オートタキシン測定による膵疾患の検査方法および検査薬
【課題】膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患と膵臓癌との診断や判別が可能な簡便な検査方法および検査薬を提供すること。
【解決手段】健常者と比較し非癌膵疾患患者ではオートタキシン濃度が低値を示すこと、および膵疾患において非癌膵疾患患者では膵臓癌患者と比較しオートタキシン濃度が低値を示すことを利用した膵疾患の検査方法、ならびに前記方法を利用した検査薬により、前記課題を解決する。
【解決手段】健常者と比較し非癌膵疾患患者ではオートタキシン濃度が低値を示すこと、および膵疾患において非癌膵疾患患者では膵臓癌患者と比較しオートタキシン濃度が低値を示すことを利用した膵疾患の検査方法、ならびに前記方法を利用した検査薬により、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト検体中のオートタキシン濃度の測定による膵疾患の検査方法および検査薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトオートタキシンは、１９９２年Ｍ．Ｌ．ＳｔｒａｃｋｅらによってＡ２０５８ヒト黒色腫細胞培養培地から細胞運動性を惹起する物質として単離された分子量約１２５ＫＤａの糖蛋白質である（非特許文献１）。オートタキシンはそのリゾホスホリパーゼＤ活性によりリゾホスファチジルコリンを基質としリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。生体内ではＬＰＡが癌の増殖、転移に関与していることが多くの研究者により示され（非特許文献２から４）、その産生酵素であるオートタキシンと様々な疾病との因果関係が研究されている。最近になり、ヒトオートタキシンを定量する手法が確立され（特許文献１、非特許文献５）、様々な疾患の診断マーカーとして期待されている。
【０００３】
オートタキシンはそのＬＰＡ産生能から癌あるいは癌転移との関連が注目され現在も盛んに研究されている。１９９２年に癌との関連を示した特許が出願され（特許文献２および３）、その後ヒトテラトカルシノーマ（非特許文献６）、肺の非小細胞癌（非特許文献７）、甲状腺癌（非特許文献８）、乳癌（非特許文献９）、多型膠芽腫（非特許文献１０および１１）、前立腺癌（非特許文献１２）、ホジキンリンパ腫（非特許文献１３）など多種多様な癌においてオートタキシンの関与が報告されている。しかしながら、これら報告はいずれも臓器における発現に関する報告である。
【０００４】
一方、体液中のオートタキシン濃度の上昇に関する報告は、卵巣癌患者血清で差が認められない報告（非特許文献１４）、前立腺癌患者血清で差が認められない報告（非特許文献１５）など否定的な報告が多く、肯定的な報告としては、卵巣癌患者腹水中でオートタキシン濃度の上昇が示された論文や悪性腫瘍の一つである悪性リンパ腫患者で血清オートタキシン濃度が高値を示す報告がある（特許文献１、非特許文献１６）。これら報告から、健常者血清のオートタキシン濃度は比較的高く、癌細胞がオートタキシンを産生しても血清濃度を上昇させるに至るほどではないことを示唆しており、腹水中の卵巣癌細胞や血液中に癌細胞が存在する悪性リンパ腫でのみ血清オートタキシン濃度の上昇が検出された結果であることが示唆される。したがって、癌における体液中のオートタキシン濃度の上昇は極めて限定的な癌にのみ検出可能であるといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０１６１８６号
【特許文献２】米国公開２００６／０２７５８６５号公報
【特許文献３】加国登録２１２８２１５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６、２５２４、１９９２
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、３、５８２、２００３
【非特許文献３】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０、１０９、８３３、２００４
【非特許文献４】Ｂｌｏｏｄ、１０６、２１３８、２００５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、３８８、５１、２００８
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２１８、７１４、１９９６
【非特許文献７】Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１２１６、１９９９
【非特許文献８】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０９、８３３、２００４
【非特許文献９】Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１９、６０３、２００２
【非特許文献１０】Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、７、７、２００５
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１、１７４９２、２００６
【非特許文献１２】Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２１０、１１１、２００７
【非特許文献１３】Ｂｌｏｏｄ、１０６、２１３８、２００５
【非特許文献１４】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、８０、１６４１、２００７
【非特許文献１５】Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４４、５４９、２００７
【非特許文献１６】Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ、１４３、６０、２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、血清マーカー検査、画像検査により様々な膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患および膵臓癌の診断や判別が可能な簡便な検査方法ならびに検査薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述したように、従来からヒト組織または体液中のオートタキシン濃度が様々な疾病により変動することを示唆する報告がある。しかしながら、これまではオートタキシンを定量する方法がなかったため、様々な疾病との因果関係の解析がなされてこなかった。近年、本発明者により得られた特許文献１に記載の測定方法により、血清などのヒト検体中のオートタキシン濃度を簡便、短時間、かつ信頼性高く定量することが可能となった。特許文献１に記載の測定方法はリゾホスホリパーゼＤ活性測定値と極めて良好な相関性を示すことが確認されており、いずれの手法においてもオートタキシン濃度の測定が可能である（非特許文献５）。そこで、特許文献１に記載の測定方法およびリゾホスホリパーゼＤ活性測定を用い鋭意検討を重ねた結果、健常者、非癌膵疾患、膵臓癌において血液中のオートタキシン濃度およびリゾホスホリパーゼＤ活性に差が生じることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
詳しくは、本願は下記の発明を包含する：
（１）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定することによる膵疾患の検査方法。
（２）前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、（１）に記載の方法。
（３）膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である（１）又は（２）に記載の検査方法。
（４）非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである（２）に記載の検査方法。
（５）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の健常者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載の検査方法。
（６）膵疾患が膵臓癌である（２）に記載の検査方法。
（７）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、（６）に記載の検査方法。
（８）血清検査または画像診断と、（１）から（７）のいずれかに記載の検査方法とを組み合わせた膵疾患の検査方法。
（９）血清検査がＣＡ１９−９、ＣＡ−５０、ＤＵ−ＰＡＮ−２、Ｓｐａｎ−１、ＣＳＬＥＸ、ｓｉａｌｙｌ ＳＳＥＡ−１、ＳＴ−４３９、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ｈＣＧのいずれかの腫瘍マーカーを用いた検査である（８）に記載の検査方法。
