オキソステロイド化合物の還元による、またはハイドロキシステロイド脱水素酵素を用いるハイドロキシステロイド化合物の酸化によるステロイド誘導体の調製のためのプロセス
ステロイド骨格に少なくとも一つのオキソ基を有する下記のステロイド構造（ＡＢＣＤ）を含むオキソステロイド化合物のエナンチオ選択的な酵素的還元のためのプロセスは、オキソステロイド化合物が、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素にて還元され、ａ）オキソステロイド化合物は５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、ｂ）ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、酸化状態のＮＡＤまたはＮＡＤＰは、式ＲｘＲｙＣＨＯＨの第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールの酸化によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、上記第２級アルコールの酸化または上記シクロアルカナールに対する酸化のためにそれぞれ使用される。
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つのオキソ基を有するステロイド構造（ＡＢＣＤ）を含む化合物（オキソステロイド化合物）のエナンチオ選択的な酵素的還元のためのプロセスであって、上記オキソステロイド化合物を、コファクター（補因子）であるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素（デハイドロゲナーゼ）により還元するためのプロセスに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つの水酸（ハイドロキシ）基を有するステロイド構造（ＡＢＣＤ、つまりハイドロキシステロイド）を含む化合物（ハイドロキシステロイド化合物）の酸化のためのプロセスであって、上記ハイドロキシステロイド化合物を、コファクター（共存因子）であるＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素により酸化するためのプロセスに関する。
【０００３】
（背景）
ステロイド類は、コレステロールの環システムを有し、二重結合の数、感応基のタイプ、数、および位置、メチル基やアルキル基側鎖の数、結合の配置に関して異なる各化合物である。ステロイド化合物類は、動物の器官、菌類、植物の中に見出され、男性および女性の性ホルモン類、副腎皮質ホルモン類、ビタミン類、胆汁酸類、ステロイドサポゲニン類、心臓活性化物質、ガマ毒といった、数多くの生理活性を示すものである。
【０００４】
最初に解明され、少なくとも一つのケトンの機能を、環システム内にて、またはステロイド骨格に配された側鎖内にて有するステロイド類であるオキソステロイド類について、以下の記載により理解される。
【０００５】
最初に解明され、少なくとも一つのハイドロキシの機能を、環システム内にて、またはステロイド骨格に配された側鎖内にて有するステロイド類であるハイドロキシステロイド類について、以下の記載により理解される。
【０００６】
ステロイド類の数多くの生理学的な各効果によって、ステロイド化合物類やそれらの誘導体は、医学分野においても、治療薬や医薬品として多数使用されている。
【０００７】
例えば、プロゲストゲンやエストロゲンの誘導体類は、世界中にて避妊薬として使用され、アンドロゲン（テストステロン）は、成長促進剤として使用され、アンチアンドロゲンは、例えば前立腺ガンの治療に使用される。グルココルチコイド類（コルチゾーン、コルチゾル、プレドニゾロンおよびプレドニゾン）およびそれらの誘導体は、それらの抗炎症、抗アレルギー、および免疫抑制の各効果によって、皮膚病、リューマチ病、アレルギー反応、腎臓病、胃腸病、および他の数多くの病気の治療処理に広く使用されている。
【０００８】
生物学的に活性を示すステロイド化合物類の世界市場の規模は膨大である。互いに異なる各効果を有する種々なステロイド化合物類の生産では、生物学的な変換が重要な役割を演じる。それゆえ、ヒドロキシラーゼ類および脱水素酵素類による酵素反応は特に重要である。上記生物学的な変換の関係において、デルタ−１−脱水素化、１１位ベータ−還元、２０位ベータ−還元、１７位ベータ−還元、３位および７位での立体選択的な還元、並びに、３位、７位、１２位および１７位での水酸基の立体選択的な酸化もまた、特有の役割を演じている。
【０００９】
産業上においては、ステロイド類に対する生物的な還元は、今までのところ、全く損傷していない各セルを用い、物質濃度が１０ｇ／ｌよりかなり下回る濃度にてのみ実行されている。よって、上記従来では、まず、第一に、生物学的な変換に対し関与する各酵素は、今までのところ、特定されておらず、かつ、それらの内容も不明であること、上記特定されず、不明なために、第二に、水性媒体中でのステロイド類の不溶性という一つの問題や、コファクターであるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの再生が十分な程度ではないという他の問題を解決する、十分な技術的な解決法が見出されていないとい課題を生じている。
【００１０】
また、ステロイド類の酸化は、今までのところ、産業的においては化学的に実行されてきた。
【００１１】
分離された酵素類によるステロイド類のエナンチオ選択的な還元の試みは、Ｇ．カレラによる、1975年から1988年までの下記の各非特許文献１ないし９において、ほぼ記載されている。
【非特許文献１】Eur. J. Biochemistry 44, 1974 p. 401-405
【非特許文献２】Biotechnology and Bioengineering, Vol 17, 1975, p. 1101-1108
【非特許文献３】Enzyme Microb. Technol. Vol 6, July, 1984, p. 307-311
【非特許文献４】Biotechnology and Bioengineering, Vol 26, 1984, p. 560-563
【非特許文献５】J. Org. Chem. 51, 1986, p. 2902-2906
【非特許文献６】J. Org. Chem. 58, 1993, p. 499-501
【非特許文献７】J. Org. Chem., 53, 1988, p. 88-92
【非特許文献８】Enzyme Microb. Technol., Vol 10, June, p. 333-339
【非特許文献９】Archives of Biochemistry and Biophysics, 159, 1973, p. 7-10
【非特許文献１０】Pedrini et al., Steroids 71 (2006) p 189-198
【００１２】
上記ステロイド類のエナンチオ選択的な還元では、種々なハイドロキシステロイド脱水素酵素（ＨＳＨＤ）が使用されており、コファクターであるＮＡＤＨの再生は、本質的には、ラクテート脱水素酵素、フォルメート脱水素酵素、または酵母由来のアルコール脱水素酵素といった各酵素と結合により達成される。ＮＡＤＰの再生は、グルコース脱水素酵素の手段を用いることにより達成される。
【００１３】
上記溶解性の問題を克服するために、有機層として酢酸エチルおよび酢酸ブチルを用いた二相システムにて複数の各実験も実行された。また、二相システムにて分離された各酵素を用いて、通常は、１０ｇ／リットルを下回る濃度範囲にてオペレーション（変換操作）が実行された。達成されたトータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）は、１０００を下回る程度であった。この結果は、上記二相システムでのプロセスが、ホールセルを用いたプロセスと比較して経済的な利益が得られないことを示す理由である。
【００１４】
さらに、７α位から７β位への水酸基の変換が、酸化および還元の組み合わせにより達成されたことが記載された各論文がある。上記変換は、７αＨＳＤＨおよび７βＨＳＤＨの組み合わせによって達成される（非特許文献１０）。
【００１５】
上記プロセスにおいても、変換オペレーションが、１０ｇ／リットルを下回る濃度範囲にて実行され、達成されたトータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）が、１００を下回っていた。この結果は、上記プロセスが、経済的には妥当ではないことを示す理由である。
【００１６】
本発明は、上記不利益や困難さを回避することを目標とし、オキソステロイド化合物類およびハイドロキシステロイド化合物類のそれぞれに対する、エナンチオ選択的な還元と酸化とを、より高いターンオーバー数、より高い濃度範囲、かつ、上記各コファクターのより高いＴＴＮによりより経済性が高いプロセスを提供することを目的としている。
【００１７】
前述した従来のプロセスに加えて、上記目的は、
ａ）オキソステロイド化合物は、５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、酸化状態のコファクターＮＡＤまたはＮＡＤＰは、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールの酸化によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールに対する酸化のためにそれぞれ使用される、ことによって達成される。オキシドレダクターゼは酸化還元酵素とも呼ばれる。
【００１８】
前述した従来のプロセスの別のプロセスでは、上記目的は、
ａ）ハイドロキシステロイド化合物は５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、還元状態のコファクターＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンの還元によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンに対する還元のためにそれぞれ使用される、ことによって達成される。
【００１９】
本発明は、従来技術と比較されるように、ステロイド骨格での、エナンチオ選択的な、酵素による還元および酸化の各反応を本質的な改良を含む。本発明は、オキソステロイド化合物類の還元および酸化のそれぞれによって、酵素の使用無で対応するハイドロキシステロイド類に変換することを、従来技術での濃度範囲より大きく超えた濃度範囲にて可能にする。
【００２０】
本発明に係るプロセスでは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがコファクターとして使用される。用語としてのＮＡＤＰは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートを示し、ＮＡＤＰＨは、還元状態のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートを示す。用語としてのＮＡＤは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示し、ＮＡＤＨは、還元状態のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示す。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に係るプロセスは、下記の一般式（Ｉ）の化合物を、オキソステロイド化合物として使用することを特徴としている。
【００２２】
【化１】
【００２３】
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4＋Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、オキソ基、または、Ｒ5は、ＣＯＲ10−部であり、
【００２４】
【化２】
【００２５】
上記オキソステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に係るプロセスは、下記の一般式（Ｉ）の化合物を、ハイドロキシステロイド化合物として使用することを特徴としている。
【００２７】
【化３】
【００２８】
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、水酸基であり、
【００２９】
【化４】
【００３０】
上記ハイドロキシステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物である。
【００３１】
前記一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールとしては、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、５−メチル−２−ヘキサノール、または２−オクタノールを用いることが好ましい。前記シクロアルコールとしては、シクロヘキサノールを用いる。
【００３２】
前記一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケトンとしては、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノン、４−メチル−２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、５−メチル−２−ヘキサノン、または２−オクタノンを用いることが好ましい。前記シクロアルカノンとしては、シクロヘキサノンを用いる。
【００３３】
以下では、前記一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケトンまたはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンのそれぞれ、かつ、前記一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールまたはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールのそれぞれについては、一般的な用語である、補基質（cosubstrate）として要約される。
【００３４】
本発明に係るプロセスは、水性−有機溶媒の二相システム内にて実行されることが好ましい。補酵素の再生に使用される上記共存気質は、水に対し相溶性でないことが好適であり、上記水性−有機溶媒の二相システムの有機相を形成するものである。
【００３５】
本発明の可能な他の実施形態によれば、上記コファクターの再生に含まれない有機溶媒、例えば、ジエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、ヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンが、さらに、上記プロセス中に用いられる。
