オーチャードグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用
【課題】簡便、迅速かつ正確なオーチャードグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対、マーカー遺伝子、及び品種識別方法を提供する。
【解決手段】オーチャードグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対、該プライマー対を利用してＰＣＲ増幅した増幅産物からなる特定マーカー遺伝子、及び識別対象となるオーチャードグラスのバルクＤＮＡを使用することで、個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させ、増幅された特定マーカー遺伝子断片の長さの違いを検出することで、品種の識別を行う、オーチャードグラス１４品種の品種識別方法。
【解決手段】オーチャードグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対、該プライマー対を利用してＰＣＲ増幅した増幅産物からなる特定マーカー遺伝子、及び識別対象となるオーチャードグラスのバルクＤＮＡを使用することで、個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させ、増幅された特定マーカー遺伝子断片の長さの違いを検出することで、品種の識別を行う、オーチャードグラス１４品種の品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーチャードグラスの品種の識別のために、特定のＳＳＲ領域を増幅させる遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対及びその利用に関するものであり、更に詳しくは、オーチャードグラス１４品種を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用のＦプライマー及びＲプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、該マーカーを利用してオーチャードグラスの品種を識別する方法に関するものである。本発明は、オーチャードグラスの品種識別用のＳＳＲプライマー、該プライマーを利用してオーチャードグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、その増幅断片のマーカーを比較することで品種を識別することを可能とするオーチャードグラス品種の識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ Ｌ．）は、寒地型牧草として利用される多年生イネ科の植物である。牧草として利用されているオーチャードグラス品種の大半は、４倍体（２ｎ＝２８）である。
【０００３】
先行技術として、主に飼料作物として利用される他殖性のイネ科牧草の品種識別法としては、イタリアンライグラスにおいて、１２品種を識別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００４】
この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲで増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種を識別するものである。しかし、オーチャードグラスにおいては、このような品種識別法が開発されていない。
【０００５】
このため、オーチャードグラスの品種識別は、これまで、圃場での特性調査により行われてきた。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日、草型、葉身長等の形質を調査し、共に栽培した６０個体の標準個体と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）調査のための圃場が必要である、２）調査に多くの労力が必要である、３）調査結果が判明するまでに多くの時間が必要である、等の問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２３７１８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、短期間で、簡便且つ正確にオーチャードグラス１４品種を識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅されるマーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとしたオーチャードグラスの品種識別を可能にするＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）用のＳＳＲプライマー対を提供することを目的とするものである。
【０００９】
本発明は、労力及び時間が必要な従来の圃場での特性調査に代わり、短期間で、簡便且つ正確にオーチャードグラスの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、該マーカーを利用したオーチャードグラスの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）オーチャードグラスの品種識別用のプライマーであって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１５のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１６〜３０のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（４）前記（２）に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするオーチャードグラスの品種識別用プライマーセット。
（５）オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーからＰＣＲ増幅させた特定の増幅産物からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
（６）前記（５）に記載のマーカー遺伝子であって、配列表の配列番号３１〜４５のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするマーカー遺伝子。
（７）前記（５）又は（６）に記載のマーカー遺伝子を使用し、識別対象のオーチャードグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラスの品種識別方法。
（８）識別対象のオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラス品種識別方法。
（９）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）アキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種からなるオーチャードグラス品種を識別する、前記（７）〜（９）のいずれかに記載の品種識別方法。
【００１１】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、オーチャードグラスの品種識別用のプライマーであって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、オーチャードグラスの品種識別方法であって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅される特定マーカーを使用し、識別対象のオーチャードグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで、品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明では、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対から、識別対象のオーチャードグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーサイズ、及びバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで、品種を識別する。
