オリゴ糖、その調製方法並びに使用、及び同含有薬学的組成物
本発明は、オリゴ糖、該オリゴ糖の調製方法及び使用、並びに該オリゴ糖を含有する薬学的組成物に関する。とりわけ、本発明は、特に、転移形成を予防及び阻害するための、癌治療で使用できるオリゴ糖に関する。本発明のオリゴ糖は、例えば、初期の乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌又は膵臓癌で使用できる。前記オリゴ糖は、皮下、経口又は静脈内の各投与が可能である。更に、前記オリゴ糖は、単独で、又は、例えば、ドセタキセル若しくはパクリタキセルなどの細胞障害剤などの他の抗癌剤とともに使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化学化合物、特に、新規オリゴ糖に関し、これらを調製する方法、これらの使用、及びこれらを含有する薬学的組成物に関する。これらのオリゴ糖は、癌の治療、特に、転移形成の予防及び阻害に対し、有効である。
【０００２】
より具体的には、第１の態様において、本発明は、本来抗血栓特性を有する多糖類を解重合する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗血栓特性を有する多糖類の解重合するための方法は公知である。これらの方法の一般的な態様は：
−出発多糖類を医薬製品として使用する際に起こる、副作用を制限するために、更に低い平均分子量のオリゴ糖を得ることを目的とし；
−解重合後、満足のいく抗血栓活性を維持することである。
【０００４】
ヘパリン又はエノキサパリン、チンザパリン若しくはフラグミンなどの低分子量のヘパリンなどの抗血栓特性を有する市販の多糖類は、全てヘパラナーゼ阻害剤である。
【０００５】
正常な生理学的状態のもとでは、細胞が酵素のヘパラナーゼを発現する。この酵素により、間接的に、有糸分裂誘発、新血管形成及び組織修復を調節することが可能となる。ヘパラナーゼの作用機序の１つは、へパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を開裂することである。このグリコサミノグリカンは、内皮細胞の表面に存在し、基底膜（細胞外マトリックス）の結合を確保している。へパラン硫酸プロテオグリカンの開裂は、ＦＧＦ２などの成長因子の放出をもたらす。この成長因子の放出は、有糸分裂誘発及び血管新生にとって必要である。しかし、これは、これらの生物学的機序を引き起こすのに十分でなく、タンパク質のアロステリック修飾を起こし、その受容体との相互作用を促進するためには、ＦＧＦ２が、グリコサミノグリカンに結合する必要がある。実際、ＨＳＰＧの開裂を通して、ヘパラナーゼは、ＦＧＦ２に結合するヘパラン硫酸フラグメントを生成し、その受容体との相互作用を促進し、こうして、上述の生物学的機序を誘導する。細胞外マトリックスにおけるＨＳＰＧの開裂及び毛細血管の脱構造化により、細胞遊出が可能になる。
【０００６】
ヘパラナーゼは、腫瘍細胞によって過剰発現され、それ故、その転移及び血管新形成を促進する。これらの現象は、癌性腫瘍の増殖及び生存にとって不可欠である。
【０００７】
ヘパラン硫酸に構造的に類似のグリコサミノグリカンであるヘパリンは、ヘパラナーゼの強力な阻害剤であることが知られている。この効力は、長い間、特異的なＡＴＩＩＩ−結合配列の存在に起因すると考えられている。実際に、この配列は、ヘパラン硫酸においてはそれほどでもないが、これらの２つのグリコサミノグリカンに共通している。ヘパラナーゼ開裂域を下記に表す：
【０００８】
【化１５】
【０００９】
このα−エンドグリコシダーゼによる開裂点は、最小のＡＴＩＩＩ−結合配列の中央に位置している。従って、抗血栓及びヘパラナーゼ阻害特性が密接に関連すると考えることができる（実際に、ヘパリンは、ヘパリン硫酸に対する競合的基質である。）。その結果、抗転移物質として、このグリコサミノグリカンを使用するのは困難である。実際、その強力な抗凝血性質が、治療の限度を制限し、大量出血などの深刻な副作用を引き起こす。更に、特定の場合において、ヘパリンの反復注入は、致命的転帰をもたらす血小板減少症を引き起こす可能性がある（ヘパリン及び血小板第４因子（ＰＦ４）の結合に関する免疫反応）。
【００１０】
抗移転活性との相関関係において、オリゴ糖の構造及びそれらの抗ヘパラナーゼ特性の関連を強調した文書はほとんどない。従って、Ｂｉｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９９５；３１：１０６−１１８）は、ヘパラナーゼ阻害ヘパリン種により肺メラノーマの定着化阻害に必要とされる構造条件を特定する：ヘパラナーゼは、１６又はそれ以上の糖を含有するヘパリン断片により効果的に阻害される（要約；図２、ｐ１１０；図３、ｐ１１１；ｐ１１６、右側コラム、第２文）。六糖は、ヘパラナーゼ阻害剤として劣っていると記述されている（図８、ｐ１１５）。加えて、少なくとも４０００ダルトン以上の分子量を有する分子を用いた場合にのみ、ヘパラナーゼの阻害が可能になると言われている（要約：ｐ１１６、右側コラム、第４文）。しかしながら、ヘパラナーゼの阻害性を決定する方法は、様々な試験品の存在下で細胞外マトリックスを分解する細胞能力を評価するので、間接的な方法である（ｐ１０８；右側コラム、第２段落「Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ（硫酸化プロテオグリカンの分解）」）。従って、この方法は、ヘパラナーゼに対し特異的ではない。更に、前述の全生成物は、ヘパリンを化学的に開裂する方法（亜硝酸）により取得される（ｐ１０８；左側コラム、第２段落「Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ヘパリン由来のオリゴ糖）」。
【００１１】
次も参照されたい。
【００１２】
Ｖｌｏｄａｖｓｋｉ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ，Ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｄ．Ａ．Ｌａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２；
Ｐａｒｉｓｈ ＣＲ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｓｕｌｐｈａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｕｍｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｕｍｏｒ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｒａｎａｓｅｓ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４０：５１１−５１８，１９８７。
【００１３】
現在のところ、商業的に許容される解決策がないため、抗転移化合物に対する必要性は非常に大きい。現在公知のヘパラナーゼ阻害性多糖及びオリゴ糖は、天然原料（ヘパリン）又は、事実上、実行するのが困難な方法（いくつかの低分子量のヘパリン）から直接的に生じたもので、特に、治療を受ける患者に出血の恐れがある場合において、抗癌治療に適さない際立った抗血栓成分を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、現在の問題点の１つは、容易かつ再現性のある方法を通して、基本的に抗血栓活性のない、顕著な抗ヘパラナーゼ活性を示す生成物を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的のために、驚くべきことに、特に、Ｘａ及びＩＩａ因子の阻害性のために、その抗血栓活性が実質的に消滅するまで（＜３５ＩＵ／ｍｇ）、多糖類がヘパラナーゼ１で解重合される、抗血栓特性を本来有する多糖類を解重合するための新規の方法により、顕著な抗ヘパラナーゼ活性を保存する生成物を取得することが可能であると明らかと成った。
【００１６】
それ故に、この方法では、同時にその抗血栓要素を除去する一方で、多糖類の抗ヘパラナーゼ部位濃縮生成物を取得するための効果的な手段を構成する。本方法は、その抗血栓活性が２０ＩＵ／ｍｇ未満になるまで、多糖類の解重合が遂行される場合に、より有利に使用される。
【００１７】
とりわけ、５０００Ｄａ未満、好ましくは、３０００Ｄａ未満の平均分子量に達するまで、解重合が遂行される。あらゆる予想に反し、容易に実行可能な、この方法によって得られた生成物は、特に、優れたヘパラナーゼ阻害剤である六糖を含有する。加えて、これらの六糖は、一般的に１０００ないし２０００ダルトンであるので、平均分子量が４０００ダルトンよりもかなり低い。多糖は、好ましくはヘパリンである。六糖画分の混合物が、硫酸化六糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ及びΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩｓｇｌｕを実質的に含まなくなるまで、解重合は有利に続行される。
【００１８】
酵素は、一般的に、「生理学的」条件下、すなわち、それらが抽出される生物中で、インビボで正常に機能する条件下で使用される（特に、ｐＨ、温度、イオン強度、場合により物理的補因子（可視光など）又は化学的補因子（補酵素など）。多くの酵素は、普通、生理学的温度を超える温度、例えば４５〜５０℃などで使用できる。本発明者らの状況では、あらゆる予想に反し、許容される選択性及び反応速度の状態下、好ましくは１０〜２０℃、特に１６℃の温度で解重合が起こることが可能であり、解重合反応中に形成される、ヘパラナーゼ阻害化合物をできるだけ適切に維持することを観察した。更に、これにより、反応終了時の反応媒体中のヘパリナーゼ１の最終濃度を限定することが可能となる。実際に、ヘパラナーゼ１に対する最適反応温度を下回る温度（２５ないし４５℃とすることができる。）で、その反応を実行することにより、反応過程で、酵素の過剰な数の添加を防ぐことができる。酵素は、一般的に、基質欠乏以外の原因による反応速度の低下が観測される際に添加される。従って、特に、限られた酵素が存在するため、比較的低い反応温度を用いることにより、その後に実施される場合がある精製段階を間接的に促進することが可能である。それ故に、結果として、５〜４０℃、好ましくは１０〜２０℃の温度で、解重合を実行できる。
【００１９】
特に、二糖及び四糖などの、解重合中に形成された低分子量のオリゴ糖を取り除くことができるようにするために、本発明の方法では、ｐＨ８未満及びｐＨ５超で、多糖類の解重合の生成物が、ゲル浸透クロマトグラフィーによって精製される工程を用いて、有利に遂行される。
【００２０】
本発明の方法は、固定相（例えば、シリカ）が、（ｉ）Ｃ１８−グラフト化され、且つ（ｉｉ）セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ−ＳＡＸ）でグラフト化された逆相という、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による、後の精製段階を有利に含む。
【００２１】
前記方法は、また、好ましくは、２００〜２５０ｎｍの間で実質的に透明になる電解質を水溶液中に含有する移動相の使用を有利に含む、第１の脱塩段階も含む。許容される電解液は、ＮａＣｌを含むが、２００〜２５０ｎＭでＵＶ検出器とともに使用する場合には、過塩素酸、メタンスルホン酸塩又はＮａなどのアルカリ金属のリン酸塩の使用が望ましい。第１の脱塩段階に対して許容される固定相は、陰イオン交換樹脂である。特に好ましい樹脂は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ（Ｒ）樹脂が望ましい。
【００２２】
前記方法は、好ましくは、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０（Ｒ）型の分子排除ゲルを好ましく使用する、第２の脱塩段階も含むことが可能である。
【００２３】
ＨＰＬＣカラムから排出されたときに収集される画分中に存在する本発明の生成物を検出する別の解決策は、必要に応じて、回折装置を使用することからなり得る。
【００２４】
別の許容される脱塩技術には、例えば、重合体膜を使用する、浸透圧技術の使用を含む。
【００２５】
第２の態様において、本発明は、第１の態様に従う方法によって得られた生成物に関する。
