにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界周知の方法に従って別の属又は種の株からオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定及びクローニングするための核酸プローブのデザインに利用されうる。詳しくは、かかるプローブは対応の遺伝子の同定及び単離のため、標準のサザンプロット手順に従い、注目の属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために利用されうる。かかるプローブは配列全体よりは相当に短くてよいが、長さは少なくとも15、好ましくは少なくとも25、そしてより好ましくは少なくとも35ヌクレオチドであるべきである。より長めのプローブを利用してもよい。DNA及びRNAプローブの双方が使用できる。これらのプローブは典型的には対応の遺伝子の検出のためにラベル化しておく(例えば、32P,3H,35S、ビオチン又はアビジンで)。かかるプローブは本発明により包含される。
【0024】
従って、かかるその他の生物から調製したゲノムDNA又はcDNAライブラリーは、上記のプローブとハイブリダイズし、且つオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーニングされうる。かかるその他の生物に由来するゲノム又はその他のDNAはアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はその他の分離技術により分離されうる。ライブラリー由来のDNA又は分離したDNAはニトロセルロース又はその他の担体材料に転写して固定することができる。SEQ ID NO:1又はそのサブ配列と相同性であるクローン又はDNAを同定するため、この担体材料をサザンブロットに使用する。本発明の目的のため、ハイブリダイゼーションとは当該核酸配列がSEQ ID NO:1に示す核酸配列、その相補鎖又はそのサブ配列に対応する核酸プローブと、超低乃至超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子はX線フィルムを用いて検出する。
【0025】
好適な態様において、この核酸プローブはSEQ ID NO:2のポリペプチドをコードする核酸配列又はそのサブ配列である。別の好適な態様において、この核酸プローブはSEQ ID NO:1である。別の好適な態様において、この核酸プローブはSEQ ID NO:2のアミノ酸残基123−205から成るフラグメント又はこのフラグメントの一部をコードするヌクレオチドである。別の好適な態様において、この核酸プローブは大腸菌株DSM−12660の中に収容されたプラスミドpHP1の中に含まれている核酸配列であり、ここでこの核酸配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、特にSEQ ID NO:1の成熟ポリペプチドコード領域である。
【0026】
長さが少なくとも100ヌクレオチドの長いプローブの場合、超低乃至超高ストリンジェンシー条件は42℃にて、5×SSPE、0.3%のSDS、200μg/mlの剪断変性サケ精子DNA、並びに超低及び低ストリンジェンシーでは25%のホルムアミド、中及び中高ストリンジェンシーでは35%のホルムアミド、又は高及び超高ストリンジェンシーでは50%のホルムアミドの中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、それに続くサザンブロット手順と定義する。
【0027】
長さ少なくとも100ヌクレオチドの長いプローブの場合、担体材料を最後に3回、15分づつ、2×SSC、0.2%のSDSを用いて、好ましくは少なくとも45℃(超低ストリンジェンシー)、より好ましくは少なくとも50℃(低ストリンジェンシー)、より好ましくは少なくとも55℃(中ストリンジェンシー)、より好ましくは少なくとも60℃(中高ストリンジェンシー)、更により好ましくは少なくとも65℃(高ストリンジェンシー)、そして最も好ましくは少なくとも70℃(超高ストリンジェンシー)にて洗浄する。
【0028】
長さが約15ヌクレオチド乃至約70ヌクレオチドである短いプロブの場合、ストリンジェンシー条件は、標準のサザンブロット手順に従い、ml当り0.9MのNaCl、0.09MのTris−HCl pH7.6、6mMのEDTA、0.5%のNP−40、1XのDenhardt溶液、1mMのピロリン酸ナトリウム、1mMの一リン酸ナトリウム、0.1mMのATP及び0.2mgの酵母エキスRNA中でのBolton and McCarthy(1962,Proceedings of the NationaL Academy of Sciences USA 48:1390)に従う計算を利用してもとめたTmより5℃〜10℃低い温度でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄後ハイブリダイゼーションと定義する。
【0029】
長さが約15ヌクレオチド乃至約70ヌクレオチドの短めのプローブの場合、担体材料を6XのSSC+0.1%のSDSの中で15分間1回、そして6XのSSCを用いて15分づつ2回、もとめたTmより5℃〜10℃低い温度で洗浄する。
【0030】
本発明は更に、(a)DNAを中、中高、高又は超高ストリンジェシー条件下でSEQ ID NO:1の配列、もしくはその相補鎖、又はそれらのサブ配列とハイブリダイズさせ;そして(b)核酸配列を単離することにより;生産された単離された核酸配列に関連する。このサブ配列は好ましくは少なくとも100ヌクレオチドの配列、例えばオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列、又は微生物細胞内でのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の不活化に利用するために十分に長い配列である(「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制」の章に記載)。
【0031】
本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドはSEQ ID NO:2の成熟ポリペプチドの少なくとも20%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも90%、そして最も好ましくは少なくとも100%のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有する。
【0032】
本発明の核酸配列は任意の属の微生物から獲得できうる。本発明の目的のため、一定の起源との関係で本明細書で用いる「から獲得した」とは、当該核酸配列によりコードされるポリペプチドがその起源により産生されたか、又はその起源に由来する核酸配列が挿入された細胞により産生されたことを意味しうる。
【0033】
当該核酸配列は微生物起源から獲得できうる。例えば、これらのポリペプチドはグラム陽性菌、例えばバチルス(Bacillus)株、例えばBacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus coagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis又はBacillus thuringiensis;又はストレプトマイセス(Streptomyces)株、例えばStreptomyces lividans又はStreptomyces murinus;又はグラム陰性菌、例えば大腸菌又はシュードモナス(Pseudomonas)種から獲得できうる。
【0034】
好適な態様において、この核酸配列は真菌細胞から獲得できる。本明細書でいう「真菌」はAscomycota、Busidiomycota、Chytridiomycota及びZygomycotaの間(Hawksworthら、Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版 1995,CAB International,University Press,Cambridge,UKに規定)並びにOomycota(Hawksworthら、1995、前掲、pp.171)並びに全ての分裂胞子(mitosporic)真菌(Hawksworthら、1995、前掲)を含む。
【0035】
より好適な態様において、真菌細胞は酵母細胞である。本明細書でいう酵母とは、子嚢胞子酵母(Endomycetales)、担子胞子酵母、及び不完全菌類に属する酵母(Blastomycetes)を含む。酵母の分類は将来にわたって変わりうるため、本発明の目的のため、酵母はBiology and Activities of Yeast (Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,and Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)に記載の定義に従う。
【0036】
より詳しくは、この核酸配列は酵母株、例えば、Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、又はYarrowia株;又はより好ましくは糸状菌株、例えばAcremonium、Aspergillus、Aureobasidium、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium又はTrichoderma株から獲得できうる。
【0037】
好適な態様において、この核酸配列はSaccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis又はSaccharomyces oviformis株から獲得される。
【0038】
別の好適な態様において、この核酸配列はAspergillus aculeatus、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus japonicus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium graminum、Fusarium heterosporum、Fusarium negundi、Fusarium oxysporum、Fusarium reticulatum、Fusarium roseum、Fusarium sambucinum、Fusarium sarcochroum、Fusarium sporotrichioides、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、Neurospora crassa、Penicillium purpurogenum、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei又はTrichoderma viride株から獲得される。