【００３６】
その上、本発明による上記プロセスのＴＴＮを１０3以上とすることが可能である。
【００３７】
さらに、用いたオキソステロイド化合物またはハイドロキシステロイド化合物のそれぞれの少なくとも５０％を、還元して対応するハイドロキシステロイド化合物または酸化してオキソステロイド化合物とすることが、２時間ないし９６時間以内にできる。
【００３８】
本発明に係るプロセスの好ましい各実施形態は、オキソステロイド化合物類として、例えば、ケトリソコール酸（式（II））、デキサメタゾン（式（III））、４−アンドロステン−３，１７−ジオン（式（IV））、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（式（Ｖ））、エストロン（式（VI））、プレグネノロン（式（VII））、コルチゾーン（式（VIII））を用いることを特徴としている。
【００３９】
さらに、本発明に係るプロセスの好ましい各実施形態は、ハイドロキシステロイド化合物として、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、１２−オクソコール酸、３−ハイドロキシ−１２−オクソコール酸、ケトリソコール酸、リソコール酸といった胆汁酸の種々な誘導体、または、ハイドロコルチゾーンも、使用される。
【００４０】
ハイドロキシステロイド脱水素酵素類について一般に理解されているように、上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、ステロイド骨格上において、ケト型基を水酸基へ還元すること、または、水酸基を対応するケト型基へ酸化することを、それぞれ触媒できるものである。それゆえ、上記酸化または還元のそれぞれは、ステロイド自体の環システム上にて（例えば、７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素）、または、上記ステロイドの骨格構造の炭素部位上にて（例えば、２０−βハイドロキシステロイド脱水素酵素）、生じる。
【００４１】
オキソステロイド化合物類の還元のために好適なハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、例えば、３−αハイドロキシステロイド脱水素酵素（ＨＳＤＨ）、３βＨＳＤＨ、１２αＨＳＤＨ、２０βＨＳＤＨ、７αＨＳＤＨ、７βＨＳＤＨ、１７βＨＳＤＨ、および１１βＨＳＤＨである。
【００４２】
好適な３−αハイドロキシステロイド脱水素酵素は、例えば、シュードモナス・テストステローニ（J. Biol. Chem. 276 (13), 9961-9970 (2001)）から得られ、３−α−ハイドロキシステロイド類の酸化、および、３−ケト胆汁酸類、プロゲステロン、４−アンドロステン−３，１７−ジオン、５−α−アンドロスタン−３，１７−ジオン等といった３−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。
【００４３】
３−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する好適な酵素類は、例えば、クロストリジウム・インノクム（Applied and Environmental Microbiology, June 1989, p. 1656-1659）、または、シュードモナス・テストステローニから得られ、３−β−ハイドロキシステロイド類の酸化、および、３−ケト胆汁酸類、プロゲステロン、４−アンドロステン−３，１７−ジオン、５−α−アンドロスタン−３，１７−ジオン等といった３−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。
【００４４】
１２αＨＳＤＨは、例えば、クロストリジア（Eur. J. Biochem. 196 (1991) 439-450）から得られ、１２α−ハイドロキシステロイド類（例えば、コール酸）の酸化のために、および、例えば、１２−ケト−胆汁酸類（１２−ケトケノデオキシコール酸、デハイドロコール酸）といった１２−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。１２−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する、クロストリジアからの酵素類については、従来から記載されていて公知である（Biochim. Biophys. Acta 1988 Oct. 14; 962(3): 362-370）。
【００４５】
２０−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する酵素類は、例えば、ストレプトマイセス群の器官から得られ（The Journal of Biological Chemistry, 1977, Vol 252 No 1, Jan 10, 205-211）、コルチゾーンおよびコルチゾルの各誘導体（コルチゾーン、コルチゾル、コルテクソロン、プロゲステロン）を、対応する２０−β−ハイドロキシステロイド類（例えば、２０−β−ハイドロキシプロゲステロン）に還元するために使用することができる。
【００４６】
２０−αハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する、対応する酵素類は、例えば、クロストリジア、特にクロストリジウム・サイデンス（Journal of Bacteriology, June 1989, p. 2925-2932）、および、テトラヒメナ・ピリフォルミス（Biochem.J. (1994) 297, 195-200）から得られる。
【００４７】
好適な７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、腸内細菌、例えばクロストリジア（クロストリジウム・アブソナム、クロストリジウム・ソルデリイ）（Journal of Bacteriology, Aug. 1994, p. 4865-4874）から、エシェリチア・コリ（Journal of Bacteriology Apr., 1991, p. 2173-2179）から、バクテロイデス・フラギリス（Current Microbiology, Vol 47 (2003) 475-484）から、ブルセラ属から、およびユーバクテリウム属といった、他のものから得られ、７−α−ハイドロキシステロイド類（ケノリソコール酸）の酸化のために、かつ、例えば、７−ケト−胆汁酸類（ケトリソコール酸）といった７−ケトステロイド類の還元にそれぞれ使用することができる。
【００４８】
７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する対応する酵素類は、クロストリジアから、ルミノコッシ科（J. Biochemistry 102, 1987, p. 613-619）またはペプトストレプトコッシ科（Biochimica and Biophysica Acta 1004, 1989, p. 230-238）の各微生物から、ユーバクテリウム・エアロファシエンス（Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p. 1057-1063）から、クサントモナス・マルトフィリア（Pedrini et al, Steroids 71 (2006) p 189-198）から、それぞれ得られる。７−βＨＳＤＨによって、例えば、ウルソデオキシコール酸を、ケトリソコール酸から生産することが可能となる。
【００４９】
１７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、サイリンドロカルポン・ラジコーラ（J. Biochemistry 103, 1988, 1039-1044）や、ココリオボラス・ルナツス（J. Steroid Biochem. Molec.Biol. Vol 59, 1996, No. 2, p. 205-214）といったカビから、ストレプトマイセス科のバクテリア（Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Vol. 356, 1975, 1843-1852）や、シュードモナス科のバクテリア（The Journal of Biological Chemistry, Vol. 252 No.ll, June 10, 1977, p. 3775-3783）や、アルカリジェネス科のバクテリア（The Journal of Biological Chemistry, Vol. 260, No. 25, Nov 5, 1985, p. 13648-13655）から得られることが知られている。
【００５０】
１７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、１７−βハイドロキシステロイド類の酸化のために、および、例えば、４−アンドロステン−３，１７−ジオン、アンドロステロン、エストステロンといった１７−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。
【００５１】
１７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する対応する酵素類は、ユーバクテリウムのスピーシーズ（Journal of Lipid Research, Vol. 35, 1994, p. 922-929）から得られることが記載されている。
【００５２】
１１−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、高等哺乳類から得られることが知られており、例えば、コルチゾルをコルチゾーンに酸化するために使用することが可能である。
【００５３】
しかしながら、ステロイド骨格上において、酸化反応および還元反応を触媒する他の何れのオキシドレダクターゼも、上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素として使用することができる。
【００５４】
前述したように、例えば、シュードモナス・テストステローニから得られた１７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類、クロストリジウム・インノクムから得られた３−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類、またはバクテロイデス・フラギリスから得られた７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素類を用いたとき、ＮＡＤＨまたはＮＡＤを再生するための、好適な第２級アルコール脱水素酵素類は、カンディダ属およびピキア属の酵母類から分離される。例えば、カルボニルレダクターゼは、カンディダ・パラプシロリス（ＣＲＣＲ）（US 5,523,223, US 5,763,236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15(l l):950-8）、ピキア・カプスラータ（DE 10327454.4）、ピキア・ファリノーザ（A 1261/2005, Kl. C12N）、ピキア・フィンランディカ（EP 1179595 Al）、カンディダ・ネモデンドラ（A 1261/2005, Kl. C12N）、ピキア・トレハロフィリア（A 1261/2005, Kl. C12N）、ロードトルーラ・ムキラギノーザ（A 1261/2005, Kl. C12N）、ロダロマイセス・エロンギスポーラス（A 1261/2005, Kl. C12N）、ピキア・スチピディス（A 1261/2005, Kl. C12N）から得られる。
【００５５】
さらに、ＮＡＤＨの再生もまた、上述したような、第２級アルコール脱水素酵素類／オキシドレダクターゼにより改善される。第２級アルコール脱水素酵素類は、ロードコッカス・エリスロポリス（US 5,523,223）、ノルカディア・フスカ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999）, pp. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62(4):380-6, Epub 2003 Apr 26）、ロードコッカス・ルバー（J. Org. Chem. 2003 Jan 24; 8(2):402-6.）、またはマイクロバクテリウムのスピーシーズ（A 1261/2005, Kl. C12N）からといった、放線細菌から分離される。
【００５６】
例えば、前述したように、クロストリジウム・パラプトリフィカムからの１２α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素類、ユーバクテリウムのスピーシーズからの１７α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素類、または、クロストリジウム・ソルデリイからの７α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素類を用いたとき、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰのそれぞれを再生するための、好適な第２級アルコール脱水素酵素類／オキシドレダクターゼは、ラクトバシラレス目（ラクトバシラス・ケフィール（US 5,200,335）、ラクトバシラス・ブレビス（DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8）、ラクトバシラス・マイノール（DE 10119274）、リューコノストック・カルノサム（A 1261/2005, Kl. C12N））の器官から、またはサーモアネロビウム・ブロッキイ、サーモアネロビウム・エタノリカス、あるいはクロストリジウム・ベイジェリンキイから得られる。
【００５７】
ハイドロキシステロイド脱水素酵素およびオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素の双方は、エシェリチア・コリ（Ｅ．coli）菌内にて、遺伝子組み換えにより上書きされた状態にて得られたものを用いることが好ましい。本発明に係るプロセスでは、ハイドロキシステロイド脱水素酵素およびアルコール／オキシドレダクターゼ脱水素酵素の双方は、完全に精製された状態、部分的に精製された状態、各細胞内に含まれたクルードな状態の何れでも使用可能である。よって、使用される上記細胞は、原型のまま、浸潤された状態、または分解された状態の何れでもよい。
【００５８】