【００１３】
対象品種のバルクＤＮＡを使用することで、１個体毎の解析を行わないため、オーチャードグラスの遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の解析が行える。すなわち、本発明では、個体単位での解析が不要となるため、対象品種のバルクＤＮＡを使用したオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う。他殖性であるオーチャードグラスは、遺伝的に個体間で異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることで、品種の非特異的な個体間の差異を無くし、かつ効率よく品種の識別が可能となる。
【００１４】
本発明により、オーチャードグラス品種を識別するオーチャードグラスのＳＳＲマーカーが提供され、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、オーチャードグラスのアキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種の品種識別を行うことができる。
【００１５】
本発明では、２〜４塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの１５対（表１参照）で、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるオーチャードグラス１４品種について、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで、品種を識別する。
【００１６】
本発明では、実際の使用時に、バルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため、対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体混合するバルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより識別が行われる。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたオーチャードグラスＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００１７】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「ｐｒｉｍｅｒ ０．５，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明のオーチャードグラスの品種識別に有用なプライマー対の配列を、次の表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
次に、上記表１の配列のプライマー対の１４品種内での増幅型の詳細について説明する（表２参照）。
【００２０】
プライマー「ＯＧ２０２」は、ハルジマン及びトヨミドリを識別するプライマー対で、２３０ｂｐ付近で、ハルジマンに特異的な増幅を示し、１４５〜１７５ｂｐの間に、トヨミドリ特有の増幅を示し、品種特異的な増幅があることを示す。
【００２１】
プライマー「ＯＧ２６１」は、ベンチマークを識別するプライマー対で、２３０ｂｐ付近に、ベンチマークに特異的な増幅を示す。
【００２２】
プライマー「ＯＧ２６４」は、マキバミドリを識別するプライマー対で、２３０から２５５ｂｐの間で、マキバミドリに特異的な増幅を示す。
【００２３】
プライマー「ＯＧ３５７」は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違い、すなわち、品種特異的なバンドパターンによって、フロンティア及びポトマックの識別を行うことができる。「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」と比較することが必要となる。
【００２４】
プライマー「ＯＧ４７４」は、オカミドリを識別するプライマー対で、１４５〜１７５ｂｐの間で、オカミドリに特異的な増幅を示す。
【００２５】
プライマー「ＯＧ４９３」は、アキミドリＩＩを識別するプライマー対であって、１４５〜１７５ｂｐの間で、アキミドリＩＩに特異的な増幅を示す。「ＯＧ９５４」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００２６】
プライマー「ＯＧ５０３」は、はるねみどりを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で、はるねみどりに特異的な増幅を示す。
【００２７】
プライマー「ＯＧ６５４」は、ワセミドリを識別するプライマー対で、１４５ｂｐ付近で、ワセミドリに特異的な増幅を示す。
【００２８】
プライマー「ＯＧ６７０」は、ナツミドリを識別するプライマー対で、１００ｂｐ付近で、ナツミドリに特異的な増幅を示す。
【００２９】
プライマー「ＯＧ７５７」は、まきばたろうを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示す。「ＯＧ８２７」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００３０】
プライマー「ＯＧ７８５」は、キタミドリを識別するプライマー対で、１７６ｂｐ付近で、キタミドリに特異的な増幅を示す。
【００３１】
プライマー「ＯＧ８０６」は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違い、すなわち、品種特異的な増幅があることによって、フロンティア及びポトマックの識別を行うことができる。「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」と比較することが必要となる。
【００３２】
プライマー「ＯＧ８２７」は、まきばたろうを識別するプライマー対で、２０４ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示す。「ＯＧ７５７」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００３３】
プライマー「ＯＧ９５４」は、アキミドリＩＩ及びバッカスを識別するプライマー対で、１７５〜２００ｂｐの間で、アキミドリＩＩ特有の増幅を示し、１７５ｂｐ付近で、バッカスに特異的な増幅を示す。アキミドリＩＩについては、「ＯＧ９５４」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００３４】
プライマー「ＯＧ９６５」は、１７５ｂｐ付近の増幅で、フロンティアとポトマック間の区別性を示す。「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」と比較することが必要となる。
【００３５】
上述のプライマー対を、１４品種で比較した場合に見られるバンドパターンを、次の表２にまとめて示す。
【００３６】
【表２】
【発明の効果】
【００３７】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、オーチャードグラスの品種を識別するオーチャードグラスのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、オーチャードグラスの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、アキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、からなる１４品種相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例におけるＯＧ４９３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍは、サイズマーカーを示し、そのサイズを右端にｂｐで記載する。それぞれの品種４サンプルの電気泳動の結果を示す。図２〜１５も同様である。