【0039】
より好適な態様において、この核酸配列はアスペルギルス・ニガー、そして最も好ましくはA.ニガー株BO1 DSM 12665から獲得され、例えばSEQ ID NO:1に示す核酸配列である。別のより好適な態様において、この核酸配列は大腸菌株DSM−12660の中に収容されたプラスミドpHP1に含まれる配列である。別の好適な態様において、この核酸配列は、SEQ ID NO:2の成熟ポリペプチドをコードする、SEQ ID NO:1のヌクレオチド1157−1411、1504−1651及び1764−2383から構成されるヌクレオチド配列である。
【0040】
上記の種に関し、本発明は完全及び不完全な状態の双方、並びにその他の異名均等物、例えばその種名が知られていようと関係なくアナモルフを包含するものと解されるべきであろう。当業者は適当な均等物の種類を容易に認定できるであろう。例えば、このポリペプチドは、種名が知られていようと関係なく、Benn and Klich(Benn J.W and M.A.Klich(1992)Aspergillus,Biology and Industrial Applications.Butterworth−Heinemann,USA)による定義に従いアスペルギルス・ニガーの異名均等物、例えばA.aculeatus、A.awamori、A.carboniarus、A.ellipticus、A.ficuum、A.foetidus、A.heteromorphus、A.japonicus、A.phoenicis、A.pulverulentus、A.tubingensis、A.helicothrix、A.atroviolaceus、A.citricus、A.acidicus又はA.fonsecaeusである微生物から獲得できうる。
【0041】
これらの種の株は数多くの培養物寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center (NRRL)で公共的に容易に入手できる。
【0042】
更に、かかる核酸配列はその他の起源、例えば上記のプローブを用いて自然(例えば、土壌、堆肥、水、等)から単離した微生物から同定及び獲得できうる。自然環境から微生物を単離する技術は当業界周知である。
【0043】
当該核酸配列はその他の微生物のゲノム又はcDNAライブラリーの同様のスクリーニングによりかくして誘導できうる。ポリペプチドをコードする核酸配列がプローブで検出できたなら、その配列を当業者が公知の技術を利用して単離又はクローニングすることができうる(例えば、Sambrookら、1989、前掲)。
【0044】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローニングするのに用いる技術は当業界において公知であり、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製又はそれらの組合せが挙げられる。かかるゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は共有の構造特性を有するクローニングされたDNAフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングによって行うことができる。例えば、Innisら、1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York参照のこと。PCRの場合、SEQ ID NO:2のアミノ酸123−205をコードするヌクレオチド配列に広がる一連のプライヤーを利用することが特に関係しうる。その他の核酸増幅手順、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR)、ライゲーション活性化転写(LAT)及び核酸配列系増幅(NASBA)が利用されうる。核酸配列はアスペルギルスの株、又はその他のもしくは近縁の生物からクローンでき、そして例えば当該核酸配列のポリペプチドコード領域のアレル又は種変異体であってよい。
【0045】
本発明の核酸配列の修飾は当該ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要でありうる。当該ポリペプチドに「実質的に類似する」とは、ポリペプチドの非天然形態を意味する。このようなポリペプチドは天然起源から単離したポリペプチドとは若干操作された態様で相違することがあり、例えば変異体は比活性、熱安定性、至適pH、等で相違する。この変異配列はSEQ ID NO:1のポリペプチドコード部分、例えばそのサブ配列として示す核酸配列に基づいて構築されたものでよく、及び/又は当該核酸配列によりコードされるポリペプチドとは異なるアミノ酸配列は供しないが、当該酵素を生産させるつもりの宿主生物のコドン用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を供しうるヌクレオチド置換の導入により構築されうる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えばFordら、1991,Protein Expression and Purification 2:95−107を参照のこと。
【0046】
かかる置換は、分子の機能にとって重要な領域外にあり、且つ活性ポリペプチドを未だもたらすように施してよいことが当業者に明らかであろう。本発明の単離された核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、それ故置換を施すことが好ましくないアミノ酸残基は、当業界公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発に従って同定されうる(例えば、Cunningham and Wells,1989,Science 244;1081−1085参照のこと)。後者の技術では、突然変異を分子内の全ての正に帯電した残基に導入し、そして得られる突然変異分子をオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性について試験し、この分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。基質酵素相互作用の部位は核磁気共鳴解析、結晶学又は光親和性ラベリングの如き技術による決定に従い、三次元構造の解析によって決定することもできる(例えば、de Vosら、1992,Science 255:306−312;Smithら、1992,Journal of Molecular Biology 224:899−904;Wlodaverら、1992,FEBS Letters 309:59−64を参照のこと)。
【0047】
突然変異核酸配列を生産するための方法 本発明は更に突然変異核酸配列を生産するための方法であって、SEQ ID NO:1の成熟ポリペプチドコード配列又はそのサブ配列の中に少なくとも一の突然変異を導入することを含んで成り、ここでこの突然変異核酸配列はSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜341から成るポリペプチド又はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するそのフラグメントをコードする。
【0048】
一のヌクレオチドを別のヌクレオチドで変換するための当該核酸配列への突然変異の導入は当業界公知の任意の方法を利用する部位特異的突然変異誘発により達成される。特に有用なのは、注目のインサートと所望の突然変異を含む2本の合成プライマーによるスーパーコイル二本鎖DNAベクターを利用する手順である。各々ベクターの対立鎖に相補性であるオリゴヌクレオチドプライマーはPfuDNAポリメラーゼにより温度サイクリングの間に伸長する。プライマーの合体により、ゆらぎニックを含む突然変異プラスミドができ上がる。温度サイクリングを経て、この産物をメチル化及びヘミメチル化DNAに特異的なDpnIで処理して親DNA鋳型を消化し、突然変異含有合成DNAを選別する。その他の当業界公知の技術も利用してよい。
【0049】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の除去又は抑制 本発明は親細胞から突然変異した細胞を生産するための方法にも関連し、この方法は本発明の核酸配列又はそのコントロール配列を中断又は欠失させ、同一条件で培養したときに親細胞よりも少ない量の当該核酸によりコードされるオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを産生する、それ故少ない量のシュウ酸を産生する突然変異細胞を得ることを含んで成る。
【0050】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性及びシュウ酸産生能の低まった株の構築は、細胞内のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現に必要な核酸配列の修飾又は不活化により簡単に達成されうる。修飾又は不活化すべき核酸配列は、例えば当該ポリペプチド又はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を発揮するのに必須なその一部をコードする核酸配列、例えば「オキサロ酢酸活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に記載の本発明の核酸配列であってよく、又は当該核酸配列はそのコード配列からのポリペプチドの発現のために必要な調節機能を有するものであってよい。かかる調節又はコントロール配列の例は、プロモーター配列又はその機能性部分、即ち、ポリペプチドの発現を及ぼすのに十分な部分であってよい。考えられる修飾のためのその他のコントロール配列をこの章の中で更に説明する。
【0051】
当該核酸配列の修飾又は不活化は、細胞を突然変異誘発にかけ、そしてオキサロ酢酸ヒドロラーゼ産生能力の低下した細胞を選別又はスクリーニングすることにより実施できうる。特異的又はランダムでもよいこの突然変異誘発は、例えば適当な物理又は化学突然誘発因子の利用により、適当なオリゴヌクレオチドの利用により、又はこのDNA配列をPCR系突然変異誘発にかけることにより実施してよい。更に、この突然変異誘発はこれらの突然変異誘発因子の任意の組合せを利用することにより実施してよい。
【0052】