【００２６】
Ｐｅｔｉｔｏｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８８）、２６３（１８）、８６８５−８６９０は、ヘパラナーゼ１を用いたヘパリンの部分解重合の方法により取得される生成物から単離された、ナトリウム塩形態の式ΔＩｓ−ＩＩａｉｄｕ−ＩＩｓｇｌｕの六糖を開示している。この生成物は、抗血栓活性を示さないと説明されている。該生成物の他の性質については実証されていない。
【００２７】
第３の態様において、本発明は以下の式（Ｉ）の生成物に関する。
【００２８】
【化１６】
（式中、
Ｒは、Ｈ及びＳＯ３Ｍから選択され、並びに
Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択され、
ｎ＝０、Ｒ＝ＳＯ３Ｍ及びＭ＝Ｎａの生成物は除かれる。）
【００２９】
意外にも、ＭがＬｉ、Ｎａ及びＫ、好ましくはＮａから選択される場合には、本発明の第３態様に係る生成物が、より優れた物理化学的性質を示すことが観察されている。特に、溶解度及び安定度が向上している。
【００３０】
式（Ｉ）の好ましい生成物は、ｎ＝０の生成物である。
【００３１】
第４の態様において、本発明は、六糖に関する。
【００３２】
下記の式（Ｉａ）の生成物：
【００３３】
【化１７】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００３４】
下記の式（１ｂ）の生成物：
【００３５】
【化１８】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００３６】
下記の式（Ｉｃ）の生成物：
【００３７】
【化１９】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００３８】
下記の式（Ｉｄ）の生成物：
【００３９】
【化２０】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４０】
下記の式（Ｉｅ）の生成物：
【００４１】
【化２１】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４２】
下記の式（Ｉｆ）の生成物：
【００４３】
【化２２】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４４】
下記の式（Ｉｇ）の生成物：
【００４５】
【化２３】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４６】
下記の式（Ｉｈ）の生成物：
【００４７】
【化２４】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４８】
下記の式（Ｉｊ）の生成物：
【００４９】
【化２５】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００５０】
下記の式（Ｉｋ）の生成物：
【００５１】
【化２６】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００５２】
下記の式（Ｉｍ）の生成物：
【００５３】
【化２７】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００５４】
第５の態様において、本発明は、特に癌、とりわけ乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌又は膵臓癌に関連する、細胞増殖を調節するための、前記第２の態様から第４の態様に係るいずれか１つの態様の生成物の使用に関する。
【００５５】
本発明の第５の態様に従った生成物の使用は、細胞増殖が、転移過程に関連しており、また、疾患の初期段階で使用される場合において、特に有利である。
【００５６】
本発明の第５の態様に従った生成物の使用は、第２の抗癌生成物、特に、細胞毒性生成物と組み合わせると、特に有利である。
【００５７】
第２の抗癌生成物は、シスプラシン又はオキサリプラチンなどのプラチナ誘導体、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのタキソイド、５−ＦＵ、カペシタビン又はゲムシタビンなどのプリン塩基誘導体又はピリミジン塩基誘導体、ビンクリスチン又はビンブラスチンなどのビンカ、マスタード、スタウロスポリン、エリプチシン又はイリノテカン、トポテカンなどのカンプトテシンなどの縮合芳香族複素環、ＣＡ４Ｐなどのコンブレタスタチン、並びにリン酸コルチノールなどのコルヒチン誘導体から、有利に選択される。
【００５８】
第２の抗癌生成物は、好ましくは、ドセタキセル、オキサリプラチン又はイリノテカンである。
【００５９】
様々な市販の低分子量ヘパリンによるヘパラナーゼの阻害が研究されると、それらは全てヘパラナーゼを阻害することが明白になる（エノキサパリン、チンザパリン、フラグミン等）。しかし、本発明者らは、新しい超低分子量ヘプリン（ＵＬＭＷＨ）（ＷＯ０２／０８２９５及び国際出願ＰＣＴ／ＦＲ０３／０２９６０、未公開）は、エノキサパリンよりもＡＴＩＩＩに対する親和性を伴う更に多くの配列を含むが、ヘパラナーゼを阻害しないということを観察できた。その結果、上記の理論に対する矛盾がここに存在する。
【００６０】
本発明に従って使用される方法は、特に、Ｉｓ−ＩＩａ−ＩＩｓ構造の、ＩｓｏＡＴＩＩである六糖の形成をもたらし、下記は六糖Ｉｓ−ＩＩａ−ＩＩｓ（ＩｓｏＡＴＩＩＩ）である：
【００６１】
【化２８】
【００６２】
下記の結果は、この六糖のＩｓｏ ＡＴＩＩＩが非常に優れたヘパラナーゼの阻害剤であることを示す。また、ＡＴＩＩＩに対する親和性を持たず、従って、抗血栓活性を欠くという多大な有利さを有する。本発明の大きな利点は、ヘパリノイドの抗血栓特性を、それらのヘパラナーゼ阻害性質から分離することである。ヘパリン及びＬＭＷＨと比較すると、六糖Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩの治療限界は大きく増大し、抗転移剤として使用できる可能を秘めている。本発明において、本発明者らは、それ自体の使用及び六糖のＩｓｏ ＡＴＩＩＩのみの調製又はヘパラナーゼ１を用いたヘパリンの調節された解重合から生じる、他の六糖との混合物としての調製を権利として請求する。更に、ａＸａ活性が消滅するまで、ヘパラナーゼ１を用いてヘパリンを解重合するという着想、及び抗転移剤としてのこの混合物の使用を権利として請求する。この場合、これは、非抗血栓性の、具体的には、ヘパラナーゼ阻害性のＬＭＷＨとなる。
【００６３】
本発明は、単離された又は混合物としての、以下の生成物調製及びの抗転移剤としての使用を権利として請求する。
【００６４】
【化２９】
【００６５】
実験の部
ＧＰＣ
２つのＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ２０００カラム（３００×４．６ｍｍ）及び１つのＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ガードカラム（３５×４．６ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＥＰ）を用いて、ゲル排除クロマトグラフィーを実行する。ＵＶ域２３２ｎｍにおいて、吸光光度分析法により、検出を行なう。移動相は、０．１Ｍ酢酸アンモニウムである。注入された量は５μｌである。
【００６６】
ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー
ＣＴＡ−ＳＡＸ方法により、ＨＰＬＣのモニタリングを実行する。使用したカラムは、４５℃で、０．２ｍｌ／分にて、４時間、水／メタノール（６８／３２）ｖ／ｖの混合物中の、１ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムリン酸水素溶液の浸透により、セチルトリメチルアンモニウムがその上に吸着された、３μｍ粒子のＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ（１５０×２．１ｍｍ）である。
【００６７】
この種のカラム上での分離条件は次のとおりである：グラフト化されたカラムの温度を４０℃に維持する。メタンスルホン酸を添加することにより、溶媒ＡをｐＨ３に調節した水で、溶出勾配を行なう。溶媒Ｂは、ｐＨを２．６に調節されたメタンスルホン酸アンモニウムの２Ｎ溶液である。その勾配溶出は、次のとおりである。
【００６８】
【表１】
【００６９】
使用される検出は、２３２ｎｍでのＵＶ領域における吸光光度分析法である。また、アセチル化されたオリゴ糖に対し特異的な検出として、２０２〜２４７ｎｍも使用される。
【００７０】
ＣＴＡ−ＳＡＸ上でのセミ分取クロマトグラフィー
４５℃で、２ｍｌ／分にて、４時間、水／メタノール（６８／３２）ｖ／ｖの混合物中の、１ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムリン酸水素溶液の浸透により、セチルトリメチルアンモニウム鎖がその上にグラフト化された、５μｍ粒子のＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳカラム（２５０×２０ｍｍ）上のクロマトグラフィー。室温で分離を実行する。使用される溶出勾配：溶媒Ａは、ＨＣｌを添加することによってｐＨを２．５にした水である。溶媒Ｂは、ｐＨ２．５に調節された、２Ｎ ＮａＣｌ溶液である。
【００７１】
【表２】
【００７２】
２３２ｎｍでのＵＶ域において、検出を行なう。１００ｍｇの六糖画分を、各分離において注入できる。
【００７３】
六糖Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩの調製
ヘパラナーゼ１を用いたヘパリンのＡＴＩＩＩの親和性部位の開裂によって、六糖ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ（六糖ｉｓｏ ＡＴＩＩＩ）を得る。ヘパラナーゼ１を用いたヘパリンの解重合は、内因性溶解性であり：それらの非還元末端が不飽和のオリゴ糖の混合物をもたらす。反応終了後、二糖、四糖及び六糖の混合物を得る。ヘパリンの最も硫酸化された全領域を開裂し、二糖及び四糖へ転換する。アセチル化された部分のみが、六糖形態を維持し、特に、−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ又は６ＯＨ）−ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ又は６ＯＨ）−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ（３Ｓ又は３ＯＨ，６Ｓ又は６ＯＨ）−型の鎖を維持する。
【００７４】
【化３０】
【００７５】
ヘパリンの解重合を次の条件下にて実行する：ブタの粘膜から得たヘパリン３ｇを、ｐＨ７に調節された、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ＢＳＡ、５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４の溶液３０ｍＬ中に溶解する。解重合温度は１６℃である。ヘパラナーゼ１の２ＩＵを最初に導入する。７日後、ヘパリナーゼ１の追加単位を添加する。１５日後、ヘパリンの解重合を終了したとみなす。その反応は、ＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ ２０００カラム（図１）上、又はＣＴＡ−ＳＡＸカラム（図２ａ）上のどちらかの分析用ＧＣによってモニタリングする。サイズが八糖よりも大きなオリゴ糖の割合を制限し、前記混合物中の、２つの主な硫酸化された六糖であるΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ及びΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩｓｇｌｕを、四糖に解重合した際に、酵素反応が、十分促進されたと見なすことができる。酵素反応が終わると、０．２μｍの膜を通して前記溶液をろ過し、次いで、２段階で、０．２Ｎ ＮａＣｌの移動相が循環する、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ１０（Ｂｉｏ Ｒａｄ）が充填されたＧＣカラム上に注入される（図３）。六糖のΔＩｓ−１Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕは、アルカリ溶媒中で非常に脆弱である：六糖のΔＩｓ−１Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕは、その３−Ｏ−硫酸化末端のグルコサミンを失い、ｐＨが８を超えるとすぐに五糖ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＧＩｃＡに転換される。従って、全六糖画分を、僅かに酸性化することが（ｐＨが５〜６）非常に重要である。図４には、全六糖画分のクロマトグラムを示されている。