【図２】実施例におけるＯＧ９５４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例におけるＯＧ７８５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるＯＧ６７０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるＯＧ４７４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるＯＧ６５４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるＯＧ２０２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるＯＧ２６４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるＯＧ２６１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるＯＧ５０３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるＯＧ３５７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１２】実施例におけるＯＧ８０６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１３】実施例におけるＯＧ９６５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１４】実施例におけるＯＧ７５７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１５】実施例におけるＯＧ８２７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１６】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【図１７】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【図１８】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【図１９】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
国内で育成されたオーチャードグラスのアキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４１】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合し、バルクにしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００４２】
本実施例で使用した機器は、以下の通りである。
すなわち、本実施例では、Ｔ ＧＲＡＤＩＥＮＴ Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＴＰ６００（タカラバイオ株式会社）、ｉ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、及び、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ）、ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いた。
【００４３】
＜５０％アクリルアミドゲル＞
本実施例で使用した試薬は、以下の通りである。
アクリルアミドゲルとして、尿素（和光純薬工業株式会社）、Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ Ｇｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、１０ｘＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）、を用いた。
【００４４】
＜ＰＣＲ反応液＞
ＰＣＲ反応液として、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（和光純薬工業株式会社）もしくはＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢＩＯ ＮＥＥＲ）、１ｐｍｏｌ／μｌ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）、を用いた。サイズマーカーとして、５０−３５０ｂｐ ＳＩＺＩＮＧ ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用した。本発明では、ＬＩ−ＣＯＲのプロトコールに基づいて、ゲルと色素マーカーの作製を行った。
【００４５】
＜ＰＣＲ反応液：計１０μｌの調製＞
ＰＣＲ反応液の調製は、以下の通りとした。
トールフェスク対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（５ ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
ＢＩＯ ＮＥＥＲのＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する場合にも、同様にＰＣＲ反応液を調製した。
【００４６】
＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲ条件は、以下の通りとした。
９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００４７】
本実施例では、特に記載しない限り、オーチャードグラスのアキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種を、テンプレートとして使用した。
【００４８】
本実施例では、オーチャードグラスの１４品種それぞれのバルクしたＤＮＡを、４サンプル使用して、電気泳動を行い、１４品種を同時に比較した（図１〜１５）。
【００４９】
プライマー「ＯＧ４９３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１に示す。このプライマー対は、１４５〜１７５ｂｐの間で、アキミドリＩＩに特異的な増幅を示し、アキミドリＩＩの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ９５４」を併用することで、識別精度が向上した。
【００５０】
プライマー「ＯＧ９５４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２に示す。このプライマー対は、１７５〜２００ｂｐの間で、アキミドリＩＩ特有の増幅を示し、１７５ｂｐ付近で、バッカスに特異的な増幅を示し、２品種の識別に有効であった。アキミドリＩＩについては、プライマー「ＯＧ４９３」を併用することで、識別精度が向上した。
【００５１】
プライマー「ＯＧ７８５」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図３に示す。このプライマー対は、１７６ｂｐ付近で、キタミドリに特異的な増幅を示し、キタミドリの識別に有効であった。
【００５２】
