オリゴ糖の同定方法、オリゴ糖の配列分析方法
【課題】 本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、その目的は、正確かつ容易にオリゴ糖の種類を同定できるオリゴ糖の同定方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖において、糖修飾基に関する情報が得られるオリゴ糖の配列分析方法を提供することである。
【解決手段】 本発明に係る同定方法は、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖の質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を用いて被検オリゴ糖の同定を行う。また、本発明に係る配列分析方法は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖の質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を用いて前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得る。
また、本発明の別の目的は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖において、糖修飾基に関する情報が得られるオリゴ糖の配列分析方法を提供することである。
【解決手段】 本発明に係る同定方法は、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖の質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を用いて被検オリゴ糖の同定を行う。また、本発明に係る配列分析方法は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖の質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を用いて前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は配列が未知のオリゴ糖の同定方法に関する。また、本発明はＮ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖の配列分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチンは、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸の交互配列構造を有するグリコサミノグリカンとして知られている。これらのグリコサミノグリカンは、いずれも構造異性体の関係にあるため、糖鎖長が同じであれば分子量が同じでありかつ電荷数も同じであることから、識別同定が困難である。
【０００３】
例えば、上記グリコサミノグリカンは、それぞれの特異的分解酵素（Ｎ−アセチルヘパロサンであればヘパリチナーゼ、ヒアルロナンであればヒアルロニダーゼ等）によって切断されるため、その分解特異性の差によっていずれのグリコサミノグリカンであるかを同定することが可能である。この方法は、ある程度糖鎖長の長いオリゴ糖や多糖に対しては有効であるが、例えば２糖のように分解酵素が認識できないほど短い糖鎖の場合には、このような酵素学的手法では判別が困難である。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル測定による識別同定も可能であるが、試料を比較的多量に必要とするという問題がある。
【０００４】
一方、Ｎ−アセチルヘパロサンは、生体内においてヘパリン、ヘパラン硫酸の合成前駆体となるグリコサミノグリカン（GAG）である。従来から、Ｎ−アセチルヘパロサンの構造解析は、糖組成分析法とＮＭＲスペクトル測定により行われてきた（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、これまでその配列情報を得ることができる手段は存在しなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１８８４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、その目的は、正確かつ容易にオリゴ糖の種類を同定できるオリゴ糖の同定方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖において、糖修飾基に関する情報が得られるオリゴ糖の配列分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ−アセチルヘパロサンオリゴ糖、それらと同じ分子量を持つヒアルロナン及びコンドロイチンの不飽和型オリゴ糖を用意し、それぞれの質量分析の２乗スペクトル（以下、ＭＳ2スペクトルと略称する）を測定のうえ比較したところ、同一糖鎖長のオリゴ糖間で識別同定が可能となることを初めて見出すに至った。これにより、生体試料分析あるいは医薬候補化合物スクリーニング等の各種スクリーニングの際に、構造・物性の極めて類似したこれらの化合物を誤認することなく、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖を同定できるようになった。
【０００８】
また、本発明者らの検討によれば、Ｎ−アセチルヘパロサンから調製したオリゴ糖を質量分析により解析した結果、ＭＳ２スペクトルが単糖残基単位での配列情報を与え得ることを見出した。これにより、構造的に修飾を受けたＮ−アセチルヘパロサンの配列を解析する手段として有用であることを見出し、本発明を完成した。
なお、本発明のように交互配列型化合物を対象とし、フラグメンテーションの規則性によって得られるスペクトルを予測し、それと照らしながらオリゴ糖の同定および配列解析が可能であることを報告した例はこれまでにはない。
【０００９】
すなわち、上記課題は、以下の手段により解決される。
１． Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖をＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、前記ｎ乗スペクトルから被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とするオリゴ糖の同定方法。
２． 前記ｎ乗スペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のｎ乗スペクトルとを比較することにより、被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とする上記１に記載のオリゴ糖の同定方法。
３． 前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも１種以上を含むことを特徴とする上記１又は２に記載のオリゴ糖の同定方法。
４． 前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサンに由来するオリゴ糖であることを同定することを特徴とする上記１〜３のいずれかに記載のオリゴ糖の同定方法。
５． Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖をＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、