（１０）血清検査がアミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ１、アルカリ性ホスファターゼ、γＧＴＰ、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、インスリンのいずれかの血清マーカーを用いた検査である（８）に記載の検査方法。
（１１）ヒト検体が全血もしくは血球、血清、血漿などのヒト血液成分またはヒト細胞もしくは組織の抽出液である（１）から（１０）のいずれかに記載の検査方法。
（１２）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その測定値を男性健常者または女性健常者の統計学的数値で補正して得られるオートタキシン指数を用いて検査する膵疾患の検査方法。
（１３）統計学的数値がオートタキシン濃度測定値の平均値、中央値、９５パーセンタイル上限値のいずれかである（１２）に記載の検査方法。
（１４）前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である（１２）から（１４）のいずれかに記載の検査方法。
（１６）非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである（１５）に記載の検査方法。
（１７）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が健常者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、（１２）から（１６）のいずれかに記載の検査方法。
（１８）膵疾患が膵臓癌である（１４）に記載の検査方法。
（１９）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、（１８）に記載の検査方法。
（２０）抗体を用いた免疫化学的方法でオートタキシン濃度を測定する（１）から（１９）のいずれかに記載の検査方法。
（２１）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定する方法がリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法である（１）から（１９）のいずれかに記載の検査方法。
（２２）（２０）または（２１）に記載の検査方法を利用した膵疾患の検査薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定すること、そして対照群のオートタキシン濃度と比較することにより膵疾患を検査することが可能である。特に健常者群のオートタキシン濃度と比較した場合に、ヒト検体中のオートタキシン濃度の低下により非癌膵疾患を検査できる。一方で、膵疾患が疑われる患者において、非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度と比較することにより患者検体中のオートタキシン濃度から非癌膵疾患と膵臓癌との判別ができる。
【００１１】
本発明の検査方法を実施するにあたり、ヒト検体中のオートタキシン濃度の測定はオートタキシンの有する酵素活性であるリゾホスホリパーゼＤ活性の測定でも可能であるし、特許文献１に記載の方法を用いた免疫学的定量試薬で測定することも可能である。免疫学的定量試薬でオートタキシン濃度を測定する場合、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく、かつ短時間でオートタキシンを定量可能であり、小規模医療施設においても簡便、低コストで検査可能な試薬を提供することが可能である。
【００１２】
さらに、本発明の検査方法に既存の血清検査または画像診断とを組み合わせることで、血清検査または画像検査単一の検査による診断と比較し、より高い精度で膵疾患を検査することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】健常者血清中における、自動免疫測定装置ＡＩＡによるオートタキシン濃度定量値（縦軸）とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値（横軸）との相関性を示す。
【図２】男性健常者および女性健常者血清中のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値の分布を示す。
【図３】男性健常者および女性健常者血清中のオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）の分布を示す。
【図４】非癌膵疾患および膵臓癌患者血清中のオートタキシン濃度（縦軸）とリゾホスホリパーゼＤ活性（横軸）との相関性を示す。
【図５】健常者および非癌膵疾患患者のオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）をＢｏｘ−ａｎｄ−Ｗｈｉｓｋｅｒ Ｐｌｏｔで示した図。２群の有意差検定はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験にて実施した。
【図６】膵臓癌および非癌膵疾患患者のオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）をＢｏｘ−ａｎｄ−Ｗｈｉｓｋｅｒ Ｐｌｏｔで示した図。２群の有意差検定はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験にて実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明者は、オートタキシン濃度と膵疾患との関係について鋭意検討した。その結果、膵疾患において健常者と比較し非癌膵疾患患者ではオートタキシン濃度が低値を示すこと、膵臓癌患者ではオートタキシン濃度が高値を示す例はあっても低値は示さないことを、それぞれ見いだした。本結果よりヒト検体中のオートタキシン濃度を測定することにより非癌膵疾患および膵臓癌の診断、ならびに膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患と膵臓癌との判別が可能なことを見いだした。本発明は、たとえば血液検査にて、全血中または血球、血清、血漿などのヒト血液成分中のオートタキシン濃度を簡便に測定することにより膵疾患の診断を可能にする技術および試薬を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明の検査方法と、既存の血清検査または画像診断とを組み合わせることにより、さらに高精度な膵疾患の診断が期待できる。既存の血清検査としては、ＣＡ１９−９、ＣＡ−５０、ＤＵ−ＰＡＮ−２、Ｓｐａｎ−１、ＣＳＬＥＸ、ｓｉａｌｙｌ ＳＳＥＡ−１、ＳＴ−４３９、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ｈＣＧなど従来から用いられている腫瘍マーカーによる検査や、アミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ１、アルカリ性ホスファターゼ、γＧＴＰ、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、インスリンなどの従来から用いられる血清マーカーによる検査が例示できる。
【００１６】
なお、男性のオートタキシン濃度と女性のオートタキシン濃度とには有意差が存在する（特願２００９−２９８０４８号）。そのため、測定したヒト検体中のオートタキシン濃度を、あらかじめ測定した男性健常者または女性健常者のオートタキシン濃度で補正して得られるオートタキシン指数を用いて膵疾患を検査すると、男女の性差を考慮しなくて済む点で好ましい。なお、測定したヒト検体中のオートタキシン濃度を補正するのに用いる、男性健常者または女性健常者のオートタキシン濃度は、男性健常者または女性健常者のオートタキシン濃度測定値の平均値であってもよいし、中央値であってもよいし、９５パーセンタイル上限値であってもよい。オートタキシン指数は、オートタキシン濃度をリゾホスホリパーゼＤ活性に基づき測定した場合には、ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘとし、オートタキシン濃度を免疫学的定量試薬で測定する場合には、ＡＴＸ ｉｎｄｅｘとする。以下の実施例２及び実施例３において記載されるように、免疫学的定量試薬で測定したオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性とは極めて高い相関性を有することから、ｌｙｓｐｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘとＡＴＸ ｉｎｄｅｘとは同視することができる。
【００１７】