プライマー「ＯＧ６７０」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図４に示す。このプライマー対は、１００ｂｐ付近で、ナツミドリに特異的な増幅を示し、ナツミドリの識別に有効であった。
【００５３】
プライマー「ＯＧ４７４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図５に示す。このプライマー対は、１４５〜１７５ｂｐの間で、オカミドリに特異的な増幅を示し、オカミドリの識別に有効であった。キタミドリによく似たサイズの増幅が見られることから、キタミドリのバルクＤＮＡをスタンダードとして、同時に泳動し、比較することが必要になる。
【００５４】
プライマー「ＯＧ６５４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図６に示す。このプライマー対は、１４５ｂｐ付近で、ワセミドリに特異的な増幅を示し、ワセミドリの識別に有効であった。
【００５５】
プライマー「ＯＧ２０２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図７に示す。このプライマー対では、２３０ｂｐ付近で、ハルジマンに特異的な増幅を示し、１４５〜１７５ｂｐの間に、トヨミドリ特有の増幅を示し、これらの２品種の識別に有効であった。
【００５６】
プライマー「ＯＧ２６４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図８に示す。このプライマー対は、２３０から２５５ｂｐの間で、マキバミドリに特異的な増幅を示し、マキバミドリの識別に有効であった。
【００５７】
プライマー「ＯＧ２６１」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図９に示す。このプライマー対は、２３０ｂｐ付近で、ベンチマークに特異的な増幅を示し、ベンチマークの識別に有効であった。
【００５８】
プライマー「ＯＧ５０３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１０に示す。このプライマー対は、２００ｂｐ付近で、はるねみどりに特異的な増幅を示し、はるねみどりの識別に有効であった。
【００５９】
プライマー「ＯＧ３５７」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１１に示す。このプライマー対は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違いによって、フロンティア及びポトマックの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」を併用することで、精度を向上させることができる。
【００６０】
プライマー「ＯＧ８０６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１２に示す。このプライマー対は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違いによって、フロンティア及びポトマックの識別を行うことができた。プライマー「ＯＧ３５７」及び「ＯＧ９６５」を併用することで、精度を向上させることができる。
【００６１】
プライマー「ＯＧ９６５」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１３に示す。このプライマー対は、１７５ｂｐ付近の増幅でフロンティアとポトマック間の区別性を示し、フロンティア及びポトマックの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ３５７」及び「ＯＧ８０６」を併用することで、精度を向上させることができる。
【００６２】
プライマー「ＯＧ７５７」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１４に示す。このプライマー対は、１２０ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示し、まきばたろうの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ８２７」を併用することで、識別精度が向上した。
【００６３】
「ＯＧ８２７」を使用しＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１５に示す。このプライマー対は、２０４ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示し、まきばたろうの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ７５７」を併用することで、識別精度が向上した。本発明のプライマーで増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、図１６〜１９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上詳述したように、本発明は、オーチャードグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、オーチャードグラス１４品種の特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対を提供することができる。また、本発明は、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲにより識別対象の遺伝子を増幅させてなるマーカー遺伝子を提供することができ、そのマーカー遺伝子のサイズ及びバンドパターンを検証することにより、オーチャードグラスの品種識別を行うことができる。本発明により、オーチャードグラスの１４品種相互での品種識別を行うことができる。本発明は、短い時間で、正確なオーチャードグラスの品種識別を可能にする新しい品種識別方法を提供するものとして有用である。
【符号の説明】
【００６５】
１ アキミドリＩＩ
２ キタミドリ
３ ナツミドリ
４ バッカス
５ オカミドリ
６ ワセミドリ
７ ハルジマン
９ マキバミドリ
１０ トヨミドリ
１１ ベンチマーク
１２ はるねみどり
１３ フロンティア
１４ ポトマック
１５ まきばたろう
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーチャードグラスの品種の識別のために、特定のＳＳＲ領域を増幅させる遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対及びその利用に関するものであり、更に詳しくは、オーチャードグラス１４品種を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用のＦプライマー及びＲプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、該マーカーを利用してオーチャードグラスの品種を識別する方法に関するものである。本発明は、オーチャードグラスの品種識別用のＳＳＲプライマー、該プライマーを利用してオーチャードグラスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、その増幅断片のマーカーを比較することで品種を識別することを可能とするオーチャードグラス品種の識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ Ｌ．）は、寒地型牧草として利用される多年生イネ科の植物である。牧草として利用されているオーチャードグラス品種の大半は、４倍体（２ｎ＝２８）である。
【０００３】
先行技術として、主に飼料作物として利用される他殖性のイネ科牧草の品種識別法としては、イタリアンライグラスにおいて、１２品種を識別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００４】