前記ｎ乗スペクトルから前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得ることを特徴とするオリゴ糖の配列分析方法。
６． 前記修飾基情報が、少なくともオリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造のいずれかを含むことを特徴とする上記５に記載のオリゴ糖の配列分析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の同定方法は、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有するオリゴ糖から質量分析によりＭＳｎスペクトルを得ることにより、容易かつ正確にオリゴ糖を同定することができるものであり、生体試料分析あるいは医薬候補化合物スクリーニング等の各種スクリーニングに有用である。
また、本発明によれば、Ｎ−アセチルへパロサン全長の構造を推定することも可能となり、例えば、生体内酵素或いは化学的手法等により構造修飾を施されたＮ−アセチルへパロサンの構造解析等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（同定方法）
まず、本発明に係る第１の方法は、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖のＭＳｎスペクトルから、被検オリゴ糖がどのようなグリコサミノグリカンに由来するオリゴ糖であるかを同定する方法である。
本発明の同定方法に係る被検オリゴ糖としては、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有するものであればよく、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも１種以上を含むことが好ましい。
【００１２】
本発明に係る同定方法は、被検オリゴ糖が４糖の場合は、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンのＭＳｎスペクトルを解析することにより、これらのいずれかに由来するオリゴ糖であるかを同定することができる。なお、２糖及び６糖以上のオリゴ糖においては、ヒアルロナン由来のオリゴ糖とコンドロイチン由来のオリゴ糖との識別が困難と考えられるが、これらとＮ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖とを識別同定することができる（より詳細は本実施例１〜３により示す。）。
【００１３】
被検オリゴ糖のイオン化法としては、ＥＳＩ法（エレクトロスプレーイオン化法）又はＭＡＬＤＩ法（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）を用いる。被検オリゴ糖をイオン化することにより、被検オリゴ糖の分子量に起因する１種類又は２種類以上のイオン（以下、分子量関連イオンと呼ぶ。）が生成する。生成した分子量関連イオンを検出することにより、当該被検オリゴ糖の分子量を確定することができる。
【００１４】
分子量関連イオンの検出は、任意の質量分析装置を用いて行うことができるが、ＥＳＩ法の場合は、ＩＴ型（イオントラップ型）、三連四重極型、ＴＯＦ型（飛行時間型）、或いはＦＴ−ＩＣＲ型（フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型）分析装置、ＭＡＬＤＩ法の場合はＩＴ型、ＴＯＦ型、或いはＦＴ−ＩＣＲ型分析装置を用いることが好ましい。このような質量分析装置を用いて分子量関連イオンを検出することにより、ＭＳの１乗スペクトル（ＭＳ１スペクトル）が得られる。
【００１５】
このように、本発明では、イオン化法としてＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法を採用し、分析装置として任意の質量分析装置を採用することができるが、装置が小型で軽量且つ操作が簡便である等の点から、ＥＳＩ法によりイオン化し、ＩＴ型分析装置によって検出を行う方法（以下、ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法という。）が好ましい。ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法は、例えばＥｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカー社製）等の一般的な市販の装置を使用して行うことができる。
【００１６】
前記のようにして得られたＭＳ１スペクトルにおける分子量関連イオンを前駆イオンとしてフラグメンテーションを行い、フラグメントイオンを生成させて検出する（これによって、ＭＳ２スペクトルが得られる）。さらに必要に応じてＭＳ２スペクトルにおけるフラグメントイオンについてフラグメンテーションを行いＭＳ３スペクトルを、以下同様にＭＳの４乗、・・・、ｎ乗スペクトルを得ることができる。ＭＳのｎ乗スペクトル（ＭＳｎスペクトル；ｎは２以上の整数。以下同じ。）も、上記ＭＳ１スペクトルと同様にして得ることができる。
ＭＳｎスペクトルは少なくともＭＳ２スペクトルまで求めることが好ましい。
【００１７】
ＭＳｎスペクトルを得る際のフラグメンテーションの方法は、CID法（collision-induced dissociation、衝突誘起解離法）、PSD法（post-source decay法）、ISD法（in-source decay法）を用いることができるが、ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法においてはCID法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法においてはPSD法を用いることが好ましい。
【００１８】
上記のようにして得られたＭＳｎスペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のＭＳｎスペクトルとを比較する。標準オリゴ糖のスペクトル・データとしては、２、４、６糖のオリゴ糖の場合は、本実施例により得られるスペクトル・データを用いることができる。また、その他の糖鎖長のオリゴ糖については、予め、糖鎖長が既知のオリゴ糖について上記方法によりＭＳｎスペクトルを得ておくことが望ましい。
【００１９】
（配列分析方法）
また、本発明に係る第２の方法は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖においてＭＳｎスペクトルを測定することにより、当該被検オリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造等の修飾基情報を得て、当該オリゴ糖の配列を分析する方法である。
【００２０】
本発明者らは、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖について、ＭＳ２スペクトルを得た。（詳しい過程については実施例４に示す。）
これら各々のシグナルを構造式上に帰属すると、図１１及び図１２に示すように、種々の位置のグリコシド結合が切断されたフラグメントイオンが万遍なく生じていることが判明した。（図１１は偶数糖について、図１２は奇数糖について示している。）
【００２１】