本目的のために適当な物理又は化学突然変異誘発因子の例には紫外線(UV)照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート(EMS)、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。
【0053】
かかる因子を使用する場合、その突然変異誘発は典型的には突然変異すべき細胞を選定の突然変異誘発因子の存在下で適当な条件下でインキュベーションし、そして低下したオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性又は生産能を発揮する細胞を選定することにより実施される。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性の低下又は消失は以降の実施例に記載のアッセイの利用により決定されうる。
【0054】
本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドの生産の修飾又は不活性化は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列又はその転写もしくは翻訳のために必要な調節要素内の1又は複数のヌクレオチドの導入、置換又は除去により達成されうる。例えば、ヌクレオチドは、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームの改変をもたらすように挿入又は除去してよい。かかる修飾又は不活化は当業界公知の方法に従って部位特異的突然変異誘発又はPCR系突然変異誘発により成し遂げることができうる。原理的には、この修飾はin vivoで、即ち、修飾すべき核酸配列を発現する細胞に対して直接実施してよいが、修飾は下記に例示の通りin vitroで行うのが好ましい。
【0055】
選定の宿主細胞による生産能の消失又は抑制を行う好都合な方法の例は遺伝子置換又は遺伝子中断の技術を基礎とする。例えば、遺伝子中断技術では、注目の内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントに対応する核酸をin vitroで突然変異させて欠陥核酸配列を作り、それを宿主細胞に形質転換させて欠陥遺伝子を産生させる。相同性組換によると、欠陥核酸配列を内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントと置き換えている。欠陥遺伝子又は遺伝子フラグメントは当該ポリペプチドをコードする遺伝子が修飾又は破壊されている形質転換体の選別のために利用されうるマーカーもコードするが所望されうる。
【0056】
他方、核酸配列の修飾又は不活化はポリペプチドコード配列に相補性のヌクレオチド配列を用いる確立されたアンチーセンス技術により実施してよい。より詳しくは、細胞によるポリペプチドの産生は、細胞の中で転写され得、且つ細胞により産生されるポリペプチドmRNAにハイブリダイズすることのできる当該ポリペプチドをコードする核酸配列に相補性なヌクレオチド配列を導入することにより抑制又は消失されうる。相補性アンチセンスヌクレオチド配列がポリペプチドmRNAにハイブリダイズすることを可能にする条件下で、翻訳されるポリペプチドの量はかくして抑制又は消失する。
【0057】
本発明の方法に従って修飾する細胞は微生物起源のもの、特にオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸配列についての起源として「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章で上記した種のいずれかである。好ましくは、この細胞は、それに対して相同又は異種のいずれかの所望の産物、例えばポリペプチド又は主要もしくは副次代謝物の産生に適する真菌株である。更により好ましくは、この細胞はアスペルギルス、特にA.ニガーの細胞である。
【0058】
本発明は更に当該ポリペプチドをコードする核酸配列又はそのコントロール配列の中断又は欠失を含んで成る親細胞の突然変異細胞に関連し、ここでこの中断又は欠失は親細胞よりも少ない量のポリペプチドを産生する突然変異細胞をもたらすものである。
【0059】
このようにして構築したこのポリペプチド欠陥突然変異細胞は相同及び/又は異種発現産物、例えば相同又は異種ポリペプチド又は主要もしくは副次代謝物の発現のための宿主細胞として特に有用である。従って、本発明は更に相同又は異種産物を産生するための方法であって、(a)当該突然変異細胞を当該産物の産生を誘導する条件下で培養し、そして(b)この産物を回収することを含んで成る方法に関する。
【0060】
注目の産物の培養及び精製のために利用する方法は当業者に周知方法、例えば下記の「生産方法」の章に記載の通りにして実施できうる。
【0061】
本質的にシュウ酸を含まない産物を生産するための本発明の方法は、主要代謝物、特に食品級クエン酸及びその他のクレブス回路酸、並びに相同又は異種ポリペプチド、特に真核生物ポリペプチドの生産において特に注目される。
【0062】
このポリペプチドは突然変異細胞にとって相同又は異種の任意のポリペプチドであってよい。「ポリペプチド」とは、ここでは特定の長さのコード産物を意味するものではなく、それ故ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。「異種」ペプチドとはここではこの突然変異細胞にとって天然ではないポリペプチド(又は天然配列を改変するように修飾の施されたタンパク質、又は組換DNA技術による突然変異細胞の操作の結果として発現が定量的に改変された天然タンパク質)をいう。この突然変異細胞は相同又は異種ポリペプチドをコードする核酸配列の1又は複数のコピーを含んでよい。好適な態様において、この異種ポリペプチドは細胞外分泌ポリペプチドである。
【0063】
好ましくは、生産すべきポリペプチドはホルモン、ホルモン変異体、レセプターもしくはその一部、抗体もしくはその一部、又はリポーターである。この酵素は例えばデンプン分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、酵化還元酵素又は植物細胞壁分解酵素から選択され得る。そのような酵素の例は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インペルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼを包含する。このオキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠損性細胞はまた、医薬的興味の異種タンパク質、たとえばホルモン、成長因子、受容体及び同様のものを発現するためにも使用され得る。
【0064】
本発明の突然変異細胞、特に糸状菌突然変異細胞において発現されうる異種ポリペプチドをコードする核酸配列は任意の原核、真核生物又はその他の起源から獲得できうる。本発明の目的のため、一定の起源との関係で本明細書で用いる「から獲得」とは、当該ポリペプチドがその起源から産生される又は当該起源に由来する遺伝子の挿入された細胞により産生されることを意味する。
【0065】
本発明の方法において、突然変異細胞、特に突然変異糸状菌細胞は、その細胞にとって天然(又は「相同」)であるポリペプチド又はその他の産物、例えば主要もしくは副次代謝物の組換生産のためにも利用できうる。
【0066】
異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローニングするのに用いる技術は当業界において公知であり、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製又はそれらの組合せが含まれる。かかるゲノムDNAからの核酸配列のクローニングは例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応を利用して行うことができる。例えば、Innisら、1990,PCR Protocols:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New Yorkを参照のこと。このクローニング手順は当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、このフラグメントをベクター分子への挿入、並びにこの組換ベクターの突然変異細胞への組込みを含んで成り、その細胞で当該核酸配列の複数のコピー又はクローンが複製されうる。この核酸配列はゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成起源、又はそれらの組合せであってよい。
【0067】
本発明の方法において、異種ポリペプチドは更に、別のポリペプチドが本発明のポリペプチド又はそのフラグメントのN末端又はC末端に融合した融合又はハイブリドポリペプチドを含む。融合ポリペプチドは一のポリペプチドをコードする核酸配列(又はその一部)を別のポリペプチドをコードする核酸配列(又はその一部)と融合させることにより作られる。融合ポリペプチドを生産するための技術は当業界において公知であり、そして例えばこれらのポリペプチドをコードするコード配列同志を、それらがイン・フレームとなり、且つ同一のプロモーター及びターミネーターのコントロール下でその融合ポリペプチドが発現されるようにライゲーションすることが挙げられる。ハイブリドポリペプチドは少なくとも2種のポリペプチドから獲得した部分又は完全ポリペプチド配列の組合せを含んで成り、ここでその1又は複数は突然変異細胞にとって異種のものであってよい。
【0068】
注目の異種ポリペプチドをコードする単離された核酸配列はポリペプチドの発現を供するように様々な態様で操作されうる。発現はポリペプチドの生産に関与するあらゆる工程、例えば限定することなく、転写、後転写修飾、翻訳、後翻訳修飾及び分泌等が含まれるものと理解されるであろう。ベクターに挿入する前の核酸配列の操作は発現ベクターに依存して所望又は必須となりうる。クローニング方法を利用して核酸配列を修飾するための技術は当業界において周知である。
【0069】