オキソステロイド化合物およびハイドロキシステロイド化合部のそれぞれを、１ｋｇにて変換するには、５００００Ｕから１０×１０6Ｕまでのハイドロキシステロイド脱水素酵素および５００００Ｕから１０×１０6Ｕまでのアルコール脱水素酵素が使用される（上限は無し）。上記酵素の単位１Ｕは、１分間に１μモルのオキソステロイド化合物を変換するために必要とされるハイドロキシステロイド脱水素酵素の酵素量を示し、また、１分間に１μモルの２−アルコールを酸化するために必要とされるアルコール脱水素酵素の酵素量を示す。オキソステロイド化合物およびハイドロキシステロイド化合部のそれぞれ１ｋｇを、変換するには、ハイドロキシステロイド脱水素酵素を含むＥ．coliの１０ｇから５００ｇのウエットバイオマス、また、アルコール／オキシドレダクターゼ脱水素酵素を含むＥ．coliの１０ｇから５００ｇのウエットバイオマスが使用される（上限無し）。
【００５９】
上記プロセスでは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生は、酵素の組み合わせ法により良好な結果が得られる。
【００６０】
本発明に係るプロセスでは、コファクター、ハイドロキシステロイド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、水、オキソステロイド化合物、ハイドロキシステロイド化合物におけるそれぞれの回収のために、オキソステロイド化合物、ハイドロキシステロイド化合物の変換は、２−アルコールまたはケト化合物を含む２相システムにて生じさせることが好ましい。
【００６１】
さらに、コファクターの再生に関与しない、つまり、アルコール脱水素酵素により酸化され得る水酸基を含まない、かつ、同様に還元されないケトン基を含まない、別の有機溶媒を含んでもよい。
【００６２】
上記２相システムでの、水と相溶性でない有機溶媒成分の割合（容量）は、上記反応でのトータル容量に対して、１０％から９０％の範囲内、より好ましくは、２０％から８０％の範囲内である。水性部分（容量）は、上記反応バッチでのトータル容量に対して、９０％から１０％の範囲内、より好ましくは、８０％から２０％の範囲内である。
【００６３】
上記水に対し、バッファを加えてもよい。上記バッファとしては、例えば、５から１０、より好ましくは６から９までのｐＨ値を有する、リン酸カリウム、トリス／ＨＣｌ、グリシンまたはトリエタノールアミンの各バッファを挙げることができる。さらに、上記バッファは、上記双方の各酵素を安定化または活性化するための、各イオン、例えば、マグネシウムイオンまたは亜鉛イオンを含んでもよい。
【００６４】
その上、ハイドロキシステロイド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素の両酵素を安定化するための別の添加物を、本発明のプロセスに用いてもよい。上記添加物としては、例えば、グリセロール、ソルビトール、１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００６５】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、水性相に対して、０．００１ｍＭから１０ｍＭの範囲内、特に、０．０１ｍＭから１．０ｍＭの範囲内である。使用する各酵素の固有の各物性に依存して、反応温度は、１０度から７０度、より好ましくは２０度から３５度までの範囲内である。
【００６６】
本発明のプロセスにおいて達成されるＴＴＮ（トータルターンオーバー数＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）は、上記プロセスを用いることによって、１０2から１０5までの範囲内であり、普通は、ＴＴＮ＞１０3が選択される。
【００６７】
通常、還元されるオキソステロイド化合物類およびハイドロキシステロイド化合物類は、それぞれ、水への溶解性に乏しいものである。上記反応の間、基質は、完全に溶解した状態でも、不完全に溶解した状態で存在していてもよい。もし、反応混合物中において、基質が完全には溶解されていないとき、上記基質の一部は、固体状態となり、それゆえ、第３の固相を形成してもよい。
【００６８】
上記変換の間、上記反応混合物は、一時的にエマルジョンを形成していてもよい。本発明のプロセスでは、還元されるオキソステロイド化合物類および酸化されるハイドロキシステロイド化合物類のそれぞれは、上記反応バッチのトータル容量に対して、５０ｇ／リットル以上の量にて使用される。好ましくは、オキソステロイド化合物およびハイドロキシステロイド化合物類の５０ｇ／リットルから４００ｇ／リットルの範囲内にて、特に好ましくは、５０ｇ／リットルから２００ｇ／リットルの範囲内にて使用される。
【００６９】
コファクターの再生に関与しない、他の好適な有機溶媒は、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ヘプタン、ヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、またはシクロヘキアン、またはそれらの互いに異なる組成の混合物が挙げられる。
【００７０】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生は、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールの酸化によって達成される。上記再生では、反応生成物として、一般式ＲｘＲｙＣ＝ＯまたはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンのケトン類が形成される。好ましい第２級アルコール類は、イソプロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、２−オクタノール、４−メチル−２−ペンタノール、５−メチル−２−ヘキサノールといった脂肪族の２−アルコール類と共に、シクロヘキサノール、シクロペンタノールといった環状の第２級アルコール類である。原理的には、１，４−シクロヘキサンジオールといったジオール類の使用も同様に想定内である。
【００７１】
ＮＡＤ（Ｐ）の再生は、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンの還元によって達成される。上記再生では、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコール類またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナール類が、反応生成物として形成される。好ましいケト型化合物は、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、４−メチル−２−ペンタノン、５−メチル−２−ヘキサノンといったケトン類と共に、シクロヘキサノン、シクロペンタノンといった環状のケトン類である、原理的には、１，４−シクロヘキサンジオンといったジオン類の使用も同様に想定内である。
【００７２】
本発明に係るプロセスは、例えば、ガラスまたは金属からなる反応容器内にて実行される。上記反応の目的のために、各組成は、上記反応容器内に個別に送られ、例えば、窒素または空気の雰囲気下にて攪拌される。使用されるオキソステロイド化合物に応じて、反応時間は、１時間から９６時間までの範囲内、特に２時間から４８時間までの範囲内である。この期間では、オキソステロイド化合物が、対応するハイドロキシステロイド化合物に少なくとも５０％まで還元され、また、ハイドロキシステロイド化合物が、オキソステロイド化合物に、少なくとも５０％まで酸化される。
【００７３】
以下では、本発明が、各実施例によってさらに詳細に説明される。
【００７４】
（実施例１）アンドロステン−３，１７−ジオンの１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）への還元
Ａ）補酵素再生のための４−メチル−２−ペンタノールを有する２相システム
１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）の合成のために、０．４ミリリットルの４−メチル−２−ペンタノールに溶解させた、１００ｍｇのアンドロステン−３，１７−ジオンを、ＮＡＤを０．１ｍｇ、シュードモナス・テストステローニからの遺伝子組み換え１７−β−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P 19871）を３０単位（Ｕ）、ピキア・カプスラータからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE-A 103 27 454）を５０単位（Ｕ）を含む、０．５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのアンドロステン−３，１７−ジオンの濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００７５】
上記反応が完了したとき、反応混合物は、例えば、上記反応混合物を有機溶媒にて抽出し、続いて、上記溶媒を蒸留により除去することによって処理されてもよい。
【００７６】
２４時間後、使用されたアンドロステン−３，１７−ジオンの約９４％が、１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）に変換されていた。
【００７７】
アンドロステン−３，１７−ジオンの、１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）への変換は、ガスクロマトグラフィーによりモニターされ確認された。上記変換のモニターの目的のために、ガスクロマトグラフィー装置（ＧＣ−１７Ａ、島津社製）が、キラル分離用カラムリポデックスＥ（１２ｍ、マケリ−ナーゲル社製、デュレン、ドイツ）、フレームイオン化検出器、キャリアガスとしてヘリウムを使用して用いられた。
【００７８】
Ｂ）補酵素再生のための酢酸ブチルおよび２−プロパノールを有する２相システム
１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）の合成のために、０．３ミリリットルの酢酸ブチルおよび０．１ミリリットルの２−プロパノールに溶解させた、１００ｍｇのアンドロステン−３，１７−ジオンを、ＮＡＤを０．１ｍｇ、シュードモナス・テストステローニからの遺伝子組み換え１７−β−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P 19871）を３０単位（Ｕ）、ピキア・カプスラータからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE-A 103 27 454）を５０単位（Ｕ）を含む、０．５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのアンドロステン−３，１７−ジオンの濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００７９】
上記反応が完了したとき、反応混合物は、例えば、上記反応混合物を有機溶媒にて抽出し、続いて、上記溶媒を蒸留により除去することによって処理されてもよい。
【００８０】
２４時間後、使用されたアンドロステン−３，１７−ジオンの約９０％−９５％が、１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）に変換されていた。
【００８１】
（実施例２）ケトリソコール酸のケノリソコール酸への還元
Ａ）サーモアナエロビウム・ブロキイ由来のＡＤＨ／２相システムによる補酵素の再生
３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケノデオキシコール酸）の合成のために、０．５ミリリットルのメチルプロパノールに溶解させた、１００ｍｇの３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コール酸（ケトリソコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンスからの遺伝子組み換え７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）を１０単位（Ｕ）、サーモアナエロビウム・ブロキイからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素を１０単位（Ｕ）を含む、０．２ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ＝８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケトリソコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００８２】
２４時間後、使用されたケトリソコール酸の約９０％−９８％が、ケノデオキシコール酸に変換されていた。
【００８３】
ケトリソコール酸のケノデオキシコール酸への変換は、ＨＰＬＣによってモニターされ確認された。上記ＨＰＬＣのために、分離用カラムＥＣ１２５／４ネクレオデュール１００−５ Ｃ１８ec（マケリ−ナーゲル社製、デュレン、ドイツ）が、溶離液メタノール／水（８０／２０）を等濃度にて用いて使用された。
【００８４】
Ｂ）ラクトバチルス由来のＡＤＨ（DE 10119274）／２相システムによる補酵素の再生
３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケノデオキシコール酸）の合成のために、０．５ミリリットルのオクタノールに溶解させた、１００ｍｇの３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コール酸（ケトリソコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンスからの遺伝子組み換え７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）を１０単位（Ｕ）、ラクトバチルスからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE 10119274）を１０単位（Ｕ）を含む、０．３ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミンバッファ、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケトリソコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００８５】
２４時間後、使用されたケトリソコール酸の約７０％−８０％が、ケノデオキシコール酸に変換されていた。
【００８６】