本発明に係る検査方法は、ヒト検体中のオートタキシン濃度又は指数を測定し、その値が健常者群測定値からなる正常値範囲より算出したカットオフ値より低値を示した場合に非癌膵疾患を罹患する、とする。これにより、非癌膵疾患を診断することが可能になる。このようなカットオフ値は、当業者であれば健常者群と非癌膵疾患群におけるオートタキシン濃度又は指数の分布を参照して任意に決定することができる。カットオフ値の決定法は、例えば血清中のオートタキシン濃度または指数の９５％パーセンタイル値下限をカットオフ値に設定することや、オートタキシン濃度または指数を用いたＲＯＣ曲線による統計的解析で設定可能である。また、膵疾患が疑われる患者において、ヒト検体中のオートタキシン濃度又は指数を測定し、その値が非癌膵疾患群の測定値範囲より算出したカットオフ値より高値を示した場合に膵臓癌を罹患する、とする。これにより、非癌膵疾患と膵臓癌との判別が可能である。膵疾患が疑われる患者とは、好ましくは膵疾患を患っている患者のことをいう。このような、カットオフ値は、当業者であれば、非癌膵疾患群と膵臓癌患者群におけるオートタキシン濃度又は指数の分布を参照して任意に決定することができる。カットオフ値の決定法は、例えば血清中のオートタキシン濃度または指数の９５％パーセンタイル値上限をカットオフ値に設定することや、オートタキシン濃度または指数を用いたＲＯＣ曲線による統計的解析で設定可能である。
【実施例】
【００１８】
以下に本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、実施例で使用した血清検体の採取および測定は東京大学医学部附属病院で実施し、研究倫理について東京大学大学院医学研究科倫理委員会での承認のもと実施した。また、オートタキシン濃度の測定は特許文献１の方法に基づき自動免疫測定装置ＡＩＡシリーズ（東ソー社製）を用い実施し、リゾホスホリパーゼＤ活性測定法も特許文献１に記載されている。これらの測定方法を以下に詳述する。
【００１９】
血清中ヒトオートタキシンの濃度測定
ヒトオートタキシンモノクローナル抗体Ｒ１０．２３を固相用抗体として用い、ヒトオートタキシンモノクローナル抗体Ｒ１０．２１を二次抗体として用いた２ステップ２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡにより、血清中のヒトオートタキシンを測定した。固相用抗体Ｒ１０．２３はペプシン消化によりＦ（ａｂ）2化し使用した。Ｒ１０．２３を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ社製）に２μｇ／ｍＬ濃度で５０μＬ／ウェルにて添加し、一昼夜、４℃にてプレートに結合させた。ＴＢＳにより３回洗浄後、３％ ＢＳＡを含むＴＢＳを２５０μＬ／ウェルで添加し２時間ブロッキング処理を行った。ＴＢＳにより３回洗浄後、ヒトオートタキシン標準品（０、０．３４、０．６７５、１．３５、２．７０、５．４０μｇ／ｍＬ）ならびに濃度未知のヒト血清をＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で１／５に希釈し５０μＬ／ウェルにて添加した。室温で２時間反応後、ＴＢＳＴにより４回洗浄し、０．８μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｒ１０．２１を含むＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液を５０μＬ／ウェル添加した。室温で２時間放置後、ＴＢＳＴにより４回洗浄し、１０００倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ社製）を含むＥＬＩＳＡ緩衝液を５０μＬ／ウェル添加した。１時間室温放置後、ＴＢＳＴにより６回洗浄し、ＴＭＢ基質を５０μＬ／ウェルで添加した。室温３０分後、１Ｎ−リン酸により反応を停止し４５０nmの吸光度を測定した。ヒトオートタキシンの標準品による検量線の回帰を、３次回帰により行った。ヒトオートタキシン濃度依存的に４５０nmの吸光度上昇が確認された。本検量線を用い未知濃度のヒト血清で得られた４５０ｎｍの吸光度より検体中のヒトオートタキシンの濃度を算出した。
【００２０】
血清中のリゾホスホリパーゼＤ活性の濃度測定
リゾホスフォリパーゼＤ活性測定はＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５７１，１９７−２０４，２００４を若干変更し行った。具体的には、サンプル２０μＬと２ｍＭのリゾホスファチジルコリン（１４：０−リゾホスファチジルコリン）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ９．０）を含む基質溶液２０μＬを混合し、３７℃にて６時間から一昼夜反応させた。続いて本酵素反応により生成したコリンを定量するため、０．５ｍＭ ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−３−メチルアニリン）、１０Unit／ｍＬ 西洋ワサビペルオキシダーゼ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）からなるＲ１溶液１５０μＬを加え５分間放置した後、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１０Unit／ｍＬ コリンオキシダーゼ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなるＲ２溶液５０μＬを加えた。３０分後、生成したコリンを５５０ｎｍの吸光度で測定し、既知濃度の塩化コリンを基準にしてリゾホスホリパーゼＤ活性値とした。
【００２１】
実施例１：健常者検体のオートタキシン濃度の定量
患者検体測定に先立ち、コントロール群として健常者血清のオートタキシン濃度を測定した。血液は採血７日前より投薬のない健常な成人ボランティアからインフォームドコンセントを得た後、肘前中静脈より採取し、室温１５分放置後、１５００×ｇにて５分間遠心分離することにより血清を取得し測定した。
【００２２】
男性７４名（２３歳から６５歳）、女性４６名（２１歳から６０歳）の健常者血清中のオートタキシン濃度を自動免疫測定装置にて実施した。１２０名全員のオートタキシン濃度測定値は０．７３１±０．１７６ｍｇ／Ｌ（算術平均値±標準偏差）であり、９５パーセンタイルからなる参考基準範囲は０．４６８ｍｇ／Ｌから１．１３４ｍｇ／Ｌであった。なお、男性健常者のオートタキシン測定値は０．６５６±０．１２１ｍｇ／Ｌ、中央値０．６４１ｍｇ／Ｌ、９５パーセンタイル参考基準範囲０．４３８ｍｇ／Ｌから０．９１４ｍｇ／Ｌであり、女性健常者のオートタキシン測定値は０．８５２±０．１８４ｍｇ／Ｌ、中央値０．８２０ｍｇ／Ｌ、９５パーセンタイル参考基準範囲０．６２５ｍｇ／Ｌから１．３２３ｍｇ／Ｌであった。
【００２３】
実施例２：健常者検体のリゾホスホリパーゼＤ活性測定
実施例１と同一検体のリゾホスホリパーゼＤ活性を測定した。１２０名全員のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値は３．５６±０．８０ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）（算術平均値±標準偏差）であり、中央値３．４６ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、９５パーセンタイルからなる参考基準範囲は３．２８ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）から３．５５ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）であった。実施例１で測定したオートタキシン定量値との相関性は相関係数ｒ＝０．９４６と極めて良好であり、免疫測定によるオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値とはともに同等の診断が可能なことを示している（図１）。なお、男性健常者のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値は３．１８±０．５５ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、中央値３．１７ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、９５パーセンタイル参考基準範囲２．９７ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）から３．３２ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）であり、女性健常者のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値は４．１５±０．７９ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、中央値４．００ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、９５パーセンタイル参考基準範囲３．８０ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）から４．４８ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）であった（図２）。女性血清中リゾホスホリパーゼＤ活性は男性に比べ明らかに高濃度であり、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔではＰ＜０．０００１の有意差を示した。