すなわち、比較的短鎖のオリゴ糖（８糖以下）では、グリコシド結合以外の結合も切断されるが、ＭＳ２スペクトル上に見られる規則性は、単糖グリコシド単位の配列情報に他ならない。よって、Ｎ−アセチルヘパロサンの配列はＭＳ２スペクトル測定によって解読が可能であることが初めて示されるとともに、ここに観測されているシグナルの規則性から、より長鎖のＮ−アセチルヘパロサンのＭＳ２スペクトルで得られるであろうシグナルを、実際に測定しなくとも容易に推定することが可能となった。
【００２２】
より具体的には、
Ａ：５糖以上の奇数糖および６糖以上の偶数糖のＭＳ２スペクトルには必ず、４糖フラグメント以上の、構造上可能なすべての偶数糖フラグメントシグナルが観測される。それらのm/z値は、７５７＋ｎ×３７９（ｎは０以上の整数）近傍である。
Ｂ：５糖以上の奇数糖および４糖以上の偶数糖のＭＳ２スペクトルには必ず、３糖フラグメント以上の、構造上可能なすべての奇数糖フラグメントシグナルが観測される。それらのm/z値は、５９９＋ｍ×３７９（ｍは０以上の整数）近傍である。
【００２３】
実際に再度ＭＳ２スペクトルを精査してみると、例えば１２糖のＭＳ２スペクトル中には３糖から１１糖までの各糖鎖長のフラグメントシグナルが観測されており、一方で例えば１３糖のＭＳ２スペクトル中には３糖から１２糖までの各糖鎖長のフラグメントシグナルが観測されている。そしてすべてのフラグメント間の質量差を計算すると、これらのオリゴ糖鎖がすべてＮ−アセチルヘキソサミン（質量差221）とウロン酸（質量差158）の交互構造であることが明白である。
【００２４】
上述のように、Ｎ−アセチルヘパロサンの構造がＮ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互配列であることが、明確に示された。これにより、糖鎖配列中に種々の置換基導入などの構造修飾が施された場合に、その修飾部分を含むフラグメントイオンだけがシグナル位置を変える（修飾基の質量分）ため、その修飾基の配列上の位置を決定することが可能である。
また、一般にＮ−アセチルヘパロサンの修飾基としては、硫酸基、メチル基、アセチル基、エチル基、ベンジル基、リン酸基等が挙げられる。また、水酸基の酸化、還元や、ウロン酸のエステル化等の修飾も決定可能である。さらに、本発明の方法によれば、修飾基の位置のみならず、修飾基の質量からＮ−アセチルヘパロサンに結合している修飾基の構造も特定することが可能である。
【００２５】
簡単な例として、Ｎ−アセチルヘパロサンの６糖のオリゴ糖を水素化ホウ素ナトリウムで還元処理した場合を挙げる（図１３参照。）。図１３に示すように、処理後のオリゴ糖はＭＳ１スペクトルにおいて元の化合物よりも質量が２だけ大きかった。これについてＭＳ２スペクトルを測定したところ、還元末端を含むフラグメントイオンの質量値が２だけ増え、還元末端を含まないフラグメントイオンの質量値は不変であった。即ち、還元反応が起こった位置は、６糖配列中の還元末端糖であることが決定された。この例に止まらず、例えば、糖鎖の末端ではなく内側の任意の糖残基において修飾が施された場合においても、その配列を決定できることは充分に予測される範囲内である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
［実施例１］
（不飽和２糖のＭＳ２分析による同定）
（１）Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖の調製
特開２００４−１８８４０号公報の実施例１に記載の方法と同様にして大腸菌Ｋ５菌株を培養し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を得て、さらに、同公報の実施例２に記載の方法と同様にしてこのＮ−アセチルヘパロサン画分を精製した。
精製したＮ−アセチルヘパロサン画分（100mg）を濃度が10mg/mlになるように、5mM酢酸カルシウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解した。
【００２７】
このN−アセチルヘパロサン溶解液に、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI（０．２ユニット）を添加し、３７℃で４５分間インキュベーションした。
その後、沸騰水浴中で反応を停止させた後、沈殿物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分）によって除去し、上清液を凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を131.25mg得た（塩類を含む）。
【００２８】
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物を、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分取精製し凍結乾燥して、Ｎ−アセチルヘパロサン由来の２糖の精製オリゴ糖画分を得た。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーには、アマシャム・バイオサイエンス社製のSuperdex Peptide 10/300GLを使用した。
【００２９】
（２）ヒアルロナン由来の調製及びコンドロイチン由来のオリゴ糖の調製
分解酵素として放線菌由来ヒアルロニダーゼを用い、ヒアルロナンを分解することで、ヒアルロナン由来の２糖のオリゴ糖を調製した。
また、分解酵素としてProteus vulgaris由来コンドロイチナーゼＡＢＣを用い、コンドロイチンを分解することで、コンドロイチン由来の２糖のオリゴ糖を調製した。
【００３０】
（３）質量分析
ESI-IT-MS（Esquire 3000 plus，ブルカー・ダルトニクス社製）およびMALDI-TOF-MS（Ultraflex，ブルカー・ダルトニクス社製）を用い、それぞれの方法にてＭＳ２スペクトルを測定した。なお、ＭＳ２スペクトルを得る際のフラグメンテーションの方法は、ESI-IT-MSにおいてはCID法、MALDI-TOF-MSにおいてはPSD法を用いた。測定用マトリックスとしてはDHB (2,5- dihydroxybenzoic acid)を用いた。
この結果をそれぞれ図１及び２に示す。なお、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和２糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
図１及び図２に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、Ｎ−アセチルヘパロサン由来２糖のＭＳ２スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、他の不飽和２糖との判別が可能であることがわかった。
【００３１】
［実施例２］
（不飽和４糖のＭＳ２分析による同定）
（１）オリゴ糖の調製
上記実施例１と同様の方法により、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチン由来の４糖のオリゴ糖を調製した。
（２）質量分析
上記実施例１と同様にして、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSを用い、それぞれの方法にてＭＳ２スペクトルを測定した。なお、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和４糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