（実施例３）１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの１７−β−ハイドロキシ−１，４−アンドロスタジエン−３−オンへの還元
１７−β−ハイドロキシ−１，４−アンドロスタジエン−３−オンの合成のために、０．４ミリリットルの４−メチル−２−ペンタノールに溶解させた、１００ｍｇの１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンを、ＮＡＤを０．１ｍｇ、シュードモナス・テストステローニからの遺伝子組み換え１７−β−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P 19871）を３０単位（Ｕ）、ピキア・カプスラータからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE-A 103 27 454）を５単位（Ｕ）を含む、０．５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中での１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００８７】
上記反応が完了したとき、反応混合物は、例えば、上記反応混合物を有機溶媒にて抽出し、続いて、上記溶媒を蒸留により除去することによって処理されてもよい。
【００８８】
２４時間後において、使用された１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの約９０％−９８％が、１７−βハイドロキシ−４−アンドロスタジエン−３−オンに変換されていた。
【００８９】
１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの、１７−βハイドロキシ−４−アンドロスタジエン−３−オンへの変換は、ガスクロマトグラフィーによりモニターされ確認された。上記変換のモニターの目的のために、マススペクトル測定装置付きのガスクロマトグラフィー装置（オートシステムＸＬ、パーキンエルマー社製）が、ＦＳ−キャピラリーカラム（オプチマ−５ＭＳ、マケリ−ナーゲル社製、デュレン、ドイツ）、キャリアガスとしてヘリウムを使用して用いられた。
【００９０】
（実施例４）ケノリソコール酸のケトリソコール酸への酸化
Ａ）サーモアナエロビウム・ブロキイ由来のＡＤＨ／２相システムによる補酵素の再生
３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コラン酸（ケトリソコール酸）の合成のために、０．５ミリリットルのメチルプロパノールに溶解させた、１００ｍｇの３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケのデオキシコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンスからの７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）の遺伝子が組み込まれて上記７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを１０ｍｇ、サーモアナエロビウム・ブロキイからのアルコール脱水素酵素の遺伝子が組み込まれて上記アルコール脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを５ｍｇを含む、０．４ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ＝８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケノデオキシコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００９１】
２４時間後、使用されたケノデオキシコール酸の約８０％が、ケトリソシコール酸に変換されていた。
【００９２】
ケノデオキシコール酸のケトリソシコール酸への変換は、薄層クロマトグラフィーによりモニターされ確認された。
【００９３】
Ｂ）ラクトバチルス由来のＡＤＨ（DE 10119274）／２相システムによる補酵素の再生
３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コラン酸（ケトリソコール酸）の合成のために、０．７ミリリットルのメチルイソブチルケトンに溶解させた、１００ｍｇの３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケノデオキシコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンス由来の７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）の遺伝子が組み込まれて上記７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを１０ｍｇ、ラクトバチルス由来のアルコール脱水素酵素（DE 10119274）の遺伝子が組み込まれて上記アルコール脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを５ｍｇ含む、０．１５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケノデオキシコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００９４】
２４時間後、使用されたケノデオキシコール酸の９０％以上が、ケトリソコール酸に変換されていた。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つのオキソ基を有するステロイド構造（ＡＢＣＤ）を含む化合物（オキソステロイド化合物）のエナンチオ選択的な酵素的還元のためのプロセスであって、上記オキソステロイド化合物を、コファクター（補因子）であるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素（デハイドロゲナーゼ）により還元するためのプロセスに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つの水酸（ハイドロキシ）基を有するステロイド構造（ＡＢＣＤ、つまりハイドロキシステロイド）を含む化合物（ハイドロキシステロイド化合物）の酸化のためのプロセスであって、上記ハイドロキシステロイド化合物を、コファクター（共存因子）であるＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素により酸化するためのプロセスに関する。
【０００３】
（背景）
ステロイド類は、コレステロールの環システムを有し、二重結合の数、感応基のタイプ、数、および位置、メチル基やアルキル基側鎖の数、結合の配置に関して異なる各化合物である。ステロイド化合物類は、動物の器官、菌類、植物の中に見出され、男性および女性の性ホルモン類、副腎皮質ホルモン類、ビタミン類、胆汁酸類、ステロイドサポゲニン類、心臓活性化物質、ガマ毒といった、数多くの生理活性を示すものである。
【０００４】
最初に解明され、少なくとも一つのケトンの機能を、環システム内にて、またはステロイド骨格に配された側鎖内にて有するステロイド類であるオキソステロイド類について、以下の記載により理解される。
【０００５】
最初に解明され、少なくとも一つのハイドロキシの機能を、環システム内にて、またはステロイド骨格に配された側鎖内にて有するステロイド類であるハイドロキシステロイド類について、以下の記載により理解される。
【０００６】
ステロイド類の数多くの生理学的な各効果によって、ステロイド化合物類やそれらの誘導体は、医学分野においても、治療薬や医薬品として多数使用されている。
【０００７】
例えば、プロゲストゲンやエストロゲンの誘導体類は、世界中にて避妊薬として使用され、アンドロゲン（テストステロン）は、成長促進剤として使用され、アンチアンドロゲンは、例えば前立腺ガンの治療に使用される。グルココルチコイド類（コルチゾーン、コルチゾル、プレドニゾロンおよびプレドニゾン）およびそれらの誘導体は、それらの抗炎症、抗アレルギー、および免疫抑制の各効果によって、皮膚病、リューマチ病、アレルギー反応、腎臓病、胃腸病、および他の数多くの病気の治療処理に広く使用されている。
【０００８】
生物学的に活性を示すステロイド化合物類の世界市場の規模は膨大である。互いに異なる各効果を有する種々なステロイド化合物類の生産では、生物学的な変換が重要な役割を演じる。それゆえ、ヒドロキシラーゼ類および脱水素酵素類による酵素反応は特に重要である。上記生物学的な変換の関係において、デルタ−１−脱水素化、１１位ベータ−還元、２０位ベータ−還元、１７位ベータ−還元、３位および７位での立体選択的な還元、並びに、３位、７位、１２位および１７位での水酸基の立体選択的な酸化もまた、特有の役割を演じている。
【０００９】
産業上においては、ステロイド類に対する生物的な還元は、今までのところ、全く損傷していない各セルを用い、物質濃度が１０ｇ／ｌよりかなり下回る濃度にてのみ実行されている。よって、上記従来では、まず、第一に、生物学的な変換に対し関与する各酵素は、今までのところ、特定されておらず、かつ、それらの内容も不明であること、上記特定されず、不明なために、第二に、水性媒体中でのステロイド類の不溶性という一つの問題や、コファクターであるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの再生が十分な程度ではないという他の問題を解決する、十分な技術的な解決法が見出されていないとい課題を生じている。
【００１０】
また、ステロイド類の酸化は、今までのところ、産業的においては化学的に実行されてきた。
【００１１】
分離された酵素類によるステロイド類のエナンチオ選択的な還元の試みは、Ｇ．カレラによる、1975年から1988年までの下記の各非特許文献１ないし９において、ほぼ記載されている。
【非特許文献１】Eur. J. Biochemistry 44, 1974 p. 401-405
【非特許文献２】Biotechnology and Bioengineering, Vol 17, 1975, p. 1101-1108
【非特許文献３】Enzyme Microb. Technol. Vol 6, July, 1984, p. 307-311
【非特許文献４】Biotechnology and Bioengineering, Vol 26, 1984, p. 560-563
【非特許文献５】J. Org. Chem. 51, 1986, p. 2902-2906
【非特許文献６】J. Org. Chem. 58, 1993, p. 499-501
【非特許文献７】J. Org. Chem., 53, 1988, p. 88-92
【非特許文献８】Enzyme Microb. Technol., Vol 10, June, p. 333-339
【非特許文献９】Archives of Biochemistry and Biophysics, 159, 1973, p. 7-10
【非特許文献１０】Pedrini et al., Steroids 71 (2006) p 189-198
【００１２】
上記ステロイド類のエナンチオ選択的な還元では、種々なハイドロキシステロイド脱水素酵素（ＨＳＨＤ）が使用されており、コファクターであるＮＡＤＨの再生は、本質的には、ラクテート脱水素酵素、フォルメート脱水素酵素、または酵母由来のアルコール脱水素酵素といった各酵素と結合により達成される。ＮＡＤＰの再生は、グルコース脱水素酵素の手段を用いることにより達成される。
【００１３】
上記溶解性の問題を克服するために、有機層として酢酸エチルおよび酢酸ブチルを用いた二相システムにて複数の各実験も実行された。また、二相システムにて分離された各酵素を用いて、通常は、１０ｇ／リットルを下回る濃度範囲にてオペレーション（変換操作）が実行された。達成されたトータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）は、１０００を下回る程度であった。この結果は、上記二相システムでのプロセスが、ホールセルを用いたプロセスと比較して経済的な利益が得られないことを示す理由である。
【００１４】
さらに、７α位から７β位への水酸基の変換が、酸化および還元の組み合わせにより達成されたことが記載された各論文がある。上記変換は、７αＨＳＤＨおよび７βＨＳＤＨの組み合わせによって達成される（非特許文献１０）。
【００１５】
上記プロセスにおいても、変換オペレーションが、１０ｇ／リットルを下回る濃度範囲にて実行され、達成されたトータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）が、１００を下回っていた。この結果は、上記プロセスが、経済的には妥当ではないことを示す理由である。
【００１６】
本発明は、上記不利益や困難さを回避することを目標とし、オキソステロイド化合物類およびハイドロキシステロイド化合物類のそれぞれに対する、エナンチオ選択的な還元と酸化とを、より高いターンオーバー数、より高い濃度範囲、かつ、上記各コファクターのより高いＴＴＮによりより経済性が高いプロセスを提供することを目的としている。
【００１７】
前述した従来のプロセスに加えて、上記目的は、
ａ）オキソステロイド化合物は、５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、酸化状態のコファクターＮＡＤまたはＮＡＤＰは、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールの酸化によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールに対する酸化のためにそれぞれ使用される、ことによって達成される。オキシドレダクターゼは酸化還元酵素とも呼ばれる。
【００１８】
前述した従来のプロセスの別のプロセスでは、上記目的は、
ａ）ハイドロキシステロイド化合物は５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、還元状態のコファクターＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンの還元によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンに対する還元のためにそれぞれ使用される、ことによって達成される。
【００１９】
本発明は、従来技術と比較されるように、ステロイド骨格での、エナンチオ選択的な、酵素による還元および酸化の各反応を本質的な改良を含む。本発明は、オキソステロイド化合物類の還元および酸化のそれぞれによって、酵素の使用無で対応するハイドロキシステロイド類に変換することを、従来技術での濃度範囲より大きく超えた濃度範囲にて可能にする。