【００２４】
図２の結果からも分かるように検体測定時には男女の性差を考慮する必要があった。そこで以降の評価は、検体測定値を男女それぞれの平均値である３．１８ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）（男性）または４．１５ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）（女性）で除する（リゾホスホリパーゼＤ活性測定値［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］÷男性健常者または女性健常者平均値［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］）ことで男女性差を補正したオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）を用い実施した。性差補正後のそれぞれのｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ分布は、男性健常者においては１．００１±０．１７３、中央値０．９９５、９５パーセンタイル参考基準範囲０．９３０から１．０４０であった。一方、女性健常者においては１．００２±０．１８９、中央値０．９６５、９５パーセンタイル参考基準範囲０．９１２から１．０５０であった（図３）。
【００２５】
実施例３：膵疾患患者血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性値
膵疾患患者の血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値とを測定し検証した。検体は膵臓癌患者検体９例と非癌膵疾患２例、計１１例用いた。測定した１１検体における血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値との相関性はｒ＝０．９８３と非常に良好な相関性を示した（図４）。また図４より得られた相関式は、
オートタキシン濃度［μｇ／Ｌ］＝
２．１６３×リゾホスホリパーゼＤ活性［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］＋０．０６５４
であり、健常者（図１）における相関式、
オートタキシン濃度［μｇ／Ｌ］＝
２．０７２×リゾホスホリパーゼＤ活性［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］−０．００５７
と大きな差が認められなかった。よって、健常者同様、膵疾患を評価する際にも、オートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値、いずれを用いても問題ないことがわかる。
【００２６】
実施例４：非癌膵疾患の診断
健常者１２０例および非癌膵疾患患者７３例について血清中のリゾホスホリパーゼＤ活性を測定し、オートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）を算出比較した。なお、非癌膵疾患患者は慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患よりなる。結果、健常者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘと比較し、非癌膵疾患患者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘは有意に低値を示した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。前記結果より、オートタキシン濃度、リゾホスホリパーゼＤ活性測定値またはｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘにより非癌膵疾患の診断が可能なことがわかる。
【００２７】
実施例５：非癌膵疾患と膵臓癌の判別
膵臓癌患者１０３例および非癌膵疾患患者７３例について血清リゾホスホリパーゼＤ活性を測定し、オートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）を算出比較した。非癌膵疾患患者は慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患よりなる。結果、膵臓癌患者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘと比較し、非癌膵疾患患者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘは有意に低値を示した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。前記結果より、オートタキシン濃度、リゾホスホリパーゼＤ活性測定値またはｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘにより膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患と膵臓癌の判別が可能なことがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト検体中のオートタキシン濃度の測定による膵疾患の検査方法および検査薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトオートタキシンは、１９９２年Ｍ．Ｌ．ＳｔｒａｃｋｅらによってＡ２０５８ヒト黒色腫細胞培養培地から細胞運動性を惹起する物質として単離された分子量約１２５ＫＤａの糖蛋白質である（非特許文献１）。オートタキシンはそのリゾホスホリパーゼＤ活性によりリゾホスファチジルコリンを基質としリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。生体内ではＬＰＡが癌の増殖、転移に関与していることが多くの研究者により示され（非特許文献２から４）、その産生酵素であるオートタキシンと様々な疾病との因果関係が研究されている。最近になり、ヒトオートタキシンを定量する手法が確立され（特許文献１、非特許文献５）、様々な疾患の診断マーカーとして期待されている。
【０００３】
オートタキシンはそのＬＰＡ産生能から癌あるいは癌転移との関連が注目され現在も盛んに研究されている。１９９２年に癌との関連を示した特許が出願され（特許文献２および３）、その後ヒトテラトカルシノーマ（非特許文献６）、肺の非小細胞癌（非特許文献７）、甲状腺癌（非特許文献８）、乳癌（非特許文献９）、多型膠芽腫（非特許文献１０および１１）、前立腺癌（非特許文献１２）、ホジキンリンパ腫（非特許文献１３）など多種多様な癌においてオートタキシンの関与が報告されている。しかしながら、これら報告はいずれも臓器における発現に関する報告である。
【０００４】
一方、体液中のオートタキシン濃度の上昇に関する報告は、卵巣癌患者血清で差が認められない報告（非特許文献１４）、前立腺癌患者血清で差が認められない報告（非特許文献１５）など否定的な報告が多く、肯定的な報告としては、卵巣癌患者腹水中でオートタキシン濃度の上昇が示された論文や悪性腫瘍の一つである悪性リンパ腫患者で血清オートタキシン濃度が高値を示す報告がある（特許文献１、非特許文献１６）。これら報告から、健常者血清のオートタキシン濃度は比較的高く、癌細胞がオートタキシンを産生しても血清濃度を上昇させるに至るほどではないことを示唆しており、腹水中の卵巣癌細胞や血液中に癌細胞が存在する悪性リンパ腫でのみ血清オートタキシン濃度の上昇が検出された結果であることが示唆される。したがって、癌における体液中のオートタキシン濃度の上昇は極めて限定的な癌にのみ検出可能であるといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０１６１８６号
【特許文献２】米国公開２００６／０２７５８６５号公報
【特許文献３】加国登録２１２８２１５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６、２５２４、１９９２
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、３、５８２、２００３