「核酸構築体」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は本来は天然に存在しない態様で組合され、そして並置される、核酸のセグメントを含むよう修飾されている、一本鎖又は二本鎖での核酸分子として本明細書においては定義される。用語、核酸構築体とは、その核酸構築体が本発明のコード配列の発現のために必要とされるすべてのコントロール配列を含む場合、用語、発現カセットと類似する。用語“コード配列”は、本明細書において定義される場合、コントロールmRNA中に転写され、そして本発明のポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は一般的に、mRNAの5′−末端でのオープンリーディングフレームのすぐ上流にある翻訳開始コドンATG及び3′−末端でのオープンリーディングフレームのすぐ下流にある翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、ゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成、組換又はその組合せを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本明細書に記載の核酸構築体のコード配列はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列であってよく(「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に定義)、それにおいてはこの核酸構築体は上記の章又は当該核酸配列の関与するその他の操作で規定するオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの生産のために利用されうる。又は、このコード配列は本発明の突然変異細胞内で産生される異種ポリペプチドをコードするものであってよい。
【0070】
用語、“コントロール配列”とは、異種ポリペプチドの発現のために必要であるか又は好都合であるすべての成分を包含するよう本明細書において定義される。個々のコントロール配列は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来のものであり、又は外来性であり得る。そのようなコントロール配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少では、コントロール配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。コントロール配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのコントロール配列の連結を促進する特異的制限部位を導入するためのリンカーを供給され得る。用語、“作用可能的式に連結される”とは、コントロール配列が、異種ポリペプチドの生成を指令するよう DNA配列のコード配列に対して一定の位置に適切に置かれている配置(configuration)として本明細書で定義される。
【0071】
コントロール配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために細胞、特に糸状菌細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、異種ポリペプチドの発現を仲介する転写コントロール配列を含む。プロモーターは、突然変異細胞等の細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、突然変異、切断された及びハイブリッドのプロモーターを包含し、そして細胞に対して相同であるか又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【0072】
糸状菌宿主おいて本発明の核酸構築体の転写を指令するための適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザ TAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)のアスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸性安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコル・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザのアルカリ プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザのトリオース ホスフェート イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアセトアミダーゼ、アスペルギルス・オリザのアセトアミダーゼ(amdS)、フサリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ(米国特許第 4,288,627号に記載される)をコードする遺伝子から得られたプロモーター、及びその変異体、切断された及びハイブリッドプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2−tpi(アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザのトリオースホスフェート イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)、及びグルコアミラーゼプロモーターである。
【0073】
コントロール配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終止するために宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作用可能式に連結される。宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る。
【0074】
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザの TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニレート シンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムのトリプシン株プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0075】
コントロール配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域であり得る。リーダー配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作用可能式に連結される。細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。
【0076】
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザの TAKA アミラーゼ及びアスペルギルス・ニジュランスのトリオース ホスフェート イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0077】
コントロール配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の3’末端に作用可能式に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列であり得る。細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が、発明において使用され得る。
【0078】
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザの TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニレート シンターゼ、及びアスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0079】
コントロール配列はまた、細胞分泌路中にコードされたポリペプチドを誘導することができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードする、シグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントにより翻訳読取り枠においtを整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を本来含むことができる。他方では、コード配列の5’末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列が通常、シグナルペプチドコード領域を含まない場合に必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、リゾムコール種からのリパーゼ又はプロティナーゼ遺伝子から得られる。しかしながら、細胞の分泌路中に発現されたポリペプチドを誘導するいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
【0080】
糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス・オリザの TAKA アミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロティナーゼ遺伝子及びヒュミコラ・ラヌギノサのセルラーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【0081】
コントロール配列は、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするぺプチドコード領域でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド(多くの場合、チモーゲン)として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、リゾムコール・ミエヘイプロテナーゼ及びマイセリオフソラ・サーモフィラのラッカーゼコード遺伝子(WO 95/33836)から得られる。
【0082】
シグナルペプチド及びプロペプチドの双方がポリペプチドのアミノ末端にある場合、このプロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【0083】
本発明の核酸構築体はまた、ポリペプチドの発現を指令するために好都合である1又は複数の因子、たとえば転写活性化因子(たとえばトランス−作用因子)、カペロン(chaperone)及びプロセッシング プロテアーゼをコードする1又は複数の核酸配列を含んで成る。選択の宿主細胞において機能するいずれかの因子が本発明において使用され得る。1又は複数のそれらの因子をコードする核酸は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列と必ずしもタンデムで存在しない。
【0084】