【００２０】
本発明に係るプロセスでは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがコファクターとして使用される。用語としてのＮＡＤＰは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートを示し、ＮＡＤＰＨは、還元状態のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェートを示す。用語としてのＮＡＤは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示し、ＮＡＤＨは、還元状態のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを示す。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に係るプロセスは、下記の一般式（Ｉ）の化合物を、オキソステロイド化合物として使用することを特徴としている。
【００２２】
【化１】
【００２３】
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4＋Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、オキソ基、または、Ｒ5は、ＣＯＲ10−部であり、
【００２４】
【化２】
【００２５】
上記オキソステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に係るプロセスは、下記の一般式（Ｉ）の化合物を、ハイドロキシステロイド化合物として使用することを特徴としている。
【００２７】
【化３】
【００２８】
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、水酸基であり、
【００２９】
【化４】
【００３０】
上記ハイドロキシステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物である。
【００３１】
前記一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールとしては、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、５−メチル−２−ヘキサノール、または２−オクタノールを用いることが好ましい。前記シクロアルコールとしては、シクロヘキサノールを用いる。
【００３２】
前記一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケトンとしては、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノン、４−メチル−２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、５−メチル−２−ヘキサノン、または２−オクタノンを用いることが好ましい。前記シクロアルカノンとしては、シクロヘキサノンを用いる。
【００３３】
以下では、前記一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケトンまたはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンのそれぞれ、かつ、前記一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールまたはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールのそれぞれについては、一般的な用語である、補基質（cosubstrate）として要約される。
【００３４】
本発明に係るプロセスは、水性−有機溶媒の二相システム内にて実行されることが好ましい。補酵素の再生に使用される上記共存気質は、水に対し相溶性でないことが好適であり、上記水性−有機溶媒の二相システムの有機相を形成するものである。
【００３５】
本発明の可能な他の実施形態によれば、上記コファクターの再生に含まれない有機溶媒、例えば、ジエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、ヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンが、さらに、上記プロセス中に用いられる。
【００３６】
その上、本発明による上記プロセスのＴＴＮを１０3以上とすることが可能である。
【００３７】
さらに、用いたオキソステロイド化合物またはハイドロキシステロイド化合物のそれぞれの少なくとも５０％を、還元して対応するハイドロキシステロイド化合物または酸化してオキソステロイド化合物とすることが、２時間ないし９６時間以内にできる。
【００３８】
本発明に係るプロセスの好ましい各実施形態は、オキソステロイド化合物類として、例えば、ケトリソコール酸（式（II））、デキサメタゾン（式（III））、４−アンドロステン−３，１７−ジオン（式（IV））、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（式（Ｖ））、エストロン（式（VI））、プレグネノロン（式（VII））、コルチゾーン（式（VIII））を用いることを特徴としている。
【００３９】
さらに、本発明に係るプロセスの好ましい各実施形態は、ハイドロキシステロイド化合物として、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、１２−オクソコール酸、３−ハイドロキシ−１２−オクソコール酸、ケトリソコール酸、リソコール酸といった胆汁酸の種々な誘導体、または、ハイドロコルチゾーンも、使用される。
【００４０】
ハイドロキシステロイド脱水素酵素類について一般に理解されているように、上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、ステロイド骨格上において、ケト型基を水酸基へ還元すること、または、水酸基を対応するケト型基へ酸化することを、それぞれ触媒できるものである。それゆえ、上記酸化または還元のそれぞれは、ステロイド自体の環システム上にて（例えば、７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素）、または、上記ステロイドの骨格構造の炭素部位上にて（例えば、２０−βハイドロキシステロイド脱水素酵素）、生じる。
【００４１】
オキソステロイド化合物類の還元のために好適なハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、例えば、３−αハイドロキシステロイド脱水素酵素（ＨＳＤＨ）、３βＨＳＤＨ、１２αＨＳＤＨ、２０βＨＳＤＨ、７αＨＳＤＨ、７βＨＳＤＨ、１７βＨＳＤＨ、および１１βＨＳＤＨである。
【００４２】
好適な３−αハイドロキシステロイド脱水素酵素は、例えば、シュードモナス・テストステローニ（J. Biol. Chem. 276 (13), 9961-9970 (2001)）から得られ、３−α−ハイドロキシステロイド類の酸化、および、３−ケト胆汁酸類、プロゲステロン、４−アンドロステン−３，１７−ジオン、５−α−アンドロスタン−３，１７−ジオン等といった３−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。
【００４３】
３−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する好適な酵素類は、例えば、クロストリジウム・インノクム（Applied and Environmental Microbiology, June 1989, p. 1656-1659）、または、シュードモナス・テストステローニから得られ、３−β−ハイドロキシステロイド類の酸化、および、３−ケト胆汁酸類、プロゲステロン、４−アンドロステン−３，１７−ジオン、５−α−アンドロスタン−３，１７−ジオン等といった３−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。
【００４４】
１２αＨＳＤＨは、例えば、クロストリジア（Eur. J. Biochem. 196 (1991) 439-450）から得られ、１２α−ハイドロキシステロイド類（例えば、コール酸）の酸化のために、および、例えば、１２−ケト−胆汁酸類（１２−ケトケノデオキシコール酸、デハイドロコール酸）といった１２−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。１２−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する、クロストリジアからの酵素類については、従来から記載されていて公知である（Biochim. Biophys. Acta 1988 Oct. 14; 962(3): 362-370）。
【００４５】
２０−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する酵素類は、例えば、ストレプトマイセス群の器官から得られ（The Journal of Biological Chemistry, 1977, Vol 252 No 1, Jan 10, 205-211）、コルチゾーンおよびコルチゾルの各誘導体（コルチゾーン、コルチゾル、コルテクソロン、プロゲステロン）を、対応する２０−β−ハイドロキシステロイド類（例えば、２０−β−ハイドロキシプロゲステロン）に還元するために使用することができる。
【００４６】
２０−αハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する、対応する酵素類は、例えば、クロストリジア、特にクロストリジウム・サイデンス（Journal of Bacteriology, June 1989, p. 2925-2932）、および、テトラヒメナ・ピリフォルミス（Biochem.J. (1994) 297, 195-200）から得られる。
【００４７】
好適な７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、腸内細菌、例えばクロストリジア（クロストリジウム・アブソナム、クロストリジウム・ソルデリイ）（Journal of Bacteriology, Aug. 1994, p. 4865-4874）から、エシェリチア・コリ（Journal of Bacteriology Apr., 1991, p. 2173-2179）から、バクテロイデス・フラギリス（Current Microbiology, Vol 47 (2003) 475-484）から、ブルセラ属から、およびユーバクテリウム属といった、他のものから得られ、７−α−ハイドロキシステロイド類（ケノリソコール酸）の酸化のために、かつ、例えば、７−ケト−胆汁酸類（ケトリソコール酸）といった７−ケトステロイド類の還元にそれぞれ使用することができる。
【００４８】
７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する対応する酵素類は、クロストリジアから、ルミノコッシ科（J. Biochemistry 102, 1987, p. 613-619）またはペプトストレプトコッシ科（Biochimica and Biophysica Acta 1004, 1989, p. 230-238）の各微生物から、ユーバクテリウム・エアロファシエンス（Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p. 1057-1063）から、クサントモナス・マルトフィリア（Pedrini et al, Steroids 71 (2006) p 189-198）から、それぞれ得られる。７−βＨＳＤＨによって、例えば、ウルソデオキシコール酸を、ケトリソコール酸から生産することが可能となる。
【００４９】
１７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、サイリンドロカルポン・ラジコーラ（J. Biochemistry 103, 1988, 1039-1044）や、ココリオボラス・ルナツス（J. Steroid Biochem. Molec.Biol. Vol 59, 1996, No. 2, p. 205-214）といったカビから、ストレプトマイセス科のバクテリア（Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Vol. 356, 1975, 1843-1852）や、シュードモナス科のバクテリア（The Journal of Biological Chemistry, Vol. 252 No.ll, June 10, 1977, p. 3775-3783）や、アルカリジェネス科のバクテリア（The Journal of Biological Chemistry, Vol. 260, No. 25, Nov 5, 1985, p. 13648-13655）から得られることが知られている。
【００５０】
１７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、１７−βハイドロキシステロイド類の酸化のために、および、例えば、４−アンドロステン−３，１７−ジオン、アンドロステロン、エストステロンといった１７−ケトステロイド類の還元のために、それぞれ使用することができる。
【００５１】
１７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素活性を有する対応する酵素類は、ユーバクテリウムのスピーシーズ（Journal of Lipid Research, Vol. 35, 1994, p. 922-929）から得られることが記載されている。
【００５２】
１１−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類は、高等哺乳類から得られることが知られており、例えば、コルチゾルをコルチゾーンに酸化するために使用することが可能である。
【００５３】
しかしながら、ステロイド骨格上において、酸化反応および還元反応を触媒する他の何れのオキシドレダクターゼも、上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素として使用することができる。
【００５４】