【非特許文献３】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０、１０９、８３３、２００４
【非特許文献４】Ｂｌｏｏｄ、１０６、２１３８、２００５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、３８８、５１、２００８
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２１８、７１４、１９９６
【非特許文献７】Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１２１６、１９９９
【非特許文献８】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０９、８３３、２００４
【非特許文献９】Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１９、６０３、２００２
【非特許文献１０】Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、７、７、２００５
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１、１７４９２、２００６
【非特許文献１２】Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２１０、１１１、２００７
【非特許文献１３】Ｂｌｏｏｄ、１０６、２１３８、２００５
【非特許文献１４】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、８０、１６４１、２００７
【非特許文献１５】Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４４、５４９、２００７
【非特許文献１６】Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ、１４３、６０、２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、血清マーカー検査、画像検査により様々な膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患および膵臓癌の診断や判別が可能な簡便な検査方法ならびに検査薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述したように、従来からヒト組織または体液中のオートタキシン濃度が様々な疾病により変動することを示唆する報告がある。しかしながら、これまではオートタキシンを定量する方法がなかったため、様々な疾病との因果関係の解析がなされてこなかった。近年、本発明者により得られた特許文献１に記載の測定方法により、血清などのヒト検体中のオートタキシン濃度を簡便、短時間、かつ信頼性高く定量することが可能となった。特許文献１に記載の測定方法はリゾホスホリパーゼＤ活性測定値と極めて良好な相関性を示すことが確認されており、いずれの手法においてもオートタキシン濃度の測定が可能である（非特許文献５）。そこで、特許文献１に記載の測定方法およびリゾホスホリパーゼＤ活性測定を用い鋭意検討を重ねた結果、健常者、非癌膵疾患、膵臓癌において血液中のオートタキシン濃度およびリゾホスホリパーゼＤ活性に差が生じることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
詳しくは、本願は下記の発明を包含する：
（１）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定することによる膵疾患の検査方法。
（２）前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、（１）に記載の方法。
（３）膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である（１）又は（２）に記載の検査方法。
（４）非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである（２）に記載の検査方法。
（５）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の健常者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載の検査方法。
（６）膵疾患が膵臓癌である（２）に記載の検査方法。
（７）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、（６）に記載の検査方法。
（８）血清検査または画像診断と、（１）から（７）のいずれかに記載の検査方法とを組み合わせた膵疾患の検査方法。
（９）血清検査がＣＡ１９−９、ＣＡ−５０、ＤＵ−ＰＡＮ−２、Ｓｐａｎ−１、ＣＳＬＥＸ、ｓｉａｌｙｌ ＳＳＥＡ−１、ＳＴ−４３９、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ｈＣＧのいずれかの腫瘍マーカーを用いた検査である（８）に記載の検査方法。
（１０）血清検査がアミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ１、アルカリ性ホスファターゼ、γＧＴＰ、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、インスリンのいずれかの血清マーカーを用いた検査である（８）に記載の検査方法。
（１１）ヒト検体が全血もしくは血球、血清、血漿などのヒト血液成分またはヒト細胞もしくは組織の抽出液である（１）から（１０）のいずれかに記載の検査方法。
（１２）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その測定値を男性健常者または女性健常者の統計学的数値で補正して得られるオートタキシン指数を用いて検査する膵疾患の検査方法。
（１３）統計学的数値がオートタキシン濃度測定値の平均値、中央値、９５パーセンタイル上限値のいずれかである（１２）に記載の検査方法。
（１４）前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である（１２）から（１４）のいずれかに記載の検査方法。
（１６）非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである（１５）に記載の検査方法。
（１７）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が健常者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、（１２）から（１６）のいずれかに記載の検査方法。
（１８）膵疾患が膵臓癌である（１４）に記載の検査方法。
（１９）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、（１８）に記載の検査方法。
（２０）抗体を用いた免疫化学的方法でオートタキシン濃度を測定する（１）から（１９）のいずれかに記載の検査方法。
（２１）ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定する方法がリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法である（１）から（１９）のいずれかに記載の検査方法。
（２２）（２０）または（２１）に記載の検査方法を利用した膵疾患の検査薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定すること、そして対照群のオートタキシン濃度と比較することにより膵疾患を検査することが可能である。特に健常者群のオートタキシン濃度と比較した場合に、ヒト検体中のオートタキシン濃度の低下により非癌膵疾患を検査できる。一方で、膵疾患が疑われる患者において、非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度と比較することにより患者検体中のオートタキシン濃度から非癌膵疾患と膵臓癌との判別ができる。
【００１１】
本発明の検査方法を実施するにあたり、ヒト検体中のオートタキシン濃度の測定はオートタキシンの有する酵素活性であるリゾホスホリパーゼＤ活性の測定でも可能であるし、特許文献１に記載の方法を用いた免疫学的定量試薬で測定することも可能である。免疫学的定量試薬でオートタキシン濃度を測定する場合、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく、かつ短時間でオートタキシンを定量可能であり、小規模医療施設においても簡便、低コストで検査可能な試薬を提供することが可能である。
【００１２】