この結果をそれぞれ図３及び４に示す。図３及び４に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、ＭＳ２スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、不飽和４糖がいずれの構造かを判別することが可能であることがわかった。
【００３２】
［実施例３］
（不飽和６糖のＭＳ２分析による同定）
（１）オリゴ糖の調製
上記実施例１と同様の方法により、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチン由来の６糖のオリゴ糖を調製した。
（２）質量分析
上記実施例１と同様にして、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSを用い、それぞれの方法にてＭＳ２スペクトルを測定した。なお、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和６糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
この結果をそれぞれ図５及び６に示す。図５及び６に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、Ｎ−アセチルヘパロサン由来６糖のＭＳ２スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、他の不飽和６糖との判別が可能であることがわかった。
【００３３】
以上の実施例により、従来微量分析が困難であったＮ−アセチルヘパロサン由来構造と、ヒアルロナン由来構造あるいはコンドロイチン由来構造との判別が、ＭＳ２スペクトルを測定することにより可能となることが示された。これは、オリゴ糖構造に含まれる種々の化学結合の安定性に基づいて差異が生じるものであり、判別の対象はここに示したもののみならず、飽和型オリゴ糖や奇数オリゴ糖、また、より長鎖のオリゴ糖についても可能である。
【００３４】
なお、ヘキソサミン異性体であるヒアルロナン及びコンドロイチン由来不飽和オリゴ糖は、４糖においてＭＳ２測定により識別可能であったが、２糖及び６糖では識別が困難であると考えられた。
また、ヒアルロナンの不飽和偶数オリゴ糖に関してMALDI-TOF-MSを用いてＭＳ２スペクトルを測定すると、必ずm/z=175（不飽和ウロン酸）と、m/z=[M-203]（Mは前駆イオンのm/z値、203は還元末端のN-アセチルヘキソサミンの質量221からグリコシド生成による脱水値18を除した値）の二本のシグナルが強く観測されることもわかった。
【００３５】
［実施例４］
（Ｎ−アセチルヘパロサンの配列決定）
（１）Ｎ−アセチルヘパロサンオリゴ糖のＭＳ１およびＭＳ２スペクトルの測定
上記実施例１の（１）に記載の方法と同様にして、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した、N-アセチルヘパロサンのオリゴ糖画分（２〜２０糖の不飽和偶数糖および３〜２１糖の奇数糖）を得た。
各オリゴ糖画分について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF-MS）装置を用いて、ＭＳ１およびＭＳ２スペクトルを測定した。
なお、質量分析装置としては、ブルカー・ダルトニクス社製のUltraflexを使用し、測定用マトリックスとしてはDHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)を用いた。ＭＳ２スペクトルは各々のオリゴ糖のＭＳ１スペクトル測定で得られた分子量関連イオンを前駆イオンとし、PSD（ポストソース分解）法により測定した。
【００３６】
（２）結果
この結果を図７〜１０に示す。図７は不飽和偶数オリゴ糖のＭＳ１スペクトル、図８は不飽和偶数オリゴ糖のＭＳ２スペクトル、図９は奇数オリゴ糖のＭＳ１スペクトル、図１０は奇数オリゴ糖のＭＳ２スペクトルを示している。
図７〜１０に示すように、不飽和偶数糖、奇数糖とも、ＭＳ２スペクトルにおいて規則性の高いシグナルが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】不飽和２糖をESI-IT-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図２】不飽和２糖をMALDI-TOF-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図３】不飽和４糖をESI-IT-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図４】不飽和４糖をMALDI-TOF-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図５】不飽和６糖をESI-IT-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図６】不飽和６糖をMALDI-TOF-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図７】不飽和偶数オリゴ糖のMS1スペクトルを示す図である。
【図８】不飽和偶数オリゴ糖のMS2スペクトルを示す図である。
【図９】不飽和奇数オリゴ糖のMS1スペクトルを示す図である。
【図１０】不飽和奇数オリゴ糖のMS2スペクトルを示す図である。
【図１１】Ｎ−アセチルヘパロサンの偶数オリゴ糖の構造式と、当該オリゴ糖のＭＳ２スペクトルにおいて観測されたｍ／ｚ値に基づく結合切断部位を示す図である。
【図１２】Ｎ−アセチルヘパロサンの奇数オリゴ糖の構造式と、当該オリゴ糖のＭＳ２スペクトルにおいて観測されたｍ／ｚ値に基づく結合切断部位を示す図である。
【図１３】還元処理前後のＮ−アセチルヘパロサンのオリゴ糖の構造式と、当該オリゴ糖のＭＳ２スペクトルにおいて観測されたｍ／ｚ値とを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は配列が未知のオリゴ糖の同定方法に関する。また、本発明はＮ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖の配列分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチンは、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸の交互配列構造を有するグリコサミノグリカンとして知られている。これらのグリコサミノグリカンは、いずれも構造異性体の関係にあるため、糖鎖長が同じであれば分子量が同じでありかつ電荷数も同じであることから、識別同定が困難である。
【０００３】
例えば、上記グリコサミノグリカンは、それぞれの特異的分解酵素（Ｎ−アセチルヘパロサンであればヘパリチナーゼ、ヒアルロナンであればヒアルロニダーゼ等）によって切断されるため、その分解特異性の差によっていずれのグリコサミノグリカンであるかを同定することが可能である。この方法は、ある程度糖鎖長の長いオリゴ糖や多糖に対しては有効であるが、例えば２糖のように分解酵素が認識できないほど短い糖鎖の場合には、このような酵素学的手法では判別が困難である。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル測定による識別同定も可能であるが、試料を比較的多量に必要とするという問題がある。