前述したように、例えば、シュードモナス・テストステローニから得られた１７−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類、クロストリジウム・インノクムから得られた３−βハイドロキシステロイド脱水素酵素類、またはバクテロイデス・フラギリスから得られた７−αハイドロキシステロイド脱水素酵素類を用いたとき、ＮＡＤＨまたはＮＡＤを再生するための、好適な第２級アルコール脱水素酵素類は、カンディダ属およびピキア属の酵母類から分離される。例えば、カルボニルレダクターゼは、カンディダ・パラプシロリス（ＣＲＣＲ）（US 5,523,223, US 5,763,236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15(l l):950-8）、ピキア・カプスラータ（DE 10327454.4）、ピキア・ファリノーザ（A 1261/2005, Kl. C12N）、ピキア・フィンランディカ（EP 1179595 Al）、カンディダ・ネモデンドラ（A 1261/2005, Kl. C12N）、ピキア・トレハロフィリア（A 1261/2005, Kl. C12N）、ロードトルーラ・ムキラギノーザ（A 1261/2005, Kl. C12N）、ロダロマイセス・エロンギスポーラス（A 1261/2005, Kl. C12N）、ピキア・スチピディス（A 1261/2005, Kl. C12N）から得られる。
【００５５】
さらに、ＮＡＤＨの再生もまた、上述したような、第２級アルコール脱水素酵素類／オキシドレダクターゼにより改善される。第２級アルコール脱水素酵素類は、ロードコッカス・エリスロポリス（US 5,523,223）、ノルカディア・フスカ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999）, pp. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62(4):380-6, Epub 2003 Apr 26）、ロードコッカス・ルバー（J. Org. Chem. 2003 Jan 24; 8(2):402-6.）、またはマイクロバクテリウムのスピーシーズ（A 1261/2005, Kl. C12N）からといった、放線細菌から分離される。
【００５６】
例えば、前述したように、クロストリジウム・パラプトリフィカムからの１２α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素類、ユーバクテリウムのスピーシーズからの１７α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素類、または、クロストリジウム・ソルデリイからの７α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素類を用いたとき、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰのそれぞれを再生するための、好適な第２級アルコール脱水素酵素類／オキシドレダクターゼは、ラクトバシラレス目（ラクトバシラス・ケフィール（US 5,200,335）、ラクトバシラス・ブレビス（DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8）、ラクトバシラス・マイノール（DE 10119274）、リューコノストック・カルノサム（A 1261/2005, Kl. C12N））の器官から、またはサーモアネロビウム・ブロッキイ、サーモアネロビウム・エタノリカス、あるいはクロストリジウム・ベイジェリンキイから得られる。
【００５７】
ハイドロキシステロイド脱水素酵素およびオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素の双方は、エシェリチア・コリ（Ｅ．coli）菌内にて、遺伝子組み換えにより上書きされた状態にて得られたものを用いることが好ましい。本発明に係るプロセスでは、ハイドロキシステロイド脱水素酵素およびアルコール／オキシドレダクターゼ脱水素酵素の双方は、完全に精製された状態、部分的に精製された状態、各細胞内に含まれたクルードな状態の何れでも使用可能である。よって、使用される上記細胞は、原型のまま、浸潤された状態、または分解された状態の何れでもよい。
【００５８】
オキソステロイド化合物およびハイドロキシステロイド化合部のそれぞれを、１ｋｇにて変換するには、５００００Ｕから１０×１０6Ｕまでのハイドロキシステロイド脱水素酵素および５００００Ｕから１０×１０6Ｕまでのアルコール脱水素酵素が使用される（上限は無し）。上記酵素の単位１Ｕは、１分間に１μモルのオキソステロイド化合物を変換するために必要とされるハイドロキシステロイド脱水素酵素の酵素量を示し、また、１分間に１μモルの２−アルコールを酸化するために必要とされるアルコール脱水素酵素の酵素量を示す。オキソステロイド化合物およびハイドロキシステロイド化合部のそれぞれ１ｋｇを、変換するには、ハイドロキシステロイド脱水素酵素を含むＥ．coliの１０ｇから５００ｇのウエットバイオマス、また、アルコール／オキシドレダクターゼ脱水素酵素を含むＥ．coliの１０ｇから５００ｇのウエットバイオマスが使用される（上限無し）。
【００５９】
上記プロセスでは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生は、酵素の組み合わせ法により良好な結果が得られる。
【００６０】
本発明に係るプロセスでは、コファクター、ハイドロキシステロイド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、水、オキソステロイド化合物、ハイドロキシステロイド化合物におけるそれぞれの回収のために、オキソステロイド化合物、ハイドロキシステロイド化合物の変換は、２−アルコールまたはケト化合物を含む２相システムにて生じさせることが好ましい。
【００６１】
さらに、コファクターの再生に関与しない、つまり、アルコール脱水素酵素により酸化され得る水酸基を含まない、かつ、同様に還元されないケトン基を含まない、別の有機溶媒を含んでもよい。
【００６２】
上記２相システムでの、水と相溶性でない有機溶媒成分の割合（容量）は、上記反応でのトータル容量に対して、１０％から９０％の範囲内、より好ましくは、２０％から８０％の範囲内である。水性部分（容量）は、上記反応バッチでのトータル容量に対して、９０％から１０％の範囲内、より好ましくは、８０％から２０％の範囲内である。
【００６３】
上記水に対し、バッファを加えてもよい。上記バッファとしては、例えば、５から１０、より好ましくは６から９までのｐＨ値を有する、リン酸カリウム、トリス／ＨＣｌ、グリシンまたはトリエタノールアミンの各バッファを挙げることができる。さらに、上記バッファは、上記双方の各酵素を安定化または活性化するための、各イオン、例えば、マグネシウムイオンまたは亜鉛イオンを含んでもよい。
【００６４】
その上、ハイドロキシステロイド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素の両酵素を安定化するための別の添加物を、本発明のプロセスに用いてもよい。上記添加物としては、例えば、グリセロール、ソルビトール、１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００６５】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、水性相に対して、０．００１ｍＭから１０ｍＭの範囲内、特に、０．０１ｍＭから１．０ｍＭの範囲内である。使用する各酵素の固有の各物性に依存して、反応温度は、１０度から７０度、より好ましくは２０度から３５度までの範囲内である。
【００６６】
本発明のプロセスにおいて達成されるＴＴＮ（トータルターンオーバー数＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）は、上記プロセスを用いることによって、１０2から１０5までの範囲内であり、普通は、ＴＴＮ＞１０3が選択される。
【００６７】
通常、還元されるオキソステロイド化合物類およびハイドロキシステロイド化合物類は、それぞれ、水への溶解性に乏しいものである。上記反応の間、基質は、完全に溶解した状態でも、不完全に溶解した状態で存在していてもよい。もし、反応混合物中において、基質が完全には溶解されていないとき、上記基質の一部は、固体状態となり、それゆえ、第３の固相を形成してもよい。
【００６８】
上記変換の間、上記反応混合物は、一時的にエマルジョンを形成していてもよい。本発明のプロセスでは、還元されるオキソステロイド化合物類および酸化されるハイドロキシステロイド化合物類のそれぞれは、上記反応バッチのトータル容量に対して、５０ｇ／リットル以上の量にて使用される。好ましくは、オキソステロイド化合物およびハイドロキシステロイド化合物類の５０ｇ／リットルから４００ｇ／リットルの範囲内にて、特に好ましくは、５０ｇ／リットルから２００ｇ／リットルの範囲内にて使用される。
【００６９】
コファクターの再生に関与しない、他の好適な有機溶媒は、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ヘプタン、ヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、またはシクロヘキアン、またはそれらの互いに異なる組成の混合物が挙げられる。
【００７０】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生は、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールの酸化によって達成される。上記再生では、反応生成物として、一般式ＲｘＲｙＣ＝ＯまたはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンのケトン類が形成される。好ましい第２級アルコール類は、イソプロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、２−オクタノール、４−メチル−２−ペンタノール、５−メチル−２−ヘキサノールといった脂肪族の２−アルコール類と共に、シクロヘキサノール、シクロペンタノールといった環状の第２級アルコール類である。原理的には、１，４−シクロヘキサンジオールといったジオール類の使用も同様に想定内である。
【００７１】
ＮＡＤ（Ｐ）の再生は、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンの還元によって達成される。上記再生では、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコール類またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナール類が、反応生成物として形成される。好ましいケト型化合物は、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、４−メチル−２−ペンタノン、５−メチル−２−ヘキサノンといったケトン類と共に、シクロヘキサノン、シクロペンタノンといった環状のケトン類である、原理的には、１，４−シクロヘキサンジオンといったジオン類の使用も同様に想定内である。
【００７２】
本発明に係るプロセスは、例えば、ガラスまたは金属からなる反応容器内にて実行される。上記反応の目的のために、各組成は、上記反応容器内に個別に送られ、例えば、窒素または空気の雰囲気下にて攪拌される。使用されるオキソステロイド化合物に応じて、反応時間は、１時間から９６時間までの範囲内、特に２時間から４８時間までの範囲内である。この期間では、オキソステロイド化合物が、対応するハイドロキシステロイド化合物に少なくとも５０％まで還元され、また、ハイドロキシステロイド化合物が、オキソステロイド化合物に、少なくとも５０％まで酸化される。
【００７３】
以下では、本発明が、各実施例によってさらに詳細に説明される。
【００７４】
（実施例１）アンドロステン−３，１７−ジオンの１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）への還元
Ａ）補酵素再生のための４−メチル−２−ペンタノールを有する２相システム
１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）の合成のために、０．４ミリリットルの４−メチル−２−ペンタノールに溶解させた、１００ｍｇのアンドロステン−３，１７−ジオンを、ＮＡＤを０．１ｍｇ、シュードモナス・テストステローニからの遺伝子組み換え１７−β−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P 19871）を３０単位（Ｕ）、ピキア・カプスラータからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE-A 103 27 454）を５０単位（Ｕ）を含む、０．５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのアンドロステン−３，１７−ジオンの濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００７５】
上記反応が完了したとき、反応混合物は、例えば、上記反応混合物を有機溶媒にて抽出し、続いて、上記溶媒を蒸留により除去することによって処理されてもよい。
【００７６】
２４時間後、使用されたアンドロステン−３，１７−ジオンの約９４％が、１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）に変換されていた。
【００７７】
アンドロステン−３，１７−ジオンの、１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）への変換は、ガスクロマトグラフィーによりモニターされ確認された。上記変換のモニターの目的のために、ガスクロマトグラフィー装置（ＧＣ−１７Ａ、島津社製）が、キラル分離用カラムリポデックスＥ（１２ｍ、マケリ−ナーゲル社製、デュレン、ドイツ）、フレームイオン化検出器、キャリアガスとしてヘリウムを使用して用いられた。
【００７８】
Ｂ）補酵素再生のための酢酸ブチルおよび２−プロパノールを有する２相システム
１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）の合成のために、０．３ミリリットルの酢酸ブチルおよび０．１ミリリットルの２−プロパノールに溶解させた、１００ｍｇのアンドロステン−３，１７−ジオンを、ＮＡＤを０．１ｍｇ、シュードモナス・テストステローニからの遺伝子組み換え１７−β−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P 19871）を３０単位（Ｕ）、ピキア・カプスラータからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE-A 103 27 454）を５０単位（Ｕ）を含む、０．５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのアンドロステン−３，１７−ジオンの濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００７９】