さらに、本発明の検査方法に既存の血清検査または画像診断とを組み合わせることで、血清検査または画像検査単一の検査による診断と比較し、より高い精度で膵疾患を検査することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】健常者血清中における、自動免疫測定装置ＡＩＡによるオートタキシン濃度定量値（縦軸）とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値（横軸）との相関性を示す。
【図２】男性健常者および女性健常者血清中のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値の分布を示す。
【図３】男性健常者および女性健常者血清中のオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）の分布を示す。
【図４】非癌膵疾患および膵臓癌患者血清中のオートタキシン濃度（縦軸）とリゾホスホリパーゼＤ活性（横軸）との相関性を示す。
【図５】健常者および非癌膵疾患患者のオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）をＢｏｘ−ａｎｄ−Ｗｈｉｓｋｅｒ Ｐｌｏｔで示した図。２群の有意差検定はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験にて実施した。
【図６】膵臓癌および非癌膵疾患患者のオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）をＢｏｘ−ａｎｄ−Ｗｈｉｓｋｅｒ Ｐｌｏｔで示した図。２群の有意差検定はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験にて実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明者は、オートタキシン濃度と膵疾患との関係について鋭意検討した。その結果、膵疾患において健常者と比較し非癌膵疾患患者ではオートタキシン濃度が低値を示すこと、膵臓癌患者ではオートタキシン濃度が高値を示す例はあっても低値は示さないことを、それぞれ見いだした。本結果よりヒト検体中のオートタキシン濃度を測定することにより非癌膵疾患および膵臓癌の診断、ならびに膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患と膵臓癌との判別が可能なことを見いだした。本発明は、たとえば血液検査にて、全血中または血球、血清、血漿などのヒト血液成分中のオートタキシン濃度を簡便に測定することにより膵疾患の診断を可能にする技術および試薬を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明の検査方法と、既存の血清検査または画像診断とを組み合わせることにより、さらに高精度な膵疾患の診断が期待できる。既存の血清検査としては、ＣＡ１９−９、ＣＡ−５０、ＤＵ−ＰＡＮ−２、Ｓｐａｎ−１、ＣＳＬＥＸ、ｓｉａｌｙｌ ＳＳＥＡ−１、ＳＴ−４３９、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ｈＣＧなど従来から用いられている腫瘍マーカーによる検査や、アミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ１、アルカリ性ホスファターゼ、γＧＴＰ、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、インスリンなどの従来から用いられる血清マーカーによる検査が例示できる。
【００１６】
なお、男性のオートタキシン濃度と女性のオートタキシン濃度とには有意差が存在する（特願２００９−２９８０４８号）。そのため、測定したヒト検体中のオートタキシン濃度を、あらかじめ測定した男性健常者または女性健常者のオートタキシン濃度で補正して得られるオートタキシン指数を用いて膵疾患を検査すると、男女の性差を考慮しなくて済む点で好ましい。なお、測定したヒト検体中のオートタキシン濃度を補正するのに用いる、男性健常者または女性健常者のオートタキシン濃度は、男性健常者または女性健常者のオートタキシン濃度測定値の平均値であってもよいし、中央値であってもよいし、９５パーセンタイル上限値であってもよい。オートタキシン指数は、オートタキシン濃度をリゾホスホリパーゼＤ活性に基づき測定した場合には、ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘとし、オートタキシン濃度を免疫学的定量試薬で測定する場合には、ＡＴＸ ｉｎｄｅｘとする。以下の実施例２及び実施例３において記載されるように、免疫学的定量試薬で測定したオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性とは極めて高い相関性を有することから、ｌｙｓｐｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘとＡＴＸ ｉｎｄｅｘとは同視することができる。
【００１７】
本発明に係る検査方法は、ヒト検体中のオートタキシン濃度又は指数を測定し、その値が健常者群測定値からなる正常値範囲より算出したカットオフ値より低値を示した場合に非癌膵疾患を罹患する、とする。これにより、非癌膵疾患を診断することが可能になる。このようなカットオフ値は、当業者であれば健常者群と非癌膵疾患群におけるオートタキシン濃度又は指数の分布を参照して任意に決定することができる。カットオフ値の決定法は、例えば血清中のオートタキシン濃度または指数の９５％パーセンタイル値下限をカットオフ値に設定することや、オートタキシン濃度または指数を用いたＲＯＣ曲線による統計的解析で設定可能である。また、膵疾患が疑われる患者において、ヒト検体中のオートタキシン濃度又は指数を測定し、その値が非癌膵疾患群の測定値範囲より算出したカットオフ値より高値を示した場合に膵臓癌を罹患する、とする。これにより、非癌膵疾患と膵臓癌との判別が可能である。膵疾患が疑われる患者とは、好ましくは膵疾患を患っている患者のことをいう。このような、カットオフ値は、当業者であれば、非癌膵疾患群と膵臓癌患者群におけるオートタキシン濃度又は指数の分布を参照して任意に決定することができる。カットオフ値の決定法は、例えば血清中のオートタキシン濃度または指数の９５％パーセンタイル値上限をカットオフ値に設定することや、オートタキシン濃度または指数を用いたＲＯＣ曲線による統計的解析で設定可能である。
【実施例】
【００１８】
以下に本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、実施例で使用した血清検体の採取および測定は東京大学医学部附属病院で実施し、研究倫理について東京大学大学院医学研究科倫理委員会での承認のもと実施した。また、オートタキシン濃度の測定は特許文献１の方法に基づき自動免疫測定装置ＡＩＡシリーズ（東ソー社製）を用い実施し、リゾホスホリパーゼＤ活性測定法も特許文献１に記載されている。これらの測定方法を以下に詳述する。
【００１９】
血清中ヒトオートタキシンの濃度測定
ヒトオートタキシンモノクローナル抗体Ｒ１０．２３を固相用抗体として用い、ヒトオートタキシンモノクローナル抗体Ｒ１０．２１を二次抗体として用いた２ステップ２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡにより、血清中のヒトオートタキシンを測定した。固相用抗体Ｒ１０．２３はペプシン消化によりＦ（ａｂ）2化し使用した。Ｒ１０．２３を９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ社製）に２μｇ／ｍＬ濃度で５０μＬ／ウェルにて添加し、一昼夜、４℃にてプレートに結合させた。ＴＢＳにより３回洗浄後、３％ ＢＳＡを含むＴＢＳを２５０μＬ／ウェルで添加し２時間ブロッキング処理を行った。ＴＢＳにより３回洗浄後、ヒトオートタキシン標準品（０、０．３４、０．６７５、１．３５、２．７０、５．４０μｇ／ｍＬ）ならびに濃度未知のヒト血清をＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で１／５に希釈し５０μＬ／ウェルにて添加した。室温で２時間反応後、ＴＢＳＴにより４回洗浄し、０．８μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｒ１０．２１を含むＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液を５０μＬ／ウェル添加した。室温で２時間放置後、ＴＢＳＴにより４回洗浄し、１０００倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ社製）を含むＥＬＩＳＡ緩衝液を５０μＬ／ウェル添加した。１時間室温放置後、ＴＢＳＴにより６回洗浄し、ＴＭＢ基質を５０μＬ／ウェルで添加した。室温３０分後、１Ｎ−リン酸により反応を停止し４５０nmの吸光度を測定した。ヒトオートタキシンの標準品による検量線の回帰を、３次回帰により行った。ヒトオートタキシン濃度依存的に４５０nmの吸光度上昇が確認された。本検量線を用い未知濃度のヒト血清で得られた４５０ｎｍの吸光度より検体中のヒトオートタキシンの濃度を算出した。