【００７６】
最終相は、ＣＴＡ−ＳＡＸでグラフトされた、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ１８（５μｍ）が充填された、２５×２．１ｃｍのカラム上におけるセミ分取分離からなる（図５）。前記画分は、ＨＰＬＣにより制御されている。セミ分取クロマトグラフィーで使用される移動相が、塩化ナトリウム溶液であるので、試料の最終の脱塩を調製する必要がある。これは、２段階で実行される。ＮａＣｌの９５％を取り除く第１段階は、水中で１／１０に希釈された後、カラム上でそれらをろ過することによって、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｌｏｗ陰イオン交換相（Ｐａｒｍａｃｉａ）（４０×２．６ｃｍカラム）上で、前記単離された六糖を含有する画分を再濃縮することからなる。前記六糖を、最少量（約５０ｍｌ）で、１．５Ｎ ＮａＣｌＯ４溶液を用いて溶出し、過塩素酸六糖溶液を得る。
【００７７】
最終脱塩の第２段階は、前段階で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラム（１００×７ｃｍ）上で得た過塩素酸六糖の溶液を注入して実行する。２３２ｎｍにおけるＵＶ検出及び塩の検出を可能にする伝導測定器により、モニタリングを行なう。
【００７８】
六糖と過塩素酸の分離の質が不十分である場合、この工程を繰返す必要があり得る。次いで、六糖の溶液を凍結乾燥させる。このようにして、ナトリウム塩形態の六糖ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ１０８ｍｇを得る。ＨＰＬＣ純度は９２％となる（図６）。
【００７９】
ヘパラナーゼ生物学的活性アッセイ：
ヘパラナーゼの阻害能力に関するＨｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩ関連の評価を、次のように実行した。
【００８０】
放射線標識されたヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ）を、ヘパラナーゼで分解し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）及び液体シンチレーションによって収集された画分を数えることにより測定可能な、低分子量のＨＳ断片を生成する。
【００８１】
ブタ腸粘膜からの未分画ヘパリン（ナトリウム塩）（等級Ｉａ、１８３ＵＳＰ／ｍｇ）を、Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）から得た。
【００８２】
ヘパリチナーゼ（ＨＰリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．８））を、Ｓｅｉｇａｋｕ（東京、日本）から得た。
【００８３】
ＴＳＫ４０００を、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓから得て、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）から、プレカラムを備えたＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑカラムを得た。
【００８４】
代謝標識によって３５−Ｓで標識されたヘパラン硫酸塩（プロテオグリカン）を調製するために、子宮線維芽細胞株を使用した。この細胞株は、シンデカン及びグリピカンなどの、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳ−ＰＧ）を比較的大量に生成することが示されている（Ｄｒｚｅｎｉｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ９３：２８８４−２８９７，１９９９）。
【００８５】
組織培養培地中の３３μＣｉ／ｍｌの３５−Ｓ−硫酸塩の存在下で２４時間、約１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、細胞をインキュベートすることにより、この標識化を行なう。次いで、上清を収集し、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（１ｍｍｏｌ／ｌ）を添加する。試料は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを比較的大量に含有するので、またヘパラナーゼ酵素の特異性のために、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸（プロテオグリカン）の除去が必要でなく、ＨＳ−ＰＧをＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ上で、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
【００８６】
ヘパラナーゼを、フィコール勾配操作による、多形核細胞（ＰＭＮ）で濃縮された、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ、バッフィコート）から単離した。その単離したＰＭＮの濃度を２．５×１０７細胞／ｍｌに調節し、１時間、４℃で、インキュベートする。次いで、ヘパラナーゼを含有する上清を収集し、ｐＨを６．２（クエン酸−リン酸バッファ２０ｍＭ）に調節し、すぐに使用するか、又は−２０℃にて、アリコートで、凍結保存する。
【００８７】
約２２００ｃｐｍ／ｍｌ（ｃｐｍ＝計数毎分）に調節された、３５−Ｓ−標識されたヘパラン硫酸（プロテオグリカン）２００μＬを、ヘパラナーゼを含有するＰＭＮ上清１μｌで、３７℃にて、１８時間、インキュベートする。上記で得た、混合物２００μｌを、ＴＳＫ４０００ゲル浸透クロマトグラフィーカラム（ＦＰＬＣ）上で試料を採取し、その画分を収集して、液体シンチレーションカウントによって分析する。下記の式に従って、その分解量を測定した。
【００８８】
％分解＝[[Σ計数（ｃｐｍ）画分２０−３３（ＨＥＰ）−Σ計数（ｃｐｍ）画分２０−３３（ＣＯＮＴ）]／[総合計数（ｃｐｍ）画分１２−３３（ＣＯＮＴ）]]×１００。
【００８９】
例えば、％分解を下記のとおりに計算する：ヘパラナーゼでの処理後の試料の画分２０−３３における計数（ｃｐｍ）から、対照試料のバックグランドノイズ計数（ｃｐｍ）（画分２０−３３）を差し引いた合計を、カラムに用いられる総計数（画分１２−３３）で割る。補正因子を使用して、２２００計数／ｃｐｍにおける、クロマトグラフィーの様々な回数の総計数を標準化した。その結果を％分解として得る。阻害アッセイにて、対照試料（ヘパラナーゼを伴う。）の分解を１００％（分解）に固定し、その％阻害値を、これに基づき計算した。スルファターゼ活性の修正は、スルファターゼ活性が検出されない可能性があるため、必要でない。
【００９０】
次のヘパラナーゼ阻害剤：未分画ヘパリン（ＵＦ−Ｈ）及びＨｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩを、３つの異なる濃度にて、上記のプロトコルでアッセイした。その比較は、重量基準で実行した。データを、ヘパラナーゼ活性の％阻害として表す。
【００９１】
結果
まず、ヘパラナーゼアッセイを、この研究の必要性に応じて最適化した。実用的な理由から、分解アッセイにおけるインキュベーション時間を１８時間の時点で確立した。標識化の効率性及びヘパラン硫酸（プロテオグリカン）の含有量に応じて、ヘパラン硫酸（プロテオグリカン）総計数を、約２２００ｃｐｍ／試料に固定し、ヘパラン硫酸（プロテオグリカン）の１バッチで全アッセイの実行を可能にした。図１ａは、天然試料のＴＳＫ４０００ゲル浸透クロマトグラフィーを示す。図１ｂは、その試料の分子分布における、ヘパラナーゼ誘起シフトを示す。次いで、ヘパラン硫酸プロテオグリカン約８０％を分解できるヘパラナーゼ量を決定する（ヘパラン硫酸プロテオグリカン約３５％及びコンドロイチン／デルマタン硫酸プロテオグリカン約６５％を含有する試料）。従って、１０−８０％の範囲の分解は、比較的直線状であり、阻害剤の効果の決定において許容される。図１ｃは、９７．３％の阻害で、ヘパラナーゼ活性の１μｇ／ｍｌの未分画ヘパリン（ＵＦＨ）の効果を示す。
【００９２】
アッセイ状態を決定した後、ブタ腸粘膜から得た未分画ヘパリン（ＵＦＨ）の効果を測定した。図２は、用量依存的な阻害を示す。ヘパラナーゼ活性の実質的に完全な阻害が、１μｇ／ｍｌ（最終濃度）の未分画ヘパリン（ＵＦＨ）濃度にて、観察された。図７は、Ｈｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩによる用量依存阻害を示す。これらのデータに基づいて、Ｈｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩが、強度のヘパラナーゼ阻害活性を示すと結論付けることが可能である。
【００９３】
次の刊行物の内容を、参照により、本明細書に組み込む。
【００９４】
Ｃ．Ｒ．Ｐａｒｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ａｃｔａ１４７１（２００１）９９−１０８。
【００９５】
Ｍ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３（１９９５）１１３−１２４。
【００９６】
Ｉ．Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．ＩＭＡＪ２（２０００）３７−４５。
【００９７】
Ｙ．Ｍａｔｚｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６（１９８５）、１３０６−１３１３。
【００９８】
Ｚ．Ｄｒｚｅｎｉｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９９９）２８８４−２８７９。
【００９９】
オリゴ糖を豊富に含有した他の分画は、ヘパラナーゼ１による、ヘパリンの分解生成物から単離できる。従って、六糖の場合、単一のＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフの精製で十分である。この方法では、セチルトリメチルアンモニウム鎖が、４５℃にて、２ｍｌ／分で、４時間、水−メタノールの混合物（６８−３２）ｖ／ｖ中の、セチルトリメチルアンモニウムリン酸水素の１ｍＭ溶液の浸透によりその上にグラフト化された、５μｍ粒子のＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ（２５０×２０ｍｍ）カラムを使用する。
【０１００】
室温で分離を実行する。次の勾配溶出を使用する：溶媒Ａは、ＨＣｌの添加によってｐＨを２．５に調節した水である。溶媒Ｂは、ｐＨを２．５に調節したＮａＣｌの２Ｎ溶液である。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
検出をＵＶ領域の２３２ｎｍで行う。六糖画分１００ｍｇを、各分離において、注入できる。
【０１０３】
八糖及び十糖の画分の精製は、六糖画分の精製よりも更に複雑であり、一般的に、それはＩｏｎＰａｃ（Ｒ）ＡＳ１１カラム（２５０×２０ｍｍ）（Ｄｉｏｎｅｘ）上で、更なる精製を必要とする。分離は室温で実行する。勾配溶出を使用する。溶媒Ａは、過塩素酸の添加によりｐＨ３に調節した水である。溶媒Ｂは、ｐＨ３に調節されたＮａＣｌＯ４の１Ｍ溶液である。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