【０００４】
一方、Ｎ−アセチルヘパロサンは、生体内においてヘパリン、ヘパラン硫酸の合成前駆体となるグリコサミノグリカン（GAG）である。従来から、Ｎ−アセチルヘパロサンの構造解析は、糖組成分析法とＮＭＲスペクトル測定により行われてきた（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、これまでその配列情報を得ることができる手段は存在しなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１８８４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、その目的は、正確かつ容易にオリゴ糖の種類を同定できるオリゴ糖の同定方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖において、糖修飾基に関する情報が得られるオリゴ糖の配列分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ−アセチルヘパロサンオリゴ糖、それらと同じ分子量を持つヒアルロナン及びコンドロイチンの不飽和型オリゴ糖を用意し、それぞれの質量分析の２乗スペクトル（以下、ＭＳ2スペクトルと略称する）を測定のうえ比較したところ、同一糖鎖長のオリゴ糖間で識別同定が可能となることを初めて見出すに至った。これにより、生体試料分析あるいは医薬候補化合物スクリーニング等の各種スクリーニングの際に、構造・物性の極めて類似したこれらの化合物を誤認することなく、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖を同定できるようになった。
【０００８】
また、本発明者らの検討によれば、Ｎ−アセチルヘパロサンから調製したオリゴ糖を質量分析により解析した結果、ＭＳ２スペクトルが単糖残基単位での配列情報を与え得ることを見出した。これにより、構造的に修飾を受けたＮ−アセチルヘパロサンの配列を解析する手段として有用であることを見出し、本発明を完成した。
なお、本発明のように交互配列型化合物を対象とし、フラグメンテーションの規則性によって得られるスペクトルを予測し、それと照らしながらオリゴ糖の同定および配列解析が可能であることを報告した例はこれまでにはない。
【０００９】
すなわち、上記課題は、以下の手段により解決される。
１． Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖をＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、前記ｎ乗スペクトルから被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とするオリゴ糖の同定方法。
２． 前記ｎ乗スペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のｎ乗スペクトルとを比較することにより、被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とする上記１に記載のオリゴ糖の同定方法。
３． 前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも１種以上を含むことを特徴とする上記１又は２に記載のオリゴ糖の同定方法。
４． 前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサンに由来するオリゴ糖であることを同定することを特徴とする上記１〜３のいずれかに記載のオリゴ糖の同定方法。
５． Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖をＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、
前記ｎ乗スペクトルから前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得ることを特徴とするオリゴ糖の配列分析方法。
６． 前記修飾基情報が、少なくともオリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造のいずれかを含むことを特徴とする上記５に記載のオリゴ糖の配列分析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の同定方法は、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有するオリゴ糖から質量分析によりＭＳｎスペクトルを得ることにより、容易かつ正確にオリゴ糖を同定することができるものであり、生体試料分析あるいは医薬候補化合物スクリーニング等の各種スクリーニングに有用である。
また、本発明によれば、Ｎ−アセチルへパロサン全長の構造を推定することも可能となり、例えば、生体内酵素或いは化学的手法等により構造修飾を施されたＮ−アセチルへパロサンの構造解析等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（同定方法）
まず、本発明に係る第１の方法は、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖のＭＳｎスペクトルから、被検オリゴ糖がどのようなグリコサミノグリカンに由来するオリゴ糖であるかを同定する方法である。
本発明の同定方法に係る被検オリゴ糖としては、Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有するものであればよく、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも１種以上を含むことが好ましい。
【００１２】
本発明に係る同定方法は、被検オリゴ糖が４糖の場合は、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンのＭＳｎスペクトルを解析することにより、これらのいずれかに由来するオリゴ糖であるかを同定することができる。なお、２糖及び６糖以上のオリゴ糖においては、ヒアルロナン由来のオリゴ糖とコンドロイチン由来のオリゴ糖との識別が困難と考えられるが、これらとＮ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖とを識別同定することができる（より詳細は本実施例１〜３により示す。）。
【００１３】
被検オリゴ糖のイオン化法としては、ＥＳＩ法（エレクトロスプレーイオン化法）又はＭＡＬＤＩ法（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）を用いる。被検オリゴ糖をイオン化することにより、被検オリゴ糖の分子量に起因する１種類又は２種類以上のイオン（以下、分子量関連イオンと呼ぶ。）が生成する。生成した分子量関連イオンを検出することにより、当該被検オリゴ糖の分子量を確定することができる。
【００１４】