【００２０】
血清中のリゾホスホリパーゼＤ活性の濃度測定
リゾホスフォリパーゼＤ活性測定はＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５７１，１９７−２０４，２００４を若干変更し行った。具体的には、サンプル２０μＬと２ｍＭのリゾホスファチジルコリン（１４：０−リゾホスファチジルコリン）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ９．０）を含む基質溶液２０μＬを混合し、３７℃にて６時間から一昼夜反応させた。続いて本酵素反応により生成したコリンを定量するため、０．５ｍＭ ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−３−メチルアニリン）、１０Unit／ｍＬ 西洋ワサビペルオキシダーゼ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）からなるＲ１溶液１５０μＬを加え５分間放置した後、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、１０Unit／ｍＬ コリンオキシダーゼ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなるＲ２溶液５０μＬを加えた。３０分後、生成したコリンを５５０ｎｍの吸光度で測定し、既知濃度の塩化コリンを基準にしてリゾホスホリパーゼＤ活性値とした。
【００２１】
実施例１：健常者検体のオートタキシン濃度の定量
患者検体測定に先立ち、コントロール群として健常者血清のオートタキシン濃度を測定した。血液は採血７日前より投薬のない健常な成人ボランティアからインフォームドコンセントを得た後、肘前中静脈より採取し、室温１５分放置後、１５００×ｇにて５分間遠心分離することにより血清を取得し測定した。
【００２２】
男性７４名（２３歳から６５歳）、女性４６名（２１歳から６０歳）の健常者血清中のオートタキシン濃度を自動免疫測定装置にて実施した。１２０名全員のオートタキシン濃度測定値は０．７３１±０．１７６ｍｇ／Ｌ（算術平均値±標準偏差）であり、９５パーセンタイルからなる参考基準範囲は０．４６８ｍｇ／Ｌから１．１３４ｍｇ／Ｌであった。なお、男性健常者のオートタキシン測定値は０．６５６±０．１２１ｍｇ／Ｌ、中央値０．６４１ｍｇ／Ｌ、９５パーセンタイル参考基準範囲０．４３８ｍｇ／Ｌから０．９１４ｍｇ／Ｌであり、女性健常者のオートタキシン測定値は０．８５２±０．１８４ｍｇ／Ｌ、中央値０．８２０ｍｇ／Ｌ、９５パーセンタイル参考基準範囲０．６２５ｍｇ／Ｌから１．３２３ｍｇ／Ｌであった。
【００２３】
実施例２：健常者検体のリゾホスホリパーゼＤ活性測定
実施例１と同一検体のリゾホスホリパーゼＤ活性を測定した。１２０名全員のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値は３．５６±０．８０ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）（算術平均値±標準偏差）であり、中央値３．４６ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、９５パーセンタイルからなる参考基準範囲は３．２８ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）から３．５５ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）であった。実施例１で測定したオートタキシン定量値との相関性は相関係数ｒ＝０．９４６と極めて良好であり、免疫測定によるオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値とはともに同等の診断が可能なことを示している（図１）。なお、男性健常者のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値は３．１８±０．５５ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、中央値３．１７ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、９５パーセンタイル参考基準範囲２．９７ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）から３．３２ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）であり、女性健常者のリゾホスホリパーゼＤ活性測定値は４．１５±０．７９ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、中央値４．００ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）、９５パーセンタイル参考基準範囲３．８０ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）から４．４８ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）であった（図２）。女性血清中リゾホスホリパーゼＤ活性は男性に比べ明らかに高濃度であり、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔではＰ＜０．０００１の有意差を示した。
【００２４】
図２の結果からも分かるように検体測定時には男女の性差を考慮する必要があった。そこで以降の評価は、検体測定値を男女それぞれの平均値である３．１８ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）（男性）または４．１５ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）（女性）で除する（リゾホスホリパーゼＤ活性測定値［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］÷男性健常者または女性健常者平均値［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］）ことで男女性差を補正したオートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）を用い実施した。性差補正後のそれぞれのｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ分布は、男性健常者においては１．００１±０．１７３、中央値０．９９５、９５パーセンタイル参考基準範囲０．９３０から１．０４０であった。一方、女性健常者においては１．００２±０．１８９、中央値０．９６５、９５パーセンタイル参考基準範囲０．９１２から１．０５０であった（図３）。
【００２５】
実施例３：膵疾患患者血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性値
膵疾患患者の血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値とを測定し検証した。検体は膵臓癌患者検体９例と非癌膵疾患２例、計１１例用いた。測定した１１検体における血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値との相関性はｒ＝０．９８３と非常に良好な相関性を示した（図４）。また図４より得られた相関式は、
オートタキシン濃度［μｇ／Ｌ］＝
２．１６３×リゾホスホリパーゼＤ活性［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］＋０．０６５４
であり、健常者（図１）における相関式、
オートタキシン濃度［μｇ／Ｌ］＝
２．０７２×リゾホスホリパーゼＤ活性［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｍｉｎ）］−０．００５７
と大きな差が認められなかった。よって、健常者同様、膵疾患を評価する際にも、オートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼＤ活性測定値、いずれを用いても問題ないことがわかる。
【００２６】
実施例４：非癌膵疾患の診断