上記反応が完了したとき、反応混合物は、例えば、上記反応混合物を有機溶媒にて抽出し、続いて、上記溶媒を蒸留により除去することによって処理されてもよい。
【００８０】
２４時間後、使用されたアンドロステン−３，１７−ジオンの約９０％−９５％が、１７−βハイドロキシ−４−アンドロステン−３−オン（テストステロン）に変換されていた。
【００８１】
（実施例２）ケトリソコール酸のケノリソコール酸への還元
Ａ）サーモアナエロビウム・ブロキイ由来のＡＤＨ／２相システムによる補酵素の再生
３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケノデオキシコール酸）の合成のために、０．５ミリリットルのメチルプロパノールに溶解させた、１００ｍｇの３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コール酸（ケトリソコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンスからの遺伝子組み換え７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）を１０単位（Ｕ）、サーモアナエロビウム・ブロキイからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素を１０単位（Ｕ）を含む、０．２ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ＝８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケトリソコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００８２】
２４時間後、使用されたケトリソコール酸の約９０％−９８％が、ケノデオキシコール酸に変換されていた。
【００８３】
ケトリソコール酸のケノデオキシコール酸への変換は、ＨＰＬＣによってモニターされ確認された。上記ＨＰＬＣのために、分離用カラムＥＣ１２５／４ネクレオデュール１００−５ Ｃ１８ec（マケリ−ナーゲル社製、デュレン、ドイツ）が、溶離液メタノール／水（８０／２０）を等濃度にて用いて使用された。
【００８４】
Ｂ）ラクトバチルス由来のＡＤＨ（DE 10119274）／２相システムによる補酵素の再生
３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケノデオキシコール酸）の合成のために、０．５ミリリットルのオクタノールに溶解させた、１００ｍｇの３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コール酸（ケトリソコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンスからの遺伝子組み換え７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）を１０単位（Ｕ）、ラクトバチルスからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE 10119274）を１０単位（Ｕ）を含む、０．３ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミンバッファ、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケトリソコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００８５】
２４時間後、使用されたケトリソコール酸の約７０％−８０％が、ケノデオキシコール酸に変換されていた。
【００８６】
（実施例３）１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの１７−β−ハイドロキシ−１，４−アンドロスタジエン−３−オンへの還元
１７−β−ハイドロキシ−１，４−アンドロスタジエン−３−オンの合成のために、０．４ミリリットルの４−メチル−２−ペンタノールに溶解させた、１００ｍｇの１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンを、ＮＡＤを０．１ｍｇ、シュードモナス・テストステローニからの遺伝子組み換え１７−β−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P 19871）を３０単位（Ｕ）、ピキア・カプスラータからの遺伝子組み換えアルコール脱水素酵素（DE-A 103 27 454）を５単位（Ｕ）を含む、０．５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ＝７．１、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中での１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００８７】
上記反応が完了したとき、反応混合物は、例えば、上記反応混合物を有機溶媒にて抽出し、続いて、上記溶媒を蒸留により除去することによって処理されてもよい。
【００８８】
２４時間後において、使用された１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの約９０％−９８％が、１７−βハイドロキシ−４−アンドロスタジエン−３−オンに変換されていた。
【００８９】
１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンの、１７−βハイドロキシ−４−アンドロスタジエン−３−オンへの変換は、ガスクロマトグラフィーによりモニターされ確認された。上記変換のモニターの目的のために、マススペクトル測定装置付きのガスクロマトグラフィー装置（オートシステムＸＬ、パーキンエルマー社製）が、ＦＳ−キャピラリーカラム（オプチマ−５ＭＳ、マケリ−ナーゲル社製、デュレン、ドイツ）、キャリアガスとしてヘリウムを使用して用いられた。
【００９０】
（実施例４）ケノリソコール酸のケトリソコール酸への酸化
Ａ）サーモアナエロビウム・ブロキイ由来のＡＤＨ／２相システムによる補酵素の再生
３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コラン酸（ケトリソコール酸）の合成のために、０．５ミリリットルのメチルプロパノールに溶解させた、１００ｍｇの３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケのデオキシコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンスからの７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）の遺伝子が組み込まれて上記７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを１０ｍｇ、サーモアナエロビウム・ブロキイからのアルコール脱水素酵素の遺伝子が組み込まれて上記アルコール脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを５ｍｇを含む、０．４ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ＝８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケノデオキシコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００９１】
２４時間後、使用されたケノデオキシコール酸の約８０％が、ケトリソシコール酸に変換されていた。
【００９２】
ケノデオキシコール酸のケトリソシコール酸への変換は、薄層クロマトグラフィーによりモニターされ確認された。
【００９３】
Ｂ）ラクトバチルス由来のＡＤＨ（DE 10119274）／２相システムによる補酵素の再生
３α−ハイドロキシ−７α−オキソ−５−β−コラン酸（ケトリソコール酸）の合成のために、０．７ミリリットルのメチルイソブチルケトンに溶解させた、１００ｍｇの３α−７α−ジハイドロキシ−５−β−コラン酸（ケノデオキシコール酸）を、ＮＡＤＰを０．１ｍｇ、クロストリジウム・サイデンス由来の７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素（Pubmed AAB61151）の遺伝子が組み込まれて上記７−α−ハイドロキシステロイド脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを１０ｍｇ、ラクトバチルス由来のアルコール脱水素酵素（DE 10119274）の遺伝子が組み込まれて上記アルコール脱水素酵素が過剰に発現したＥ．coliのウエットバイオマスを５ｍｇ含む、０．１５ミリリットルのバッファ（１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ＝７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）に加える。上記混合物を、常時攪拌しながら、２４時間、室温にて反応させる。上記トータル反応容量中でのケノデオキシコール酸の濃度は、約１００ｇ／リットルである。
【００９４】
２４時間後、使用されたケノデオキシコール酸の９０％以上が、ケトリソコール酸に変換されていた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つのオキソ基を有する下記のステロイド構造（ＡＢＣＤ）を含む化合物（オキソステロイド化合物）のエナンチオ選択的な酵素的還元のためのプロセスであって、
【化１】
上記オキソステロイド化合物は、コファクターＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素にて還元され、
ａ）上記オキソステロイド化合物は５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、酸化状態のコファクターＮＡＤまたはＮＡＤＰは、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールの酸化によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールに対する酸化のためにそれぞれ使用される、ことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
上記オキソステロイド化合物として、
【化２】
上記の一般式（Ｉ）にて示される化合物が使用され、
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4＋Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、オキソ基、または、Ｒ5は、ＣＯＲ10−部であり、
【化３】
上記オキソステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物であることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
上記一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールとしては、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、５−メチル−２−ヘキサノール、または２−オクタノールを用い、上記シクロアルコールとしては、シクロヘキサノールを用いることを得ちゅとする請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
上記プロセスは、水性および有機溶媒の２相システム内にて実行されることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
他の有機溶媒として、ジエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、ヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを、さらに用いることを特徴とする請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
ＴＴＮ（トータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）が、１０3以上であることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
用いたオキソステロイド化合物の少なくとも５０％が、ハイドロキシステロイド化合物に２時間ないし９６時間以内に還元されることを特徴とする請求項１ないし６の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
上記オキソステロイド化合物として、
【化４】
ケトリソコール酸（式（II））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
上記オキソステロイド化合物として、
【化５】
デクサメサゾン（式（III））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
上記オキソステロイド化合物として、
【化６】
４−アンドロステン−３，１７−ジオン（式（IV））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
上記オキソステロイド化合物として、
【化７】
１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（式（Ｖ））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
上記オキソステロイド化合物として、
【化８】
エストロン（式（VI））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
上記オキソステロイド化合物として、
【化９】
プレグネノロン（式（VII））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
上記オキソステロイド化合物として、
【化１０】