分子量関連イオンの検出は、任意の質量分析装置を用いて行うことができるが、ＥＳＩ法の場合は、ＩＴ型（イオントラップ型）、三連四重極型、ＴＯＦ型（飛行時間型）、或いはＦＴ−ＩＣＲ型（フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型）分析装置、ＭＡＬＤＩ法の場合はＩＴ型、ＴＯＦ型、或いはＦＴ−ＩＣＲ型分析装置を用いることが好ましい。このような質量分析装置を用いて分子量関連イオンを検出することにより、ＭＳの１乗スペクトル（ＭＳ１スペクトル）が得られる。
【００１５】
このように、本発明では、イオン化法としてＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法を採用し、分析装置として任意の質量分析装置を採用することができるが、装置が小型で軽量且つ操作が簡便である等の点から、ＥＳＩ法によりイオン化し、ＩＴ型分析装置によって検出を行う方法（以下、ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法という。）が好ましい。ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法は、例えばＥｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカー社製）等の一般的な市販の装置を使用して行うことができる。
【００１６】
前記のようにして得られたＭＳ１スペクトルにおける分子量関連イオンを前駆イオンとしてフラグメンテーションを行い、フラグメントイオンを生成させて検出する（これによって、ＭＳ２スペクトルが得られる）。さらに必要に応じてＭＳ２スペクトルにおけるフラグメントイオンについてフラグメンテーションを行いＭＳ３スペクトルを、以下同様にＭＳの４乗、・・・、ｎ乗スペクトルを得ることができる。ＭＳのｎ乗スペクトル（ＭＳｎスペクトル；ｎは２以上の整数。以下同じ。）も、上記ＭＳ１スペクトルと同様にして得ることができる。
ＭＳｎスペクトルは少なくともＭＳ２スペクトルまで求めることが好ましい。
【００１７】
ＭＳｎスペクトルを得る際のフラグメンテーションの方法は、CID法（collision-induced dissociation、衝突誘起解離法）、PSD法（post-source decay法）、ISD法（in-source decay法）を用いることができるが、ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法においてはCID法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法においてはPSD法を用いることが好ましい。
【００１８】
上記のようにして得られたＭＳｎスペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のＭＳｎスペクトルとを比較する。標準オリゴ糖のスペクトル・データとしては、２、４、６糖のオリゴ糖の場合は、本実施例により得られるスペクトル・データを用いることができる。また、その他の糖鎖長のオリゴ糖については、予め、糖鎖長が既知のオリゴ糖について上記方法によりＭＳｎスペクトルを得ておくことが望ましい。
【００１９】
（配列分析方法）
また、本発明に係る第２の方法は、Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖においてＭＳｎスペクトルを測定することにより、当該被検オリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造等の修飾基情報を得て、当該オリゴ糖の配列を分析する方法である。
【００２０】
本発明者らは、Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖について、ＭＳ２スペクトルを得た。（詳しい過程については実施例４に示す。）
これら各々のシグナルを構造式上に帰属すると、図１１及び図１２に示すように、種々の位置のグリコシド結合が切断されたフラグメントイオンが万遍なく生じていることが判明した。（図１１は偶数糖について、図１２は奇数糖について示している。）
【００２１】
すなわち、比較的短鎖のオリゴ糖（８糖以下）では、グリコシド結合以外の結合も切断されるが、ＭＳ２スペクトル上に見られる規則性は、単糖グリコシド単位の配列情報に他ならない。よって、Ｎ−アセチルヘパロサンの配列はＭＳ２スペクトル測定によって解読が可能であることが初めて示されるとともに、ここに観測されているシグナルの規則性から、より長鎖のＮ−アセチルヘパロサンのＭＳ２スペクトルで得られるであろうシグナルを、実際に測定しなくとも容易に推定することが可能となった。
【００２２】
より具体的には、
Ａ：５糖以上の奇数糖および６糖以上の偶数糖のＭＳ２スペクトルには必ず、４糖フラグメント以上の、構造上可能なすべての偶数糖フラグメントシグナルが観測される。それらのm/z値は、７５７＋ｎ×３７９（ｎは０以上の整数）近傍である。
Ｂ：５糖以上の奇数糖および４糖以上の偶数糖のＭＳ２スペクトルには必ず、３糖フラグメント以上の、構造上可能なすべての奇数糖フラグメントシグナルが観測される。それらのm/z値は、５９９＋ｍ×３７９（ｍは０以上の整数）近傍である。
【００２３】
実際に再度ＭＳ２スペクトルを精査してみると、例えば１２糖のＭＳ２スペクトル中には３糖から１１糖までの各糖鎖長のフラグメントシグナルが観測されており、一方で例えば１３糖のＭＳ２スペクトル中には３糖から１２糖までの各糖鎖長のフラグメントシグナルが観測されている。そしてすべてのフラグメント間の質量差を計算すると、これらのオリゴ糖鎖がすべてＮ−アセチルヘキソサミン（質量差221）とウロン酸（質量差158）の交互構造であることが明白である。
【００２４】
上述のように、Ｎ−アセチルヘパロサンの構造がＮ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互配列であることが、明確に示された。これにより、糖鎖配列中に種々の置換基導入などの構造修飾が施された場合に、その修飾部分を含むフラグメントイオンだけがシグナル位置を変える（修飾基の質量分）ため、その修飾基の配列上の位置を決定することが可能である。
また、一般にＮ−アセチルヘパロサンの修飾基としては、硫酸基、メチル基、アセチル基、エチル基、ベンジル基、リン酸基等が挙げられる。また、水酸基の酸化、還元や、ウロン酸のエステル化等の修飾も決定可能である。さらに、本発明の方法によれば、修飾基の位置のみならず、修飾基の質量からＮ−アセチルヘパロサンに結合している修飾基の構造も特定することが可能である。
【００２５】
簡単な例として、Ｎ−アセチルヘパロサンの６糖のオリゴ糖を水素化ホウ素ナトリウムで還元処理した場合を挙げる（図１３参照。）。図１３に示すように、処理後のオリゴ糖はＭＳ１スペクトルにおいて元の化合物よりも質量が２だけ大きかった。これについてＭＳ２スペクトルを測定したところ、還元末端を含むフラグメントイオンの質量値が２だけ増え、還元末端を含まないフラグメントイオンの質量値は不変であった。即ち、還元反応が起こった位置は、６糖配列中の還元末端糖であることが決定された。この例に止まらず、例えば、糖鎖の末端ではなく内側の任意の糖残基において修飾が施された場合においても、その配列を決定できることは充分に予測される範囲内である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
［実施例１］
（不飽和２糖のＭＳ２分析による同定）
（１）Ｎ−アセチルヘパロサン由来のオリゴ糖の調製