健常者１２０例および非癌膵疾患患者７３例について血清中のリゾホスホリパーゼＤ活性を測定し、オートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）を算出比較した。なお、非癌膵疾患患者は慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患よりなる。結果、健常者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘと比較し、非癌膵疾患患者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘは有意に低値を示した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。前記結果より、オートタキシン濃度、リゾホスホリパーゼＤ活性測定値またはｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘにより非癌膵疾患の診断が可能なことがわかる。
【００２７】
実施例５：非癌膵疾患と膵臓癌の判別
膵臓癌患者１０３例および非癌膵疾患患者７３例について血清リゾホスホリパーゼＤ活性を測定し、オートタキシン指数（ｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘ）を算出比較した。非癌膵疾患患者は慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患よりなる。結果、膵臓癌患者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘと比較し、非癌膵疾患患者のｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘは有意に低値を示した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）。前記結果より、オートタキシン濃度、リゾホスホリパーゼＤ活性測定値またはｌｙｓｏＰＬＤ ｉｎｄｅｘにより膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患と膵臓癌の判別が可能なことがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を用いることによる膵疾患の検査方法。
【請求項２】
前記オートタキシン指数が、オートタキシン濃度の測定値を男性健常者または女性健常者の統計学的数値で補正することにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記統計学的数値がオートタキシン濃度測定値の平均値、中央値、９５パーセンタイル上限値のいずれかである請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である請求項１〜４のいずれか一項に記載の検査方法。
【請求項６】
ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を測定し、その値が健常者群のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである請求項５又は６に記載の検査方法。
【請求項８】
膵疾患が膵臓癌である請求項４に記載の検査方法。
【請求項９】
ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を測定し、その値が非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
血清検査または画像診断と、請求項１から９のいずれかに記載の検査方法とを組み合わせた膵疾患の検査方法。
【請求項１１】
血清検査がＣＡ１９−９、ＣＡ−５０、ＤＵ−ＰＡＮ−２、Ｓｐａｎ−１、ＣＳＬＥＸ、ｓｉａｌｙｌ ＳＳＥＡ−１、ＳＴ−４３９、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ｈＣＧのいずれかの腫瘍マーカーを用いた検査である請求項１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
血清検査がアミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ１、アルカリ性ホスファターゼ、γＧＴＰ、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、インスリンのいずれかの血清マーカーを用いた検査である請求項１０に記載の検査方法。
【請求項１３】
ヒト検体が全血もしくは血球、血清、血漿などのヒト血液成分またはヒト細胞もしくは組織の抽出液である請求項１から１２のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１４】
抗体を用いた免疫化学的方法でオートタキシン濃度を測定する請求項１から１３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１５】
ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定する方法がリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法である請求項１から１３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の検査方法を利用した膵疾患の検査薬。
【請求項１】
ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を用いることによる膵疾患の検査方法。
【請求項２】
前記オートタキシン指数が、オートタキシン濃度の測定値を男性健常者または女性健常者の統計学的数値で補正することにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記統計学的数値がオートタキシン濃度測定値の平均値、中央値、９５パーセンタイル上限値のいずれかである請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である請求項１〜４のいずれか一項に記載の検査方法。
【請求項６】
ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を測定し、その値が健常者群のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである請求項５又は６に記載の検査方法。
【請求項８】
膵疾患が膵臓癌である請求項４に記載の検査方法。
【請求項９】
ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を測定し、その値が非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
血清検査または画像診断と、請求項１から９のいずれかに記載の検査方法とを組み合わせた膵疾患の検査方法。
【請求項１１】
血清検査がＣＡ１９−９、ＣＡ−５０、ＤＵ−ＰＡＮ−２、Ｓｐａｎ−１、ＣＳＬＥＸ、ｓｉａｌｙｌ ＳＳＥＡ−１、ＳＴ−４３９、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ｈＣＧのいずれかの腫瘍マーカーを用いた検査である請求項１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
血清検査がアミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ１、アルカリ性ホスファターゼ、γＧＴＰ、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、インスリンのいずれかの血清マーカーを用いた検査である請求項１０に記載の検査方法。
【請求項１３】
ヒト検体が全血もしくは血球、血清、血漿などのヒト血液成分またはヒト細胞もしくは組織の抽出液である請求項１から１２のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１４】
抗体を用いた免疫化学的方法でオートタキシン濃度を測定する請求項１から１３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１５】
ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定する方法がリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法である請求項１から１３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の検査方法を利用した膵疾患の検査薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−５２８７５（Ｐ２０１２−５２８７５Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９４６５８（Ｐ２０１０−１９４６５８）
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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