図８は、ＧＣより単離された各六糖、八糖及び十糖において、オリゴ糖を豊富に含有した画分から単離された生成物の同定が可能である。
【０１０６】
酵素システムにおけるヘパラナーゼ阻害剤の活性評価
フォンダパリヌクスを分解する能力により、ヘパラナーゼの活性を決定する。フォンダパリヌクスの濃度を、その抗Ｘａ因子の活性によって決定する。
【０１０７】
Ａ．物質及び方法
ヘパラナーゼは、Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ（Ｌａｂｅｇｅ、フランス）によって、調製される。
【０１０８】
Ｘａ因子をアッセイするための試薬は、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）から販売されている。
【０１０９】
本発明の化合物の漸増濃度、ヘパラナーゼ阻害剤（可変希釈量：１ｎＭ〜１０μＭ）を、ヘパラナーゼの一定濃度と混合する（各バッチにおいて、先行実験により、添加された０．４５μｇ／ｍｌのフォンダパリヌクスの分解に対し、十分な酵素活性を決定できる。）。３７℃で５分後、その混合物をフォンダパリヌクスと接触させ、３７℃で、１時間、放置する。９５℃で、５分間加熱することにより、その反応を停止する。残存のフォンダパリヌクスの濃度を、Ｘａ因子及びその特異的な発色基質（参照番号Ｓ２２２２）を添加することにより測定する。
【０１１０】
次の手順に従い、様々な混合物を調製する：
ａ）反応混合物
酢酸ナトリウムバッファ（０．２Ｍ、ｐＨ４．２）５０μｌを、フォンダパリヌクス（０．４５μｇ／ｍｌ）５０μｌ及びヘパラナーゼ溶液５９μｌと混合する。混合物を３７℃で、１時間、インキュベートし、次いで９５℃で、５分間、インキュベートする。ｐＨは、２．４から７となる。次いで、反応混合物１００μｌを、１７５ｍＭ ＮａＣｌ及び７５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ１４の５０ｍＭトリスバッファ５０μｌのと混合する。
【０１１１】
フォンダパリヌクスの抗Ｘａ因子活性を、次の方法で測定する。
【０１１２】
ｂ）フォンダパリヌクスの抗Ｘａ因子活性のアッセイ
段階ａ）で得た溶液１００μｌを、ＡＴ（０．５μｇ／ｍｌ）１００μｌと混合する。この混合物を３７℃で、２分間、維持し、次いで、Ｘａ因子（７ｎｋａｔ／ｍｌ）１００μｌを添加する。その混合物を３７℃で、２分間、維持し、発色基質（参照番号：Ｓ２２２２）（１ｍＭ）１００μｌを添加する。この混合物を３７℃で、２分間、維持し、次いで酢酸（５０％）１００μｌを添加する。
【０１１３】
光学濃度を４０５ｎｍで読み取る。
【０１１４】
阻害剤なしで対照に対し、％阻害を決定する。％阻害曲線により、ＩＣ５０を算出できる。
【０１１５】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ヘパラナーゼ１によるヘパリン解重合（ＧＣ監視）。
【図１ａ】天然ＨＳＰＧαゲル浸透クロマトグラフ。
【図１ｂ】ヘパラナーゼ処理後のゲル浸透クロマトグラフ。
【図１ｃ】未分画ヘパリンのゲル浸透クロマトグラフ。
【図２】未分画ヘパリンのヘパラナーゼ阻害活性。
【図２ａ】ヘパラナーゼ１によるヘパリン解重合（ＣＴＡ−ＳＡＸ監視）。
【図３】解重合されたヘパリンの各画分。
【図４】解重合されたヘパリンの六糖画分。
【図５】六糖画分の半分取分離。
【図６】脱塩後の六糖画分分析。
【図７】Ｈｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩのヘパラナーゼ阻害活性。
【図８】単離された各糖画分のＧＣ分析。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化学化合物、特に、新規オリゴ糖に関し、これらを調製する方法、これらの使用、及びこれらを含有する薬学的組成物に関する。これらのオリゴ糖は、癌の治療、特に、転移形成の予防及び阻害に対し、有効である。
【０００２】
より具体的には、第１の態様において、本発明は、本来抗血栓特性を有する多糖類を解重合する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗血栓特性を有する多糖類の解重合するための方法は公知である。これらの方法の一般的な態様は：
−出発多糖類を医薬製品として使用する際に起こる、副作用を制限するために、更に低い平均分子量のオリゴ糖を得ることを目的とし；
−解重合後、満足のいく抗血栓活性を維持することである。
【０００４】
ヘパリン又はエノキサパリン、チンザパリン若しくはフラグミンなどの低分子量のヘパリンなどの抗血栓特性を有する市販の多糖類は、全てヘパラナーゼ阻害剤である。
【０００５】
正常な生理学的状態のもとでは、細胞が酵素のヘパラナーゼを発現する。この酵素により、間接的に、有糸分裂誘発、新血管形成及び組織修復を調節することが可能となる。ヘパラナーゼの作用機序の１つは、へパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を開裂することである。このグリコサミノグリカンは、内皮細胞の表面に存在し、基底膜（細胞外マトリックス）の結合を確保している。へパラン硫酸プロテオグリカンの開裂は、ＦＧＦ２などの成長因子の放出をもたらす。この成長因子の放出は、有糸分裂誘発及び血管新生にとって必要である。しかし、これは、これらの生物学的機序を引き起こすのに十分でなく、タンパク質のアロステリック修飾を起こし、その受容体との相互作用を促進するためには、ＦＧＦ２が、グリコサミノグリカンに結合する必要がある。実際、ＨＳＰＧの開裂を通して、ヘパラナーゼは、ＦＧＦ２に結合するヘパラン硫酸フラグメントを生成し、その受容体との相互作用を促進し、こうして、上述の生物学的機序を誘導する。細胞外マトリックスにおけるＨＳＰＧの開裂及び毛細血管の脱構造化により、細胞遊出が可能になる。
【０００６】
ヘパラナーゼは、腫瘍細胞によって過剰発現され、それ故、その転移及び血管新形成を促進する。これらの現象は、癌性腫瘍の増殖及び生存にとって不可欠である。
【０００７】
ヘパラン硫酸に構造的に類似のグリコサミノグリカンであるヘパリンは、ヘパラナーゼの強力な阻害剤であることが知られている。この効力は、長い間、特異的なＡＴＩＩＩ−結合配列の存在に起因すると考えられている。実際に、この配列は、ヘパラン硫酸においてはそれほどでもないが、これらの２つのグリコサミノグリカンに共通している。ヘパラナーゼ開裂域を下記に表す：
【０００８】
【化１５】
【０００９】
このα−エンドグリコシダーゼによる開裂点は、最小のＡＴＩＩＩ−結合配列の中央に位置している。従って、抗血栓及びヘパラナーゼ阻害特性が密接に関連すると考えることができる（実際に、ヘパリンは、ヘパリン硫酸に対する競合的基質である。）。その結果、抗転移物質として、このグリコサミノグリカンを使用するのは困難である。実際、その強力な抗凝血性質が、治療の限度を制限し、大量出血などの深刻な副作用を引き起こす。更に、特定の場合において、ヘパリンの反復注入は、致命的転帰をもたらす血小板減少症を引き起こす可能性がある（ヘパリン及び血小板第４因子（ＰＦ４）の結合に関する免疫反応）。
【００１０】
抗移転活性との相関関係において、オリゴ糖の構造及びそれらの抗ヘパラナーゼ特性の関連を強調した文書はほとんどない。従って、Ｂｉｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９９５；３１：１０６−１１８）は、ヘパラナーゼ阻害ヘパリン種により肺メラノーマの定着化阻害に必要とされる構造条件を特定する：ヘパラナーゼは、１６又はそれ以上の糖を含有するヘパリン断片により効果的に阻害される（要約；図２、ｐ１１０；図３、ｐ１１１；ｐ１１６、右側コラム、第２文）。六糖は、ヘパラナーゼ阻害剤として劣っていると記述されている（図８、ｐ１１５）。加えて、少なくとも４０００ダルトン以上の分子量を有する分子を用いた場合にのみ、ヘパラナーゼの阻害が可能になると言われている（要約：ｐ１１６、右側コラム、第４文）。しかしながら、ヘパラナーゼの阻害性を決定する方法は、様々な試験品の存在下で細胞外マトリックスを分解する細胞能力を評価するので、間接的な方法である（ｐ１０８；右側コラム、第２段落「Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ（硫酸化プロテオグリカンの分解）」）。従って、この方法は、ヘパラナーゼに対し特異的ではない。更に、前述の全生成物は、ヘパリンを化学的に開裂する方法（亜硝酸）により取得される（ｐ１０８；左側コラム、第２段落「Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ヘパリン由来のオリゴ糖）」。
【００１１】
次も参照されたい。
【００１２】
Ｖｌｏｄａｖｓｋｉ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ，Ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｄ．Ａ．Ｌａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２；
Ｐａｒｉｓｈ ＣＲ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｓｕｌｐｈａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｕｍｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｕｍｏｒ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｒａｎａｓｅｓ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４０：５１１−５１８，１９８７。
【００１３】
現在のところ、商業的に許容される解決策がないため、抗転移化合物に対する必要性は非常に大きい。現在公知のヘパラナーゼ阻害性多糖及びオリゴ糖は、天然原料（ヘパリン）又は、事実上、実行するのが困難な方法（いくつかの低分子量のヘパリン）から直接的に生じたもので、特に、治療を受ける患者に出血の恐れがある場合において、抗癌治療に適さない際立った抗血栓成分を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、現在の問題点の１つは、容易かつ再現性のある方法を通して、基本的に抗血栓活性のない、顕著な抗ヘパラナーゼ活性を示す生成物を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的のために、驚くべきことに、特に、Ｘａ及びＩＩａ因子の阻害性のために、その抗血栓活性が実質的に消滅するまで（＜３５ＩＵ／ｍｇ）、多糖類がヘパラナーゼ１で解重合される、抗血栓特性を本来有する多糖類を解重合するための新規の方法により、顕著な抗ヘパラナーゼ活性を保存する生成物を取得することが可能であると明らかと成った。
【００１６】
それ故に、この方法では、同時にその抗血栓要素を除去する一方で、多糖類の抗ヘパラナーゼ部位濃縮生成物を取得するための効果的な手段を構成する。本方法は、その抗血栓活性が２０ＩＵ／ｍｇ未満になるまで、多糖類の解重合が遂行される場合に、より有利に使用される。
【００１７】
とりわけ、５０００Ｄａ未満、好ましくは、３０００Ｄａ未満の平均分子量に達するまで、解重合が遂行される。あらゆる予想に反し、容易に実行可能な、この方法によって得られた生成物は、特に、優れたヘパラナーゼ阻害剤である六糖を含有する。加えて、これらの六糖は、一般的に１０００ないし２０００ダルトンであるので、平均分子量が４０００ダルトンよりもかなり低い。多糖は、好ましくはヘパリンである。六糖画分の混合物が、硫酸化六糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ及びΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩｓｇｌｕを実質的に含まなくなるまで、解重合は有利に続行される。
【００１８】