特開２００４−１８８４０号公報の実施例１に記載の方法と同様にして大腸菌Ｋ５菌株を培養し、Ｎ−アセチルヘパロサン画分を得て、さらに、同公報の実施例２に記載の方法と同様にしてこのＮ−アセチルヘパロサン画分を精製した。
精製したＮ−アセチルヘパロサン画分（100mg）を濃度が10mg/mlになるように、5mM酢酸カルシウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解した。
【００２７】
このN−アセチルヘパロサン溶解液に、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI（０．２ユニット）を添加し、３７℃で４５分間インキュベーションした。
その後、沸騰水浴中で反応を停止させた後、沈殿物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分）によって除去し、上清液を凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を131.25mg得た（塩類を含む）。
【００２８】
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物を、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分取精製し凍結乾燥して、Ｎ−アセチルヘパロサン由来の２糖の精製オリゴ糖画分を得た。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーには、アマシャム・バイオサイエンス社製のSuperdex Peptide 10/300GLを使用した。
【００２９】
（２）ヒアルロナン由来の調製及びコンドロイチン由来のオリゴ糖の調製
分解酵素として放線菌由来ヒアルロニダーゼを用い、ヒアルロナンを分解することで、ヒアルロナン由来の２糖のオリゴ糖を調製した。
また、分解酵素としてProteus vulgaris由来コンドロイチナーゼＡＢＣを用い、コンドロイチンを分解することで、コンドロイチン由来の２糖のオリゴ糖を調製した。
【００３０】
（３）質量分析
ESI-IT-MS（Esquire 3000 plus，ブルカー・ダルトニクス社製）およびMALDI-TOF-MS（Ultraflex，ブルカー・ダルトニクス社製）を用い、それぞれの方法にてＭＳ２スペクトルを測定した。なお、ＭＳ２スペクトルを得る際のフラグメンテーションの方法は、ESI-IT-MSにおいてはCID法、MALDI-TOF-MSにおいてはPSD法を用いた。測定用マトリックスとしてはDHB (2,5- dihydroxybenzoic acid)を用いた。
この結果をそれぞれ図１及び２に示す。なお、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和２糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
図１及び図２に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、Ｎ−アセチルヘパロサン由来２糖のＭＳ２スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、他の不飽和２糖との判別が可能であることがわかった。
【００３１】
［実施例２］
（不飽和４糖のＭＳ２分析による同定）
（１）オリゴ糖の調製
上記実施例１と同様の方法により、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチン由来の４糖のオリゴ糖を調製した。
（２）質量分析
上記実施例１と同様にして、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSを用い、それぞれの方法にてＭＳ２スペクトルを測定した。なお、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和４糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
この結果をそれぞれ図３及び４に示す。図３及び４に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、ＭＳ２スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、不飽和４糖がいずれの構造かを判別することが可能であることがわかった。
【００３２】
［実施例３］
（不飽和６糖のＭＳ２分析による同定）
（１）オリゴ糖の調製
上記実施例１と同様の方法により、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及びコンドロイチン由来の６糖のオリゴ糖を調製した。
（２）質量分析
上記実施例１と同様にして、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSを用い、それぞれの方法にてＭＳ２スペクトルを測定した。なお、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、およびコンドロイチンそれぞれの不飽和６糖のプレカーサー・イオンの位置を矢印で示した。
この結果をそれぞれ図５及び６に示す。図５及び６に示すように、ESI-IT-MSおよびMALDI-TOF-MSのどちらでも、Ｎ−アセチルヘパロサン由来６糖のＭＳ２スペクトル・パターンが顕著に異なるため、このスペクトル・パターンから、他の不飽和６糖との判別が可能であることがわかった。
【００３３】
以上の実施例により、従来微量分析が困難であったＮ−アセチルヘパロサン由来構造と、ヒアルロナン由来構造あるいはコンドロイチン由来構造との判別が、ＭＳ２スペクトルを測定することにより可能となることが示された。これは、オリゴ糖構造に含まれる種々の化学結合の安定性に基づいて差異が生じるものであり、判別の対象はここに示したもののみならず、飽和型オリゴ糖や奇数オリゴ糖、また、より長鎖のオリゴ糖についても可能である。
【００３４】
なお、ヘキソサミン異性体であるヒアルロナン及びコンドロイチン由来不飽和オリゴ糖は、４糖においてＭＳ２測定により識別可能であったが、２糖及び６糖では識別が困難であると考えられた。
また、ヒアルロナンの不飽和偶数オリゴ糖に関してMALDI-TOF-MSを用いてＭＳ２スペクトルを測定すると、必ずm/z=175（不飽和ウロン酸）と、m/z=[M-203]（Mは前駆イオンのm/z値、203は還元末端のN-アセチルヘキソサミンの質量221からグリコシド生成による脱水値18を除した値）の二本のシグナルが強く観測されることもわかった。
【００３５】
［実施例４］
（Ｎ−アセチルヘパロサンの配列決定）
（１）Ｎ−アセチルヘパロサンオリゴ糖のＭＳ１およびＭＳ２スペクトルの測定
上記実施例１の（１）に記載の方法と同様にして、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した、N-アセチルヘパロサンのオリゴ糖画分（２〜２０糖の不飽和偶数糖および３〜２１糖の奇数糖）を得た。
各オリゴ糖画分について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF-MS）装置を用いて、ＭＳ１およびＭＳ２スペクトルを測定した。