宿主細胞の増殖に関して異種ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的剌激に応答して遺伝子の発現のターンオン又はターンオフを可能にするものである。糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ プロモーター、及びアスペルギルス・オリザのグルコアミラーゼ プロモーターが、調節配列として使用される得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列により作用可能式に連結される。
【0085】
上記の種々の核酸及びコントロール配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするための1又は複数の便利な制限部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、前記核酸配列、又は前記配列を含んで成る核酸構築体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、前記コード配列は、そのコード配列が発現及びたぶん分泌のために適切なコントロール配列と作用可能式に連結されるよう、ベクターに位置する。
【0086】
組換え発現ベクターは、組換え DNA方法に簡単にゆだねられ得、そして核酸配列の発現をもらたすことができるいずれかのベクター(たとえばプラスミド又はウィルス)であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入されるべき細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは線状化された又は環状化された環状プラスミドであり得る。ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわち染色体外実在物として存在するベクター(この複製は染色体複製に無関係である)、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体であり得る。ベクターは自己複製を確保するためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるものであり得る。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノム中に導入されるべき全体の DNA、又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドであり得る。
【0087】
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする1又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物性又は耐ウィルス性、重金属に対する耐性、原栄養体の独立栄養生物への変換、等を提供する遺伝子生成物である。糸状菌宿主細胞への使用のための選択マーカーは、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB(ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)及びtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、並びにその同等物を包含する群から選択され得るが、但しこれらだけには限定されない。アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・オリザのamdS及びpyrG遺伝子、及びストレプトマイセス・ヒグロスコピカスの bar遺伝子が、アスペルギルス細胞への使用のために好ましい。
【0088】
本発明のベクターは好ましくは、細胞ゲノム中へのベクターの安定した組込み、又は細胞のゲノムに無関係の細胞におけるベクターの自主的複製を可能にする要素を含む。
【0089】
導入とは、核酸配列を含んでなるベクターを細胞に、そのベクターが染色体組み込み物又は自己複製式染色体外ベクターとして維持されるように導入することを意味する。組み込むが一般に有利と考えられ、なぜなら核酸配列は細胞内でより安定でありがちだからである。染色体へのベクターの組み込みは相同組換え、非相同組換え又はトランス転移により起こる。
【0090】
発現ベクターの細胞への導入は、周知の態様に従うプロトプラストの形式、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生から成る工程を包括する。アスペルギルスの形質転換のための適当な手法は、ヨーロッパ特許238023号及びYeltonなど.,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8 1:1470−1474に記載されている。フサリウム種を形質転換する適切な方法は、 Malardierなど.,1989,Gene 78:147−156、又はWO96/00787に記載される。
【0091】
本発明のベクターは、細胞ゲノム中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。組込みのためには、ベクターは、異種ペプチドをコードする核酸配列、又は相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組込みのためのベクターのいずれか他の要素に依存することができる。他方では、ベクターは、細胞のゲノム中への相同組換えによる組込みを指令するための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体中の正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組込みを可能にする。正確な位置での組込みの傾向を高めるためには、組込み要素は好ましくは、十分な数の核酸、たとえば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最とも好ましくは800〜1,500個の塩基対を含むべきであり、ここでそれらの要素は相同組換えの確立を高めるためにその対応する標的配列とひじょうに相同性である。その組込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組込まれ得る。
【0092】
自主複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてベクターの自主的な複製を可能にする複製起点を含んで成る。
【0093】
本発明の方法は当該突然変異細胞を獲得するための特定の順序に限定されない。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの生産に関与する遺伝子の修飾は、異種ポリペプチドの生産のための細胞の構築における任意の段階において親細胞の中に導入することができうる。細胞は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の導入の前に本発明の方法を利用してオキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥に既にされていることが好ましい。
【0094】
組換発現ベクターを構築するために本明細書に記載の要素をライゲーションするために用いる手順は当業者に周知である(例えば、J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor,New York参照のこと)。
【0095】
本発明はまた、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥突然変異細胞、特に糸状菌突然変異細胞を獲得するための方法であって、(a)親細胞、特に親糸状菌細胞にオキサロ酢酸ヒドロラーゼの産生に関与する遺伝子の少なくとも一つの修飾を含んで成る第一核酸配列及び異種ポリペプチドをコードする第二核酸配列を導入し;そして(b)同一条件下で培養したときに親細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼを産生するこの修飾核酸配列を含んで成る工程(a)由来の突然変異体を同定することを含んで成る方法に関連する。
【0096】
本発明はまた、異種ポリペプチドを産生するための細胞、特に糸状菌細胞のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ突然変異体に関連し、ここでこの細胞はオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの産生に関与する遺伝子の少なくとも一の修飾を含んで成る第一核酸配列及び異種ポリペプチドをコードする第二核酸配列を含んで成り、ここで当該突然変異体は同一条件下で培養したときにその親細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを産生するものである。
【0097】
本発明の別の観点において、この突然変異細胞は更に所望の産物、例えば注目の異種ポリペプチドの産生、回収及び/又は用途にとって有害でありうるタンパク質をコードする1又は複数の核酸配列の修飾を含みうる。この修飾は1又は複数の第三の核酸配列の発現を抑制又は消失させ、同一条件下で培養したときにこの第三の核酸配列が修飾されていない突然変異細胞よりも多い量の異種ポリペプチドを産生しうる修飾第三核酸配列を有する突然変異細胞をもたらす。この第三の核酸配列は任意のタンパク質又は酵素をコードしうる。例えば、この酵素はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルアミヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼであってよい。この第三の核酸配列は好ましくはタンパク質分解酵素、例えばアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、又はプロテアーゼをコードする。
【0098】
更なる観点において、本発明は本発明の方法により産生されるオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を本質的に有さないタンパク質産物に関連する。
【0099】
本発明は更に、SEQ ID NO:1の核酸配列、そのサブ配列又はその相同体(「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に記載)を含む、当該配列の発現のための核酸構築体、組換発現ベクター及び宿主細胞に関連する。この構築体及びベクターは本明細書に記載の通りにして構築できうる。この宿主細胞は核酸配列の発現のために適当な任意の細胞、特に本発明の核酸配列の起源として「オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列」の章に記載の任意の細胞であってよい。特に、宿主細胞は糸状菌細胞、例えばアスペルギルスの細胞、例えばA.ニガー又はA.オリザ、又はフサリウムの細胞である。