酵素は、一般的に、「生理学的」条件下、すなわち、それらが抽出される生物中で、インビボで正常に機能する条件下で使用される（特に、ｐＨ、温度、イオン強度、場合により物理的補因子（可視光など）又は化学的補因子（補酵素など）。多くの酵素は、普通、生理学的温度を超える温度、例えば４５〜５０℃などで使用できる。本発明者らの状況では、あらゆる予想に反し、許容される選択性及び反応速度の状態下、好ましくは１０〜２０℃、特に１６℃の温度で解重合が起こることが可能であり、解重合反応中に形成される、ヘパラナーゼ阻害化合物をできるだけ適切に維持することを観察した。更に、これにより、反応終了時の反応媒体中のヘパリナーゼ１の最終濃度を限定することが可能となる。実際に、ヘパラナーゼ１に対する最適反応温度を下回る温度（２５ないし４５℃とすることができる。）で、その反応を実行することにより、反応過程で、酵素の過剰な数の添加を防ぐことができる。酵素は、一般的に、基質欠乏以外の原因による反応速度の低下が観測される際に添加される。従って、特に、限られた酵素が存在するため、比較的低い反応温度を用いることにより、その後に実施される場合がある精製段階を間接的に促進することが可能である。それ故に、結果として、５〜４０℃、好ましくは１０〜２０℃の温度で、解重合を実行できる。
【００１９】
特に、二糖及び四糖などの、解重合中に形成された低分子量のオリゴ糖を取り除くことができるようにするために、本発明の方法では、ｐＨ８未満及びｐＨ５超で、多糖類の解重合の生成物が、ゲル浸透クロマトグラフィーによって精製される工程を用いて、有利に遂行される。
【００２０】
本発明の方法は、固定相（例えば、シリカ）が、（ｉ）Ｃ１８−グラフト化され、且つ（ｉｉ）セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ−ＳＡＸ）でグラフト化された逆相という、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による、後の精製段階を有利に含む。
【００２１】
前記方法は、また、好ましくは、２００〜２５０ｎｍの間で実質的に透明になる電解質を水溶液中に含有する移動相の使用を有利に含む、第１の脱塩段階も含む。許容される電解液は、ＮａＣｌを含むが、２００〜２５０ｎＭでＵＶ検出器とともに使用する場合には、過塩素酸、メタンスルホン酸塩又はＮａなどのアルカリ金属のリン酸塩の使用が望ましい。第１の脱塩段階に対して許容される固定相は、陰イオン交換樹脂である。特に好ましい樹脂は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ（Ｒ）樹脂が望ましい。
【００２２】
前記方法は、好ましくは、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０（Ｒ）型の分子排除ゲルを好ましく使用する、第２の脱塩段階も含むことが可能である。
【００２３】
ＨＰＬＣカラムから排出されたときに収集される画分中に存在する本発明の生成物を検出する別の解決策は、必要に応じて、回折装置を使用することからなり得る。
【００２４】
別の許容される脱塩技術には、例えば、重合体膜を使用する、浸透圧技術の使用を含む。
【００２５】
第２の態様において、本発明は、第１の態様に従う方法によって得られた生成物に関する。
【００２６】
Ｐｅｔｉｔｏｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８８）、２６３（１８）、８６８５−８６９０は、ヘパラナーゼ１を用いたヘパリンの部分解重合の方法により取得される生成物から単離された、ナトリウム塩形態の式ΔＩｓ−ＩＩａｉｄｕ−ＩＩｓｇｌｕの六糖を開示している。この生成物は、抗血栓活性を示さないと説明されている。該生成物の他の性質については実証されていない。
【００２７】
第３の態様において、本発明は以下の式（Ｉ）の生成物に関する。
【００２８】
【化１６】
（式中、
Ｒは、Ｈ及びＳＯ３Ｍから選択され、並びに
Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択され、
ｎ＝０、Ｒ＝ＳＯ３Ｍ及びＭ＝Ｎａの生成物は除かれる。）
【００２９】
意外にも、ＭがＬｉ、Ｎａ及びＫ、好ましくはＮａから選択される場合には、本発明の第３態様に係る生成物が、より優れた物理化学的性質を示すことが観察されている。特に、溶解度及び安定度が向上している。
【００３０】
式（Ｉ）の好ましい生成物は、ｎ＝０の生成物である。
【００３１】
第４の態様において、本発明は、六糖に関する。
【００３２】
下記の式（Ｉａ）の生成物：
【００３３】
【化１７】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００３４】
下記の式（１ｂ）の生成物：
【００３５】
【化１８】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００３６】
下記の式（Ｉｃ）の生成物：
【００３７】
【化１９】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００３８】
下記の式（Ｉｄ）の生成物：
【００３９】
【化２０】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４０】
下記の式（Ｉｅ）の生成物：
【００４１】
【化２１】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４２】
下記の式（Ｉｆ）の生成物：
【００４３】
【化２２】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４４】
下記の式（Ｉｇ）の生成物：
【００４５】
【化２３】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４６】
下記の式（Ｉｈ）の生成物：
【００４７】
【化２４】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００４８】
下記の式（Ｉｊ）の生成物：
【００４９】
【化２５】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００５０】
下記の式（Ｉｋ）の生成物：
【００５１】
【化２６】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００５２】
下記の式（Ｉｍ）の生成物：
【００５３】
【化２７】
は、その第４態様に従った本発明に沿う。
【００５４】
第５の態様において、本発明は、特に癌、とりわけ乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌又は膵臓癌に関連する、細胞増殖を調節するための、前記第２の態様から第４の態様に係るいずれか１つの態様の生成物の使用に関する。
【００５５】
本発明の第５の態様に従った生成物の使用は、細胞増殖が、転移過程に関連しており、また、疾患の初期段階で使用される場合において、特に有利である。
【００５６】
本発明の第５の態様に従った生成物の使用は、第２の抗癌生成物、特に、細胞毒性生成物と組み合わせると、特に有利である。
【００５７】
第２の抗癌生成物は、シスプラシン又はオキサリプラチンなどのプラチナ誘導体、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのタキソイド、５−ＦＵ、カペシタビン又はゲムシタビンなどのプリン塩基誘導体又はピリミジン塩基誘導体、ビンクリスチン又はビンブラスチンなどのビンカ、マスタード、スタウロスポリン、エリプチシン又はイリノテカン、トポテカンなどのカンプトテシンなどの縮合芳香族複素環、ＣＡ４Ｐなどのコンブレタスタチン、並びにリン酸コルチノールなどのコルヒチン誘導体から、有利に選択される。
【００５８】
第２の抗癌生成物は、好ましくは、ドセタキセル、オキサリプラチン又はイリノテカンである。
【００５９】
様々な市販の低分子量ヘパリンによるヘパラナーゼの阻害が研究されると、それらは全てヘパラナーゼを阻害することが明白になる（エノキサパリン、チンザパリン、フラグミン等）。しかし、本発明者らは、新しい超低分子量ヘプリン（ＵＬＭＷＨ）（ＷＯ０２／０８２９５及び国際出願ＰＣＴ／ＦＲ０３／０２９６０、未公開）は、エノキサパリンよりもＡＴＩＩＩに対する親和性を伴う更に多くの配列を含むが、ヘパラナーゼを阻害しないということを観察できた。その結果、上記の理論に対する矛盾がここに存在する。
【００６０】
本発明に従って使用される方法は、特に、Ｉｓ−ＩＩａ−ＩＩｓ構造の、ＩｓｏＡＴＩＩである六糖の形成をもたらし、下記は六糖Ｉｓ−ＩＩａ−ＩＩｓ（ＩｓｏＡＴＩＩＩ）である：
【００６１】
【化２８】
【００６２】
下記の結果は、この六糖のＩｓｏ ＡＴＩＩＩが非常に優れたヘパラナーゼの阻害剤であることを示す。また、ＡＴＩＩＩに対する親和性を持たず、従って、抗血栓活性を欠くという多大な有利さを有する。本発明の大きな利点は、ヘパリノイドの抗血栓特性を、それらのヘパラナーゼ阻害性質から分離することである。ヘパリン及びＬＭＷＨと比較すると、六糖Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩの治療限界は大きく増大し、抗転移剤として使用できる可能を秘めている。本発明において、本発明者らは、それ自体の使用及び六糖のＩｓｏ ＡＴＩＩＩのみの調製又はヘパラナーゼ１を用いたヘパリンの調節された解重合から生じる、他の六糖との混合物としての調製を権利として請求する。更に、ａＸａ活性が消滅するまで、ヘパラナーゼ１を用いてヘパリンを解重合するという着想、及び抗転移剤としてのこの混合物の使用を権利として請求する。この場合、これは、非抗血栓性の、具体的には、ヘパラナーゼ阻害性のＬＭＷＨとなる。
【００６３】
本発明は、単離された又は混合物としての、以下の生成物調製及びの抗転移剤としての使用を権利として請求する。
【００６４】
【化２９】
【００６５】
実験の部
ＧＰＣ
２つのＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ２０００カラム（３００×４．６ｍｍ）及び１つのＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ガードカラム（３５×４．６ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＥＰ）を用いて、ゲル排除クロマトグラフィーを実行する。ＵＶ域２３２ｎｍにおいて、吸光光度分析法により、検出を行なう。移動相は、０．１Ｍ酢酸アンモニウムである。注入された量は５μｌである。
【００６６】
ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー
ＣＴＡ−ＳＡＸ方法により、ＨＰＬＣのモニタリングを実行する。使用したカラムは、４５℃で、０．２ｍｌ／分にて、４時間、水／メタノール（６８／３２）ｖ／ｖの混合物中の、１ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムリン酸水素溶液の浸透により、セチルトリメチルアンモニウムがその上に吸着された、３μｍ粒子のＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ（１５０×２．１ｍｍ）である。
【００６７】
この種のカラム上での分離条件は次のとおりである：グラフト化されたカラムの温度を４０℃に維持する。メタンスルホン酸を添加することにより、溶媒ＡをｐＨ３に調節した水で、溶出勾配を行なう。溶媒Ｂは、ｐＨを２．６に調節されたメタンスルホン酸アンモニウムの２Ｎ溶液である。その勾配溶出は、次のとおりである。
【００６８】
【表１】
【００６９】
使用される検出は、２３２ｎｍでのＵＶ領域における吸光光度分析法である。また、アセチル化されたオリゴ糖に対し特異的な検出として、２０２〜２４７ｎｍも使用される。
【００７０】
ＣＴＡ−ＳＡＸ上でのセミ分取クロマトグラフィー
４５℃で、２ｍｌ／分にて、４時間、水／メタノール（６８／３２）ｖ／ｖの混合物中の、１ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムリン酸水素溶液の浸透により、セチルトリメチルアンモニウム鎖がその上にグラフト化された、５μｍ粒子のＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳカラム（２５０×２０ｍｍ）上のクロマトグラフィー。室温で分離を実行する。使用される溶出勾配：溶媒Ａは、ＨＣｌを添加することによってｐＨを２．５にした水である。溶媒Ｂは、ｐＨ２．５に調節された、２Ｎ ＮａＣｌ溶液である。
【００７１】
【表２】
【００７２】