この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲで増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種を識別するものである。しかし、オーチャードグラスにおいては、このような品種識別法が開発されていない。
【０００５】
このため、オーチャードグラスの品種識別は、これまで、圃場での特性調査により行われてきた。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日、草型、葉身長等の形質を調査し、共に栽培した６０個体の標準個体と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）調査のための圃場が必要である、２）調査に多くの労力が必要である、３）調査結果が判明するまでに多くの時間が必要である、等の問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２３７１８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、短期間で、簡便且つ正確にオーチャードグラス１４品種を識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅されるマーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとしたオーチャードグラスの品種識別を可能にするＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）用のＳＳＲプライマー対を提供することを目的とするものである。
【０００９】
本発明は、労力及び時間が必要な従来の圃場での特性調査に代わり、短期間で、簡便且つ正確にオーチャードグラスの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、該マーカーを利用したオーチャードグラスの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）オーチャードグラスの品種識別用のプライマーであって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１５のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１６〜３０のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（４）前記（２）に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするオーチャードグラスの品種識別用プライマーセット。
（５）オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーからＰＣＲ増幅させた特定の増幅産物からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
（６）前記（５）に記載のマーカー遺伝子であって、配列表の配列番号３１〜４５のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするマーカー遺伝子。
（７）前記（５）又は（６）に記載のマーカー遺伝子を使用し、識別対象のオーチャードグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラスの品種識別方法。
（８）識別対象のオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラス品種識別方法。
（９）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）アキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種からなるオーチャードグラス品種を識別する、前記（７）〜（９）のいずれかに記載の品種識別方法。
【００１１】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、オーチャードグラスの品種識別用のプライマーであって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、オーチャードグラスの品種識別方法であって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅される特定マーカーを使用し、識別対象のオーチャードグラスＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで、品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明では、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対から、識別対象のオーチャードグラス遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーサイズ、及びバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで、品種を識別する。
【００１３】
対象品種のバルクＤＮＡを使用することで、１個体毎の解析を行わないため、オーチャードグラスの遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の解析が行える。すなわち、本発明では、個体単位での解析が不要となるため、対象品種のバルクＤＮＡを使用したオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う。他殖性であるオーチャードグラスは、遺伝的に個体間で異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることで、品種の非特異的な個体間の差異を無くし、かつ効率よく品種の識別が可能となる。
【００１４】
本発明により、オーチャードグラス品種を識別するオーチャードグラスのＳＳＲマーカーが提供され、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、オーチャードグラスのアキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種の品種識別を行うことができる。
【００１５】
本発明では、２〜４塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの１５対（表１参照）で、単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるオーチャードグラス１４品種について、ＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで、品種を識別する。
【００１６】
本発明では、実際の使用時に、バルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため、対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体混合するバルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより識別が行われる。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたオーチャードグラスＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００１７】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「ｐｒｉｍｅｒ ０．５，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明のオーチャードグラスの品種識別に有用なプライマー対の配列を、次の表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