なお、質量分析装置としては、ブルカー・ダルトニクス社製のUltraflexを使用し、測定用マトリックスとしてはDHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)を用いた。ＭＳ２スペクトルは各々のオリゴ糖のＭＳ１スペクトル測定で得られた分子量関連イオンを前駆イオンとし、PSD（ポストソース分解）法により測定した。
【００３６】
（２）結果
この結果を図７〜１０に示す。図７は不飽和偶数オリゴ糖のＭＳ１スペクトル、図８は不飽和偶数オリゴ糖のＭＳ２スペクトル、図９は奇数オリゴ糖のＭＳ１スペクトル、図１０は奇数オリゴ糖のＭＳ２スペクトルを示している。
図７〜１０に示すように、不飽和偶数糖、奇数糖とも、ＭＳ２スペクトルにおいて規則性の高いシグナルが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】不飽和２糖をESI-IT-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図２】不飽和２糖をMALDI-TOF-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図３】不飽和４糖をESI-IT-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図４】不飽和４糖をMALDI-TOF-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図５】不飽和６糖をESI-IT-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図６】不飽和６糖をMALDI-TOF-MSを用いて同定した結果を示す図である。
【図７】不飽和偶数オリゴ糖のMS1スペクトルを示す図である。
【図８】不飽和偶数オリゴ糖のMS2スペクトルを示す図である。
【図９】不飽和奇数オリゴ糖のMS1スペクトルを示す図である。
【図１０】不飽和奇数オリゴ糖のMS2スペクトルを示す図である。
【図１１】Ｎ−アセチルヘパロサンの偶数オリゴ糖の構造式と、当該オリゴ糖のＭＳ２スペクトルにおいて観測されたｍ／ｚ値に基づく結合切断部位を示す図である。
【図１２】Ｎ−アセチルヘパロサンの奇数オリゴ糖の構造式と、当該オリゴ糖のＭＳ２スペクトルにおいて観測されたｍ／ｚ値に基づく結合切断部位を示す図である。
【図１３】還元処理前後のＮ−アセチルヘパロサンのオリゴ糖の構造式と、当該オリゴ糖のＭＳ２スペクトルにおいて観測されたｍ／ｚ値とを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖をＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、前記ｎ乗スペクトルから被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とするオリゴ糖の同定方法。
【請求項２】
前記ｎ乗スペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のｎ乗スペクトルとを比較することにより、被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とする請求項１に記載のオリゴ糖の同定方法。
【請求項３】
前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも１種以上を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のオリゴ糖の同定方法。
【請求項４】
前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサンに由来するオリゴ糖であることを同定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴ糖の同定方法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖をＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、
前記ｎ乗スペクトルから前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得ることを特徴とするオリゴ糖の配列分析方法。
【請求項６】
前記修飾基情報が、少なくともオリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造のいずれかを含むことを特徴とする請求項５に記載のオリゴ糖の配列分析方法。
【請求項１】
Ｎ−アセチルヘキソサミンとウロン酸との交互繰り返し構造を有する被検オリゴ糖をＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、前記ｎ乗スペクトルから被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とするオリゴ糖の同定方法。
【請求項２】
前記ｎ乗スペクトルと、予め用意した標準オリゴ糖のｎ乗スペクトルとを比較することにより、被検オリゴ糖の同定を行うことを特徴とする請求項１に記載のオリゴ糖の同定方法。
【請求項３】
前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサン、ヒアルロナン、及び、コンドロイチンに由来するオリゴ糖の少なくとも１種以上を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のオリゴ糖の同定方法。
【請求項４】
前記被検オリゴ糖が、Ｎ−アセチルヘパロサンに由来するオリゴ糖であることを同定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴ糖の同定方法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルヘパロサン由来の被検オリゴ糖をＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該被検オリゴ糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を得て、
前記ｎ乗スペクトルから前記被検オリゴ糖における修飾基情報を得ることを特徴とするオリゴ糖の配列分析方法。
【請求項６】
前記修飾基情報が、少なくともオリゴ糖における修飾基の位置及び修飾基の構造のいずれかを含むことを特徴とする請求項５に記載のオリゴ糖の配列分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００６−２９２６２７（Ｐ２００６−２９２６２７Ａ）
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１１６０１４（Ｐ２００５−１１６０１４）
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、糖鎖エンジニアリングプロジェクト／糖鎖構造解析技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、糖鎖エンジニアリングプロジェクト／糖鎖構造解析技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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