２３２ｎｍでのＵＶ域において、検出を行なう。１００ｍｇの六糖画分を、各分離において注入できる。
【００７３】
六糖Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩの調製
ヘパラナーゼ１を用いたヘパリンのＡＴＩＩＩの親和性部位の開裂によって、六糖ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ（六糖ｉｓｏ ＡＴＩＩＩ）を得る。ヘパラナーゼ１を用いたヘパリンの解重合は、内因性溶解性であり：それらの非還元末端が不飽和のオリゴ糖の混合物をもたらす。反応終了後、二糖、四糖及び六糖の混合物を得る。ヘパリンの最も硫酸化された全領域を開裂し、二糖及び四糖へ転換する。アセチル化された部分のみが、六糖形態を維持し、特に、−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ又は６ＯＨ）−ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ又は６ＯＨ）−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ（３Ｓ又は３ＯＨ，６Ｓ又は６ＯＨ）−型の鎖を維持する。
【００７４】
【化３０】
【００７５】
ヘパリンの解重合を次の条件下にて実行する：ブタの粘膜から得たヘパリン３ｇを、ｐＨ７に調節された、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ＢＳＡ、５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４の溶液３０ｍＬ中に溶解する。解重合温度は１６℃である。ヘパラナーゼ１の２ＩＵを最初に導入する。７日後、ヘパリナーゼ１の追加単位を添加する。１５日後、ヘパリンの解重合を終了したとみなす。その反応は、ＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ ２０００カラム（図１）上、又はＣＴＡ−ＳＡＸカラム（図２ａ）上のどちらかの分析用ＧＣによってモニタリングする。サイズが八糖よりも大きなオリゴ糖の割合を制限し、前記混合物中の、２つの主な硫酸化された六糖であるΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ及びΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩｓｇｌｕを、四糖に解重合した際に、酵素反応が、十分促進されたと見なすことができる。酵素反応が終わると、０．２μｍの膜を通して前記溶液をろ過し、次いで、２段階で、０．２Ｎ ＮａＣｌの移動相が循環する、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ１０（Ｂｉｏ Ｒａｄ）が充填されたＧＣカラム上に注入される（図３）。六糖のΔＩｓ−１Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕは、アルカリ溶媒中で非常に脆弱である：六糖のΔＩｓ−１Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕは、その３−Ｏ−硫酸化末端のグルコサミンを失い、ｐＨが８を超えるとすぐに五糖ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＧＩｃＡに転換される。従って、全六糖画分を、僅かに酸性化することが（ｐＨが５〜６）非常に重要である。図４には、全六糖画分のクロマトグラムを示されている。
【００７６】
最終相は、ＣＴＡ−ＳＡＸでグラフトされた、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ１８（５μｍ）が充填された、２５×２．１ｃｍのカラム上におけるセミ分取分離からなる（図５）。前記画分は、ＨＰＬＣにより制御されている。セミ分取クロマトグラフィーで使用される移動相が、塩化ナトリウム溶液であるので、試料の最終の脱塩を調製する必要がある。これは、２段階で実行される。ＮａＣｌの９５％を取り除く第１段階は、水中で１／１０に希釈された後、カラム上でそれらをろ過することによって、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｌｏｗ陰イオン交換相（Ｐａｒｍａｃｉａ）（４０×２．６ｃｍカラム）上で、前記単離された六糖を含有する画分を再濃縮することからなる。前記六糖を、最少量（約５０ｍｌ）で、１．５Ｎ ＮａＣｌＯ４溶液を用いて溶出し、過塩素酸六糖溶液を得る。
【００７７】
最終脱塩の第２段階は、前段階で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラム（１００×７ｃｍ）上で得た過塩素酸六糖の溶液を注入して実行する。２３２ｎｍにおけるＵＶ検出及び塩の検出を可能にする伝導測定器により、モニタリングを行なう。
【００７８】
六糖と過塩素酸の分離の質が不十分である場合、この工程を繰返す必要があり得る。次いで、六糖の溶液を凍結乾燥させる。このようにして、ナトリウム塩形態の六糖ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ１０８ｍｇを得る。ＨＰＬＣ純度は９２％となる（図６）。
【００７９】
ヘパラナーゼ生物学的活性アッセイ：
ヘパラナーゼの阻害能力に関するＨｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩ関連の評価を、次のように実行した。
【００８０】
放射線標識されたヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ）を、ヘパラナーゼで分解し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）及び液体シンチレーションによって収集された画分を数えることにより測定可能な、低分子量のＨＳ断片を生成する。
【００８１】
ブタ腸粘膜からの未分画ヘパリン（ナトリウム塩）（等級Ｉａ、１８３ＵＳＰ／ｍｇ）を、Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）から得た。
【００８２】
ヘパリチナーゼ（ＨＰリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．８））を、Ｓｅｉｇａｋｕ（東京、日本）から得た。
【００８３】
ＴＳＫ４０００を、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓから得て、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）から、プレカラムを備えたＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑカラムを得た。
【００８４】
代謝標識によって３５−Ｓで標識されたヘパラン硫酸塩（プロテオグリカン）を調製するために、子宮線維芽細胞株を使用した。この細胞株は、シンデカン及びグリピカンなどの、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳ−ＰＧ）を比較的大量に生成することが示されている（Ｄｒｚｅｎｉｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ９３：２８８４−２８９７，１９９９）。
【００８５】
組織培養培地中の３３μＣｉ／ｍｌの３５−Ｓ−硫酸塩の存在下で２４時間、約１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、細胞をインキュベートすることにより、この標識化を行なう。次いで、上清を収集し、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（１ｍｍｏｌ／ｌ）を添加する。試料は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを比較的大量に含有するので、またヘパラナーゼ酵素の特異性のために、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸（プロテオグリカン）の除去が必要でなく、ＨＳ−ＰＧをＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ上で、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。
【００８６】
ヘパラナーゼを、フィコール勾配操作による、多形核細胞（ＰＭＮ）で濃縮された、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ、バッフィコート）から単離した。その単離したＰＭＮの濃度を２．５×１０７細胞／ｍｌに調節し、１時間、４℃で、インキュベートする。次いで、ヘパラナーゼを含有する上清を収集し、ｐＨを６．２（クエン酸−リン酸バッファ２０ｍＭ）に調節し、すぐに使用するか、又は−２０℃にて、アリコートで、凍結保存する。
【００８７】
約２２００ｃｐｍ／ｍｌ（ｃｐｍ＝計数毎分）に調節された、３５−Ｓ−標識されたヘパラン硫酸（プロテオグリカン）２００μＬを、ヘパラナーゼを含有するＰＭＮ上清１μｌで、３７℃にて、１８時間、インキュベートする。上記で得た、混合物２００μｌを、ＴＳＫ４０００ゲル浸透クロマトグラフィーカラム（ＦＰＬＣ）上で試料を採取し、その画分を収集して、液体シンチレーションカウントによって分析する。下記の式に従って、その分解量を測定した。
【００８８】
％分解＝[[Σ計数（ｃｐｍ）画分２０−３３（ＨＥＰ）−Σ計数（ｃｐｍ）画分２０−３３（ＣＯＮＴ）]／[総合計数（ｃｐｍ）画分１２−３３（ＣＯＮＴ）]]×１００。
【００８９】
例えば、％分解を下記のとおりに計算する：ヘパラナーゼでの処理後の試料の画分２０−３３における計数（ｃｐｍ）から、対照試料のバックグランドノイズ計数（ｃｐｍ）（画分２０−３３）を差し引いた合計を、カラムに用いられる総計数（画分１２−３３）で割る。補正因子を使用して、２２００計数／ｃｐｍにおける、クロマトグラフィーの様々な回数の総計数を標準化した。その結果を％分解として得る。阻害アッセイにて、対照試料（ヘパラナーゼを伴う。）の分解を１００％（分解）に固定し、その％阻害値を、これに基づき計算した。スルファターゼ活性の修正は、スルファターゼ活性が検出されない可能性があるため、必要でない。
【００９０】
次のヘパラナーゼ阻害剤：未分画ヘパリン（ＵＦ−Ｈ）及びＨｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩを、３つの異なる濃度にて、上記のプロトコルでアッセイした。その比較は、重量基準で実行した。データを、ヘパラナーゼ活性の％阻害として表す。
【００９１】
結果
まず、ヘパラナーゼアッセイを、この研究の必要性に応じて最適化した。実用的な理由から、分解アッセイにおけるインキュベーション時間を１８時間の時点で確立した。標識化の効率性及びヘパラン硫酸（プロテオグリカン）の含有量に応じて、ヘパラン硫酸（プロテオグリカン）総計数を、約２２００ｃｐｍ／試料に固定し、ヘパラン硫酸（プロテオグリカン）の１バッチで全アッセイの実行を可能にした。図１ａは、天然試料のＴＳＫ４０００ゲル浸透クロマトグラフィーを示す。図１ｂは、その試料の分子分布における、ヘパラナーゼ誘起シフトを示す。次いで、ヘパラン硫酸プロテオグリカン約８０％を分解できるヘパラナーゼ量を決定する（ヘパラン硫酸プロテオグリカン約３５％及びコンドロイチン／デルマタン硫酸プロテオグリカン約６５％を含有する試料）。従って、１０−８０％の範囲の分解は、比較的直線状であり、阻害剤の効果の決定において許容される。図１ｃは、９７．３％の阻害で、ヘパラナーゼ活性の１μｇ／ｍｌの未分画ヘパリン（ＵＦＨ）の効果を示す。
【００９２】
アッセイ状態を決定した後、ブタ腸粘膜から得た未分画ヘパリン（ＵＦＨ）の効果を測定した。図２は、用量依存的な阻害を示す。ヘパラナーゼ活性の実質的に完全な阻害が、１μｇ／ｍｌ（最終濃度）の未分画ヘパリン（ＵＦＨ）濃度にて、観察された。図７は、Ｈｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩによる用量依存阻害を示す。これらのデータに基づいて、Ｈｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩが、強度のヘパラナーゼ阻害活性を示すと結論付けることが可能である。