コルチゾーン（式（VIII））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つの水酸（ハイドロキシ）基を有するステロイド構造（ＡＢＣＤ、つまりハイドロキシステロイド）を含む化合物（ハイドロキシステロイド化合物）の酵素的酸化のためのプロセスであって、
【化１１】
上記ハイドロキシステロイド化合物は、コファクター（共存因子）であるＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素により酸化され、
ａ）上記ハイドロキシステロイド化合物は５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、還元状態のコファクターＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンの還元によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンに対する還元のためにそれぞれ使用されることを特徴とするプロセス。
【請求項１６】
上記ハイドロキシステロイド化合物として、
【化１２】
上記一般式（Ｉ）にて示される化合物を用い、
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、水酸基であり、
【化１３】
上記ハイドロキシステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物であることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
上記一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケトンとして、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノン、４−メチル−２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、５−メチル−２−ヘキサノン、または２−オクタノンを用い、上記シクロアルカノンとして、シクロヘキサノンを用いることを特徴とする請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
上記プロセスは、水性および有機溶媒の２相システム内にて実行されることを特徴とする請求項１５ないし１７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
他の有機溶媒として、ジエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、ヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを、さらに用いることを特徴とする請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
ＴＴＮ（トータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝酸化されたハイドロキシステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）が、１０3以上であることを特徴とする請求項１５ないし１９の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
用いたハイドロキシステロイド化合物の少なくとも５０％が、オキソステロイド化合物に２時間ないし９６時間以内に酸化されることを特徴とする請求項１５ないし２０の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１】
１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つのオキソ基を有する下記のステロイド構造（ＡＢＣＤ）を含む化合物（オキソステロイド化合物）のエナンチオ選択的な酵素的還元のためのプロセスであって、
【化１】
上記オキソステロイド化合物は、コファクターＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素にて還元され、
ａ）上記オキソステロイド化合物は５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、酸化状態のコファクターＮＡＤまたはＮＡＤＰは、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールの酸化によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールの酸化またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカナールに対する酸化のためにそれぞれ使用される、ことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
上記オキソステロイド化合物として、
【化２】
上記の一般式（Ｉ）にて示される化合物が使用され、
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4＋Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、オキソ基、または、Ｒ5は、ＣＯＲ10−部であり、
【化３】
上記オキソステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物であることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
上記一般式ＲｘＲｙＣＨＯＨにて示される第２級アルコールとしては、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、５−メチル−２−ヘキサノール、または２−オクタノールを用い、上記シクロアルコールとしては、シクロヘキサノールを用いることを得ちゅとする請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
上記プロセスは、水性および有機溶媒の２相システム内にて実行されることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
他の有機溶媒として、ジエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、ヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを、さらに用いることを特徴とする請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
ＴＴＮ（トータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝還元されたオキソステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）が、１０3以上であることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
用いたオキソステロイド化合物の少なくとも５０％が、ハイドロキシステロイド化合物に２時間ないし９６時間以内に還元されることを特徴とする請求項１ないし６の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
上記オキソステロイド化合物として、
【化４】
ケトリソコール酸（式（II））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
上記オキソステロイド化合物として、
【化５】
デクサメサゾン（式（III））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
上記オキソステロイド化合物として、
【化６】
４−アンドロステン−３，１７−ジオン（式（IV））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
上記オキソステロイド化合物として、
【化７】
１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（式（Ｖ））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
上記オキソステロイド化合物として、
【化８】
エストロン（式（VI））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
上記オキソステロイド化合物として、
【化９】
プレグネノロン（式（VII））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
上記オキソステロイド化合物として、
【化１０】
コルチゾーン（式（VIII））を用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
１以上のヘテロ原子、１以上の二重結合、および／または環構造内に芳香族組成を含み、かつ、ステロイド環構造内の３，７，１１，１２または１７位に、またはステロイド骨格の何れかの炭素原子部位のα位置に、少なくとも一つの水酸（ハイドロキシ）基を有するステロイド構造（ＡＢＣＤ、つまりハイドロキシステロイド）を含む化合物（ハイドロキシステロイド化合物）の酵素的酸化のためのプロセスであって、
【化１１】
上記ハイドロキシステロイド化合物は、コファクター（共存因子）であるＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下にてハイドロキシステロイド脱水素酵素により酸化され、
ａ）上記ハイドロキシステロイド化合物は５０ｇ／リットル以上の濃度にて反応に供給され、
ｂ）上記ハイドロキシステロイド脱水素酵素により形成された、還元状態のコファクターＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンの還元によって連続的に再生され（Ｒｘ、Ｒｙは、それぞれ独立に、水素、分枝または非分枝のＣ１−Ｃ８のアルキル基、および、Ｃtotal≧３を示す）、
ｃ）別のオキシドレダクターゼ／アルコール脱水素酵素が、一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケト型化合物の還元またはＣ４−Ｃ６のシクロアルカノンに対する還元のためにそれぞれ使用されることを特徴とするプロセス。
【請求項１６】
上記ハイドロキシステロイド化合物として、
【化１２】
上記一般式（Ｉ）にて示される化合物を用い、
Ｒ1は、水素、メチル基、水酸基、またはオキソ基を示し、
Ｒ2は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ3は、水素、水酸基、オキソ基、またはメチル基を示し、
Ｒ4は、水素、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素、ＣＯＲ10−部（Ｒ10は、水酸基にて非置換または置換された、あるいは、Ｃ１−Ｃ４のカルボキシル基にて非置換または置換されたＣ１−Ｃ４のアルキル基）、または、Ｒ4およびＲ5が共にオキソ基を示し、
Ｒ6は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ7は、水素、メチル基、オキソ基、または水酸基を示し、
Ｒ8は、水素、メチル基、またはハロゲン基を示し、
Ｒ9は、水素、メチル基、水酸基、オキソ基またはハロゲン基を示し、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9の少なくとも一つは、水酸基であり、
【化１３】
上記ハイドロキシステロイド化合物の上記構造要素は、
ベンゼン環、または、０、１、または２個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ６の環状化合物であることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
上記一般式ＲｘＲｙＣＯにて示されるケトンとして、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノン、４−メチル−２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、５−メチル−２−ヘキサノン、または２−オクタノンを用い、上記シクロアルカノンとして、シクロヘキサノンを用いることを特徴とする請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
上記プロセスは、水性および有機溶媒の２相システム内にて実行されることを特徴とする請求項１５ないし１７の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
他の有機溶媒として、ジエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、ヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを、さらに用いることを特徴とする請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
ＴＴＮ（トータルターンオーバー数（ＴＴＮ＝酸化されたハイドロキシステロイド化合物のモル数／使用されたコファクターのモル数）が、１０3以上であることを特徴とする請求項１５ないし１９の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
用いたハイドロキシステロイド化合物の少なくとも５０％が、オキソステロイド化合物に２時間ないし９６時間以内に酸化されることを特徴とする請求項１５ないし２０の何れか１項に記載のプロセス。
【公表番号】特表２００９−５３５０１７（Ｐ２００９−５３５０１７Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４６３３（Ｐ２００９−５０４６３３）
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１８６４４
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０６３７１３１６）アイイーピー ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１８６４４
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０６３７１３１６）アイイーピー ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]