次に、上記表１の配列のプライマー対の１４品種内での増幅型の詳細について説明する（表２参照）。
【００２０】
プライマー「ＯＧ２０２」は、ハルジマン及びトヨミドリを識別するプライマー対で、２３０ｂｐ付近で、ハルジマンに特異的な増幅を示し、１４５〜１７５ｂｐの間に、トヨミドリ特有の増幅を示し、品種特異的な増幅があることを示す。
【００２１】
プライマー「ＯＧ２６１」は、ベンチマークを識別するプライマー対で、２３０ｂｐ付近に、ベンチマークに特異的な増幅を示す。
【００２２】
プライマー「ＯＧ２６４」は、マキバミドリを識別するプライマー対で、２３０から２５５ｂｐの間で、マキバミドリに特異的な増幅を示す。
【００２３】
プライマー「ＯＧ３５７」は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違い、すなわち、品種特異的なバンドパターンによって、フロンティア及びポトマックの識別を行うことができる。「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」と比較することが必要となる。
【００２４】
プライマー「ＯＧ４７４」は、オカミドリを識別するプライマー対で、１４５〜１７５ｂｐの間で、オカミドリに特異的な増幅を示す。
【００２５】
プライマー「ＯＧ４９３」は、アキミドリＩＩを識別するプライマー対であって、１４５〜１７５ｂｐの間で、アキミドリＩＩに特異的な増幅を示す。「ＯＧ９５４」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００２６】
プライマー「ＯＧ５０３」は、はるねみどりを識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で、はるねみどりに特異的な増幅を示す。
【００２７】
プライマー「ＯＧ６５４」は、ワセミドリを識別するプライマー対で、１４５ｂｐ付近で、ワセミドリに特異的な増幅を示す。
【００２８】
プライマー「ＯＧ６７０」は、ナツミドリを識別するプライマー対で、１００ｂｐ付近で、ナツミドリに特異的な増幅を示す。
【００２９】
プライマー「ＯＧ７５７」は、まきばたろうを識別するプライマー対で、１２０ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示す。「ＯＧ８２７」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００３０】
プライマー「ＯＧ７８５」は、キタミドリを識別するプライマー対で、１７６ｂｐ付近で、キタミドリに特異的な増幅を示す。
【００３１】
プライマー「ＯＧ８０６」は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違い、すなわち、品種特異的な増幅があることによって、フロンティア及びポトマックの識別を行うことができる。「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」と比較することが必要となる。
【００３２】
プライマー「ＯＧ８２７」は、まきばたろうを識別するプライマー対で、２０４ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示す。「ＯＧ７５７」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００３３】
プライマー「ＯＧ９５４」は、アキミドリＩＩ及びバッカスを識別するプライマー対で、１７５〜２００ｂｐの間で、アキミドリＩＩ特有の増幅を示し、１７５ｂｐ付近で、バッカスに特異的な増幅を示す。アキミドリＩＩについては、「ＯＧ９５４」と併用することで、識別能を向上させることができる。
【００３４】
プライマー「ＯＧ９６５」は、１７５ｂｐ付近の増幅で、フロンティアとポトマック間の区別性を示す。「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」と比較することが必要となる。
【００３５】
上述のプライマー対を、１４品種で比較した場合に見られるバンドパターンを、次の表２にまとめて示す。
【００３６】
【表２】
【発明の効果】
【００３７】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、オーチャードグラスの品種を識別するオーチャードグラスのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、オーチャードグラスの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、アキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、からなる１４品種相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例におけるＯＧ４９３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍは、サイズマーカーを示し、そのサイズを右端にｂｐで記載する。それぞれの品種４サンプルの電気泳動の結果を示す。図２〜１５も同様である。
【図２】実施例におけるＯＧ９５４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例におけるＯＧ７８５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例におけるＯＧ６７０を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例におけるＯＧ４７４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例におけるＯＧ６５４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例におけるＯＧ２０２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例におけるＯＧ２６４を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例におけるＯＧ２６１を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１０】実施例におけるＯＧ５０３を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１１】実施例におけるＯＧ３５７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１２】実施例におけるＯＧ８０６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１３】実施例におけるＯＧ９６５を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１４】実施例におけるＯＧ７５７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１５】実施例におけるＯＧ８２７を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図１６】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【図１７】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【図１８】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【図１９】本発明のプライマーで増幅した特定マーカーの塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
国内で育成されたオーチャードグラスのアキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４１】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合し、バルクにしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００４２】
本実施例で使用した機器は、以下の通りである。
すなわち、本実施例では、Ｔ ＧＲＡＤＩＥＮＴ Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＴＰ６００（タカラバイオ株式会社）、ｉ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、及び、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ）、ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いた。
【００４３】
＜５０％アクリルアミドゲル＞
本実施例で使用した試薬は、以下の通りである。
アクリルアミドゲルとして、尿素（和光純薬工業株式会社）、Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ Ｇｅｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、１０ｘＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）、を用いた。
【００４４】
＜ＰＣＲ反応液＞
ＰＣＲ反応液として、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（和光純薬工業株式会社）もしくはＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢＩＯ ＮＥＥＲ）、１ｐｍｏｌ／μｌ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）、を用いた。サイズマーカーとして、５０−３５０ｂｐ ＳＩＺＩＮＧ ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用した。本発明では、ＬＩ−ＣＯＲのプロトコールに基づいて、ゲルと色素マーカーの作製を行った。
【００４５】
＜ＰＣＲ反応液：計１０μｌの調製＞
ＰＣＲ反応液の調製は、以下の通りとした。
トールフェスク対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ（５ ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
ＢＩＯ ＮＥＥＲのＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する場合にも、同様にＰＣＲ反応液を調製した。
【００４６】
＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲ条件は、以下の通りとした。
９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００４７】
本実施例では、特に記載しない限り、オーチャードグラスのアキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種を、テンプレートとして使用した。
【００４８】
本実施例では、オーチャードグラスの１４品種それぞれのバルクしたＤＮＡを、４サンプル使用して、電気泳動を行い、１４品種を同時に比較した（図１〜１５）。
【００４９】
プライマー「ＯＧ４９３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１に示す。このプライマー対は、１４５〜１７５ｂｐの間で、アキミドリＩＩに特異的な増幅を示し、アキミドリＩＩの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ９５４」を併用することで、識別精度が向上した。
【００５０】
プライマー「ＯＧ９５４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図２に示す。このプライマー対は、１７５〜２００ｂｐの間で、アキミドリＩＩ特有の増幅を示し、１７５ｂｐ付近で、バッカスに特異的な増幅を示し、２品種の識別に有効であった。アキミドリＩＩについては、プライマー「ＯＧ４９３」を併用することで、識別精度が向上した。
【００５１】
プライマー「ＯＧ７８５」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図３に示す。このプライマー対は、１７６ｂｐ付近で、キタミドリに特異的な増幅を示し、キタミドリの識別に有効であった。
【００５２】
プライマー「ＯＧ６７０」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図４に示す。このプライマー対は、１００ｂｐ付近で、ナツミドリに特異的な増幅を示し、ナツミドリの識別に有効であった。
【００５３】
プライマー「ＯＧ４７４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図５に示す。このプライマー対は、１４５〜１７５ｂｐの間で、オカミドリに特異的な増幅を示し、オカミドリの識別に有効であった。キタミドリによく似たサイズの増幅が見られることから、キタミドリのバルクＤＮＡをスタンダードとして、同時に泳動し、比較することが必要になる。
【００５４】
プライマー「ＯＧ６５４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図６に示す。このプライマー対は、１４５ｂｐ付近で、ワセミドリに特異的な増幅を示し、ワセミドリの識別に有効であった。
【００５５】
プライマー「ＯＧ２０２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図７に示す。このプライマー対では、２３０ｂｐ付近で、ハルジマンに特異的な増幅を示し、１４５〜１７５ｂｐの間に、トヨミドリ特有の増幅を示し、これらの２品種の識別に有効であった。
【００５６】
プライマー「ＯＧ２６４」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図８に示す。このプライマー対は、２３０から２５５ｂｐの間で、マキバミドリに特異的な増幅を示し、マキバミドリの識別に有効であった。
【００５７】
プライマー「ＯＧ２６１」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図９に示す。このプライマー対は、２３０ｂｐ付近で、ベンチマークに特異的な増幅を示し、ベンチマークの識別に有効であった。
【００５８】
プライマー「ＯＧ５０３」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１０に示す。このプライマー対は、２００ｂｐ付近で、はるねみどりに特異的な増幅を示し、はるねみどりの識別に有効であった。
【００５９】
プライマー「ＯＧ３５７」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１１に示す。このプライマー対は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違いによって、フロンティア及びポトマックの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ８０６」及び「ＯＧ９６５」を併用することで、精度を向上させることができる。
【００６０】
プライマー「ＯＧ８０６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１２に示す。このプライマー対は、１４５ｂｐ付近の増幅パターンの違いによって、フロンティア及びポトマックの識別を行うことができた。プライマー「ＯＧ３５７」及び「ＯＧ９６５」を併用することで、精度を向上させることができる。
【００６１】