【００９３】
次の刊行物の内容を、参照により、本明細書に組み込む。
【００９４】
Ｃ．Ｒ．Ｐａｒｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ａｃｔａ１４７１（２００１）９９−１０８。
【００９５】
Ｍ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３（１９９５）１１３−１２４。
【００９６】
Ｉ．Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．ＩＭＡＪ２（２０００）３７−４５。
【００９７】
Ｙ．Ｍａｔｚｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６（１９８５）、１３０６−１３１３。
【００９８】
Ｚ．Ｄｒｚｅｎｉｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９９９）２８８４−２８７９。
【００９９】
オリゴ糖を豊富に含有した他の分画は、ヘパラナーゼ１による、ヘパリンの分解生成物から単離できる。従って、六糖の場合、単一のＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフの精製で十分である。この方法では、セチルトリメチルアンモニウム鎖が、４５℃にて、２ｍｌ／分で、４時間、水−メタノールの混合物（６８−３２）ｖ／ｖ中の、セチルトリメチルアンモニウムリン酸水素の１ｍＭ溶液の浸透によりその上にグラフト化された、５μｍ粒子のＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ（２５０×２０ｍｍ）カラムを使用する。
【０１００】
室温で分離を実行する。次の勾配溶出を使用する：溶媒Ａは、ＨＣｌの添加によってｐＨを２．５に調節した水である。溶媒Ｂは、ｐＨを２．５に調節したＮａＣｌの２Ｎ溶液である。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
検出をＵＶ領域の２３２ｎｍで行う。六糖画分１００ｍｇを、各分離において、注入できる。
【０１０３】
八糖及び十糖の画分の精製は、六糖画分の精製よりも更に複雑であり、一般的に、それはＩｏｎＰａｃ（Ｒ）ＡＳ１１カラム（２５０×２０ｍｍ）（Ｄｉｏｎｅｘ）上で、更なる精製を必要とする。分離は室温で実行する。勾配溶出を使用する。溶媒Ａは、過塩素酸の添加によりｐＨ３に調節した水である。溶媒Ｂは、ｐＨ３に調節されたＮａＣｌＯ４の１Ｍ溶液である。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
図８は、ＧＣより単離された各六糖、八糖及び十糖において、オリゴ糖を豊富に含有した画分から単離された生成物の同定が可能である。
【０１０６】
酵素システムにおけるヘパラナーゼ阻害剤の活性評価
フォンダパリヌクスを分解する能力により、ヘパラナーゼの活性を決定する。フォンダパリヌクスの濃度を、その抗Ｘａ因子の活性によって決定する。
【０１０７】
Ａ．物質及び方法
ヘパラナーゼは、Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ（Ｌａｂｅｇｅ、フランス）によって、調製される。
【０１０８】
Ｘａ因子をアッセイするための試薬は、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）から販売されている。
【０１０９】
本発明の化合物の漸増濃度、ヘパラナーゼ阻害剤（可変希釈量：１ｎＭ〜１０μＭ）を、ヘパラナーゼの一定濃度と混合する（各バッチにおいて、先行実験により、添加された０．４５μｇ／ｍｌのフォンダパリヌクスの分解に対し、十分な酵素活性を決定できる。）。３７℃で５分後、その混合物をフォンダパリヌクスと接触させ、３７℃で、１時間、放置する。９５℃で、５分間加熱することにより、その反応を停止する。残存のフォンダパリヌクスの濃度を、Ｘａ因子及びその特異的な発色基質（参照番号Ｓ２２２２）を添加することにより測定する。
【０１１０】
次の手順に従い、様々な混合物を調製する：
ａ）反応混合物
酢酸ナトリウムバッファ（０．２Ｍ、ｐＨ４．２）５０μｌを、フォンダパリヌクス（０．４５μｇ／ｍｌ）５０μｌ及びヘパラナーゼ溶液５９μｌと混合する。混合物を３７℃で、１時間、インキュベートし、次いで９５℃で、５分間、インキュベートする。ｐＨは、２．４から７となる。次いで、反応混合物１００μｌを、１７５ｍＭ ＮａＣｌ及び７５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ１４の５０ｍＭトリスバッファ５０μｌのと混合する。
【０１１１】
フォンダパリヌクスの抗Ｘａ因子活性を、次の方法で測定する。
【０１１２】
ｂ）フォンダパリヌクスの抗Ｘａ因子活性のアッセイ
段階ａ）で得た溶液１００μｌを、ＡＴ（０．５μｇ／ｍｌ）１００μｌと混合する。この混合物を３７℃で、２分間、維持し、次いで、Ｘａ因子（７ｎｋａｔ／ｍｌ）１００μｌを添加する。その混合物を３７℃で、２分間、維持し、発色基質（参照番号：Ｓ２２２２）（１ｍＭ）１００μｌを添加する。この混合物を３７℃で、２分間、維持し、次いで酢酸（５０％）１００μｌを添加する。
【０１１３】
光学濃度を４０５ｎｍで読み取る。
【０１１４】
阻害剤なしで対照に対し、％阻害を決定する。％阻害曲線により、ＩＣ５０を算出できる。
【０１１５】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ヘパラナーゼ１によるヘパリン解重合（ＧＣ監視）。
【図１ａ】天然ＨＳＰＧαゲル浸透クロマトグラフ。
【図１ｂ】ヘパラナーゼ処理後のゲル浸透クロマトグラフ。
【図１ｃ】未分画ヘパリンのゲル浸透クロマトグラフ。
【図２】未分画ヘパリンのヘパラナーゼ阻害活性。
【図２ａ】ヘパラナーゼ１によるヘパリン解重合（ＣＴＡ−ＳＡＸ監視）。
【図３】解重合されたヘパリンの各画分。
【図４】解重合されたヘパリンの六糖画分。
【図５】六糖画分の半分取分離。
【図６】脱塩後の六糖画分分析。
【図７】Ｈｅｘａ Ｉｓｏ ＡＴＩＩＩのヘパラナーゼ阻害活性。
【図８】単離された各糖画分のＧＣ分析。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に、Ｘａ因子及びＩＩａ因子の阻害による、抗血栓活性が、実質的に消滅されるまで（＜３５ＩＵ／ｍｇ）、多糖類がヘパリナーゼ１で解重合される段階を含むことを特徴とする、抗血栓特性を有する多糖を解重合する方法。
【請求項２】
多糖が、ヘパリンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合物が、硫酸化六糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ及びΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩｓｇｌｕが実質的に存在しない六糖画分を含むまで、解重合が遂行されることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
解重合が、５ないし４０℃の温度で実施されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
解重合が、１０ないし２０℃の温度で実施されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
５０００Ｄａ未満の平均分子量が達成されるまで解重合が遂行されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
３０００Ｄａ未満の平均分子量が達成されるまで解重合が遂行されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
多糖の解重合の生成物が、ｐＨ８未満かつ５超で、ゲル浸透クロマトグラフィーにより精製される段階も含むことを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項９】
固定相が、（ｉ）Ｃ１８−グラフト化され、且つ（ｉｉ）セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ−ＳＡＸ）でグラフト化された逆相である、高速液体クロマトグラフィーによる精製段階も含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脱塩段階も含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
脱塩段階が、２００ｎｍと２５０ｎｍの間で実質的に透明な水溶液中に電解質を含有する移動相の使用を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
電解質が、Ｎａなどのアルカリ金属の、過塩素酸塩、メタンスルホン酸塩又はリン酸塩から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
脱塩が、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ（Ｒ）型の、陰イオン交換樹脂を使用して実施されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
特に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０（Ｒ）型の、分子排除ゲルを使用する、第２の脱塩段階を含むことを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法により得られる生成物。
【請求項１６】
式（Ｉ）の生成物
【化１】
（式中、
Ｒは、Ｈ及びＳＯ３Ｍから選択され、並びに
Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択される。）
ただし、ｎ＝０、Ｒ＝ＳＯ３Ｍ及びＭ＝Ｎａの生成物は除かれる。
【請求項１７】
Ｍが、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の生成物。
【請求項１８】
ｎ＝０であることを特徴とする、請求項１６又は請求項１７に記載の生成物。
【請求項１９】
Ｍ＝Ｎａであることを特徴とする、請求項１５又は請求項１６に記載の生成物。
【請求項２０】
下記の式（Ｉａ）の、請求項１９に記載の生成物。
【化２】
【請求項２１】
下記の式（Ｉｂ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化３】
【請求項２２】
下記の式（Ｉｃ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化４】
【請求項２３】
下記の式（Ｉｄ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化５】
【請求項２４】
下記の式（Ｉｅ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化６】
【請求項２５】
下記の式（Ｉｆ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化７】
【請求項２６】
下記の式（Ｉｇ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化８】
【請求項２７】
下記の式（Ｉｈ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化９】
【請求項２８】
下記の式（Ｉｊ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化１０】
【請求項２９】
下記の式（Ｉｋ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化１１】
【請求項３０】
下記の式（Ｉｍ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化１２】
【請求項３１】
ヘパラナーゼ阻害剤としての、式（Ｉ）
【化１３】
（式中、
Ｒは、Ｈ及びＳＯ３Ｍから選択され、並びに
Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択される。）