【0100】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、そのプロトプラストによる形質転換、及びそれ自体既知である態様での細胞壁の再生を含有する方法により形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許238023号及びYeltonなど.,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8 1:1470−1474に記載されている。フサリウム種を形質転換する適切な方法は、Malardierなど.,1989,Gene 78:147−156、又はWO96/00787に記載される。酵母は、Becker and Guarente,Abelson,J.N.and Simon,M.I.,editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Vo1ume 194,pp182−187,Academic Press,Inc.,New York;Itoなど.,1983,Journal of Bacteriology 153:163;及びHinnenなど.,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920により記載される方法を用いて形質転換され得る。
【0101】
生成方法
本発明はまた、(a)本発明のヌクレオチド配列を保有する宿主細胞を当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを生産するための方法にも関する。
【0102】
本発明はまた、(a)宿主細胞を、当該ポリペプチドの生産を誘導する条件下で培養し、ここで当該宿主はSEQ ID No:1の成熟ポリペプチドコード領域内に少なくとも一の突然変異を有する突然変異核酸配列を含んでなり、ここで当該突然変異核酸配列はSEQ ID No:2のアミノ酸1〜341から成るポリペプチドをコードし;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生産するための方法にも関する。
【0103】
本発明の生産方法において、細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。たとえば、細胞は、適切な培地において、及びポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする条件下で行なわれる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵(連続、バッチ、供給−バッチ、又は固体状態発酵を包含する)により培養され得る。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行なわれる(たとえば、細菌及び酵母についての参考文献;Bennett,J.W.and LaSure,L.,editors,More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991を参照のこと)。適切な培地は、商業的供給者から入手でき、又は公開された組成(たとえば、American Type Culture Collectionのカタログにおける)に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。
【0104】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消出を包含する。たとえば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。
【0105】
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。たとえば、ポリペプチドは、従来の方法、たとえば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿(但し、それらだけには限定されない)により栄養培地から回収され得る。
【0106】
得られるポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、たとえばクロマトグラフィー(たとえば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動法(たとえば分離用等電点電気泳動)(IEF)、示差溶解性(たとえば硫酸アンモニウム沈殿)、SDS−PAGE、又は抽出(たとえば、Protein Purification,J.−C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989を参照のこと)(但し、それらだけには限定されない)により精製され得る。
【0107】
用途
本発明は更にオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを利用する方法に関連する。
【0108】
本発明のポリペプチドは診断用酵素として、例えば食品又はその他の製品におけるシュウ酸の検出のために利用されうる。
【0109】
本発明のヌクレオチド配列は細胞、例えばヒドロラーゼを通常産生する微生物細胞によるオキサロ酢酸ヒドロラーゼ、それ故シュウ酸の生産の改変のために利用されうる。特に、このヌクレオチド配列は注目の細胞のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ、それ故シュウ酸の生産能を抑制又は消失させるために利用されうる。
【0110】
本発明を以下の非限定的な実施例で更に詳しく説明する。
【実施例】
【0111】
実施例
緩衝剤及び基質として用いた化学品は少なくとも同薬級の商品とした。
【0112】
株:
アスペルギルス・ニガーBO1(DSM 12665)
大腸菌DH5αD.M.Woodcockら、(1989)Nucleic Acids Res.17,3469−3478
【0113】
培地及びアッセイ
バッファーA:50mMのトリス/HCl pH7.5,2mMのMnCl2,20mMのDTT,5%のスクロース
【0114】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性アッセイ:1000mlの0.1MのMOPS、pH7.5、2mMのMnCl2 25mlの40mMのオキサロ酢酸塩、5〜100mlのサンプル。吸収は255nmで測定した。活性は吸収の低下速度及びオキサロ酢酸塩の吸収係数からもとめた(1.1mM−1cm−1,Lenzら、Partial purification and some properties of oxalacetase from Aspergillus niger.1976,Eur.J.Biochem.65:255−236)。アッセイは30℃で実施した。
【0115】
タンパク質アッセイ:タンパク質濃度はBioRad(Hercules,CA,USA)Bio−Rad Protein Assay)cat.No.500−0006を用い、製造者の仕様書に従い、且つ標準品として牛血清アルブミンを用いて測定した。
【0116】
実施例1
オキサロ酢酸ヒドロラーゼの精製(EC 3.7.1.1)
アスペルギルス・ニガーBO1を振濁フラスコの中で、30℃にて、以下の培地の中で発酵させた:スクロース20g/L,NaNO3 15gL,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4・7H2O 1g/L,NaCl 1g/L,CaCl2・2H2O 0.1g/L,微量溶液0.5ml/L。微量溶液:ZnSO4・7H2O 14.3g/L,CuSO4・5H2O 2.5g/L,NiCl2・6H2O 0.5g/L,FeSO4・7H2O 13.8g/L,MnCl2 6g/L。pHは約0.5g/Lのバイオマス濃度が達成されるまで2.5とした。次いでpHを2MのNaOHの添加により6にシフトさせ、そして細胞をバイオマス濃度が約5g/Lに達するまで増殖させた。細胞を濾過により集め、0.9%(W/V)のNaClで洗い、そして液体窒素の中で凍結させた。凍結細胞を乳鉢の中で液体窒素を伴って破壊し、次いでバッファーAに懸濁した。その懸濁物を遠心分離し(15min、40,000g、4℃)、そしてその上清液を単離した。硫酸アンモニウムを45%飽和となるまで加え(277g/L)、そして形成された懸濁物を遠心分離し(15min、40,000g、4℃)、そしてその上清液は廃棄した。そのパレットをバッファーAに溶解し、そして0.45μmのフィルターで濾過した。
【0117】
硫酸アンモニウムをサンプルに50mS/cmの導電率となるまで加えた。次にそのサンプルをバッファーAに溶解した0.5mの硫酸アンモニウムで平衡にしたPhenyl Sepharose High Performance カラム(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala)に、その製造者の仕様書に従って載せた。このカラムを同バッファーで洗い、次いでバッファーAに溶解した0.5mの硫酸アンモニウムから純粋なバッファーAに至る線形塩勾配を用いて溶出させた。
【0118】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有する画分をプールした。この溶液を2mMのMnCl2、20mMのDTT、5%のスクロースで4mS/cmの導電率にまで希釈し、次いでバッファーAで平衡にしたQ Sepharose High Performanceカラム(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala)に載せた。このカラムをバッファーAで洗い、次いでバッファーAと溶解した0Mから0.5Mに至るNaClの線形塩勾配を用いて溶出させた。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有する画分をプールした。
【0119】