プライマー「ＯＧ９６５」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１３に示す。このプライマー対は、１７５ｂｐ付近の増幅でフロンティアとポトマック間の区別性を示し、フロンティア及びポトマックの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ３５７」及び「ＯＧ８０６」を併用することで、精度を向上させることができる。
【００６２】
プライマー「ＯＧ７５７」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１４に示す。このプライマー対は、１２０ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示し、まきばたろうの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ８２７」を併用することで、識別精度が向上した。
【００６３】
「ＯＧ８２７」を使用しＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を図１５に示す。このプライマー対は、２０４ｂｐ付近で、まきばたろうに特異的な増幅を示し、まきばたろうの識別に有効であった。プライマー「ＯＧ７５７」を併用することで、識別精度が向上した。本発明のプライマーで増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、図１６〜１９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上詳述したように、本発明は、オーチャードグラスの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、オーチャードグラス１４品種の特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対を提供することができる。また、本発明は、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲにより識別対象の遺伝子を増幅させてなるマーカー遺伝子を提供することができ、そのマーカー遺伝子のサイズ及びバンドパターンを検証することにより、オーチャードグラスの品種識別を行うことができる。本発明により、オーチャードグラスの１４品種相互での品種識別を行うことができる。本発明は、短い時間で、正確なオーチャードグラスの品種識別を可能にする新しい品種識別方法を提供するものとして有用である。
【符号の説明】
【００６５】
１ アキミドリＩＩ
２ キタミドリ
３ ナツミドリ
４ バッカス
５ オカミドリ
６ ワセミドリ
７ ハルジマン
９ マキバミドリ
１０ トヨミドリ
１１ ベンチマーク
１２ はるねみどり
１３ フロンティア
１４ ポトマック
１５ まきばたろう
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーチャードグラスの品種識別用のプライマーであって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１５のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１６〜３０のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項２に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするオーチャードグラスの品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１から４のいずれかに記載のプライマーからＰＣＲ増幅させた特定の増幅産物からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載のマーカー遺伝子であって、配列表の配列番号３１〜４５のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするマーカー遺伝子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のマーカー遺伝子を使用し、識別対象のオーチャードグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラスの品種識別方法。
【請求項８】
識別対象のオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラス品種識別方法。
【請求項９】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
アキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種からなるオーチャードグラス品種を識別する、請求項７〜９のいずれかに記載の品種識別方法。
【請求項１】
オーチャードグラスの品種識別用のプライマーであって、オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１５のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号１６〜３０のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項２に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするオーチャードグラスの品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
オーチャードグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１から４のいずれかに記載のプライマーからＰＣＲ増幅させた特定の増幅産物からなることを特徴とするマーカー遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載のマーカー遺伝子であって、配列表の配列番号３１〜４５のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするマーカー遺伝子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のマーカー遺伝子を使用し、識別対象のオーチャードグラスＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラスの品種識別方法。
【請求項８】
識別対象のオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするオーチャードグラス品種識別方法。
【請求項９】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したオーチャードグラス遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
アキミドリＩＩ、キタミドリ、ナツミドリ、バッカス、オカミドリ、ワセミドリ、ハルジマン、マキバミドリ、トヨミドリ、ベンチマーク、はるねみどり、フロンティア、ポトマック、まきばたろう、の１４品種からなるオーチャードグラス品種を識別する、請求項７〜９のいずれかに記載の品種識別方法。
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−２１１９４８（Ｐ２０１１−２１１９４８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８２４８２（Ｐ２０１０−８２４８２）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０１０２５３８８）社団法人日本草地畜産種子協会 (11)
【Ｆターム（参考）】
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