の生成物の使用。
【請求項３２】
【化１４】
であることを特徴とする、請求項３１に記載の式（Ｉ）の生成物の使用。
【請求項３３】
式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、Ｉｇ、Ｉｈ、Ｉｊ、Ｉｋ及びＩｍの生成物から選択されることを特徴とする、請求項３１に記載の式（Ｉ）の生成物の使用。
【請求項３４】
細胞増殖を調節するための、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の生成物の使用。
【請求項３５】
細胞増殖が癌に関連することを特徴とする、請求項３４に記載の生成物の使用。
【請求項３６】
細胞増殖が転移過程に関連することを特徴とする、請求項３５に記載の生成物の使用。
【請求項３７】
細胞分裂停止剤としての、請求項３５又は請求項３６に記載の生成物の使用。
【請求項３８】
疾患の初期段階で実施されることを特徴とする、請求項３６又は請求項３７に記載の生成物の使用。
【請求項３９】
第２の抗癌生成物と組み合わされた、請求項３７及び３８のいずれか一項に記載の生成物の使用。
【請求項４０】
第２の抗癌生成物が細胞毒性であることを特徴とする、請求項３９に記載の生成物の使用。
【請求項４１】
第２の抗癌生成物が、シスプラシン又はオキサリプラチンなどのプラチナ誘導体、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのタキソイド、５−ＦＵ、カペシタビン又はゲムシタビンなどのプリン塩基又はピリミジン塩基誘導体、ビンクリスチン又はビンブラスチンなどのビンカ、マスタード、スタウロスポリン、エリプチシン又はイリノテカン、トポテカンなどのカンプトテシンなどの縮合芳香族複素環、ＣＡ４Ｐなどのコンブレタスタチン、並びにリン酸コルチノールなどのコルヒチン誘導体から選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の生成物の使用。
【請求項４２】
第２の抗癌生成物が、ドセタキセル、オキサリプラチン又はイリノテカンであることを特徴とする、請求項４１に記載の生成物の使用。
【請求項４３】
癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌又は膵臓癌であることを特徴とする、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の生成物の使用。
【請求項１】
特に、Ｘａ因子及びＩＩａ因子の阻害による、抗血栓活性が、実質的に消滅されるまで（＜３５ＩＵ／ｍｇ）、多糖類がヘパリナーゼ１で解重合される段階を含むことを特徴とする、抗血栓特性を有する多糖を解重合する方法。
【請求項２】
多糖が、ヘパリンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合物が、硫酸化六糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ及びΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩｓｇｌｕが実質的に存在しない六糖画分を含むまで、解重合が遂行されることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
解重合が、５ないし４０℃の温度で実施されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
解重合が、１０ないし２０℃の温度で実施されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
５０００Ｄａ未満の平均分子量が達成されるまで解重合が遂行されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
３０００Ｄａ未満の平均分子量が達成されるまで解重合が遂行されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
多糖の解重合の生成物が、ｐＨ８未満かつ５超で、ゲル浸透クロマトグラフィーにより精製される段階も含むことを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項９】
固定相が、（ｉ）Ｃ１８−グラフト化され、且つ（ｉｉ）セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ−ＳＡＸ）でグラフト化された逆相である、高速液体クロマトグラフィーによる精製段階も含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脱塩段階も含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
脱塩段階が、２００ｎｍと２５０ｎｍの間で実質的に透明な水溶液中に電解質を含有する移動相の使用を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
電解質が、Ｎａなどのアルカリ金属の、過塩素酸塩、メタンスルホン酸塩又はリン酸塩から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
脱塩が、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑ（Ｒ）型の、陰イオン交換樹脂を使用して実施されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
特に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０（Ｒ）型の、分子排除ゲルを使用する、第２の脱塩段階を含むことを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法により得られる生成物。
【請求項１６】
式（Ｉ）の生成物
【化１】
（式中、
Ｒは、Ｈ及びＳＯ３Ｍから選択され、並びに
Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択される。）
ただし、ｎ＝０、Ｒ＝ＳＯ３Ｍ及びＭ＝Ｎａの生成物は除かれる。
【請求項１７】
Ｍが、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の生成物。
【請求項１８】
ｎ＝０であることを特徴とする、請求項１６又は請求項１７に記載の生成物。
【請求項１９】
Ｍ＝Ｎａであることを特徴とする、請求項１５又は請求項１６に記載の生成物。
【請求項２０】
下記の式（Ｉａ）の、請求項１９に記載の生成物。
【化２】
【請求項２１】
下記の式（Ｉｂ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化３】
【請求項２２】
下記の式（Ｉｃ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化４】
【請求項２３】
下記の式（Ｉｄ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化５】
【請求項２４】
下記の式（Ｉｅ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化６】
【請求項２５】
下記の式（Ｉｆ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化７】
【請求項２６】
下記の式（Ｉｇ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化８】
【請求項２７】
下記の式（Ｉｈ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化９】
【請求項２８】
下記の式（Ｉｊ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化１０】
【請求項２９】
下記の式（Ｉｋ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化１１】
【請求項３０】
下記の式（Ｉｍ）の、請求項１６に記載の生成物。
【化１２】
【請求項３１】
ヘパラナーゼ阻害剤としての、式（Ｉ）
【化１３】
（式中、
Ｒは、Ｈ及びＳＯ３Ｍから選択され、並びに
Ｍは、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ及びＫから選択される。）
の生成物の使用。
【請求項３２】
【化１４】
であることを特徴とする、請求項３１に記載の式（Ｉ）の生成物の使用。
【請求項３３】
式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、Ｉｇ、Ｉｈ、Ｉｊ、Ｉｋ及びＩｍの生成物から選択されることを特徴とする、請求項３１に記載の式（Ｉ）の生成物の使用。
【請求項３４】
細胞増殖を調節するための、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の生成物の使用。
【請求項３５】
細胞増殖が癌に関連することを特徴とする、請求項３４に記載の生成物の使用。
【請求項３６】
細胞増殖が転移過程に関連することを特徴とする、請求項３５に記載の生成物の使用。
【請求項３７】
細胞分裂停止剤としての、請求項３５又は請求項３６に記載の生成物の使用。
【請求項３８】
疾患の初期段階で実施されることを特徴とする、請求項３６又は請求項３７に記載の生成物の使用。
【請求項３９】
第２の抗癌生成物と組み合わされた、請求項３７及び３８のいずれか一項に記載の生成物の使用。
【請求項４０】
第２の抗癌生成物が細胞毒性であることを特徴とする、請求項３９に記載の生成物の使用。
【請求項４１】
第２の抗癌生成物が、シスプラシン又はオキサリプラチンなどのプラチナ誘導体、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのタキソイド、５−ＦＵ、カペシタビン又はゲムシタビンなどのプリン塩基又はピリミジン塩基誘導体、ビンクリスチン又はビンブラスチンなどのビンカ、マスタード、スタウロスポリン、エリプチシン又はイリノテカン、トポテカンなどのカンプトテシンなどの縮合芳香族複素環、ＣＡ４Ｐなどのコンブレタスタチン、並びにリン酸コルチノールなどのコルヒチン誘導体から選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の生成物の使用。
【請求項４２】
第２の抗癌生成物が、ドセタキセル、オキサリプラチン又はイリノテカンであることを特徴とする、請求項４１に記載の生成物の使用。
【請求項４３】
癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌又は膵臓癌であることを特徴とする、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の生成物の使用。
【図１】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２】
【図２ａ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２】
【図２ａ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５２２８２３（Ｐ２００７−５２２８２３Ａ）
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００２５４（Ｐ２００７−５００２５４）
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／０００４３１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９０５９１
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／０００４３１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９０５９１
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
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