これらのサンプルを10mMのNaH2PO4 pH7.2、0.1mMのMnCl2、5%のスクロース、10mMのDTTで平衡にしておいたPD−10カラム(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala)に載せ、そして同バッファーで溶出させた。そのサンプルを10mMのNaH2PO4 pH7.2、0.1mMのMnCl2、5%のスクロース、10mMのDTTで平衡にしたEcono−Pac HTPカラムに載せた。そのカラムを10mMのNaH2PO4 pH6.8、0.1mMのMnCl2、5%のスクロース、10mMのDTTで洗い、次いで10mMのNaH2PO4 pH6.8、0.1mMのMnCl2、5%のスクロース、10mMのDTTから400mMのNaH2PO4 pH6.8、0.1mMのMnCl2、5%のスクロース、10mMのDTTに至る線形勾配で溶出させた。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するサンプルをSDS−PAGEのために用いた。
【0120】
実施例2
オキサロ酢酸ヒドロラーゼの画分のタンパク質配列の決定
実施例1の精製オキサロ酢酸ヒドロラーゼを標準の方法を利用して12.5%のゲル上でのSDS−PAGEゲル電気泳動にかけた(Laemmli,U.K.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature.227:680−685)。タンパク質をエレクトロブロッティングによりPVDF膜にブロットし、そしてその膜をクマジ−ブリリアントブルーR−250により、Ploughら(Plough M,Jensen AL and Barkholt V.1989:Anal Biochem,181:33−39)に記載の通りにして染色した。38〜40kDの見かけ上の分子量の範囲内の4本のタンパク質バンドを切り出し、そしてPerkin Elmer−Applied Biosystems,Norwalk,CT,USA由来のProcise−494タンパク質シーケンサーを用い、その製造者の仕様書に従ってアミノ末端配列決定した。以下の配列が得られた。
【0121】
【化1】

【0122】
実施例3
オキサロ酢酸ヒドロラーゼをコードする遺伝子のクローニング
実施例2で決定されたタンパク質配列をデーターベースサーチのために用い、そしてアスペルギルス・ニガーEST配列が回収できた(EMBL,T82752,AN752)。このESTは実施例2由来の4本の配列と100%の同一性をもってアライニングできるタンパク質配列をコードする。このEST配列を下記のPCRプライマーのデザインのために用いた。
【0123】
【化2】

【0124】
これらのプライマーをLeachら(J.Leach,D.B.Finkelstein and J.A.Rambosek(1986)Fungalgent.newsl.,33,32−33)に本質的に記載の通りにして、Perkin Elmer(Norwalk,CT,USA)由来のamplitaq taqポリメラーゼを用いてその製造者の仕様に従い調製したA.ニガーBO1からDNAを増幅するために用いた。PCR反応はMJ PCT 150キャピラリーPCRサイクラー(MJ Research,Watertown,MA,USA)の中で、10μlの容量において、94℃で10秒の変性温度、55℃で10秒のアニーリング温度及び72℃で30秒の伸長温度のサイクルを30回運転して、変性温度からアニーリング温度に至る温度勾配を−0.5℃/秒として、行った。
【0125】
得られる219bpのフラグメントをpCRIIベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)の中に、その製造者の仕様書に従ってライゲーションし、そして大腸菌DH5αにSambrook(J.Sambrookら(1989)Molecular cloning:a laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載の通りにして形質転換させた。予測のサイズのインサートを含むクローンを次のプライマーを用いて配列決定した。
【0126】
【化3】

【0127】
DNA配列分析はABI PRISM 377 DNAシーケンサーをABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin Elmer Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)と共に、その製造者の推奨に従って用いることで行った。その配列はフラグメントが所望の配列であることを確証した。
【0128】
制限地図はSambrookらのプロトコールに従い、プローブとして219bpのインサートを用いるサザンブロット分析により確立した。この制限地図から、この遺伝子は5kbのBgLIIフラグメント上にあると考えられた。
【0129】
次にこの遺伝子を逆PCRによりクローニングした。A.ニガーBO1由来のゲノムDNAをBgLIIで消化し、そして4kbから6kbに範囲するフラグメントをアガロースゲルから回収した。そのDNAをT4 DNAリガーゼを用いて16℃でライゲーションした。このライゲーション混合物を下記のプライマーを用いるPCR反応において鋳型として用いた。
【0130】
【化4】

【0131】
増幅のためにExpand High Fidelityポリメラーゼ(Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany)をその製造者の推奨に従って用いた。反応におけるMgCl2の濃度は1mMとした。その他の条件は上記の通りである。5kbのフラグメントができた。このフラグメントをBgLIIで消化し、そしてその消化したフラグメントをBamHI及びHincIIで消化したpUC19(C.Vanisch−Perronら(1985)Gene 33,103−119)にライゲーションした。そのライゲーション混合物を大腸菌DH5αに形質転換させた。1.3kb及び3.7kbのインサートサイズを有するコロニーが認められた。各クラスのコロニー一つをMBリバースプライマー及びM13フォワード(−20)プライマーを用いて配列決定した。このようにして、BgLII近位配列が決定され、そして下記のプライマーをこの5kbBgLIIフラグメントのPCR増幅のためにデザインした。
【0132】
【化5】

【0133】
これらのプライマーを逆PCRと同じPCR条件を利用してゲノムA.ニガーBO1DNAを増幅するのに用いた。作製された5kbフラグメントをpCRIIにライゲーションし、pHPIを作った。オキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子を鋳型としてのpHPIと、下記のプライマーを用いて配列決定した。
【0134】
【化6】

【0135】
【化7】

【0136】
そのDNA配列をSEQ ID NO:1に示す。この配列をコード配列について及びイントロンの存在についてコンピューターソフトウェアNetgene 2(S.M.Hebsgaard,P.G.Korning,N.Tolstrup,J.Engelbrecht,P.Rouze,S.Brunak,1996,Nuleic Acids Research 24:3439−3452)を用いて解析し、3つのエキソンの存在を示唆した(SEQ ID NO:1の備考を参照のこと)。これら3つのイントロンから推定した341残基タンパク質配列をSEQ ID NO:2に示す。
【0137】
疑問配列としてこのタンパク質配列(oah)を用いるデーターベースサーチは、アスペルギルス・ニジュランス(Swiss prot P28298)及びニューロスポラ・クラッサ(Swiss prot P28299)由来のイソクエン酸イソメラーゼ、並びにストレプトマイセスヒグロスコピカス(Swiss prot P11435)由来のカルボキシビニルカルボキシホスホネートホスホリルムターゼ及びバチルス・スプリチス(Swiss prot P54528)由来のヒポセティカルタンパク質との配列相同性を示した。
【0138】
【表1】

【0139】
プラスミドpHPIを保有する大腸菌株はDSM 12660として寄託した。
【0140】
実施例4
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ遺伝子の中断
pHPIをNruI及びBstEIIで消化し、そして6.6kbのフラグメントが単離された。アスペルギルス・ニガーpyrG遺伝子を保有するプラスミド、pJRoy10(図1)をNcoIで消化し、そして5’へこみ末端をDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで埋め、次にBstEIIで消化した。2948bpのフラグメントが単離され、そしてpHPIのフラグメントにライゲーションした。そのライゲーション混合物を大腸菌DH5αの形質転換のために用いた。所望のプラスミドを保有するコロニーを同定し、そしてそのプラスミドをpHP3と命名した(図2)。プラスミドpHP3を保有する大腸菌株をDSM 12661として寄託した。
【0141】
pyrG欠陥A.ニガーBO1誘導体JRoy3(BO1はpyrG遺伝子領域の欠失フラグメントによる形質転換及びFOAでの選別によりpyrGネガティブとなっている)をpHP3の5kbのEcoRI−NotIフラグメントでEP特許EP0531372B1に記載の方法に従い形質転換した。275の形質転換体を2回再単離し、次いで96穴マイクロタイター皿の中で34℃にして、pH6.0で48hrかけ、培地、グルコース20g/L,NaNO3 15g/L,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4・7H2O 1g/L,NaCl 1g/L,CaCl2・2H2O 0.1g/L,微量溶液0.5ml/Lの中で増殖させた。微量溶液:ZnSO4・7H2O 14.3g/L,CuSO4・5H2O 2.5g/L,NiCl2・6H2O 0.5g/L,FeSO4・7H2O 13.8g/L,MnCl2 6g/L。その上清液をSigma(St.Louis,MO,USA)シュウ酸(cat.No.591−C)キットを用いてシュウ酸についてアッセイした。8の形質転換体がシュウ酸を生産しないことがわかった。そのうち6つをサザンブロット分析に、2つのシュウ酸産生形質転換体BO1及びJRoyを陽性コントロールとして一緒にかけた。実施例3に記載の219bpのEST PCRフラグメントをプローブとして用いた。同じサンプルの別のブロットをpJRoy10のNcoI−BstEIIフラグメントでプロービングした。サザンブロットは6つのシュウ酸陰性株がオキサロ酢酸遺伝子内で中断されており、陽性コントロールは完全なオキサロ酢酸遺伝子を含むことを示した。
【0142】
実施例5
オキサロ酢酸陰性株の発酵
オキサロ酢酸陰性株の一つを、攪拌、温度制御、pH制御及び通気の備ったバッチ発酵槽の中で増殖させた。その培地はグルコース16g/L,(NH42SO4 7.5g/L,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4・7H2O 1g/L,NaCl 1g/L,CaCl2・2H2O 0.1g/L,微量溶液0.5ml/Lである。微量溶液:ZnSO4・7H2O 14.3g/L,CuSO4・5H2O 2.5g/L,NiCl2・6H2O 0.5g/L,FeSO4・7H2O 13.8g/L,MnCl2 6g/L。そのpHをバイオマスが0.5g/Lの濃度に達するまで2.5とした。この時点でpHをpH6.0にシフトさせた。発酵ブロスをシュウ酸塩、クエン酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、グリセロール、エタノール及びグルコースについて分析した(Nissen,T.L.,U.Schulze,J.Nielsen,and J.Villadsen.1997.Flux distributions in anaerobic,glucose−limited continuous cultures of Saccharomyces cerevisiae.Microbiol.143:203−218)。副産物のうち、クエン酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩およびグリセロールのみが検出でき、そしてこれらの副産物の最大濃度はそれぞれ0.74g/L,0.81g/L,0.14g/L及び0.13g/Lであった。グルコースに基づくバイオマス収率は0.58g/gであり、比増殖速度は0.23h-1であった。
【0143】
微生物材料の寄託
下記の生物材料をブダペスト条約に従い、DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,D−38124 Braunschweig,Germany)に寄託し、そして以下の受託番号が付与された:寄託ref. 受託番号 寄託日NN049454 DSM 12660 1999−02−03NN049455 DSM 12661 1999−02−03NN049047 DSM 12665 1999−02−03

【特許請求の範囲】
【請求項1】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって:
(a)SEQ ID NO:2のアミノ酸1〜341と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする核酸;及び
(b)SEQ ID NO:1のヌクレオチド1157〜1411、1504〜1651及び1764〜2383から構成されるヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する核酸;
から成る群から選ばれる核酸。
【請求項2】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする、又は
SEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも90%の相同性を有する配列から成る、又は
SEQ ID NO:1の核酸配列から成る、又は
大腸菌株DSM12660に収容されたプラスミドpHP1の中に含まれている、
請求項1記載の核酸。
【請求項3】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、(a)DNAを高ストリンジェンシー条件下で(i)SEQ ID NO:1の核酸、(ii)SEQ ID NO:1のcDNA、(iii)少なくとも100ヌクレオチドの(i)もしくは(ii)のサブ配列の核酸、又は(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)の相補鎖とハイブリダイゼーションさせ;そして(b)当該核酸を単離することにより生産された核酸。
【請求項4】
適当な発現宿主内での前記ポリペプチドの産生を指令する1又は複数のコントロール配列に作用可能式に連結された請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸を含んで成る核酸構築体。
【請求項5】
請求項4記載の核酸構築体、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換発現ベクター。
【請求項6】
請求項4記載の核酸構築体を含んで成る組換宿主細胞。
【請求項7】
オキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するための方法であって、(a)請求項6記載の宿主細胞を当該ポリペプチドの産生に適した条件下で培養し、そして(b)当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項8】
糸状菌細胞の突然変異細胞を生産するための方法であって、請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸を中断又は欠失させ、もとの細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼを産生する突然変異体を生み出すことを含んで成る方法。
【請求項9】
(a)親糸状菌細胞に、オキサロ酢酸デヒドロラーゼの産生を司る少なくとも一の遺伝子の修飾を含んで成る核酸を導入し;そして
(b)同一条件下で親細胞よりも少ない量のオキサロ酢酸デヒドロラーゼを産生する工程(a)由来の突然変異細胞を同定する;
ことを含んで成る請求項8記載の方法。
【請求項10】
請求項8又は9記載の方法により生産された突然変異細胞。
【請求項11】
アスペルギルス(Aspergillus)、アクレモニウム(Acremonium)、オーレオバシジウム(Aureobasidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フサリウム(Fusarium)、ジッベレラ(Gibberella)、ヒュミコラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフソラ(Myceliophthora)、ミロセシウム(Myrothecium)、ネオカリマスティックス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロマイセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(penicillium)、ピロマイセス(Piromyces)、シゾフィルム(Schizophyllum)、タラロマイセス(Talaromyces)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、又はトリコデルマ(Trichoderma)株の細胞である、請求項10記載の突然変異細胞。
【請求項12】
アスペルギルス・ニガー(A.niger)株の細胞である、請求項11記載の突然変異細胞。
【請求項13】
前記突然変異細胞が親細胞よりも、同一条件下で培養したときに少なくとも約25%少ない量のオキサロ酢酸ヒドロラーゼ又はシュウ酸を産生する、請求項10〜12のいずれか1項記載の突然変異細胞。
【請求項14】
前記突然変異細胞が1又は複数の第三の核酸配列の1又は複数の修飾を更に含んで成り、ここで当該修飾は当該1又は複数の第三の核酸配列の発現を抑制又は消失させるものである、請求項10〜13のいずれか1項記載の突然変異細胞。
【請求項15】
前記第三の核酸がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチターゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、アンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼから成る群から選ばれる酵素をコードする、請求項14記載の突然変異細胞。
【請求項16】
前記突然変異細胞が更にプロテアーゼをコードする1又は複数の遺伝子の修飾を含んで成る、請求項10〜15のいずれか1項記載の突然変異細胞。
【請求項17】
天然物を生産するための方法であって、(a)請求項10〜16のいずれか1項記載の突然変異細胞を当該天然物の産生が誘導される条件下で培養し、そして(b)当該天然物を回収することを含んで成る方法。
【請求項18】
前記天然物がクエン酸である、請求項17記載の方法。
【請求項19】
異種ポリペプチドをコードする核酸を更に含んで成る、請求項10〜16のいずれか1項記載の突然変異細胞。
【請求項20】
異種ポリペプチドを生産するための方法であって、(a)請求項19記載の突然変異細胞を当該ポリペプチドの産生が誘導される条件下で培養し、そして(b)当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項21】
前記異種ポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、レセプター又はその一部、抗体又はその一部、又はリポーターである、請求項20記載の方法。
【請求項22】
前記酵素がオキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼ、好ましくはアミノペプチターゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチターゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、アンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである、請求21記載の方法。
【請求項23】
食品におけるシュウ酸の検出のための請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸によりコードされるオキサロ酢酸デヒドロラーゼの使用。
【請求項24】
大腸菌株DSM 12260又はDSM 12661の実質的に純粋な培養物。

【図1】
image rotate

【図2】
image rotate


【公開番号】特開2011−101651(P2011−101651A)
【公開日】平成23年5月26日(2011.5.26)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2010−287753(P2010−287753)
【出願日】平成22年12月24日(2010.12.24)
【分割の表示】特願2000−601140(P2000−601140)の分割
【原出願日】平成12年2月18日(2000.2.18)
【出願人】(500586299)ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Fターム(参考)】